CN110950967A

CN110950967A - 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法

Info

Publication number: CN110950967A
Application number: CN201911282598.7A
Authority: CN
Inventors: 赵冠华; 靳昌忠
Original assignee: Hangzhou Heavy Chain Technology Co ltd; Shandong Minkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jin Changzhong
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110950967B

Abstract

本发明公开一种抗人血清白蛋白纳米抗体与IL‑2融合蛋白及制备方法，通过合成编码上述融合蛋白的核酸分子，制备表达载体，将表达载体转染宿主细胞，从细胞培养物中提取、纯化得到融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抗人血清白蛋白纳米抗体与IL‑2融合蛋白具有与人血清白蛋白特异性结合的活性，亲和力较高，可有效延长药物半衰期，同时不影响IL‑2的生物活性；同时，由于药物在体内的停留和作用时间延长，可以减少药物的使用剂量，大大降低药物的毒副作用；融合的纳米抗体具有分子量小，性质稳定，免疫原性小，易于加工合成等特点。

Description

抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白及制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学及生物制药技术领域，涉及一种抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白及其制备方法。

背景技术

重组蛋白/多肽类药物具有活性高、免疫原性低、毒副作用少等优点，在临床疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。白细胞介素2(IL-2)是趋化因子家族的一种细胞因子，能够刺激T细胞生长，诱导细胞毒作用，刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性，在临床抗肿瘤治疗中发挥重要作用。但由于IL-2相对分子量较小，仅有15KD，在体内循环时易被肾小球滤过而排出体外，血清半衰期较短，仅30-80分钟左右，生物利用度较差，临床使用时需要频繁高剂量给药，这无疑增加了患者的经济负担和使用的不便性，限制了这些药物在临床上的应用，迫切需要对其进行二次改造。对这类药物进行长效化改造是改善药物代谢动力学的只要措施，也是当前蛋白质和多肽类药升级换代的发展趋势。长效化策略包括糖基化改造、聚乙二醇修饰、人血清白蛋白融合、转铁蛋白融合、抗体Fc片段融合等，其中人血清白蛋白融合是常用的手段。

人血清白蛋白是人体血浆中含量最丰富的可溶性蛋白，也是许多内源因子和外源药物的载体。人血清白蛋白由585个氨基酸构成，相对分子质量约为66.5kDa。由于正常情况下不易透过肾小球，人血清白蛋白在血浆中的半衰期较长(可达14～20天，平均约为19天)，没有酶学和免疫学活性，安全无毒，生物相容性好，而且体内分布极广，是理想的药物载体。各种基于人血清白蛋白的药物长效化技术得到了广泛的应用和发展，目前主要包括构建人血清白蛋白融合蛋白、通过共价化学键与人血清白蛋白偶联、通过非共价键与人血清白蛋白可逆性结合等。

近年来，人血清白蛋白融合技术在长效干扰素、粒细胞生长因子以及白介素等药物的研制上得到了广泛的应用。但该技术目前也存在一些共性问题，如融合蛋白的表达产物活性有所降低，融合蛋白的稳定性不够，出现的降解问题，以及在商业化生产上如何提高融合蛋白的表达产量等问题。另外，目前这些利用人血清白蛋白作为载体的长效化技术均需体外重组表达或修饰人血清白蛋白，无法利用体内内源性的天然人血清白蛋白，这不仅增加了药物制备的难度，而且在安全性上也存在风险。

纳米抗体是一种源自骆驼属体内重链抗体的新型抗体。在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区。单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，也被称作纳米抗体。纳米抗体可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。本发明提供了一种抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白及其制备方法，所构建的融合蛋白分子量较小，制备简单，可以与体内的人血清白蛋白特异性结合，延长IL-2的半衰期，实现药物的长效化。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明的融合蛋白的氨基酸序列并不限于SEQ ID NO.1所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.1所示的序列基础上经过一个或多个氨基酸残基的替换、插入或者删除得到的序列，并且具有与SEQ ID NO.1相同的生物活性，例如与人血清白蛋白特异性结合的活性或者活性加强或减弱的衍生序列。这些衍生序列也在本发明的保护范围。

本发明的另一个目的在于提供一种编码抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白的核酸分子，该核酸分子编码上述抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白，其序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明所涉及的该核酸分子序列并不限于SEQ ID NO.2所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.2所示的序列基础上经过一个或多个核苷酸的替换得到的、能够编码出本发明提供的纳米抗体的衍生序列。这些衍生序列也在本发明的保护范围。

本发明的另一个目的在于提供一种融合蛋白的表达载体，包含pMAL-c5x骨架载体和上述编码融合蛋白的核酸分子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述骨架载体包括但不限于pMAL-c5x表达载体。

本发明的再一个目的在于提供一种表达融合蛋白的BL21(DE3)宿主细胞，通过脂质体转染的方式将上述融合蛋白表达载体转入BL21(DE3)细胞。

本发明的再一个目的是提供所述抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白的制备方法，通过以下步骤实现：

(1)按照SEQ ID NO.2所示的序列，合成编码上述融合蛋白的核酸分子，并在5’端添加BamH I酶切位点(GGATCC)，3’端添加Hind III酶切位点(AAGCTT)。

(2)使用BamH I和Hind III酶双酶切pMAL-c5x表达载体和上述融合蛋白的核酸分子片段，并通过凝胶电泳回收片段。

(3)使用T4连接酶连接双酶切的载体与核酸分子片段。

(4)取5μL连接产物，加入50μL融化的BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，在冰上进行细胞转化，并将转化好的细胞37℃培养1小时后，均匀涂于氨苄西林阳性的LB琼脂培养板上，37℃培养过夜。

(5)挑选阳性克隆6-8个，进行BamH I和Hind III酶双酶切鉴定。连接正确的质粒即为上述融合蛋白表达载体，含有该载体的BL21(DE3)大肠杆菌细胞即为上述表达融合蛋白的宿主细胞。

(6)将上述表达融合蛋白的BL21(DE3)宿主细胞37℃培养至OD值0.6左右，用1mmol/L的IPTG37℃诱导3-4小时；离心收集菌体，加入细胞裂解液，置冰上超声破碎菌体；离心20取上清，使用HisPur^TMNi-NTA Superflow Agarose镍离子亲和层析柱纯化带有His标签蛋白的重组融合蛋白。洗脱的融合蛋白用PBS透析后，测定蛋白浓度，放置-20℃保存备用。

在本发明公开了抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易通过基因工程技术、化学合成等方法得到本发明的抗人血清白蛋白纳米抗体，其相应的制备方法均属于本发明的保护范围。

本发明具有以下有益效果：本发明提供的抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白具有与人血清白蛋白特异性结合的活性，亲和力较高，可有效延长药物半衰期，同时不影响IL-2的生物活性；同时，由于药物在体内的停留和作用时间延长，可以减少药物的使用剂量，大大降低药物的毒副作用；融合的纳米抗体具有分子量小，性质稳定，免疫原性小，易于加工合成等特点。

附图说明

图1.抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白结构示意图。

图2.pMAL-c5x/抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白表达载体图谱。

图3.抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白纯化电泳图。

图4.融合蛋白与人血清白蛋白相互作用曲线图。

图5.融合蛋白中IL-2与单纯IL-2生物学活性比对。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优先实施方案进行描述，但是应该理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是本发明权利要求的限制。

实施例1、抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白的制备

(1)融合蛋白的设计如图1所示，抗人血清白蛋白纳米抗体与人IL-2蛋白的N端融合，融合蛋白N末端为MBP蛋白标签，C末端为His标签，MBP与纳米抗体之间含有TEV蛋白酶切位点。抗人血清白蛋白纳米抗体与人IL-2融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)按照上述SEQ ID NO.2所示的序列，合成编码上述融合蛋白的核酸分子。同时，在该核酸分子的5’端添加BamH I酶切位点(GGATCC)，3’端添加Hind III酶切位点(AAGCTT)。

(3)使用pMAL-c5x原核表达质粒作为融合蛋白表达载体，其图谱如图2所示。该表达载体和上述融合蛋白的核酸分子片段使用BamH I和Hind III酶双酶切，酶切条件为：DNA1μg，10X缓冲液5μL，BamH I和Hind III酶各1μL，加水至50μL，37℃水浴20分钟后80℃灭活10分钟，跑胶后回收片段。

(4)载体与片段连接：载体50μg，片段40μg，T4连接酶1μL，10X缓冲液2μL，加水至20μL，室温1小时。

(5)取5μL连接产物，加入50μL融化的BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，冰上放置30分钟，42℃热休克30秒，冰上修复5分钟，加入2mL SOC培养基37℃培养1h。离心收集细胞，弃大部分上清，留100μL左右上清，吹打混匀后均匀涂于氨苄西林阳性的LB琼脂培养板上，37℃培养过夜。

(6)挑选阳性克隆6-8个，于2mL氨苄西林阳性的LB培养基中37℃培养过夜，取1mL提取质粒，用BamH I和Hind III酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。连接正确的质粒即为上述包含编码融合蛋白核酸分子的载体，含有该载体的BL21(DE3)大肠杆菌细胞即为上述宿主细胞。

(7)选取双酶切鉴定正确的宿主细胞，于2mL氨苄西林阳性的LB培养基中37℃培养过夜。按1:100将菌液稀释到氨苄西林阳性的LB培养基中，37℃培养至OD值0.6左右，加入IPTG至1mmol/L，37℃培养3-4小时。

(8)离心收集菌体，用PBS清洗一次，离心收集菌体。用含有1％Triton X-100的PBS10mL吹打混匀菌体，置冰上超声破碎菌体，超声5s，间隔5s，功率20％，共计10分钟。

(9)将破碎的菌液10000g 4℃离心20分钟，取上清，使用HisPur^TMNi-NTASuperflow Agarose镍离子亲和层析柱纯化带有His标签蛋白的重组融合蛋白。洗脱的融合蛋白用PBS透析后，测定蛋白浓度，放置-20℃保存备用。

(10)取10ug纯化的融合蛋白，用5IU的TEV蛋白酶酶切，SDS-PAG凝胶电泳鉴定纯化的融合蛋白及酶切效果，结果如图3所示。

实施例2、融合蛋白与人血清白蛋白相互作用

采用GE Biacore X100生物大分子相互作用分析仪检测纯化的融合蛋白与人血清白蛋白的亲和力。

(1)插入一个新的BIAcore CM-5葡聚糖芯片。

(2)用PBS作为工作液以持续流动系统平衡系统。

(3)确定最佳缓冲条件和浓度，使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的人血清白蛋白和融合蛋白最小化。

(4)插入一张新的芯片。

(5)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的情况下通过注入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化葡聚糖羧酸酯。

(6)在低pH的乙酸钠缓冲液中注入融合蛋白，使得葡聚糖上存在足够的蛋白量。

(7)乙醇胺处理封闭所有没有反应活化的羧酸酯。

(8)在步骤(3)中确定的缓冲液条件和浓度范围内注入含有已知浓度的人血清白蛋白。

(9)用实验方法确定再生条件，使人血清白蛋白能够完全从共价结合的融合蛋白上解离。

(10)如果有必要的话，插入一张新的芯片。

(11)在最适的缓冲液条件和配体密度下重复步骤(2)、(5)、(6)、(7)和(8)中的操作，使用至少三种不同浓度的人血清白蛋白。

(12)用BIA评估软件point-and-click，计算分离率和结合率常数。用三个靶蛋白浓度所得的结合率和分离率的平均值计算平衡常数。结果如图4所示，其结合的Kd值为162pM。

实施例3、融合蛋白中IL-2生物学活性检测

通过检测融合蛋白对IL-2敏感细胞株CTLL-2细胞的增殖作用，来检测融合蛋白中IL-2的生物学活性，并与单纯的IL-2蛋白做对比。

(1)CTLL-2细胞制备：取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用RPMI-1640培养液离心洗涤2次，每次400g离心5分钟，再用10％FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×10⁵/mL。

(2)加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1mL。同时将融合蛋白和IL-2蛋白分别从2μg/mL和1μg/mL做倍比稀释，每孔加入0.1mL，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔(100μL细胞+100μL培养液)。37℃，5％CO2孵育40小时。

(3)MTT掺入：轻轻吸取上清液100μL，加MTT(1mg/mL)100μL，37℃，5％CO2孵育2小时。

(4)测定：离心培养板，1600g 5分钟，吸弃上清液，每孔加100μL DMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值。

(5)如图5所示，融合蛋白中的IL-2生物学活性与单纯IL-2相比无差异，说明与抗人血清白蛋白纳米抗体融合不影响IL-2的生物学活性。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东民康生物科技有限公司

杭州重链科技有限公司

<120> 抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白及制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工重组合成(Unknow)

<400> 1

Met Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gln Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Arg Ser Phe Thr

20 25 30

Thr Asn Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Phe Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Gly Gly Leu Gly Tyr Val Ala Asp Ser

50 55 60

Met Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Lys Asp Thr Met Ile

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Lys Thr Ser Thr Thr Ala Thr Glu Ala Thr Met Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly His Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Glu Pro Lys Thr Pro

115 120 125

Lys Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr

130 135 140

Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu

145 150 155 160

Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys

165 170 175

Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr

180 185 190

Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu

195 200 205

Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg

210 215 220

Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser

225 230 235 240

Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val

245 250 255

Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr

260 265 270

Leu Thr His His His His His His

275 280

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 2

atggcagatg ttcagctggt tgaaagcggt ggtggtctgg ttcagcctgg tcagagcctg 60

cgtctgagct gtgcagcaac cggtcgtagc tttaccacca atgcaatggc atggtttcgt 120

cagtttccgg gtaaagaacg tgaatttgtt gcagcaatta gctggggtgg cctgggttat 180

gttgcagata gcatgcgtgg tcgttttacc attagccgtg ataccaaaga taccatgatt 240

ctgcgtctgt caagcctgaa acgtgaagat accgcaatct attattgtgc agcacgtaaa 300

accagcacca ccgcaaccga agcaaccatg tatgcatatt ggggtcatgg cacccaggtt 360

accgttagcg aaccgaaaac accgaaagaa ttcggtggtg gaggctctgg agggggcggt 420

tcggcaccta cttcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 480

gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 540

ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 600

gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactttcac 660

ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 720

gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 780

agatggatta ccttttgtca aagcatcatc tcaacactaa ctcatcatca tcatcaccat 840

Claims

1.一种抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述一种抗人血清白蛋白纳米抗体与IL-2融合蛋白的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1所述融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含pMAL-c5x骨架载体和权利要求2编码融合蛋白的核酸分子。

4.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述表达融合蛋白的BL21(DE3)宿主细胞，通过脂质体转染的方式将上述融合蛋白表达载体转入BL21(DE3)细胞。

5.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)按照SEQ ID NO.2所示的序列，合成编码融合蛋白的核酸分子，并在5’端添加BamHI酶切位点(GGATCC)，3’端添加Hind III酶切位点(AAGCTT)；

(3)使用BamH I和Hind III酶双酶切pMAL-c5x表达载体和融合蛋白的核酸分子片段，并通过凝胶电泳回收片段；

(4)使用T4连接酶连接双酶切的载体与核酸分子片段；

(5)取5μL连接产物，加入50μL融化的BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，在冰上进行细胞转化，并将转化好的细胞37℃培养1小时后，均匀涂于氨苄西林阳性的LB琼脂培养板上，37℃培养过夜；

(6)挑选阳性克隆6-8个，进行BamH I和Hind III酶双酶切鉴定，连接正确的质粒即为上述融合蛋白表达载体，含有该载体的BL21大肠杆菌细胞即为表达融合蛋白的宿主细胞；

(7)将上述表达融合蛋白的BL21宿主细胞37℃培养至OD值0.6左右，用1mmol/L的IPTG37℃诱导3-4小时，离心收集菌体，加入细胞裂解液，置冰上超声破碎菌体，离心20取上清，使用HisPur^TMNi-NTA Superflow Agarose镍离子亲和层析柱纯化带有His标签蛋白的重组融合蛋白，洗脱的融合蛋白用PBS透析后，测定蛋白浓度，放置-20℃保存备用。