HU219503B - Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására - Google Patents
Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU219503B HU219503B HU9501832A HU9501832A HU219503B HU 219503 B HU219503 B HU 219503B HU 9501832 A HU9501832 A HU 9501832A HU 9501832 A HU9501832 A HU 9501832A HU 219503 B HU219503 B HU 219503B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- virus
- prm
- tbe
- derived
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 33
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 26
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 79
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 7
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DYDKXJWQCIVTMR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 101100015199 Caenorhabditis elegans gly-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 description 1
- SIGGQAHUPUBWNF-BQBZGAKWSA-N Gln-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O SIGGQAHUPUBWNF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- IDXZDKMBEXLFMB-HGNGGELXSA-N His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 IDXZDKMBEXLFMB-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 239000012570 Opti-MEM I medium Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HXNYBZQLBWIADP-WDSKDSINSA-N Pro-Cys Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HXNYBZQLBWIADP-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000120645 Yellow fever virus group Species 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány TBE-vírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmasvakcinára vonatkozik. A vakcina nem fertőző, szubvirális partikulákbóláll, amelyek E-proteint és adott esetben prM/M proteint tartalmaznak. ŕ
Description
A találmány TBE-vírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas javított vakcinára vonatkozik, valamint a vakcina előállítására szolgáló eljárásra.
A TBE-vírus (Tick-Bome-Encephalitis vírus) számos európai országban, a volt Szovjetunióban és Kínában okoz endemiás járványokat. Néhány közép-európai országban, így Ausztriában, Németországban, Szlovákiában, Szlovéniában vagy Magyarországon, ahol minden évben több száz - kórházba felvett - esetet regisztrálnak, ez a betegség jelentős problémát jelent a közegészségügy számára [WHO: EURO Reports and Studies, 104, (1983)].
A TBE-vírus, amelynek nyugati, európai és távolkeleti szubtípus formái ismertek, a Flavivirusok családjához tartozik. Ezek a vírusok gömb alakú, lipidburokkal ellátott RNS-vírusok [lásd: T. P. Monath: Flaviviruses, Β. N. Fields: Virology, Raven Press, Ν. Y. (1990) 763-814 oldal],
A Flavivirus virion általánosságban egy olyan nukleokapszidból áll, amelyben az RNS-genom pozitív szála a virális kapszidproteinnel (C-protein) kapcsolódik. A nukleokapszidot egy lipidburok veszi körül, amely az E (50-60 KD) és M (7-8 KD) membránasszociált proteineket tartalmazza [van Regenmortel és Neurath (szerkesztők), „Immunochemistry of Viruses. II. The Basis fór Seradiagnosis and Vaccines”, című kiadványban (Elsevier Sciences, Amsterdam, 1990), Heinz és Roehrig, 289-305. oldalak].
Az E-főburokprotein központi szerepet játszik a Flavivirusok biológiájában, mivel jelentős virális beépülési funkciókat közvetít, és a gazdában protektív immunválaszt vált ki. A TBE-vírus E-burokproteinje szerkezetéről már jelentős mennyiségű információ áll rendelkezésre, és a számos biokémiai és immunológiai adat alapján szerkezetének modelljét is bemutatták [Mandl et al., J. Virol., 63, 564-571 (1989)].
A betegség eredményesen gátolható [Kunz, Ch. Acta leidensia, 60, 1-14 (1990)] egy megfelelően tisztított, formalinmaktivált teljes vírust tartalmazó, olyan oltóanyaggal való oltással (Kunz et al., J. Med. Virol, 6, 103-109 (1980)], amely a vírus szerkezeti proteinjeivel szemben immunválaszt indukál. Ez az oltóanyag bizonyult a legjobbnak, azonban az előállításával kapcsolatos eljárások folyamán nagy mennyiségű fertőző és potenciálisan veszélyes vírusszuszpenzióval kell foglalkozni, és ezért átfogó és drága biztonsági intézkedések alkalmazására van szükség.
Az antitestek vírusneutralizáló képessége attól függ, hogy milyen eredményesen ismerik fel a vírus felületén a proteinek eredeti szerkezetét. A TBE-vírusok és más Flavivirusok esetében tehát elsősorban az E-proteinről van szó [Heinz és Mandl, APMISm 101, 735-745 (1994)]. Egy immunizálás folyamán a lehető leghatékonyabb ellenanyagok eredményes indukciója érdekében tehát megkívánt, hogy az oltóanyag ezt a proteint ugyanabban a formában tartalmazza, mint ahogyan ez a fertőző vírus felületén előfordul. A teljesvírus-oltóanyagoknak az a hátrányuk, hogy a szükséges inaktiválási eljárások az eredeti proteinszerkezet részleges megváltozásához vezethetnek.
A rekombináns DNS-technológia lehetőséget nyújt arra, hogy a teljesvírus-oltóanyagot olyan rekombináns proteinekkel helyettesítsük, amelyek az immunválaszt indukáló proteinek lényeges részét tartalmazzák. Az egyes vírusproteinek géntechnológiai kifejezése kapcsán azonban nincs rögzítve, hogy ezen rekombináns proteinek antigénszerkezete megfelel-e a vírus felületén lévő megfelelő proteinekének.
A TBE-vírusok rekombináns felületi proteinjeinek expressziójáról például Allison és munkatársai [Gemeinsame Jahrestagung ÖBG-ÖGGGT (1993) 114. oldal] számoltak be. Megállapították, hogy az E-protein és az M-protein meghatározott feltételek mellett történő rekombináns expressziójuk esetén, különböző formában - beleértve a nem fertőző szubvirális partikulákat - szekretálódnak.
Ilyen szubvirális partikulák a TBE-vírusok távoli rokonainál, így a Japán Encephalitis Vírusnál (JEV), a sárgaláz vírusainál és a Dengue-láz vírusainál [Konishi et al., Virology, 188, 714-720 (1992); WO 92/03545] ismertek.
Konishi és munkatársai ugyan leírták, hogy az ilyen szubvirális partikulák, amelyeket komplett Freundadjuvánssal emulgeáltak és az egész E-proteint tartalmazták, egerekben bizonyos immunválaszt váltanak ki, másrészt azonban kimutatták, hogy egy olyan E-proteinnel, amelyet C-terminális részénél részben megrövidítettek, lényegesen hatékonyabb védelmet lehet elérni egy Flavivírus-fertőzés ellen, mint a teljes E-proteinnel (WO 92/03161).
A találmány feladata tehát az, hogy a TBE-fertőzések elleni javított oltóanyagot biztosítson.
Ezt a feladatot a találmány egy, a Tick-Bome-Encephalitis-Virus- (TBE-vírus-) fertőzések elleni immunizálásra alkalmas olyan vakcinával oldja meg, amely nem fertőző, szubvirális partikulákból áll. Ezek a partikulák lényegében az E-protein teljes eredeti formáját és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattunk. Lényegesnek tartjuk, hogy az E-protein itt teljes eredeti formájában van jelen, mivel csak ezzel lehet hatékony védelmet biztosítani. A találmány szerinti vakcinában az E-protein natív formáját különböző analízisek segítségével tudtuk bizonyítani, éspedig
a) antigénszerkezet vizsgálata monoklonális antitestekkel,
b) savindukált konformáció változásokra való képesség vizsgálata,
c) hemagglutinációs aktivitás vizsgálata.
Az a tény, hogy a találmány szerinti vakcina összetételénél fogva nem fertőző - tekintettel az ismert vakcinákra -, fontos szempont az oltóanyag biztonsága szempontjából.
Az E-protein és adott esetben a prM/M protein előnyösen rekombináns proteinek.
A vakcina egy különösen előnyös kiviteli formájában az E-proteint a TBE-vírusból származtatjuk, és ebben - a felhasználási területnek megfelelően - mind a nyugati (európai) szubtípust, mind a távol-keleti szubtipust alkalmazzuk. Előnyös, ha a vakcina egy lipid alko2
HU 219 503 Β tórészt is tartalmaz, amely előnyösen vezikuláris formában van jelen.
Azt találtuk, hogy - a szakma véleménye (lásd: WO 92/03161) ellenére - a rekombináns E-protein, amelyet a TBE-vírusokból vezettünk le, csak ebben a nem fertőző, szubvirális partikula formában adhat elégséges immunitást fertőzésekkel szemben. Az E-protein egy részlegesen megrövidített formája, amelynél - mint a WO 92/03161 számon közzétett szabadalmi bejelentésben - a C-terminális membránhorgot eltávolítottuk, hatékony vakcina előállítására nem használható. A találmány szerinti vakcina előnyösen olyan nem fertőző partikulát tartalmaz, amely lényegében PCR-rel kimutatható, TBEvírus eredetű nukleinsavaktól mentes, ez például a Konishi és munkatársai által leírt módszerrel kimutatható.
A találmány egy további eleme TBE-vakcina előállítására vonatkozik, az említett eljárás a következőkkel jellemezhető:
- előállítunk egy olyan sejttenyészet-rendszert, amely a prM- és E-proteineket - ezek a proteinek a TBE-vírusból vezethetők le - kódolószekvenciákat tartalmazza,
- az E-protein a maga teljes, natív formájában fejeződik ki, amikor is
- szubvirális, nem fertőző partikulák képződnek, amelyek lényegében a rekombináns E-proteint a maga teljes natív formájában és adott esetben a rekombináns prM/Μ proteint tartalmazzák, majd
- a partikulákat összegyűjtjük, és közvetlenül immunizálásra alkalmas összetételben dolgozzuk fel.
A találmány szerinti eljárásnak az a nagy előnye, hogy nem szükséges vírusinaktiváló lépést - például formáimnál - alkalmazni, ami egyrészt a vakcina minőségét jelentékenyen javítja (az E-proteint natív formában és nem a formalinkezelés által módosított és legalábbis részben denaturált formában tartalmazza), másrészt jelentősen megkönnyíti technikailag a vakcina termelését, mivel a partikulákat közvetlenül (tehát formalinkezelés nélkül) gyógyszerkészítménnyé lehet feldolgozni.
Az eljárás megvalósítása során különösen előnyös, ha olyan sejttenyészet-rendszert alkalmazunk, amely a TBE-vírus rekombináns prM- és E-proteinjeit kódoló szekvenciákat kromoszómába integrált formában tartalmazza.
Vannak azonban olyan sejttenyészet-rendszerek, amelyekben virális vektorokat alkalmazunk, és olyan sejttenyészet-rendszerek, amelyekben vírusmentesen - például egy plazmidvektorral - dolgozunk, szintén a találmány szerinti partikulák előállítására alkalmas módon.
Az eljárás egy előnyös kiviteli alakja szerint mind a protermék expressziója, mind a partikulák képződése folyamatos.
A találmány egy további elemét a nem fertőző, szubvirális partikulák - amelyek a TBE-vírusból származtatott E-proteint, lényegében teljes natív formájában és adott esetben a prM/Μ proteint tartalmazzák TBE-vírus-fertőzések elleni aktív immunizálásra szolgáló vakcina előállítására való alkalmazása képezi.
Az E-protein és adott esetben a prM/Μ protein előnyösen rekombináns proteinek.
A találmány tárgyát képezi továbbá a nem fertőző, szubvirális partikuláknak - amelyek a TBE-vírusból származtatott E-protein lényegében teljes natív formáját és adott esetben a prM/Μ proteint tartalmazzák - a gyógyászati felhasználása, különösen anti-TBE-vírus immunglobulin-készítmények előállítására való alkalmazása. Ez esetben is előnyös, ha az E-protein és adott esetben a prM/Μ protein rekombináns proteinek.
A találmányt az alábbi példákon részletesebben ismertetjük.
Az ábrák leírása: az 1. ábrán az expressziós plazmidokban alkalmazott inszertumok vázlatos ábrázolása látható, a 2. ábra a ρΞνβ plazmid vázlatát mutatja be, amelyet az 1. ábrán bemutatott szerkezet expressziójához használtunk, a 3a., b. és c. ábrák az 1. ábrán bemutatott SVPE wt szerkezet teljes nukleotid- és aminosavszekvenciáját tartalmazzák: a 4. ábra a Triton X-100 segítségével oldatba vitt sejtlizátumok immunprecipitációját mutatja be az 1. ábrán ábrázolt szerkezetekkel való transzfekció után, valamint TBEvírussal (COS/TBE) való fertőzés után. Az 5. ábrán bemutatott diagram az E-protein kimutatására vonatkozik, amelyet 4 rétegű ELISA segítségével olyan COSsejtek tenyészeteinek felülúszóiból végeztünk, amelyeket az 1. ábrán látható szerkezetekkel transzfektáltunk. A 6. ábra a COS-sejtek SV-PEwt-vel, illetve SV-PEst-vel való transzfekciója után a sejttenyészet felülúszóinak immunprecipitációját ábrázolja; a 7. ábrán a COS-sejtek SV-PEwt-vel, illetve SV-PEst-vel való transzfekciója, valamint TBE-vírussal való fertőzése után a sejttenyészet-felülúszók szedimentációs analíziséről készített diagram látható; a szedimentáció iránya: balról jobbra; a 8. ábra az rSP (SV-PEwt) 0,5% Triton Χ-100-zal való kezelése után, illetve kezelése nélkül végzett szedimentációs analízisét ábrázolja; a szedimentáció iránya: balról jobbra; a 9. ábrán a tisztított TBE-vírus és a tisztított rSP-k SDS-PAGE analízisének képe látható; Coomassie-blue-festés; a 10. ábrán a COS-sejtekből és a stabilan transzfektált CHOsejtvonalból származó rSP-k összehasonlítása látható: all. ábra 19 E-protein specifikus monoklonális antitest reaktivitási diagramját mutatja be, amelyet 4 rétegű ELISA segítségével és TBE-vírussal, formáimnál inaktivált TBE-vírussal, rSP-vel és rE*-gal készítettünk: a 12. ábra a TBE-vírus, illetve az rSP B3, i2, IC3 és C6 monoklonális antitestekkel 4 rétegű ELISAvizsgálatban való reaktivitását ábrázolja pH 6,0 melletti kezelés után, illetve kezelés nélkül (pH 8,0); a
13. ábra a pE* B3, i2, IC3 és C6 monoklonális antitestekkel - 4 rétegű ELISA-vizsgálatban - való reaktivitását ábrázolja pH 6,0 mellett való kezelés után, illetve kezelés nélkül (pH 8,0).
A találmányt a következő példákkal részletesebben szemléltetjük, anélkül azonban, hogy a példákkal a találmány oltalmi körét korlátoznánk.
1. példa
A partikulák előállítása
Erre a célra 4 expressziós plazmidot szerkesztettünk, amelyek az E-proteint, illetve az E-protein egy
HU 219 503 Β membránhorgonymentes formáját, vagy ezt a prM-proteiimel együtt tartalmazták (1. ábra).
E plazmidok előállítására vonatkozó példát írtak le Allison és munkatársai [Vírus Genes, 8, 187-198 (1994)].
Az itt leírt pSVp kiindulási plazmidot a 2. ábra mutatja be.
Az expressziós kiónok szerkesztéséhez a pSV46 vektort alkalmaztuk. Ez a vektor az SV40-en alapuló eukarióta pSVp expressziós vektor (Clontech) - amelyből Notl-gyel való emésztéssel a β-galaktozidázgént tartalmazó inszertumot [G. R. MacGregor, C. T. Caskey, Nucl. Acids Rés., 17, 2365 (1989)] eltávolítottuk és ligáltunk - egy származéka. A transzlációs stophelytől 3’-irányban elhelyezkedő polilinker egy részét Xbal-gyel és HindlII-mal való emésztés, Klenowbetöltés és religálás révén szintén eltávolítottuk.
Ebbe a vektorba PCR-termékeket építettünk be, amelyekhez a következőképpen jutottunk.
Szintetikus oligonukleotid printereket használtunk a TBE-vírus prM+E szakaszának vagy csak E szakaszának megfelelő cDNS-részek sokszorozásához. A Mandl és munkatársai [C. W. Mandl, F. X. Heinz, C. Kunz, Virology, 166, 197-205 (1988)] szerinti nukleotidkoordinátákat használtuk, amelyeket később úgy dolgoztak át, hogy a TBE-genom első 20 nukleotidját [C. W. Mandl, F. X. Heinz, E. Stockl, C. Kunz, Virology, 173,] tartalmazzák. A prM+E szerkezet és az E szerkezet 5’-primerei a következő 27mer-szekvenciák voltak: AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA, illetve AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Mindkét szekvencia első 11 nukleotidja mesterséges szekvenciából áll, amely a NotI restrikciós enzim számára egy felismerőhelyet (GCGGCCGC) tartalmaz. Az ezt követő 16 tagú nukleotidszekvenciák a 388-403 (SV-PE sor) vagy a 883-898 (SV-E sor) nukleotidoknak felelnek meg. Mindkét esetben a megfelelő géntől 5’-felé egy természetben előforduló ATB-kodont alkalmaztunk startkodonként, és a prímért úgy alakítottuk ki, hogy ez az ATB-t alkalmas összefüggésben tartalmazza (GCCGCCATGG) ahhoz, hogy COS-sejtekben hatékony transzláció induljon meg [M. Kozák, Cell., 44, 283-292 (1986); M. Kozák, 7. Mól. Bioi, 196, 947950 1980]. A hasonló 28 nukleotid hosszú oligonukleotidot (ATGCGGCCGCTAGTCATACCATTCTGAG) mindkét szerkezetnél 3’-primerként alkalmaztuk. Ez a primer 3’-végén a 2535-2550 nukleotidokkal komplementer és 5’-végén egy NotI helyet tartalmaz és egy TAG stopkodon komplementert (CTA) ugyanezen leolvasási keretben.
A PCR-sokszorozást lényegében standard körülmények mellett, a Cetus cég előirata szerint [R. K. Saiki, D. H. Gelfand, J. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich, Science, 239, 487-491 (1988)] végeztük. A reakcióelegyek összetétele 100 pl össztérfogatban a következő volt: 50 mM kálium-klorid, 10 mM trisz-HCl, pH 8,3, 1,5 mM magnézium-klorid, 200-200 μΜ dNTP, az egyes primerek 10 pg-ja, a cDNS-mátrix 1000-szeres hígításából μΐ, 3 E AmpIiTaq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus). A mintákra 100 μΐ paraffinolajat rétegeztünk. A mintákat hőmérséklet váltást biztosító Perkin-Elmer-készülékben sokszoroztuk.
A mintákat 6,5 percig 94 °C-on tartottuk, ezután 40 °C-os hibridizációs hőmérsékletre hűtöttük, mielőtt a Taq-polimerázt hozzáadtuk. Összesen 35 sokszorozóciklust végeztünk. Mindegyik ciklusban 1,5 percig 94 °C-ot, 3 percig 40 °C-ot és 7 percig 68 °C-ot alkalmaztunk. A mintákat fenol-kloroformos extrahálással tisztítottuk, etanollal kicsaptuk, és steril, kétszer desztillált vízben feloldottuk. A PCR-termékek minőségét és mennyiségét agaróz-gélelektroforézissel határoztuk meg, és a mintákat -20 °C-on tároltuk, amíg ezt követően a klönozási lépéshez felhasználtuk.
A polimeráz láncreakciót arra használtuk, hogy egy cDNS-plazmid-klónokból álló, olyan inszertumokat tartalmazó minibankot kapjunk, amelyek a TBE-vírusgenom prM+E szakaszának (S4-PE sor), 388-2550 nukleotid, vagy E szakaszainak (SV-E sor), 883-2550 nukleotid, felelnek meg (1. ábra).
Minthogy a TBE-vírus szerkezeti proteinjei egy nagy poliproteinprekurzor kotranszlációs feldolgozása révén keletkeznek, a transzlációs start- és stopkodonokat úgy vezettük be, hogy azokat az oligonukleotid primerbe építettük be. Mindegyik szerkezetbe egy termiszter ATG-kodont - amely alkalmas kontextusban helyezkedett el ahhoz, hogy indítókodonként szerepeljen - vezettünk be a belső szignálszekvenciától 5’irányban annak érdekében, hogy lehetővé tegyük a gazda szignaláza által történő természetes feldolgozást és a megfelelő rávitelt a szekréciós útra. Minden szerkezetben hasonló módon helyeztük el a TG-stopkodont a szignaláz-hasítási helytől - amely az E-protein karboxiterminális végét képezi - 3’-irányban. A NotI restrikciósenzim-felismerő helyeket szintén a végeken építettük be, hogy a PCR-termékek ezután következő klónozását megkönnyítsük.
A PCR-DNS-eket Notl-gyel elhasítottuk, és a pSV46 plazmidvektor NotI klónozóhelyére ligáltuk, ez lehetővé teszi, hogy a pontosan beépített gének a korai SVHO promoter szabályozása alatt fejeződjenek ki [g. R. MacGregor, C. T. Caskey, Nucl. Acids Rés., 17, 2365 (1989)]. A vektorban rendelkezésre áll egy poliadenilező szignál is a hatékony expresszió érdekében és egy SVHO replikációs origo, hogy a transzfektált COS-sejtekben - amelyek konstitutív módon fejezik ki a nagy SVHO-T-antigént [Y. Gluzman, Cell., 23, 175-182 (1981)] - lehetővé tegye a rekombináns plazmidok replikációját.
A ligálóelegyeket használtuk fel E. coli HBlOl-sejtek transzformálására, majd az egyes ampicillinrezisztens telepeket - amelyek egyetlen kiónt képviselnek izoláltuk. A plazmidokban az inszertum irányát restrikciós enzimes emésztésekkel és agaróz-gélelektroforézissel határoztuk meg. A megfelelő irányítottságú inszertumokat tartalmazó kiónokat tartottuk meg a további analízisekhez.
A helyes irányítottságú inszertumokat tartalmazó plazmidokat restrikciós analízissel azonosítottuk, és
HU 219 503 Β cézium-klorid-gradiensben való centrifugálással tisztítottuk.
Mindegyik plazmidszerkezetnél a DNS-szekvencia meghatározásához készítményből származó, tisztított, kétszálú plazmid-DNS-t használtunk. A szekvenálási reakciókat hőmérsékletváltásra alkalmas Perkin-Elmer-készülékben végeztük TBE-specifikus primerek, AmpIiTaq-polimeráz (Perkin-Elmer Cetus) és fluoreszkáló színezékkel jelzett didezoxiterminátorok használatával, az előállító cég (Applied Biosystems) előírásai szerint. A szekvenálási reakciók termékeit az Applied Biosystems 373A automata DNS-szekvenátorával analizáltuk.
PCR-rel létrehozott mutációk analízise
Annak érdekében, hogy a klónozott inszertumokat részletesen analizáljuk, és hogy a Taq-polimeráz által létrehozott mutagenizálás hatékonyságát megítéljük, kiválasztottunk 13 olyan egyedi E. coli-klónt, amelyek SV-PE sorozatból származó plazmidot tartalmaztak, és 9 olyan kiónt, amelyek SV-E sorozatból származó plazmidot tartalmaztak. A kiónok plazmid-DNS-ét tisztítottuk, és a klónozott inszertumok mindkét szálát teljes szekvenálással analizáltuk. A CDNS-szekvenciákat ezután a szülői vad típusú TBE-vírus Neudörfl törzs [C. W. Mandl, F. X. Heinz, C. Kunz, Virology, 166, 197-205 (1988)] megfelelő RNS-szekvenciával hasonlítottuk össze.
Mint vártuk, az egyes plazmidklónok több nukleotidban különböztek a vad típusú TBE-vírus szekvenciájától. Néhány kivételtől eltekintve (lásd alább) e változások nagyobb részben olyan egyedi mutációk voltak, amelyeket nyilvánvalóan a PCR-sokszorozás vezetett be és így csak egyetlen kiónban voltak megtalálhatók.
1. táblázat
A PCR által okozott mutációk összefoglalása
| Klón | Nukleotidváltozásokó | Aminosawáltozásokb> | |
| prM | E | ||
| SV-PE | |||
| 01 | 945 G—»A 1122 G-»C 1395 C->T 2027 T-»C 2480 A—»G | Gin 50-»His Val 352-» Alá | |
| 02 | 551 T—»A 1080 G-»A 1153 T-»C 1168 T—>C 1690 A—»G 2458 G—>del | Val 24—»Glu | Ser 66—»Pro Arg 240—»Gly Alá 495-» Leolvasásikeret-eltolódás |
| 03 | 952 T->C 976 C-»T 1163 A—»G 1679 A-»G 1889 T—»A | Cys 15 8-» Arg | Arg 2-»Cys Lys 64-» Arg Asn 236-»Ser Met 306-»Lys |
| 04d | 1434 C-»T 2275 A—»T 2364 G-»A | Lys 435-»stop | |
| 05c | 701 T-»C 1488 C—»A 1492 T-»C 1893 T-»A | Leu 74—>Pro | Cys 307-»stop |
| 06 | 782 T-»C 865 A-»G 1002 C-»T 1972 G-»A | Leu 101-»Pro Lys 129-»Glu | Gly 334-» Arg |
| 07c | 1327 G-»del 2248 G—»A | Alá 119-» Leolvasásikeret-eltolódás Alá 426—»Thr | |
| 08 | 701 T-»A 2092 A—»G 2124 T-»C | Leu 74-»Gln | Met 374-» Val |
HU 219 503 Β
1. táblázat (folytatás)
| Klón | Nuklcotidváltozásoka> | Aminosawáltozásokbi | |
| prM | E | ||
| 09 | 452 T^C 960 A+T 1746 A->G 2086 A-»G 2142 T->C 2290 G->A 2361 A->G | Ile 372—»Val Val 440-»Ile | |
| SV-PE | |||
| 10' | 1625 A->G 2475 T-»C | Asp 218—>Gly | |
| 11' | - | ||
| 12' | 1303 G-»A | Met 77-*Ile | |
| 13' | 1366 T->C 1381 A->G 1728 G—>A | Tyr 132—>His Ile 137—>Val Met 252—>Ile | |
| SV-E | 2134 C->T | ||
| 01d | 1239 C->T | ||
| 02 | 1093 A—>T 2301 C->T | Met41->Leu | |
| 03 | 1321 G—>A 1688 A-»G 1717 G-»A 2053 A—>G 2092 A—>G | Val 117—>Ile Glu 239—>Gly Ala 249—> Thr Asn 361-»Asp Met 374->Val | |
| 04 | 2073 T->C 2438 C->T | Ala 489->Val | |
| 05 | 938 T->C 973 T->C 2401 T-»G | (Leu 153-»Pro)' | Ser l-»Pro Ser 477->Aia |
| 06 | 891 C->T 1151 G—>A 1364 T->C 1567 A-»G 2045 T->C | Cys 60-»Tyr Val 131—> Ala Ile 199-»Val Ile 358—> Thr | |
| 07 | 1257 T->C 1694 T->C 1794 A->G 2159 G->T | Leu 241-»Pro Gly 396->Val | |
| 08 | 1806 A—>G 2205 A-»G | ||
| 09 | 2491 A-»del' |
a) A nukleotídkoordináták a teljes TBE-genomra vonatkoznak.
b) Az aminosavkoordináták a prM-rc vagy E-re vonatkoznak.
c) Aminosawáltozások az NS1- vagy a C-génbcn.
d) Az SV-PEOH új neve „SV-Pest” és az SV-EO1 új neve „SV-Ewt”.
e) A PCR okozta mutációkon kívül más mutációkat nem említünk (vesd össze a szöveggel).
f) Ebben a szerkezetben a prM-nek csak a C-terminális része volt jelen.
HU 219 503 Β
Amint az 1. táblázat mutatja, a 22 szekvenált inszertum (összesen 43 549 bázispár) 71 olyan egyedi nukleotidváltozást tartalmazott, amelyeket a Taq-polimeráz hibájára vezettünk vissza. Ezek a változások 42 (59%) szubsztitúcióhoz vezettek a várt aminosavszekvenciában, és 3 deléciót okoztak, amelyeknek leolvasásikeret-eltolódás volt a következménye (2. táblázat).
2. táblázat
PCR-mutáció gyakoriság
| Bázispárváltozások | Az előfordulások száma3 | Bázisonkcnti gyakoriság |
| G/C-»A/T | 20 (28%) | 4,59x10-“ |
| G/C—>T/A | 2 (2,8%) | 4,59xl0-5 |
| G/C->C/G | 1 (1,4%) | 2,30x10-5 |
| A/T—>G/C | 37 (52%) | 8,50x10-“ |
| A/T-»C/G | 1 (1,4%) | 2,30x10-5 |
| A/T->T/A | 7 (9, 9%) | 1,61x10-“ |
| G/C deléció | 2 (2,8%) | 4,59x10-5 |
| A/T deléció | 1 (1,4%) | 2,30x10 5 |
| Átmenetek | 57 (80%) | l,31xl0-3 |
| Transzverziók | 11 (15%) | 2,53x10“ |
| Összes mutáció | 71 (100%) | 1,63x10-3 |
| Aminosavszubsztitúciók | 42 (59%) | 9,64x10-“ |
| Csendes mutációk | 24 (34%) | 5,51x10-“ |
| Leolvasásikeret-eltoló- dások | 3 (4,2%) | 6,89x10-5 |
| T erminátorkodonok | 2 (2,8%) | 4,59x10-5 |
a) 43 549 szekvenált bázispár.
A mutációk eloszlása erősen eltolódott az A/T G/C és G/C A/T átmenetmutációk javára, amit előzőleg már mások is megfigyeltek [A. M. Dunning, P. Talmud, S. E. Humphries, Nucl. Acids Rés., 16, 10393 (1988); J. Chen, A. Sahota, P. J. Stambrook, J. A. Tischfield, Mutat. Rés., 249, 169-176 (1991); R. C. Cadwell, G. F. Joyce, PCR Methods Applic., 2, 28-33 (1992)]. Egy 35 ciklusú sokszorozásnál az összes mutáció gyakorisága bázispáronként 1,63 χ 10~3 volt (4,7 χ 10 5 per bázispár per ciklus), ami a Taq-Polymerase hibáinak gyakoriságáról közölt értékekkel megegyezik. Az átlagos aminosavszubsztitúciós arány prM-nél (164 aminosav hosszú) génenként 0,46 volt és E-nél (496 aminosav hosszú) 1,59.
A 930. nukleotidnál egy csendes mutáció volt jelen minden kiónban, és így feltételezhető, hogy ez természetes mutáció gyanánt keletkezett a vírus szaporodása folyamán. Ezenkívül megállapítottuk, hogy az SV-PE sorozat öt kiónjában - SV-PE05, SV-PE07, SV-PE11, SV-PE12 és SV-PE13 - egyformán két azonos mutáció fordult elő a 849., 1285., 1346., 1404., 1909., 2247. és 2255. nukleotidnál. Az SV-PElO-et kivéve, amely e mutációk közül hármat (1909, 2247 és 2255) tartalmazott, ilyeneket nem találtunk a többi
SV-PE-klónban, sem valamely SV-E-klónban. Az egyik ilyen változás - egy nukleotid deléció az 1346. pozícióban - leolvasásikeret-eltolódást okozott az E-génben, a 125. kodonnál és azt vártuk volna, hogy ez egy működésre képtelen E-proteint eredményez. Minthogy e két, azonos mutációkat tartalmazó klón közül egyet a külön CDNS- és külön PCR-előállitásoktól függetlenül kaptunk meg (adatokat nem mutattunk be), úgy tűnik, hogy ez a variáns már a sokszorozás előtt jelen volt a vírus-RNS populációban. Ezeket a sajátos mutációkat ezért nem vontuk be a PCR által okozott mutációk analízisébe.
Vad típusú és deletált E-proteineket kódoló szerkezetek
Az egyes aminosawáltozásokat kódoló kiónokon kívül érdekeltek voltunk az olyan prM+E- és csak Eszerkezetek előállításában is, amelyek vad típusú és deletált proteineket kódolnak. Minthogy azonban az SV-PE-sorozatból mindegyik PCR-rel előállított klón olyan mutációkat tartalmazott, amelyek az aminosavszekvenciában változásokhoz vezettek volna, közvetlen szubklónozást alkalmaztunk egy olyan vad típusú szerkezet előállítására, amely a módosítatlan prM- és E-proteint, valamint a csak e szerkezet egy deletált formáját kódolja.
Az SV-PE04 plazmid DNS-szekvenciája két csendes mutáción kívül egy szubsztitúciót mutatott a 2275. nukleotidnál, amikor is az AT-re cserélődött, miáltal az E-protein 435-ös lizinjének AAG kodonja TAG-stopkodonná változott (1. táblázat). Ennélfogva előre látható volt, hogy az SV-PE04 egy vad típusú prM-proteint és egy deletált E-proteint kódol, amelyből a karboxiterminális 61 aminosavmaradék hiányzik, amely a valószínű membránt átszelő szakaszt foglalja magában [C. W. Mandl, F. Guirakhoo, H. Holzmann, F. X. Heinz, C. Kunz, J. Virol, 63, 564- 571 (1989)]. Azt találtuk, hogy az SV-E01 plazmid, amelyből a prM-gén nagy része hiányzik, a génben csak egy csendes mutációt tartalmaz, miáltal egy vad típusú E-proteint kódol.
Annak érdekében, hogy egy olyan prM+E szerkezethez jussunk, amely egy vad típusú aminosavszekvencia teljes hosszával rendelkezik és egy prM nélküli csak E-szerkezethez, de amely egy stopkodont tartalmaz a 2275. nukleotidnál, az SV-PE04-ből és az SV-EOl-ből (elnevezésük a későbbiekben SV-PEst, illetve SV-Ewt) kapott restrikciós fragmentumokat kicseréltük. Erre a célra, a CfrlOI restrikciós enzim számára két hasítási helyet használtunk, az egyiket a 960. és 961. nukleotid között, a prM- és E-gén határához közel, a másikat a vektor ampicillinrezisztencia-génjében. A kapott plazmidszerkezetek közül egy, az SV-PEwt, tartalmazta az SV-PEst-ből származó vad típusú prMgént és az SV-Ewt-ből származó vad típusú E-gént, míg a másik plazmidszerkezetből, az SV-Est-bői, a prM-gén hiányzott, tartalmazta azonban a SV-PEstből származó, stopkodont tartalmazó E-gént. Ezeket a változásokat a két plazmid inszertumainak a szekvenálásával igazoltuk. Ez a két szerkezet egy készletet tett teljessé négy expressziós plazmidból, a vad típusú szerkezetből (SV-PEwt) kifejeződött E-protei7
HU 219 503 Β nek szerkezetének és feldolgozásának az összehasonlítására olyanokéval, amelyekből a prM (SV-Ewt), az E-horgony-szakasz (SV-PEst) vagy mindkettő hiányzott.
A PEwt-inszertum teljes szekvenciáját a 3a., b. és c. ábrákon mutatjuk be.
A megfelelő plazmidokkal COS-sejteket transzfektáltunk, amelyeket rekombináns proteinek expressziójára vizsgáltunk.
DNS-transzfekció
A COS-1 sejtjeket [Y. Gluzman, Cell, 23, 175-182 (1991)] „COS-táptalajban” - összetétel: Dulbecco-féle MÉM (GIBCO-BRL) 10% fetális marhaszérummal, penicillinnel (100 E/ml) és sztreptomicinnel (100 pg/ml) kiegészítve - tartottuk fenn, 37 °C-on, 5% szén-dioxid mellett.
A klónozott TBE-géneket tartalmazó plazmidokat liposzómaközvetített transzfekcióval - Felgner és munkatársai eljárásának egy módosított változatának alkalmazásával [P. L. Felgner, T. R. Gadek, M. Molm, R. Román, H. W. Chan, M. Wenz, J. P. Northrop, G. M. Ringold, M. Danielsen, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413-7417 (1987)] - BioRad-féle Gene Pulserkészülék segítségével vittük be a COS-1 sejtekbe. A Lipofectin reagenst (GIBCO-BRL) Opti-MEM-I redukált szérum tápoldattal (GIBCO-BRL) 20 pg/mlre hígítottuk és 8 pg/ml megfelelő plazmid-DNS-t tartalmazó azonos mennyiségű Opti-MEM-I-gyel kevertük össze. Egy transzfekcióhoz 5 pg Lipofectint és 2 pg plazmid-DNS-t használtunk fel. A keveréket 15 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk a DNSLipofectin-komplex képződéséhez, majd ebből a keverékből 0,5 ml-eket mértünk egy 24 tartályos sejttenyésztő lemez (Nunc) minden tartályába. A tartályok olyan sejteket tartalmaztak, amelyeket a tenyésztő táptalajból származó szérum nyomainak eltávolítására kétszer 1 ml Opti-MEM-oldattal mostunk. A sejteket a DNS-Lipofectin keverékkel 5 órán át 37 °C-on 5% szén-dioxid atmoszférában inkubáltuk, ezután hozzáadtunk 1 ml komplett COS-táptalajt, és az inkubálást egy éjszakán át tovább folytattuk. A transzfekció után 24 órával a táptalajt eltávolítottuk, és friss COS-táptalajjal helyettesítettük, majd tovább inkubáltunk a transzfekció utáni körülbelül 46 óráig, amely időpontban a sejteket vagy immunfluoreszcenciás analízishez fixáltuk, vagy feloldottuk ELISA-val végzendő intracelluláris antigénanalízishez.
Az immunfluoreszcenciás kontrollok céljára a COS-sejtek TBE-vírussal való fertőzésénél lényegében ugyanúgy jártunk el, mint a transzfekciós eljárásnál, azzal a kivétellel, hogy a plazmid-DNS és Lipofectin helyett a TBE-vírust Opti-MEM-I-táptalajjal 100-szorosára hígított, szopós egerekből származó agyszuszpenzió formájában alkalmaztuk.
A kifejezett proteinek analízise
a) A sejtlizátumok immunprecipitációja
A transzfektált sejteket 35S-ciszteinnel jeleztük, 1%
Triton Χ-100-zal szolubilizáltuk, és egy, a TBE-vírus E- és prM-proteinjére specifikus, poliklonális nyúlszérummal immunprecipitáltuk. Mint a 4. ábrából látható, az SV-PEwt és SV-Ewt szerkezetek expressziója autentikus nagyságú E-protein szintéziséhez vezetett. Az SV-Pewt és SV-Est által szintetizált proteinek, mint vártuk, - rövidebb C-terminális végük következtében - kisebbek voltak, mint a vad típusú E-protein.
b) A rekombináns protein szekréciójának vizsgálata sejtfelülúszóban
A transzfektált sejtek felülúszóit a transzfekció után O-tól 4. napig E-protein jelenlétére vizsgáltuk 4 rétegű ELISA-val - mennyiségileg - Heinz és munkatársai által leírtak szerint [Heinz et al., J. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)]. Az 5. ábrán bemutatott eredmények mutatják, hogy csak azok a szerkezetek szekretálták az E-proteint, amelyek a prM-proteint is kifejezték. A felülúszók immunprecipitációjával (6. ábra) igazoltuk, hogy a kicsapott proteinek ugyanolyan nagyságúak voltak, mint a megfelelő intracelluláris proteinek (vesd össze a 4. ábrával).
A rekombináns proteinek szekréciója óriási előnyt jelent a termelés szempontjából, ugyanis nem szükséges a sejteket feloldani a kívánt protein kinyerése érdekében, és így a szennyező sejtanyagok eltávolítása kiküszöbölődik. Megfelelő feltételek mellett ez lehetővé teszi a rekombináns proteinek folyamatos aratását a sejtek feltárása nélkül.
c) A kicsapott rekombináns proteinek vizsgálata
Az 5. ábrán bemutatott felülúszókat szacharóz-sűrűség-gradiensben centrifugáltuk, 5-30% (tömeg/tömeg) szacharózgradiens és Beckman SW-40 rotor használatával. A centrifúgálás 38 000 fordulat/perc, 4 °C mellett, 100 percig tartott. A gradienseket elválasztottuk és az E-protein mennyiségét minden frakcióban meghatároztuk 4 rétegű ELISA [lásd Heinz et al., J. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)] segítségével. A vírussal fertőzött sejtek felülúszóját használtuk kontrollként, amely két E-protein-tartalmú csúcsot (7. ábra) adott. Ezek közül az egyik a teljes vírusnak felelt meg, a másik az úgynevezett nem fertőző „lassan ülepedő hemagglutinin”-nek [„slowlysedimenting hemagglutinin” (SHA); lásd Russel et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses című közleményt; R. W. Schlesinger (szerkesztő) „The Togaviruses” című kiadvány 503-529. oldalak (Academic Press, 1980)]. Az SV-PEwt-vel transzfektáló sejtekről származó felülúszó az E-protein egy speciális formáját tartalmazta, amelynek a szedimentációs sebessége hasonló volt a virális SHA-éhoz, míg az SV-PEst-ből származó, C-terminális végén megrövidített E-protein nem képezett stabil részecskéket, és a gradiens tetején maradt.
Az SV-PEwt-ből származó speciális formát „rekombináns szubvirális részecskének” („recombinant subviral partiele”, rSP) neveztük és az SV-PEst-ből származó oldható formát „rekombináns E*”-nak (rE*).
Az rSP kezelése 0,5%-os Triton Χ-100-zal felbontotta a részecskét. Ennek szedimentációs analízise (lásd a 8. ábrát) lipidmembrán jelenlétére utal.
Az rSPL és rL* előállítása
a) Az rSP tisztítása
Az SV-PEwt-vel transzfektált COS-sejtek felülúszóit 30 perces centrifugálással - 10 000 fordulat/perc, 4 °C, Sorvall szupercentrifúga - derítettük, és a részecs8
HU 219 503 Β kéket Beckman Ti45 rotor használatával, 44 000 fordulat/perc, 4 °C mellett, 120 percig tartó centrifugálással arattuk le. Az rSP-tartalmú üledékfrakciót TAN-pufferben (pH 8,0) reszuszpendáltuk és felvittük egy ugyanezen pufferrel előállított 5-20%-os szacharózgradiensre. Ezután 90 perces centrifugálással, amelyet 38 000 fordulat/perc és 4 °C mellett, Beckman SW40 rotor használatával végeztünk, frakcionáltuk a mintákat, és a csúcsfrakciókat HA aktivitásra teszteléssel (Clarké, Casals, Aver. J. Trop. Med. Hyg., 7, 561-573 (1958)] azonosítottuk. A gradiensekből származó csúcsfrakciókat egyensúlyi centrifugálással (35 000 fordulat/perc, 4 °C, egy éjszakán át) továbbtisztítottuk, és a frakciókat újból azonosítottuk HA teszteléssel. Az E-összprotein mennyiségi meghatározását 4 rétegű ELISA-val végeztük, tisztaságát Coomassie-blue-festéssel, SDS-PAGErendszerben határoztuk meg (9. ábra).
b) Az rE* előállítása
Az SV-PEst-vel transzfektált COS-sejtektől származó szérummentes felülúszókat, mint fent leírtuk, derítettük, és ultraszűréssel 15-szörösére koncentráltuk.
Kromoszómába integrált prM- és E-gént tartalmazó sejtvonalak előállítása
Stabilan transzfektált, rSP-termelő sejtek előállítására a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) szelekciós rendszert alkalmaztuk (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.), valamint azt a szerkezetet, amely a prM- és E-proteint meghatározó teljes géneket tartalmazza (1. ábra), és az rSP-k szintézisét és szekrécióját biztosítja. A DHFR-gén átvitelét a pSV2-dhfr-plazmid [S. Subramani et el., Mól. Cell. Bioi., 1, 854-865 (1981)] segítségével végeztük, a prM- és E-gén átvitelét a CMV-PEwt plazmid segítségével, amelyet az SV-PEwt plazmából származó inszertumnak a pCMVpplazmidba (Clontech) való átklónozásával állítunk elő.
A DHFR-hiányos CHO-DG44 hörcsög-sejtvonalat [Som. Cell., Mól. Génét., 12, 555-666 (1986) 10% fetális botjúszérummal kiegészített HAM-féle F12 táptalajon tenyésztettük, és 20:1 arányban pCMV-PEwt, valamint pSV2-dhfr-plazmiddal transzfektáltuk elektroporációt alkalmazva, BioRad Gene-Pulser-készülék használatával. A transzfektált sejteket ezután további 2 napon át tenyésztettük 10% fetális borjúszérum-tartalmú HAM-féle F12 táptalajban. A sejteket tripszinnel kezeltük, majd nagy hígításban - annak érdekében, hogy egyedi DHFR és prM+E kifejező sejtklónokat kapjunk a szelektív táptalajban (MEM-α ribo- és dezoxiribonukleotid nélkül +10 fetális boíjúszérum) - Petri-csészékre szélesztettük. Tíz nap múlva az egyes, mikroszkóp alatt látható sejttelepeket kis tenyésztőedényekbe vittük át, és továbbszaporítottuk. Az FSME-specifikus antigént termelő sejtklónokat a sejtfelülúszók ELISAvizsgálatával azonosítottuk (FSME=Frühsommermeningo-encephalitis).
Egy ilyen sejtklónt (CHO-37) használtunk az általa termelt rSP-k izolálásához és vizsgálatához. Ennek érdekében a sejteket a fenti szelektív táptalajon tenyésztettük, és az rSP-ket a sejtfelülúszóból ugyanazon tisztítási eljárással nyertük ki, mint amelyet a COS-sejtekből izolált rSP-kre leírtunk. A 10. ábrán a COS-sejtekből származó rSP-knél és a stabilan transzfektált CHO-37 sejtvonalból származó rSP-knél kapott szacharóz-sűrűséggradiens centrifugálással kapott eredmények összehasonlítása látható. A centrifúgálási feltételek a következők voltak: 20-50% szacharóz; Beckman Ti-40 rotor, 35 000 fordulat/perc egy éjszakán át. Centrifúgálás után a gradienseket elválasztottuk és az egyes frakciókat hemagglutinációs teszttel és ELISA-val FSME-vírusspecifikus antigénre analizáltuk. Amint ezt az ábra mutatja, a két készítmény szedimentációs tulajdonságaiban, illetve specifikus sűrűségében, valamint hemagglutinációs aktivitásában különbség nem mutatkozott.
2. példa
A natív proteinszerkezetre vonatkozó vizsgálatok
Az ilyen módon előállított készítményeket a következőképpen vizsgáltuk:
a) Antigénszerkezet vizsgálata monoklonális antitestekkel
b) Savval indukálható konformációváltozások
c) Hemagglutinációs aktivitás
Ad a) Antigénszerkezet
A formaiinnal inaktivált teljes vírus antigénszerkezetét - az rSP-ból és rE*-ből - 19 E-protein-specifikus monoklonális antitest használatával hasonlítottuk össze a natív fertőző vírus antigénszerkezetével [Mandl et al., J. Virol, 63, 564-571 (1989); saját kísérletek]. Az egyes monoklonális antitestek reaktivitását az egyes, előzőkben említett készítményekkel 4 rétegű ELISA-val analizáltuk Heinz és munkatársai [J. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)] szerint. A vizsgálatban minden antigénkészítményt az E-proteinre előzőleg meghatározott, 1 pg/ml-es állandó koncentrációban és a monoklonális antitesteket olyan hígításban használtuk, amelyek a natív fertőző vírussal 0,5-1,6 tartományban adtak extinkciós értéket. Mint all. ábrából kitűnik, a monoklonális antitestek (mAt) reaktivitási görbéje az rSP-nél és a fertőző vírusnál gyakorlatilag azonos, amiből azt következtethetjük, hogy az rSP-kben az E-protein ugyanolyan natív formában létezik, mint a fertőző vírusban.
Ezzel szemben a formáimnál való inaktiválás jelentős változásokat idéz elő az antigénszerkezetben, ahol azokat az epitópokat is érinti, amelyek a neutralizáló antitesteket kötik meg. Ez a megállapítás az i2 mAt-re [Mandl et al., J. Virol, 63, 564-571 (1989)] - amelynek az epitópját a formalinkezelés elbontja - ugyanúgy vonatkozik, mint az A dómén és a B dómén területén lévő epitópokra [Mandl et al., J. Virol, 63, 564-571 (1989)], amelyek legalábbis korlátozott reaktivitást mutattak. Ez a vizsgálat azt is mutatja, hogy az E* szerkezete egyáltalán nem felel meg a vírus felületén lévő natív E-protein szerkezetének.
Ad b) Savval indukálható konformációváltozások
A TBE-vírus receptorközvetített endocitózis segítségével hatol be a sejtekbe, ahol az endoszómákba kerül, amelyek savanyú pH-ja (<6,4) specifikus konformációváltozást indukál. Ez a konformációváltozás szükséges a vírusmembránnak az endoszómamembránnal való fúziójához, azaz a vírus fertőzőképességéhez. Ezek a szerkezeti változások az egyes mAt-ek reaktivi9
HU 219 503 Β tásának a változásával nyomon követhetők [Heinz et al., Virology, 198, 109-117 (1994)] és többek között az i2 és IC3 (a reaktivitás erős csökkenése), illetve C6 (megerősödött reaktivitás) epitópokat érintik, azonban a B3 epitópot nem.
Ezek a változások az E-protein funkciójára nézve lényegesek. Savanyú pH-ra a leírt módon való reagálási képesség azért ugyancsak kritériuma annak, hogy vajon az E-protein natív, a fertőző vírusnak megfelelő formában van-e. Trietanol-amin pufferes (pH 8,0) rSP-, rE*- és fertőzővírus-készítményeket 0,05 M mES, 0,1 M nátriumklorid és 0,1% marhaszérumalbumin-tartalmú pufferrel kevertünk úgy, hogy a pH-érték 6,0-ra változzon, majd az elegyeket 10 percig 37 °C-on inkubáltuk, és ezután a pH-t újból 8,0-ra állítottuk be trietanol-amin segítségével. A készítmények reaktivitását a savanyú pH-η való inkubálás előtt és után 83, i2, IC3 és C6 mAt-ekkel 4 rétegű ELISA-tesztben analizáltuk az „Antigénszerkezet” fejezetben leírtak szerint. Az eredményeket a 12. és
13. ábrán ábrázoltuk, amelyekből kitűnik, hogy a savanyú pH az rSP-k E-proteinjében ugyanolyan szerkezeti változásokat okoz, mint a fertőző vírusban (lásd a 12. ábrát), azonban ugyanez az analízis az rE*-nál hasonló átrendeződésre nem utal (lásd a 13. ábrát).
Ad c) Specifikus hemagglutinációs aktivitás
Az FSME-vírus egyik jellemző tulajdonsága, hogy meghatározott körülmények között a liba-vörösvérsejteket agglutinálja (hemagglutinációs aktivitás). A vírus ezen tulajdonságát az E-protein közvetíti, és ez további indikátora annak, hogy ez a protein egy natív, működőképes szerkezettel rendelkezik. A hemagglutinációs vizsgálatokat Clarké és Casals [amer. J. Trop. Med. Hyg., 7, 561-573 (1958)] módszerével végeztük, libavörösvérsejtek használatával, pH 6,4 mellett.
Fertőzővírus-, formalin-inaktivált vírus-, rSP- és rE*készítményeket 5 pg/ml - ELISA-val meghatározott antigéntartalomra állítottunk be, és elvégeztük a készítmények hemagglutinációs analízisét. Az eredményt a 3. táblázat tartalmazza. Ebből látható, hogy az rSP hemagglutinációs aktivitása azonos a fertőző víruséval, és hogy ezen E-protein által közvetített aktivitás a formalin-inaktiválás következtében majdnem teljesen elvész. Az rE*készítménynek nincs mérhető HA-aktivitása.
3. táblázat HA-aktivitás
| Készítmény | HA-titer |
| Fertőző vírus | 512 |
| Formalin-inaktivált vírus | 4 |
| rSP | 512 |
| rE* | <2 |
3. példa
Immunogenitás egerekben
Az alábbi antigénkészítmények immunogenitását egerek immunizálásával vizsgáltuk:
- formalin-inaktivált tisztított vírus
-rSP
-rE*
Az E-protein-tartalmat enzim immunassay-vel állapítottuk meg [Heinz et al, 7. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)], és minden készítményt 5 pg/ml antigén-koncentrációra állítottunk be. Az akkor alkalmazott TBEvakcinának megfelelően (FSME-ImmunR) 0,1% humán albumint tartalmazó PBS-t (pH 7,4) használtunk hígitópufferként, és 0,2% alumínium-hidroxid-adjuvánst adtunk hozzá.
Az rSP és rE* immunogenitását adjuváns hozzáadása nélkül teszteltük.
Immunizálási művelet
Mindegyik készítménnyel 10-10 15 g-os Swiss albínó egérből (5 nőstény és 5 hím) álló csoportot oltottunk kétszer szubkután, 14 nap időközt hagyva, egerenként és oltásonként 0,2 ml antigén alkalmazásával. A második immunizáló oltás után egy héttel vért vettünk, és minden egeret 500 LD50 egér-patogén TBEvírus törzzsel (Hypr) felülfertőztünk (challenge teszt). Az egereken ezután 14 napon át figyeltük az elhulláshoz vezető encephalitis fellépését.
Egy tízes csoportbál - amelyben ugyanazon immunogénnel immunizáltunk - minden egyes egér szérumából aliquot mennyiségeket pooloztunk, és a TBE-specifikus antitesttartalmat enzim immunassay-vel (ELISA) hemagglutináció gátlási tesztben (HGT) és neutralizációs tesztben (NT) analizáltuk.
Az ELISA-vizsgálatban antigénként tisztított TBEvírust használtunk, és a vizsgálatot Heinz és munkatársai [J. Gén. Virol, 65, 1921-1929 (1984)] leírása szerint végeztük el. A hemagglutináció gátlási vizsgálatot Clarké és Casals [Amer. J. Trop. Med. Hyg, 7, 561-573 (1958)] szerint végeztük, és liba-vörösvérsejteket használtunk 6,4 vég-pH mellett. A neutralizációs vizsgálatban BHK-2 sejteket és 500 fertőzőegység víruskoncentrációt használtunk.
Az immunizálási kísérlet eredményét a 4. táblázatban foglaljuk össze. Ebből kitűnik, hogy rSP akár adjuváns nélkül, akár adjuvánssal minden egeret ugyanúgy megvédett a halálos adagú TBE-vírustól, mint a formáimnál inaktivált teljes vírus. Ezzel szemben az rE*-gal végzett immunizálás után védőhatás egyáltalán nem (adjuváns nélkül) vagy csak minimális (adjuvánssal) volt megfigyelhető.
Ami az antitest-indukciót illeti, az rSP-készítmények még a formáimnál inaktivált vírust is felülmúlták, különösen jelentősen alumínium-hidroxid-adjuváns használatánál. Ez az ELISA-tesztben kimutatott víruskötő antitestre is vonatkozott, valamint a - védő immunválasz szempontjából még jelentősebb - hemagglutináció gátlási és neutralizációs vizsgálatban mért antitestre is, amelyek a vírusspecifikus funkciót (hemagglutináció, illetve fertőzőképesség) is blokkolják.
A nem létező, illetve csekély védőhatással összhangban az rE*-antitest indukciója is nagyon alacsony volt vagy nem volt kimutatható.
Látható tehát, hogy az rSP-k kiemelkedően jó immunogének, amelyek az egyébként halálos kimenetelű encephalitis-től védenek, és a funkcionális, vírusneutralizáló antitestek indukciója vonatkozásában akár a formalininaktivált teljes vírust is felülmúlják.
HU 219 503 Β
4. táblázat
Egerek immunizálása
| Challenge-teszt Túlélők száma per összes egér (=10) | Antitesttiter | |||
| ELISA | HGT | NT | ||
| F ormalininakti vált vírus+adjuváns | 10/10 | 10 000 | 40 | 20-40 |
| rSP adjuváns nélkül | 10/10 | 12 000 | 80-160 | 40-80 |
| rSP+adjuváns | 10/10 | 30 000 | 160 | 160 |
| rE* adjuváns nélkül | 0/10 | 100 | <10 | <10 |
| rE* adjuváns | 10/10 | 4 000 | <10 | <10-10 |
| Pufferkontroll | 0/10 | neg | <10 | <10 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Tick-Bome encephalitis vírus- (TBE-vírus-) fér- 20 tőzések elleni immunizálásra alkalmas, nem fertőző szubvirális partikulákból álló vakcinák, amelyek lényegében az E-proteint teljes, natív formájában és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattuk. 25
- 2. Az 1. igénypont szerinti vakcinák, amelyekben az E-protein és adott esetben a prM/M protein rekombináns proteinek.
- 3. A 2. igénypont szerinti vakcinák, amelyekben a rekombináns E-proteint az európai vagy távol-keleti 30 TBE-vírus szubtípusokból származtattuk.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcinák, amelyekben a nem fertőző partikulák előnyösen vezikuláris formájú lipidkomponenst is tartalmaznak.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vakéi- 35 nák, amelyekben a nem fertőző partikulák lényegében mentesek PCR-rel kimutatható, PBE-vírusból levezetett nukleinsavaktól.
- 6. Eljárás TBE-vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy 40- egy olyan sejttenyésztő rendszert állítunk elő, amely a TBE-vírusból levezetett prM- és E-protein kódolószekvenciáit tartalmazza,- az E-proteint a maga teljes, natív formájában fejezzük ki, amikor is 45- szubvirális, nem fertőző partikulákat képezünk, amelyek a rekombináns E-proteint lényegében teljes, natív formában és adott esetben a rekombináns prM/M proteint tartalmazzák, és- a partikulákat összegyűjtjük, és immunizálásra al- 50 kalmas összetétellé feldolgozzuk.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan sejttenyésztő rendszert állítunk elő, amely a TBE-vírusból származtatott prM- és E-protein kódolószekvenciáit kromoszómába integrált formában tartalmazza.
- 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyésztő rendszerben virális vektorokat alkalmazunk.
- 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyésztő rendszerben vírusmentesen dolgozunk.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidvektort alkalmazunk.
- 11. A 6-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proteinek kifejeződése és a partikulák képződése folyamatosan megy végbe.
- 12. Nem fertőző szubvirális partikulák - amelyek lényegében az E-protein teljes natív formáját és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattuk - felhasználása TBE-vírus-fertózések elleni aktív immunizálásra alkalmas vakcina előállítására.
- 13. A 12. igénypont szerinti felhasználás, azzaljellemezve, hogy az E-protein és adott esetben a prM/M protein rekombináns proteinek.
- 14. Nem fertőző szubvirális partikulák - amelyek lényegében az E-protein teljes natív formáját és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattuk - felhasználása antiTBE-vírus immunglobulin készítmény előállítására.
- 15. A 14. igénypont szerinti felhasználás, azzaljellemezve, hogy az E-protein és adott esetben a prM/M protein rekombináns proteinek.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9903233A HU224199B1 (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0135294A AT402897B (de) | 1994-07-08 | 1994-07-08 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
| AT0087195A AT405607B (de) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9501832D0 HU9501832D0 (en) | 1995-08-28 |
| HUT72395A HUT72395A (en) | 1996-04-29 |
| HU219503B true HU219503B (hu) | 2001-04-28 |
Family
ID=25594155
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501832A HU219503B (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására |
| HU9903233A HU224199B1 (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9903233A HU224199B1 (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0869184B1 (hu) |
| AT (2) | ATE198909T1 (hu) |
| CZ (1) | CZ282927B6 (hu) |
| DE (2) | DE59509667D1 (hu) |
| DK (2) | DK0869184T3 (hu) |
| ES (2) | ES2165109T3 (hu) |
| FI (2) | FI117974B (hu) |
| HU (2) | HU219503B (hu) |
| RU (1) | RU2150294C1 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69833388D1 (de) * | 1997-11-20 | 2006-04-13 | Us Army Medical Res Materiel C | Dna impfstoffe gegen zecken-flavivieren |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| EP1572941A4 (en) * | 2002-02-26 | 2009-03-18 | Maxygen Inc | NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES |
| CA2591665C (en) | 2004-12-20 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| US8052974B2 (en) | 2005-05-12 | 2011-11-08 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| US8211431B2 (en) | 2006-06-06 | 2012-07-03 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof |
| WO2010008411A1 (en) | 2007-11-09 | 2010-01-21 | The Salk Institute For Biological Studies | Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2074422T3 (es) * | 1987-03-20 | 1995-09-16 | Immuno Ag | Moleculas de adn y arn del subtipo accidental del virus fsma, polipeptidos, que son codificados por estas moleculas, y su uso. |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| WO1992003161A1 (en) | 1990-08-27 | 1992-03-05 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Flavivirus envelope proteins with increased immunogenicity for use in immunization against virus infection |
| DK0584348T3 (da) | 1992-03-11 | 2005-09-19 | Powderject Vaccines Inc | Genetisk vaccine mod immundefektvirusser |
-
1995
- 1995-06-21 HU HU9501832A patent/HU219503B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-21 HU HU9903233A patent/HU224199B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 AT AT95890132T patent/ATE198909T1/de active
- 1995-07-06 DE DE59509667T patent/DE59509667D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES98107383T patent/ES2165109T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES95890132T patent/ES2155510T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 AT AT98107383T patent/ATE206459T1/de active
- 1995-07-06 EP EP98107383A patent/EP0869184B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 EP EP95890132A patent/EP0691404B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DK DK98107383T patent/DK0869184T3/da active
- 1995-07-06 DK DK95890132T patent/DK0691404T3/da active
- 1995-07-06 DE DE59508988T patent/DE59508988D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-07 FI FI953371A patent/FI117974B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 RU RU95113194/14A patent/RU2150294C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 CZ CZ951769A patent/CZ282927B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-17 FI FI20070041A patent/FI118222B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0869184T3 (da) | 2001-12-17 |
| HU9903233D0 (en) | 1999-11-29 |
| FI953371A0 (fi) | 1995-07-07 |
| CZ176995A3 (en) | 1996-01-17 |
| EP0869184A3 (de) | 1999-05-12 |
| DK0691404T3 (da) | 2001-03-19 |
| RU2150294C1 (ru) | 2000-06-10 |
| DE59509667D1 (de) | 2001-11-08 |
| EP0691404B1 (de) | 2001-01-24 |
| EP0869184B1 (de) | 2001-10-04 |
| HU9501832D0 (en) | 1995-08-28 |
| CZ282927B6 (cs) | 1997-11-12 |
| FI117974B (fi) | 2007-05-15 |
| ES2165109T3 (es) | 2002-03-01 |
| ATE198909T1 (de) | 2001-02-15 |
| HU224199B1 (hu) | 2005-06-28 |
| FI20070041A (fi) | 2007-01-17 |
| ES2155510T3 (es) | 2001-05-16 |
| EP0691404A2 (de) | 1996-01-10 |
| FI118222B (fi) | 2007-08-31 |
| FI953371A (fi) | 1996-01-09 |
| ATE206459T1 (de) | 2001-10-15 |
| EP0869184A2 (de) | 1998-10-07 |
| HUT72395A (en) | 1996-04-29 |
| DE59508988D1 (de) | 2001-03-01 |
| EP0691404A3 (de) | 1997-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019285048B2 (en) | Nanoparticle vaccines with novel structural components | |
| US10548964B2 (en) | Antigens and vaccines directed against human enteroviruses | |
| JP2024050973A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡドメインワクチン | |
| JP4504464B2 (ja) | キメラフラビウイルスワクチン | |
| Kofler et al. | Capsid protein C of tick-borne encephalitis virus tolerates large internal deletions and is a favorable target for attenuation of virulence | |
| US8853379B2 (en) | Chimeric poly peptides and the therapeutic use thereof against a flaviviridae infection | |
| US20150056244A1 (en) | Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses | |
| CN116096409A (zh) | 编码稳定化的冠状病毒刺突蛋白的rna复制子 | |
| FI118222B (fi) | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin | |
| JPH01501357A (ja) | ヒト呼吸器系ウイルス用ワクチン | |
| JP5290576B2 (ja) | 修飾されたｈｉｖ−１エンベロープタンパク質 | |
| JPH05505616A (ja) | 天然のコンホメーションを保持している精製ｇｐ１２０組成物 | |
| EP0518313A2 (en) | Gene of hepatitis C virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same | |
| US5439814A (en) | DNA encoding infectious rubella virus | |
| US20090004721A1 (en) | Dengue virus mutant strain MBU 01-2002 | |
| EP0492920A1 (en) | Chimaeric influenza-HIV vaccine | |
| HU222995B1 (hu) | Kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Borne Encephalitis/TBE) vírus fertőző cDNS-klónja, ebből készült rekombináns oltóanyag és eljárás előállítására | |
| TW202217000A (zh) | Ｓａｒｓ—ｃｏｖ—２ ｍｒｎａ結構域疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |