CN114656557A - 一种血清铁蛋白特异性纳米抗体及其elisa方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血清铁蛋白特异性纳米抗体，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb70、纳米抗体Nb72、纳米抗体Nb151、纳米抗体Nb106或纳米抗体Nb117中的至少一种。本发明所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体可用于人体血清中血清铁蛋白特异性纳米抗体的制备和检测体系构建。

Description

一种血清铁蛋白特异性纳米抗体及其ELISA方法
技术领域
本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种血清铁蛋白特异性纳米抗体及其ELISA方法。
背景技术
铁蛋白(ferritin)是广泛存在于几乎所有生命体中的储铁蛋白，具有储存和转化铁、维持细胞铁代谢平衡以及保护细胞免受氧化损伤等功能。血清铁蛋白是铁储量的标志，与血红蛋白浓度一起，可用于识别缺铁性贫血，这种疾病具有巨大的健康负担，会造成孕产妇认知障碍、健康和生产力下降。同时，也可以用于多种疾病的诊断，包括肝炎、肝癌及乳腺癌等，由于铁蛋白浓度被广泛地用作铁储存和状态的标志，所以构建常用的评估铁蛋白浓度的方法来检测铁状态(缺铁、补充和超负荷)是很重要的。
在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)。克隆并表达重链抗体的重链可变区得到重链抗体的抗原识别和结合域，称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体与传统的单克隆抗体相比，其稳定性极高，能够在高温、强酸、强碱等环境中保持其原有性质，能够长期稳定储存。而且，其制备成本低，更适用于原核及真核系统表达。
传统单克隆抗体制备周期长，成本高，纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种血清铁蛋白特异性纳米抗体及其ELISA方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种血清铁蛋白特异性纳米抗体，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb70、纳米抗体Nb72、纳米抗体Nb151、纳米抗体Nb106或纳米抗体Nb117中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb70：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
对于纳米抗体Nb72：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
对于纳米抗体Nb151：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
对于纳米抗体Nb106：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
对于纳米抗体Nb117：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步，所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4；
对于纳米抗体Nb70：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
对于纳米抗体Nb72：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
对于纳米抗体Nb151：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
对于纳米抗体Nb106：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于纳米抗体Nb117：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
进一步，所述的纳米抗体Nb70的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述的纳米抗体Nb72的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
所述的纳米抗体Nb151的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
所述的纳米抗体Nb106的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
所述的纳米抗体Nb117的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在血清铁蛋白免疫检测中的应用。
所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在缺铁性贫血、营养性贫血、炎症性疾病、肝硬化或恶性肿瘤检测中的应用。
进一步，所述的恶性肿瘤为肝癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌或白血病中的一种；所述的炎症性疾病为肝炎。
所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在制备ELISA检测试剂盒中的应用。
所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的双抗夹心ELISA方法，包括如下步骤：将带有His和HA标签的特异性纳米抗体作为捕获抗体，将生物素化抗体作为检测抗体，在捕获抗体中加入脱脂乳粉与血清铁蛋白，然后加入所述的检测抗体进行显色后即成。
进一步，所述的生物素化抗体由包括如下步骤的方法制成：将带有HA-和His-标签的特异性纳米抗体与生物素按照摩尔比为1：20混合均匀，常温下振荡1小时，纳米抗体偶联生物素后即为生物素化抗体。
进一步，所述的显色步骤采用HRP标记的链霉素亲和素、TMB为底物进行显色。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体可用于人体血清中血清铁蛋白特异性纳米抗体的制备和检测体系构建。
本发明所述的ELISA方法用于高灵敏快速检测血清中的痕量血清铁蛋白。
附图说明
图1为本发明实施例所述的血清铁蛋白的凝胶电泳图；
图2为本发明实施例所述的纳米抗体吸光度(OD405)柱状图；
图3为本发明实施例所述的纯化后的纳米抗体的凝胶电泳图；
图4为本发明实施例所述的纯化后的纳米抗体的蛋白印迹图；
图5为本发明实施例所述的抗体对筛选结果图；
图6为本发明实施例所述的抗体对浓度筛选结果图；
图7为本发明实施例所述的双抗夹心ELISA方法标准曲线图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1基于血清铁蛋白的羊驼免疫和纳米抗体库构建
将血清铁蛋白对羊驼进行免疫以在其外周血中产生相应抗体。每次取0.1mg血清铁蛋白免疫羊驼，每次免疫前需将蛋白与弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂按照体积比为1：1混合均匀并充分乳化。共免疫6次，第6次免疫完成后，间隔3天，采集羊驼颈静脉血液。采用密度梯度离心法，通过SepMateTM离心管(STEMCELL Technologies)密度梯度离心分离出淋巴细胞，并加入TRIzolTM试剂(Invitrogen)提取总RNA，进而以RNA为模板反转录合成cDNA。通过巢式PCR大量扩增VHH基因片段。一轮PCR以cDNA为模板，以CALL001和CALL002为引物，扩增VHH和CH2区域之间的片段，扩增完成后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离两个扩增产物，切取700bp处的电泳条带，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)进行回收。二轮PCR以一轮PCR产物为模板，以带有SapⅠ酶切位点的引物进行扩增，扩增产物通过PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。纯化后的PCR产物与质粒pMECS-gg混合均匀，并添加SapⅠ酶和T4DNA连接酶，在酶切的同时将基因连接到载体上。重组质粒通过苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)纯化，然后电转至大肠杆菌TG1感受态细胞(Lucigen)中。电转后的细胞涂布培养于添加氨苄抗生素的LB琼脂平板上，取少量细胞梯度稀释后涂布培养于添加氨苄抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置过夜培养。次日，通过稀释度平板计数计算文库库容量及多样性。计算完成后，随机挑取平板上48个单菌落，以MP57和GIII为引物进行PCR，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳计算菌落VHH片段的正确插入率。同时用细胞刮刀收集LB琼脂平板上的菌落，重悬于添加了100％甘油的LB培养基中，分装后于-80℃保存。
实施例2特异性纳米抗体的筛选和鉴定
取1ml含有纳米抗体文库的TG1细胞于4℃条件下解冻，然后加入到300ml含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的2×TY培养基中，37℃培养1.5h，待其OD600达到2.0时，在室温下用-1012VCSM13辅助噬菌体侵染TG1细胞30min。侵染完成后，离心收集TG1细胞，并使用1ml含有100μg/ml氨苄青霉素和70mg/ml卡那霉素的2×TY培养基重悬后添加至300ml相同培养基中于37℃过夜培养。离心去除TG1细胞沉淀，将含有噬菌体的上清液与预冷的PEG/NaCl混合均匀从而使噬菌体沉淀下来。通过离心收集噬菌体颗粒并用1ml无菌PBS重悬，并测量其浓度。96孔板中包被溶解于PBS的血清铁蛋白孔为“+”孔，另包被了PBS作为阴性对照，即为“-”孔。4℃过夜后，每孔添加200μl 3％乳粉在室温下封闭2h，然后用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤数次后，将收集到的噬菌体颗粒分别添加至“+”“-”孔中，室温下结合1h。
然后用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤10次(第2轮和第3轮分别洗涤20次)，以去除未结合的噬菌体。每孔添加100μl三乙胺(100mM TEA，pH 11.0)洗脱结合的噬菌体，然后用100μlTris-HCl(1.0M，pH 7.4)进行中和并转移到预先标记的无菌离心管中。96孔板中选取一列每孔添加90μl无菌PBS，吸取10μl收集到的噬菌体从上到下依次进行10倍梯度稀释，最终稀释至10-7。96孔板中选取一列添加90μl指数生长期的TG1细胞，然后吸取10μl各稀释度噬菌体添加至其中进行侵染。30分钟后，将10μl系列稀释的TG1细胞液涂布于LB琼脂平板上，37℃培养过夜。同时，剩余的噬菌体颗粒感染TG1细胞用于重新扩大培养，以进行下一轮的淘选准备。经过连续三轮淘选，淘选出对抗原具有高亲和力的TG1细胞。
于96孔板中每孔添加100μl含有2％(w/v)葡萄糖，10％(w/v)甘油和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基，从三轮淘选获得的生长于LB琼脂平板上的菌落中随机挑选200个单菌落接种于该96孔平板中，37℃过夜培养。取无菌的2ml深孔板(Axygen)，每孔添加1ml含0.1％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素2×TY培养基并做好标记，将10μl过夜培养的菌液添加至2ml深孔板对应标记的孔中。在37℃下振荡培养3-4h，直到OD600达到1左右，然后在孔中加入终浓度为1mM的IPTG，继续振荡培养4h以进行纳米抗体诱导表达。将2ml深孔板在4℃条件下离心以去除上清，然后放置-80℃冰箱中通过冻融法获得含纳米抗体的周质提取物。通过ELISA评估和挑选特异性的菌株。96孔酶标板(Corning)中每孔包被0.1μg血清铁蛋白作为阳性孔，同时包被PBS作为阴性对照孔。将100μl可溶性提取物分别加入阳性孔和阴性孔，室温下孵育1h。经PBST洗涤数次后，3％乳粉封闭1h。之后每孔分别添加100μl以1:5000稀释的Mouse anti-His MAb(Invitrogen)作为一抗，室温下孵育1h。然后添加1:5000稀释的带有碱性磷酸酶标记的Goat anti-Mouse MAb(Invitrogen)作为二抗，室温下孵育1h。经PBST洗涤数次后，加入显色剂，分别于5min，15min，30min，60min测定OD405并选择符合要求的菌落(阳性孔OD值至少为阴性孔的2倍)，结果如图2所示。随后，从这些阳性菌株中提取质粒并测序，根据测序结果挑选出序列不同的特异性菌株用于后续纳米抗体表达，同时于-80℃留存菌种。
实施例3特异性纳米抗体的表达与纯化
将筛选出的具备不同纳米抗体序列的阳性菌株的质粒，通过电转法电转化进入大肠杆菌WK6细胞，并涂布培养于具备氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上。随机挑取WK6单菌落接种于330ml含2mM MgCl2，0.1％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中，37℃摇床中培养2-3h。经测定其OD600达到0.6左右时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导纳米抗体表达，并在28℃下进一步过夜培养。次日，将过夜诱导的菌液分装至各离心瓶，离心收集菌体，向菌体中加入TES提取液，通过渗透压休克法获得含纳米抗体的周质提取物。利用固定化金属亲和层析(IMAC)进行纳米抗体纯化。由于纳米抗体携带His标签，可与HisPurTM Ni-NTA树脂中的Ni2+紧密结合，因此将提取液与预处理过的HisPurTM Ni-NTA树脂(Thermo-Scientific)于4℃条件下结合1h,然后将提取液装载到PD-10柱(GE Healthcare)上，通过PBS洗涤去除非特异性组分，通过500mM咪唑洗脱树脂中与Ni2+紧密结合的His-标签蛋白。收集洗脱组分，通过尺寸排阻色谱(SEC)进一步去除杂蛋白及咪唑。纯化后的纳米抗体经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定，结果如图3-4所示。
实施例4特异性纳米抗体靶向过敏原的确证
利用免疫共沉淀(Co-IP)对特异性纳米抗体的靶向蛋白进行确证。纳米抗体与血清铁蛋白混合均匀后于室温下孵育1h,形成抗体-抗原复合物，然后加入预先处理过的HisPurTM Ni-NTA磁珠(Thermo-Scientific)，室温下孵育1h。纳米抗体以His-tag与磁珠结合,形成磁珠-抗体-抗原复合物。通过磁力架收集磁珠，洗涤液(含30mM咪唑的PBST；pH8.0)洗涤2次后，加入25μl洗脱缓冲液(含250mM咪唑的PBS；pH 8.0)室温下振荡孵育15min，通过磁力架分离获得纳米抗体的靶向蛋白。经非还原条件下SDS-PAGE蛋白电泳对复合物进行分离，观察条带位置，与血清铁蛋白进行比对。
实施例5纳米抗体的配对筛选
取100μg纯化获得的带有HA-和His-标签的特异性纳米抗体与生物素按照摩尔比为1：20混合均匀，常温下振荡1小时，此时该纳米抗体上成功偶联生物素，称为生物素化抗体。将HA-和His-标签的特异性纳米抗体作为捕获抗体，将生物素化抗体作为检测抗体，以此为准，将所有抗体两两配对筛选出最合适的抗体对，结果如图5所示。其中，1：5000稀释的HRP标记的链霉素亲和素作为显色抗体，并用TMB为底物进行显色并测定OD450。挑选合适的抗体对进行后续方法建立。
实施例6双抗夹心ELISA方法条件的优化
根据筛选的捕获和检测用纳米抗体对，进行纳米抗体浓度优化。将不同浓度的捕获抗体进行包被，通过与血清铁蛋白孵育后，将不同浓度的生物素化抗体孵育，用1：5000稀释的HRP标记的链霉素亲和素作为显色抗体，并用TMB为底物进行显色并测定OD450，确定捕获抗体与检测抗体的应用浓度，结果如图6所示。
实施例7双抗夹心ELISA方法的构建
取带有HA-和His-标签的纳米抗体用PBS稀释至优化好的浓度，，4℃过夜包被在96孔板中。经PBST洗涤5次后，每孔加入200μl 3％脱脂乳粉，室温封闭1h。经PBST洗涤五次后，将稀释在PBS中的100μl血清铁蛋白(0.5μg/ml)加入孔中，阴性对照为每孔加入100μlPBS，室温孵育1h。随后加入生物素化纳米抗体作为检测抗体，PBST洗涤后，将100μl 1:5000稀释的HRP标记的链霉素亲和素作为显色抗体，于室温下孵育1h。最后，经PBST洗涤数次后并拍干后，加入TMB显色液，用酶标仪测定450nm处的吸光度OD450。
实施例8双抗夹心ELISA方法标准曲线的建立
根据优化的条件，构建基于纳米抗体双抗夹心ELISA检测方法并测定血清铁蛋白的标准曲线。将血清铁蛋白按一定的浓度比例稀释，以抗原浓度的对数值为横坐标，对应OD450值为纵坐标绘制曲线，结果如图7所示。根据绘制的曲线选取最佳的线性范围，检测限(LOD)为空白孔平均值加上三倍标准偏差(SD)所对应曲线上的浓度值，定量限(LOQ)为空白孔平均值加上十倍标准偏差(SD)所对应曲线上的浓度值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种血清铁蛋白特异性纳米抗体及其ELISA方法
<130> 2022.3.22
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
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Tyr Tyr Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Claims (10)

1.一种血清铁蛋白特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb70、纳米抗体Nb72、纳米抗体Nb151、纳米抗体Nb106或纳米抗体Nb117中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb70：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
对于纳米抗体Nb72：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
对于纳米抗体Nb151：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
对于纳米抗体Nb106：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
对于纳米抗体Nb117：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
2.根据权利要求1所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4；
对于纳米抗体Nb70：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
对于纳米抗体Nb72：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
对于纳米抗体Nb151：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
对于纳米抗体Nb106：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于纳米抗体Nb117：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
3.根据权利要求2所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体，其特征在于：所述的纳米抗体Nb70的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述的纳米抗体Nb72的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示；
所述的纳米抗体Nb151的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
所述的纳米抗体Nb106的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示；
所述的纳米抗体Nb117的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在血清铁蛋白免疫检测中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在缺铁性贫血、营养性贫血、炎症性疾病、肝硬化或恶性肿瘤检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的恶性肿瘤为肝癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌或白血病中的一种；所述的炎症性疾病为肝炎。
7.权利要求1-3中任一项所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在制备ELISA检测试剂盒中的应用。
8.权利要求1-3中任一项所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的双抗夹心ELISA方法，其特征在于：包括如下步骤：将带有His和HA标签的特异性纳米抗体作为捕获抗体，将生物素化抗体作为检测抗体，在捕获抗体中加入脱脂乳粉与血清铁蛋白，然后加入所述的检测抗体进行显色后即成。
9.根据权利要求8所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述的生物素化抗体由包括如下步骤的方法制成：将带有HA-和His-标签的特异性纳米抗体与生物素按照摩尔比为1：20混合均匀，常温下振荡1小时，纳米抗体偶联生物素后即为生物素化抗体。
10.根据权利要求8所述的血清铁蛋白特异性纳米抗体的制备方法，其特征在于：所述的显色步骤采用HRP标记的链霉素亲和素、TMB为底物进行显色。
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