CN112321709B - 澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体及其应用，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb58、纳米抗体Nb68、纳米抗体Nb81、纳米抗体Nb135、纳米抗体Nb139或纳米抗体Nb181中的至少一种。本发明所述的一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高，可用于免疫检测体系的构建。

Description

澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体及其应用。
背景技术
传统食物过敏原组分的免疫检测技术开发基于单克隆或多克隆抗体的筛选与制备，其要求在动物免疫过程中注射高纯度过敏原蛋白，并且筛选和制备抗体周期较长。在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)。克隆并表达重链抗体的重链可变区得到重链抗体的抗原识别和结合域，称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体具有与原重链抗体相当的结构稳定性及抗原结合活性，是目前已知的可结合靶向抗原的最小抗体单位。传统免疫过程需要制备高纯度过敏原蛋白，并且传统单克隆抗体制备周期长，成本高，与传统单克隆抗体片段相比，纳米抗体存在诸多优势。纳米抗体可溶性极高，不易发生聚集沉淀，具有很高的稳定性，能够在高温、强酸、强碱等致变性条件下保持抗原结合活性，适合于原核及真核表达系统。目前，纳米抗体被广泛应用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)、亲和纯化基质、免疫学研究等基础科学研究领域。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体及其应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb58、纳米抗体Nb68、纳米抗体Nb81、纳米抗体Nb135、纳米抗体Nb139或纳米抗体Nb181中的至少一种。
进一步，所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb58：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
对于纳米抗体Nb68：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
对于纳米抗体Nb81：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
对于纳米抗体Nb135：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；
对于纳米抗体Nb139：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；
对于纳米抗体Nb181：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；
所述的特异性纳米抗体的4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
进一步，所述的纳米抗体Nb58的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示；所述的纳米抗体Nb68的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述的纳米抗体Nb81的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；所述的纳米抗体Nb135的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述的纳米抗体Nb139的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述的纳米抗体Nb181的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。
所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在食品过敏原免疫检测中的应用。
所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在食品过敏原表位鉴定中的应用。
所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在基于抗体的过敏原纯化和示踪的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高，可用于食物组分中过敏原特异性纳米抗体的制备和检测体系构建，能够开发食品中痕量过敏原的高灵敏快速检测体系。
附图说明
图1为本发明实施例所述的澳洲坚果总蛋白质的电泳图；
图2为本发明实施例所述的澳洲坚果过敏原纳米抗体富集度的柱状图；
图3为本发明实施例所述的酶联免疫反应筛选结果的柱状图；
图4为本发明实施例所述的澳洲坚果过敏原纳米抗体纯化的曲线图；
图5为本发明实施例所述的澳洲坚果过敏原纳米抗体的蛋白电泳图；
图6为本发明实施例所述的纯化的澳洲坚果过敏原纳米抗体的免疫印迹图；
图7为本发明实施例所述的纳米抗体特异性鉴定的电泳图；
图8为本发明实施例所述的纳米抗体靶向澳洲坚果过敏原蛋白电泳图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
1、澳洲坚果总蛋白的提取
称取100g生澳洲坚果并破碎至糊状，用500ml正己烷在磁力搅拌器搅拌24h的条件下进行脱脂，之后通过真空抽滤装置去除液体并在通风橱中挥发残留的正己烷，得到去除油脂的蛋白粉末。用纯水以液料比为50:1(V:M)在磁力搅拌器下搅拌进行溶解，并通过NaOH(1M)调节溶液pH值至9.0，在室温下磁力搅拌4h后离心取上清液。得到的上清液用HCl(1M)调节pH值至4.5，再次离心取沉淀。用去离子水溶解沉淀物并调节pH值至7.0。最后真空冻干得到macadamia(澳洲坚果)总蛋白，测蛋白得率，并采用SDS-PAGE凝胶电泳进行表征，如图1所示。
2、基于总蛋白的羊驼免疫和纳米抗体库构建
使用提取的macadamia总蛋白进行羊驼免疫，每次免疫0.5mg蛋白，每隔一周进行一次免疫，总共免疫6次。在最后一次免疫结束3-4天后，从羊驼颈静脉采集900ml血液。通过SepMateTM离心管(STEMCELL Technologies)密度梯度离心分离出淋巴细胞，之后通过TRIzolTM试剂(Invitrogen)从淋巴细胞中提取总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA。然后通过巢式PCR获得VHH片段。第一次PCR以CALL001和CALL002为引物，扩增VHH和CH2区域之间的片段，通过1％琼脂糖凝胶获得两个主要的PCR产物，并用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)切取较短片段(约700bp)进行回收纯化。第二次PCR用带有NotI和PstI限制酶位点的引物PMCF和A6E对第一次PCR回收产物扩增得到VHH片段并通过PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。将得到的PCR产物与pMECS质粒载体用NotI和PstI限制性内切酶(NEB)酶切后，在T4DNA连接酶(Thermo Scientific)的作用下进行连接形成重组质粒。重组质粒通过苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)纯化后，用GenePulser XcellTM电穿孔仪(BIO-RAD)转化至大肠杆菌TG1感受态细胞(Lucigen)中。将转化后细胞接种于添加氨苄抗生素的LB琼脂平板上，在37℃下倒置培养过夜。第二天用刮板对LB平板上的菌株进行收集，重悬于加入20％甘油的LB液体培养基中，并于-80℃冻存。同时通过梯度稀释和平板计数，计算文库的库容量。并用引物MP57和GIII对22个随机选择的菌落进行VHH片段正确插入率的测定。
3、特异性纳米抗体的筛选和鉴定
利用VCSM13辅助噬菌体进行了三轮淘选。将含有纳米抗体文库的1ml TG1细胞加入到300ml含1％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基中，37℃培养2h，然后在室温下用～1012VCSM13辅助噬菌体侵染TG1细胞30min。离心收集侵染后的TG1细胞，并于300ml含有100μg/ml氨苄青霉素和70mg/ml卡那霉素的2×TY培养基中重悬。37℃培养过夜后，离心去除TG1细胞沉淀，用PEG/NaCl沉淀上清液中的噬菌体颗粒，然后再用1ml无菌PBS进行重悬。采用96孔板(Corning)进行淘选时，“+”孔以5μg macadamia蛋白溶解于PBS中并在4℃包被过夜，而作为阴性对照的“-”孔则在每轮淘洗中只用PBS包被进行对照。第二天，用3％的脱脂乳粉在室温下封闭1h，然后用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤10次(第2轮和第3轮分别洗涤20次)，以去除未结合的噬菌体。结合的噬菌体用100μl三乙胺(100mMTEA，pH 11.0)洗脱10min，并用100μl Tris-HCl(1.0M，pH 7.4)进行中和并转移到一个无菌的离心管中。接下来取10μl收集到的噬菌体在96孔板中按从上到下的顺序用PBS进行10倍稀释至10-7，然后将等量不同稀释度的噬菌体加入到含有90μl已培养至指数生长期的TG1细胞的孔中进行侵染。孵育30分钟后，将10μl系列稀释的TG1细胞液涂布于LB琼脂平板上，37℃培养过夜。同时，剩余的噬菌体颗粒感染TG1细胞用于重新扩大培养，以进行下一轮的淘选准备。经过连续三轮淘选，淘选出对抗原具有高亲和力的TG1细胞。
从3轮淘洗中随机挑选190个个体菌落，使用96孔板在添加10％(w/v)甘油，2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基中，37℃下过夜静置培养。之后将10μl的培养液转移到2ml深孔板(Axygen)中，并接种1ml含0.1％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素2×TY培养基。深孔板在37℃下继续振荡培养3-4h，直到OD600达到1左右，然后在孔中加入终浓度为1mM的IPTG，进行纳米抗体诱导表达。继续振荡
培养4h后，通过冻融法获得含纳米抗体的周质提取物，并用ELISA评估和挑选特异性的菌株。即将每个孔100μl可溶性提取物分别加入含2.5μg macadamia蛋白的阳性孔和另一个以PBS为阴性对照的孔中进行1h的室温孵育。3％脱脂乳粉封闭后分别孵育100μl以1:3000稀释的Mouse anti-His MAb(Invitrogen)作为一抗，以及1:3000稀释的带有碱性磷酸酶标记的Goat anti-Mouse MAb(Invitrogen)作为二抗。加入显色剂后5min，15min，30min，60min测定OD405并选择符合要求的菌落(阳性孔OD值至少为阴性孔的2倍)。随后，对从这些阳性菌株中提取的质粒进行测序，挑选序列不用的特异性菌株。结果如图3所示。
4、特异性纳米抗体的表达与纯化
测序后，从TG1细胞中筛选出具有不同纳米抗体序列的pMECS阳性表达载体，电转化进入大肠杆菌WK6细胞，并在琼脂平板上培养。将WK6细胞培养在含有330ml含0.1％(w/v)葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素和2mM MgCl2的TB培养基中。37℃培养至OD600达到0.6-0.9时，加入1mM IPTG诱导纳米抗体表达，并在28℃下进一步过夜培养。第二天离心后，通过渗透压休克法获得含纳米抗体的周质提取物。利用固定化金属亲和层析(IMAC)进行纳米抗体纯化。即使用HisPurTM Ni-NTA树脂(Thermo-Scientific)将提取液装载到PD-10柱(GEHealthcare)上，在洗去非特异性组分后，用500mM咪唑洗脱树脂中与Ni2+紧密结合的His-标签蛋白。收集洗脱组分，并通过尺寸排阻色谱(SEC)进一步纯化。纯化的纳米抗体经SDS-PAGE和免疫印迹分析鉴定，结果如图4-6所示。
5、特异性纳米抗体靶向过敏原的确证
利用免疫共沉淀(Co-IP)和高分辨液质(LC-MS/MS)对特异性纳米抗体的靶向蛋白进行确证。用纳米抗体和Macadamia蛋白孵育形成抗体-抗原复合物，之后加入HisPurTMNi-NTA磁珠(Thermo-Scientific)以其与纳米抗体的His-标签结合并共孵育30min，经磁力架磁性分离收集磁珠，用洗涤缓冲液(含50mM咪唑的PBST；pH 8.0)洗涤4次后，加入25μl洗脱缓冲液(含250mM咪唑的PBS；pH 8.0)孵育10min后磁力架分离获得纳米抗体的靶向蛋白。经Western blot分析纳米抗体靶向蛋白的位置，经非还原条件下SDS-PAGE蛋白电泳对复合物进行分离，并根据Western blot结果切取靶向蛋白条带在胰蛋白酶消化后进行LC-MS/MS分析，结果用Sequest针对Uniprot DB进行序列比对确定过敏原蛋白为7S Vicilin种子储藏蛋白(MiAMP2)，或者称为macadamia过敏原蛋白Mac i 1，结果如图7-8所示。
6、纳米抗体亲和力测定
通过间接ELISA法测定纳米抗体亲和力。将溶于100μl PBS中的5μg macadamia蛋白4℃过夜包被在96孔板中。3％脱脂乳粉在室温下封闭1h后，分别加入100000，10000，1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.001，0nM浓度的梯度稀释纳米抗体，在室温下孵育1h。用anti-His MAb和HRP标记的Goat anti-Mouse MAb孵育后，以TMB为显色底物进行显色反应并在450nm测定吸光度。纳米抗体的亲和力以平衡解离常数(KD)即响应信号为最大值的一半时的纳米抗体浓度表示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体及其应用
<130> 2020.11.28
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Ala
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ile Tyr Asn Asn Gly Ile Thr
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Arg Ser Pro Gly Ser Val
1 5
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Arg Ala Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Arg Arg Leu Gly Gly Ser Thr
1 5
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<211> 16
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Ala Val Ser Glu Arg Tyr Arg Glu Phe Ser Arg Ala Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
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1 5 10 15
Ala
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Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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20 25 30
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35
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Tyr
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<211> 17
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Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val
1 5 10 15
Ala
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Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
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Ile Ser Arg Ser Gly Gly Arg Thr
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1 5 10 15
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
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20 25
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<212> PRT
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Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala
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Tyr Tyr Ser Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Ser Met Pro Val Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Leu Thr Phe Arg Ser Ser Leu Tyr Asp
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Met Ser Trp Ser Gly Asp Tyr Thr
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Ala Ala Gly Gly Asn Phe Arg Ala Thr Thr Trp Asn Pro Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 43
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Lys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ser Tyr Tyr Gly Gly Ile Ser Tyr Arg Gly
100 105 110
Asn Glu Ala Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Trp Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Tyr Asn Asn Gly Ile Thr Ser Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Pro Gly Ser Val Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 45
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Arg Arg Leu Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ser Glu Arg Tyr Arg Glu Phe Ser Arg Ala Gly Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Val Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu
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115 120
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Thr Phe Ala Asp Pro Gly
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 48
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Arg Ser Ser
20 25 30
Leu Tyr Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Pro Val Ala Ala Met Ser Trp Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ser Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Ser Met Pro Val Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Gly Gly Asn Phe Arg Ala Thr Thr Trp Asn Pro Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (5)

1.一种澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb58、纳米抗体Nb68、纳米抗体Nb81、纳米抗体Nb135、纳米抗体Nb139或纳米抗体Nb181中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb58：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
对于纳米抗体Nb68：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
对于纳米抗体Nb81：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
对于纳米抗体Nb135：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；
对于纳米抗体Nb139：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；
对于纳米抗体Nb181：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示；
所述的特异性纳米抗体的4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
2.根据权利要求1所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体，其特征在于：所述的纳米抗体Nb58的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示；所述的纳米抗体Nb68的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述的纳米抗体Nb81的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示；所述的纳米抗体Nb135的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述的纳米抗体Nb139的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述的纳米抗体Nb181的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。
3.权利要求1所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在澳洲坚果过敏原免疫检测中的应用。
4.权利要求1所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在澳洲坚果过敏原表位鉴定中的应用。
5.权利要求1所述的澳洲坚果过敏原Vicilin特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在基于抗体的澳洲坚果过敏原纯化和示踪的应用。
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Unbiased immunization strategy yielding specific nanobodies against macadamia allergen of vicilin-like protein for immunoassay development;Hu Y et al.;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20210421;第69卷(第17期);全文 *

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