CN101460519A - 具有杀灭葡萄球菌活性的人结合分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合葡萄球菌并且具有杀灭葡萄球菌活性的人结合分子、编码所述人结合分子的核酸、包含所述人结合分子的组合物及鉴别或产生所述人结合分子的方法。所述人结合分子可用于葡萄球菌所致病症的诊断、预防和/或治疗中。

Description

具有杀灭葡萄球菌活性的人结合分子及其应用
发明领域
本发明涉及药物。本发明特别涉及葡萄球菌感染的诊断、预防和/或治疗。
发明背景
葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，且是微球菌科成员。葡萄球菌是主要在人和其它温血动物的皮肤和粘膜上发现的球形细菌，聚集成小的葡萄样团块。葡萄球菌可以分为两组，即凝固酶阳性和凝固酶阴性葡萄球菌。共有大约30种葡萄球菌。
葡萄球菌在人体内通过毒素产生或侵入而可以导致多种疾病。自上世纪开始已经认识到金黄色葡萄球菌(S.aureus)是最重要的致死性人细菌病原体之一。直至抗生素时代，血液中有金黄色葡萄球菌生长的患者有80％死亡。尽管通常已知凝固酶阳性金黄色葡萄球菌所致感染是潜在致命的，但是凝固酶阴性葡萄球菌作为不能导致人体发生疾病的无毒性皮肤共生物而已经被排除。然而，在过去的30年里，凝固酶阴性葡萄球菌感染呈现出是医学发展的主要并发症之一。它们目前是在美国医院中最经常从留置的体外设置感染中分离的病原体，并且是导致医院(医院获得性)菌血症的主要因素。葡萄球菌感染通常用抗微生物剂治疗。然而，葡萄球菌作为主要的医院病原体的优势地位也与对于(多种)抗微生物剂有抗性的这些分离株的比例增加有关。估计2004年美国两百万医院感染病例中，70％的病例对于至少一种抗生素具有抗性，从而导致显著的医疗问题及随之的经济问题。90％的葡萄球菌菌株是青霉素抗性的，仅2，6二甲氧基苯青霉素和万古霉素可治疗大多数的感染。然而，随着关于2，6二甲氧基苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的报道数增加，药剂师们面临着令人畏缩的产生具有新的作用模式的新抗生素的任务。尽管迫切需要开发新的抗生素，但是大多数制药公司似乎丧失了对抗生素市场的兴趣。2002年，处于临床开发II或III期的500种以上的药物中仅5种药物是新抗生素。在过去的6年中，仅10种抗生素登记注册，且其中仅2种未呈现与现有药物具有交叉反应性(并因此未受制于相同药物抗性模式)。这种倾向归因于几个因素：新药开发的成本及与抗高血压、关节炎和生活方式药物例如治疗阳痿的药物相比对感染性疾病的治疗产生相对较小的投资利润。另一因素是发现新靶位日渐困难，进一步抬高了开发成本。因此，在这种迫近的卫生保健关键时期迫切需要研究(多药物抗性)细菌感染的新的治疗或预防措施。
用疫苗进行主动免疫及用免疫球蛋白进行被动免疫是期望的与传统小分子治疗不同的供选方案。曾经导致广泛传播的疾病、残疾和死亡的一些细菌疾病现在可以通过使用疫苗而预防。所述疫苗基于减毒的或失活的细菌、细菌表面成分或者基于失活的毒素。由疫苗产生的免疫应答主要针对免疫原性结构，细菌上有限数目的蛋白质或糖结构被免疫系统主动作用。由于这些免疫原性结构非常特异于生物体，因此疫苗需要包含该疫苗针对其提供保护作用的细菌的所有变体的免疫原性成分。因此，疫苗是非常复杂的，需要长时间和昂贵成本来开发。使得疫苗设计更为复杂的因素是“抗原置换”现象。当与疫苗覆盖的那些菌株在血清学方面不同且因此在抗原性方面不同的新菌株变得普遍存在时会发生这种情况。处于医院感染风险中的群体的免疫状态使得疫苗的设计更为复杂。这些患者本身即生病，且甚至也许是免疫低下的(由于免疫抑制剂的作用所致)，导致对于感染性病原体的免疫性迟缓或不足。此外，除了在某些择期情况中，不可能鉴别处于风险中的患者并对其进行接种，以为其提供足够的免于感染的免疫保护作用。
直接给予治疗性免疫球蛋白也称作被动免疫，其不需要病人发生免疫应答，因此直接提供保护作用。另外，被动免疫可以针对非免疫原性的细菌结构，对机体的特异性较低。针对病原性生物体的被动免疫基于衍生自人或非人供体的血清。然而，血液制品具有与这些产品本性相关的潜在健康风险。另外，免疫球蛋白可以表现批次差异，在突发群体暴露事件(sudden mass exposures)中可用性受限。重组产生的抗体不具有这些缺点，并因此可以代替得自血清的免疫球蛋白。
本领域已知针对葡萄球菌的鼠单克隆抗体(见WO 03/059259和WO03/059260)。然而，由于将鼠抗体给予人体会产生一系列相关问题如血清半衰期较短、不能触发某些人体效应功能以及在人体内引起针对鼠抗体的不希望的显著免疫应答(HAMA)，因此限制了鼠抗体的体内应用。
在WO 03/059259和WO 03/059260中，尝试通过制备嵌合抗体而克服在人体中使用完全鼠抗体相关的问题。然而这些嵌合抗体的缺点是其仍保留一些鼠序列，并因此仍引起不希望的免疫反应，特别是当长期给予时。
WO 2004/043405涉及葡萄球菌感染的多糖疫苗，它们制备自葡萄球菌的聚N-乙酰氨基葡萄糖(PNAG)表面多糖及其去乙酰化形式(dPNAG)。WO2004/043405还揭示了与白喉类毒素(DTm)结合的PNAG和dPNAG的兔抗血清。
尽管WO 03/059259、WO 03/059260和WO 2004/043405提及人抗体为预期的分子，但事实上其中揭示并应用的抗体是部分鼠或完全兔源的，这些文献无一揭示了任何人抗体及其序列。
考虑到在人体内的治疗益处，因此仍需要抗葡萄球菌的人单克隆抗体。本发明提供了这些抗体及其序列，并且揭示了它们可用于药物中，特别用于诊断、预防和/或治疗葡萄球菌感染的药物中。
附图简述
图1示出抗体CR2430(白色圆点)、CR5132(黑色三角形)、CR5133(黑色圆点)及阴性对照单克隆抗体(白色方形)在不存在补体时对在对数生长期间收获的金黄色葡萄球菌菌株Cowan的抗体介导的吞噬作用。
图2示出抗体CR2430(白色圆点)、CR5132(黑色三角形)、CR5133(黑色圆点)及阴性对照单克隆抗体(白色方形)在不存在补体时对在稳定生长期间收获的金黄色葡萄球菌菌株Cowan的抗体介导的吞噬作用。
图3示出抗体CR5132(黑色三角形)、CR5133(黑色圆点)及阴性对照单克隆抗体(白色方形)在不存在补体时对在稳定生长期间收获的金黄色葡萄球菌菌株SA125的抗体介导的吞噬作用。
图4示出抗体CR5132(黑色三角形)、CR5133(黑色圆点)及阴性对照单克隆抗体(白色方形)在不存在补体时对在稳定生长期间收获的表皮葡萄球菌菌株SE131的抗体介导的吞噬作用。
发明详述
下文描述了本发明中使用的术语的定义。
定义
氨基酸序列
如本文所用，术语“氨基酸序列”是指天然存在的或者合成的分子，且是指肽、寡肽、多肽或蛋白质序列。
结合分子
如本文所用，术语“结合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体，如嵌合的、人源化或人单克隆抗体，或者是指抗原结合结构域和/或可变结构域，其包含与完整的免疫球蛋白竞争特异性结合免疫球蛋白的结合配体例如葡萄球菌的免疫球蛋白片段。不论结构如何，抗原结合片段结合完整的免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可包含肽或多肽，所述肽或多肽包含所述结合分子氨基酸序列的至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少35个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或者至少250个连续氨基酸残基。
如本文所用，术语“结合分子”包括本领域已知的所有免疫球蛋白类别和亚类。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，结合分子可分为5种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，一些这些类别可进一步分为亚类(同种型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗原结合片段包括Fab、F(ab＇)、F(ab＇)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、二抗体、三抗体、四抗体、至少含有足以赋予与(多)肽特异性抗原结合的免疫球蛋白片段的(多)肽等。上述片段可以合成产生或者通过对完整的免疫球蛋白进行酶或化学裂解而产生，或者可以通过重组DNA技术遗传工程化。所述产生方法为本领域所熟知，例如在Antibodies：A Laboratory Manual，Edited by：E.Harlow and D，Lane(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York中描述，所述文献在本文并入作参考。结合分子或其抗原结合片段可具有一或多个结合位点。如果有一个以上的结合位点，则所述结合位点可以彼此相同或不同。
所述结合分子可以是裸的或未结合的结合分子，但也可以是免疫缀合物的一部分。裸的或未结合的结合分子是指与效应成分或标记如毒性物质、放射性物质、脂质体、酶等未结合的、未可操纵地连接或未另外物理或功能性缔合的结合分子。应理解裸的或未结合的结合分子不排除已经稳定化、多聚体化、人源化或以附着效应成分或标记之外的任何其它方式处理的结合分子。因此，所有翻译后修饰的裸的和未结合的结合分子均包括在本文所用该术语范围内，包括在天然产生结合分子的细胞环境中进行的修饰、通过重组产生结合分子的细胞，在最初的结合分子制备后通过人工方式导入。当然，术语裸的或未结合的结合分子不排除在给予机体后结合分子与效应细胞和/或分子形成功能性缔合的能力，一些这种相互作用是发挥生物学作用所必需的。缔合的效应基团或标记的缺少因此用于定义在体外而非在体内的裸或未结合的结合分子。
生物样品
如本文所用，术语“生物样品”涵盖了多种样品类型，包括来源于生物体的血液或其它液体样品、固体组织样品如活检组织样品或组织培养物，或者衍生自其中的细胞及其后代。该术语还包括在获得后已经以任何方式处理的样品，如通过试剂处理、增溶或浓缩某些成分如蛋白质或多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的多种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。
互补决定区(CDR)
如本文所用，术语“互补决定区”是指结合分子如免疫球蛋白可变区中的序列，它们通常很大程度上贡献了在形状和电荷分布方面与抗原上所识别的表位互补的抗原结合位点。CDR区域可特异于蛋白质或蛋白质片段的线性表位、不连续的表位，或者特异于以其天然构象或者在一些情况中以变性形式(例如通过在SDS中增溶)存在于蛋白质上的构象表位。表位也可以由蛋白质的翻译后修饰组成。
缺失
如本文所用，术语“缺失”是指氨基酸或核苷酸序列中的变化，其中一或多个氨基酸或核苷酸残基与亲代(通常为天然存在的分子)相比而缺少。
调节表达的核酸序列
如本文所用，术语“调节表达的核酸序列”是指可操纵地连接的编码序列在特定的宿主生物体中表达所需的和/或影响这种表达的多核苷酸序列。调节表达的序列如合适的转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列；阻抑物或激活物序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；及当需要时增强蛋白质分泌的序列；这些调节表达的序列可以是在选择的宿主生物体中具有活性的任何核酸序列，且可以衍生自编码与宿主生物体同源或异源的蛋白质的基因。调节表达的序列的鉴别和应用为本领域技术人员所已知。
功能性变体
如本文所用，术语“功能性变体”是指包含与亲代结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比具有一或多个核苷酸和/或氨基酸的变化的核苷酸和/或氨基酸序列但仍然能够与所述亲代结合分子竞争结合结合配体例如葡萄球菌的结合分子。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不明显影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍然能够识别并结合其靶位。所述功能性变体可具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如定向诱变技术和随机PCR介导的诱变技术，且可以包含天然的以及非天然的核苷酸和氨基酸。
保守的氨基酸取代包括氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的氨基酸残基置换。本领域已经描述了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员已知也可以应用除了上述氨基酸家族之外的其它类别的氨基酸家族。此外，变体可具有非保守氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或化学性质的氨基酸残基置换。类似的较小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或者这二者。确定哪个氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除免疫学活性的指导方针可以使用本领域熟知的计算机程序发现。
核苷酸序列中的突变可以是在一个基因座的单一变化(点突变)，例如转换或颠换突变，或者可以在一个基因座进行多个核苷酸的插入、缺失或变化。另外，可以在核苷酸序列中的任何数目的基因座进行一或多个变化。突变可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。
宿主
如本文所用，术语“宿主”是指其中已经导入载体如克隆载体或表达载体的生物体或细胞。所述生物体或细胞可以是原核或真核生物体或细胞。应理解该术语不仅用于描述特定对象生物体或细胞，也用于描述这种生物体或细胞的后代。由于突变或环境影响导致某些修饰在后续世代中可以出现，这种后代事实上与其亲代生物体或细胞不相同，但是仍包括在本文所用术语“宿主”的范围内。
人
术语“人”当用于本文所述结合分子时，是指直接衍生自人或者基于人序列的分子。当结合分子衍生自或基于人序列并随后被修饰时，在本说明书中仍认为其是人结合分子。换句话说，术语人当用于结合分子时是指包括具有衍生自人免疫球蛋白序列的可变和恒定区或者基于在人或人淋巴细胞中出现的可变或恒定区的并以一些方式修饰的结合分子。因此，人结合分子可包括不是由人免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，包含取代和/或缺失(例如通过例如体外随机或位点特异性诱变或者体内体细胞突变导入的突变)。如本文所用，术语“基于”是指核酸序列可以精确地从模板中拷贝、或者具有较小突变如通过易错PCR方法或者合成产生，与模板精确匹配或具有较小修饰。基于人序列的半合成的分子也认为是本文所用的人结合分子。
插入
术语“插入”也称作“添加”，是指氨基酸或核苷酸序列中与亲代序列相比分别添加了一或多个氨基酸或核苷酸残基的变化。
固有活性
术语“固有活性”当用于本文所述的结合分子时，是指结合分子能结合病原体如细菌表面上某些蛋白质或碳水化合物抗原且能抑制病原体正常生长和分裂的能力。这种结合分子可例如阻断为细菌生长或毒素从细菌中转运所需的特定营养素的输入。通过后者的作用，它们也可以增加细菌对于抗生素药物作用的敏感性。
分离的
术语“分离的”当用于本文所述的结合分子时，是指结合分子基本上没有其它蛋白质或多肽，特别是没有具有不同抗原特异性的其它结合分子，且也基本上没有其它细胞材料和/或化合物。例如，当结合分子是重组产生的时，其优选基本上没有培养基；当结合分子是通过化学合成产生的时，其优选基本上没有化合物前体或其它化合物，即其与蛋白质合成中包含的化合物前体或前体化合物分离。术语“分离的”当用于本文所述的编码结合分子的核酸分子时，是指这样的核酸分子，其中编码所述结合分子的核苷酸序列没有其它核苷酸序列，特别是编码结合除了葡萄球菌之外的结合配体的结合分子的核苷酸序列。此外，术语“分离的”是指核酸分子基本上与在其天然宿主中与天然核酸分子天然伴随的其它细胞成分分离，例如核糖体、聚合酶或者与其天然相关联的基因组序列。另外，“分离的”核酸分子如cDNA分子可以基本上没有其它细胞材料或者培养基(当通过重组技术产生时)，或者基本上没有化合物前体或其它化合物(当化学合成时)。
单克隆抗体
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单一分子成分的抗体分子制备物。单克隆抗体呈现对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指呈现单一结合特异性的抗体，其具有衍生自或基于人免疫球蛋白序列或者衍生自全合成序列的可变区和恒定区。制备单克隆抗体的方法是无关的。
天然存在的
如本文所用，术语“天然存在的”物体是指在自然界可发现的物体。例如，存在于可分离自天然来源的生物体中且未在实验室中经人工有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
核酸分子
如本发明所用，术语“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式，包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，及合成形式和上述分子的混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或者任一类型核苷酸的修饰的形式。该术语还包括单链和双链形式的DNA。另外，多核苷酸可包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键合连接在一起的天然存在核苷酸和修饰的核苷酸。核酸分子可以经化学或生物化学方式修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，这易于为本领域技术人员所意识到。这种修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一或多个天然存在的核苷酸、核苷酸内修饰如无电荷的键(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬挂成分(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的键(例如α异头核苷酸等)。该术语还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双螺旋、三螺旋、发夹、环状和扣锁(padlocked)构象。该术语还包括合成分子，其模拟多核苷酸通过氢键及其它化学相互作用而结合指定序列的能力。这种分子为本领域所已知，包括例如在分子主链中以肽键取代磷酸键。除非特别指出，核苷酸序列涵盖其互补序列。因此，具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖其互补链及其互补序列。互补链也可用于例如反义治疗、杂交探针和PCR引物。
可操纵地连接
术语“可操纵地连接”是指两或多个核苷酸序列元件，其通常是物理连接的，且彼此存在功能关系。例如，如果启动子能引起或调节编码序列的转录或表达，则该启动子与编码序列是可操纵地连接的，在这种情况中，编码序列应理解为是在所述启动子的“控制下”。
调理活性
“调理活性”是指调理素(一般为结合分子例如抗体，或者血清补体因子)通过特异性抗原识别(在抗体的情况中)或者通过表面结合的分子的催化作用(例如由于表面结合的抗体而使得C3b沉积增加)结合病原体表面的能力。由于调理素特异性识别吞噬细胞上的受体(在抗体自身是调理素的情况中是Fc受体，在补体是调理素的情况中是补体受体)，因此对被调理的病原体的吞噬作用增强。某些细菌、特别是荚膜(encapsulated)细菌由于荚膜的存在而对于吞噬作用存在抗性，当用调理性抗体包被时而变得对吞噬细胞如中性粒细胞和巨噬细胞非常有吸引力，且其从血流和感染的器官中的清除速度显著增强。调理活性可以通过任何常规方式测量(例如调理吞噬杀灭测定法)。
药物可接受的赋形剂
“药物可接受的赋形剂”是指与活性分子如药物、物质或者结合分子组合以制备合适的或常规的药物剂型的任何惰性物质。“药物可接受的赋形剂”是在所用剂量和浓度对于受体无毒性的赋形剂，且与包含所述药物、物质或结合分子的配方的其它成分相容。
特异性结合
如本文所用，描述结合分子例如抗体与其结合配体例如抗原的相互作用的术语“特异性结合”是指所述相互作用依赖于所述结合配体上的特殊结构例如抗原决定簇或表位的存在。换句话说，即使结合配体存在于其它分子或生物体的混合物中时，所述抗体也优先结合或识别该结合配体。所述结合可以通过共价或非共价相互作用或者这二者而介导。再换句话说，术语“特异性结合”是指与抗原或其片段的免疫特异性结合，而与其它抗原不免疫特异性结合。免疫特异性结合抗原的结合分子可以与其它肽或多肽以较低亲和性免疫特异性结合，这通过例如放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、BIACORE或本领域已知的其它测定法确定。免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段可以与相关抗原交叉反应。优选地，免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段与其它抗原不交叉反应。
取代
如本文所用，“取代”是指一或多个氨基酸或核苷酸分别由不同的氨基酸或核苷酸置换。
治疗有效量
术语“治疗有效量”是指本文所述结合分子有效预防、减轻和/或治疗葡萄球菌感染病症的量。
治疗
术语“治疗”是指治疗性处理以及预防或防病措施，以治愈或停止或者至少延迟疾病进展。需要治疗的患者包括已经患有葡萄球菌感染病症的患者以及需要预防葡萄球菌感染的患者。部分或完全从葡萄球菌感染中恢复的对象也许也需要治疗。预防包括抑制或降低葡萄球菌的传播，或者抑制或降低与葡萄球菌感染相关的一或多种症状的发生、发展或进展。
载体
术语“载体”是指这样的核酸分子，在其中可以插入第二种核酸分子以导入宿主中，在宿主中其将被复制且在一些情况中被表达。换句话说，载体能转运与其连接的核酸分子。克隆载体以及表达载体涵盖在本文所用术语“载体”范围中。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)及衍生自噬菌体或植物或动物(包括人)病毒的载体。载体包含由建议的宿主识别的复制起点，在表达载体的情况中包含启动子和由宿主识别的其它调节区。含有第二种核酸分子的载体通过转化、转染或者利用病毒侵入机制而被导入细胞中。某些载体在其被导入的宿主中能自主复制(例如具有细菌复制起点的载体可在细菌中复制)。其它载体在导入宿主中时可以被整合进宿主基因组中，在此其随着宿主基因组一起复制。
发明概述
本发明提供了能特异性结合葡萄球菌并呈现杀灭葡萄球菌和/或抑制葡萄球菌生长的活性的人结合分子。本发明还涉及编码至少人结合分子的结合区的核酸分子。本发明进一步提供了本发明的人结合分子在预防和/或治疗患有或者处于发生葡萄球菌感染风险中的对象中的应用。除此之外，本发明还涉及本发明的人结合分子在诊断/检测葡萄球菌中的应用。
发明详述
第一方面，本发明涵盖了能特异性结合葡萄球菌的结合分子。优选地，所述结合分子是人结合分子。优选地，本发明的结合分子呈现杀灭葡萄球菌的活性。另一方面，本发明的结合分子能特异性结合和/或具有杀灭至少两种不同葡萄球菌菌种的活性。优选本发明的结合分子能特异性结合和/或具有杀灭至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种、至少十六种、至少十七种、至少十八种、至少十九种、至少二十种、至少二十一种、至少二十二种、至少二十三种、至少二十四种、至少二十五种、至少二十六种、至少二十七种、至少二十八种、至少二十九种、至少三十种不同葡萄球菌菌种的活性。本发明的结合分子能特异性结合和/或杀灭的葡萄球菌菌种选自：金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌(S.auricularis)、头状葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、肌肉葡萄球菌(S.caseolyticus)、产色葡萄球菌(S.chromogenes)、科恩葡萄球菌(S.cohnii)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、中间葡萄球菌(S.intermedium)、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、里昂葡萄球菌(S.lugdunensis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、华纳葡萄球菌(S.warneri)、和木糖葡萄球菌(S.xylosus)。在一个实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合一种葡萄球菌菌种内的不同菌株并具有杀灭其的活性。在另一个实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合停滞期、对数期、静止期和/或死亡期的葡萄球菌菌株并具有杀灭其的活性。优选地，其特异性结合对数期和静止期的葡萄球菌菌株并具有杀灭其的活性。在另一个实施方案中，本发明的结合分子甚至能特异性结合至少一种其它革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌和/或具有杀灭其的活性，所述细菌包括但不限于A组链球菌(Group A streptococci)；化脓性链球菌(streptococcus pyrogenes)，B组链球菌(Group B streptococci)；无乳链球菌(streptococcusagalactiae)，米勒链球菌(streptococcus milleri)，肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)，草绿色链球菌(Viridans streptococci)；变形链球菌(streptococcus mutans)，肠球菌(Enterococcus)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和尿肠球菌(Enterococcus faecium)，白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，溃疡棒杆菌(Corynebacteriumulcerans)，假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)，干燥棒状杆菌(Corynebacteriumxerosis)，假白喉棒杆菌(Corynebacterium pseudodiphtheriticum)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，难辨梭菌(Clostridium difficile)，结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，麻风分支杆菌(Mycobacteriumleprae)，衣氏放线菌(Actinomyces israelii)，星型奴卡氏菌(Norcardiaasteroides)，巴西奴卡氏菌(Norcardia brasiliensis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，副伤寒沙门氏菌A，B & C(Salmonellaparatyphi A，B & C)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae-suis)，沙门菌韦尔肖血清型(Salmonellavirchow)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)，鲍氏志贺菌(Shigella boydii)，弗氏志贺菌(Shigella flexneri)，宋内氏志贺菌(Shigella sonnei)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，幽门弯曲菌(Campylobacter pylori)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)，淋球病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)，卡他布兰汉氏菌(Branhamella catarrhalis)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)，百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，牛布鲁氏菌(Brucella abortus)，牛布鲁氏菌(Brucella abortus)，羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，梅毒螺旋体(Treponema pallidum)，品他病螺旋体(Treponema carateum)，问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)，双曲钩端螺旋体(Leptospira biflexa)，回归热包柔氏螺旋体(Borrelia recurrentis)，莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)，沙眼衣原体(Clamydia trachomatis)，鹦鹉热衣原体(Clamydia psittaci)，肺炎衣原体(Clamydia pneumoniae)。本发明的结合分子能特异性结合葡萄球菌及任选特异性结合能活的、活的和/或感染性的或者失活/减毒形式的其它革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌。失活/减毒细菌的方法为本领域所熟知，包括但不限于抗生素处理、UV处理、甲醛处理等。
本发明的结合分子也能特异性结合葡萄球菌(及其它革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌)的一或多个片段，例如衍生自葡萄球菌的一或多个蛋白质和/或(多)肽制备物或者一或多种重组产生的葡萄球菌蛋白质和/或多肽。治疗和/或预防葡萄球菌感染结合分子的方法优选能特异性结合葡萄球菌的表面可及蛋白质。对于诊断目的，所述结合分子也能特异性结合不存在于葡萄球菌表面上的蛋白质。各种葡萄球菌菌种和菌株的核苷酸和/或蛋白质氨基酸序列可见于GenBank-数据库、EMBL-数据库和/或其它数据库。
或者，本发明的结合分子也能特异性结合其它葡萄球菌分子，包括但不限于抑制吞噬细胞吞噬作用的表面因子；增强其在吞噬细胞中存活的因子；溶解真核细胞膜的侵袭素；破坏宿主组织或者另外引起疾病症状的外毒素；多糖；其它细胞壁成分如磷壁酸、脂磷壁酸、肽聚糖、五甘氨酸寡肽、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰半乳糖醛酸、N-乙酰岩藻糖胺、N-乙酰葡糖胺糖醛酸、N-乙酰甘露糖胺糖醛酸、O-乙酰基、葡糖胺、胞壁酸、半乳糖胺糖醛酸、岩藻糖胺、葡糖胺糖醛酸、甘露糖胺糖醛酸及任何这些成分之间的键合单位。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合上述蛋白质和/或其它分子的片段，其中所述片段至少包含本发明的结合分子识别的抗原决定簇。如本文所用，术语“抗原决定簇”是能以足够高的亲和性结合本发明的结合分子以形成可检测的抗原-结合分子复合物的组成部分。
本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白如多克隆或单克隆抗体，或者所述结合分子可以是结合抗原的片段，包括但不限于Fab、F(ab＇)、F(ab＇)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、二抗体、三抗体、四抗体和多抗体，其含有免疫球蛋白的足以赋予与葡萄球菌或其片段的特异性抗原结合的片段。在优选的实施方案中，本发明的结合分子是人单克隆抗体。
本发明的结合分子可以以非分离的或分离的形式应用。此外，本发明的结合分子可以单独应用，或者在包含至少一种本发明结合分子(或者其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含本发明的两或多种结合分子、其变体或片段的药物组合物应用。例如，在一项治疗中可以组合具有不同的但互补的活性的结合分子，以达到预期的预防、治疗或诊断作用；但是在一项治疗中也可以组合具有相同活性的结合分子，以达到预期的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂如抗生素可用于预防和/或治疗葡萄球菌感染。
通常地，本发明的结合分子可以结合其结合配体，即葡萄球菌或其片段，其结合的亲和性常数(Kd-值)低于0.2×10-4M、1.0×10-5M、1.0×10-6M、1.0×10-7M，优选低于1.0×10-8M，更优选低于1.0×10-9M，更优选低于1.0×10-10M，甚至更优选低于1.0×10-11M，特别是低于1.0×10-12M。根据抗体同种型，亲和性常数可以不同。例如，IgM的亲和结合是指结合亲和性为至少大约1.0×10-7M。亲和性常数可例如使用表面等离子共振技术测量，例如使用BIACORE系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)测量。
本发明的结合分子可以结合例如在样品或悬浮液中的可溶形式的葡萄球菌或其片段，或者可以结合与载体或基质例如微滴定平板、膜和珠等结合或附着于其的葡萄球菌或其片段。载体或基质可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝化纤维或Teflon等制成。这种支持物的表面可以是实心或有孔的，且可以是任何常规形状的。此外，所述结合分子可以结合纯化/分离的或者非纯化/非分离形式的葡萄球菌。
本发明的结合分子呈现杀灭活性。杀灭活性在本文是指包括但不限于调理活性或者任何其它活性，所述其它活性是增加/增大/增强吞噬作用和/或吞噬细胞对细菌例如葡萄球菌的杀灭；固有(杀灭)活性，例如降低或抑制细菌生长或者直接杀死细菌；增加细胞对于抗生素处理的敏感性；或者这些活性的任何组合。调理活性可例如本文所述测量。另一种测量调理活性的测定法在例如Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology，7th Edition中描述。本领域也已知测量其它提及的活性的测定法。
在优选的实施方案中，本发明的结合分子包含至少CDR3区，优选重链CDR3区，包含选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。包含在本发明结合分子中的CDR区示于表12中。CDR区如Kabat et al.(1991)在Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept Health andHuman Services，NIH，USA(第五版)中描述。在一个实施方案中，结合分子可包含本发明结合分子的2、3、4、5或者甚至所有6个CDR区。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含重链，所述重链包含选自SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的可变重链。在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含轻链，所述轻链包含选自SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：36的氨基酸序列的可变轻链。表13示出了本发明结合分子的重链和轻链可变区。
另一方面，本发明的结合分子能特异性结合一种特定的葡萄球菌菌种，优选一种特定的葡萄球菌菌株。换句话说它们是菌种甚至菌株特异性的。优选地，本发明的结合分子呈现杀灭特异性葡萄球菌菌种/菌株的活性。在优选的实施方案中，所述葡萄球菌菌种是金黄色葡萄球菌，所述菌株是金黄色葡萄球菌菌株Cowan。本发明的结合分子也能特异性结合任何时期例如对数期和/或静止期的特异的葡萄球菌菌种/菌株并呈现杀灭其的活性。在优选的实施方案中，所述结合分子包含至少CDR3区，优选重链CDR3区，包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。所述结合分子的CDR区示于表12。CDR区如Kabat et al.(1991)在Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services，NIH，USA(第五版)中所描述。在一个实施方案中，结合分子可包含本发明结合分子的2、3、4、5或者甚至所有6个CDR区。在另一个实施方案中，所述结合分子包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：26所示氨基酸序列的可变重链。在另一个实施方案中，所述结合分子包含轻链，所述轻链包含SEQ IDNO：32所示氨基酸序列的可变轻链。表13示出了本发明结合分子的重链和轻链可变区。
本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代人结合分子竞争特异性结合葡萄球菌(或者其它革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌)或其片段，则认为该分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍然能结合葡萄球菌或其片段。优选所述功能变体能竞争特异性结合亲代人结合分子特异性结合的至少两种(或多种)不同的葡萄球菌菌种或其片段。此外，如果某些分子具有杀灭葡萄球菌的活性，优选杀灭亲代结合分子对其呈现杀灭活性的至少两种(或多种)葡萄球菌菌种的活性，则认为所述分子是本发明结合分子的功能变体。在另一个实施方案中，本发明的结合分子的功能变体也具有杀灭其它革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的活性。功能变体包括例如但不限于衍生物，其与原始结构序列基本相似，但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内的化学/生物化学修饰。这种修饰包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解、磷酸化等。
或者，功能变体可以是包含如下这样的氨基酸序列的本发明的结合分子，所述氨基酸序列与亲代结合分子的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸取代、插入、缺失或这些变化的组合。此外，功能变体可包含在氨基末端或羧基末端或这两端截短的氨基酸序列。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同(较高或较低)的结合亲和性，但是仍能结合葡萄球菌或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于葡萄球菌或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、超可变区、特别是CDR3区的氨基酸序列被修饰。通常地，轻链和重链可变区包含三个超可变区，包括三个CDR及更保守的区域，即所谓的构架区(FR)。超可变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自超可变环的氨基酸残基。包含早本发明范围内的功能变体与本文所述的亲代人结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。计算机程序如本领域技术人员已知的Gap或Bestfit可用于优化排列对比的氨基酸序列，并说明相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过本领域已知的一般分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸定向诱变、定位诱变，及重链和/或轻链改组。在一个实施方案中，本发明的功能变体具有杀灭葡萄球菌活性。所述杀灭活性与亲代结合分子的杀灭活性相比可以相同，或者较高或较低。此外，具有杀灭活性的功能变体在葡萄球菌控制中可具有进一步活性。其它活性在上文提及。此后，但使用术语(人)结合分子时，其也涵盖(人)结合分子的功能变体。
本发明提供了一组有用的人单克隆抗体，其具有杀灭葡萄球菌的调理吞噬活性，所述抗体包含如下任一种抗体的重链和轻链可变区：CR2430、CR5132、CR5133CR6166、CR6171、CR6176、CR6187、CR6193、CR6249、CR6273、CR6389、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6453、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6526、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566或CR6625；或者包含具有与其至少80％、优选至少90％、更优选至少95％相同的可变区。优选完整抗体的序列与本文揭示的这些抗体的序列至少80％、更优选至少90％、特别优选至少95％相同。基于靶位竞争测定，将抗体分为5个不同组。A组由CR5132、CR5133、CR6187和CR6453组成；B组由CR5140和CR6171组成；C组由CR6176组成；D组由CR6526组成；E组由剩余的CR6166、CR6193、CR6249、CR6273、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566、CR6625组成。基于其效能，从每组抗体中鉴别一种抗体作为优选抗体，优选的抗体是：CR5133、CR6166、CR6171、CR6176和CR6526。这些抗体均示出结合至少两种不同葡萄球菌菌种(金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)及至少3个不同的金黄色葡萄球菌菌株(502、Mn8、Newman)，并具有杀灭其的调理吞噬活性。本发明还提供了包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或者多种本发明的人单克隆抗体的组合物。在优选的实施方案中，所述组合物中至少2种所述抗体来自不同组。这样具有识别葡萄球菌上的不同靶位并因此增加杀灭细菌的机会。当然，较高亲和性的突变体或者具有其它优势性质的突变体可以基于本文揭示的抗体序列利用常规方法制备。当抗体的重链和轻链可变区与本文揭示的抗体的可变区的序列至少80％、优选至少90％、更优选至少95％相同时，这种改良的抗体包括在本发明范围内。
另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含至少一种本文所述结合分子及进一步包含至少一个标记如可检测的成分/物质的分子。本发明还涉及本发明的免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明的免疫缀合物与另一种分子如治疗剂或另一种结合分子或免疫缀合物的混合物。在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，且可以与所述结合分子非共价连接/结合。所述标记也可以与人结合分子通过共价键直接连接/结合。或者，所述标记可以通过一或多个连接化合物与结合分子连接/结合。将标记与结合分子结合的技术为本领域技术人员所熟知。
本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是其也可以是可检测的成分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测剂的免疫缀合物可以诊断性用于例如评估对象是否感染了葡萄球菌菌种细菌，或者作为临床检查程序的一部分监测葡萄球菌感染的发生或进展，以例如确定制定的治疗方案的效率。然而，它们也可用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的成分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、发射正电子的金属及非放射性顺磁性金属离子。用于标记结合分子以用于检测和/或分析和/或诊断目的的标记依赖于所用的特异的检测/分析/诊断技术和/或方法，如(组织)样品的免疫组织化学染色、流式细胞测量术、激光扫描细胞测量术、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、Western印迹等。适于本领域已知的检测/分析/诊断技术的标记为本领域技术人员所熟知。
此外，本发明的人结合分子或免疫缀合物也可以附着于固体支持物，特别适用于葡萄球菌或其片段的体外免疫测定或纯化。这种固体支持物可以是有孔或无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以融合于标记序列如肽以便于纯化。所述标记序列例如但不限于六组氨酸标记、血凝素(HA)标记、myc标记或flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体结合形成抗体异源结合物。另一方面，本发明的结合分子可以与一或多种抗原结合/附着。优选地，这些抗原是由被给予所述结合分子-抗原结合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原彼此可以相同，但也可以不同。将抗原附着于结合分子的结合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子将结合葡萄球菌，及附着于所述结合分子的抗原将引起对于结合物的强大T细胞攻击，这将最后导致葡萄球菌的破坏。
在通过直接结合或者通过例如接头间接结合产生免疫缀合物之后，所述免疫缀合物可以作为包含本发明的结合分子与合适的标记的融合蛋白而产生。融合蛋白可以通过本领域已知的方法产生，例如通过构建包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列及编码合适标记的核苷酸序列的核酸分子、及随后表达所述核酸分子而重组产生。
本发明另一方面提供了编码至少本发明的结合分子、其功能变体或免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可用作克隆的中间物，例如用于上述亲和成熟的方法中。在优选的实施方案中，所述核酸分子是分离的或纯化的。
技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是核酸序列，其可以通过使用标准遗传密码子而被直接翻译，提供与从亲代核酸分子中翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
优选地，所述核酸分子编码包含CDR区的结合分子，优选包含具有选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链CDR3区。在另一个实施方案中，所述核酸分子编码包含本发明结合分子的2、3、4、5或者甚至所有6个CDR区的结合分子。
在另一个实施方案中，所述核酸分子编码包含重链的结合分子，所述重链包含选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的可变重链。在另一个实施方案中，所述核酸分子编码包含轻链的结合分子，所述轻链包含选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34和SEQ IDNO：36的氨基酸序列的可变轻链。
本发明另一方面提供了载体，即包含本发明的一或多种核酸分子的核酸构建体。载体可以衍生自质粒如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌体如λ噬菌体、λ样噬菌体、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T-even、T-odd、T2、T4、T7等；植物病毒。载体可用于克隆和/或表达本发明的结合分子，甚至可用于基因治疗目的。包含与一或多种调节表达的核酸分子可操纵地连接的本发明的一或多种核酸分子的载体也涵盖在本发明范围内。载体的选择依赖于随后的重组方法及所用宿主。载体导入宿主细胞中可以通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或者电穿孔方法实现。载体可以自主复制或者可以与整合进入其中的染色体一起复制。优选地，所述载体含有一或多个选择标记。标记的选择可依赖于选择的宿主细胞，正如本领域技术人员所熟知这对于本发明无关。所述标记包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。包含与编码可用于分离人结合分子的蛋白质或肽的一或多种核酸分子可操纵地连接的编码如上述人结合分子的一或多种核酸分子的载体，也涵盖在本发明内。这些蛋白质或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合型多组氨酸、绿色荧光蛋白、荧光素酶和β-半乳糖苷酶。
含有一或多个拷贝的上述载体的宿主是本发明的另一主题。优选地，所述宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于源于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌的细胞。细菌细胞包括但不限于来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的细胞如一些肠杆菌菌种的细菌，如大肠杆菌和假单胞菌。在真菌细胞中，优选使用酵母细胞。在酵母中的表达可通过使用酵母株如毕赤酵母、啤酒酵母和多形汉逊酵母实现。此外，昆虫细胞如果蝇细胞和Sf9可用作宿主细胞。除此之外，宿主细胞可以是植物细胞如作物植株例如森林植物的细胞，或者提供食品和原材料的植物如禾谷类植物或药用植物的细胞，或者观赏植物的细胞，或者鳞茎花卉植物的细胞。转化的(转基因的)植物或植物细胞通过已知方法产生，例如通过土壤杆菌-介导的基因转移、叶盘法转化法、通过聚乙二醇诱导的DNA转移进行的原生质体转化、电穿孔、超声、显微注射或者基因枪(bolistic)基因转移。另外，合适的表达系统可以是杆状病毒系统。本发明优选使用哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞或Bowes黑素瘤细胞的表达系统。哺乳动物细胞提供了具有翻译后修饰的表达的蛋白质，其与源于哺乳动物的天然分子最相似。由于本发明涉及给予人体的分子，因此特别优选完全的人表达系统。因此，更优选所述宿主细胞是人细胞。人细胞例如是HeLa、911、AT1080、A549、293和HEK293T细胞。在优选的实施方案中，人生产细胞包含可表达形式的编码腺病毒E1区的核酸序列的至少其功能部分。在更优选的实施方案中，所述宿主细胞衍生自人视网膜，且用包含腺病毒E1序列的核酸永生化，如911细胞或细胞系，于1996年2月29日保藏在位于英国威尔特郡SP4 OJG的索尔兹伯里市CAMR的欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为96022940，以商标PER.C
Figure A200780020923D0028094140QIETU
(PER.C6是Crucell Holland B.V.的注册商标)销售。在本说明书中，“PER.C6”是指以保藏号96022940保藏的细胞或者其祖先、上游或下游传代，以及保藏的细胞的祖先的后代，以及任何前述细胞的衍生物。宿主细胞中重组蛋白的产生可以根据本领域熟知的方法进行。以商标PER.C
Figure A200780020923D0028094140QIETU
销售的细胞作为感兴趣的蛋白质的生产平台的应用已经在WO 00/63403中描述，所述文献以其全部内容并入本文作参考。
产生本发明的结合分子的方法是本发明的另一部分。所述方法包括如下步骤：a)在有益于所述结合分子表达的条件下培养本发明的宿主，及b)任选地回收表达的结合分子。表达的结合分子或者免疫缀合物可以从无细胞提取物中回收，优选从培养基中回收。上述产生结合分子的方法也可以用于产生本发明的结合分子和/或免疫缀合物的功能变体。从无细胞提取物或者培养基中回收蛋白质如结合分子的方法为本领域技术人员所熟知。通过上述方法可获得的结合分子、其功能变体和/或免疫缀合物也是本发明的一部分。
或者，在宿主如宿主细胞中表达之后，本发明的结合分子和免疫缀合物可以通过常规肽合成仪或者在无细胞翻译系统中使用衍生自本发明DNA分子的RNA核酸合成产生。通过上述合成产生方法或者无细胞翻译系统可获得的结合分子和免疫缀合物也是本发明的一部分。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子也可以在转基因的非人哺乳动物如兔、山羊或牛中产生，并分泌进例如其乳汁中。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子、优选特异性结合葡萄球菌或其片段的人结合分子，可以由表达人免疫球蛋白基因的转基因的非人哺乳动物例如转基因小鼠或兔产生。优选地，转基因的非人哺乳动物具有包含编码上述所有或部分人结合分子的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。转基因的非人哺乳动物可以用葡萄球菌或其片段的纯化或浓缩制备物免疫接种。免疫接种非人哺乳动物的方案为本领域所熟知。见UsingAntibodies：A Laboratory Manual，Edited by：E.Harlow，D.Lane(1998)，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York和Current Protocolsin Immunology，Edited by：J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober(2001)，John Wiley & Sons Inc.，New York所述，所述文献以其全部内容并入本文作参考。免疫接种方案通常包括多次免疫接种，使用或不使用佐剂如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，但是也可以包括裸DNA免疫接种。在另一个实施方案中，所述人结合分子是由得自转基因动物的B细胞或浆细胞产生。在另一个实施方案中，所述人结合分子由杂交瘤产生，所述杂交瘤是将得自上述转基因的非人哺乳动物的B细胞与永生化的细胞融合而制备。可得自上述转基因的非人哺乳动物的B细胞、浆细胞和杂交瘤以及可得自上述转基因的非人哺乳动物、B细胞、浆细胞和杂交瘤的人结合分子也是本发明的一部分。
另一方面，本发明提供了鉴别特异性结合至少两种不同的细菌生物体的结合分子如人结合分子例如人单克隆抗体或其片段或者编码这种结合分子的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将可复制的遗传包装(genetic packages)表面上的结合分子的集合与第一种细菌生物体在有益于结合的条件下接触，(b)选择至少一次与第一种细菌生物体结合的可复制的遗传包装，(c)任选将与第一种细菌生物体结合的可复制的遗传包装与不结合第一种细菌生物体的可复制的遗传包装分离，将分离的可复制的遗传包装与第二种细菌生物体在有益于结合的条件下接触，并至少选择一次与第二种细菌生物体结合的可复制的遗传包装，以及(d)分离不结合第一种和/或第二种细菌生物体的可复制的遗传包装与结合第一种和/或第二种细菌生物体的可复制的遗传包装，并回收结合第一种和/或第二种细菌生物体的可复制的遗传包装。可扩展至第三种以及另外的细菌生物体的上述方法也是本发明的一部分。
如本文所用，可复制的遗传包装可以是原核或真核生物，包括细胞、孢子、酵母、细菌、病毒、(细菌)噬菌体、核糖体和多核糖体。优选的可复制的遗传包装是噬菌体。结合分子例如单链Fv在可复制的遗传包装上展示，即其附着于位于可复制的遗传包装外表面的基团或分子。可复制的遗传包装是可筛选的单位，包含与编码结合分子的核酸分子连接的待被筛选的结合分子。所述核酸分子应能在体内(例如作为载体)或体外(例如通过PCR、转录和翻译)复制。体内复制可以是自主复制(如对细胞而言)、借助于宿主因子(如对病毒而言)或者借助于宿主和辅助病毒(如对噬菌粒而言)。展示结合分子集合的可复制的遗传包装的形成通过将编码被展示的外源结合分子的核酸分子导入可复制的遗传包装的基因组中，与内源蛋白质形成通常从可复制的遗传包装的外表面表达的融合蛋白来进行。融合蛋白的表达、转运至外表面和装配使得外源结合分子在可复制的遗传包装的外表面展示。
本发明的方法中的选择步骤可以使用活的且仍具有感染性或者失活的细菌生物体进行。细菌生物体的失活可以通过本领域技术人员熟知的细菌失活方法进行，例如用低pH即pH4处理6小时至21天；用有机溶剂/去污剂处理，即向细菌中加入有机溶剂和去污剂(Triton X-100或Tween-80)；UV/光照射；γ射线放射；以及用相关抗生素处理。本领域技术人员熟知测试细菌生物体是否仍是活着的、感染性的和/或能活的或者部分或完全失活的方法。上述方法中使用的细菌生物体可以是非分离的，例如存在于感染的个体的血清和/或血液中。使用的细菌生物体也可以作为在37℃在合适的培养基如绵羊血液琼脂上培养过夜后的分立的菌落来分离。
在一个实施方案中，所述第一种和/或第二种细菌生物体当与可复制的遗传包装接触时是在悬浮液中。或者，当进行接触时也可以与载体连接。在另一个实施方案中，所述第一种和第二种细菌生物体来自不同的细菌科，例如第一种细菌是革兰氏阴性细菌，第二种细菌是革兰氏阳性细菌。这样可以发现能特异性结合革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的结合分子。优选地，第一种和第二种细菌生物体均是革兰氏阳性细菌。第一种和第二种细菌生物体可以均是葡萄球菌。在一个实施方案中，第一种细菌和第二种细菌生物体是相同菌种的不同菌株，例如葡萄球菌菌种如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。这样可以发现能特异性结合一个菌种内不同菌株的菌种特异性结合分子。在另一个实施方案中，第一种和第二种细菌生物体是不同葡萄球菌菌种的成员，例如第一种和第二种葡萄球菌菌种选自由金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌组成的菌种。这样可以发现能特异性结合一个细菌属内不同菌种的结合分子。或者，第一种和第二种细菌生物体可以是肠球菌。在一个实施方案中，第一种和第二种细菌生物体是相同细菌种的不同菌株，如肠球菌种例如粪肠球菌或尿肠球菌。这样可以发现能特异性结合一个菌种内不同菌株的菌种特异性结合分子。在另一个实施方案中，第一种和第二种细菌生物体是不同肠球菌种的成员，例如第一种和第二种肠球菌种选自粪肠球菌或尿肠球菌组成的菌种。
或者，选择步骤可以在存在细菌生物体片段的情况中进行，细菌生物提片段例如是细胞膜制备物、已经用酶(例如蛋白酶K)处理除去了蛋白质的细胞膜制备物、已经用酶(例如用高碘酸盐)处理除去了碳水化合物成分的细胞膜制备物、重组蛋白质或多糖。在另一个实施方案中，选择步骤在存在衍生自细菌生物体的一或多种蛋白质或(多)肽、包含这些蛋白质或(多)肽的融合蛋白等情况中进行。这些蛋白质的细胞外暴露部分也可以用作选择材料。活的或失活的细菌生物体或其片段在使用之前可以固定于合适的材料。或者，使用于悬浮液中的活的或失活的细菌。在一个实施方案中，可以对得自细菌生物体的不同材料进行选择。例如，第一次选择循环可以对在悬浮液中的活的或失活的细菌生物体进行，而第二次和第三次选择循环可以分别对重组的细菌蛋白和多糖进行。当然，也可以尝试其它组合。在一个选择/淘选步骤期间也可以使用不同的细菌材料。另一方面，本发明提供了其中选择步骤中使用的细菌生物体得自相同或不同生长期(例如停滞期、对数期、静止期或死亡期)细菌的方法。这样可以发现生长期特异性抗菌的结合分子。例如，第一种细菌生物体可以是静止期的金黄色葡萄球菌，而第二种细菌生物体是对数期的金黄色葡萄球菌；或者第一种细菌生物体可以是停滞期的金黄色葡萄球菌，而第二种细菌生物体是停滞期的表皮葡萄球菌。其它组合也为本领域技术人员所熟知。
在特异的实施方案中，本发明提供如上述的方法，其中如果第一种和/或第二种葡萄球菌菌种是金黄色葡萄球菌菌株，则在金黄色葡萄球菌菌株与可复制的遗传包装接触之前封闭所述金黄色葡萄球菌菌株表面上存在的蛋白A。合适的封闭剂可以是兔血清、纯化的兔免疫球蛋白、胎牛血清、集合的人血清。
另一方面，本发明提供了获得特异性结合至少两种不同的细菌生物体的结合分子或者编码这种结合分子的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：a)进行上述鉴别结合分子的方法，b)从回收的可复制的遗传包装中分离所述结合分子和/或编码所述结合分子的核酸分子。可复制的遗传包装表面上的结合分子的集合可以是scFv或Fab的集合。一旦利用上述鉴别结合分子或编码结合分子的核酸分子的方法确定或鉴别出新的scFv或Fab，则编码所述scFv或Fab的DNA可以分离自所述细菌或噬菌体，组合标准的分子生物学技术产生编码具有期望的特异性的二价scFv或完整的人免疫球蛋白的构建体(例如IgG、IgA或IgM)。这些构建体可以转染进合适的细胞系中并产生完整的人单克隆抗体(见Huls et al.，1999；Boel et al.，2000)。
如前所述，优选的可复制的遗传包装是噬菌体。鉴别和获得(人)结合分子例如(人)单克隆抗体的噬菌体展示方法是本领域技术人员已知的常用方法。所述方法例如在美国专利No.5,696,108、Burton and Barbas，1994、de Kruif et al.，1995b及Phage Display：A Laboratory Manual.Edited by：CFBarbas，DR Burton，JK Scott and GJ Silverman(2001)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York中描述。所有这些文献在此均以其全部内容并入作参考。为了构建噬菌体展示文库，将人单克隆抗体重链和轻链可变区的集合在噬菌体表面上表达，优选丝状噬菌体、微粒，例如单链Fv(scFv)或者Fab形式(见Kruif et al.，1995b)。抗体片段表达噬菌体的较大文库通常含有1.0×109以上的抗体特异性，且可以从在免疫或未免疫的个体的B淋巴细胞中表达的免疫球蛋白V区中装配。在本发明的特异实施方案中，结合分子的噬菌体文库、优选scFv噬菌体文库从分离自得自对象的细胞的RNA中制备，所述对象已经针对细菌进行了免疫接种、最近针对不相关的病原体进行了免疫接种、最近患有慢性或急性细菌感染例如葡萄球菌感染、或者是健康个体。RNA可以分离自骨髓或外周血，优选外周血淋巴细胞或者分离的B细胞，或者甚至B细胞的亚群。所述对象可以是针对细菌进行免疫接种的动物，或者是患有或已经患有细菌感染的动物。优选地，所述动物是已经针对细菌进行免疫接种或者患有或已经患有慢性细菌感染或急性细菌感染的人对象。优选地，所述人对象最近刚从细菌感染中恢复。
或者，噬菌体展示文库可以从已经在体外部分装配以在文库(半合成文库)中导入额外的抗体多样性的免疫球蛋白可变区中构建。例如，在体外装配的可变区在对于抗体特异性重要的那些分子区域例如CDR区域中含有合成产生的随机或部分随机的DNA节段。特异于细菌如葡萄球菌的噬菌体抗体可以从文库中选择，通过将所述细菌或其材料暴露于噬菌体文库，使得可以与表达特异于所述细菌或其材料的抗体片段的噬菌体结合。未结合的噬菌体通过洗涤除去，洗脱结合的噬菌体以进行大肠杆菌感染及随后的增殖。通常需要多次选择和增殖循环以足以富集特异于所述细菌或其材料的噬菌体。如果需要，在噬菌体文库暴露于所述细菌或其材料之前，首先可以通过将噬菌体文库暴露于非靶向材料如不同科、菌种和/或菌株的细菌或者不同生长期的细菌或者这些细菌的材料而使其缩减。这些缩减的细菌或其材料可以结合固相或者可以是悬浮的。也可以根据与复合抗原如细菌蛋白质或(多)肽任选补充细菌多糖或其它细菌材料的复合混合物的结合选择噬菌体。编码细菌如葡萄球菌的一或多种蛋白质或(多)肽的宿主细胞也可以用于选择目的。使用这些宿主细胞的噬菌体展示方法可以通过在筛选期间加入过量的宿主细胞以缩减不相关的结合子而扩充和改良，所述宿主细胞不包含靶分子或者包含与靶分子相似但不相同的非靶分子，从而显著增加发现相关结合分子的机会。当然，所述缩减可以在用细菌生物体或其材料筛选之前、期间或之后进行。所述方法称作
Figure A200780020923D0033164548QIETU
方法(
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是Crucell Holland B.V.的注册商标；也见于美国专利No.6,265,150所述，所述文献在此并入作参考)。
另一方面，本发明提供了获得潜在具有杀灭至少两种不同细菌生物体活性的结合分子的方法，其中所述方法包括如下步骤：(a)进行如上述获得特异性结合至少两种不同细菌生物体的结合分子或者编码这种结合分子的核酸分子的方法，及(b)核实所述结合分子是否具有杀灭至少两种不同细菌生物体的活性。核实结合分子是否具有杀灭活性的方法为本领域所熟知(见例如Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology，7th Edition)。在另一个实施方案中，也检测所述结合分子的其它活性。其它有用的活性如上述。
另一方面，本发明涉及具有杀灭至少两种、优选至少三种或更多种不同细菌生物体例如葡萄球菌的活性，且可以通过如上述方法获得的结合分子。包含所述结合分子的药物组合物、进一步包含至少一种药物可接受的赋形剂的药物组合物也是本发明的一部分。药物可接受的赋形剂为本领域技术人员所熟知。本发明的药物组合物可进一步包含至少一种其它治疗剂。合适的治疗剂也为本领域技术人员所熟知。
另一方面，本发明提供了包含至少一种结合分子优选人单克隆抗体、至少一种其功能变体、至少一种免疫缀合物或其组合的组合物。除此之外，所述组合物可包含稳定分子如白蛋白或聚乙二醇、或盐。优选地，使用的盐是保留所述结合分子的希望的生物学活性但是不赋予任何不希望的毒性作用的盐。如果需要，本发明的人结合分子可以用材料包被或者包被于材料上，以保护其免于酸或者可以失活所述结合分子的其它天然或非天然条件的作用。
另一方面，本发明提供了包含本发明所述至少一种核酸分子的组合物。所述组合物可包含水溶液如含有盐(例如NaCl或如上述的盐)、去污剂(例如SDS)和/或其它合适成分的水溶液。
此外，本发明涉及包含本发明的至少一种结合分子如人单克隆抗体(或其功能片段或变体)、至少一种免疫组合物、至少一种组合物或者这些成分的组合的药物组合物。本发明的药物组合物进一步包含至少一种药物可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，所述药物组合物可包含两或多种具有杀灭细菌生物体例如葡萄球菌菌种活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合使用所述结合分子时，其呈现协同杀灭活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有杀灭活性的结合分子，特征在于所述结合分子在杀灭的细菌生物体如葡萄球菌菌种中协同发挥作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合使用所述结合分子时，结合分子的组合作用高于其单独应用时的累加作用。协同作用的结合分子可以结合细菌生物体的同一独特片段上的不同结构。在一个实施方案中，协同发挥杀灭细菌生物体活性的结合分子也可以协同杀灭其它细菌生物体。通过综合指数计算协同作用的方式。关于综合指数(CI)的概念在Chou and Talalay，1984中描述。具有协同活性的两或多种结合分子具有独特的作用模式。例如，第一种结合分子可具有调理活性，而第二种结合分子具有增加/增大/增强吞噬作用的另一种活性；或者第一种结合分子可具有固有(杀灭)活性，例如降低或抑制细菌生长或者直接杀灭细菌，而第二种结合分子增加细菌对于抗生素治疗的敏感性。应理解其它组合方式也涵盖在本发明中。
本发明的药物组合物可进一步包含至少一种其它治疗剂、预防剂和/或诊断剂。优选地，所述药物组合物包含至少一种其它预防剂和/或治疗剂。优选地，所述进一步的治疗剂和/或预防剂是能预防和/或治疗细菌例如葡萄球菌感染和/或得自这种感染的病症的物质。治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗微生物剂。这些物质可以是结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗微生物肽等。目前用于治疗细菌感染如葡萄球菌感染的患者的其它物质是抗生素，例如二代和三代头孢菌素、氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类抗生素(Carbapenems)、大环内酯类抗生素、酮内酯类抗生素(Ketolides)、喹诺酮类抗菌药和其它抗生素如达托霉素(daptomycin)、利奈唑酮(linezolid)、呋喃坦啶、奎奴普丁(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)、甲氧苄啶/磺胺类药物、万古霉素。这些药物可以与本发明的结合分子组合使用。能预防和/或治疗细菌感染和/或得自这种感染的病症的试验阶段的物质也可以用作本发明中的其它治疗剂和/或预防剂。
本发明的结合分子或药物组合物在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中测试。这种动物模型系统包括但不限于小鼠脓血症和腹膜炎模型、大鼠脓血症和心内膜炎模型，及兔心内膜炎模型。
通常地，药物组合物在生产和贮存条件下必须是无菌和稳定的。本发明的结合分子、免疫缀合物、核酸分子或组合物可以是粉末形式，在给予人体之前及给予时于适当的药物可接受的赋形剂中重建。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末情况中，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，从先前经过滤灭菌的溶液中产生具有活性成分与任何其它希望成分的粉末。
或者，本发明的结合分子、免疫缀合物、核酸分子或组合物可以在溶液中，且在给予人体之前或者在给予时可以加入和/或混合适当的药物可接受的赋形剂，以提供单位剂量的可注射剂型。优选地，本发明中使用的药物可接受的赋形剂适于高药物浓度、可以保持合适的流动性，且如果需要可以延缓吸收。
给予所述药物组合物的最佳途径的选择受到一些因素的影响，包括组合物中活性分子的物理-化学性质、临床状况的紧急性及活性分子的血清浓度与希望的治疗效应之间的关系。例如，如果需要，本发明的结合分子可以用保护其免于迅速释放的载体制备，如控释配制品，包括植入体、透皮贴剂及微囊给药系统。可以使用可生物降解的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此外，也许需要包被所述结合分子，或者共同给予所述结合分子与防止所述人结合分子失活的材料或化合物。例如，所述结合分子可以在适当的载体例如脂质体或稀释剂中给予对象。
给予途径可以分为两种主要形式：口服和肠道外给予。优选的给予途径是静脉内给予。
口服剂型可以配制为片剂、糖锭、锭剂、水溶液或油脂悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳状液、硬胶囊、软凝胶胶囊、糖浆剂或酏剂、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶或悬浮液。这些配制品可含有药物赋形剂，包括但不限于惰性稀释剂、粒化剂和分解剂、结合剂、润滑剂、防腐剂、色素、香味剂或甜味剂、植物油或矿物质油、增湿剂和增稠剂。
本发明的药物组合物也可以配制成肠道外给予形式。肠道外给予配制品可以是水溶液或者非水溶液的等张无菌无毒注射液或灌注液或悬浮液。所述溶液或悬浮液可包含在使用的剂量和浓度范围内对受体无毒的物质，如1，3-丁二醇、Ringer＇s溶液、Hank’s溶液、等张的氯化钠溶液、油类、脂肪酸、局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、增稠剂或增加稳定剂、水溶性抗氧化剂、脂溶性抗氧化剂及金属螯合剂。
另一方面，本发明的结合分子如人单克隆抗体(其功能片段和变体)、免疫缀合物、组合物或药物组合物可用作药物。因此，使用本发明的结合分子、免疫缀合物、组合物或药物组合物治疗和/或预防细菌(革兰氏阳性和/或革兰氏阴性)例如葡萄球菌感染的方法是本发明的另一部分。上述分子可以用于细菌感染的诊断、预防、治疗或者这些用途的组合。它们也适于治疗细菌感染仍不相关的患者及其细菌感染已经治疗或者治疗的患者。它们可用于患者如住院的婴幼儿、早产儿、烧伤患者、老年患者免疫功能低下的患者、免疫功能抑制的患者、进行介入手术的患者、及卫生保健人员。每种给予均可保护对象免于细菌生物体的进一步感染直至3或4周，和/或将延迟感染相关症状的发生或进展。本发明的结合分子除了调理作用之外，可以通过增加细菌对抗生素的敏感性而提高现有抗生素治疗的效率，可以刺激免疫系统攻击细菌入侵。这种作用可以获得对于细菌感染的长期保护作用。此外，本发明的结合分子可直接抑制细菌的生长，或者抑制细菌感染期间存活需要的毒性因子。
上述分子或组合物可以与可用于诊断、预防和/或治疗的其它分子联合应用。可以在体外、源于体内或在体内应用。例如，本发明的结合分子如人单克隆抗体(或其功能变体)、免疫缀合物、组合物或药物组合物可以与细菌生物体的疫苗(如果可获得)共同给予。或者，所述疫苗也可以在在给予本发明的分子之前或之后给予。代替疫苗，抗微生物剂也可以与本发明的结合分子联合应用。合适的抗微生物剂如上所述。
所述分子通常以治疗或诊断有效量配制成本发明的组合物和药物组合物。或者，可以单独配制及给予。例如，其它分子如抗微生物剂可以全身性应用，而本发明的结合分子可以鞘内或心室内注射。
可以调节给药剂量方案以提供最佳的预期应答(例如治疗反应)。合适的剂量范围可例如是0.1-100mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。此外，根据治疗情况例如可以给予一次推注、分成几次给予、或者成比例地降低或提高给予剂量。本发明的结合分子和组合物优选是无菌的。使得这些结合分子和组合物灭菌的方法为本领域所熟知。可用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以与本发明的结合分子相似给药剂量方案给予。如果单独给予其它分子，可以在给予本发明的一或多种结合分子或药物组合物之前(例如2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周之前)、同时或之后(例如2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周之后)给予。精确的给药剂量方案通常在人患者临床试验期间选择出。
当作为体内治疗剂给予人体时，通常优选人结合分子和包含人结合分子的药物组合物，因为受体对于给予的抗体的免疫应答通常低于给予单克隆鼠的、嵌合的或人源化的结合分子的免疫应答。
另一方面，本发明涉及本发明的结合分子如杀灭活性的人单克隆抗体(其功能片段和变体)、免疫缀合物、核酸分子、组合物或药物组合物在制备用于诊断、预防、治疗细菌(革兰氏阳性和/或革兰氏阴性)感染例如葡萄球菌感染的药物中的应用或其组合应用。
接下来，包含本发明的至少一种结合分子如杀灭活性人单克隆抗体(其功能片段和变体)、至少一种免疫缀合物、至少一种核酸分子、至少一种组合物、至少一种药物组合物、至少一种载体、至少一种宿主或者这些成分的组合物的试剂盒也是本发明的一部分。任选地，上述本发明试剂盒的成分包装在合适的容器中并根据诊断、预防和/或治疗目的而进行标记。上述成分可以水溶液、优选无菌溶液形式或者以重建的冻干、优选无菌冻干形式贮存在单位容器或者多剂量容器中。所述容器可以由各种材料制成，如玻璃或塑料制品，且具有无菌入口(例如容器可以是静脉内注射溶液包或者具有可由皮下注射针穿透的塞子的小瓶)。所述试剂盒可进一步包含具有药物可接受的缓冲液的多个容器。所述试剂盒可进一步包括从商业和使用者角度需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、注射针、注射器、针对一或多种合适宿主的培养基，甚至可能包含至少一种其它的治疗剂、预防剂或诊断剂。试剂盒附带说明书，通常包括治疗、预防或诊断制品的商业包装，其含有关于例如这种治疗、预防或诊断制品的使用说明、用途、剂量、生产、给予、禁忌症和/或注意事项等内容。
本发明的结合分子也可以用于包被医用设备或聚合的生物材料。
本发明进一步涉及检测样品中细菌生物体(革兰氏阳性和/或革兰氏阴性)的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将样品与诊断有效量的本发明的结合分子(其功能片段和变体)或免疫缀合物接触，及(b)确定所述结合分子或免疫缀合物是否特异性结合样品分子。优选地，所述方法用于检测样品中的葡萄球菌。所述样品可以是生物样品，包括但不限于来自(潜在)感染的个体的血液、血清、尿液、组织或其它生物材料；或者是非生物样品，例如水、饮料等。所述(潜在)感染的个体可以是人，但是也可以使用本发明的人结合分子或免疫组合物对怀疑是这种细菌生物体的载体的动物测试所述细菌生物体的存在情况。首先可以对样品进行处理以使其更适于检测方法。处理意味着对怀疑含有和/或含有细菌生物体的样品进行处理，由此使所述生物体分解成为抗原性成分如蛋白质、(多)肽或者其它抗原性片段。优选地，将本发明的人结合分子或免疫缀合物与样品在使得所述人结合分子与样品中也许存在的细菌生物体或其抗原性成分之间形成免疫学复合物的条件下接触。免疫学复合物的形成表示样品中所述细菌生物体的存在，通过适当方法检测并测量免疫学复合物的形成。这种方法包括同源和异源结合免疫测定法，例如放射性免疫测定(RIA)、ELISA、免疫荧光测定、免疫组织化学测定、FACS、BIACORE和Western印迹分析。
优选的测定技术、特别是对于大规模临床筛选患者血清和血液及血液制品的优选测定技术是ELISA和Western印迹技术。特别优选ELISA测试。为了在这些测定法中用作试剂，使本发明的结合分子或免疫缀合物与微滴定孔的内表面适当结合。本发明的结合分子或免疫缀合物可以直接结合所述微滴定孔。然而，本发明的结合分子或免疫缀合物与孔的最大结合可以通过在加入本发明的结合分子或免疫缀合物之前用聚赖氨酸预处理所述孔而实现。此外，可以通过已知方法使本发明的结合分子或免疫缀合物与孔共价附着。通常地，使用的结合分子或免疫缀合物为0.01至100μg/ml以进行包被，但是也可以使用更高及更低的量。然后将样品加入用本发明的结合分子或免疫缀合物包被的孔中。
此外，本发明的结合分子可用于鉴别细菌生物体例如葡萄球菌的特异性结合结构。所述结合结构可以是蛋白质和/或多肽上的表位。它们可以是线性的，但是也可以是具有结构和/或构象的。在一个实施方案中，所述结合结构可以通过PEPSCAN分析法(见WO 84/03564、WO 93/09872、Slootstra et al.，1996所述)进行分析。或者，可以对包含细菌生物体蛋白质的肽的随机肽文库进行筛选，筛选能结合本发明的结合分子的肽。发现的结合结构/肽/表位可以用作疫苗及用于诊断细菌感染。可以通过质谱测量、高效液相层析及核磁共振法鉴别由所述结合分子的结合结构结合的蛋白质和/或多肽之外的片段。
另一方面，本发明提供了筛选特异性结合与本发明的人结合分子结合的表位相同的细菌生物体(革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌)例如葡萄球菌的表位的结合分子(或其功能片段或变体)的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将筛选的结合分子、本发明的结合分子与细菌生物体或其片段接触，(b)测量筛选的结合分子是否能与本发明的结合分子竞争性特异性结合所述细菌生物体或其片段。在进一步的步骤中，可以确定能竞争性特异性结合所述细菌生物体或其片段的筛选的结合分子是否具有杀灭活性，例如调理活性。能与本发明的结合分子竞争性特异性结合细菌生物体或其片段的结合分子是本发明的另一部分。在上述筛选方法中，“特异性结合相同表位”也涵盖了特异性结合与本发明的结合分子结合的表位大体相同或基本相同的表位。阻断或者竞争本发明的结合分子结合细菌生物体的能力通常表示筛选的结合分子结合细菌生物体上的与本发明的结合分子免疫特异性识别的细菌生物体上的结合位点结构重叠的表位或结合位点。或者，这可以表示筛选的结合分子结合与本发明的结合分子免疫特异性识别的结合位点最接近的表位或结合位点，以在空间上或另外抑制本发明的结合分子与细菌生物体的结合。
通常地，竞争性抑制通过一种测定法测量，其中将抗原组合物(即包含细菌生物体或其片段的组合物)与参考结合分子(即本发明的结合分子)及筛选的结合分子混合。通常筛选的结合分子过量存在。基于ELISA和Western印迹的方法适用于这种单一竞争性研究。通过使用物种或同种型二抗，可以仅检测到结合的参考结合分子，这种结合由于识别基本相同表位的筛选的结合分子的存在而降低。在进行参考结合分子与任何筛选的结合分子(无论是物种还是同种型的)之间结合分子竞争性研究中，可以首先用可检测的标记如生物素、酶或放射性或者其它标记物标记所述参考结合分子以使得可以进行随后的鉴别。通过这些竞争性测定鉴别的结合分子(竞争性结合分子或者交叉反应性结合分子)包括但不限于结合所述参考结合分子即本发明的结合分子结合的表位或结合位点的抗体、抗体片段及其它结合剂，以及结合与所述参考结合分子结合的表位最接近的表位或结合位点的抗体、抗体片段及其它结合剂，以在筛选的和参考的结合分子之间发生竞争性结合。优选地，当本发明的竞争性结合分子过量存在时，其抑制参考结合分子与选择的靶物种的特异性结合，抑制程度为至少10％、优选至少25％、更优选至少50％、最优选至少75％-90％或者甚至更高。结合与本发明的结合分子所结合的大约相同、大体相同、基本相同或相同的表位的一或多种竞争性结合分子的鉴别是简单明了的技术。由于竞争性结合分子的鉴别在与参考结合分子即本发明的结合分子的对比中确定，因此应理解鉴别结合与所述参考结合分子相同或大体相同或基本相同的表位的竞争性结合分子实际上不需要确定所述参考结合分子和竞争性结合分子结合的表位。
实施例
为了例证本发明，提供了如下实施例。所述实施例无以任何方式限制本发明范围之意。
实施例1：使用从针对调理活性而筛选的供体中提取的RNA构建scFv噬 菌体展示文库
从据报告最近感染革兰氏阳性细菌的供体和25-50岁的健康成人中取血样。通过离心分离周围血白细胞，保留血清并在-80℃贮存。使用基于FACS的吞噬作用测定法(Cantinieaux et al.，1989)筛选供体血清的调理活性，并与正常健康供体血清集合的相应活性进行比较。选择与正常血清相比具有较高吞噬活性的供体血清，用于产生噬菌体展示文库。使用有机相分离及随后通过乙醇沉淀，从这些供体的周围血白细胞中制备总RNA。将获得的RNA溶解于无RNAse的水中，通过OD 260nm测量法确定浓度。之后，将RNA稀释为100ng/μl浓度。接着，如下所述将1μg的RNA转变为cDNA：向10μl总RNA中加入13μl DEPC-处理的超纯水和1μl随机六聚体(random hexamers)(500ng/μl)，将获得的混合物在65℃加热5分钟并迅速在干冰上冷却。然后，向混合物中加入8μl 5X First-Strand缓冲液、2μl dNTP(10mM each)、2μl DTT(0.1M)、2μl RNAse-抑制剂(40U/μl)和2μl SuperscriptTMIII MMLV逆转录酶(200U/μl)，在室温保温5分钟并在50℃保温1小时。通过加热失活终止反应，即在75℃保温该混合物15分钟。用DEPC-处理的超纯水将获得的cDNA产物稀释为终体积200μl。获得的cDNA产物的50倍稀释溶液(于10mM Tris缓冲液中)的OD 260nm用于确定cDNA浓度。对于每种供体，5-10μl稀释的cDNA产物用作免疫球蛋白γ重链家族和κ或λ轻链序列的PCR扩增模板，使用特异性寡核苷酸引物(见表1-7)进行反应。另外，对于一种供体，进行免疫球蛋白μ重链家族和κ或λ轻链序列的PCR扩增。除了稀释的cDNA产物之外，PCR反应混合物还含有25pmol有义引物和25pmol反义引物，终体积为50μl于20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、250μMdNTP和1.25单位Taq聚合酶中。在温度为96℃的热盖热循环仪中，使获得的混合物迅速解链2分钟，随后进行30次如下循环：96℃反应30秒、55℃或60℃反应30秒以及在72℃反应60秒。最后，将样品在72℃保温10分钟并在4℃冷藏保存直至进一步应用。
在第一次扩增循环中，将18个轻链可变区有义引物(12个针对λ轻链(见表1；HuVL1A-Back，HuVL1B-Back和HuVL1C-Back有义引物在使用前以等摩尔混合，HuVL9-Back和HuVL10-Back引物也如此)，6个针对κ轻链(见表2))的每一种与识别C-κ恒定区HuCK-FOR 5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’(SEQ ID NO：37)或者C-λ恒定区HuCL2-FOR 5’-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3’(SEQ ID NO：38)和HuCL7-FOR 5’-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3’(SEQ ID NO：39)(HuCL2-FOR和HuCL7-FOR反义引物在使用之前等摩尔混合)的反义引物组合，产生大约650个碱基对的15种产物。这些产物在琼脂糖凝胶上纯化，使用Qiagen凝胶提取柱从凝胶中分离。1/10的每种分离的产物用于与上述相同的PCR反应中，使用18种有义引物进行反应，从而每个λ轻链有义引物均与三个Jλ区特异性反义引物之一组合，每个κ轻链有义引物均与五个Jκ区特异性反义引物之一组合(见表3；HuVL1A-Back-SAL、HuVL1B-Back-SAL和HuVL1C-Back-SAL有义引物在应用之前等摩尔混合，HuVL9-Back-SAL和HuVL10-Back-SAL有义引物也如此)。第二次扩增循环中使用的有义引物与第一次扩增中使用引物相同，但是用限制位点(见表3)延伸以可以在噬菌体展示载体PDV-C06(SEQ ID NO：40)中定向克隆。这样产生大约400个碱基对的57种产物(如表4示出)，保持文库中不同J节段和轻链家族的天然分布，且不会过度或不足地代表某些家族。集合的产物使用Qiagen PCR纯化柱纯化。在接下来的步骤中，3μg集合的产物和100μg PDV-C06载体用SalI和NotI消化并从凝胶中纯化。此后，如下所述在16℃连接过夜：向500ng PDV-C06载体中加入35、70或者140ng集合的产物，连接混合物总体积为50μl，含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25μg/ml BSA和2.5μl T4DNA连接酶(400U/μl)。通过苯酚/氯仿提取、随后通过氯仿提取和乙醇沉淀，从而纯化该连接混合物，所述方法为本领域技术人员所熟知。将获得的DNA溶解于50μl 10mM Tris-HCl pH8.5中，根据厂商指导(Stratagene)将1或2μl每一连接混合物电穿孔进40μl的TG1感受态大肠杆菌中。转化体在37℃在补加50μg/ml氨苄青霉素和4.5％葡萄糖的2TY琼脂上生长过夜。计数菌落以确定最佳插入比率的载体。从最佳比率的连接混合物中，将多个1或2μl等分如上述进行电穿孔，并将转化体在37℃生长过夜，通常产生大约107个菌落。从所述琼脂平板中刮取转化体，获得可变轻链区的(亚)文库。这个(亚)文库直接用于使用QiagenTM QIAFilter MAXIprep试剂盒进行质粒DNA制备。
通过与上述关于轻链区相似的两次PCR循环和相同的反应参数从相同的cDNA制备物中扩增重链免疫球蛋白序列，条件是使用表5和表6中示出的引物。第一次扩增使用一组8个有义指导的引物进行(见表5；HuVH1B/7A-Back和HuVH1C-Back有义引物在使用之前等摩尔混合)，每个引物均与称作HuCIgG 5’-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3’(SEQ ID NO：41)的IgG特异性恒定区反义引物混合，产生大约650个碱基对的7种产物。对于一个供体，使用称作HuCIgM 5’-TGG AAG AGGCAC GTT CTT TTC TTT-3’(SEQ ID NO：42)的IgM特异性恒定区反义引物代替引物HuCIgG。产物在琼脂糖凝胶上纯化并使用Qiagen凝胶提取柱从凝胶中分离。将1/10的每种分离的产物用于与上述相同的PCR反应中，使用8个有义引物进行，从而每个重链有义引物均与4个JH区特异性反义引物之一组合(见表6；HuVH1B/7A-Back-Sfi和HuVH1C-Back-Sfi有义引物在使用之前等摩尔混合)。第二次PCR循环中使用的有义引物与在第一次扩增中使用的引物相同，但是用限制位点(见表6)延伸，以能够在轻链(亚)文库载体中定向克隆。这样产生大约400个碱基对的28种产物(示于表7中)，保持文库中不同J节段和重链家族的天然分布，且不会过度或不足地代表某些家族。集合的产物使用Qiagen PCR纯化柱纯化。接着，使用与上述关于轻链(亚)文库相同的连接程序和体积，将3μg纯化的产物用SfiI和XhoI消化并连接在用相同限制酶切割的轻链(亚)文库载体中。如上文关于轻链(亚)文库所述，同样对所得的最后文库也进行连接混合物纯化及随后的转化。将所有细菌、通常为大约107个细菌收获在含有50μg/ml氨苄青霉素和4.5％葡萄糖的2TY培养基中，与甘油混合为15％(v/v)，并以1.5ml等分在-80℃冷冻。每个文库的拯救和选择如下文所述进行。所述各个文库名称为GPB-05-M01、GPB-05-G01、GPB-05-G02、GPB-05-G03、GPB-05-G04和GPB-05-G05。使用与上述程序相似的方法构建两个其它文库RAB-03-G01和RAB-04-G01，如先前在国际专利申请WO2005/118644中所述。
实施例2：使用从记忆B细胞中提取的RNA构建scFv噬菌体展示文库
使用EDTA抗凝取样试管通过静脉穿刺从正常健康供体、康复期供体或者接种的供体中收集外周血。将血样(45ml)用PBS稀释两次，并将30ml等分铺于10ml Ficoll-Hypaque(Pharmacia)上，在室温以900×g连续离心20分钟。小心除去上清，直至恰好在含有淋巴细胞和血小板部分的白色层之上。接着，将此层小心取出(～10ml)，移至新的50ml试管中，用40ml PBS洗涤3次，并在室温以400×g旋转10分钟以除去血小板。获得的含有淋巴细胞的团块再悬浮于含有2％FBS的RPMI培养基中，通过细胞计数法确定细胞数。使用CD24、CD27和表面IgM作为标记对大约1x108个淋巴细胞染色以进行荧光细胞淘选，分离转换的(switched)IgM记忆B细胞。使用设定为Yield模式的Becton Dickinson Digital Vantage装
Figure A200780020923D0045081206QIETU
进行物理记忆B细胞淘选和分离。淋巴细胞作为小的致密细胞群从FSC/SSC窗中门控(gated)。随后从初始B细胞(CD24+/CD27-)和记忆T细胞(CD24-/CD27+)中分离记忆B细胞(CD24+/CD27+)。在接下来的步骤中，使用IgM表达从转换(switch)记忆B细胞(IgM-)中分离IgM记忆B细胞(IgM+)。在这个步骤中，在单独的样品管中淘选IgM记忆B细胞和转换记忆B细胞。将每个细胞群的1 x 105至1 x 106个细胞收集在DMEM/50％FBS中，在淘选完成后将其均以400×g离心10分钟。然后将淘选的IgM记忆B细胞用作文库构建起始材料，根据本发明实施例1所述方法进行构建，在重链免疫球蛋白序列的第一次扩增循环中使用引物HuCIgM。获得的各个文库的名称为MEM-05-M01、MEM-05-M02、MEM-05-M03、MEM-05-M04、MEM-05-M05、MEM-05-M06、MEM-05-M07、MEM-05-M08、MEM-05-M09和MEM-05-M10。
实施例3：选择携带特异性结合葡萄球菌的单链Fv片段的噬菌体
使用抗体噬菌体展示文库、普通噬菌体展示技术和
Figure A200780020923D00461
技术，基本如美国专利No.6,265,150和WO 98/15833(这两篇文献均并入本文作参考)所述，选择抗体片段。使用的抗体噬菌体文库是如实施例1所述制备的筛选的供体文库、如实施例2所述制备的IgM记忆文库及de Kruif et al.，1995b描述的半合成的scFv噬菌体文库(JK1994)。WO 02/103012(在此并入本文作参考)中描述的方法和辅助噬菌体用于本发明中。为了鉴别识别葡萄球菌的噬菌体抗体，使用悬浮状态的活细菌进行噬菌体选择实验。用于选择和筛选的临床分离株示于表8中。所述分离株基于RFLP-分型是不同的。
将细菌在血琼脂平板上在37℃生长过夜，刮取置于含有1mg/ml兔IgG和1％BSA的RPMI缓冲液中，浓度为5 x 109个细菌/ml，在室温保温60分钟。将等份的噬菌体文库(大约1013cfu，使用CT辅助噬菌体扩增(见WO 02/103012))在封闭缓冲液(于PBS中2％ELK)中在室温封闭1-2小时。将封闭的噬菌体文库加入封闭的细菌悬浮液中，总体积为1.5ml，在室温在翻滚式转子(end-over-end rotor)(5rpm)中保温2小时。将此悬浮液在室温以6800×g离心3分钟，弃去上清。将细菌用含有1％ BSA和0.05％ v/vTween-20的RPMI缓冲液洗涤5次，然后用含有1％BSA的RPMI缓冲液洗涤5次，以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体通过与1ml的0.1M三乙胺在室温在翻滚式转子(5rpm)中保温10分钟而从抗原中洗脱。然后将管中的全部内容物与0.5ml的1M Tris-HCl pH7.5混合以中和pH。这个混合物用于感染已经在37℃生长至OD 600nm为大约0.3的5ml的XL1-Blue大肠杆菌培养物。在37℃使得噬菌体感染XL1-Blue细菌30分钟。然后，将该混合物在室温以3200×g离心10分钟，将细菌团块再悬浮于0.5ml 2-胰蛋白胨酵母提取物(2TY)培养基中。将获得的细菌悬浮液分入补加了四环素、氨苄青霉素和葡萄糖的2个2TY琼脂平板中。将该平板在37℃保温过夜后，从平板中刮取菌落，用于制备辅助噬菌体文库，基本如De Kruif et al.(1995a)和WO 02/103012所述进行。简而言之，刮取的细菌用于接种含有氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY培养基，并在37℃温度下生长至OD 600nm为大约0.3。加入CT辅助噬菌体并使其感染所述细菌，之后将培养基更换为含有氨苄青霉素、四环素和卡那霉素的2TY培养基。继续在30℃保温过夜。第二天，通过离心从2TY培养基中去除细菌，之后使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl沉淀培养基中的噬菌体。最后，将噬菌体溶解于具有1％牛血清白蛋白(BSA)的2ml PBS中，过滤灭菌并用于接下来的选择程序中。
通常地，在分离单独的噬菌体抗体之前进行两次选择。对相同的细菌菌株进行两次选择，或者依次使用不同的菌株(见表8关于选择菌株所示)。在第二次选择之后，将单独的大肠杆菌菌落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上是将单独的菌落于96孔平板中生长至对数期并用CT辅助噬菌体感染，之后使噬菌体抗体产生持续过夜。产生的噬菌体抗体经PEG/NaCl沉淀和过滤灭菌，及在ELISA和/或FACS中测试与如前述制备的葡萄球菌的结合。
实施例4：葡萄球菌特异性单链噬菌体抗体的确认
通过基于FACS的肠杆菌结合测定法，在FACS中确认如上述筛选中获得的被选择的单链噬菌体抗体的特异性葡萄球菌结合活性，即其结合一或多种如前述制备的葡萄球菌菌株，但是不不结合肠球菌的活性。将噬菌体抗体用FACS缓冲液(20mM HEPES缓冲液pH7.5，100mM NaCl，1％BSA)在冰上封闭20分钟。将从血液琼脂平板中刮取并于FACS缓冲液中洗涤的每种染色的1 x 109个细菌细胞，加入每个eppendorf管中。将细菌用含有15％人血清(Biowhittaker)的FACS缓冲液在室温封闭30分钟。通过在4℃以1700×g离心3分钟使细菌成为团块沉淀，将其再悬浮于封闭的噬菌体抗体中，在冰上保温1.5小时。然后用FACS缓冲液洗涤细菌，随后与生物素酰化的小鼠抗M13抗体(RDI)保温，继之与链霉亲和素-PE保温。将细胞固定于缓冲的4％甲醛中，并在FACS量具上分析。SC05-132和SC05-133(均选自悬浮状态菌株Cowan上的RAB-03-G01)示出在所有临床测试的分离株上均染色，表示其识别泛葡萄球菌靶位。SC02-430(选自悬浮状态菌株Cowan上JK1994)示出特异性结合葡萄球菌菌株Cowan(见表9)。在进一步的选择中，获得称作SC06-166、SC06-171、SC06-176、SC06-187、SC06-193、SC06-249、SC06-273、SC06-389、SC06-403、SC06-406、SC06-410、SC06-446、SC06-450、SC06-452、SC06-453、SC06-464、SC06-471、SC06-516、SC06-517、SC06-526、SC06-528、SC06-531、SC06-533、SC06-536、SC06-537、SC06-538、SC06-540、SC06-544、SC06-566、SC06-625的单链噬菌体抗体。这些抗体结合至少一种临床测试的分离株(见表9)。SC06-166、SC06-171、SC06-176和SC06-187选自免疫文库，其它噬菌体抗体选自IgM记忆B细胞文库。
为了测试对于非细菌抗原的非特异性反应性，使用ELISA测定。将复合的抗原5％FBS、2％ELK和1％BSA于MaxisorpTM ELISA平板上包被过夜。将选择的单链噬菌体抗体于含有1％BSA的等体积PBS中保温15分钟，以获得封闭的噬菌体抗体。倒空该平板，向孔中加入封闭的单链噬菌体抗体。在室温保温2小时，将平板于含有0.1％v/v Tween-20的PBS中洗涤，结合的噬菌体抗体通过OD 492nm测量进行检测，使用与过氧化物酶缀合的抗-M13抗体进行。作为对照，同时进行该方法，但不用单链噬菌体抗体而使用West Nile病毒包膜蛋白(SC04-374)的阴性对照的单链噬菌体抗体。如表10所示，称作SC02-430、SC05-132和SC05-133的选择的噬菌体抗体未示出与阴性对照抗原FBS、ELK和BSA的任何可检测的结合。
实施例5：葡萄球菌特异性scFv的鉴定
根据标准技术从选择的特异性单链噬菌体抗体(scFv)克隆中，获得质粒DNA并确定核苷酸序列。称作SC02-430、SC05-132和SC05-133的scFv的核苷酸序列(包括克隆限制位点)分别示于SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：23。称作SC02-430、SC05-132和SC05-133的scFv的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。
特异性结合葡萄球菌的scFv的VH和VL基因特征(见Tomlinson IM，Williams SC，Ignatovitch O，Corbett SJ，Winter G.VBASE Sequence Directory.Cambridge United Kingdom：MRC Centre for Protein Engineering(1997))和CDR序列分别示于表11和表12.
与上述单链噬菌体抗体相似，确定了如下名称的单链噬菌体抗体的VL和VH基因特征及CDR序列：SC06-166、SC06-171、SC06-176、SC06-187、SC06-193、SC06-249、SC06-273、SC06-389、SC06-403、SC06-406、SC06-410、SC06-446、SC06-450、SC06-452、SC06-453、SC06-464、SC06-471、SC06-516、SC06-517、SC06-526、SC06-528、SC06-531、SC06-533、SC06-536、SC06-537、SC06-538、SC06-540、SC06-544、SC06-566和SC06-625(数据未示出)。
实施例6：从选择的抗葡萄球菌单链Fv中构建完全人免疫球蛋白分子(人 单克隆抗葡萄球菌抗体)
使用寡核苷酸通过PCR扩增SC02-430的重链和轻链可变区，以附加限制位点和/或用于在IgG表达载体pSyn-C03-HCγ1(SEQ ID No：43)和pSyn-C04-Cλ(SEQ ID No：44)中表达的序列。将SC02-430的重链可变区克隆进载体pSyn-C03-HCγ1中，将SC02-430的轻链可变区克隆进载体pSyn-C04-Cλ中。使用如下寡核苷酸系列首次扩增VLλ基因：5L-B(SEQ IDNO：45)和sy3L-A(SEQ ID NO：46)，并将PCR产物克隆进载体pSyn-C04-Cλ中。根据本领域技术人员已知的标准技术确认所述构建体的核苷酸序列。使用如下寡核苷酸系列首次扩增VH基因：5H-F(SEQ ID NO：47)和sy3H-A(SEQ ID NO：48)。之后将PCR产物克隆进载体pSyn-C03-HCγ1中，根据本领域技术人员已知的标准技术确认核苷酸序列。
将如下名称的scFv的重链和轻链可变区通过限制消化直接克隆，以在IgG表达载体pIg-C911-HCgammal(SEQ ID NO：49)和pIg-C909-Ckappa(SEQ ID NO：50)或pIg-C910-Clambda(SEQ ID NO：115)中表达：SC05-132、SC05-133、SC06-166、SC06-171、SC06-176、SC06-187、SC06-193、SC06-249、SC06-273、SC06-389、SC06-403、SC06-406、SC06-410、SC06-446、SC06-450、SC06-452、SC06-453、SC06-464、SC06-471、SC06-516、SC06-517、SC06-526、SC06-528、SC06-531、SC06-533、SC06-536、SC06-537、SC06-538、SC06-540、SC06-544、SC06-566、SC06-625。将如下名称的scFv的重链可变区通过使用SfiI和XhoI酶限制消化克隆进载体pIg-C911-HCgammal中：SC05-132、SC05-133、SC06-166、SC06-171、SC06-176、SC06-187、SC06-193、SC06-249、SC06-273、SC06-389、SC06-403、SC06-406、SC06-410、SC06-446、SC06-450、SC06-452、SC06-453、SC06-464、SC06-471、SC06-516、SC06-517、SC06-526、SC06-528、SC06-531、SC06-533、SC06-536、SC06-537、SC06-538、SC06-540、SC06-544、SC06-566and SC06-625；将如下名称的scFv的轻链可变区通过使用SalI和NotI酶限制消化克隆进载体pIg-C909-Ckappa或pIg-C910-Clambda中：SC05-132、SC05-133、SC06-166、SC06-171、SC06-176、SC06-187、SC06-193、SC06-249、SC06-273、SC06-389、SC06-403、SC06-406、SC06-410、SC06-446、SC06-450、SC06-452、SC06-453、SC06-464、SC06-471、SC06-516、SC06-517、SC06-526、SC06-528、SC06-531、SC06-533、SC06-536、SC06-537、SC06-538、SC06-540、SC06-544、SC06-566和SC06-625。之后根据本领域技术人员已知的标准技术确认核苷酸序列。
将编码抗人IgG1重链的所得表达质粒pgG102-430C03、pgG105-132C911、pgG105-133C911、pgG106-166C911、pgG106-171C911、pgG106-176C911、pgG106-187C911、pgG106-193C911、pgG106-249C911、pgG106-273C911、pgG106-389C911、pgG106-403C911、pgG106-406C911、pgG106-410C911、pgG106-446C911、pgG106-450C911、pgG106-452C911、pgG106-453C911、pgG106-464C911、pgG106-471C911、pgG106-516C911、pgG106-517C911、pgG106-526C911、pgG106-528C911、pgG106-531C911、pgG106-533C911、pgG106-536C911、pgG106-537C911、pgG106-538C911、pgG106-540C911、pgG106-544C911、pgG106-566C911和pgG106-625C911及编码抗葡萄球菌人Ig轻链的质粒pSyn-C04-Vl2、pgG105-132C909、pgG105-133C909、pgG106-166C910、pgG106-171C910、pgG106-176C909、pgG106-187C909、pgG106-193C910、pgG106-249C910、pgG106-273C910、pgG106-389C910、pgG106-403C910、pgG106-406C910、pgG106-410C910、pgG106-446C910、pgG106-450C910、pgG106-452C909、pgG106-453C909、pgG106-464C910、pgG106-471C910、pgG106-516C909、pgG106-517C910、pgG106-526C910、pgG106-528C910、pgG106-531C910、pgG106-533C909、pgG106-536C909、pgG106-537C910、pgG106-538C910、pgG106-540C910、pgG106-544C910、pgG106-566C910、pgG106-625C910在293T细胞中组合瞬时表达，获得含有人IgG1抗体的上清。称作CR2430、CR5132、CR5133、CR6166、CR6171、CR6176、CR6187、CR6193、CR6249、CR6273、CR6389、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6453、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6526、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566和CR6625的抗体重链的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ IDNO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ IDNO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ IDNO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ IDNO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ IDNO：160、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ IDNO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：174。称作CR2430、CR5132、CR5133、CR6166、CR6171、CR6176、CR6187、CR6193、CR6249、CR6273、CR6389、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6453、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6526、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566、和CR6625的抗体重链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ IDNO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ IDNO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ IDNO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ IDNO：157、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ IDNO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171、SEQ IDNO：173和SEQ ID NO：175。称作CR2430、CR5132、CR5133、CR6166、CR6171、CR6176、CR6187、CR6193、CR6249、CR6273、CR6389、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6453、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6526、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566和CR6625的抗体轻链的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178、SEQ IDNO：180、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：186、SEQ IDNO：188、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：194、SEQ IDNO：196、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：202、SEQ IDNO：204、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：210、SEQ IDNO：212、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：218、SEQ IDNO：220、SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：224、SEQ ID NO：226、SEQ IDNO：228、SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：232和SEQ ID NO：234。称作CR2430、CR5132、CR5133  CR6166、CR6171、CR6176、CR6187、CR6193、CR6249、CR6273、CR6389、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6453、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6526、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566、和CR6625的抗体轻链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：177、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ IDNO：185、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：191、SEQ IDNO：193、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：199、SEQ IDNO：201、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ IDNO：209、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：215、SEQ IDNO：217、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：223、SEQ IDNO：225、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：231、SEQ IDNO：233和SEQ ID NO：235。根据Kabat et al.(1991)在Sequences of Proteinsof Immunological Interest，US Dept.Health and Human Services，NIH，USA(第五版)中所述，本领域技术人员可以确定上述抗体和单链噬菌体抗体的重链和轻链可变区。根据Kabat et al.(1991)、Chothia and Lesk(1987)或者这二者所述，本领域技术人员可以确定上述抗体和单链噬菌体抗体的重链和轻链的CDR区。或者，可以使用VBASE数据库确定可变区和CDR区，该数据库为抗体领域技术人员熟知的数据库。可以将本发明抗体的序列与VBASE数据库中免疫球蛋白序列进行对比(见Tomlinson IM，WilliamsSC，Ignatovitch O，Corbett SJ，Winter G.VBASE Sequence Directory.Cambridge United Kingdom：MRC Centre for Protein Engineering(1997))http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/；MRC Centre for Protein Engineering)，基于这种对比可以确定可变区和CDR区。一些抗体的可变区示于表13中。基本如针对scFv所述通过FACS确认人抗葡萄球菌IgG1抗体结合葡萄球菌的能力(见表14)。阴性对照抗体是抗-West Nile病毒抗体(CR4374)。或者，使用标准程序产生和纯化每种抗体大于1mg的批次。
实施例7：通过FACS测量的葡萄球菌特异性IgG的体外调理吞噬活性
使用新近分化的HL-60细胞通过调理吞噬作用(OPA)测定法测量抗葡萄球菌IgG的调理活性。在OPA测定期间，将荧光细菌与分化的HL-60细胞及系列稀释的IgG混合。使细菌生长至静止期或对数期，之后进行标记。为了使细菌生长至静止期，将不同的葡萄球菌分离株在绵羊血液琼脂平板上在37℃保温过夜。将细菌再悬浮于5ml碳酸氢盐缓冲液(0.1MNaHCO3，pH8.0)中，在室温以800×g离心10分钟后收获，并稀释至浓度为2.9x109个细菌/ml。首先将生长至对数期的细菌在37℃在LB培养基上培养过夜，然后将培养物稀释10倍并在37℃于LB培养基中再生长3小时。通过以800×g离心10分钟收获细菌并再悬浮于碳酸氢盐缓冲液中洗涤直至浓度为2.9 x 109个细菌/ml。将501的5，6-羧基荧光素、琥珀酰亚胺酯溶液((FAM-SE；Molecular Probes，Eugene，Oregon)；于二甲基亚砜中10mg/ml(Fisher Scientific Co.，Fair Lawn，N.J.))加入1ml的2.9 x 109细菌中，将混合物在37℃非振荡保温1小时。标记的细菌在20ml调理吞噬作用缓冲液(具有Ca2+和Mg2+及0.2％牛血清白蛋白的Hanks平衡的盐溶液)中洗涤3次，直至观测到上清呈无色状态。将FAM-SE-标记的细菌再悬浮于8ml OPA缓冲液中，以500μl等份在-20℃避光贮存。
将HL-60细胞(人早幼粒白血病细胞；ECACC NO 98070106)在含有2mM L-谷氨酰胺及补加了10％热灭活的胎牛血清(HyClone Laboratories，Logan，Utah)和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中生长至细胞密度为1-9×105个细胞/ml。第6-35代之间的细胞用于分化。通过在补加了5 x 10-7M全反式维甲酸(Sigma)、6 x 10-12M维生素-D3(Sigma)和30ng/ml人重组G-CSF(R&D)的相同培养基中使细胞分化为粒细胞。通过以160×g离心10分钟收获HL-60细胞，于15ml洗涤缓冲液(Hanks平衡的盐溶液，无Ca2+和Mg2+，含有0.2％牛血清白蛋白中)洗涤2次。将细胞在调理吞噬作用缓冲液中洗涤1次，再悬浮于4ml调理吞噬作用缓冲液中，于血细胞计数器中计数。将细胞浓度调节为5 x 106个细胞/ml。
将抗葡萄球菌IgG和对照IgG(CR4374)在总体积为20μl的调理吞噬作用缓冲液中系列稀释，获得IgG浓度为2.50μg/ml、1.20μg/ml、0.60μg/ml、0.30μg/ml、0.15μg/ml、0.075μg/ml、0.0375μg/ml和0.019μg/ml的稀释液。该稀释液的调理活性在用于PBS中1％BSA封闭的圆底平板中通过OPA测定法测量。作为对照，不使用IgG进行该测定。向该平板的每个孔中加入15μl含有5.4×106个细胞的细菌悬浮液等份。当使用金黄色葡萄球菌菌株Cowan或表皮葡萄球菌的细菌悬浮液时，首先将IgG/细菌悬浮液在37℃保温30分钟，同时将平板在Heidolph titramax 1000中水平振荡(1300rpm)。接着，向平板的每个孔中加入15μl分化的HL-60细胞(共75 x 103个细胞)，并将平板在37℃振荡保温30-45分钟。孔中终体积为50μl。通过加入含有4％v/v甲醛的50μl洗涤缓冲液终止反应。将每个孔中的内容物再悬浮并移至聚苯乙烯一次性试管中以进行流式细胞测量术。样品在4℃于黑暗处贮存直至进行分析。将所述试管涡旋3秒钟，之后于流式细胞仪中分析。为了控制HL-60细胞的分化，测量补体受体CD11b的表达情况。首先将分化与未分化细胞的Fc-受体用兔IgG于冰上封闭15分钟，随后将细胞用CD11bAPC(BD)在冰上标记15分钟。当分析的平均荧光强度(MFI)与未分化细胞的荧光强度相比升高至少10-100倍时，认为细胞是适当分化的。使用FACSCalibur免疫血细胞计数系统(BectonDickinson and Co.，Paramus，N.J.)测定样品并使用CELLQuest软件(version1.2 for Apple system 7.1；Becton Dickinson)分析。每个试管分析7,000个门控的(gated)HL-60粒细胞。在488nm波长激发FAM-SE，针对每个抗体稀释液测量门控的活HL-60细胞的FAM-SE荧光信号。当可以观测到浓度依赖性吞噬作用高于或等于对照IgG的两倍时，认为IgG在吞噬测定中是阳性的。IgG CR2430、CR5132和CR5133证实在对数生长期(见图1)和静止期(见图2)对于金黄色葡萄球菌菌株Cowan均具有调理活性。这三种IgG在生长对数期更有效地增强吞噬活性。IgG CR5132和CR5133与阴性对照抗体相比增强对于金黄色葡萄球菌菌株SA125的吞噬作用(见图3)，抗体CR5133当与阴性对照抗体相比时显著增强分化的HL60细胞对于表皮葡萄球菌菌株SE131的吞噬作用(见图4)。
实施例8：葡萄球菌特异性IgG1结合活性的幅度
为了确定选择的人抗葡萄球菌IgG1抗体的靶位在葡萄球菌及其它革兰氏阳性细菌上的保守程度，基本上如针对scDv所述对一扩大组的临床细菌分离株进行FACS测定(见表15)。从该测定中得出CR5132和CR5133结合所有检测的菌株。CR5140结合除了人葡萄球菌KV111、华纳葡萄球菌KV112、华纳葡萄球菌KV114、表皮葡萄球菌KV115、溶血葡萄球菌KV117、华纳葡萄球菌vd65、华纳葡萄球菌vd66、华纳葡萄球菌vd732、人葡萄球菌vd136、人葡萄球菌vd139和人葡萄球菌K136之外的所有检测的菌株。CR6171结合除了表皮葡萄球菌KV110、人葡萄球菌KV111、华纳葡萄球菌KV112、腐生葡萄球菌KV113、华纳葡萄球菌KV114、溶血葡萄球菌KV117、人葡萄球菌KV118、溶血葡萄球菌K119、华纳葡萄球菌vd65、华纳葡萄球菌vd66、华纳葡萄球菌vd732、人葡萄球菌vd136、人葡萄球菌vd139和人葡萄球菌K136之外的所有测试的菌株。最后，CR6453结合除了人葡萄球菌vd136和人葡萄球菌K136之外的所有检测的菌株。
另外，使用相同的基于FACS的方法，证实该组抗体结合其它革兰氏阳性细菌。抗体CR5132和CR6453示出结合单核细胞增生李斯特氏菌、蜡状芽孢杆菌和A群链球菌，CR5132还结合丙酸杆菌(Propionibacteriumspp.)。抗体CR5133、CR5140和CR6171示出结合A群链球菌，CR5140还结合粪肠球菌(数据未示出)。
实施例9：通过调理吞噬活性的检测(OPKA)测量的葡萄球菌特异性IgG的体外调理吞噬活性
为了更好地确定抗体的功能活性，进行调理吞噬测定以量化抗葡萄球菌人IgG1杀灭金黄色葡萄球菌菌株502、Mn8和Newman及表皮葡萄球菌菌株M187的活性。将新抽取的人血液(10-30ml)与等体积的葡聚糖-肝素缓冲液(4.5g葡聚糖，Sigma Chemical，St.Louis；28.4mg肝素钠于500ml蒸馏水中)混合，将该混合物在37℃保温1小时。通过离心收集含有白细胞的上层，通过将细胞团块悬浮于1％(w/v)NH4Cl中完成对剩余红细胞的低渗细胞溶解。随后将白细胞群在具有15％(v/v)胎牛血清的RPMI中洗涤。使用台盼蓝染色及在血细胞计数仪中计数，确定活的白细胞的浓度，将最终的白细胞浓度调节为2 x 107个细胞/ml。一式两份进行吞噬作用测定，测定使用或不使用加入到以下物质中的100μl白细胞悬浮液：100μl细菌(经分光光度测定将浓度调节为2 x 107个/ml，并通过存活计数证实)、于RPMI中稀释的100μl抗葡萄球菌人IgG1及100μl幼兔补体。将反应混合物在转子架上在37℃保温90分钟；在0时及90分钟后取样品，于1％ Proteose Peptone(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)中稀释，并铺板于胰酶大豆琼脂平板上。抗体的杀灭活性(％)以从无白细胞的样品中存活的CFU平均数中减去含有白细胞的样品中存活的CFU平均数，除以无白细胞的样品中存活的CFU平均数并乘以100而计算。抗葡萄球菌人IgG1的杀灭活性在两个浓度1250和12.5ng/ml进行检测(见表16)。
结果示出抗体CR5132、CR5133、CR6446、CR6453和CR6566即使在12.5ng/ml的低浓度也具有20％以上的杀灭表皮葡萄球菌菌株M187的活性。
实施例10：IgG1竞争测定
为了确定所述抗体是否竞争性结合相同靶位，进行竞争性ELISA。将表皮葡萄球菌菌株SE132在血液琼脂平板上划线，并在37℃保温过夜。使用5ml的50mM碳酸盐缓冲液(8体积的0.2M Na2CO3，17体积的0.2M NaHCO3和75体积的蒸馏水)从该平板中刮取菌落，并以4000rpm离心3分钟。将获得的沉淀再悬浮于500μl碳酸盐缓冲液中，再次离心并将沉淀再悬浮于500μl碳酸盐缓冲液中。细胞密度通过测量细菌的系列稀释液的OD600而确定。将表皮葡萄球菌菌株稀释为5 x 109个细胞/ml，并以100μl(5 x 108个细胞)/孔在Nunc-Immuno Maxisorp F96平板上在4℃包被过夜。在保温后，将孔用PBS洗涤3次，用在PBS中的300μl 2％(v/v)ELK/孔在室温封闭1小时。在单独的试管中，将稀释为不完全饱和水平(通过上述ELISA确定)的25μl每种scFv-噬菌体maxiprep(如上述产生)与25μl封闭缓冲液(4％(v/v)ELK/PBS)和在PBS中稀释为10μg/ml的50μlIgG1上清混合，并于冰上保温20分钟。在除去封闭溶液之后，向每个孔中加入100μl封闭的噬菌体与IgG1的混合物，在室温保温1小时。将孔用PBS/0.01％(v/v)Tween洗涤3次及用PBS洗涤1次。洗涤后，向每个孔中加入100μl抗-M13HRP(1:5000于PBS中2％(v/v)ELK)，在室温保温60分钟。将孔再次洗涤，并通过向每个孔中加入100μl OPD-溶液观察染色情况。在5-10分钟后，通过向每个孔中加入50μl 1M H2SO4而终止反应，在492nm测量OD。使用全部的抗体和对照IgG1 CR4374重复两次进行实验。结果示出抗体分成5个不同组。A组由CR5132、CR5133、CR6187和CR6453组成；B组由CR5140和CR6171组成；C组由CR6176组成；D组由CR6526组成；E组由剩余的CR6166、CR6193、CR6249、CR6273、CR6403、CR6406、CR6410、CR6446、CR6450、CR6452、CR6464、CR6471、CR6516、CR6517、CR6528、CR6531、CR6533、CR6536、CR6537、CR6538、CR6540、CR6544、CR6566、CR6625组成。抗体的结合活性和功能活性与分组是一致的。
实施例11：A组中IgG1的靶位鉴别
为了确定所述抗体的结合靶位，将如上确定的每组的代表性抗体(基于调理活性选择的每组中最有效的抗体)与从金黄色葡萄球菌中提取的LTA在固相ELISA中保温(见表17)。将在PBS中的1μg/ml脂磷壁酸(Sigma)溶液在孔中室温包被过夜。将平板用PBS洗涤1次并用在PBS中的400μl2％(v/v)ELK封闭。将每种抗葡萄球菌IgG1上清和阴性对照上清CR4374及阳性对照抗-LTA小鼠mAb 12248(Abcam)的系列稀释液在室温保温1小时。将孔用PBS洗涤5次，并加入在PBSE中稀释的100μl抗人HRP(1/2000)或抗小鼠HRP(1/2000)，在室温保温1小时。如上述观测并读数所述孔。结果明显证实A组的CR5133强力结合LTA。阳性对照的小鼠单克隆抗体12248示出相似结果。相反，其它组或阴性对照组中无一抗体示出与LTA的明显反应性。A组的抗体CR5132和CR6453一致示出结合LTA，然而CR6187未示出与LTA的结合反应性(数据未示出)。这也许是由于CR6187与组中其它抗体相比较低的亲和性所致。
实施例12：通过调理吞噬杀灭活性检测(OPKA)测量的葡萄球菌特异性IgG抗在不同培养条件下生长的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的体外调理吞噬活性
为了确定如上文所述鉴别的最有效的和非竞争性的调理吞噬性抗葡萄球菌IgG1抗体的细菌杀灭活性是否受不同的细菌生长条件的影响，对在不同培养基中及在不同条件下生长的金黄色葡萄球菌菌株Newman和表皮葡萄球菌菌株RP62A进行上述调理吞噬活性测定。LBA是取自感染患者的免疫血清，用作阳性对照。检测10,000、300、10，、0.3、0.01ng/ml或者-5，-6.5，-8，-9.5，-11 log[g/ml]五种浓度的抗葡萄球菌人IgG1对于生长至中对数期(图5A、B)或者生长至静止期(图5G、H)或者在由1％葡萄糖组成的培养基中(图5C、D)或者在100％人血浆(图5E，F)中的两种葡萄球菌的杀灭活性。
结果示出抗体CR5133、CR6166、CR6171、CR6176和CR6526在所有测试的生长条件下对于两种葡萄球菌菌株均具有强力的调理吞噬活性。重要的是，它们与示出低活性或无活性的阴性对照抗体CR3009显著不同。这提示该组抗体的靶位在多种细菌生长条件下稳定表达，这是对靶细菌可能存在于营养不良条件下的治疗性应用有潜在重要性的因素。
实施例13：葡萄球菌特异性IgG在致死的金黄色葡萄球菌攻击模型中的体内保护作用
在小鼠中进行细菌滴定实验，以确定产生80％-100％致死率的最佳接种剂量。动物经腹膜内接种金黄色葡萄球菌菌株Mn8，剂量为5x109和5x108。观测动物5天，存活用作滴定终点。选择在5天后导致0％存活的剂量作为进一步实验的攻击剂量。
使用上述确定的细菌接种剂量，进行一系列攻击实验以评定已经证实了体外调理吞噬活性的一组葡萄球菌结合mAb(CR5133、CR6166、CR6171、CR6176和CR6526)的保护作用。为了进行每个实验，经腹膜内注射纯化的mAb(一个同种型对照IgG1和5个测试IgG1)(0.5-1ml于PBS中)，剂量为15mg/kg。测试5个mAb的抗金黄色葡萄球菌Mn8的能力。
24小时后，为动物经腹膜内接种上述接种剂量的金黄色葡萄球菌。在即将接种之前，收集少量血液(～50-100ml)(使用切尾方法)，以测量循环血液中的抗体水平。将血液在室温保持30分钟至2小时，使得血液凝固，然后在4℃离心5分钟。取出血清，贮存于-20℃。对接种之前和处死之后的所有血液样品进行人IgG1 ELISA。在进一步的分析中排除在接种之前血液中无可测量的抗体的动物。
每天观测小鼠，持续5天，当表现出严重疾病迹象时处死动物。在5天观测结束时，记录每组存活情况。为了使每个实验生效，实验组存活率必须低于阴性对照IgG1组的20％。
在上述模型中进行进一步实验，其中抗体从10mg/kg半对数(half-log)剂量滴定，以确定其在体内的保护效力。
表1：人λ链可变区引物(有义)
 
引物名称 引物核苷酸序列 SEQ ID NO
HuVL1A-Back 5’-CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3’ SEQ ID NO：51
HuVL1B-Back 5’-CAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3’ SEQ ID NO：52
HuVL1C-Back 5’-CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3’ SEQ ID NO：53
HuVL2B-Back 5’-CAGTCTGCCCTGACTCAGCC-3’ SEQ ID NO：54
HuVL3A-Back 5’-TCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3’ SEQ ID NO：55
HuVL3B-Back 5’-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3’ SEQ ID NO：56
HuVL4B-Back 5’-CAGCYTGTGCTGACTCAATC-3’ SEQ ID NO：57
HuVL5-Back 5’-CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3’ SEQ ID NO：58
HuVL6-Back 5’-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3’ SEQ ID NO：59
HuVL7/8-Back 5’-CAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3’ SEQ ID NO：60
HuVL9-Back 5’-CWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3’ SEQ ID NO：61
HuVL10-Back 5’-CAGGCAGGGCTGACTCAG-3’ SEQ ID NO：62
表2：人κ链可变区引物(有义)
 
引物名称 引物核苷酸序列 SEQ ID NO
HuVK1B-Back 5’-GACATCCAGWTGACCC SEQ ID NO：63
 
AGTCTCC-3’
HuVK2-Back 5’-GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：64
HuVK2B2 5’-GATATTGTGATGACCCAGACTCC-3’ SEQ ID NO：65
HuVK3B-Back 5’-GAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：66
HuVK5-Back 5’-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：67
HuVK6-Back 5’-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：68
表3：用SalI限制位点延伸的人κ链可变区引物(有义)、用NotI限制位点延伸的人κ链J区引物(反义)、用SalI限制位点延伸的人λ链可变区引物(有义)及用NotI限制位点延伸的人λ链J区引物(反义)
 
引物名称 引物核苷酸序列 SEQ ID NO
HuVK1B-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGGACATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：69
HuVK2-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：70
HuVK2B2-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGGATATTGTGATGACCCAGACTCC-3’ SEQ ID NO：71
HuVK3B-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：72
HuVK5-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGGAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3’ SEQ ID NO：73
HuVK6-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGCTGACT SEQ ID NO：74
 
CAGTCTCC-3’
HuJK1-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：75
HuJK2-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：76
HuJK3-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：77
HuJK4-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：78
HuJK5-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’ SEQ ID NO：79
HuVL1A-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3’ SEQ ID NO：80
HuVL1B-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3’ SEQ ID NO：81
HuVL1C-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3’ SEQ ID NO：82
HuVL2B-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC-3’ SEQ ID NO：83
HuVL3A-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGTCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3’ SEQ ID NO：84
HuVL3B-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3’ SEQ ID NO：85
 
HuVL4B-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGCYTGTGCTGACTCAATC-3’ SEQ ID NO：86
HuVL5-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3’ SEQ ID NO：87
HuVL6-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3’ SEQ ID NO：88
HuVL7/8-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3’ SEQ ID NO：89
HuVL9-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3’ SEQ ID NO：90
HuVL10-Back-SAL 5’-TGAGCACACAGGTCGACGCAGGCAGGGCTGACTCAG-3’ SEQ ID NO：91
HuJL1-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：92
HuJL2/3-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：93
HuJL7-FOR-NOT 5’-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3’ SEQ ID NO：94
表4：在最终混合物中的不同轻链产物的百分比，基于琼脂糖凝胶分析确定的浓度
Figure A200780020923D00641
Figure A200780020923D00651
Figure A200780020923D00661
表5：人IgG重链可变区引物(有义)
 
引物名称 引物核苷酸序列 SEQ ID NO
HuVH1B/7A-Back 5’-CAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3’ SEQ ID NO：95
HuVH1C-Back 5’-SAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3’ SEQ ID NO：96
HuVH2B-Back 5’-CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3’ SEQ ID NO：97
HuVH3A-Back 5’-GAGGTGCAGCTGGTGGAG-3＇ SEQ ID NO：98
HuVH3C-Back 5’-GAGGTGCAGCTGGTG SEQ ID NO：99
 
GAGWCYGG-3’
HuVH4B-Back 5’-CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG-3’ SEQ ID NO：100
HuVH4C-Back 5’-CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3’ SEQ ID NO：101
HuVH6A-Back 5’-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3’ SEQ ID NO：102
表6：用SfiI/NcoI限制位点延伸的人IgG重链可变区引物(有义)和用XhoI/BstEII限制位点延伸的人IgG重链J区引物(反义)
 
引物名称 引物核苷酸序列 SEQ ID NO
HuVH1B/7A-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3＇ SEQ ID NO：103
HuVH1C-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3＇ SEQ ID NO：104
HuVH2B-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3＇ SEQ ID NO：105
HuVH3A-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAG-3＇ SEQ ID NO：106
HuVH3C-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG-3＇ SEQ ID NO：107
HuVH4B-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAG SEQ ID NO：108
 
TGGGG-3＇
HuVH4C-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3＇ SEQ ID NO：109
HuVH6A-Back-Sfi 5＇-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3＇ SEQ ID NO：110
HuJH1/2-FOR-XhoIB 5’-GAGTCATTCTCGACTCGAGACRGTGACCAGGGTGCC-3’ SEQ ID NO：111
HuJH3-FOR-Xho 5’-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCATTGTCCC-3’ SEQ ID NO：112
HuJH4/5-FOR-Xho 5’-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3’ SEQ ID NO：113
HuJH6-FOR-Xho 5’-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3’ SEQ ID NO：114
表7：最终混合物中的不同重链产物的百分比
Figure A200780020923D00681
Figure A200780020923D00691
表8：用于抗葡萄球菌单链(scFv)噬菌体抗体的选择和筛选的葡萄球菌临床分离株
 
ID 菌株 医院编码 分离部位
Cowan 金黄色葡萄球菌 NA NA
SA099 金黄色葡萄球菌 D3 前鼻孔
SA100 金黄色葡萄球菌 D8 前鼻孔
SA101 金黄色葡萄球菌 D13 前鼻孔
SA102 金黄色葡萄球菌 D15 前鼻孔
SA103 金黄色葡萄球菌 D16 前鼻孔
SA104 金黄色葡萄球菌 D17 前鼻孔
SA105 金黄色葡萄球菌 D18 前鼻孔
SA108 金黄色葡萄球菌 D20 前鼻孔
SA109 金黄色葡萄球菌 D21 前鼻孔
SA110 金黄色葡萄球菌 D23 前鼻孔
SA111 金黄色葡萄球菌 D26 前鼻孔
SA112 金黄色葡萄球菌 D34 前鼻孔
SA113 金黄色葡萄球菌 D43 前鼻孔
SA114 金黄色葡萄球菌 D44 前鼻孔
SA115 金黄色葡萄球菌 Kv2 肾透析
SA116 金黄色葡萄球菌 Kv3 肾透析
SA117 金黄色葡萄球菌 Kv5 血液
 
SA118 金黄色葡萄球菌 Kv6 血液
SA119 金黄色葡萄球菌 Kv7 血液
SA120 金黄色葡萄球菌 Kv8 伤口
SA121 金黄色葡萄球菌 Kv9 伤口
SA122 金黄色葡萄球菌 Kv11 伤口
SA123 金黄色葡萄球菌 Kv24 CSF
SA124 金黄色葡萄球菌 Kv25 CSF
SA125 金黄色葡萄球菌 Kv27 肺胸膜
SA126 金黄色葡萄球菌 Kv28 肺胸膜
SA127 金黄色葡萄球菌 Kv30 心包的
SA128 金黄色葡萄球菌 Kv31 关节
SA129 金黄色葡萄球菌 Kv32 关节
SE130 表皮葡萄球菌 1587/29 血液
SE131 表皮葡萄球菌 1688/35 血液
SE132 表皮葡萄球菌 1724/42 血液
SE133 表皮葡萄球菌 1587(Kv110) 未知
SE134 表皮葡萄球菌 V48(Kv115) 未知
SE135 表皮葡萄球菌 354(Kv118) 未知
SE136 表皮葡萄球菌 V16 肾透析
SE137 表皮葡萄球菌 V29 肾透析
SE138 表皮葡萄球菌 V33 肾透析
SE139 表皮葡萄球菌 V65 肾透析
SE140 表皮葡萄球菌 V75 肾透析
表9：由FACS测量的单链(scFv)噬菌体抗体的葡萄球菌特异性结合活性
Figure A200780020923D00701
Figure A200780020923D00711
ND未确定
表10：由ELISA在492nm测量的葡萄球菌反应性单链(scFv)噬菌体抗体的非特异性结合活性
Figure A200780020923D00712
表11：葡萄球菌特异性单链Fv的数据
 
scFv名称 核苷酸序列的SEQ IDNO 氨基酸序列的SEQ ID NO* VH-基因座 VL-基因座
SC02-430 19 20(Vh1-118；Vl 134-242) VH4(4-31) Vl 2(2b2)
SC05-132 21 22(Vh 1-118； VH3(3-07) VkI(L12)
 
Vl 135-242)
SC05-133 23 24(Vh1-120；Vl 137-244) VH3(3-11) VkIII(A27)
*括号内示出组成重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸
表12：葡萄球菌特异性单链Fv的CDR区的数据
 
scFv名称 HCDR1(SEQ IDNO：) HCDR2(SEQ ID NO：) HCDR3(SEQ IDNO：) LCDR1(SEQ IDNO：) LCDR2(SEQ IDNO：) LCDR3(SEQ IDNO：)
SC02-430 1 2 3 4 5 6
SC05-132 7 8 9 10 11 12
SC05-133 13 14 15 16 17 18
表13：葡萄球菌特异性IgG的数据
 
名称IgG 核苷酸序列的SEQ ID NO重链 氨基酸序列的SEQ ID NO*重链 核苷酸序列的SEQ ID NO轻链 氨基酸序列的SEQ ID NO*轻链
CR2430 25 26(Vh 1-118) 31 32(Vl 1-109)
CR5132 27 28(Vh 1-118) 33 34(Vl 1-110)
CR5133 29 30(Vh 1-120) 35 36(Vl 1-110)
*括号内示出组成重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸
表14：FACS测量的IgG1分子的葡萄球菌特异性结合活性
Figure A200780020923D00721
ND未确定
表15：FACS测量的IgG1抗体的葡萄球菌特异性结合活性
Figure A200780020923D00731
Figure A200780020923D00741
表16：OPKA测量的IgG1抗体的葡萄球菌杀灭活性
Figure A200780020923D00742
Figure A200780020923D00751
表17：ELISA测量的IgG1抗体的LTA结合活性
Figure A200780020923D00752
参考文献
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<130>0143 WO 00 ORD
<160>235
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Figure A200780020923D00773
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Figure A200780020923D00774
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>5
Figure A200780020923D00781
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Figure A200780020923D00782
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Figure A200780020923D00783
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
Figure A200780020923D00784
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
Figure A200780020923D00785
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Figure A200780020923D00791
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>11
Figure A200780020923D00792
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>12
Figure A200780020923D00793
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>13
Figure A200780020923D00794
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Figure A200780020923D00795
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>15
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Figure A200780020923D00802
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
Figure A200780020923D00803
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Figure A200780020923D00804
<210>19
<211>726
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>SC02-430
<400>19
Figure A200780020923D00805
Figure A200780020923D00811
<210>20
<211>242
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>SC02-430
<400>20
Figure A200780020923D00812
<210>21
<211>726
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>SC05-132
<400>21
Figure A200780020923D00821
<210>22
<211>242
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>SC05-132
<400>22
Figure A200780020923D00822
Figure A200780020923D00831
<210>23
<211>732
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>SC05-133
<400>23
Figure A200780020923D00832
<210>24
<211>244
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>SC05-133
<400>24
Figure A200780020923D00841
<210>25
<211>1344
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1344)
<223>
<400>25
<210>26
<211>448
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>26
Figure A200780020923D00862
Figure A200780020923D00871
<210>27
<211>1344
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1344)
<223>
<400>27
Figure A200780020923D00872
Figure A200780020923D00881
<210>28
<211>448
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>28
Figure A200780020923D00891
Figure A200780020923D00901
<210>29
<211>1350
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
<223>
<400>29
Figure A200780020923D00902
<210>30
<211>450
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>30
Figure A200780020923D00912
<210>31
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>31
Figure A200780020923D00931
<210>32
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>32
<210>33
<211>645
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(645)
<223>
<400>33
Figure A200780020923D00942
Figure A200780020923D00951
<210>34
<211>215
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>34
Figure A200780020923D00952
Figure A200780020923D00961
<210>35
<211>645
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(645)
<223>
<400>35
Figure A200780020923D00962
Figure A200780020923D00971
<210>36
<211>215
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>36
Figure A200780020923D00972
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Anti-sense primer HuCK-FOR
<400>37
<210>38
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Anti-sense primer HuCL2-FOR
<400>38
Figure A200780020923D00981
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Anti-sense primer HuCL7-FOR
<400>39
Figure A200780020923D00982
<210>40
<211>4941
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Vector PDV-C06
<400>40
Figure A200780020923D00983
Figure A200780020923D00991
Figure A200780020923D01001
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Anti-sense primer HuCIgG
<400>41
Figure A200780020923D01002
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Anti-sense primer HuCIgM
<400>42
Figure A200780020923D01003
<210>43
<211>6778
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Vector pSyn-C03-HCgammal
<400>43
Figure A200780020923D01011
Figure A200780020923D01021
<210>44
<211>6283
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Vector pSyn-C04-Clambda
<400>44
Figure A200780020923D01041
Figure A200780020923D01051
Figure A200780020923D01061
<210>45
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide 5L-B
<400>45
Figure A200780020923D01062
<210>46
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide sy3L-A
<400>46
Figure A200780020923D01071
<210>47
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide 5H-F
<400>47
Figure A200780020923D01072
<210>48
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide sy3H-A
<400>48
Figure A200780020923D01073
<210>49
<211>10515
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Vector piG-C911-HCgammal
<220>
<221>misc_feature
<222>(1326)..(5076)
<223>Stuffer
<400>49
Figure A200780020923D01081
Figure A200780020923D01091
Figure A200780020923D01101
Figure A200780020923D01111
Figure A200780020923D01121
<210>50
<211>8777
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Vector piG-C909-Ckappa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1328)..(3860)
<223>Stuffer
<400>50
Figure A200780020923D01122
Figure A200780020923D01131
Figure A200780020923D01141
Figure A200780020923D01151
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL1A-Back
<400>51
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL1B-Back
<400>52
Figure A200780020923D01163
<210>53
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL1C-Back
<400>53
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL2B-Back
<400>54
Figure A200780020923D01165
<210>55
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL3A-Back
<400>55
Figure A200780020923D01171
<210>56
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL3B-Back
<400>56
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL4B-Back
<400>57
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL5-Back
<400>58
Figure A200780020923D01174
<210>59
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL6-Back
<400>59
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL7/8-Back
<400>60
Figure A200780020923D01181
<210>61
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL9-Back
<400>61
Figure A200780020923D01182
<210>62
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL10-Back
<400>62
Figure A200780020923D01183
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213<Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK1B-Back
<400>63
Figure A200780020923D01184
<210>64
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK2-Back
<400>64
Figure A200780020923D01185
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK2B2
<400>65
Figure A200780020923D01191
<210>66
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK3B-Back
<400>66
Figure A200780020923D01192
<210>67
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK5-Back
<400>67
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK6-Back
<400>68
Figure A200780020923D01194
<210>69
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK1B-Back-SAL
<400>69
Figure A200780020923D01195
<210>70
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK2-Back-SAL
<400>70
Figure A200780020923D01201
<210>71
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK2B2-SAL
<400>71
Figure A200780020923D01202
<210>72
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK3B-Back-SAL
<400>72
Figure A200780020923D01203
<210>73
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK5-Back-SAL
<400>73
Figure A200780020923D01204
<210>74
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVK6-Back-SAL
<400>74
Figure A200780020923D01205
<210>75
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJK1-FOR-NOT
<400>75
Figure A200780020923D01211
<210>76
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJK2-FOR-NOT
<400>76
Figure A200780020923D01212
<210>77
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJK3-FOR-NOT
<400>77
Figure A200780020923D01213
<210>78
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJK4-FOR-NOT
<400>78
Figure A200780020923D01214
<210>79
<211>48
<212>DNA
<213>Arti ficialsequence
<220>
<223>Primer HuJK5-FOR-NOT
<400>79
Figure A200780020923D01215
<210>80
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL1A-Back-SAL
<400>80
Figure A200780020923D01221
<210>81
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL1B-Back-SAL
<400>81
Figure A200780020923D01222
<210>82
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL1C-Back-SAL
<400>82
<210>83
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL2B-Back-SAL
<400>83
Figure A200780020923D01224
<210>84
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL3A-Back-SAL
<400>84
<210>85
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL3B-Back-SAL
<400>85
Figure A200780020923D01231
<210>86
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL4B-Back-SAL
<400>86
Figure A200780020923D01232
<210>87
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL5-Back-SAL
<400>87
Figure A200780020923D01233
<210>88
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL6-Back-SAL
<400>88
Figure A200780020923D01234
<210>89
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL7/8-Back-SAL
<400>89
Figure A200780020923D01235
<210>90
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL9-Back-SAL
<400>90
Figure A200780020923D01241
<210>91
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVL10-Back-SAL
<400>91
<210>92
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJL1-FOR-NOT
<400>92
<210>93
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJL2/3-FOR-NOT
<400>93
Figure A200780020923D01244
<210>94
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJL7-FOR-NOT
<400>94
Figure A200780020923D01245
<210>95
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH1B/7A-Back
<400>95
Figure A200780020923D01251
<210>96
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH1C-Back
<400>96
Figure A200780020923D01252
<210>97
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH2B-Back
<400>97
<210>98
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH3A-Back
<400>98
Figure A200780020923D01254
<210>99
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH3C-Back
<400>99
Figure A200780020923D01255
<210>100
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH4B-Back
<400>100
Figure A200780020923D01261
<210>101
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH4C-Back
<400>101
<210>102
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH6A-Back
<400>102
Figure A200780020923D01263
<210>103
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH1B/7A-Back-Sfi
<400>103
Figure A200780020923D01264
<210>104
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH1C-Back-Sfi
<400>104
<210>105
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH2B-Back-Sfi
<400>105
Figure A200780020923D01271
<210>106
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH3A-Back-Sfi
<400>106
Figure A200780020923D01272
<210>107
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH3C-Back-Sfi
<400>107
Figure A200780020923D01273
<210>108
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH4B-Back-Sfi
<400>108
Figure A200780020923D01274
<210>109
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH4C-Back-Sfi
<400>109
<210>110
<211>56
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuVH6A-Back-Sfi
<400>110
Figure A200780020923D01281
<210>111
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJH1/2-FOR-XhoIB
<400>111
<210>112
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJH3-FOR-Xho
<400>112
Figure A200780020923D01283
<210>113
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJH4/5-FOR-Xho
<400>113
Figure A200780020923D01284
<210>114
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Primer HuJH6-FOR-Xho
<400>114
Figure A200780020923D01285
<210>115
<211>8792
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Vector pIg-C910-Clambda
<220>
<221>misc_feature
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<223>Stuffer
<400>115
Figure A200780020923D01291
Figure A200780020923D01301
Figure A200780020923D01311
Figure A200780020923D01321
<210>116
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>116
Figure A200780020923D01331
<210>117
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>117
Figure A200780020923D01342
Figure A200780020923D01351
<210>118
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>118
Figure A200780020923D01352
Figure A200780020923D01361
Figure A200780020923D01371
<210>119
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>119
Figure A200780020923D01372
Figure A200780020923D01381
<210>120
<211>1377
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1377)
<223>
<400>120
Figure A200780020923D01382
Figure A200780020923D01391
Figure A200780020923D01401
<210>121
<211>459
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>121
Figure A200780020923D01402
Figure A200780020923D01411
<210>122
<211>1350
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>122
Figure A200780020923D01421
Figure A200780020923D01431
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<211>450
<212<PRT
<213>Homo sapiens
<400>123
Figure A200780020923D01432
Figure A200780020923D01441
Figure A200780020923D01451
<210>124
<211>1344
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>124
Figure A200780020923D01452
Figure A200780020923D01461
<210>125
<211>448
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>125
Figure A200780020923D01462
Figure A200780020923D01471
Figure A200780020923D01481
<210>126
<211>1356
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>126
Figure A200780020923D01482
Figure A200780020923D01491
Figure A200780020923D01501
<210>127
<211>452
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>127
Figure A200780020923D01502
Figure A200780020923D01511
<210>128
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>128
Figure A200780020923D01512
Figure A200780020923D01521
Figure A200780020923D01531
<210>129
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>129
Figure A200780020923D01532
Figure A200780020923D01541
<210>130
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>130
Figure A200780020923D01551
Figure A200780020923D01561
<210>131
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>131
Figure A200780020923D01562
Figure A200780020923D01571
Figure A200780020923D01581
<210>132
<211>1347
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1347)
<223>
<400>132
Figure A200780020923D01582
Figure A200780020923D01591
<210>133
<211>449
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>133
Figure A200780020923D01611
<210>134
<211>1359
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1359)
<223>
<400>134
Figure A200780020923D01621
Figure A200780020923D01631
<210>135
<211>453
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>135
Figure A200780020923D01632
Figure A200780020923D01641
<210>136
<211>1350
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
<223>
<400>136
Figure A200780020923D01651
Figure A200780020923D01661
<210>137
<211>450
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>137
Figure A200780020923D01662
Figure A200780020923D01671
Figure A200780020923D0168103308QIETU
<210>138
<211>1350
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
<223>
<400>138
Figure A200780020923D01681
Figure A200780020923D01691
<210>139
<211>450
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>139
Figure A200780020923D01701
Figure A200780020923D01711
<210>140
<211>1359
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1359)
<223>
<400>140
Figure A200780020923D01712
Figure A200780020923D01721
Figure A200780020923D01731
<210>141
<211>453
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>141
Figure A200780020923D01741
<210>142
<211>1335
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1335)
<223>
<400>142
Figure A200780020923D01742
Figure A200780020923D01751
Figure A200780020923D01761
<210>143
<211>445
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>143
Figure A200780020923D01771
<210>144
<211>1350
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
<223>
<400>144
Figure A200780020923D01781
Figure A200780020923D01791
<210>145
<211>450
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>145
Figure A200780020923D01792
Figure A200780020923D01801
Figure A200780020923D01811
<210>146
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>146
Figure A200780020923D01812
Figure A200780020923D01821
<210>147
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>147
Figure A200780020923D01831
<210>148
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>148
Figure A200780020923D01842
Figure A200780020923D01851
Figure A200780020923D01861
<210>149
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>149
Figure A200780020923D01862
Figure A200780020923D01871
<210>150
<211>1368
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>150
Figure A200780020923D01891
<210>151
<211>456
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>151
Figure A200780020923D01892
Figure A200780020923D01901
<210>152
<211>1347
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1347)
<223>
<400>152
Figure A200780020923D01911
Figure A200780020923D01921
<210>153
<211>449
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>153
Figure A200780020923D01922
Figure A200780020923D01931
Figure A200780020923D01941
<210>154
<211>1341
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1341)
<223>
<400>154
Figure A200780020923D01942
Figure A200780020923D01951
<210>155
<211>447
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>155
Figure A200780020923D01961
Figure A200780020923D01971
<210>156
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>156
Figure A200780020923D01972
Figure A200780020923D01981
Figure A200780020923D01991
<210>157
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>157
Figure A200780020923D01992
Figure A200780020923D02001
<210>158
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>158
Figure A200780020923D02011
Figure A200780020923D02021
<210>159
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>159
Figure A200780020923D02022
Figure A200780020923D02031
<210>160
<211>1344
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1344)
<223>
<400>160
Figure A200780020923D02051
<210>161
<211>448
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>161
Figure A200780020923D02052
Figure A200780020923D02061
<210>162
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>162
Figure A200780020923D02081
<210>163
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>163
Figure A200780020923D02091
Figure A200780020923D02101
<210>164
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>164
Figure A200780020923D02102
Figure A200780020923D02111
Figure A200780020923D02121
<210>165
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>165
Figure A200780020923D02122
Figure A200780020923D02131
<210>166
<211>1359
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1359)
<223>
<400>166
Figure A200780020923D02151
<210>167
<211>453
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>167
Figure A200780020923D02152
Figure A200780020923D02161
Figure A200780020923D02171
<210>168
<211>1353
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<223>
<400>168
Figure A200780020923D02172
Figure A200780020923D02181
<210>169
<211>451
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>169
Figure A200780020923D02182
Figure A200780020923D02191
Figure A200780020923D02201
<210>170
<211>1356
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1356)
<223>
<400>170
Figure A200780020923D02202
Figure A200780020923D02211
Figure A200780020923D02221
<210>171
<211>452
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>171
Figure A200780020923D02222
<210>172
<211>1338
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1338)
<223>
<400>172
Figure A200780020923D02232
Figure A200780020923D02241
Figure A200780020923D02251
<210>173
<211>446
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>173
Figure A200780020923D02252
Figure A200780020923D02261
<210>174
<211>1359
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1359)
<223>
<400>174
Figure A200780020923D02271
Figure A200780020923D02281
<210>175
<211>453
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>175
Figure A200780020923D02282
Figure A200780020923D02291
Figure A200780020923D02301
<210>176
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>176
Figure A200780020923D02302
Figure A200780020923D02311
<210>177
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>177
Figure A200780020923D02312
<210>178
<211>648
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(648)
<223>
<400>178
Figure A200780020923D02321
<210>179
<211>216
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>179
Figure A200780020923D02331
<210>180
<211>642
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(642)
<223>
<400>180
Figure A200780020923D02341
<210>181
<211>214
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>181
<210>182
<211>657
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(657)
<223>
<400>182
Figure A200780020923D02352
Figure A200780020923D02361
<210>183
<211>219
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>183
Figure A200780020923D02371
<210>184
<211>663
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(663)
<223>
<400>184
Figure A200780020923D02372
Figure A200780020923D02381
<210>185
<211>221
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>185
Figure A200780020923D02382
Figure A200780020923D02391
<210>186
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>186
Figure A200780020923D02392
Figure A200780020923D02401
<210>187
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>187
Figure A200780020923D02402
<210>188
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>188
Figure A200780020923D02411
<210>189
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>189
Figure A200780020923D02421
<210>190
<211>654
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(654)
<223>
<400>190
<210>191
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>191
Figure A200780020923D02432
<210>192
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<40D>192
Figure A200780020923D02442
Figure A200780020923D02451
<210>193
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>193
Figure A200780020923D02452
Figure A200780020923D02461
<210>194
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>194
Figure A200780020923D02462
Figure A200780020923D02471
<210>195
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>195
Figure A200780020923D02472
Figure A200780020923D02481
<210>196
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>196
Figure A200780020923D02482
<210>197
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>197
Figure A200780020923D02492
Figure A200780020923D02501
<210>198
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>198
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<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>199
Figure A200780020923D02511
<210>200
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
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<223>
<400>200
<210>201
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>201
Figure A200780020923D02522
Figure A200780020923D02531
<210>202
<211>639
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(639)
<223>
<400>202
Figure A200780020923D02532
<210>203
<211>213
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>203
<210>204
<211>642
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(642)
<223>
<400>204
Figure A200780020923D02552
Figure A200780020923D02561
<210>205
<211>214
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>205
Figure A200780020923D02562
Figure A200780020923D02571
<210>206
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>206
Figure A200780020923D02572
Figure A200780020923D02581
<210>207
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>207
Figure A200780020923D02582
<210>208
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>208
Figure A200780020923D02592
<210>209
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>209
Figure A200780020923D02601
<210>210
<211>639
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(639)
<223>
<400>210
<210>211
<211>213
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>211
Figure A200780020923D02612
Figure A200780020923D02621
<210>212
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>212
Figure A200780020923D02622
<210>213
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>213
Figure A200780020923D02632
Figure A200780020923D02641
<210>214
<211>663
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(663)
<223>
<400>214
Figure A200780020923D02642
Figure A200780020923D02651
<210>215
<211>221
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>215
Figure A200780020923D02652
Figure A200780020923D02661
<210>216
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>216
Figure A200780020923D02662
Figure A200780020923D02671
<210>217
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>217
Figure A200780020923D02672
Figure A200780020923D02681
<210>218
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>218
Figure A200780020923D02682
Figure A200780020923D02691
<210>219
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>219
Figure A200780020923D02692
<210>220
<211>639
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(639)
<223>
<400>220
Figure A200780020923D02701
<210>221
<211>213
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>221
Figure A200780020923D02711
<210>222
<211>657
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(657)
<223>
<400>222
Figure A200780020923D02712
Figure A200780020923D02721
<210>223
<211>219
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>223
Figure A200780020923D02722
Figure A200780020923D02731
<210>224
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>224
Figure A200780020923D02732
<210>225
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>225
Figure A200780020923D02742
Figure A200780020923D02751
<210>226
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>226
Figure A200780020923D02752
Figure A200780020923D02761
<210>227
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>227
Figure A200780020923D02762
<210>228
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>228
Figure A200780020923D02772
Figure A200780020923D02781
<210>229
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>229
<210>230
<211>663
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(663)
<223>
<400>230
Figure A200780020923D02791
<210>231
<211>221
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>231
Figure A200780020923D02801
<210>232
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>232
Figure A200780020923D02811
<210>233
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>233
Figure A200780020923D02812
Figure A200780020923D02821
<210>234
<211>660
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(660)
<223>
<400>234
Figure A200780020923D02831
<210>235
<211>220
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>235
Figure A200780020923D02841

Claims (12)

1.一种人单克隆抗体，特征在于其具有针对至少两种不同的葡萄球菌菌种及至少三种不同金黄色葡萄球菌菌株的调理吞噬杀灭活性，其中所述抗体选自如下抗体组成的组：
i)具有包含SEQ.ID.NO.30所示可变区的重链和包含SEQ.ID.NO.36所示可变区的轻链的抗体，或者具有与所述的可变区至少80％相同的可变区的抗体；
ii)具有包含SEQ.ID.NO.117所示可变区的重链和包含SEQ.ID.NO.177所示可变区的轻链的抗体，或者具有与所述的可变区至少80％相同的可变区的抗体；
iii)具有包含SEQ.ID.NO.119所示可变区的重链和包含SEQ.ID.NO.179所示可变区的轻链的抗体，或者具有与所述的可变区至少80％相同的可变区的抗体；
iv)具有包含SEQ.ID.NO.121所示可变区的重链和包含SEQ.ID.NO.181所示可变区的轻链的抗体，或者具有与所述的可变区至少80％相同的可变区的抗体；以及
v)具有包含SEQ.ID.NO.155所示可变区的重链和包含SEQ.ID.NO.215所示可变区的轻链的抗体，或者具有与所述的可变区至少80％相同的可变区的抗体。
2.权利要求1的人单克隆抗体，特征在于其对于处于对数生长期和静止期的葡萄球菌菌种具有所述调理吞噬杀灭活性。
3.权利要求1或2的人单克隆抗体，特征在于所述葡萄球菌菌种包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
4.包含至少两种权利要求1-3任一项的人抗体的组合物。
5.包含权利要求1-3任一项的人单克隆抗体的免疫缀合物，所述免疫缀合物进一步包含至少一个标记。
6.编码权利要求1-3任一项的人单克隆抗体的核酸分子。
7.包含至少一种权利要求6的核酸分子的载体。
8.包含至少一种权利要求7的载体的宿主细胞。
9.产生权利要求1-3任一项的人单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
a)在有益于所述人单克隆抗体表达的条件下培养权利要求8的宿主细胞，及任选地，
b)回收表达的人单克隆抗体。
10.包含权利要求1-3任一项的人单克隆抗体、权利要求4的组合物或权利要求5的免疫缀合物的药物组合物，所述药物组合物进一步包含至少一种药物可接受的赋形剂。
11.权利要求10的药物组合物，其进一步包含至少一种其它的治疗剂。
12.权利要求1-3任一项的人单克隆抗体、权利要求4的组合物、权利要求5的免疫缀合物或者权利要求10或11的药物组合物在诊断、预防、治疗葡萄球菌感染中的应用或者其组合应用。
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