CN113980127A

CN113980127A - 抗耐甲氧西林葡萄球菌的纳米抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113980127A
Application number: CN202111218647.8A
Authority: CN
Inventors: 马丁.卡弗瑞; 谈静泉
Original assignee: Nanjing Zhongai Artificial Intelligence And Life Sciences Research Institute Co ltd
Current assignee: Nanjing Zhongai Artificial Intelligence And Life Sciences Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2022-01-28

Abstract

本发明提供了一种靶向耐甲氧西林葡萄球菌LspA蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用。所提供的纳米抗体主要识别结合耐甲氧西林葡萄球菌LspA的结合基序区域，包括框架区FR和互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。其一种具体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所述纳米抗体能够高效、特异地与耐甲氧西林葡萄球菌LspA蛋白相结合，亲和力可达到纳摩尔级别；同时本发明提供的纳米抗体能够在耐甲氧西林葡萄球菌检测或由耐甲氧西林葡萄球菌引发的疾病中获得优异的效果，本发明可应用于生物、医学领域。

Description

抗耐甲氧西林葡萄球菌的纳米抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于纳米抗体筛选制备技术领域，特别是涉及一种抗耐甲氧西林葡萄球菌的纳米抗体及其制备方法和用途。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制。但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素具有耐药性。而在解决这一问题的过程中，科学家研究出了一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。

甲氧西林应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株，但英国的Jevons筛选发现了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)。MRSA从发现至2021年感染几乎遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。MRSA除对甲氧西林具有耐药性外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均具有耐药性，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量PABA等不同机制对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药性。

在耐甲氧西林葡萄球菌的生命周期中，脂蛋白的翻译后修饰成熟是至关重要的一个环节。这个过程依赖于脂蛋白信号肽酶(LspA)，它是负责脂蛋白信号肽切除的关键酶。因此，经由抑制LspA功能来阻断脂蛋白合成不仅消耗了必需脂蛋白以及毒性相关脂蛋白，而且还可以导致错误定位的未加工脂蛋白的聚集，它们均导致细菌细胞死亡。因此，LspA抑制剂提供了对抗革兰氏阴性细菌感染的新途径。

发明内容

本发明的目的是提供种抗耐甲氧西林葡萄球菌的纳米抗体及其制备方法和用途，从而弥补现有技术中对于抗耐甲氧西林葡萄球菌没有有效的抗菌制品的缺陷。

本发明首先提供一种抗LspA-MRSA蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体中包含有互补决定区和框架区；其中互补决定区包含有CDR1、CDR2和CDR3中的任一个或几个；

所述的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列信息如下：

CDR1序列：GSFFEFGT(SEQ ID NO:3)、

CDR2序列：ITGNDHR(SEQ ID NO:4)、

CDR3序列：NILEGQRWSNY(SEQ ID NO:5)；

所述的互补决定区，包含有CDR1和CDR2，或CDR1和CDR3，或CDR2和 CDR3，或包含CDR1、CDR2和CDR3。

所述的框架区，包含有FR1、FR2、FR3、FR4中的至少一个或几个；

其中FR1、FR2、FR3、FR4的序列信息如下：

FR1：QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:6)

FR2：VGWFRQAPGKQRELVSR(SEQ ID NO:7)

FR3：YYADSVKGRFTISRDNDETTVYLQMDSLKPEDTAIYHC(SEQ ID NO:8)

FR4：WGQGTQVTVS(SEQ ID NO:9)。

作为实施例的一种具体记载，所述的纳米抗体SA4的氨基酸序列如下：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFFEFGTVGWFRQAPGKQRELVSRITGND HRYYADSVKGRFTISRDNDETTVYLQMDSLKPEDTAIYHCNILEGQRWSNYWGQ GTQVTVS(SEQ ID NO:1)；

本发明中，与所述纳米抗体的氨基酸序列具有一定同一性的多肽也在本发明的保护范围内。如与所述纳米抗体具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上序列同一性且具有所述纳米抗体功能的抗体或抗体片段(具有90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性)。具体地，对所述纳米抗体经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1- 20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、 1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸得到的，且具有所述纳米抗体功能的多肽片段。

本发明另一方面还提供一种分离的核苷酸片段，所述的核苷酸片段编码上述的纳米抗体。

其中用于编码上述纳米抗体SA4的核苷酸片段，其序列如下：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCC TGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTCCTTCTTCGAGTTCGGCACAGTGGGCT GGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGCAGAGGGAGCTGGTGTCCAGGATCACCGG CAACGATCACAGATACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCA GGGACAACGACGAGACCACCGTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAAGCCTGA GGACACAGCCATCTACCACTGCAATATCCTGGAGGGCCAGAGGTGGTCCAATT ACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCC(SEQ ID NO:2)

本发明另一方面提供一种构建体，为插入有上述分离的核苷酸片段的表达载体。

在本发明某些实施方式中，所述构建体由所述分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

本发明另一方面提供一种纳米抗体的表达系统，所述表达系统含有构建体。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

在本发明某些实施方式中，宿主细胞选自E.coli MC1061细胞、BL21(DE3)细胞、Expi293细胞中的一种或多种的组合。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含在药学可接受的载体中，以及含有根据如上所述的纳米抗体中的一种或几种。

本发明还提供了一种检测试剂或检测试剂盒，其含有根据如上所述的纳米抗体。

本发明进一步提供了与所述纳米抗体相关的生物材料、衍生抗体等。

本发明进一步提供了一种抑制耐甲氧西林葡萄球菌信号肽酶LspA蛋白活性的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。

本发明进一步提供了一种预防和/或治疗耐甲氧西林葡萄球菌引起的疾病的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。

本发明进一步提供了一种非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。

本发明进一步提供了一种拮抗耐甲氧西林葡萄球菌LspA蛋白的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。

本发明进一步提供了一种所述纳米抗体与其他试剂或药物联合使用的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明分离并鉴定了一种能够特异识别和中和LspA-MRSA的纳米抗体(SA4)，对耐甲氧西林葡萄球菌的LspA蛋白具有高度特异的识别和结合能力，亲和力可达到Kd<1x10^-12M。

(2)本发明所述纳米抗体不易聚集，能耐高温、强酸、强碱具有结构和物化性质稳定性好的特点。

(3)本发明所述纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达、表达效率高，便于分离纯化，成本低。

因此，本发明所述纳米抗体识别结合机制清晰，能够在耐甲氧西林葡萄球菌检测、筛选诊断中获得优异的效果，或在预防和/或治疗耐甲氧西林葡萄球菌感染中发挥有效的免疫保护重要，可能在生物、医学领域中具备以下应用：I)在制备耐甲氧西林葡萄球菌抑制剂中的应用；II)在制备预防和/或治疗耐甲氧西林葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用；III)在非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析或在制备耐甲氧西林葡萄球菌的检测试剂或试剂盒中的应用；IV)在制备LspA-MRSA拮抗剂中的应用；V)与其他试剂或药物联合使用中的应用。

附图说明

图1显示为纳米抗体筛选技术流程。

图2显示为RBD抗原纯化结果。

图3显示为小羊驼mRNA提取样本检测及两轮PCR扩增纳米抗体基因序列结果。

图4显示为ELISA鉴定与RBD结合的纳米抗体。其中，横坐标各字母代表克隆编号。

图5显示为SA4-RBD的FSEC结果。

图6显示为SA4和阳性对照组(其他具有中和活性纳米抗体)中和实验结果。将SARS-Cov-2假病毒分别与不同浓度的SA4纳米抗体孵育后，再去感染VeroE6- hACE2细胞，流式检测细胞的感染比率。

图7显示为SA4亲和力测定结果。将2μg/mL生物素标记的RBD固定到SA传感器上，平衡后放到不同浓度的SA4溶液中，检测BLI信号。

图8显示为RBD-SA4复合物纯化及结晶结果。

具体实施方式

本发明通过体外重组表达耐甲氧西林葡萄球菌的LspA蛋白(说明书中简写为LspA-MRSA)对小羊驼进行免疫，然后分离出外周血淋巴细胞并抽提细胞的总 RNA，随后反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，用引物扩增出包含有潜在的纳米抗体的核酸片段，构建噬菌体文库。再经过生物淘汰筛选，FSEC相互作用筛选，假病毒中和活性验证以及高分辨率复合物晶体的解析等技术手段，分离获得抗 LspA-MRSA的纳米抗体。本发明还提供上述纳米抗体的氨基酸序列及其制备方法和用途，所提供的纳米抗体具有强的与耐甲氧西林葡萄球菌特异性结合的能力(Kd<1x10^-12M)，可应用于耐甲氧西林葡萄球菌的诊断和治疗。

对于本发明说明书中所涉及的词汇记载如下：

纳米抗体：自然界中(骆驼科和鲨鱼)存在一种天然缺失轻链，仅含有重链的抗体(重链抗体)。该类抗体的可变区约12-15kDa左右，可以识别结合抗原，且亲和力极高，是最小的活性抗原结合片段，因此也称为纳米抗体。纳米抗体具有分子量小、穿透性强、易于表达、易于基因改造以及易于结合多个表位等优点。因此此类抗体可作为一种有效检测或治疗抗体的候选者，且当前尚无针对耐甲氧西林葡萄球菌的上市纳米抗体检测试剂或药物。

本发明中，所述纳米抗体可以是多种抗体形式，包括但不仅限于完全抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体和遗传改造抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体或重组抗体、以及这些抗体的片段，条件是其保持本发明所述的性质；其中，所述抗体片段进一步定义为Fab'、Fab、F(ab')₂、单结构域抗体、Fv或scFv等。

“互补决定区”或“CDR”意指抗体分子的重链可变区或轻链可变区内三个高变区中的一个，其形成与被结合抗原的三维结构互补的N端抗原-结合面。从重链或轻链的N端开始，这些互补决定区分别表示为“CDR1”、“CDR2”以及“CDR3”。 CDR涉及抗原-抗体结合，且CDR3包含对抗原-抗体结合具有特异性的独特区域。因此，抗原-结合位点可包括六个CDR，其包含来自重链与轻链V区的每一个的 CDR区。

氨基酸序列互补决定区CDR1(互补区CDR1)，纳米抗体的第一段可变区序列；

氨基酸序列互补决定区CDR2(互补区CDR2)，纳米抗体的第二段可变区序列；

氨基酸序列互补决定区CDR3(互补区CDR3)，纳米抗体的第三段可变区序列。

本发明中，所述进一步包括框架区，所述框架区是任何能够实现本发明所述纳米抗体功能的框架区，包括人源的或鼠源的。

IC50:半抑制浓度，指定的生物过程(或该过程中的某个组分比如酶、受体、细胞等)抑制一半时所需的药物或者抑制剂的浓度。

FSEC:荧光分子筛，一种定性分析生物分子之间相互作用的实验手段

Kd:解离常数，反映的是物质之间的亲和力大小，值越小亲和力越强。

本发明对所述编码序列的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成方法即可。

本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的抗耐甲氧西林葡萄球菌看题可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识。

实施例1.LspA-MRSA蛋白的表达和纯化

将LspA-MRSA(uniport：P0DTC2，330-541位氨基酸)构建到pET28a载体上，阅读框编码序列从N端到C端分别是Honeybee Melittin分泌信号肽(KFLVNVALVFMVVYISYIYAA)，Gly-Ser连接序列，RBD目的蛋白序列，Gly-Ser 连接序列，3C蛋白酶切位点(LEVLFQGP)，Gly-Ser连接序列，Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)，Gly-Ser连接序列，和10×His标签。

RBD的表达是在Trichoplusia ni High Five悬浮细胞中进行分泌表达，收集表达后的上清，用0.22um滤膜过滤后，加入20mM咪唑，与3mL Ni-Smart beads填料(SA035100)混合，于4℃环境下搅拌孵育结合3小时。随后将上清-resin混合物加入到重力柱中，收集resin，用10个柱体积的加入20mM咪唑的缓冲液A(150mM NaCl,20mM Tris HCl pH 8.0)洗杂，然后用含有300mM咪唑的缓冲液A洗脱蛋白。

RBD抗原样品制备：将亲和纯化所样本按100：1的比例加入3C蛋白酶，4℃酶切16小时，然后通过分子筛(Superdex Increase 200 10/300GL)进一步分离纯化蛋白(图2)。将含有目的蛋白的部分混合到一起，浓缩到2mg/mL后分装，样本直接用于免疫或液氮速冻后保存在-80℃冰箱。

LspA-MRSA的生物素化标记：将0.8mg/mL LspA-MRSA与22ug/mL纯化的 BirA(生物素连接酶)混合到一起，加入5mM ATP，10mM醋酸镁，44μM生物素，混匀后，在4℃放置反应16小时，随后通过分子筛(Superdex Increase 200 10/300GL)进一步分离纯化蛋白。将含有目的蛋白的部分混合到一起，分装，液氮速冻后保存在-80℃冰箱中，用于噬菌体展示筛选。

实施例2.纳米抗体筛选

2.1羊驼免疫

免疫前，将实施例1中制备的免疫抗原(2mg/mL,500uL)与GERBU佐剂(GERBUAJUVANT P#3111)按体积比1:1混合，使之形成乳浊液，之后在羊驼颈部靠近弓淋巴结的位置分10个点皮下注射抗原-佐剂乳浊液，每隔2周进行一次加强免疫，总共进行4次免疫注射实验。第一次免疫前，采血3mL，室温凝血2h。室温3000 g离心5min，收集上清作为免疫前血清；第1至4次免疫后的血清也按照此法分别收集，之后通过ELISA法测定血清抗体效价。第4次免疫后，血清抗体的效价高于 10⁶，在EDTA包被的采血管中收集80ml血液。立即上下颠倒2次以抑制凝血。按照生产商的说明，用Ficoll Plus 1.077分离外周血淋巴细胞PBLs。

2.2噬菌体文库构建

利用RNAsio Plus(TaKaRa)裂解实施例2中的PBLs，并提取RNA(图3A)。然后利用试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme)制备cDNA。进一步通过两轮PCR获得VHH片段。其中，第一步PCR的引物为 CALL001(5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′)和CALL002(5′- GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′)，从cDNA中扩增所有免疫球蛋白的重链可变区，也就是包括普通抗体的重链可变区VH(1000bp)和重链抗体的可变区VHH (700bp)(图3B)。然后，通过琼脂糖凝胶电泳可将VH和VHH分开，从胶上切下 700bp的产物，按照生产商的说明，用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme)回收该产物。第二轮PCR以该产物为模板，使用如下序列的特异引物：

VHH-BspQI-F： 5′-ATATGCTCTTCAAGTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3′

VHH-BspQI-R： 5′-TATAGCTCTTCCTGCCGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3′

扩增纳米抗体的编码基因(图3C)；这两个引物分别结合在编码纳米抗体的 FR1和FR4的位置，获得的片段使用BspQI酶切后连接到pDX-init载体上。将构建好的文库电转到E.coli SS320菌株中，获得噬菌体展示文库。

2.3噬菌体展示

本发明共进行了三轮噬菌体展示。第一轮用的是包被了60nM neutravidin蛋白的96孔板。纯化好的噬菌体颗粒先与50nM生物素化标记的LspA-MRSA孵育(来源于实施例1)，随后100μL/孔分装到96孔板中，室温结合后，洗杂去除非特异结合的噬菌体，再用0.25mg/mL胰蛋白酶消化释放出剩余的噬菌体。筛选到的噬菌体侵染E.coli SS320，经过体内扩增，体外纯化后，进行第二轮噬菌体展示。在第二轮展示中，本发明通过磁珠作为介质进行实验，12μL MyOne Streptavidin C1先与 50nM生物素化标记的LspA-MRSA孵育，加入扩增收集的噬菌体溶液孵育反应 20min，洗杂后加入5μM非生物素化标记的LspA-MRSA进行竞争结合，去掉一些亲和力低或者解离快的噬菌体，最后再用胰蛋白酶消化释放选择出来的噬菌体。筛选到的噬菌体侵染E.coli SS320，再经过体内扩增，体外纯化后，进行第三轮噬菌体展示(参照第二轮实验流程)。三轮筛选后，将筛选到的VHH基因克隆到表达载体pSb_init上，目的蛋白的N端含有pelb分泌信号肽(MSKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA),C端含有Myc标签和6xHis标签，基因质粒转化到E.coli MC1061(市售)中进一步筛选单克隆。

2.4ELISA筛选

挑取含有编码VHH基因的克隆到96孔板中，37℃300rpm培养5h后，按1:20 (v/v)转接到1mL含有25μg/mL氯霉素的TB培养基中。培养2h后，降温到 22℃，继续培养1.5h，加入0.02％(w/v)的阿拉伯糖，诱导17h。3,220g离心30 min收细胞，弃上清，加入0.1mL TES缓冲液(20％(w/v)sucrose,0.5mM EDTA,0.5 μg/mL lysozyme,50mM Tis-HCl pH 8.0)，重悬细胞后，室温震荡30min，加入0.9 mL含有1mM MgCl₂的TBS(150mM NaCl,20mM Tris-HCl pH7.4)缓冲液，混匀后，3,220g在4℃离心30min。含有VHH蛋白的上清直接用于ELISA或FSEC检测。

在做ELISA前一天，先用Protein A包被Maxi-Sorp 96孔板(Cat.442404, ThermoFisher)中，4℃孵育16h。第二天弃去Protein A溶液，用0.5％(w/v)溶于 TBS的牛血清白蛋白(BSA)封闭96孔板。室温孵育30min后，弃去BSA溶液，用 TBS洗3次后，加入0.1mL 1:2,000稀释的anti-myc抗体，室温孵育20min，使抗体与Protein A结合。弃anti-myc抗体溶液，用TBST(TBS补加0.05％(v/v)Tween 20)洗3次。将上述准备好带Myc标签的VHH蛋白加入到96孔板中，室温孵育20 min。弃去蛋白溶液，用TBST洗3次。加入0.1mL 50nM生物素化标记的LspA- MRSA或MBP(the maltose-binding protein，作为对照)，室温孵育20min后，弃掉溶液，并用TBST洗涤96孔板3次。将偶联辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素加入到每个孔中(1:5,000,Cat S2438,Sigma)。室温孵育20min后，用TBST再次洗涤三次。加入0.1mL显影液(51mM Na₂HPO₄,24mM citric acid,0.006％(v/v)H₂O₂,0.1 mg/mL 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)在室温孵育，显色后测650nm处的吸收。实验组吸收值与对照组吸收值的比率高于1.5时，认为是具有亲和力的阳性克隆(图4)。其中，实验组吸收值与对照组吸收值的比率高于1.5的阳性克隆

2.5荧光分子筛选-FSEC

将生物素化RBD与荧光素标记的链霉亲和素(Cat 16955,AAT Bioquest)按1:1 混合，放冰上备用。将上述周质提取物(SA4)与荧光标记的LspA-MRSA按体积比 1:1.5混合，再进行荧光分子筛(FSEC)分析。FSEC中LspA-MRSA的终浓度为500 nM，检测482/508nm的荧光。结果图5所示，SA4在分子筛中可以使荧光标记 RBD的峰发生前移。

对SA4纳米抗体进行测序，确定其编码基因的序列如下：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCC TGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTCCTTCTTCGAGTTCGGCACAGTGGGCT GGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGCAGAGGGAGCTGGTGTCCAGGATCACCGG CAACGATCACAGATACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCA GGGACAACGACGAGACCACCGTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAAGCCTGA GGACACAGCCATCTACCACTGCAATATCCTGGAGGGCCAGAGGTGGTCCAATT ACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCC(SEQ ID NO:2)；

氨基酸序列如下：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFFEFGTVGWFRQAPGKQRELVSRITGN DHRYYADSVKGRFTISRDNDETTVYLQMDSLKPEDTAIYHCNILEGQRWSNYWG QGTQVTVS(SEQ ID NO:1)；

其中互补决定区包含有CDR1、CDR2和CDR3，其序列信息分别如下：

CDR1序列：GSFFEFGT(SEQ ID NO:3)、

CDR2序列：ITGNDHR(SEQ ID NO:4)、

CDR3序列：NILEGQRWSNY(SEQ ID NO:5)；

其中框架区，包含有FR1、FR2、FR3、FR4，其序列信息如下：

FR1：QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:6)

FR2：VGWFRQAPGKQRELVSR(SEQ ID NO:7)

FR3：YYADSVKGRFTISRDNDETTVYLQMDSLKPEDTAIYHC(SEQ ID NO:8)

FR4：WGQGTQVTVS(SEQ ID NO:9)。

实施例3纳米抗体纯化

将编码纳米抗体的基因构建到pSb-init载体，其C端还有Myc标签和6xHis标签。构建好的质粒转化至大肠杆菌MC1061中进行表达。大致流程如下：细胞用含 25mg/L氯霉素的TB培养基(0.17M KH₂PO₄和0.72M K₂HPO₄，1.2％(w/v)蛋白胨，2.4％(w/v)酵母抽提物(yeast extract)，0.5％(v/v)甘油(glycerol))，37℃，220rpm 培养。待细菌生长到OD约0.5时将温度降到22℃，继续培养细胞，当OD到1.5左右时，加0.02％(w/v)的阿拉伯糖诱导表达16h。离心收集培养好的细胞，每升细胞用20mL的TES-high Buffer(0.5M蔗糖,0.5mMEDTA,和0.2M Tris Tris-HCl pH 8.0)重悬，4℃孵育30min。随后加入40mL冰水，4℃搅拌1h。然后10000g，4℃离心 30min，收集上清，并加入终浓度为150mM NaCl和2mM MgCl₂；处理好的上清与 3mL Ni-Smart beads(SA035100)孵育结合30min，然后用含5mM imidazole的buffer A进行洗杂，目的蛋白用含250mM咪唑的buffer A进行洗脱，洗脱下的目的蛋白或直接用于下一步的RBD-Nanobody复合物的纯化，结晶或其他理化试验，或液氮速冻后存放于-80℃。

实施例4结合亲和力检测

使用Octet RED96仪器进行生物膜干涉法检测SA4和LspA-MRSA的结合动力学。为了测定LspA-MRSA和SA4结合亲和力，将生物素化标记的LspA-MRSA用 PBS-T(1xPBS,0.005％(v/v)Tween20)稀释至终浓度为2μg/mL，稀释后的蛋白在 30℃下固定到链霉亲和素标签上，换到PBS-T中平衡(baseline)120s，然后与不同浓度的SA4结合(association)300s，随后将传感器浸泡在PBS-T溶液中进行解离。数据处理使用的是Data Analysis 10.0软件，按照1:1化学计量学来拟合。生物膜干涉测定法(BLI)检测结果显示SA4与LspA-MRSA结合的K_D值小鱼1x10^-12M(图6)。

综上，本发明所提供的纳米抗体能够高效结合耐甲氧西林葡萄球菌，在检测、筛选诊断中获得优异的效果，或在预防和/或治疗耐甲氧西林葡萄球菌感染中发挥有效的免疫保护重要。

序列表

<110> 南京中爱人工智能与生命科学研究院有限公司

<120> 抗耐甲氧西林葡萄球菌的纳米抗体及其制备方法和用途

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Phe Phe Glu Phe Gly

20 25 30

Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ser Arg Ile Thr Gly Asn Asp His Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Glu Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr His Cys Asn

85 90 95

Ile Leu Glu Gly Gln Arg Trp Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser

115

<210> 2

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60

tcctgcgccg ccagcggctc cttcttcgag ttcggcacag tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagc agagggagct ggtgtccagg atcaccggca acgatcacag atactacgcc 180

gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg acgagaccac cgtgtacctg 240

cagatggaca gcctgaagcc tgaggacaca gccatctacc actgcaatat cctggagggc 300

cagaggtggt ccaattactg gggccagggc acccaggtga cagtgtcc 348

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ser Phe Phe Glu Phe Gly Thr

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Thr Gly Asn Asp His Arg

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Ile Leu Glu Gly Gln Arg Trp Ser Asn Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ser

1 5 10 15

Arg

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Asp Glu Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Ile Tyr His Cys

35

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

1 5 10

Claims

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体中包含有互补决定区和框架区；其中互补决定区包含有CDR1、CDR2和CDR3中的任一个或几个；所述的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3-5。

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的互补决定区包含有CDR1和CDR2，或CDR1和CDR3，或CDR2和CDR3，或包含CDR1、CDR2和CDR3。

3.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的框架区包含有FR1、FR2、FR3、FR4中的至少一个或几个；其中FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6-9。

4.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的抗体；

2)在1)的氨基酸序列上经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸，由1)衍生的，具有1)所述纳米抗体功能的纳米抗体。

5.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于编码权利要求1-4任一项所述的纳米抗体。

6.如权利要求5所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ IDNO:2。

7.一种构建体，其特征在于，所述的构建体中为插入有权利要求5或6所述的核苷酸片段的表达载体。

8.一种抗体表达系统，其特征在于，所述的表达系统中包含有权利要求7所述的构建体。

9.权利要求1-4任一项所述的纳米抗体在制备抑制耐甲氧西林葡萄球菌的制品中的应用。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中包含有药学可接受的载体中和权利要求1-4任一项所述的纳米抗体。

11.一种检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂或检测试剂盒中包含有权利要求1-4任一项所述的纳米抗体。

12.权利要求1-4任一项所述的纳米抗体在非疾病诊断治疗目的，抑制耐甲氧西林葡萄球菌信号肽酶LspA蛋白活性中的应用。