CN115594758A - 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的纳米抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的纳米抗体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种靶向新型冠状病毒SARS‑CoV‑2受体结合结构域的纳米抗体及其制备方法和应用。本发明还公开了与所述纳米抗体相关的生物材料、衍生抗体和检测试剂等。本发明所述纳米抗体主要识别结合RBD的受体结合基序区域。所述纳米抗体包括互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，还可以包括框架区FR。本发明所述纳米抗体能够高效、特异地与SARS‑CoV‑2相结合，亲和力可达到皮摩尔级别；同时本发明提供的纳米抗体具有较好的中和生物学活性，且识别结合机制清晰能够在SARS‑CoV‑2检测或由SARS‑CoV‑2引发的疾病中获得优异的效果，本发明可应用于生物、医学领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的纳米抗体及其制备方法和用途。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)属于β冠状病毒，是2019年年底发现并导致全球传播的新型冠状肺炎疾病(COVID-19)的病原体。由于其传染性强、传播速度快、致死率较高等特点，且没有完全有效的治疗手段，已成为危害全球公共卫生安全的重要传染性疾病之一，因此针对该病毒的药物开发，预防性疫苗开发及相关抗体的开发显得尤为迫切。
目前，疫苗接种是预防和控制传染性疾病的主要方式，全球已有数个针对SARS-CoV-2的上市疫苗，这些疫苗包括灭活疫苗，亚单位疫苗，病毒载体疫苗和核酸疫苗等，这些疫苗研发周期长，制备成本高。当前，较低的疫苗接种率以及高频率的病毒变异现象使我们仍保持高度的危机感。
中和抗体是一类能与病毒颗粒表位结合，通过阻碍病毒侵染而降低病毒感染性的抗体。中和抗体来源广泛，既可以从康复者血浆中获取，也可以通过免疫不同病毒抗原表位获得识别多表位的抗体，其制备工艺相对成熟，研发周期短，因此研发针对SARS-CoV-2的高滴度中和抗体也是预防病毒传播和感染的有效手段。
SARS-CoV-2病毒感染宿主依赖于其刺突蛋白S的受体结构域(RBD)对宿主上皮细胞的血管紧张素转换酶2(ACE2)的识别和结合，随后与细胞膜融合，病毒完成侵染过程。因此，阻断S蛋白与ACE2的结合是一个预防，或切断病毒感染的有效治疗措施。
自然界中(骆驼科和鲨鱼)存在一种天然缺失轻链，仅含有重链的抗体(重链抗体)。该类抗体的可变区约12-15kDa左右，可以识别结合抗原，且亲和力极高，是最小的活性抗原结合片段，因此也称为纳米抗体。纳米抗体具有分子量小、穿透性强、易于表达、易于基因改造以及易于结合多个表位等优点。因此此类抗体可作为一种有效中和抗体的候选者，且当前尚无针对SARS-CoV-2的上市纳米抗体药物。
发明内容
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
鉴于以上现有技术的缺点，本发明采用体外重组表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白对小羊驼进行4次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞并抽提细胞的总RNA，随后反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，用特异引物扩增出纳米抗体序列，构建噬菌体文库。再经过3轮生物淘汰筛选，FSEC相互作用筛选，假病毒中和活性验证以及高分辨率复合物晶体的解析等技术手段，分离获得抗新型冠状病毒SARS-CoV-2S蛋白RBD结构域(RBD：Receptor-BindingDomain)的纳米抗体。
本发明公开一种上述纳米抗体的氨基酸序列及其制备方法(图1)和用途，所述纳米抗体具有较强的与新型冠状病毒SARS-CoV-2特异性结合的能力(Kd<1x10-12M)及清晰的结合表位信息，所述纳米抗体的应用为新型冠状病毒SARS-CoV-2的诊断和治疗提供更广泛的手段，用于解决现有技术中的问题。
本发明提供一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2S蛋白RBD结构域的纳米抗体氨基酸序列(SA4)，所述纳米抗体序列中包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其氨基酸序列如下：
1)SA4的氨基酸序列：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSFFEFGTVGWFRQAPGKQRELVSRITGNDHRYYADSVKGRFTISRDNDETTVYLQMDSLKPEDTAIYHCNILEGQRWSNYWGQGTQVTVS(SEQ ID NO:1)
2)CDR1序列：GSFFEFGT(SEQ ID NO:2)
3)CDR2序列：ITGNDHR(SEQ ID NO:3)
4)CDR3序列：NILEGQRWSNY(SEQ ID NO:4)
本发明所述纳米抗体可以是包含上述CDR1、CDR2和CDR3中的一个或多个的抗体，即所述纳米抗体可以是包含CDR1，或包含CDR2，或包含CDR3，或包含CDR1和CDR2，或包含CDR1和CDR3，或包含CDR2和CDR3，或包含CDR1、CDR2和CDR3。
在一具体实施方式中，所述纳米抗体至少包括CDR1。
在一具体实施方式中，所述纳米抗体至少包括CDR2。
在一具体实施方式中，所述纳米抗体至少包括CDR3。
本发明中，所述进一步包括框架区，所述框架区是任何能够实现本发明所述纳米抗体功能的框架区，包括人源的或鼠源的。本发明中，所述纳米抗体可以包括以下框架区中的一个或多个：
FR1序列：QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:5)；
FR2序列：VGWFRQAPGKQRELVSR(SEQ ID NO:6)；
FR3序列：YYADSVKGRFTISRDNDETTVYLQMDSLKPEDTAIYHC(SEQ ID NO:7)；
FR4序列：WGQGTQVTVS(SEQ ID NO:8)。
本发明中，所述纳米抗体可以是多种抗体形式，包括但不仅限于完全抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体和遗传改造抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体或重组抗体、以及这些抗体的片段，条件是其保持本发明所述的性质。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体。该多核苷酸的序列为：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTCCTTCTTCGAGTTCGGCACAGTGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGCAGAGGGAGCTGGTGTCCAGGATCACCGGCAACGATCACAGATACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGACGAGACCACCGTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAAGCCTGAGGACACAGCCATCTACCACTGCAATATCCTGGAGGGCCAGAGGTGGTCCAATTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCC(SEQ ID NO:9)。
本发明中，与所述纳米抗体的氨基酸序列具有一定同一性的多肽也在本发明的保护范围内。如与所述纳米抗体具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上序列同一性且具有所述纳米抗体功能的抗体或抗体片段(具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性)。具体地，对所述纳米抗体经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸得到的，且具有所述纳米抗体功能的多肽片段。
本发明另一方面提供一种构建体，含有所述分离的多核苷酸。
在本发明某些实施方式中，所述构建体由所述分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
本发明另一方面提供一种纳米抗体的表达系统，所述表达系统含有所述构建体或基因组中整合有外源的所述多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
在本发明某些实施方式中，宿主细胞选自E.coli MC1061细胞、BL21(DE3)细胞、Expi293细胞、Trichoplusia ni High Five细胞和E.coli SS320细胞中的一种或多种的组合。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含在药学可接受的载体中，以及含有根据如上所述的纳米抗体中的一种或几种。
本发明还提供了一种检测试剂或检测试剂盒，其含有根据如上所述的纳米抗体中的一种或几种。
本发明进一步提供了与所述纳米抗体相关的生物材料、衍生抗体等。
本发明所述纳米抗体主要识别结合RBD的受体结合基序区域(RBM:Receptor-Binding Motif)。
本发明另一方面提供所述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗新型冠状病毒SARS-CoV-2纳米抗体的条件下，培养所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2纳米抗体的表达系统，从而表达出所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2纳米抗体，纯化分离出所述的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2纳米抗体。
本发明进一步提供了一种抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2活性的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。
本发明进一步提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-Cov-2引起的疾病的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。
本发明进一步提供了一种非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。
本发明进一步提供了一种拮抗SARS-CoV-2 RBD受体的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。
本发明进一步提供了一种所述纳米抗体与其他试剂或药物联合使用的方法，包括向有治疗需要的个体施用有效量的如上所述的纳米抗体或其相关生物材料、或包含所述纳米抗体的药物组合物。
本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的抗新型冠状病毒SARS-CoV-2可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明分离并鉴定了一种能够高效、特异地中和SARS-CoV-2的纳米抗体(SA4)，对SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD具有高度特异的识别和结合能力，主要识别结合RBD的受体结合基序区域(RBM:Receptor-Binding Motif)；亲和力可达到Kd<1x10-12M，且具有较好的病毒中和活性，其IC50约12.68nM。
(2)SA4-RBD复合物高分辨率晶体的结构分析显示，所述纳米抗体与RBD的结合部位与ACE2的RBD的主要结合部位重合，从而竞争性抑制RBD蛋白与ACE2的结合，相互作用机制清晰。
(3)本发明所述纳米抗体不易聚集，能耐高温、强酸、强碱具有结构和物化性质稳定性好的特点。
(5)本发明所述纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达、表达效率高，便于分离纯化，成本低。
因此，本发明所述纳米抗体识别结合机制清晰，能够在SARS-CoV-2检测、筛选诊断中获得优异的效果，或在预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒中发挥有效的免疫保护重要，可能在生物、医学领域中具备以下应用：I)在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2抑制剂中的应用；II)在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-Cov-2引起的疾病的药物中的应用；III)在非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析或在制备新型冠状病毒SARS-Cov-2的检测试剂或试剂盒中的应用；IV)在制备SARS-CoV-2RBD受体拮抗剂中的应用；V)与其他试剂或药物联合使用中的应用。
名词解释：
纳米抗体：重链抗体的可变区部分VHH。
“互补决定区”或“CDR”意指抗体分子的重链可变区或轻链可变区内三个高变区中的一个，其形成与被结合抗原的三维结构互补的N端抗原-结合面。从重链或轻链的N端开始，这些互补决定区分别表示为“CDR1”、“CDR2”以及“CDR3”。CDR涉及抗原-抗体结合，且CDR3包含对抗原-抗体结合具有特异性的独特区域。因此，抗原-结合位点可包括六个CDR，其包含来自重链与轻链V区的每一个的CDR区。
氨基酸序列互补决定区CDR1(互补区CDR1)，纳米抗体的第一段可变区序列；氨基酸序列互补决定区CDR2(互补区CDR2)，纳米抗体的第二段可变区序列；氨基酸序列互补决定区CDR3(互补区CDR3)，纳米抗体的第三段可变区序列。
IC50:半抑制浓度，指定的生物过程(或该过程中的某个组分比如酶、受体、细胞等)抑制一半时所需的药物或者抑制剂的浓度。
FSEC:荧光分子筛，一种定性分析生物分子之间相互作用的实验手段。
Kd:解离常数，反映的是物质之间的亲和力大小，值越小亲和力越强。
附图说明
图1显示为纳米抗体筛选技术流程；其中，FSEC检测图中，横坐标为体积(mL)，纵坐标为FL 482/508(mV)。
图2显示为RBD抗原纯化结果。
图3显示为小羊驼mRNA提取样本检测及两轮PCR扩增纳米抗体基因序列结果。
图4显示为ELISA鉴定与RBD结合的纳米抗体。其中，横坐标各字母SA1、SA2……等代表克隆编号；纵坐标表示实验组吸收值与阴性对照组吸收值的比率。
图5显示为SA4-RBD的FSEC结果。横坐标表示目的蛋白的洗脱体积(mL)，纵坐标表示A482或A508的吸收值(nm)。NC表示荧光标记的RBD的FSEC结果；SA4表示SA4-RBD的FSEC结果。
图6显示为SA4亲和力测定结果。将2μg/mL生物素标记的RBD固定到SA传感器上，平衡后放到不同浓度的SA4溶液中，检测BLI信号。
图7显示为SA4和阳性对照组(其他具有中和活性的纳米抗体)中和实验结果。将SARS-Cov-2假病毒分别与不同浓度的SA4纳米抗体孵育后，再去感染VeroE6-hACE2细胞，流式检测细胞的感染比率。横坐标表示SA4蛋白浓度的对数，纵坐标表示病毒中和效率百分比。
图8显示为RBD-SA4复合物纯化及结晶结果。横坐标表示目的蛋白洗脱的体积(mL)，纵坐标表示A280吸收值(mAU)。
图9显示为SA4识别RBD表位与ACE2识别表位的结构比较示意图。SA4和ACE2的主要识别表位重合，识别表位用虚线椭圆标注。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明对所述编码序列的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成方法即可。
实施例1.SARS-CoV-2 S蛋白RBD结构域的表达和纯化
将RBD(uniport：P0DTC2，330-541位氨基酸)构建到pFastBac1载体上，阅读框编码序列从N端到C端分别是Honeybee Melittin分泌信号肽(KFLVNVALVFMVVYISYIYAA)(SEQ IDNO:10)，Gly-Ser连接序列，RBD目的蛋白序列，Gly-Ser连接序列，3C蛋白酶切位点(LEVLFQGP)(SEQ ID NO:11)，Gly-Ser连接序列，Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)(SEQ ID NO:12)，Gly-Ser连接序列，和10×His标签。
RBD的表达是在Trichoplusia ni High Five悬浮细胞中进行分泌表达，收集表达后的上清，用0.22um滤膜过滤后，加入20mM咪唑，与3mL Ni-Smart beads填料(SA035100)混合，于4℃环境下搅拌孵育结合3小时。随后将上清-填料混合物加入到重力柱中，收集填料，用10个柱体积的加入20mM咪唑的缓冲液A(150mM NaCl,20mM Tris HCl pH 8.0)洗杂，然后用含有300mM咪唑的缓冲液A洗脱蛋白。
RBD抗原样品制备：将亲和纯化所样本按100：1的比例加入3C蛋白酶，4℃酶切16小时，然后通过分子筛(Superdex Increase 200 10/300GL)进一步分离纯化蛋白(图2)。将含有目的蛋白的部分混合到一起，浓缩到2mg/mL后分装，样本直接用于免疫或液氮速冻后保存在-80℃冰箱。
RBD的生物素化标记：将0.8mg/mL RBD与22ug/mL纯化的BirA(生物素连接酶)混合到一起，加入5mM ATP，10mM醋酸镁，44μM生物素，混匀后，在4℃放置反应16小时，随后通过分子筛(Superdex Increase 200 10/300GL)进一步分离纯化蛋白。将含有目的蛋白的部分混合到一起，分装，液氮速冻后保存在-80℃冰箱中，用于噬菌体展示筛选。
实施例2.纳米抗体筛选
2.1羊驼免疫
免疫前，将实施例1中制备的免疫抗原(2mg/mL,500μL)与GERBU佐剂(GERBUAJUVANT P#3111)按体积比1:1混合，使之形成乳浊液，之后在羊驼颈部靠近弓淋巴结的位置分10个点皮下注射抗原-佐剂乳浊液，每隔2周进行一次加强免疫，总共进行4次免疫注射实验。第一次免疫前，采血3mL，室温凝血2h。室温3000g离心5min，收集上清作为免疫前血清；第1至4次免疫后的血清也按照此法分别收集，之后通过ELISA法测定血清抗体效价。第4次免疫后，血清抗体的效价高于106，在EDTA包被的采血管中收集80ml血液。立即上下颠倒2次以抑制凝血。按照生产商的说明，用Ficoll Plus 1.077分离外周血淋巴细胞PBLs。
2.2噬菌体文库构建
利用RNAsio Plus(TaKaRa)裂解实施例2中的PBLs，并提取RNA(图3A)。然后利用试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme)制备cDNA。进一步通过两轮PCR获得VHH片段。其中，第一步PCR的引物为CALL001(5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′)(SEQ ID NO.13)和CALL002(5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′)(SEQ ID NO.14)，从cDNA中扩增所有免疫球蛋白的重链可变区，也就是包括普通抗体的重链可变区VH(1000bp)和重链抗体的可变区VHH(700bp)(图3B)。然后，通过琼脂糖凝胶电泳可将VH和VHH分开，从胶上切下700bp的产物，按照生产商的说明，用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme)回收该产物。第二轮PCR以该产物为模板，利用特异引物VHH-BspQI-F(5′-ATATGCTCTTCAAGTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3′)(SEQ ID NO.15)和VHH-BspQI-R(5′-TATAGCTCTTCCTGCCGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3′)(SEQ ID NO.16)扩增纳米抗体的编码基因(图3C)；这两个引物分别结合在编码纳米抗体的FR1和FR4的位置，获得的片段使用BspQI酶切后连接到pDX-init载体上。将构建好的文库电转到E.coli SS320菌株中，获得噬菌体展示文库。
2.3噬菌体展示
本发明共进行了三轮噬菌体展示。第一轮用的是包被了60nM neutravidin蛋白的96孔板。纯化好的噬菌体颗粒先与50nM生物素化标记的RBD孵育(来源于实施例1)，随后100μL/孔分装到96孔板中，室温结合后，洗杂去除非特异结合的噬菌体，再用0.25mg/mL胰蛋白酶消化释放出剩余的噬菌体。筛选到的噬菌体侵染E.coli SS320，经过体内扩增，体外纯化后，进行第二轮噬菌体展示。在第二轮展示中，本发明通过磁珠作为介质进行实验，12μLMyOne Streptavidin C1先与50nM生物素化标记的RBD孵育，加入扩增收集的噬菌体溶液孵育反应20min，洗杂后加入5μM非生物素化标记的RBD进行竞争结合，去掉一些亲和力低或者解离快的噬菌体，最后再用胰蛋白酶消化释放选择出来的噬菌体。筛选到的噬菌体侵染E.coli SS320，再经过体内扩增，体外纯化后，进行第三轮噬菌体展示(参照第二轮实验流程)。三轮筛选后，将筛选到的VHH基因克隆到表达载体pSb_init上，目的蛋白的N端含有pelb分泌信号肽(MSKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA；SEQ ID NO.17)，C端含有Myc标签和6xHis标签，基因质粒转化到E.coli MC1061(市售)中进一步筛选单克隆。
2.4ELISA筛选
挑取47个含有编码VHH基因的克隆(图4中SA1～SA12，SB1～SB12，SC1～SC12以及SD1～SD11)及一个来自人源文库的阳性对照克隆(图4中PC)到96孔板中，37℃300rpm培养5h后，按1:20(v/v)转接到1mL含有25μg/mL氯霉素的TB培养基中。培养2h后，降温到22℃，继续培养1.5h，加入0.02％(w/v)的阿拉伯糖，诱导17h。3,220g离心30min收细胞，弃上清，加入0.1mL TES缓冲液(20％(w/v)sucrose,0.5mM EDTA,0.5μg/mL lysozyme,50mM Tis-HClpH 8.0)，重悬细胞后，室温震荡30min，加入0.9mL含有1mM MgCl2的TBS(150mM NaCl,20mMTris-HCl pH 7.4)缓冲液，混匀后，3,220g在4℃离心30min。含有VHH蛋白的上清直接用于ELISA或FSEC检测。
在做ELISA前一天，先用Protein A包被Maxi-Sorp 96孔板(Cat.442404,ThermoFisher)，4℃孵育16h。第二天弃去Protein A溶液，用0.5％(w/v)溶于TBS的牛血清白蛋白(BSA)封闭96孔板。室温孵育30min后，弃去BSA溶液，用TBS洗3次后，加入0.1mL 1:2,000稀释的anti-myc抗体，室温孵育20min，使抗体与Protein A结合。弃anti-myc抗体溶液，用TBST(TBS补加0.05％(v/v)Tween 20)洗3次。将上述准备好带Myc标签的VHH蛋白加入到96孔板中，室温孵育20min。弃去蛋白溶液，用TBST洗3次。加入0.1mL 50nM生物素化标记的RBD或MBP(the maltose-binding protein，作为阴性对照)，室温孵育20min后，弃掉溶液，并用TBST洗涤96孔板3次。将偶联辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素加入到每个孔中(1:5,000,Cat S2438,Sigma)。室温孵育20min后，用TBST再次洗涤三次。加入0.1mL显影液(51mMNa2HPO4,24mM citric acid,0.006％(v/v)H2O2,0.1mg/mL 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)在室温孵育，显色后测650nm处的吸收。实验组吸收值与阴性对照组吸收值的比率高于1.5时，认为是具有亲和力的阳性克隆(图4)。其中，47个克隆中有45个为阳性(除B5和D8外)，表明这45个阳性克隆表达的纳米抗体可以结合RBD，剩下的2个比率低于1.5的克隆(SB5和SD8)可能与RBD有结合但亲和力较低或者没有表达纳米抗体。
2.5荧光分子筛选-FSEC
将生物素化RBD与荧光素标记的链霉亲和素(Cat 16955,AAT Bioquest)按1:1混合，制备荧光标记的RBD，放冰上备用。将上述周质提取物(SA4，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)与荧光标记的RBD按体积比1:1.5混合，再进行荧光分子筛(FSEC)分析(荧光标记的RBD作为对照(NC))。FSEC中RBD的终浓度为500nM，检测482/508nm的荧光。结果图5所示，SA4在分子筛中可以使荧光标记RBD的峰发生前移。
实施例3纳米抗体纯化
将编码纳米抗体的基因构建到pSb-init载体，其C端还有Myc标签和6xHis标签。构建好的质粒转化至大肠杆菌MC1061中进行表达。大致流程如下：细胞用含25mg/L氯霉素的TB培养基(0.17M KH2PO4和0.72M K2HPO4，1.2％(w/v)蛋白胨，2.4％(w/v)酵母抽提物(yeast extract)，0.5％(v/v)甘油(glycerol))，37℃，220rpm培养。待细菌生长到OD约0.5时将温度降到22℃，继续培养细胞，当OD到1.5左右时，加0.02％(w/v)的阿拉伯糖诱导表达16h。离心收集培养好的细胞，每升细胞用20mL的TES-high Buffer(0.5M蔗糖,0.5mM EDTA,和0.2M Tris Tris-HCl pH 8.0)重悬，4℃孵育30min。随后加入40mL冰水，4℃搅拌1h。然后10000g，4℃离心30min，收集上清，并加入终浓度为150mM NaCl和2mM MgCl2；处理好的上清与3mL Ni-Smart beads(SA035100)孵育结合30min，然后用含5mM imidazole的buffer A进行洗杂，目的蛋白用含250mM咪唑的buffer A进行洗脱，洗脱下的目的蛋白或直接用于下一步的RBD-Nanobody复合物的纯化，结晶或其他理化试验，或液氮速冻后存放于-80℃。
实施例4结合亲和力检测
使用Octet RED96仪器进行生物膜干涉法检测SA4和RBD的结合动力学。为了测定RBD和SA4结合亲和力，将生物素化标记的RBD用PBS-T(1xPBS,0.005％(v/v)Tween20)稀释至终浓度为2μg/mL，稀释后的蛋白在30℃下固定到链霉亲和素标签上，换到PBS-T中平衡(baseline)120s，然后与不同浓度的SA4结合(association)300s，随后将传感器浸泡在PBS-T溶液中进行解离。数据处理使用的是Data Analysis 10.0软件，按照1:1化学计量学来拟合。生物膜干涉测定法(BLI)检测结果显示SA4与RBD结合的KD值小于1pM(图6)。
实施例5 SARS-CoV-2病毒中和实验
假病毒中和实验如下：将编码病毒包膜糖蛋白、小鼠白血病病毒核心/包装成分(MLV Gag-pol)的载体以及含有绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒转移载体用PEI转染到HEK293T细胞中。48h后，将培养液上清用0.45μm的滤膜过滤获得假病毒，可用于病毒感染。
将50mL表达人ACE2蛋白的VeroE6细胞(VeroE6-hACE2细胞)接种于48孔板，培养至细胞密度为104个/孔，每孔中加入100μL上述收集到的假病毒。在感染前，将SA4和具有中和活性的阳性对照(PC)分别与假病毒在37℃预先孵育1h。感染6h后，将培养基换成无假病毒培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium-2％fetal calf serum)。用荧光活化流式细胞术检测细胞中GFP的表达水平，作为感染效率的指标。中和实验的结果如图7所示，SA4对SARS-CoV-2假病毒有活性，IC50＝12.68nM。
实施例6 SA4-RBD复合物制备，结晶及结构解析
为了得到SA4-RBD复合物，将准备好的RBD和纳米抗体SA4(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)按摩尔比1:2混合在一起，4℃孵育2h。然后通过分子筛(Superdex Increase 20010/300 GL column)进行复合物分离。将分离得到的SA4-RBD复合物浓缩到约10mg/mL用于结晶实验，结果如图8所示，由图8可以看出，SA4和RBD形成稳定均一的复合物，复合物洗脱体积在15mL左右。
本发明通过座滴法进行晶体初筛，晶体培养于16℃。36h后观察到晶体。用于衍射的晶体生长于0.2M Ammonium sulfate，0.1M Sodium acetate trihydrate，pH 4.6和25％w/v Polyethylene glycol 4,000条件中；向晶体生长条件中加入终浓度约25％甘油，约120s后将晶体快速转移冻存于液氮中。
衍射数据是在上海同步辐射光源BL18U1线站的Pilatus 6M探测器上收集的，使用的X射线束是50x50μm，波长为
数据是利用XDS软件整合到一起，并使用Aimless进行扩展和合并。结构的解析是以6M0J和6ZXN中对应的RBD和VHH部分作为搜索模型，用Phaser进行分子替代进行的。模型在Coot中使用2Fo-Fc图谱进行手动调整，并使用Phenix精修，最终用PyMol展现结构。
解析SA4-RBD复合物的晶体结构分辨率达到
(表1)。晶体结果显示SA4与RBD以1:1的化学计量结合。结构比对显示，SA识别的表位与ACE2识别表位重合(图9)。
表1 SA4-RBD衍射数据与结构参数
a.最高壳层参数
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
序列表
<110> 南京晶准生物科技有限公司
<120> 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的纳米抗体及其制备方法和用途
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Phe Phe Glu Phe Gly
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Arg Ile Thr Gly Asn Asp His Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Glu Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr His Cys Asn
85 90 95
Ile Leu Glu Gly Gln Arg Trp Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser
115
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Phe Phe Glu Phe Gly Thr
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Thr Gly Asn Asp His Arg
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ile Leu Glu Gly Gln Arg Trp Ser Asn Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 7
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Asp Glu Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr His Cys
35
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60
tcctgcgccg ccagcggctc cttcttcgag ttcggcacag tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagc agagggagct ggtgtccagg atcaccggca acgatcacag atactacgcc 180
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg acgagaccac cgtgtacctg 240
cagatggaca gcctgaagcc tgaggacaca gccatctacc actgcaatat cctggagggc 300
cagaggtggt ccaattactg gggccagggc acccaggtga cagtgtcc 348
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Tyr Ile Tyr Ala Ala
20
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atatgctctt caagtcaggt gcagctgcag gagtctggrg gagg 44
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatagctctt cctgccgagg agacggtgac ctgggt 36
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Ser Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala
20
Claims (11)
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括如下互补决定区CDR1、CDR2和CDR3中的一个或多个：如SEQ ID NO:2所示的CDR1；如SEQ ID NO:3所示的CDR2；如SEQ ID NO:4所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下框架区FR1、FR2、FR3和FR4中的一个或多个：如SEQ ID NO:5所示的FR1；如SEQ ID NO:6所示的FR2；如SEQ ID NO:7所示的FR3；如SEQ ID NO:8所示的FR4。
3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
4.一种编码根据权利要求1所述的纳米抗体的分离的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示。
6.一种构建体，其特征在于，其含有根据权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种纳米抗体的表达系统，所述表达系统含有所述根据权利要求6所述的构建体或基因组中整合有外源的根据权利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一种药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1～3之任一项所述的纳米抗体中的一种或几种，以及药学上可接受的载体。
9.一种检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，其含有根据权利要求1～3之任一项所述的纳米抗体中的一种或几种。
10.根据权利要求1～3之任一项所述的纳米抗体或根据权利要求4或5所述的多核苷酸或根据权利要求6所述的构建体或根据权利要求7所述的表达系统或根据权利要求8所述的药物组合物的以下用途：
I)在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2抑制剂中的应用；
II)在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-Cov-2引起的疾病的药物中的应用；
III)在非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析或在制备新型冠状病毒SARS-Cov-2的检测试剂或试剂盒中的应用；
IV)在制备SARS-CoV-2RBD受体拮抗剂中的应用；或
V)与其他试剂或药物联合使用中的应用。
11.一种根据权利要求1～3之任一项所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，
包括如下步骤：在适合表达所述纳米抗体的条件下，培养所述的纳米抗体的表达系统，从而表达出所述的纳米抗体，纯化分离出所述纳米抗体。
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