CN113185610A

CN113185610A - 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体、应用及试剂盒

Info

Publication number: CN113185610A
Application number: CN202110558555.8A
Authority: CN
Inventors: 季艳伟; 陈利莉; 王莹莹; 王建龙; 王妍入; 彭晓丽; 吴昊芬; 刘源; 张开惠
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113185610B

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体、应用及试剂盒，本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异性识别SEA，较常规单克隆抗体用途更广，特异性更强。本发明公布了这种纳米抗体及编码该纳米抗体的基因序列，生产该纳米抗体的方法以及应用了该抗体的试剂盒。本发明获得的纳米抗体可避免与金黄色葡萄球菌表面蛋白A结合，表现出较高特异性，具有稳定性好、分子量小且可大规模生产。

Description

一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体、应用及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体、应用及试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种常见的食源性致病菌，由其引起的食品中毒在革兰氏阳性菌中高居首位，其致病能力主要取决于该菌产生的肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)。SEs是由金黄色葡萄球菌分泌产生的可溶性胞外毒素蛋白质，结构相似，分子量为27.5～30kDa，热稳定性好，经100℃煮沸30min而不被破坏，因此，金黄色葡萄球菌污染的食物经过一般加热处理后，虽然细菌菌体可被杀死，但其产生的肠毒素仍然具有活性和致病力。按血清学分类，主要有A、B、Cs、D、E等血清型，其中以SEA引起的食物中毒发病率最高，主要存在于肉类，乳等蛋白质含量较高的动物性食品中，因此，对食品中SEA的检测显得尤为重要。然而，SEA的检测存在两个主要问题：首先食物基质的成分较为复杂，含有多种蛋白质、脂类及其他化合物，这些成分的存在给SEA的准确检测造成了干扰；其次，SA在食物中往往仅产生痕量或微量的SEA(ng/g)这对检测方法的灵敏度提出了较高的要求。在食物基质中实现对肠毒素的定量检测一直是一项具有挑战性的任务。目前，免疫学检测方法因具有快速、特异性强、操作简便、结果易于判断等特点被广泛应用于SEs的快速检测中。其中免疫学检测法因具有操作简单、检测速度快等特点，是SEs例行筛查检测中最常用方法且发展较为成熟的检测方法，其原理为两个识别SEA表面的两个抗原位点的抗体，在SEA存在时形成夹心结构，借助检测抗体上的标记物从而判读检测结果。目前，国内外研究制备的金黄色葡萄球菌及其肠毒素抗体均为识别其表面抗原的多克隆抗体或单克隆抗体，但是传统单克隆抗体的制备耗时耗力且产量低，且葡萄球菌蛋白A(spA)的干扰是对SEs的基于免疫学检测中最重要的问题。SpA是金黄色葡萄球菌在细胞表面展示的蛋白质，也在外部释放，强烈结合哺乳动物产生的所有IgG的Fc端，因此，用于检测金黄色葡萄球菌毒素的抗体会产生假阳性结果，使方法准确性较差，从而影响了应用价值。

纳米抗体技术，是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为单域重链抗体(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，又称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体与多克隆抗体和单克隆抗体相比，还具有以下优点：

1)无Fc识别位点，可避免与proteinA结合导致的假阳性问题；

2)具有更长的CDR3区，且CDRs区和自身的另一些结构域不存在成对互补关系，故具有更多的柔韧性和凸面性，加之小体积(12～15kD，2×2×4nm)，能其更好的和抗原表面的裂缝和腔隙相结合，从而提高纳米抗体的抗原特异性和亲和力，在纳摩尔至皮摩尔范围内都有很好的亲和力。在相同的检测范围内，单价纳米抗体的亲和力是普通二价抗体的两倍。特别对于表面结构较复杂的细菌或大分子蛋白等，纳米抗体将有利于克服表面结构的位阻效应与表面抗原识别。

3)纳米抗体稳定性高、水溶性好、可在微生物系统中大量合成表达，为纳米抗体低成本、高效率的生产创造了条件。

4)纳米抗体的C端(C-terminus)位于抗原结合位点的相反部位，易于进行定向功能化修饰，进而进行定向修饰。

目前的现有技术中，申请人于2019年8月19日申请了申请号为(201910763776.1)和(201910763782.7)的专利，专利未公开该抗体的氨基酸或核苷酸序列，且该抗体可与公开的201910763776.1专利中的纳米抗体A13形成双纳米抗体夹心配对组合，因此可进一步构建双纳米抗体夹心酶联免疫吸附法，提高SEA免疫学检测的灵敏度和特异性，以达到现场检测的要求。

发明内容

针对上述现有技术不足与缺陷，本发明的目的在于，提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150、应用及试剂盒，解决现有技术中的抗体特异性差，检测方法成本高、操作复杂的技术问题。

为了达到上述目的，本申请采用如下技术方案予以实现：

一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，包括：

互补决定区CDR1、CRD2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3所示、SEQ IDNO：5所示和SEQ ID NO：7所示。

可选的，还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2所示、SEQ ID NO：4所示、SEQ ID NO：6所示及SEQ ID NO：8所示。

一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，编码所述纳米抗体的核苷酸序列如SEQID NO：9所示。

一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体的制备方法，在驼源免疫的纳米抗体库中筛选能与靶分子SEA结特异性合的纳米抗体，并通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行制备；

所述基因工程重组表达的方式是指将本发明所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行纳米抗体的制备。

本发明所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体在金黄色葡萄球菌肠毒素A免疫学检测中的应用。

具体的，所述的免疫学检测为基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析或免疫斑点杂交。

本发明所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体用于制备金黄色葡萄球菌肠毒素A免疫检测试剂盒的应用。

一种免疫检测试剂盒，携带本发明所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体。

一种免疫检测试剂盒，为双纳米抗体夹心的酶联免疫检测试剂盒，申请号：201910763782.7中的纳米抗体A13为捕获抗体，本发明所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体为检测抗体。

本发明与现有技术相比，有益的技术效果是：

本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异性识别SEA，较常规单克隆抗体用途更广，特异性更强。本发明获得的纳米抗体可以与该抗体可与公开的201910763782.7专利申请中的纳米抗体A13形成双纳米抗体夹心配对组合，因此可进一步构建双纳米抗体夹心酶联免疫吸附法，提高SEA免疫学检测的灵敏度和特异性，以达到现场检测的要求。

本发明获得的纳米抗体可避免与金黄色葡萄球菌表面蛋白A结合，表现出较高特异性，具有稳定性好、分子量小且可大规模生产。本发明获得的纳米抗体可解决现有检测方法成本高、操作复杂、特异性差的问题，具有广阔的应用前景。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1为实施例的扩增纳米抗体基因的第一轮PCR和第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定图(泳道1为DL2000marker；泳道2为第一轮PCR产物；泳道3为第二轮PCR产物)；

图2为淘选的阳性克隆鉴定ELISA结果；

图3为抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的SDS-PAGE电泳图(泳道1为蛋白marker；泳道2、3均为纯化后的纳米抗体Anti-SEA-Nb A150)；

图4是为以噬菌体展示的纳米抗体Anti-SEA-Nb A150建立的间接ELISA标准曲线，线性范围是0.97～125ng/mL，线性关系为R²＝0.983，最低检测限为1.02ng/mL；

图5是纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的热稳定性分析；

图6是纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的特异性分析；

图7是以公开的专利号(申请号：201910763782.7)中的纳米抗体A13作为捕获抗体，以噬菌体展示的纳米抗体Anti-SEA-Nb A150作为检测抗体，构建双纳米抗体夹心酶联免疫吸附法的标准曲线，线性范围是0.97～500ng/mL，线性关系为R²＝0.99，最低检测限为1.18ng/mL。

以下结合附图和实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

具体实施方式

在通过示例性描述、实施例和结果进一步详细描述本公开的各种实施方案之前，应理解本公开的化合物、组合物和方法在应用中不限于以下描述中阐述的具体实施方案和实施例的细节。本文提供的描述仅用于说明目的，而无意在限制意义上进行解释。这样，本文所使用的语言旨在给予尽可能广泛的范围和含义，并且实施方式和实施例是示例性的，而不是穷举的。另外，应理解，本文所采用的措词和术语仅仅是出于描述的目的，除非另有说明，否则不应视为限制性的。此外，在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本公开的更透彻的理解。然而，对于本领域普通技术人员将显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况下，没有详细描述本领域普通技术人员公知的特征，以避免说明书有不必要的复杂。申请人意图将对本领域普通技术人员显而易见的所有替代、替换、修改和等同方式都包括在本公开的范围内。根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文公开的所有化合物、组合物、方法、应用和用途。因此，尽管已经根据特定实施方案描述了本公开的化合物、组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文描述的化合物、组合物、方法以及方法的步骤或步骤的顺序可以有变化而不脱离本发明构思的概念、精神和范围。

说明书中提到的或在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物(包括公开文章)均以引用的方式明确地全文并入本文，其程度与每篇单独的专利或出版物被具体和单独地指出以引用方式并入的程度相同。比如，本发明的纳米抗体与申请号为：201910763782.7中的纳米抗体A13有关联性，因此，视为将申请号为：201910763782.7的公开文本中的内容引入本发明中。

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

本发明采用SEA免疫阿拉善双峰驼，从经免疫的双峰驼的外周血淋巴细胞中提取其RNA，特异性扩增骆驼单链抗体可变区基因，从而构建纳米抗体基因库，分析其库容量及多样性。通过用噬菌体展示技术，从纳米抗体库中筛选能与靶分子(SEA)特异性结合的纳米抗体，构建纳米抗体Anti-SEA-Nb A150表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定，即得到所需要的纳米抗体Anti-SEA-Nb A150。采用淘选得到的纳米抗体建立ELISA检测法。本发明制备的纳米抗体作为一种新型的基因工程抗体，由于其独特的结构特征，抗原识别能力强，可用于快速、准确的SEA检测。

本发明采用SEA免疫双峰驼，然后利用该双峰驼外周血淋巴细胞建立了针对金黄色葡萄球菌肠毒素A的噬菌体展示纳米抗体文库。随后试验中将金黄色葡萄球菌肠毒素A吸附在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体文库，从而获得了针对了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A的特异性纳米抗体Anti-SEA-Nb A150，其具有SEQ ID NO.:1所述的氨基酸序列。

本发明所提及的纳米抗体包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)。其中，框架区(FR1～FR4)分别选自SEQID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8，互补决定区分别为(CDR1～CDR3)分别选自SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。

本发明还涉及编码该纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO.:9。

本发明提及的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。

本发明还涉及所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。

本发明所述的纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。

本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和力、特异性和稳定性等)更好的突变体。

实施例1、驼源纳米抗体噬菌体展示文库的构建

1)双峰驼的免疫

以SEA作为免疫原采用皮下多点注射方式免疫成年雄性阿拉善双峰驼，共进行五轮免疫。初次免疫采用弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)与等体积的免疫抗原乳化后进行注射，免疫剂量为100μg/只。往后每隔两周加强免疫一次，采用弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)与等体积的免疫原乳化后进行注射，每次免疫剂量为50μg/只。第五次加强免疫后第七天，采取双峰驼外周血，用于构建纳米抗体噬菌体展示文库。

2)淋巴细胞的分离

最后一次免疫后第7天，用一次性塑料血袋(含抗凝剂)采集200mL外周血，使用前用等体积的PBS稀释血液样品。将Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液平衡至室温，吸取15mL加入

淋巴细胞分离管(带多孔隔板)，用水平转子离心机1000g室温离心30s，使淋巴细胞分离液刚好位于筛网以下。将稀释好的血液样品平衡至室温后加入淋巴细胞分离管，30mL/支，用水平转子离心机1000g室温离心10min，离心机制动加速度调为0。离心后红细胞位于淋巴细胞分离管底部，最上层为血浆，血浆与白色透明淋巴细胞分离液之间的一层环装乳白色物质即为淋巴细胞，用滴管小心移去上层血浆，直到距离细胞层5～10mm。用滴管收集淋巴细胞至另一干净的50mL离心管中，加入至少10倍体积的冰浴的PBS，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。弃去上清，用45mL冰浴的PBS重悬细胞，250g，4℃离心10min，用同样方法再洗涤细胞两次。最后一次离心后，用10mL冰浴的PBS重悬细胞，用血细胞计数板进行计数，计数后分装于1.5mL离心管中，1×10⁷个细胞/支，250g，4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀直接用于RNA提取，或-80℃保存备用。

3)淋巴细胞RNA的提取

在离心管中加入1mL Trizol试剂，用移液器吹打离心管底部的淋巴细胞团块，把其打散；

向上述裂解液中加入1/5体积氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15s，室温静置5min。4℃，12000g离心10-15min。小心吸取上层水相至新离心管中，加入1/2体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10min。4℃，12000g离心10min。小心弃去上清，加入等体积75％乙醇。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。4℃，7500g离心5min，弃上清。室温放置空气干燥5～10min。加入30～100μL无RNase水溶解RNA，待完全溶解后，取少量检测，其余溶液-70℃保存。测定总RNA的OD₂₆₀及OD₂₆₀/OD₂₈₀，确定总RNA的浓度和质量。

4)cDNA的合成和VHH基因的扩增

以总RNA为模板，采用反转录PCR经两步反应合成cDNA，具体步骤如下：按照反转录PCR体系1(见表1)配制反应体系，65℃反应5min后立即冰浴；在第一步反应液中加入按照反转录PCR体系2(见表2)配制反应体系中，反应条件42℃，30min，50℃，60min，70℃，15min；PCR产物-20℃冻存备用。

表1反转录PCR体系1

表2反转录PCR体系2

根据双峰驼VHH上下游序列，用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，并送公司合成引物，序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；

VHH-FOR：

5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’；

VHH-REV：

5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’。

第一轮PCR：以cDNA为模板，利用引物CALL001和引物CALL002进行第一轮PCR扩增，反应体系为PCR体系3，详见表3：

表3第一轮PCR体系3

反应条件：95℃、5min，95℃、30s；55℃、30s，72℃、45s；30个循环；72℃、10min。4℃保存。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切去700bp附近的目的条带，用割胶回收试剂盒按照说明书操作步骤回收PCR产物，测定回收产物的浓度用于下一步实验。

第二轮PCR：以第一轮PCR胶回收产物(700bp附近的条带)为模板(如附图1)，用引物VHH-FOR和VHH-REV扩增VHH基因片段，反应体系为4：详见表4；反应条件：98℃、10s，55℃、15s，72℃、30s；72℃、10min，30个循环。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带(400bp附近)(如附图1)，用胶回收试剂盒按照说明书操作步骤回收PCR产物，测定回收产物的浓度用于下一步实验。

表4第二轮PCR体系4

5)文库的构建和鉴定：

载体和插入片段的酶切反应：按照表5的酶切体系，Sfi I 50℃过夜酶切pHEN I噬菌粒载体和VHH片段。

表5 Sfi I酶切反应体系

琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，采用DNA纯化试剂盒纯化回收酶切产物。

载体和插入片段的连接

按表6的连接体系进行连接反应，并设置阴性对照和阳性对照。

表6连接反应体系

16℃反应12h；加入5μL 3M乙酸钠(pH5.2)后，再加入125μL的冷无水乙醇，-20℃放置1h。4℃，10000g离心15min，弃上清；70％的冷乙醇清洗沉淀；4℃，10000g离心5min，弃上清；真空干燥后，20μL无菌水重悬沉淀，定量并-20℃冻存备用。

连接产物的电转化：取5μL连接产物加至80μL感受态细胞E.coli TG1中，充分混匀，冰上放置1min。转入0.1cm的电击杯中电击转化(电压为1.8kV)，立即向电击杯中加入900μL LB培养基，37℃160rpm培养1h。将菌液涂布于LB-AG平板，37℃倒置培养过夜。

初始文库的救援：接种超过10倍库容量的细胞于100mL2×YT/amp/2％葡萄糖，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体(20:l感染复数)，37℃，静置15min后，220rpm培养45min；4℃，1000g离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃10000rpm离心10min，取上清；加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃静置3～4h；4℃10000rpm离心15min，弃上清，沉淀用1mL PBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。

实施例2：纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

1)纳米抗体的亲和淘选：首先，用PBS(pH7.4)将SEA稀释至终浓度5μg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.1％Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入5％BSA-PBS(或5％OVA-PBS)37℃封闭1小时。然后用PBST洗涤6次，每孔加入100μL驼源单域重链抗体库(滴度约2.0×10¹¹cfu)，37℃孵育2小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M,pH2.2)洗脱8min后，立即用15μL Tris-HCl(1M，pH9.1)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染25mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、第三和第四轮的淘选过程中，包被的SEA浓度分别为2.5μg/mL，1.25μg/mL和0.625μg/mL，加入噬菌体孵育后用PBST洗涤次数分别为12次，15次和18次，其余步骤同上。

2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮和第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取172个克隆，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，用PBS(pH7.4)将SEA稀释至500ng/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100μL噬菌体扩增液(2.0×10¹¹cfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)测定450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆，共得到116株阳性克隆(附图2所示)。经测序共得到7株序列不同的序列，分别为Anti-SEA-Nb A12、Anti-SEA-Nb A26、Anti-SEA-Nb A40、Anti-SEA-Nb A126、Anti-SEA-Nb A135、Anti-SEA-Nb A150、Anti-SEA-Nb A155，其中Anti-SEA-Nb A26与本人申请的(申请号：201910763782.7)中的纳米抗体A13序列一致。为构建针对SEA的双抗体夹心免疫分析方法，对此七种序列进行双纳米抗体夹心实验。

实施例3：双纳米抗体夹心ELISA配对实验

以纳米抗体作为捕获抗体，以噬菌体展示纳米抗体作为检测抗体进行两两配对。将七种纳米抗体均用PBS(pH7.4)稀释至10μg/mL，4℃包被过夜，第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；将SEA用PBS(pH7.4)稀释至500ng/mL，37℃孵育1小时；而后加入100μL稀释至2×10¹⁰pfu/mL的噬菌体展示的纳米抗体，37℃孵育1小时；加入1:10000稀释HRP标记的M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色15min，测定OD₄₅₀。以P_OD450(SEA＝500ng/mL)/N_OD450(SEA＝0ng/mL)作为参数，结果如表1所示，其中以Anti-SEA-Nb A26，即为(申请号：201910763782.7)中的纳米抗体A13为捕获抗体，以Anti-SEA-Nb A150为检测抗体时，其P_OD450(SEA＝500ng/mL)/N_OD450(SEA＝0ng/mL)最大。

表1

实施例4：纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将Anti-SEA-Nb A150克隆进行DNA测序，根据DNA测序结果及密码子表用Bioedit软件可获得纳米抗体的氨基酸序列，即纳米抗体Anti-SEA-Nb A150，并确定抗体序列的框架区和互补决定区。

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的氨基酸序列如SEQ IDNO.:1所示

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150框架区FR1氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示；

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150框架区FR2氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示；

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150框架区FR3氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示；

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150框架区FR4氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示；

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150互补决定区CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示；

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150互补决定区CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示；

抗金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150互补决定区CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示；

金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的核苷酸序列如SEQ IDNO.:9所示。

实施例5：Anti-SEA-Nb A150纳米抗体的大量制备

(1)以噬菌体扩增的方式进行制备

将展示有阳性纳米抗体的噬菌体加入至20mL接种有E.coli TG1的培养物中，37℃、220rpm振荡培养6h。将培养物转入另一离心管中，4℃、10000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置120min后，4℃、10000rpm离心10min，弃上清；再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃10000rpm离心10min，弃上清，加入1mLPBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

(2)以蛋白表达的形式进行制备

提取Anti-SEA-Nb A150克隆的质粒，将重组表达载体转入大肠杆菌Top10’。从转化平板上挑一单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB/Amp，2％葡萄糖培养基中，37℃，220r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD₆₀₀达到0.5时，向培养物中加入0.1mM的IPTG，30℃，220r/min振荡培养8～12h；将培养物于4℃，8000rpm，离心20min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心20min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体Anti-SEA-Nb A150(SDS-PAGE结果如图3所示)。

实施例6：间接ELISA标准曲线的建立

采用间接ELISA的方法进行纳米抗体Anti-SEA-Nb A150灵敏度的鉴定，具体方法为：用PBS(pH7.4)将SEA至500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.81、3.90625、1.95、0.98、0.49、0.24、0ng/mL，4℃包被过夜；第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；加入100μL 10μg/mL的噬菌体展示的纳米抗体Anti-SEA-Nb A150，37℃孵育1小时；加入1:10000稀释HRP标记的抗M13抗体100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min，测定OD₄₅₀，绘制标准曲线(如附图4所示)，线性范围是0.97～125ng/mL，线性关系为R²＝0.99，最低检测限为1.02ng/mL。

实施例7纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的热稳定性评估

包被：用PBS(pH7.4)将SEA至500ng/mL，4℃包被过夜；第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；PBST(10mMPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次；将纳米抗体用PBS稀释至10μg/mL，分别置于30，40，50，60，70，80，90℃水浴10min，恢复到室温后，再分别取100μL加入处理好的板条中，37℃孵育1小时；加入1:10000稀释HRP标记的抗HA抗体100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min，测定OD₄₅₀。比较不同温度处理条件下的吸光度值，得出纳米抗体的耐热能力，结果表明在37～70℃之间，可保持较好的抗原结合能力，表明纳米抗体Anti-SEA-Nb A150具有一定的热稳定性(附图5所示)。

实施例8：纳米抗体Anti-SEA-Nb A150特异性鉴定

采用ELISA的方法进行纳米抗体Anti-SEA-Nb A150的特异性鉴定，具体方法为：用PBS(pH7.4)将金黄色葡萄球菌肠毒素B、金黄色葡萄球菌肠毒素C分别稀释至500ng/mL，将金黄色葡萄球菌ATCC25923，金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌ATCC26111分别稀释至10⁷cfu/mL，4℃包被过夜；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入100μL辣根过氧化氢酶与纳米抗体的偶联物，37℃孵育1小时；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min，加入50μL 2MH₂SO₄终止液终止反应后，测定OD₄₅₀。结果见附图6，Anti-SEA-Nb A150纳米抗体与金黄色葡萄球菌肠毒素B、金黄色葡萄球菌ATCC25923，金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌ATCC26111均无交叉反应，表明纳米抗体Anti-SEA-Nb A150与金黄色葡萄球菌表明蛋白A无结合，表现出较好的特异性。

实例9双纳米抗体夹心ELISA方法线性分析

采用双抗体夹心ELISA的方法进行灵敏度的鉴定，具体方法为：将纳米抗体A13用PBS(pH7.4)稀释至10μg/mL，4℃包被过夜，第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；将SEA用PBS(pH7.4)稀释至1500、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.81、3.90625、1.95、0.98、0.49、0.24、0ng/mL，37℃孵育1小时；而后加入100μL稀释至2×10¹⁰pfu/mL的噬菌体展示的纳米抗体Anti-SEA-NbA150，37℃孵育1小时；加入1:10000稀释HRP标记的M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色15min，测定OD₄₅₀，绘制标准曲线(附图7所示)，线性范围是0.97～500ng/mL，线性关系为R²＝0.98，最低检测限为1.18ng/mL，表现出较好的灵敏度。

从前面的描述将理解，可以在不背离其真实精神的情况下，对本公开的各种实施方式进行各种修改和改变。除非特别指出，否则本文提供的描述仅用于说明目的，而无意在限制意义上进行解释。因此，尽管这里已经结合某些非限制性的实施方式描述了本公开，使得可以更充分地理解和领会其各方面，但是并不意味着本公开限于这些特定的实施方式。相反，所有替代、修改和等同方式均意图包括在本文所定义的本公开的范围内。因此，上述各示例，包括具体的实施方案，将用于举例说明本公开的实践，应当理解，所示的细节仅是示例性的，仅是出于对特定实施方式的说明性讨论的目的，并且是为了提供被认为是对程序以及发明构思的原理和概念方面的有用且容易理解的描述而展示的。可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下对本文所述的各种组分和组合物的配制，本文所述的方法或本文所述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。

核苷酸序列表电子文件

<110>西北农林科技大学

<120>一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体、应用及试剂盒

<160>9

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）氨基酸序列

<400> 1

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser 20

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg 40

Glu Gly Val Ser Cys Ile Asn Trp Asn Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Met Pro Ile Leu Asp 100

Asp His Gly Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 116

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）FR1

<400> 2

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）CDR1

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met Gly

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）FR2

<400> 4

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）CDR2

<400>5

Asn Trp Asn Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Ala

<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）FR3

<400>6

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）CDR3

<400>7

Gly Arg Met Pro Ile Leu Asp Asp His Gly Tyr Val Tyr

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 双峰驼（Llama）FR4

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

<210> 9

<211> 348

<212> DNA

<213> 双峰驼（Llama）核苷酸序列

<400> 9

GAGTCTGGAG GAGGCTTGGT GCAGGCAGGG GGGTCTCTGA GACTCTCCTG 50

TACAACCTCT GGATTCACTT TTGATGATTA TGCTATGGGC TGGTTCCGCC 100

AGGCTCCAGG GAAGGAGCGC GAGGGGGTCT CATGTATTAA TTGGAATGGT 150

GCGAACGCAT ACTATGCGGA CTCCGTGAAG GGCCGATTCA CCATCTCCAG 200

AGACAACAAC AAGAACACCC TGTATCTGCA AATGAACAGC CTGAAACCTG 250

AGGACACGGC CTTGTATTAC TGTGCGGCCG GACGGATGCC GATTTTGGAT 300

GACCATGGCT ATGTCTACTG GGGCCAGGGG ACCCAGGTCA CCGTCTCC 348

Claims

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，其特征在于，包括：

互补决定区CDR1、CRD2和CDR3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3所示、SEQ ID NO：5所示和SEQ ID NO：7所示。

2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，其特征在于，还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2所示、SEQ ID NO：4所示、SEQ IDNO：6所示及SEQ ID NO：8所示。

3.一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体，其特征在于，编码所述纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

5.一种金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体的制备方法，其特征在于，在驼源免疫的纳米抗体库中筛选能与靶分子SEA结特异性合的纳米抗体，并通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行制备；

所述基因工程重组表达的方式是指将权利要求1～4任一所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行纳米抗体的制备。

6.权利要求1～4任一所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体在金黄色葡萄球菌肠毒素A免疫学检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的免疫学检测为基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析或免疫斑点杂交。

8.权利要求1～4任一所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体用于制备金黄色葡萄球菌肠毒素A免疫检测试剂盒的应用。

9.一种免疫检测试剂盒，其特征在于，携带权利要求1～4任一所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体。

10.一种免疫检测试剂盒，其特征在于，为双纳米抗体夹心的酶联免疫检测试剂盒，申请号：201910763782.7中的纳米抗体A13为捕获抗体，权利要求1～4任一所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A纳米抗体为检测抗体。