HU219503B - Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására - Google Patents

Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU219503B
HU219503B HU9501832A HU9501832A HU219503B HU 219503 B HU219503 B HU 219503B HU 9501832 A HU9501832 A HU 9501832A HU 9501832 A HU9501832 A HU 9501832A HU 219503 B HU219503 B HU 219503B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
virus
prm
tbe
derived
Prior art date
Application number
HU9501832A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9501832D0 (en
HUT72395A (en
Inventor
Steven Allison
Franz Xaver Heinz
Christian Kunz
Christian Mandl
Original Assignee
Baxter Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AT0135294A external-priority patent/AT402897B/de
Priority claimed from AT0087195A external-priority patent/AT405607B/de
Application filed by Baxter Aktiengesellschaft filed Critical Baxter Aktiengesellschaft
Priority to HU9903233A priority Critical patent/HU224199B1/hu
Publication of HU9501832D0 publication Critical patent/HU9501832D0/hu
Publication of HUT72395A publication Critical patent/HUT72395A/hu
Publication of HU219503B publication Critical patent/HU219503B/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525Virus
    • A61K2039/5258Virus-like particles
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24111Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24111Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24161Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/24162Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány TBE-vírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmasvakcinára vonatkozik. A vakcina nem fertőző, szubvirális partikulákbóláll, amelyek E-proteint és adott esetben prM/M proteint tartalmaznak. ŕ

Description

A találmány TBE-vírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas javított vakcinára vonatkozik, valamint a vakcina előállítására szolgáló eljárásra.
A TBE-vírus (Tick-Bome-Encephalitis vírus) számos európai országban, a volt Szovjetunióban és Kínában okoz endemiás járványokat. Néhány közép-európai országban, így Ausztriában, Németországban, Szlovákiában, Szlovéniában vagy Magyarországon, ahol minden évben több száz - kórházba felvett - esetet regisztrálnak, ez a betegség jelentős problémát jelent a közegészségügy számára [WHO: EURO Reports and Studies, 104, (1983)].
A TBE-vírus, amelynek nyugati, európai és távolkeleti szubtípus formái ismertek, a Flavivirusok családjához tartozik. Ezek a vírusok gömb alakú, lipidburokkal ellátott RNS-vírusok [lásd: T. P. Monath: Flaviviruses, Β. N. Fields: Virology, Raven Press, Ν. Y. (1990) 763-814 oldal],
A Flavivirus virion általánosságban egy olyan nukleokapszidból áll, amelyben az RNS-genom pozitív szála a virális kapszidproteinnel (C-protein) kapcsolódik. A nukleokapszidot egy lipidburok veszi körül, amely az E (50-60 KD) és M (7-8 KD) membránasszociált proteineket tartalmazza [van Regenmortel és Neurath (szerkesztők), „Immunochemistry of Viruses. II. The Basis fór Seradiagnosis and Vaccines”, című kiadványban (Elsevier Sciences, Amsterdam, 1990), Heinz és Roehrig, 289-305. oldalak].
Az E-főburokprotein központi szerepet játszik a Flavivirusok biológiájában, mivel jelentős virális beépülési funkciókat közvetít, és a gazdában protektív immunválaszt vált ki. A TBE-vírus E-burokproteinje szerkezetéről már jelentős mennyiségű információ áll rendelkezésre, és a számos biokémiai és immunológiai adat alapján szerkezetének modelljét is bemutatták [Mandl et al., J. Virol., 63, 564-571 (1989)].
A betegség eredményesen gátolható [Kunz, Ch. Acta leidensia, 60, 1-14 (1990)] egy megfelelően tisztított, formalinmaktivált teljes vírust tartalmazó, olyan oltóanyaggal való oltással (Kunz et al., J. Med. Virol, 6, 103-109 (1980)], amely a vírus szerkezeti proteinjeivel szemben immunválaszt indukál. Ez az oltóanyag bizonyult a legjobbnak, azonban az előállításával kapcsolatos eljárások folyamán nagy mennyiségű fertőző és potenciálisan veszélyes vírusszuszpenzióval kell foglalkozni, és ezért átfogó és drága biztonsági intézkedések alkalmazására van szükség.
Az antitestek vírusneutralizáló képessége attól függ, hogy milyen eredményesen ismerik fel a vírus felületén a proteinek eredeti szerkezetét. A TBE-vírusok és más Flavivirusok esetében tehát elsősorban az E-proteinről van szó [Heinz és Mandl, APMISm 101, 735-745 (1994)]. Egy immunizálás folyamán a lehető leghatékonyabb ellenanyagok eredményes indukciója érdekében tehát megkívánt, hogy az oltóanyag ezt a proteint ugyanabban a formában tartalmazza, mint ahogyan ez a fertőző vírus felületén előfordul. A teljesvírus-oltóanyagoknak az a hátrányuk, hogy a szükséges inaktiválási eljárások az eredeti proteinszerkezet részleges megváltozásához vezethetnek.
A rekombináns DNS-technológia lehetőséget nyújt arra, hogy a teljesvírus-oltóanyagot olyan rekombináns proteinekkel helyettesítsük, amelyek az immunválaszt indukáló proteinek lényeges részét tartalmazzák. Az egyes vírusproteinek géntechnológiai kifejezése kapcsán azonban nincs rögzítve, hogy ezen rekombináns proteinek antigénszerkezete megfelel-e a vírus felületén lévő megfelelő proteinekének.
A TBE-vírusok rekombináns felületi proteinjeinek expressziójáról például Allison és munkatársai [Gemeinsame Jahrestagung ÖBG-ÖGGGT (1993) 114. oldal] számoltak be. Megállapították, hogy az E-protein és az M-protein meghatározott feltételek mellett történő rekombináns expressziójuk esetén, különböző formában - beleértve a nem fertőző szubvirális partikulákat - szekretálódnak.
Ilyen szubvirális partikulák a TBE-vírusok távoli rokonainál, így a Japán Encephalitis Vírusnál (JEV), a sárgaláz vírusainál és a Dengue-láz vírusainál [Konishi et al., Virology, 188, 714-720 (1992); WO 92/03545] ismertek.
Konishi és munkatársai ugyan leírták, hogy az ilyen szubvirális partikulák, amelyeket komplett Freundadjuvánssal emulgeáltak és az egész E-proteint tartalmazták, egerekben bizonyos immunválaszt váltanak ki, másrészt azonban kimutatták, hogy egy olyan E-proteinnel, amelyet C-terminális részénél részben megrövidítettek, lényegesen hatékonyabb védelmet lehet elérni egy Flavivírus-fertőzés ellen, mint a teljes E-proteinnel (WO 92/03161).
A találmány feladata tehát az, hogy a TBE-fertőzések elleni javított oltóanyagot biztosítson.
Ezt a feladatot a találmány egy, a Tick-Bome-Encephalitis-Virus- (TBE-vírus-) fertőzések elleni immunizálásra alkalmas olyan vakcinával oldja meg, amely nem fertőző, szubvirális partikulákból áll. Ezek a partikulák lényegében az E-protein teljes eredeti formáját és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattunk. Lényegesnek tartjuk, hogy az E-protein itt teljes eredeti formájában van jelen, mivel csak ezzel lehet hatékony védelmet biztosítani. A találmány szerinti vakcinában az E-protein natív formáját különböző analízisek segítségével tudtuk bizonyítani, éspedig
a) antigénszerkezet vizsgálata monoklonális antitestekkel,
b) savindukált konformáció változásokra való képesség vizsgálata,
c) hemagglutinációs aktivitás vizsgálata.
Az a tény, hogy a találmány szerinti vakcina összetételénél fogva nem fertőző - tekintettel az ismert vakcinákra -, fontos szempont az oltóanyag biztonsága szempontjából.
Az E-protein és adott esetben a prM/M protein előnyösen rekombináns proteinek.
A vakcina egy különösen előnyös kiviteli formájában az E-proteint a TBE-vírusból származtatjuk, és ebben - a felhasználási területnek megfelelően - mind a nyugati (európai) szubtípust, mind a távol-keleti szubtipust alkalmazzuk. Előnyös, ha a vakcina egy lipid alko2
HU 219 503 Β tórészt is tartalmaz, amely előnyösen vezikuláris formában van jelen.
Azt találtuk, hogy - a szakma véleménye (lásd: WO 92/03161) ellenére - a rekombináns E-protein, amelyet a TBE-vírusokból vezettünk le, csak ebben a nem fertőző, szubvirális partikula formában adhat elégséges immunitást fertőzésekkel szemben. Az E-protein egy részlegesen megrövidített formája, amelynél - mint a WO 92/03161 számon közzétett szabadalmi bejelentésben - a C-terminális membránhorgot eltávolítottuk, hatékony vakcina előállítására nem használható. A találmány szerinti vakcina előnyösen olyan nem fertőző partikulát tartalmaz, amely lényegében PCR-rel kimutatható, TBEvírus eredetű nukleinsavaktól mentes, ez például a Konishi és munkatársai által leírt módszerrel kimutatható.
A találmány egy további eleme TBE-vakcina előállítására vonatkozik, az említett eljárás a következőkkel jellemezhető:
- előállítunk egy olyan sejttenyészet-rendszert, amely a prM- és E-proteineket - ezek a proteinek a TBE-vírusból vezethetők le - kódolószekvenciákat tartalmazza,
- az E-protein a maga teljes, natív formájában fejeződik ki, amikor is
- szubvirális, nem fertőző partikulák képződnek, amelyek lényegében a rekombináns E-proteint a maga teljes natív formájában és adott esetben a rekombináns prM/Μ proteint tartalmazzák, majd
- a partikulákat összegyűjtjük, és közvetlenül immunizálásra alkalmas összetételben dolgozzuk fel.
A találmány szerinti eljárásnak az a nagy előnye, hogy nem szükséges vírusinaktiváló lépést - például formáimnál - alkalmazni, ami egyrészt a vakcina minőségét jelentékenyen javítja (az E-proteint natív formában és nem a formalinkezelés által módosított és legalábbis részben denaturált formában tartalmazza), másrészt jelentősen megkönnyíti technikailag a vakcina termelését, mivel a partikulákat közvetlenül (tehát formalinkezelés nélkül) gyógyszerkészítménnyé lehet feldolgozni.
Az eljárás megvalósítása során különösen előnyös, ha olyan sejttenyészet-rendszert alkalmazunk, amely a TBE-vírus rekombináns prM- és E-proteinjeit kódoló szekvenciákat kromoszómába integrált formában tartalmazza.
Vannak azonban olyan sejttenyészet-rendszerek, amelyekben virális vektorokat alkalmazunk, és olyan sejttenyészet-rendszerek, amelyekben vírusmentesen - például egy plazmidvektorral - dolgozunk, szintén a találmány szerinti partikulák előállítására alkalmas módon.
Az eljárás egy előnyös kiviteli alakja szerint mind a protermék expressziója, mind a partikulák képződése folyamatos.
A találmány egy további elemét a nem fertőző, szubvirális partikulák - amelyek a TBE-vírusból származtatott E-proteint, lényegében teljes natív formájában és adott esetben a prM/Μ proteint tartalmazzák TBE-vírus-fertőzések elleni aktív immunizálásra szolgáló vakcina előállítására való alkalmazása képezi.
Az E-protein és adott esetben a prM/Μ protein előnyösen rekombináns proteinek.
A találmány tárgyát képezi továbbá a nem fertőző, szubvirális partikuláknak - amelyek a TBE-vírusból származtatott E-protein lényegében teljes natív formáját és adott esetben a prM/Μ proteint tartalmazzák - a gyógyászati felhasználása, különösen anti-TBE-vírus immunglobulin-készítmények előállítására való alkalmazása. Ez esetben is előnyös, ha az E-protein és adott esetben a prM/Μ protein rekombináns proteinek.
A találmányt az alábbi példákon részletesebben ismertetjük.
Az ábrák leírása: az 1. ábrán az expressziós plazmidokban alkalmazott inszertumok vázlatos ábrázolása látható, a 2. ábra a ρΞνβ plazmid vázlatát mutatja be, amelyet az 1. ábrán bemutatott szerkezet expressziójához használtunk, a 3a., b. és c. ábrák az 1. ábrán bemutatott SVPE wt szerkezet teljes nukleotid- és aminosavszekvenciáját tartalmazzák: a 4. ábra a Triton X-100 segítségével oldatba vitt sejtlizátumok immunprecipitációját mutatja be az 1. ábrán ábrázolt szerkezetekkel való transzfekció után, valamint TBEvírussal (COS/TBE) való fertőzés után. Az 5. ábrán bemutatott diagram az E-protein kimutatására vonatkozik, amelyet 4 rétegű ELISA segítségével olyan COSsejtek tenyészeteinek felülúszóiból végeztünk, amelyeket az 1. ábrán látható szerkezetekkel transzfektáltunk. A 6. ábra a COS-sejtek SV-PEwt-vel, illetve SV-PEst-vel való transzfekciója után a sejttenyészet felülúszóinak immunprecipitációját ábrázolja; a 7. ábrán a COS-sejtek SV-PEwt-vel, illetve SV-PEst-vel való transzfekciója, valamint TBE-vírussal való fertőzése után a sejttenyészet-felülúszók szedimentációs analíziséről készített diagram látható; a szedimentáció iránya: balról jobbra; a 8. ábra az rSP (SV-PEwt) 0,5% Triton Χ-100-zal való kezelése után, illetve kezelése nélkül végzett szedimentációs analízisét ábrázolja; a szedimentáció iránya: balról jobbra; a 9. ábrán a tisztított TBE-vírus és a tisztított rSP-k SDS-PAGE analízisének képe látható; Coomassie-blue-festés; a 10. ábrán a COS-sejtekből és a stabilan transzfektált CHOsejtvonalból származó rSP-k összehasonlítása látható: all. ábra 19 E-protein specifikus monoklonális antitest reaktivitási diagramját mutatja be, amelyet 4 rétegű ELISA segítségével és TBE-vírussal, formáimnál inaktivált TBE-vírussal, rSP-vel és rE*-gal készítettünk: a 12. ábra a TBE-vírus, illetve az rSP B3, i2, IC3 és C6 monoklonális antitestekkel 4 rétegű ELISAvizsgálatban való reaktivitását ábrázolja pH 6,0 melletti kezelés után, illetve kezelés nélkül (pH 8,0); a
13. ábra a pE* B3, i2, IC3 és C6 monoklonális antitestekkel - 4 rétegű ELISA-vizsgálatban - való reaktivitását ábrázolja pH 6,0 mellett való kezelés után, illetve kezelés nélkül (pH 8,0).
A találmányt a következő példákkal részletesebben szemléltetjük, anélkül azonban, hogy a példákkal a találmány oltalmi körét korlátoznánk.
1. példa
A partikulák előállítása
Erre a célra 4 expressziós plazmidot szerkesztettünk, amelyek az E-proteint, illetve az E-protein egy
HU 219 503 Β membránhorgonymentes formáját, vagy ezt a prM-proteiimel együtt tartalmazták (1. ábra).
E plazmidok előállítására vonatkozó példát írtak le Allison és munkatársai [Vírus Genes, 8, 187-198 (1994)].
Az itt leírt pSVp kiindulási plazmidot a 2. ábra mutatja be.
Az expressziós kiónok szerkesztéséhez a pSV46 vektort alkalmaztuk. Ez a vektor az SV40-en alapuló eukarióta pSVp expressziós vektor (Clontech) - amelyből Notl-gyel való emésztéssel a β-galaktozidázgént tartalmazó inszertumot [G. R. MacGregor, C. T. Caskey, Nucl. Acids Rés., 17, 2365 (1989)] eltávolítottuk és ligáltunk - egy származéka. A transzlációs stophelytől 3’-irányban elhelyezkedő polilinker egy részét Xbal-gyel és HindlII-mal való emésztés, Klenowbetöltés és religálás révén szintén eltávolítottuk.
Ebbe a vektorba PCR-termékeket építettünk be, amelyekhez a következőképpen jutottunk.
Szintetikus oligonukleotid printereket használtunk a TBE-vírus prM+E szakaszának vagy csak E szakaszának megfelelő cDNS-részek sokszorozásához. A Mandl és munkatársai [C. W. Mandl, F. X. Heinz, C. Kunz, Virology, 166, 197-205 (1988)] szerinti nukleotidkoordinátákat használtuk, amelyeket később úgy dolgoztak át, hogy a TBE-genom első 20 nukleotidját [C. W. Mandl, F. X. Heinz, E. Stockl, C. Kunz, Virology, 173,] tartalmazzák. A prM+E szerkezet és az E szerkezet 5’-primerei a következő 27mer-szekvenciák voltak: AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA, illetve AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Mindkét szekvencia első 11 nukleotidja mesterséges szekvenciából áll, amely a NotI restrikciós enzim számára egy felismerőhelyet (GCGGCCGC) tartalmaz. Az ezt követő 16 tagú nukleotidszekvenciák a 388-403 (SV-PE sor) vagy a 883-898 (SV-E sor) nukleotidoknak felelnek meg. Mindkét esetben a megfelelő géntől 5’-felé egy természetben előforduló ATB-kodont alkalmaztunk startkodonként, és a prímért úgy alakítottuk ki, hogy ez az ATB-t alkalmas összefüggésben tartalmazza (GCCGCCATGG) ahhoz, hogy COS-sejtekben hatékony transzláció induljon meg [M. Kozák, Cell., 44, 283-292 (1986); M. Kozák, 7. Mól. Bioi, 196, 947950 1980]. A hasonló 28 nukleotid hosszú oligonukleotidot (ATGCGGCCGCTAGTCATACCATTCTGAG) mindkét szerkezetnél 3’-primerként alkalmaztuk. Ez a primer 3’-végén a 2535-2550 nukleotidokkal komplementer és 5’-végén egy NotI helyet tartalmaz és egy TAG stopkodon komplementert (CTA) ugyanezen leolvasási keretben.
A PCR-sokszorozást lényegében standard körülmények mellett, a Cetus cég előirata szerint [R. K. Saiki, D. H. Gelfand, J. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich, Science, 239, 487-491 (1988)] végeztük. A reakcióelegyek összetétele 100 pl össztérfogatban a következő volt: 50 mM kálium-klorid, 10 mM trisz-HCl, pH 8,3, 1,5 mM magnézium-klorid, 200-200 μΜ dNTP, az egyes primerek 10 pg-ja, a cDNS-mátrix 1000-szeres hígításából μΐ, 3 E AmpIiTaq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus). A mintákra 100 μΐ paraffinolajat rétegeztünk. A mintákat hőmérséklet váltást biztosító Perkin-Elmer-készülékben sokszoroztuk.
A mintákat 6,5 percig 94 °C-on tartottuk, ezután 40 °C-os hibridizációs hőmérsékletre hűtöttük, mielőtt a Taq-polimerázt hozzáadtuk. Összesen 35 sokszorozóciklust végeztünk. Mindegyik ciklusban 1,5 percig 94 °C-ot, 3 percig 40 °C-ot és 7 percig 68 °C-ot alkalmaztunk. A mintákat fenol-kloroformos extrahálással tisztítottuk, etanollal kicsaptuk, és steril, kétszer desztillált vízben feloldottuk. A PCR-termékek minőségét és mennyiségét agaróz-gélelektroforézissel határoztuk meg, és a mintákat -20 °C-on tároltuk, amíg ezt követően a klönozási lépéshez felhasználtuk.
A polimeráz láncreakciót arra használtuk, hogy egy cDNS-plazmid-klónokból álló, olyan inszertumokat tartalmazó minibankot kapjunk, amelyek a TBE-vírusgenom prM+E szakaszának (S4-PE sor), 388-2550 nukleotid, vagy E szakaszainak (SV-E sor), 883-2550 nukleotid, felelnek meg (1. ábra).
Minthogy a TBE-vírus szerkezeti proteinjei egy nagy poliproteinprekurzor kotranszlációs feldolgozása révén keletkeznek, a transzlációs start- és stopkodonokat úgy vezettük be, hogy azokat az oligonukleotid primerbe építettük be. Mindegyik szerkezetbe egy termiszter ATG-kodont - amely alkalmas kontextusban helyezkedett el ahhoz, hogy indítókodonként szerepeljen - vezettünk be a belső szignálszekvenciától 5’irányban annak érdekében, hogy lehetővé tegyük a gazda szignaláza által történő természetes feldolgozást és a megfelelő rávitelt a szekréciós útra. Minden szerkezetben hasonló módon helyeztük el a TG-stopkodont a szignaláz-hasítási helytől - amely az E-protein karboxiterminális végét képezi - 3’-irányban. A NotI restrikciósenzim-felismerő helyeket szintén a végeken építettük be, hogy a PCR-termékek ezután következő klónozását megkönnyítsük.
A PCR-DNS-eket Notl-gyel elhasítottuk, és a pSV46 plazmidvektor NotI klónozóhelyére ligáltuk, ez lehetővé teszi, hogy a pontosan beépített gének a korai SVHO promoter szabályozása alatt fejeződjenek ki [g. R. MacGregor, C. T. Caskey, Nucl. Acids Rés., 17, 2365 (1989)]. A vektorban rendelkezésre áll egy poliadenilező szignál is a hatékony expresszió érdekében és egy SVHO replikációs origo, hogy a transzfektált COS-sejtekben - amelyek konstitutív módon fejezik ki a nagy SVHO-T-antigént [Y. Gluzman, Cell., 23, 175-182 (1981)] - lehetővé tegye a rekombináns plazmidok replikációját.
A ligálóelegyeket használtuk fel E. coli HBlOl-sejtek transzformálására, majd az egyes ampicillinrezisztens telepeket - amelyek egyetlen kiónt képviselnek izoláltuk. A plazmidokban az inszertum irányát restrikciós enzimes emésztésekkel és agaróz-gélelektroforézissel határoztuk meg. A megfelelő irányítottságú inszertumokat tartalmazó kiónokat tartottuk meg a további analízisekhez.
A helyes irányítottságú inszertumokat tartalmazó plazmidokat restrikciós analízissel azonosítottuk, és
HU 219 503 Β cézium-klorid-gradiensben való centrifugálással tisztítottuk.
Mindegyik plazmidszerkezetnél a DNS-szekvencia meghatározásához készítményből származó, tisztított, kétszálú plazmid-DNS-t használtunk. A szekvenálási reakciókat hőmérsékletváltásra alkalmas Perkin-Elmer-készülékben végeztük TBE-specifikus primerek, AmpIiTaq-polimeráz (Perkin-Elmer Cetus) és fluoreszkáló színezékkel jelzett didezoxiterminátorok használatával, az előállító cég (Applied Biosystems) előírásai szerint. A szekvenálási reakciók termékeit az Applied Biosystems 373A automata DNS-szekvenátorával analizáltuk.
PCR-rel létrehozott mutációk analízise
Annak érdekében, hogy a klónozott inszertumokat részletesen analizáljuk, és hogy a Taq-polimeráz által létrehozott mutagenizálás hatékonyságát megítéljük, kiválasztottunk 13 olyan egyedi E. coli-klónt, amelyek SV-PE sorozatból származó plazmidot tartalmaztak, és 9 olyan kiónt, amelyek SV-E sorozatból származó plazmidot tartalmaztak. A kiónok plazmid-DNS-ét tisztítottuk, és a klónozott inszertumok mindkét szálát teljes szekvenálással analizáltuk. A CDNS-szekvenciákat ezután a szülői vad típusú TBE-vírus Neudörfl törzs [C. W. Mandl, F. X. Heinz, C. Kunz, Virology, 166, 197-205 (1988)] megfelelő RNS-szekvenciával hasonlítottuk össze.
Mint vártuk, az egyes plazmidklónok több nukleotidban különböztek a vad típusú TBE-vírus szekvenciájától. Néhány kivételtől eltekintve (lásd alább) e változások nagyobb részben olyan egyedi mutációk voltak, amelyeket nyilvánvalóan a PCR-sokszorozás vezetett be és így csak egyetlen kiónban voltak megtalálhatók.
1. táblázat
A PCR által okozott mutációk összefoglalása
Klón Nukleotidváltozásokó Aminosawáltozásokb>
prM E
SV-PE
01 945 G—»A 1122 G-»C 1395 C->T 2027 T-»C 2480 A—»G Gin 50-»His Val 352-» Alá
02 551 T—»A 1080 G-»A 1153 T-»C 1168 T—>C 1690 A—»G 2458 G—>del Val 24—»Glu Ser 66—»Pro Arg 240—»Gly Alá 495-» Leolvasásikeret-eltolódás
03 952 T->C 976 C-»T 1163 A—»G 1679 A-»G 1889 T—»A Cys 15 8-» Arg Arg 2-»Cys Lys 64-» Arg Asn 236-»Ser Met 306-»Lys
04d 1434 C-»T 2275 A—»T 2364 G-»A Lys 435-»stop
05c 701 T-»C 1488 C—»A 1492 T-»C 1893 T-»A Leu 74—>Pro Cys 307-»stop
06 782 T-»C 865 A-»G 1002 C-»T 1972 G-»A Leu 101-»Pro Lys 129-»Glu Gly 334-» Arg
07c 1327 G-»del 2248 G—»A Alá 119-» Leolvasásikeret-eltolódás Alá 426—»Thr
08 701 T-»A 2092 A—»G 2124 T-»C Leu 74-»Gln Met 374-» Val
HU 219 503 Β
1. táblázat (folytatás)
Klón Nuklcotidváltozásoka> Aminosawáltozásokbi
prM E
09 452 T^C 960 A+T 1746 A->G 2086 A-»G 2142 T->C 2290 G->A 2361 A->G Ile 372—»Val Val 440-»Ile
SV-PE
10' 1625 A->G 2475 T-»C Asp 218—>Gly
11' -
12' 1303 G-»A Met 77-*Ile
13' 1366 T->C 1381 A->G 1728 G—>A Tyr 132—>His Ile 137—>Val Met 252—>Ile
SV-E 2134 C->T
01d 1239 C->T
02 1093 A—>T 2301 C->T Met41->Leu
03 1321 G—>A 1688 A-»G 1717 G-»A 2053 A—>G 2092 A—>G Val 117—>Ile Glu 239—>Gly Ala 249—> Thr Asn 361-»Asp Met 374->Val
04 2073 T->C 2438 C->T Ala 489->Val
05 938 T->C 973 T->C 2401 T-»G (Leu 153-»Pro)' Ser l-»Pro Ser 477->Aia
06 891 C->T 1151 G—>A 1364 T->C 1567 A-»G 2045 T->C Cys 60-»Tyr Val 131—> Ala Ile 199-»Val Ile 358—> Thr
07 1257 T->C 1694 T->C 1794 A->G 2159 G->T Leu 241-»Pro Gly 396->Val
08 1806 A—>G 2205 A-»G
09 2491 A-»del'
a) A nukleotídkoordináták a teljes TBE-genomra vonatkoznak.
b) Az aminosavkoordináták a prM-rc vagy E-re vonatkoznak.
c) Aminosawáltozások az NS1- vagy a C-génbcn.
d) Az SV-PEOH új neve „SV-Pest” és az SV-EO1 új neve „SV-Ewt”.
e) A PCR okozta mutációkon kívül más mutációkat nem említünk (vesd össze a szöveggel).
f) Ebben a szerkezetben a prM-nek csak a C-terminális része volt jelen.
HU 219 503 Β
Amint az 1. táblázat mutatja, a 22 szekvenált inszertum (összesen 43 549 bázispár) 71 olyan egyedi nukleotidváltozást tartalmazott, amelyeket a Taq-polimeráz hibájára vezettünk vissza. Ezek a változások 42 (59%) szubsztitúcióhoz vezettek a várt aminosavszekvenciában, és 3 deléciót okoztak, amelyeknek leolvasásikeret-eltolódás volt a következménye (2. táblázat).
2. táblázat
PCR-mutáció gyakoriság
Bázispárváltozások Az előfordulások száma3 Bázisonkcnti gyakoriság
G/C-»A/T 20 (28%) 4,59x10-“
G/C—>T/A 2 (2,8%) 4,59xl0-5
G/C->C/G 1 (1,4%) 2,30x10-5
A/T—>G/C 37 (52%) 8,50x10-“
A/T-»C/G 1 (1,4%) 2,30x10-5
A/T->T/A 7 (9, 9%) 1,61x10-“
G/C deléció 2 (2,8%) 4,59x10-5
A/T deléció 1 (1,4%) 2,30x10 5
Átmenetek 57 (80%) l,31xl0-3
Transzverziók 11 (15%) 2,53x10“
Összes mutáció 71 (100%) 1,63x10-3
Aminosavszubsztitúciók 42 (59%) 9,64x10-“
Csendes mutációk 24 (34%) 5,51x10-“
Leolvasásikeret-eltoló- dások 3 (4,2%) 6,89x10-5
T erminátorkodonok 2 (2,8%) 4,59x10-5
a) 43 549 szekvenált bázispár.
A mutációk eloszlása erősen eltolódott az A/T G/C és G/C A/T átmenetmutációk javára, amit előzőleg már mások is megfigyeltek [A. M. Dunning, P. Talmud, S. E. Humphries, Nucl. Acids Rés., 16, 10393 (1988); J. Chen, A. Sahota, P. J. Stambrook, J. A. Tischfield, Mutat. Rés., 249, 169-176 (1991); R. C. Cadwell, G. F. Joyce, PCR Methods Applic., 2, 28-33 (1992)]. Egy 35 ciklusú sokszorozásnál az összes mutáció gyakorisága bázispáronként 1,63 χ 10~3 volt (4,7 χ 10 5 per bázispár per ciklus), ami a Taq-Polymerase hibáinak gyakoriságáról közölt értékekkel megegyezik. Az átlagos aminosavszubsztitúciós arány prM-nél (164 aminosav hosszú) génenként 0,46 volt és E-nél (496 aminosav hosszú) 1,59.
A 930. nukleotidnál egy csendes mutáció volt jelen minden kiónban, és így feltételezhető, hogy ez természetes mutáció gyanánt keletkezett a vírus szaporodása folyamán. Ezenkívül megállapítottuk, hogy az SV-PE sorozat öt kiónjában - SV-PE05, SV-PE07, SV-PE11, SV-PE12 és SV-PE13 - egyformán két azonos mutáció fordult elő a 849., 1285., 1346., 1404., 1909., 2247. és 2255. nukleotidnál. Az SV-PElO-et kivéve, amely e mutációk közül hármat (1909, 2247 és 2255) tartalmazott, ilyeneket nem találtunk a többi
SV-PE-klónban, sem valamely SV-E-klónban. Az egyik ilyen változás - egy nukleotid deléció az 1346. pozícióban - leolvasásikeret-eltolódást okozott az E-génben, a 125. kodonnál és azt vártuk volna, hogy ez egy működésre képtelen E-proteint eredményez. Minthogy e két, azonos mutációkat tartalmazó klón közül egyet a külön CDNS- és külön PCR-előállitásoktól függetlenül kaptunk meg (adatokat nem mutattunk be), úgy tűnik, hogy ez a variáns már a sokszorozás előtt jelen volt a vírus-RNS populációban. Ezeket a sajátos mutációkat ezért nem vontuk be a PCR által okozott mutációk analízisébe.
Vad típusú és deletált E-proteineket kódoló szerkezetek
Az egyes aminosawáltozásokat kódoló kiónokon kívül érdekeltek voltunk az olyan prM+E- és csak Eszerkezetek előállításában is, amelyek vad típusú és deletált proteineket kódolnak. Minthogy azonban az SV-PE-sorozatból mindegyik PCR-rel előállított klón olyan mutációkat tartalmazott, amelyek az aminosavszekvenciában változásokhoz vezettek volna, közvetlen szubklónozást alkalmaztunk egy olyan vad típusú szerkezet előállítására, amely a módosítatlan prM- és E-proteint, valamint a csak e szerkezet egy deletált formáját kódolja.
Az SV-PE04 plazmid DNS-szekvenciája két csendes mutáción kívül egy szubsztitúciót mutatott a 2275. nukleotidnál, amikor is az AT-re cserélődött, miáltal az E-protein 435-ös lizinjének AAG kodonja TAG-stopkodonná változott (1. táblázat). Ennélfogva előre látható volt, hogy az SV-PE04 egy vad típusú prM-proteint és egy deletált E-proteint kódol, amelyből a karboxiterminális 61 aminosavmaradék hiányzik, amely a valószínű membránt átszelő szakaszt foglalja magában [C. W. Mandl, F. Guirakhoo, H. Holzmann, F. X. Heinz, C. Kunz, J. Virol, 63, 564- 571 (1989)]. Azt találtuk, hogy az SV-E01 plazmid, amelyből a prM-gén nagy része hiányzik, a génben csak egy csendes mutációt tartalmaz, miáltal egy vad típusú E-proteint kódol.
Annak érdekében, hogy egy olyan prM+E szerkezethez jussunk, amely egy vad típusú aminosavszekvencia teljes hosszával rendelkezik és egy prM nélküli csak E-szerkezethez, de amely egy stopkodont tartalmaz a 2275. nukleotidnál, az SV-PE04-ből és az SV-EOl-ből (elnevezésük a későbbiekben SV-PEst, illetve SV-Ewt) kapott restrikciós fragmentumokat kicseréltük. Erre a célra, a CfrlOI restrikciós enzim számára két hasítási helyet használtunk, az egyiket a 960. és 961. nukleotid között, a prM- és E-gén határához közel, a másikat a vektor ampicillinrezisztencia-génjében. A kapott plazmidszerkezetek közül egy, az SV-PEwt, tartalmazta az SV-PEst-ből származó vad típusú prMgént és az SV-Ewt-ből származó vad típusú E-gént, míg a másik plazmidszerkezetből, az SV-Est-bői, a prM-gén hiányzott, tartalmazta azonban a SV-PEstből származó, stopkodont tartalmazó E-gént. Ezeket a változásokat a két plazmid inszertumainak a szekvenálásával igazoltuk. Ez a két szerkezet egy készletet tett teljessé négy expressziós plazmidból, a vad típusú szerkezetből (SV-PEwt) kifejeződött E-protei7
HU 219 503 Β nek szerkezetének és feldolgozásának az összehasonlítására olyanokéval, amelyekből a prM (SV-Ewt), az E-horgony-szakasz (SV-PEst) vagy mindkettő hiányzott.
A PEwt-inszertum teljes szekvenciáját a 3a., b. és c. ábrákon mutatjuk be.
A megfelelő plazmidokkal COS-sejteket transzfektáltunk, amelyeket rekombináns proteinek expressziójára vizsgáltunk.
DNS-transzfekció
A COS-1 sejtjeket [Y. Gluzman, Cell, 23, 175-182 (1991)] „COS-táptalajban” - összetétel: Dulbecco-féle MÉM (GIBCO-BRL) 10% fetális marhaszérummal, penicillinnel (100 E/ml) és sztreptomicinnel (100 pg/ml) kiegészítve - tartottuk fenn, 37 °C-on, 5% szén-dioxid mellett.
A klónozott TBE-géneket tartalmazó plazmidokat liposzómaközvetített transzfekcióval - Felgner és munkatársai eljárásának egy módosított változatának alkalmazásával [P. L. Felgner, T. R. Gadek, M. Molm, R. Román, H. W. Chan, M. Wenz, J. P. Northrop, G. M. Ringold, M. Danielsen, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413-7417 (1987)] - BioRad-féle Gene Pulserkészülék segítségével vittük be a COS-1 sejtekbe. A Lipofectin reagenst (GIBCO-BRL) Opti-MEM-I redukált szérum tápoldattal (GIBCO-BRL) 20 pg/mlre hígítottuk és 8 pg/ml megfelelő plazmid-DNS-t tartalmazó azonos mennyiségű Opti-MEM-I-gyel kevertük össze. Egy transzfekcióhoz 5 pg Lipofectint és 2 pg plazmid-DNS-t használtunk fel. A keveréket 15 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk a DNSLipofectin-komplex képződéséhez, majd ebből a keverékből 0,5 ml-eket mértünk egy 24 tartályos sejttenyésztő lemez (Nunc) minden tartályába. A tartályok olyan sejteket tartalmaztak, amelyeket a tenyésztő táptalajból származó szérum nyomainak eltávolítására kétszer 1 ml Opti-MEM-oldattal mostunk. A sejteket a DNS-Lipofectin keverékkel 5 órán át 37 °C-on 5% szén-dioxid atmoszférában inkubáltuk, ezután hozzáadtunk 1 ml komplett COS-táptalajt, és az inkubálást egy éjszakán át tovább folytattuk. A transzfekció után 24 órával a táptalajt eltávolítottuk, és friss COS-táptalajjal helyettesítettük, majd tovább inkubáltunk a transzfekció utáni körülbelül 46 óráig, amely időpontban a sejteket vagy immunfluoreszcenciás analízishez fixáltuk, vagy feloldottuk ELISA-val végzendő intracelluláris antigénanalízishez.
Az immunfluoreszcenciás kontrollok céljára a COS-sejtek TBE-vírussal való fertőzésénél lényegében ugyanúgy jártunk el, mint a transzfekciós eljárásnál, azzal a kivétellel, hogy a plazmid-DNS és Lipofectin helyett a TBE-vírust Opti-MEM-I-táptalajjal 100-szorosára hígított, szopós egerekből származó agyszuszpenzió formájában alkalmaztuk.
A kifejezett proteinek analízise
a) A sejtlizátumok immunprecipitációja
A transzfektált sejteket 35S-ciszteinnel jeleztük, 1%
Triton Χ-100-zal szolubilizáltuk, és egy, a TBE-vírus E- és prM-proteinjére specifikus, poliklonális nyúlszérummal immunprecipitáltuk. Mint a 4. ábrából látható, az SV-PEwt és SV-Ewt szerkezetek expressziója autentikus nagyságú E-protein szintéziséhez vezetett. Az SV-Pewt és SV-Est által szintetizált proteinek, mint vártuk, - rövidebb C-terminális végük következtében - kisebbek voltak, mint a vad típusú E-protein.
b) A rekombináns protein szekréciójának vizsgálata sejtfelülúszóban
A transzfektált sejtek felülúszóit a transzfekció után O-tól 4. napig E-protein jelenlétére vizsgáltuk 4 rétegű ELISA-val - mennyiségileg - Heinz és munkatársai által leírtak szerint [Heinz et al., J. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)]. Az 5. ábrán bemutatott eredmények mutatják, hogy csak azok a szerkezetek szekretálták az E-proteint, amelyek a prM-proteint is kifejezték. A felülúszók immunprecipitációjával (6. ábra) igazoltuk, hogy a kicsapott proteinek ugyanolyan nagyságúak voltak, mint a megfelelő intracelluláris proteinek (vesd össze a 4. ábrával).
A rekombináns proteinek szekréciója óriási előnyt jelent a termelés szempontjából, ugyanis nem szükséges a sejteket feloldani a kívánt protein kinyerése érdekében, és így a szennyező sejtanyagok eltávolítása kiküszöbölődik. Megfelelő feltételek mellett ez lehetővé teszi a rekombináns proteinek folyamatos aratását a sejtek feltárása nélkül.
c) A kicsapott rekombináns proteinek vizsgálata
Az 5. ábrán bemutatott felülúszókat szacharóz-sűrűség-gradiensben centrifugáltuk, 5-30% (tömeg/tömeg) szacharózgradiens és Beckman SW-40 rotor használatával. A centrifúgálás 38 000 fordulat/perc, 4 °C mellett, 100 percig tartott. A gradienseket elválasztottuk és az E-protein mennyiségét minden frakcióban meghatároztuk 4 rétegű ELISA [lásd Heinz et al., J. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)] segítségével. A vírussal fertőzött sejtek felülúszóját használtuk kontrollként, amely két E-protein-tartalmú csúcsot (7. ábra) adott. Ezek közül az egyik a teljes vírusnak felelt meg, a másik az úgynevezett nem fertőző „lassan ülepedő hemagglutinin”-nek [„slowlysedimenting hemagglutinin” (SHA); lásd Russel et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses című közleményt; R. W. Schlesinger (szerkesztő) „The Togaviruses” című kiadvány 503-529. oldalak (Academic Press, 1980)]. Az SV-PEwt-vel transzfektáló sejtekről származó felülúszó az E-protein egy speciális formáját tartalmazta, amelynek a szedimentációs sebessége hasonló volt a virális SHA-éhoz, míg az SV-PEst-ből származó, C-terminális végén megrövidített E-protein nem képezett stabil részecskéket, és a gradiens tetején maradt.
Az SV-PEwt-ből származó speciális formát „rekombináns szubvirális részecskének” („recombinant subviral partiele”, rSP) neveztük és az SV-PEst-ből származó oldható formát „rekombináns E*”-nak (rE*).
Az rSP kezelése 0,5%-os Triton Χ-100-zal felbontotta a részecskét. Ennek szedimentációs analízise (lásd a 8. ábrát) lipidmembrán jelenlétére utal.
Az rSPL és rL* előállítása
a) Az rSP tisztítása
Az SV-PEwt-vel transzfektált COS-sejtek felülúszóit 30 perces centrifugálással - 10 000 fordulat/perc, 4 °C, Sorvall szupercentrifúga - derítettük, és a részecs8
HU 219 503 Β kéket Beckman Ti45 rotor használatával, 44 000 fordulat/perc, 4 °C mellett, 120 percig tartó centrifugálással arattuk le. Az rSP-tartalmú üledékfrakciót TAN-pufferben (pH 8,0) reszuszpendáltuk és felvittük egy ugyanezen pufferrel előállított 5-20%-os szacharózgradiensre. Ezután 90 perces centrifugálással, amelyet 38 000 fordulat/perc és 4 °C mellett, Beckman SW40 rotor használatával végeztünk, frakcionáltuk a mintákat, és a csúcsfrakciókat HA aktivitásra teszteléssel (Clarké, Casals, Aver. J. Trop. Med. Hyg., 7, 561-573 (1958)] azonosítottuk. A gradiensekből származó csúcsfrakciókat egyensúlyi centrifugálással (35 000 fordulat/perc, 4 °C, egy éjszakán át) továbbtisztítottuk, és a frakciókat újból azonosítottuk HA teszteléssel. Az E-összprotein mennyiségi meghatározását 4 rétegű ELISA-val végeztük, tisztaságát Coomassie-blue-festéssel, SDS-PAGErendszerben határoztuk meg (9. ábra).
b) Az rE* előállítása
Az SV-PEst-vel transzfektált COS-sejtektől származó szérummentes felülúszókat, mint fent leírtuk, derítettük, és ultraszűréssel 15-szörösére koncentráltuk.
Kromoszómába integrált prM- és E-gént tartalmazó sejtvonalak előállítása
Stabilan transzfektált, rSP-termelő sejtek előállítására a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) szelekciós rendszert alkalmaztuk (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.), valamint azt a szerkezetet, amely a prM- és E-proteint meghatározó teljes géneket tartalmazza (1. ábra), és az rSP-k szintézisét és szekrécióját biztosítja. A DHFR-gén átvitelét a pSV2-dhfr-plazmid [S. Subramani et el., Mól. Cell. Bioi., 1, 854-865 (1981)] segítségével végeztük, a prM- és E-gén átvitelét a CMV-PEwt plazmid segítségével, amelyet az SV-PEwt plazmából származó inszertumnak a pCMVpplazmidba (Clontech) való átklónozásával állítunk elő.
A DHFR-hiányos CHO-DG44 hörcsög-sejtvonalat [Som. Cell., Mól. Génét., 12, 555-666 (1986) 10% fetális botjúszérummal kiegészített HAM-féle F12 táptalajon tenyésztettük, és 20:1 arányban pCMV-PEwt, valamint pSV2-dhfr-plazmiddal transzfektáltuk elektroporációt alkalmazva, BioRad Gene-Pulser-készülék használatával. A transzfektált sejteket ezután további 2 napon át tenyésztettük 10% fetális borjúszérum-tartalmú HAM-féle F12 táptalajban. A sejteket tripszinnel kezeltük, majd nagy hígításban - annak érdekében, hogy egyedi DHFR és prM+E kifejező sejtklónokat kapjunk a szelektív táptalajban (MEM-α ribo- és dezoxiribonukleotid nélkül +10 fetális boíjúszérum) - Petri-csészékre szélesztettük. Tíz nap múlva az egyes, mikroszkóp alatt látható sejttelepeket kis tenyésztőedényekbe vittük át, és továbbszaporítottuk. Az FSME-specifikus antigént termelő sejtklónokat a sejtfelülúszók ELISAvizsgálatával azonosítottuk (FSME=Frühsommermeningo-encephalitis).
Egy ilyen sejtklónt (CHO-37) használtunk az általa termelt rSP-k izolálásához és vizsgálatához. Ennek érdekében a sejteket a fenti szelektív táptalajon tenyésztettük, és az rSP-ket a sejtfelülúszóból ugyanazon tisztítási eljárással nyertük ki, mint amelyet a COS-sejtekből izolált rSP-kre leírtunk. A 10. ábrán a COS-sejtekből származó rSP-knél és a stabilan transzfektált CHO-37 sejtvonalból származó rSP-knél kapott szacharóz-sűrűséggradiens centrifugálással kapott eredmények összehasonlítása látható. A centrifúgálási feltételek a következők voltak: 20-50% szacharóz; Beckman Ti-40 rotor, 35 000 fordulat/perc egy éjszakán át. Centrifúgálás után a gradienseket elválasztottuk és az egyes frakciókat hemagglutinációs teszttel és ELISA-val FSME-vírusspecifikus antigénre analizáltuk. Amint ezt az ábra mutatja, a két készítmény szedimentációs tulajdonságaiban, illetve specifikus sűrűségében, valamint hemagglutinációs aktivitásában különbség nem mutatkozott.
2. példa
A natív proteinszerkezetre vonatkozó vizsgálatok
Az ilyen módon előállított készítményeket a következőképpen vizsgáltuk:
a) Antigénszerkezet vizsgálata monoklonális antitestekkel
b) Savval indukálható konformációváltozások
c) Hemagglutinációs aktivitás
Ad a) Antigénszerkezet
A formaiinnal inaktivált teljes vírus antigénszerkezetét - az rSP-ból és rE*-ből - 19 E-protein-specifikus monoklonális antitest használatával hasonlítottuk össze a natív fertőző vírus antigénszerkezetével [Mandl et al., J. Virol, 63, 564-571 (1989); saját kísérletek]. Az egyes monoklonális antitestek reaktivitását az egyes, előzőkben említett készítményekkel 4 rétegű ELISA-val analizáltuk Heinz és munkatársai [J. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)] szerint. A vizsgálatban minden antigénkészítményt az E-proteinre előzőleg meghatározott, 1 pg/ml-es állandó koncentrációban és a monoklonális antitesteket olyan hígításban használtuk, amelyek a natív fertőző vírussal 0,5-1,6 tartományban adtak extinkciós értéket. Mint all. ábrából kitűnik, a monoklonális antitestek (mAt) reaktivitási görbéje az rSP-nél és a fertőző vírusnál gyakorlatilag azonos, amiből azt következtethetjük, hogy az rSP-kben az E-protein ugyanolyan natív formában létezik, mint a fertőző vírusban.
Ezzel szemben a formáimnál való inaktiválás jelentős változásokat idéz elő az antigénszerkezetben, ahol azokat az epitópokat is érinti, amelyek a neutralizáló antitesteket kötik meg. Ez a megállapítás az i2 mAt-re [Mandl et al., J. Virol, 63, 564-571 (1989)] - amelynek az epitópját a formalinkezelés elbontja - ugyanúgy vonatkozik, mint az A dómén és a B dómén területén lévő epitópokra [Mandl et al., J. Virol, 63, 564-571 (1989)], amelyek legalábbis korlátozott reaktivitást mutattak. Ez a vizsgálat azt is mutatja, hogy az E* szerkezete egyáltalán nem felel meg a vírus felületén lévő natív E-protein szerkezetének.
Ad b) Savval indukálható konformációváltozások
A TBE-vírus receptorközvetített endocitózis segítségével hatol be a sejtekbe, ahol az endoszómákba kerül, amelyek savanyú pH-ja (<6,4) specifikus konformációváltozást indukál. Ez a konformációváltozás szükséges a vírusmembránnak az endoszómamembránnal való fúziójához, azaz a vírus fertőzőképességéhez. Ezek a szerkezeti változások az egyes mAt-ek reaktivi9
HU 219 503 Β tásának a változásával nyomon követhetők [Heinz et al., Virology, 198, 109-117 (1994)] és többek között az i2 és IC3 (a reaktivitás erős csökkenése), illetve C6 (megerősödött reaktivitás) epitópokat érintik, azonban a B3 epitópot nem.
Ezek a változások az E-protein funkciójára nézve lényegesek. Savanyú pH-ra a leírt módon való reagálási képesség azért ugyancsak kritériuma annak, hogy vajon az E-protein natív, a fertőző vírusnak megfelelő formában van-e. Trietanol-amin pufferes (pH 8,0) rSP-, rE*- és fertőzővírus-készítményeket 0,05 M mES, 0,1 M nátriumklorid és 0,1% marhaszérumalbumin-tartalmú pufferrel kevertünk úgy, hogy a pH-érték 6,0-ra változzon, majd az elegyeket 10 percig 37 °C-on inkubáltuk, és ezután a pH-t újból 8,0-ra állítottuk be trietanol-amin segítségével. A készítmények reaktivitását a savanyú pH-η való inkubálás előtt és után 83, i2, IC3 és C6 mAt-ekkel 4 rétegű ELISA-tesztben analizáltuk az „Antigénszerkezet” fejezetben leírtak szerint. Az eredményeket a 12. és
13. ábrán ábrázoltuk, amelyekből kitűnik, hogy a savanyú pH az rSP-k E-proteinjében ugyanolyan szerkezeti változásokat okoz, mint a fertőző vírusban (lásd a 12. ábrát), azonban ugyanez az analízis az rE*-nál hasonló átrendeződésre nem utal (lásd a 13. ábrát).
Ad c) Specifikus hemagglutinációs aktivitás
Az FSME-vírus egyik jellemző tulajdonsága, hogy meghatározott körülmények között a liba-vörösvérsejteket agglutinálja (hemagglutinációs aktivitás). A vírus ezen tulajdonságát az E-protein közvetíti, és ez további indikátora annak, hogy ez a protein egy natív, működőképes szerkezettel rendelkezik. A hemagglutinációs vizsgálatokat Clarké és Casals [amer. J. Trop. Med. Hyg., 7, 561-573 (1958)] módszerével végeztük, libavörösvérsejtek használatával, pH 6,4 mellett.
Fertőzővírus-, formalin-inaktivált vírus-, rSP- és rE*készítményeket 5 pg/ml - ELISA-val meghatározott antigéntartalomra állítottunk be, és elvégeztük a készítmények hemagglutinációs analízisét. Az eredményt a 3. táblázat tartalmazza. Ebből látható, hogy az rSP hemagglutinációs aktivitása azonos a fertőző víruséval, és hogy ezen E-protein által közvetített aktivitás a formalin-inaktiválás következtében majdnem teljesen elvész. Az rE*készítménynek nincs mérhető HA-aktivitása.
3. táblázat HA-aktivitás
Készítmény HA-titer
Fertőző vírus 512
Formalin-inaktivált vírus 4
rSP 512
rE* <2
3. példa
Immunogenitás egerekben
Az alábbi antigénkészítmények immunogenitását egerek immunizálásával vizsgáltuk:
- formalin-inaktivált tisztított vírus
-rSP
-rE*
Az E-protein-tartalmat enzim immunassay-vel állapítottuk meg [Heinz et al, 7. Bioi. Stand., 14, 133-141 (1986)], és minden készítményt 5 pg/ml antigén-koncentrációra állítottunk be. Az akkor alkalmazott TBEvakcinának megfelelően (FSME-ImmunR) 0,1% humán albumint tartalmazó PBS-t (pH 7,4) használtunk hígitópufferként, és 0,2% alumínium-hidroxid-adjuvánst adtunk hozzá.
Az rSP és rE* immunogenitását adjuváns hozzáadása nélkül teszteltük.
Immunizálási művelet
Mindegyik készítménnyel 10-10 15 g-os Swiss albínó egérből (5 nőstény és 5 hím) álló csoportot oltottunk kétszer szubkután, 14 nap időközt hagyva, egerenként és oltásonként 0,2 ml antigén alkalmazásával. A második immunizáló oltás után egy héttel vért vettünk, és minden egeret 500 LD50 egér-patogén TBEvírus törzzsel (Hypr) felülfertőztünk (challenge teszt). Az egereken ezután 14 napon át figyeltük az elhulláshoz vezető encephalitis fellépését.
Egy tízes csoportbál - amelyben ugyanazon immunogénnel immunizáltunk - minden egyes egér szérumából aliquot mennyiségeket pooloztunk, és a TBE-specifikus antitesttartalmat enzim immunassay-vel (ELISA) hemagglutináció gátlási tesztben (HGT) és neutralizációs tesztben (NT) analizáltuk.
Az ELISA-vizsgálatban antigénként tisztított TBEvírust használtunk, és a vizsgálatot Heinz és munkatársai [J. Gén. Virol, 65, 1921-1929 (1984)] leírása szerint végeztük el. A hemagglutináció gátlási vizsgálatot Clarké és Casals [Amer. J. Trop. Med. Hyg, 7, 561-573 (1958)] szerint végeztük, és liba-vörösvérsejteket használtunk 6,4 vég-pH mellett. A neutralizációs vizsgálatban BHK-2 sejteket és 500 fertőzőegység víruskoncentrációt használtunk.
Az immunizálási kísérlet eredményét a 4. táblázatban foglaljuk össze. Ebből kitűnik, hogy rSP akár adjuváns nélkül, akár adjuvánssal minden egeret ugyanúgy megvédett a halálos adagú TBE-vírustól, mint a formáimnál inaktivált teljes vírus. Ezzel szemben az rE*-gal végzett immunizálás után védőhatás egyáltalán nem (adjuváns nélkül) vagy csak minimális (adjuvánssal) volt megfigyelhető.
Ami az antitest-indukciót illeti, az rSP-készítmények még a formáimnál inaktivált vírust is felülmúlták, különösen jelentősen alumínium-hidroxid-adjuváns használatánál. Ez az ELISA-tesztben kimutatott víruskötő antitestre is vonatkozott, valamint a - védő immunválasz szempontjából még jelentősebb - hemagglutináció gátlási és neutralizációs vizsgálatban mért antitestre is, amelyek a vírusspecifikus funkciót (hemagglutináció, illetve fertőzőképesség) is blokkolják.
A nem létező, illetve csekély védőhatással összhangban az rE*-antitest indukciója is nagyon alacsony volt vagy nem volt kimutatható.
Látható tehát, hogy az rSP-k kiemelkedően jó immunogének, amelyek az egyébként halálos kimenetelű encephalitis-től védenek, és a funkcionális, vírusneutralizáló antitestek indukciója vonatkozásában akár a formalininaktivált teljes vírust is felülmúlják.
HU 219 503 Β
4. táblázat
Egerek immunizálása
Challenge-teszt Túlélők száma per összes egér (=10) Antitesttiter
ELISA HGT NT
F ormalininakti vált vírus+adjuváns 10/10 10 000 40 20-40
rSP adjuváns nélkül 10/10 12 000 80-160 40-80
rSP+adjuváns 10/10 30 000 160 160
rE* adjuváns nélkül 0/10 100 <10 <10
rE* adjuváns 10/10 4 000 <10 <10-10
Pufferkontroll 0/10 neg <10 <10
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Tick-Bome encephalitis vírus- (TBE-vírus-) fér- 20 tőzések elleni immunizálásra alkalmas, nem fertőző szubvirális partikulákból álló vakcinák, amelyek lényegében az E-proteint teljes, natív formájában és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattuk. 25
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti vakcinák, amelyekben az E-protein és adott esetben a prM/M protein rekombináns proteinek.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti vakcinák, amelyekben a rekombináns E-proteint az európai vagy távol-keleti 30 TBE-vírus szubtípusokból származtattuk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcinák, amelyekben a nem fertőző partikulák előnyösen vezikuláris formájú lipidkomponenst is tartalmaznak.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vakéi- 35 nák, amelyekben a nem fertőző partikulák lényegében mentesek PCR-rel kimutatható, PBE-vírusból levezetett nukleinsavaktól.
  6. 6. Eljárás TBE-vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy 40
    - egy olyan sejttenyésztő rendszert állítunk elő, amely a TBE-vírusból levezetett prM- és E-protein kódolószekvenciáit tartalmazza,
    - az E-proteint a maga teljes, natív formájában fejezzük ki, amikor is 45
    - szubvirális, nem fertőző partikulákat képezünk, amelyek a rekombináns E-proteint lényegében teljes, natív formában és adott esetben a rekombináns prM/M proteint tartalmazzák, és
    - a partikulákat összegyűjtjük, és immunizálásra al- 50 kalmas összetétellé feldolgozzuk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan sejttenyésztő rendszert állítunk elő, amely a TBE-vírusból származtatott prM- és E-protein kódolószekvenciáit kromoszómába integrált formában tartalmazza.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyésztő rendszerben virális vektorokat alkalmazunk.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyésztő rendszerben vírusmentesen dolgozunk.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidvektort alkalmazunk.
  11. 11. A 6-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proteinek kifejeződése és a partikulák képződése folyamatosan megy végbe.
  12. 12. Nem fertőző szubvirális partikulák - amelyek lényegében az E-protein teljes natív formáját és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattuk - felhasználása TBE-vírus-fertózések elleni aktív immunizálásra alkalmas vakcina előállítására.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti felhasználás, azzaljellemezve, hogy az E-protein és adott esetben a prM/M protein rekombináns proteinek.
  14. 14. Nem fertőző szubvirális partikulák - amelyek lényegében az E-protein teljes natív formáját és adott esetben a prM/M proteint tartalmazzák, amely proteineket a TBE-vírusból származtattuk - felhasználása antiTBE-vírus immunglobulin készítmény előállítására.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti felhasználás, azzaljellemezve, hogy az E-protein és adott esetben a prM/M protein rekombináns proteinek.
HU9501832A 1994-07-08 1995-06-21 Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására HU219503B (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9903233A HU224199B1 (hu) 1994-07-08 1995-06-21 Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0135294A AT402897B (de) 1994-07-08 1994-07-08 Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung
AT0087195A AT405607B (de) 1995-05-23 1995-05-23 Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9501832D0 HU9501832D0 (en) 1995-08-28
HUT72395A HUT72395A (en) 1996-04-29
HU219503B true HU219503B (hu) 2001-04-28

Family

ID=25594155

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9501832A HU219503B (hu) 1994-07-08 1995-06-21 Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására
HU9903233A HU224199B1 (hu) 1994-07-08 1995-06-21 Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9903233A HU224199B1 (hu) 1994-07-08 1995-06-21 Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina

Country Status (9)

Country Link
EP (2) EP0869184B1 (hu)
AT (2) ATE198909T1 (hu)
CZ (1) CZ282927B6 (hu)
DE (2) DE59509667D1 (hu)
DK (2) DK0869184T3 (hu)
ES (2) ES2165109T3 (hu)
FI (2) FI117974B (hu)
HU (2) HU219503B (hu)
RU (1) RU2150294C1 (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69833388D1 (de) * 1997-11-20 2006-04-13 Us Army Medical Res Materiel C Dna impfstoffe gegen zecken-flavivieren
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
EP1572941A4 (en) * 2002-02-26 2009-03-18 Maxygen Inc NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES
CA2591665C (en) 2004-12-20 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
US8052974B2 (en) 2005-05-12 2011-11-08 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
US8211431B2 (en) 2006-06-06 2012-07-03 Crucell Holland B.V. Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof
WO2010008411A1 (en) 2007-11-09 2010-01-21 The Salk Institute For Biological Studies Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2074422T3 (es) * 1987-03-20 1995-09-16 Immuno Ag Moleculas de adn y arn del subtipo accidental del virus fsma, polipeptidos, que son codificados por estas moleculas, y su uso.
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
WO1992003161A1 (en) 1990-08-27 1992-03-05 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Flavivirus envelope proteins with increased immunogenicity for use in immunization against virus infection
DK0584348T3 (da) 1992-03-11 2005-09-19 Powderject Vaccines Inc Genetisk vaccine mod immundefektvirusser

Also Published As

Publication number Publication date
DK0869184T3 (da) 2001-12-17
HU9903233D0 (en) 1999-11-29
FI953371A0 (fi) 1995-07-07
CZ176995A3 (en) 1996-01-17
EP0869184A3 (de) 1999-05-12
DK0691404T3 (da) 2001-03-19
RU2150294C1 (ru) 2000-06-10
DE59509667D1 (de) 2001-11-08
EP0691404B1 (de) 2001-01-24
EP0869184B1 (de) 2001-10-04
HU9501832D0 (en) 1995-08-28
CZ282927B6 (cs) 1997-11-12
FI117974B (fi) 2007-05-15
ES2165109T3 (es) 2002-03-01
ATE198909T1 (de) 2001-02-15
HU224199B1 (hu) 2005-06-28
FI20070041A (fi) 2007-01-17
ES2155510T3 (es) 2001-05-16
EP0691404A2 (de) 1996-01-10
FI118222B (fi) 2007-08-31
FI953371A (fi) 1996-01-09
ATE206459T1 (de) 2001-10-15
EP0869184A2 (de) 1998-10-07
HUT72395A (en) 1996-04-29
DE59508988D1 (de) 2001-03-01
EP0691404A3 (de) 1997-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019285048B2 (en) Nanoparticle vaccines with novel structural components
US10548964B2 (en) Antigens and vaccines directed against human enteroviruses
JP2024050973A (ja) SARS-COV-2 mRNAドメインワクチン
JP4504464B2 (ja) キメラフラビウイルスワクチン
Kofler et al. Capsid protein C of tick-borne encephalitis virus tolerates large internal deletions and is a favorable target for attenuation of virulence
US8853379B2 (en) Chimeric poly peptides and the therapeutic use thereof against a flaviviridae infection
US20150056244A1 (en) Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses
CN116096409A (zh) 编码稳定化的冠状病毒刺突蛋白的rna复制子
FI118222B (fi) Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin
JPH01501357A (ja) ヒト呼吸器系ウイルス用ワクチン
JP5290576B2 (ja) 修飾されたhiv−1エンベロープタンパク質
JPH05505616A (ja) 天然のコンホメーションを保持している精製gp120組成物
EP0518313A2 (en) Gene of hepatitis C virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same
US5439814A (en) DNA encoding infectious rubella virus
US20090004721A1 (en) Dengue virus mutant strain MBU 01-2002
EP0492920A1 (en) Chimaeric influenza-HIV vaccine
HU222995B1 (hu) Kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Borne Encephalitis/TBE) vírus fertőző cDNS-klónja, ebből készült rekombináns oltóanyag és eljárás előállítására
TW202217000A (zh) Sars—cov—2 mrna結構域疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees