CN112500482A - 一种金葡特异性纳米抗体及其双抗夹心elisa方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种金葡特异性纳米抗体及其双抗夹心ELISA方法，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb85、纳米抗体Nb119、纳米抗体Nb147或纳米抗体Nb174中的至少一种。本发明所述的金黄色葡萄球菌特异性纳米抗体可以有效避免传统抗体应用于检测中的假阳性，可用于食品中金黄色葡萄球菌的靶向和高灵敏检测体系构建。

Description

一种金葡特异性纳米抗体及其双抗夹心ELISA方法
技术领域
本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及金葡特异性纳米抗体及其 双抗夹心ELISA方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是引起人类食源性疾病的一种重要病原菌，被金 黄色葡萄球菌肠毒素污染的食品能引起人体恶心、呕吐、腹泻等症状。 传统的金黄色葡萄球菌的检测技术主要依赖于常规的微生物学检测 方法，步骤繁琐、耗时较长。一些免疫检测技术开发基于单克隆或多 克隆抗体的筛选与制备，筛选和制备抗体周期较长，且检测结果会有 假阳性。在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然 缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)。克隆并表达重链抗体的重链可 变区得到重链抗体的抗原识别和结合域，称为纳米抗体(Nanobody, Nb)。纳米抗体具有与原重链抗体相当的结构稳定性及抗原结合活性， 是目前已知的可结合靶向抗原的最小抗体单位。传统针对金黄色葡萄 球菌的检测多针对其毒素检出，而针对金黄色葡萄球菌菌株的免疫检 测多引传统抗体的非特异性结合而不能应用，并且针对传统抗体的制 备时间长、假阳性高，与传统单克隆抗体片段相比，纳米抗体制备周 期短，成本低，稳定性高，并且其单结构域特性能避免与金黄色葡萄 球菌表面蛋白的非特异性结合，因此能用于金葡的免疫检测技术开发 和方法建立。目前，纳米抗体被广泛应用于开发治疗性抗体药物、诊 断试剂(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)、亲和纯化基 质、免疫学研究等基础科学研究领域。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种金葡特 异性纳米抗体及其双抗夹心ELISA方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种金葡特异性纳米抗体，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体 Nb85、纳米抗体Nb119、纳米抗体Nb147或纳米抗体Nb174中的至少 一种。
进一步，所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、 FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb85：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所 述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的FR3的氨基酸序 列如SEQ ID NO.3所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所 示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
对于纳米抗体Nb119：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示， 所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述的FR3的氨基酸 序列如SEQ ID NO.10所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11 所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述的CDR2 的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO.14所示；
对于纳米抗体Nb147：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示， 所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR3的氨基 酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.18 所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述的CDR2 的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的CDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO.21所示；
对于纳米抗体Nb174：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示， 所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述的FR3的氨基 酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.25 所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的CDR2 的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述的CDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO.28所示；
所述的特异性纳米抗体的4个框架区和3个互补决定区的排列顺 序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
进一步，所述的纳米抗体Nb85的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述的纳米抗体Nb119的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；所述的纳米抗体Nb147的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；所述的纳米抗体Nb174的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。
进一步，所述的特异性纳米抗体的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述的金葡特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在食 源性致病菌免疫检测中的应用。
所述的金葡特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在金 葡表面抗原鉴定中的应用。
所述的金葡特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在基 于抗体的金葡表面抗原的纯化和示踪中的应用。
所述的金葡特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在基 于抗体的金葡感染的诊断和治疗中的应用。
一种金葡的双抗夹心ELISA方法，包括如下步骤：
(1)金葡灭活菌株制备：
对金黄色葡萄球菌菌液进行灭活；
(2)特异性纳米抗体的配对筛选：
使用灭活后的金黄色葡萄球菌对成年羊驼进行免疫，将从羊驼血 液中获得的VHH基因片段与质粒载体进行连接形成重组质粒，然后将 所述的重组质粒电转化入大肠杆菌感受态细胞中，将电转化产物进行 培养、扩增，基于噬菌体展示技术经多轮富集筛选后，通过PE-ELISA 方法筛选特异性的纳米抗体，并制备特异性纳米抗体的噬菌粒载体用 于抗体的表达和纯化；
(3)双抗夹心ELISA方法的构建：制备生物素化的纳米抗体， 将带有His标签的纳米抗体作为捕获抗体，生物素化的纳米抗体作为 检测抗体，在捕获抗体中加入金黄色葡萄球菌，使其与所述的捕获抗 体结合，然后加入所述的检测抗体，与HRP偶联的链霉素亲和素孵育 后进行显色后即成。
进一步，所述的金葡的双抗夹心ELISA方法，所述的步骤(1) 中的灭活步骤使用0.5％的甲醛对金黄色葡萄球菌进行灭活。
所述的金葡的双抗夹心ELISA方法的应用，所述的方法在制备检 测试剂盒中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的金葡特异性纳米抗体可以有效避免传统抗体应用 于检测中的假阳性，可用于食品中金葡的靶向和高灵敏检测体系构 建。
本发明所述的金葡双抗夹心ELISA方法基于金黄色葡萄球菌灭 活全菌株的免疫和筛选策略，制备针对金黄色葡萄球菌的特异型纳米 抗体，用于高灵敏检测体系的构建。
附图说明
图1为本发明实施例所述的第一次PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例所述的第二次PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例所述的纳米抗体免疫库插入率图；
图4为本发明实施例所述的金葡纳米抗体富集度的柱状图；
图5为本发明实施例所述的酶联免疫反应筛选结果的柱状图；
图6为本发明实施例所述的纳米抗体纯化色谱峰值的曲线图；
图7为本发明实施例所述的His标签纳米抗体蛋白电泳图；
图8为本发明实施例所述的His标签纳米抗体免疫印迹图；
图9为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体的蛋白电泳图；
图10为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体免疫印迹图；
图11为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体金葡ATCC10832 特异性检测图；
图12为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体金葡ATCC25923 特异性检测图；
图13为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体金葡ATCC49521 特异性检测图；
图14为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体金葡ATCC49525 特异性检测图；
图15为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体金葡ATCC55804 特异性检测图；
图16为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体大肠杆菌0157： H7交叉反应检测图；
图17为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体沙门氏菌 ATCC14028交叉反应检测图；
图18为本发明实施例所述的生物素化纳米抗体李斯特菌 ATCC19111交叉反应检测图；
图19为本发明实施例所述的抗体对筛选结果图；
图20为本发明实施例所述的抗体对浓度筛选结果图；
图21为本发明实施例所述的双抗夹心ELISA方法标准曲线图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属 领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂， 如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明， 均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
1、金黄色葡萄球菌的灭活菌株制备
金黄色葡萄球菌的灭活方法有高温加热及甲醛灭活等。使用终浓 度为0.5％的甲醛对金黄色葡萄球菌菌液进行灭活处理。
2、基于金黄色葡萄球菌的羊驼免疫和纳米抗体库构建
使用灭活的金黄色葡萄球菌对成年羊驼进行免疫，在最后一次免 疫后3-4天后，从羊驼的颈部静脉取血。采用密度梯度离心法对血液 中的淋巴细胞进行提取。采用TRIzol法对淋巴细胞中的RNA进行提 取。以RNA为模板反转录生成cDNA。然后cDNA经过两次PCR的对VHH 基因片段进行扩增。第一次PCR以CALL001和CALL002为引物对VHH 和CH2区域之间的片段进行扩增。在1％的琼脂糖凝胶电泳中，获得 VHH基因所在的700bp片段，使用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGEN) 切胶回收。然后再以PMCF和A6E为引物，对第一次PCR产物进行第二次PCR以获得VHHs片段。使用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。
使用PstⅠ和NotⅠ两种限制性内切酶对PCR产物和PMECs质粒 进行酶切。并将酶切后的PCR产物和pMECS质粒载体在T4 DNA连接 酶的作用下进行连接，形成重组质粒。使用Phenol：Chloroform： Isoamylalcohol(25：24：1)对重组质粒进行纯化。然后将重组质 粒电转化入大肠杆菌TG1感受态细胞中。转化完成后，将电转产物涂 布于含20％葡萄糖和氨苄的LB平板上，37℃倒置孵育过夜。隔天进 行菌落计数，计算文库的库容量。随机挑取单菌株以GⅢ和MP57为 引物进行菌落PCR，确定文库中VHH片段的正确插入率。用刮板对LB 平板上的菌株进行收集、重悬，测定文库的库容量。-80℃冻存。
3、特异性纳米抗体的筛选和鉴定
采用辅助噬菌体M13K07的噬菌体展示技术对文库中的纳米抗体 抗体进行三轮的淘选，筛选出来具有特异性的纳米抗体。将冻存的纳 米抗体加入到2×TY培养基中，室温孵育至指数期(OD600＝0.5-0.6)， 加入～1012的辅助噬菌体M13K07，室温下孵育30min使其感染大肠杆 菌，离心收集菌体沉淀，将其重悬后再次培养在2×TY培养基中，室 温孵育过夜，构建噬菌体文库。8000rpm离心除去菌体沉淀，将所得 上清液与PEG/NaCl溶液按4：1(W/W)的比例混匀，使噬菌体-PEG/NaCl 复合物充分沉降后离心、重悬。使用超微量分光光度计测定噬菌体的 含量。为了淘选到特异性的纳米抗体，我们使用噬菌体ELISA的方法 对其进行淘选。金葡直接包被孵育过夜。含3％的脱脂乳粉封闭96孔 板，室温静置1h。每孔加入重悬好的噬菌体～1011，室温下孵育1h使 特异性噬菌体与抗原充分结合。向每孔中分别加入100μL的TEA溶 液，以破坏"+"孔中特异性结合的抗原和噬菌体颗粒以及"-"孔中的剩 余背景。最大值孵育10Min。加入100μL/孔1M Tris以中和TEA溶 液并转移所有游离的噬菌体到一个无菌的离心管中。其中，10μL用 于噬菌体的富集。将噬菌体进行10倍稀释到10-7，将不同稀释度的 噬菌体等量的去感染大肠杆菌室温下30min。然后将感染的大肠杆菌 等量的依次涂布于LB琼脂平板上，37℃孵育过夜，观察特异性噬菌 体的富集情况。其余的噬菌体用于重新扩大培养，进行下一轮的淘选 准备。连续进行三轮的淘选。
随机挑选淘选中富集平板中的菌株，将枪头浸泡在96孔板相对 应的LB+Amp液体培养基中，37℃孵育过夜。将过夜菌液转移到96深 孔板的1ml 2×TY培养液中，室温下孵育至OD600≈1。加入终浓度为 1mM的IPTG诱导其表达蛋白。诱导后离心得沉淀，放置于-80℃经过 冷激产生冰晶使细胞壁膜破碎得到周质蛋白。将周质蛋白用于后续进 行直接ELISA酶联免疫反应挑选特异性的抗体。用鼠抗HA单抗和碱 性磷酸酶标记的羊抗鼠多抗检测与抗原结合的特异性的抗体。分别在 加入显色剂后5min，15min，30min，60min测定OD405nm。挑选吸光度 值符合要求的抗体以GⅢ和MP57为引物进行抗体PCR，将PCR产物进 行基因测序。挑选基因序列不同的抗体再次进行直接ELISA酶联免疫 反应鉴定抗体的特异性，并同时进行抗体质粒的提取和质粒的测序。 对比两次的测序结果，挑选特异性的抗体。如图1-5所示。
4、特异性纳米抗体的表达与纯化
制备两种特异性纳米抗体，一种带有His与HA标签，一种带有 生物素标签。His与HA标签的纳米抗体构建于pMECS载体上，经转 化，培养，IPTG过夜诱导进行蛋白表达，再利用渗透压裂解细胞的 原理裂解细胞得到特异性纳米抗体。生物素标签的纳米抗体构建于pBAD17载体上，与BirA一起经转化、生物素培养、IPTG过夜诱导进 行蛋白表达，再利用渗透压裂解细胞的原理裂解细胞得到特异性纳米 抗体。两种纳米抗体经Ni-NTA柱、AKTA进行纯化。如图6-10所示。
5、纳米抗体稳定性测定
利用实时定量PCR仪对纳米抗体的稳定性进行测定。将纳米抗体 与SYPRO OrangeProtein Gel Stain混合，利用实时定量PCR仪测 定不同温度下纳米抗体的响应值，以此确定纳米抗体的热稳定性。
6、纳米抗体的配对筛选
然后将所有的抗体两两配对进行双抗夹心ELISA筛选合适抗体 对，生物素化的纳米抗体作为检测抗体，带有HA和His标签的抗体 作为捕获抗体，HRP标记的链霉素亲和素(1：5000)作为显色底物 用于TMB显色。测OD450。挑取合适的抗体对进行后续的实验。
7、双抗夹心ELISA方法的构建
将配对筛选的带His和HA标签的抗体作为捕获抗体包被酶标板， 100μL/孔，室温下1小时。PBST清洗五次。含5％的脱脂乳粉封闭酶 标板。200μL/孔，室温下1小时。用PBST清洗五次。加入金黄色葡 萄球菌使其与捕获抗体结合，100μL/孔，室温1小时孵育。PBST清 洗五次。加入生物素化的抗体作为检测抗体100μL/孔，室温下1小 时。PBST清洗五次。HRP标记的链霉素亲和素(1：5000)作为显色 底物室温孵育1h，TMB显色液进行显色。用酶标仪测吸光度OD450。
8、双抗夹心ELISA方法条件的优化
对加入孔中的检测抗体，捕获抗体的抗体对的配对和浓度的选择 等条件进行优化。
9、双抗夹心ELISA方法标准曲线的建立
根据优化的条件，构建双抗夹心ELISA检测金黄色葡萄球菌标准 曲线。将金葡菌液按一定的比例稀释，以抗原浓度为横坐标，对应 OD值为纵坐标绘制曲线。根据绘制的曲线选取最佳的线性范围，最 低检测限(LOD值)为空白对照加三倍标准差所对应标准曲线上的浓 度值，如图21所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种金葡特异性纳米抗体及其双抗夹心ELISA方法
<130> 2020.11.18
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr Asp
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
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<400> 6
Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Asp Phe Phe Asn Asn Gln Ser Ser Thr Thr Val Tyr Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
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<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
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Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
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Ala Ala Ala Asp Glu Glu Gly Gly Leu Asn Pro Ser Thr Val Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 15
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<400> 16
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Val
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<400> 17
Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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Gly His Thr Phe Ser Asn Leu Asp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ser Arg Trp Arg Asp Gly Ser Thr
1 5
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<211> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Lys Arg Thr Val Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Gln Val Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Met Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Ser Cys
35
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Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gly Arg Asn Phe Gly Asp Tyr Thr
1 5
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<400> 27
Ile Thr Trp Ser Gly Ser Met Thr
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ala Ala Ala Asp Gly Gly His Gln Arg Ser Thr Thr Val Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr
<210> 29
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Phe Asn Asn Gln Ser Ser Thr Thr Val Tyr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asp Glu Glu Gly Gly Leu Asn Pro Ser Thr Val Tyr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Thr Phe Ser Asn Leu
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Ser Arg Trp Arg Asp Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asp Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Lys Arg Thr Val Tyr Tyr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Asn Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Thr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Gln Val Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Ser Gly Ser Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asp Gly Gly His Gln Arg Ser Thr Thr Val Trp Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (10)

1.一种金葡特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体为纳米抗体Nb85、纳米抗体Nb119、纳米抗体Nb147或纳米抗体Nb174中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的金葡特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb85：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
对于纳米抗体Nb119：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
对于纳米抗体Nb147：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
对于纳米抗体Nb174：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；
所述的特异性纳米抗体的4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
3.根据权利要求1所述的金葡特异性纳米抗体，其特征在于：所述的纳米抗体Nb85的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述的纳米抗体Nb119的VHH的氨基酸序列如SEQID NO.30所示；所述的纳米抗体Nb147的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；所述的纳米抗体Nb174的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的金葡特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在食源性致病菌免疫检测中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的金葡特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在金葡表面抗原鉴定中的应用。
6.权利要求1-3中任一项所述的金葡特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在基于抗体的金葡表面抗原的纯化和示踪中的应用。
7.权利要求1-3中任一项所述的金葡特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在基于抗体的金葡感染的诊断和治疗中的应用。
8.一种金葡的双抗夹心ELISA方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)金葡灭活菌株制备：
对金黄色葡萄球菌菌液进行灭活；
(2)特异性纳米抗体的配对筛选：
使用灭活后的金黄色葡萄球菌对成年羊驼进行免疫，将从羊驼血液中获得的VHH基因片段与质粒载体进行连接形成重组质粒，然后将所述的重组质粒电转化入大肠杆菌感受态细胞中，将电转化产物进行培养、扩增，基于噬菌体展示技术经多轮富集筛选后，通过PE-ELISA方法筛选特异性的纳米抗体，并制备特异性纳米抗体的噬菌粒载体用于抗体的表达和纯化；
(3)双抗夹心ELISA方法的构建：制备生物素化的纳米抗体，将带有His标签的纳米抗体作为捕获抗体，生物素化的纳米抗体作为检测抗体，在捕获抗体中加入金黄色葡萄球菌，使其与所述的捕获抗体结合，然后加入所述的检测抗体，与HRP偶联的链霉素亲和素孵育后进行显色后即成。
9.根据权利要求8所述的金葡的双抗夹心ELISA方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的灭活步骤使用0.5％的甲醛对金黄色葡萄球菌进行灭活。
10.权利要求8或9所述的金葡的双抗夹心ELISA方法的应用，其特征在于：所述的方法在制备检测试剂盒中的应用。
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