CN110498854A

CN110498854A - 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的抗体及其应用

Info

Publication number: CN110498854A
Application number: CN201910928555.5A
Authority: CN
Inventors: 曾浩; 刘圆圆; 邹全明; 宋振; 张卫军; 赵安妮; 赵莉群
Original assignee: Army Medical University
Current assignee: Army Medical University
Priority date: 2019-09-28
Filing date: 2019-09-28
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2039-09-28
Also published as: CN110498854B

Abstract

本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体及其应用，该抗体重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示或具有同等功能的功能性活性CDR变体组成；轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示或具有同等功能的功能性活性CDR变体组成；该抗体能够特异结合金黄色葡萄球菌肠毒素B或者游离的肠毒素B，可以用于治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染中的用途，将可成为“非抗生素”治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染和控制耐药性发展研究领域的重要方向。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫领域，具体涉及一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，还涉及该抗体的应用。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是“超级细菌”的典型代表，其致病性强、传播途径广、易暴发流行，且呈多重高度耐药性发展。MRSA是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌，感染以急性、化脓性为特征，全身可导致脓毒血症、急性肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等严重感染及并发症，感染病死率高达20％；局部可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈。同时，MRSA的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B是金黄色葡萄球菌最常见和有效的外毒素之一，可与主要组织相容性复合物(MHC)II类分子和T细胞受体(TCR)的特定Vβ区域结合，导致单核细胞/巨噬细胞和T淋巴细胞的活化，并诱导高水平的促炎细胞因子和趋化因子。全身炎症因子可能会导致对患者潜在致命的中毒性休克综合征(TSS)。此外，SEB常与食物中毒有关，引发呕吐、腹痛和腹泻等症状。由于SEB容易使用基因工程技术大量生产，具有气溶胶稳定性，可作为致死和致残剂，是理想的生物毒素，被疾病预防控制中心(CDC)归类为B类选择毒剂。由于缺乏对受影响人群进行大规模治疗的有效医疗对策，对SEB的担忧更加复杂。

针对SEB目前没有批准的疫苗或者特定的药物治疗，目前的研究提出了多种治疗方法，包括小分子治疗剂，针对SEB的疫苗，以及SEB靶向单克隆抗体。立即发挥其作用的抗体是抗生素和疫苗的良好伴侣，可代表与紧急干预相关的感染的最佳方法，也可能是无法正确接种疫苗的免疫缺陷患者的最佳选择，代表着缓解和治疗SEB引起的中毒性休克综合征和金黄色葡萄球菌感染的可能。基于抗体药物为核心的被动免疫治疗MRSA感染具有巨大的发展应用前景，将可成为“非抗生素”治疗MRSA感染和控制耐药性发展新的免疫防治手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体；本发明的目的之二在于提供编码所述抗体的核苷酸序列；本发明的目的之三在于提供含有所述核苷酸序列的载体；本发明的目的之四在于提供含有所述的载体宿主细胞；本发明的目的之五在于提供所述抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B或者游离的肠毒素B的试剂或药品中的应用；本发明的目的之六在于提供所述抗体在制备治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，所述抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示或具有同等功能的功能性活性CDR变体组成；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示或具有同等功能的CDR变体组成。

所述具有同等功能的功能性活性CDR变体指保留了原氨基酸序列的生物学特性，同样能够特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B的相应片段的CDR变体。

本文使用的术语“变体”指的是通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，或通过化学衍生化氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列中的核苷酸，或序列的一个或两个远端来修饰这一序列所得到的序列，还包括天然等位突变，其中，修饰不会影响(特别是不会损失)这一序列的活性。

本发明中，术语“CDR区”意指抗体的互补决定区，即决定抗体对特定抗原的特异性的区域。重链和轻链两者上的CDR1至CDR3共同组成抗体的抗原结合部位。

所述抗体的重链CDR区位置如下：

VH外显子内的CDR1区氨基酸26至33，

VH外显子内的CDR2区氨基酸51至58，

VH外显子内的CDR3区氨基酸97至118。

所述抗体的轻链CDR区位置如下：

Vλ外显子内的CDR1区氨基酸26至33，

Vλ外显子内的CDR2区氨基酸51至53，

Vλ外显子内的CDR3区氨基酸90至100。

本发明中，所述抗体的恒定区包括人源IgM、IgA或IgG恒定区中的任意一种。

本发明中，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、单域抗体、完全或部分人源化抗体或者嵌合抗体中的任意一种；优选地，所述抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，优选为IgG1；和/或，包含或由VL/VH区域对和抗体恒定域组成的抗体，如scFv、Fab、F(ab′)2或Fv特定抗体。

优选地，本发明的单克隆抗体的轻链可以是κ型或λ型的。

在一个优选的实施例中，轻链是λ型的。

本发明的单克隆抗体的重链可以选自：同种型IgM、IgA、或IgG，优选为IgG。在一个优选的实施例中，单克隆抗体的重链是IgG型的。

本发明中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4至少85％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与SEQ ID NO.8至少85％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列。

优选的，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4至少90％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与SEQ ID NO.8至少90％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列.

更优选的，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4至少95％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与SEQ ID NO.8至少95％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列。

本发明中，所述金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸如SEQ ID NO.1所示；所述金黄色葡萄球菌肠毒素B部分氨基酸序列如SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示。

本发明中，所述抗体与SEB结合的平衡解离常数不高于1×10^-8M。如：1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M或更小的KD与金黄色葡萄球菌肠毒素B解离。其中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，表示处于平衡状态时抗体和抗原的解离程度。KD越小说明解离越小，代表抗体与抗原间的亲和力越强。

2、编码所述抗体的核苷酸序列。包括抗体中的重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区、重链或轻链。在所述抗体氨基酸序列或其特征确定的情况下，本领域技术人员能够根据该氨基酸序列获得相应的、合适且合理的核苷酸序列。

3、含有所述核苷酸序列的载体。

优选地，载体包含与核酸可操作连接的启动子以便于编码轻链和/或重链的核酸的表达。优选地，载体还包含用于在宿主细胞中复制和维持的起点。载体还可以包含位于编码轻链或重链的核酸的5’的编码信号序列的核苷酸序列。信号序列可以便于编码的肽链分泌入培养基中。

在一个优选的实施例中，本发明的人单克隆抗体自MRSA疫苗Ⅰ期临床试验受试者的血液淋巴细胞生成，并且如此生成具有高亲和力的天然精制的且选定的抗体以实现中和针对感染的有效保护。

4、含有权利要求7所述的载体宿主细胞。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。特别优选的是人生产细胞系。

5、所述抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B或者游离的肠毒素B的试剂或药品中的应用。

6、所述抗体在制备治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

本发明还提供了用于生成单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，通过培养转入信号序列的表达载体的宿主细胞来生成单克隆抗体。生成的单克隆抗体被分泌入上清液中，并且可以通过应用常规的层析技术来自其纯化。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，该抗体可以有用于检测和/或可视化肠毒素B，因此可以用在诊断方法和测定中，并且是有效的。在此所述的抗体还可以治疗感染MRSA导致的脓毒血症，对金黄色葡萄球菌的预防、治疗和检测具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为单个浆细胞分选图。

图2为全人源抗SEB抗体SDS-PAGE检测结果。

图3为全人源SEB单克隆抗体M0313与SEB和mSEB的结合活性分析。

图4为生物膜干涉技术分析抗原抗体相互作用结果。

图5为SEB与mSEB变性胶Western Blot结果图。

图6为M0313抑制SEB刺激淋巴细胞增殖结果图。

图7为M0313抑制SEB刺激产生细胞因子结果图。

图8为肠毒素B动物模型评价实验结果。

图9为MRSA脓毒血症动物模型评价实验结果。

图10为SEB多肽表位定位ELISA结果图(A：多肽和M0313单克隆抗体结合结果；B：SEB_85-102aa、SEB_88-102aa与M0313结合结果；C：突变YYY三个氨基酸后与M0313的结合力)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明在此披露了结合至金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，包括人源化或人抗体和单结构域抗体。此类抗体可以有用于检测和/或可视化肠毒素B，因此可以用在诊断方法和测定中，并且是有效的。在此所述的抗体还可以治疗感染MRSA导致的脓毒血症，因此对于治疗和预防是有效的。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可引起一系列不同的人类感染，从相对轻微的皮肤和伤口感染到更严重的危及生命的疾病，如肺炎，脓毒血症和深部组织感染。金黄色葡萄球菌可以以浮游和固着(以生物膜为基础)的形式在感染的宿主中存在。这种兼具β-溶血性、革兰氏阳性、耐盐性的强大病原体，容易定植于皮肤、各种粘膜表面、软组织、骨骼，以及留置医疗器械。大约30％的人是金黄色葡萄球菌菌株的无症状携带者，这些金葡菌具有耐抗生素，葡萄球菌肠毒素和其他毒力因子的基因。

金黄色葡萄球菌肠毒素B通过其结合T细胞受体的Vβ区和II类主要组织相容性复合物分子，从而激活T细胞，这种大规模的T细胞活化引发炎性细胞因子的全身释放，其可导致中毒性休克综合征(Toxic shock syndrome，TSS)，其特征在于红斑性皮疹，低血压和高烧，可能导致多器官衰竭和死亡。金黄色葡萄球菌肠毒素B在生物战争和生物恐怖主义中有极大的潜在威胁，被疾病控制和预防中心列为潜在的生物武器和选择剂，其可以在吸入2小时内引发头部和肌肉疼痛，心动过速，咳嗽，恶心，呕吐，腹泻和结膜刺激等症状。此外，金黄色葡萄球菌肠毒素B还是引起食物中毒的常见原因之一。

对于金黄色葡萄球菌耐药引起的严峻形势和金黄色葡萄球菌肠毒素B的巨大威胁，所述针对金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体可以帮助降低金黄色葡萄球菌感染的严重性，治疗肠毒素B引起的生物毒性，还可以使用这些抗体检测金黄色葡萄球菌肠毒素分型。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和突变型金黄色葡萄球菌肠毒素B(mSEB)的表达和纯化

将来自金黄色葡萄球菌菌株(ATCC登录号为BAA-1556)的基因组DNA通过PCR扩增SEB基因。然后使用QuickChange II XL定点诱变试剂盒通过野生型基因的定点诱变而产生L45R,Y89A,Y94A变体。DNA测序证明后，将其在大肠杆菌中表达，在含有氨苄西林的LB培养基内37℃培养过夜，离心收获细胞。利用Ni-NTA纯化获得SEB蛋白和mSEB(L45R,Y89A,Y94A)蛋白，SEB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2、外周血单个核细胞(PBMC)的分离

招募健康的志愿者和严重感染金黄色葡萄球菌后痊愈的志愿者，采集静脉血样本于含有肝素的抗凝管中，利用密度离心法分离PBMC细胞，具体操作如下：取静脉血于22℃、400×g、离心15min；吸取上层透明血浆层，置于-80℃冻存；吸取上清后，与等量的RPMI1640(Gibco)充分混匀，沿倾斜的管壁缓慢加入到等量淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min，吸取云雾层的单个核细胞于无菌离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，适量RPMI1640重悬细胞以1×10⁷/支冻存于液氮中备用。

实施例3、流式细胞仪分选单个浆细胞

流式细胞术分选单个浆细胞：以SEB保护性抗原蛋白(HPLC纯度﹥95％)为抗原对血清进行ELISA检测确定样本的抗体滴度，选择抗体滴度高的样本，通过流式细胞仪分选单个浆细胞，通过CD3/CD14/CD16/CD235a-CD19+CD20+/-CD38hi CD27hi设门分选，将不同时间点的浆细胞群分离出来。通过血清学实验与B淋巴细胞表型的分析，可以保证我们能从>3％的浆细胞群中获得大量的单个浆细胞，并从中分离抗SEB的全人源单克隆抗体的基因序列，重链核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，分选到细胞数量较多状态良好(图1)。

实施例4、抗SEB抗体的克隆和全人源抗体的表达

使用SuperscriptV逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)和随机引物合成cDNA的第一链。使用Ig引物组(重链的恒定区引物序列：5’-gcggccctgggctgcctggtcaag-3’(SEQID NO.2)；轻链的恒定区引物序列：5’-aggagagtgtcacagagcaggacag-3’(SEQ ID NO.3))通过PCR扩增人Ig V_H和V_K/L，将扩增的V_H和V_K/L产物克隆到TOPO TA载体中，并进行测序。再将上述扩增产物通过PCR进行再扩增，产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

抗体基因序列测定与生物信息学分析：将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体基因PCR产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并分别从正向与反向进行序列测定，用IMGT在线服务器(http：//imgt.cines.fr/)来分析抗体基因家族、突变率、亚型及CDR区，新的抗体基因录入抗体基因库中。

将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上，构建全人源抗SEB抗体的表达载体，然后将表达载体转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄西林的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min，取5μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子。

实施例5、全人源抗SEB抗体的表达和纯化

将实施例4中所得阳性转化子中的载体质粒转化DH5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，将Ig V_H、V_K/L与转染试剂聚醚酰亚胺共转染HEK293细胞，转染后5-6小时补充HEK293基础培养基(OPM)，并在37℃、5％CO₂培养箱中培养96小时，3000×g离心30分钟收集转染上清，利用蛋白A亲和层析法进行纯化；通过SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况。SDS-PAGE检测结果(见图2)显示，转染细胞成功表达了抗体，命名为全人源SEB单克隆抗体M0313，简称M0313抗体或M0313单克隆抗体，且该抗体的相对分子量约160-180KD，重链约55KD，轻链约25KD；重链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示。

实施例6、表达抗体的结合活性检测

以重组表达的SEB蛋白(L45R,Y89A,Y94A)和SEB分别为抗原100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜，用封闭液常温封闭2h。加入Overlapping PCR转染表达抗体(一抗)原液，阳性对照为阳性血浆样本原液(1：50倍稀释)和M0313抗体(1：1000倍稀释)，阴性对照为阴性血浆样本原液(1：50倍稀释)和阴性对照无关抗体IgG1 0.5μg/mL，空白加入封闭液，每孔100μL，设置3个复孔，37℃孵育1h。

用PBST缓冲液洗板一次(3个循环)，加入1:5000稀释的Anti-Human HRP-IgG(二抗)100μL/孔，37℃孵育45min。PBST缓冲液洗板一次(5个循环)，避光，加TMB 100μL/孔，37℃避光显色5min，加入50μL的ELISA终止液终止反应，450nm处检测吸光度。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体。

实验显示，全人源SEB单克隆抗体M0313能与SEB和mSEB(L45R,Y89A,Y94A)结合(图3)，EC50分别为0.0073μg/mL和0.0049μg/mL(表1)。

表1、M0313和SEB与mSEB(L45R,Y89A,Y94A)的EC50

实施例7、生物膜干涉技术(BLI)测定抗体与抗原的亲和力

使用生物膜干涉技术来测量M0313与SEB、mSEB(L45R,Y89A,Y94A)的动力学，分离得到的M0313单克隆抗体50nM固化到AHC传感器上，SEB与mSEB(L45R,Y89A,Y94A)两倍连续稀释物(3.13nM至50nM)以按照样品板排列加样，按照“基线检测-加载检测-淬火-淬火-洗板-基线检测-结合检测-解离检测”的程序设定进行操作。计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(kdis)、平衡解离常数(KD)，结果如表2所示，M0313与SEB的KD为3.22×10^-9M，M0313与mSEB(L45R,Y89A,Y94A)的KD为4.61×10^-9M(图4)。

表2、M0313与SEB、mSEB(L45R,Y89A,Y94A)的结合动力学数据

Ag	KD(M)	Kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
				SEB	3.22×10<sup>-9</sup>	9.08×10<sup>5</sup>	2.92×10<sup>-3</sup>
mSEB	4.61×10<sup>-9</sup>	5.93×10<sup>5</sup>	2.73×10<sup>-3</sup>

实施例8、M0313抗体表位类型的确定

蛋白样品制备：10μg SEB和mSEB(L45R,Y89A,Y94A)10μL在沸水浴中煮5min。安装电泳槽和预制胶，加入电泳缓冲液，拔掉梳子后上样。设定电泳仪电压为120V跑电泳，溴酚兰跑至距离下缘1cm即可终止电泳。电泳胶用水冲洗后，放入半干电转仪转膜，设置电压22V转膜23min；转膜后的PVDF薄膜置于含5％脱脂奶粉的TBST溶液中4℃封闭过夜。薄膜用TBST溶液洗3次，每次5min；加入1μg/mL的M0313溶液，37℃孵育1h。洗膜3次后，用TBST将Anti-Human HRP-IgG(二抗)按照1:5000稀释，将薄膜放入上述溶液中，37℃孵育45min。

薄膜用TBST溶液洗3次，每次5min；将薄膜放入干净的平皿中，每块膜避光滴加约1mL的DAB显色液，条带明显时用水冲洗终止反应。图5显示，M0313能够和变性后的SEB和mSEB(L45R,Y89A,Y94A)结合，由此判断M0313抗体的表位为线性表位。

实施例9、抑制SEB刺激淋巴细胞增殖

处死小鼠，取脾细胞研磨成单个脾细胞，沿倾斜的管壁缓缓加入等量小鼠淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min，吸取淋巴细胞层到无菌离心管中，加入适量RPMI 1640,1000rpm离心5min，清洗2次，取适量RGDS培养基(10％DMEM，10％RPMI1640,10％FBS，4.3μg/mL 2-巯基乙醇，20μg/mL青霉素)重悬细胞，5×10⁵/孔加入96孔细胞培养板，每孔50μL。将SEB(终浓度为1nM，即28ng/ml)与等体积M0313的两倍连续稀释物(终浓度为40-0.156nM,即6-0.0234μg/ml)混合后在37℃孵育30min，50μL/孔加入细胞上层，阳性对照加入50μL SEB(2nM)，阴性对照加入50μL RGDS培养基，均设置3个副孔，37℃培养48h。按照Promega细胞活力检测试剂盒说明书介绍测定化学发光强度，用以反映ATP活力，即细胞活力。

抑制率＝(阳性对照RLU-抗体组RLU)/(阳性对照RLU-阴性对照RLU)

中和活性如图6所示。结果显示，在恒定数浓度的SEB下，M0313的浓度越高，对淋巴细胞增殖的抑制率也越高，其中在M0313浓度为6μg/ml条件下抑制率达到88％。

实施例10、抑制SEB刺激淋巴细胞产生细胞因子

处死小鼠，取脾细胞研磨成单个脾细胞，沿倾斜的管壁缓缓加入等量小鼠淋巴细胞被分离液上层，2000rpm离心20min，吸取淋巴细胞层到无菌离心管中，加入适量RPMI1640,1000rpm、离心5min清洗2次，取适量RGDS培养基重悬细胞，5×10⁵/孔加入96孔细胞培养板，每孔100μL。将SEB(终浓度为2nM，即56ng/ml)与等体积M0313的两倍连续稀释物(终浓度为200-1.5625nM,即30-0.234μg/ml)混合后在37℃孵育30min，100μL/孔加入细胞上层，阳性对照加入100μL SEB(4nM)，阴性对照加入100μL RGDS培养基，均设置3个副孔，37℃培养24h。2000rpm离心20min收取细胞培养上清，采用ELISA法检测各孔IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ浓度。

抑制率＝(阳性对照细胞因子浓度-抗体组细胞因子浓度)/(阳性对照细胞因子浓度-阴性对照细胞因子浓度)。

中和活性如图7所示。结果显示，在恒定浓度的SEB下，M0313的浓度越高，对淋巴细胞产生IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的抑制率也越高，在M0313浓度为30μg/ml是抑制率达到79-90％。

实施例11、肠毒素B动物模型评价实验

取40只小鼠分为4组，每组10只。将20μgM0313、10μgM0313、20μg丙种球蛋白(IVIG)和生理盐水尾静脉注射各组小鼠，体积100μL。24h后，将20μg SEB和10mg D-氨基半乳糖盐酸盐尾静脉注射所有小鼠，体积100μL，观察小鼠3d并记录小鼠的生存情况(图8)。中和保护性评价实验表明，20μg M0313抗体能够保护100％小鼠，10μg M0313抗体能够保护88.9％小鼠，此结果表明M0313可以保护肠毒素B攻毒。总之，该实验结果说明金黄色葡萄球菌肠毒素B在致病菌中的作用，并且提供了抑制黄色金黄色葡萄球菌肠毒素B功能以限制金黄色葡萄球菌感染相关的疾病严重性甚至死亡的抗体的用途的证据。

实施例12、MRSA脓毒血症感染致死模型的建立及保护性评价

取40只小鼠，分为4组，每组10只。将400μg M0313、200μg M0313、400μg丙种球蛋白(IVIG)和生理盐水尾静脉注射各组小鼠，体积100μL。24h后，将9×10⁸CFU MRSA 252尾静脉注射所有小鼠，体积100μL，观察小鼠7d并记录小鼠的生存情况(图9)。MRSA脓毒血症保护性评价实验表明，400μg M0313抗体能够保护100％小鼠，200μg M0313抗体能够保护37.5％小鼠，此结果表明，M0313可以保护MRSA的脓毒血症。表明全人源抗SEB抗体M0313能够抑制疾病进展、增强清除并且还抑制入侵生物的全身扩散。

实施例13、抗原表位的确定

将SEB氨基酸序列截断，合成长度为18位氨基酸的多肽，相邻的两个多肽之间的6个氨基酸重叠，据此合成20条多肽。用包被液稀释链霉亲和素至2μg/mL，阳性对照为2μg/mLSEB，阴性对照为PBST，取100μ/孔加入ELISA板4℃过夜。用TBST洗板3次后，用封闭液37℃封闭2h。将每段多肽用DMSO溶解，用TBST稀释至2μg/mL加入ELISA板，阳性对照与阴性对照加入TBST，37℃孵育1h。洗板3次，每孔加入100μL浓度为2μg/mL的M0313单克隆抗体100μL，37℃孵育1h。TBST洗板3次，用TBST将Anti-Human HRP-IgG(二抗)按照1:5000稀释，100μL/孔加入ELISA板，37℃孵育45min。TBST洗板5次，每孔加TMB 100μL，37℃避光显色5min，加入50μL的ELISA终止液终止反应，450nm处检测吸光度。计算阈值(阴性对照均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体。图10中A显示多肽SEB_85-102aa能够和M0313单克隆抗体结合，序列如下：VFGANYYYQCYFSKKTND(SEQ ID NO.12)，由此M0313单克隆抗体识别的抗原位点至少包括VFGANYYYQCYFSKKTND整段氨基酸序列全长或者部分氨基酸。

将VFGANYYYQCYFSKKTND氨基酸继续截短表达，合成SEB_88-102aa(SEQ ID NO.13)、SEB_91-102aa(SEQ ID NO.14)、SEB_94-102aa(SEQ ID NO.15)三段氨基酸，序列如表3所示，采用ELISA进行表位定位。图10中B显示SEB_85-102aa、SEB_88-102aa能够与M0313结合。

表3、截短合成氨基酸序列

多肽	氨基酸序列
		SEB<sub>88-102aa</sub>	ANYYYQCYFSKKTND
SEB<sub>91-102aa</sub>	YYQCYFSKKTND
		SEB<sub>94-102aa</sub>	CYFSKKTND

将VFGANYYYQCYFSKKTND中FGANYYY各个氨基酸依次进行突变合成6段氨基酸(表4)，采用ELISA检测与M0313的结合。

表4、突变合成氨基酸序列

图10中C显示突变YYY三个氨基酸后，与M0313的结合能力减弱。由此M0313单克隆抗体识别的抗原位点至少包括SEB_90-92aa，氨基酸序列为YYY。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)

<400> 1

Met Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser

1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn

20 25 30

His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe

35 40 45

Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn

50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp

115 120 125

Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu

130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu

180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys

195 200 205

Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val

210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys

225 230 235 240

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccctgg gctgcctggt caag 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagagtgt cacagagcag gacag 25

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Gly Ser Gly Ser Thr Cys Tyr Ala Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Ser

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Arg Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Glu Tyr Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr

100 105 110

Gln Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Ser Gly Gly Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Lys Asp Arg Glu Tyr Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Pro Tyr

1 5 10 15

Gln Tyr Ala Met Asp Val

20

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Arg Pro Asn Ile Gly Gly Asn

20 25 30

Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Pro Asn Ile Gly Gly Asn Ser

1 5

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Thr Asn Asp

1

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr

1 5 10 15

Asn Asp

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp

1 5 10 15

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp

1 5

<210> 16

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaagtgcagc tggtgcagtc tggaggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt aattatggca tgagttgggt ccgccagtct 120

ccagggaagg ggctagagtg ggtctcaggt atcagtggag gtagtggtag cacatgctac 180

gcagacttcg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca aatccaagaa cacgctgtct 240

ctggaaatga acagcctgag agccgaggac agggccgtat attactgtgc gaaagatcga 300

gaatactata atagtggtta ttattacttt ccctaccaat atgcgatgga cgtctggggc 360

caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387

<210> 17

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagtctgtgt tgacgcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaggcaggcc caacatcggc ggcaactctg tatactggta ccagcagttc 120

ccaggaacgt cccccaagct cctcatctac actaatgatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aagctgatta ctactgtgca gcatgggatg acagcctgag tgcttatgtc 300

ttcggagctg ggaccaaggt caccgtccta 330

Claims

1.一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，其特征在于：所述抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示或具有同等功能的CDR变体组成；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示或具有同等功能的CDR变体组成。

2.根据权利要求1所述抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，其特征在于：所述抗体的恒定区包括人源IgM、IgA或IgA恒定区中的任意一种。

3.根据权利要求1所述抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，其特征在于：所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4至少85％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与SEQ ID NO.8至少85％的同源性且与金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸或部分氨基酸特异结合的序列。

4.根据权利要求1～3任一项所述抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌肠毒素B全长氨基酸如SEQ ID NO.1所示；所述金黄色葡萄球菌肠毒素B部分氨基酸序列如SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示。

5.根据权利要求1～3任一项所述抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，其特征在于：所述抗体与SEB结合的平衡解离常数不高于1×10^-8M。

6.编码权利要求1～5任一项所述抗体的核苷酸序列。

7.含有权利要求6所述核苷酸序列的载体。

8.含有权利要求7所述的载体宿主细胞。

9.权利要求1～5任一项所述抗体在制备特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B或者游离的肠毒素B的试剂或药品中的应用。

10.权利要求1～5任一项所述抗体在制备治疗、预防或诊断金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。