CN115232212B - 一种trop-2特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种TROP‑2特异性纳米抗体及其应用，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体60、纳米抗体Nb65或纳米抗体Nb108中的至少一种。本发明所述的TROP‑2特异性纳米抗体可用于多种肿瘤靶向治疗的临床开发，还可工程改造成双特异性纳米抗体，具有更强的特异性、靶向性和更低的脱靶毒性的靶向治疗药物，可以有效避免全长单克隆抗体治疗免疫逃逸和抗体耐药的缺陷。

Description

一种TROP-2特异性纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种TROP-2特异性纳米抗体及其应用。
背景技术
研究报道，肿瘤相关钙信号转导蛋白2(TROP-2)在许多肿瘤组织的表达水平显著高于正常组织，其过表达与乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等恶性肿瘤的预后不良、患者生存期缩短等密切相关。目前靶向TROP-2抗肿瘤的研究大多基于单克隆抗体药物，但由于其高成本和生产过程的复杂性以及相对较大的尺寸阻止mAb渗透到实体瘤组织中，并导致全身积累等，所以单克隆抗体的应用受到了一定的限制。在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)，克隆并表达重链抗体的重链可变区得到重链抗体的抗原识别和结合域，称为纳米抗体(Nanobody, Nb)，作为最小的天然抗体(12-15kDa)，纳米抗体具有适合诊疗开发的独特特性。首先小分子尺寸使纳米抗体相对容易渗透到组织中，穿过血脑屏障；其次在保持对抗原的高结合亲和力的同时，纳米抗体长而灵活的CDR3区允许与靶抗原的裂缝和空腔结合，因此，纳米抗体可以识别其他抗体难以识别的隐藏表位；此外，纳米抗体可以更方便地设计成多个功能域以产生多价/多特异性纳米抗体，从而获得更多的治疗应用功能；除以上所述，纳米抗体还具有可溶性极高，不易发生聚集沉淀，具有很高的稳定性，能够在高温、强酸、强碱等致变性条件下保持抗原结合活性，适合于原核及真核表达系统等优势，因此，纳米抗体更适合开发临床诊疗体系。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种TROP-2 特异性纳米抗体及其应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种TROP-2特异性纳米抗体，所述的特异性纳米抗体为纳米抗体60、纳米抗体Nb65或纳米抗体Nb108中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb60：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的CDR3 的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
对于纳米抗体Nb65：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR3 的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
对于纳米抗体Nb108：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的CDR3 的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步，所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、 FR4；
对于纳米抗体Nb60：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.13 所示；
对于纳米抗体Nb65：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.17 所示；
对于纳米抗体Nb108：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.21 所示。
进一步，所述的纳米抗体Nb60的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述的纳米抗体Nb65的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述的纳米抗体Nb108的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在制备用于肿瘤诊断的药物中的应用；所述的药物通过荧光示踪或放射性标记偶联的方法制成。
所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在制备ADC药物中的应用；所述的ADC药物通过由所述的特异性纳米抗体与小分子抗癌药物的偶联制得。
所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在制备用于肿瘤的靶向免疫治疗的药物中的应用；所述的药物通过由所述的特异性纳米抗体与肿瘤免疫检查点抑制剂的偶联制得。
所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在制备用于血液中肿瘤靶标的检测试剂中的应用。
所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，所述的特异性纳米抗体在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
进一步，所述的肿瘤为实体瘤和/或转移瘤；所述的实体瘤为肝癌、胃癌、结直肠癌、肺癌或胰腺癌中的至少一种。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的TROP-2特异性纳米抗体可用于多种肿瘤靶向治疗的临床开发，还可工程改造成双特异性纳米抗体，具有更强的特异性、靶向性和更低的脱靶毒性的靶向治疗药物，可以有效避免全长单克隆抗体治疗免疫逃逸和抗体耐药的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例所述的Trop-2特异性纳米抗体筛选富集率的柱状图；
图2为本发明实施例所述的Trop-2特异性纳米抗体筛选阳性克隆的柱状图；
图3为本发明实施例所述的Trop-2特异性纳米抗体蛋白电泳图；
图4为本发明实施例所述的Trop-2特异性纳米抗体免疫印迹图；
图5为本发明实施例所述的TROP-2特异性纳米抗体的亲和力图： 5-A为纳米抗体Nb60，5-B为纳米抗体Nb65，5-C为纳米抗体Nb108；
图6为本发明实施例所述的Trop-2特异性纳米抗体结合HCT116 细胞流式分析图：6-A为纳米抗体Nb60，6-B为纳米抗体Nb65，6-C 为纳米抗体Nb108，6-D为阳性对照，6-E为阴性对照；
图7为本发明实施例所述的TROP2特异性纳米抗体抑制肿瘤迁移划痕实验图：7-A为细胞迁移图，7-B为伤口闭合百分比；
图8为本发明实施例所述的TROP2特异性纳米抗体抑制肿瘤迁移 transwell实验图：8-A为细胞迁移图，8-B为迁移细胞的数量。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1基于TROP-2胞外结构域重组蛋白的羊驼免疫和纳米抗体文库构建
选择健康年轻的成年羊驼进行人TROP-2胞外重组蛋白(ACRO Biosystems，purity＞95％)的免疫注射，每次于羊驼颈部皮下注射免疫100μg，每周一次，总共免疫6次。在进行最后一次免疫后的第3天，通过采血针从羊驼颈部静脉取血，共采取90mL血液。使用抗凝真空采血管收集并储存血液。通过SepMateTM离心管密度梯度离心分离淋巴细胞，然后用TRIzolTM试剂法提取淋巴细胞中的总RNA，以RNA为模板反转录成cDNA，之后通过两轮巢式PCR扩增得到VHH 片段。
第一轮PCR通过引物CALL001：5′-GTC CTG GCT GCT CTT CTA CAA GG-3′(氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示)和CALL002：5′ -GGT ACG TGC TGT TGA ACT GTT CC-3′(氨基酸序列如SEQ ID NO.50 所示)扩增来自常规抗体和重链抗体(HCAb)的可变结构域到CH2结构域之间的信号序列，得到序列长度为～900bp的IgG1抗体重链以及序列长度为～700bp的IgG2和IgG3抗体重链。之后通过1％琼脂糖核酸电泳将这两条带分离，将产物中～700bp的条带进行切胶回收并相应纯化后，作为第二轮PCR的模板。第二轮PCR用带有Not I 和Pst I两个限制酶酶切位点的引物SapI-PMCF primer和 VHH-BACK-SapI对～700bp IgGs进行再扩增得到VHH片段，用 QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后，在NotI和PstI限制性内切酶和 T4DNA连接酶的作用下将PMECS-GG质粒和VHH片段边酶切边连接成重组质粒，重组质粒通过苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)纯化后，用GenePulser XcellTM电穿孔仪转化至大肠杆菌TG1感受态细胞中，将转化产物涂布于含有2％(w/v)葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置过夜培养，第二天用细胞刮刀收集平板上的菌落，重悬于含10％甘油的LB液体培养基中，保存于 -80℃，同时通过梯度稀释和平板计数，计算文库的库容量，以GⅢ和MP57为引物，从梯度稀释的LB培养基平板上随机挑选48个单菌落进行菌落PCR以测定VHH正确插入率。
实施例2针对Trop2胞外结构域的纳米抗体的生物淘选
运用噬菌体展示技术进行三轮淘选，将1mL纳米抗体文库接种到300mL含1％(w/v)葡萄糖以及100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基中，在37℃下以225rpm培养2h，使菌液孵育至指数期(OD 600nm ＝0.5-0.6)，然后加入～1012VCSM13辅助噬菌体室温侵染TG1 30min，离心收集被侵染后的TG1，重悬于新的300mL含100μg/mL氨苄青霉素和70μg/mL卡那霉素的2×TY培养基中，在37℃下以225rpm 过夜培养后，离心弃去菌体沉淀，上清液用PEG6000/Nacl冰上沉淀 1h后离心收集沉淀并重悬于1mL无菌PBS中。各取100μL侵染 96孔板过夜包被的抗原孔“+”孔和PBS对照孔“-”孔1h，然后用 PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤10次(第二轮洗涤25次，第三轮洗涤20次)除去未结合的噬菌体，结合的噬菌体用100μL 三乙胺(100mM TEA，pH 11.0)洗脱10min并用100μL Tris-HCl (1.0M，pH 7.4)中和后转移至无菌EP管中(共200μL)。取其中10μL在96孔细胞培养板中按从上到下的顺序用PBS进行 10-10-7稀释，然后各取10μL不同稀释度的噬菌体加入到含有90 μL已培养至指数生长期的TG1细胞中。37℃侵染30min后，将 50μL含各稀释度的TG1涂布于LB固体平板上，37℃培养过夜。剩余的噬菌体颗粒感染TG1细胞用于重新扩大培养(即最后重悬于 300mL含有100μg/ml氨苄青霉素和70μg/ml卡那霉素的2×TY 培养基中)，用于下一轮的淘选。经过三轮淘选，富集到对抗原具有高亲和力的TG1细胞，结果如图1所示。
实施例3特异性纳米抗体的表达与纯化
将挑出的不同纳米抗体序列的菌株质粒，化转入大肠杆菌WK6感受态细胞中，并在LB固体平板上37℃过夜培养，然后挑取单菌落接种至300mL含0.1％(w/v)葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素和2mM MgCl2的TB培养基中，37℃培养至OD600达到0.6-0.9时，添加终浓度为1mM的IPTG，28℃，180rpm过夜诱导表达纳米抗体，第二天离心收集菌体，利用渗透压休克法获得含有纳米抗体的周质提取液，之后通过固定化金属亲和层析(IMAC)进行纳米抗体纯化，即使用HisPurTM Ni-NTA 树脂(Thermo-Scientific)将提取液装载到PD-10柱(GEHealthcare) 上，PBS洗去非特异性组分后，用500mM咪唑洗脱树脂中与Ni2+紧密结合的His-标签蛋白即纳米抗体，收集洗脱组分，并通过尺寸排阻色谱(SEC)进一步纯化。纯化的纳米抗体经SDS-PAGE和免疫印迹分析鉴定。
实施例4用酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆
在三轮淘选的平板上随机挑选190个单菌落，接种到含10％(w/v) 甘油，2％(w/v)葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基的 96孔细胞培养板中，37℃过夜静置培养后，取10μL接种到含0.1％ (w/v)葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素2×TY培养基的2mL深孔板中，37℃振荡直至OD600达到1左右，添加终浓度为1mM的IPTG，诱导表达纳米抗体，4h后通过冻融法得到含纳米抗体的周质提取物，运用Elisa法挑选特异性菌株，即将100μL周质提取物分别加入到含抗原(0.1μg人Trop2重组蛋白)的“+”孔和PBS对照的“-”孔(已1％明胶室温封闭1h)，然后PBST洗涤5次后依次孵育1： 5000稀释的Mouse anti-HA MAb(一抗)和带有碱性磷酸酶的Goat anti-Mouse MAb(二抗)各室温1h，洗涤后加入2μg/mL的底物对硝基苯磷酸二钠，显色5min，15min，30min，60min，测定405 nm处的OD值，如图2所示，选出OD值为阴性对照至少2倍的菌株为阳性菌株，对阳性菌株提取质粒进行测序，挑选不同序列的菌株为最终特异性菌株。
实施例5特异性纳米抗体的表达与纯化
将不同序列菌株的PMECS-GG质粒化转入大肠杆菌WK6感受态细胞中，并在LB琼脂平板上37℃倒置过夜培养，然后挑取单菌落接种到含0.1％(w/v)葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素和2mM MgCl2的 TB培养基中，37℃，220rpm培养至OD值达到0.6-0.9时，接种终浓度为1mM的IPTG并在28℃，180rpm过夜诱导表达纳米抗体，第二天8000rpm、14℃离心收集菌体后，利用渗透压休克法获得含纳米抗体的周质提取物。之后通过固定化金属亲和层析(IMAC)进行纳米抗体纯化，即使用HisPurTM Ni-NTA树脂(Thermo-Scientific)将提取液装载到PD-10柱(GE Healthcare)上，PBS洗去非特异性组分后，用500mM咪唑洗脱树脂中与Ni2+紧密结合的His-标签蛋白即纳米抗体，收集洗脱组分，并通过尺寸排阻色谱(SEC)进一步纯化。纯化的纳米抗体经SDS-PAGE和WB免疫印迹分析鉴定，如图3-4所示。
实施例6所选纳米抗体的亲和力分析
使用BiacoreTM T100仪器对Nbs进行动力学分析，将10μ g/mL重组TROP-2稀释在10mM乙酸钠(pH 4.0)中，并以约1400 RU的密度固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上使用标准胺偶联化学方法，在25℃，HBS-N(GE Healthcare)作为运行缓冲液，为评估KD，以30μL/min的流速注入不同浓度的Nbs，结合3分钟，然后分离10分钟。
对于芯片再生，以10μL/min的流速注入10mM甘氨酸(pH 2.0)(GE Healthcare)1分钟。对于数据分析，使用BiacoreTM T100 评估软件评估双重参考数据，结果如图5与表1所示。
表1 TROP-2特异性纳米抗体的性质
Nb60 Nb65 Nb108
分子量/kDa 16.782 16.275 15.456
等电点 6.30 6.64 6.30
亲和力/M 7.443×10-10 3.539×10-8 1.188×10-7
实施例7流式细胞术确证特异性纳米抗体
选择阳性细胞模型HCT116细胞复苏并培养，收集对数生长期的细胞，进行分组，每组1×106个，其中一组为空白，一组为空白+荧光二抗Goat-anti-mouse Alexa Fluor 488，阳性对照组孵育Trop2 单克隆抗体(Abcam)，其他每组细胞收集后各冰上孵育10μg纳米抗体30min，用含1％BSA的冰冷无菌PBS洗涤两次，每次1500rpm， 4℃，5min，然后冰上孵育Mouse anti-HA MAb(一抗)250ng以及 goat-anti-mouse Alexa Fluor 488(二抗)250ng各30min，各用含1％BSA的冰冷无菌PBS洗涤两次，每次1500rpm，4℃，5min，最后用500μL冰冷无菌PBS重悬细胞过筛后在流式细胞仪上机检测，数据用FlowJo软件进行分析，如图6所示。
实施例8伤痕愈合和Transwell实验
将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞生长至100％融合后，用无菌的20μL移液器吸头刮擦细胞层。用PBS洗掉悬浮的细胞，并用补充有10μg Nbs的1％含血清培养基代替。另一组补充了无Nbs培养基作为对照。第一张照片是立即用倒置显微镜获得的，并将板在37℃的培养箱中培养，通过在24、48小时后拍摄快照照片来量化细胞迁移和伤口闭合的速度，结果如图7所示。图片由Image J软件分析。
在进一步的迁移验证实验中，将含有1％FBS和20μg Nbs的培养基中的1×105HCT116细胞接种到Transwell插入物(8-μm 孔径；Corning Inc.)的上室中，完全培养基含有10％将FBS作为化学引诱剂添加到下室。在37℃、5％CO2培养箱中孵育36h后，取出Transwell小室，弃去孔中的培养基并用PBS洗涤，然后将细胞在4％多聚甲醛中室温固定15min，然后0.1％结晶紫染色20min 后，用棉签轻轻擦去上层未迁移的细胞，倒置荧光显微镜下计数。通过间接计数评估迁移细胞的数量，用33％乙酸洗脱结晶紫，在570nm 处读取吸光度。结果如图8所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种TROP-2特异性纳米抗体及其应用
<130> 2022.5.26
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Arg Ser Lys Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ala Cys Asp Asp Asp Asp Glu Gly Gly Ile Ile Lys Met Arg Ser
1 5 10 15
Ser Ser Thr Val Val Trp Tyr Tyr Tyr Tyr
20 25
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Ser Trp Asn Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Arg Thr Phe Asn Arg Tyr Ala
1 5
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ala Asp Glu Phe Gly Leu Asn Pro Arg Arg Ser Thr Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Arg Thr Phe Ser Thr Phe Ala
1 5
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ala Ala Asp Asp Glu Gly Leu Ser Thr Val Val Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 12
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asn
20 25
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 16
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Leu Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Glu Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Thr
1 5 10 15
Ala
<210> 20
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ile Arg Ser Lys Asp Gly Ser
20 25 30
Thr Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Cys Asp Asp Asp Asp Glu Gly Gly Ile Ile Lys Met Arg Ser
100 105 110
Ser Ser Thr Val Val Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 23
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asn Ile Ser Trp Asn Gly Gly Arg
20 25 30
Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Val Gly Arg Thr Phe Asn Arg Tyr Ala Asp Leu Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Glu Phe Gly Leu Asn Pro Arg Arg Ser Thr Trp Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Thr Ala Gly Arg Thr Phe Ser Thr Phe Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asp Asp Glu Gly Leu Ser Thr Val Val Tyr Tyr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (6)

1.一种TROP-2特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体为纳米抗体60、纳米抗体Nb65或纳米抗体Nb108中的至少一种；
所述的特异性纳米抗体包括3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
对于纳米抗体Nb60：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
对于纳米抗体Nb65：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
对于纳米抗体Nb108：所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的TROP-2特异性纳米抗体，其特征在于：所述的特异性纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4；
对于纳米抗体Nb60：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
对于纳米抗体Nb65：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
对于纳米抗体Nb108：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
3.根据权利要求2所述的TROP-2特异性纳米抗体，其特征在于：所述的纳米抗体Nb60的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述的纳米抗体Nb65的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述的纳米抗体Nb108的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在制备用于结直肠癌诊断的药物中的应用；所述的药物通过荧光示踪或放射性标记偶联的方法制成。
5.权利要求1-3中任一项所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在制备用于血液中TROP-2的检测试剂中的应用。
6.权利要求1-3中任一项所述的TROP-2特异性纳米抗体的应用，其特征在于：所述的特异性纳米抗体在制备用于抗结直肠癌的药物中的应用。
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