FI117974B - Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents
Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI117974B FI117974B FI953371A FI953371A FI117974B FI 117974 B FI117974 B FI 117974B FI 953371 A FI953371 A FI 953371A FI 953371 A FI953371 A FI 953371A FI 117974 B FI117974 B FI 117974B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- virus
- proteins
- prm
- tbe
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 39
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims description 38
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 90
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 69
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 claims description 60
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 31
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 25
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 241000036848 Porzana carolina Species 0.000 claims 1
- 101710166632 Pre-core protein X Proteins 0.000 claims 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 10
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 5
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000031091 Synodontis clarias Species 0.000 description 3
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000132179 Eurotium medium Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- -1 Nucleotide Amino Acid Chemical class 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
117974
Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi - Förbättrat vaccin för immunisering mot TBE-virusinfektioner och förfarande för dess framställning 5
Keksintö koskee parannettua rokotetta, joka immunisoi TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmää sen valmistamiseksi.
10 TBE (Tick-Borne-Encephalitis)-virus on endeeminen monessa Euroopan maissa, entisessä Neuvostoliitossa ja Kiinassa.
Sairaus muodostaa merkittävän ongelman yleisen terveyden kannalta eräissä Keski-Euroopan maissa, kuten Itävallassa,
Tsekissä, Slovakiassa, Sloveniassa ja Unkarissa, joissa 15 joka vuosi rekisteröidään useita satoja sairaalatapauksia (WHO: EURO Reports and Studies, 104, 1983).
TBE-virus, josta on olemassa läntinen, eurooppalainen, ja kaukoidän alatyyppi, kuuluu Flavivirussukuun, jotka viruk- « 20 set ovat pallomaisia lipidivaippaisia RNA-viruksia (Monath, T.P.: Flaviviruses. In: Fields, B.N. (ed.) Virology, Raven Press, N.Y. 1990, s. 763-814).
Flavivirusvirioni koostuu yleensä nukleokapsidista, joka 25 sisältää positiivisäikeisen-RNA-genomin liitettynä viraa- • · : 1 2 3.· liseen kapsidi-(C)-proteiiniin. Nukleokapsidia ympäröi *·1: lipidivaippa, joka sisältää membraaniin assosioidut pro- ·1·1; teiinit E (50-60 kD) ja M (7-8 kD) (Heinz ja Roehrig in: » · ; van Regenmortel ja Neurath (ed.) "Immunochemstry of Viruses * 1 · · 30 II. The Basis for Seradiagnosis and Vaccines. Elsevier • · 1
Sciences, Amsterdam (1990), 289-305).
♦ • · · 2 ·“/ Pääasiallisesti vaippaproteiini E:llä on keskeinen merkitys * · 1 3
Flavivirusten biologiassa, koska se välittää tärkeitä * 35 viraalisia sisääntunkeutumisfunktioita ja laukaisee isän- j1"; nässä suojaavan immuunivasteen. On jo olemassa huomattava • · .1 , määrä tietoa koskien TBE-viruksen vaippaproteiini E:n t 1 1 *1· rakennetta ja on ehdotettu rakennemalli lukuisiin bio- • · · · · * 1 kemiallisiin ja immunologisiin tietoihin perustuen (Mandi 117974 2 et ai., J. Virol. 63 (1989), 564-571).
Sairaus voidaan tehokkaasti estää rokottamalla erittäin puhtaalla formaliinilla inaktivoidulla kokovirusrokotteella 5 (Kunz et ai., J. Med. Virol. 6 (1980), 103-109), joka indusoi immuunivasteen viruksen rakenneproteiinia vastaan (Kunz, Ch. Acta leidensia 60 No.2, 1-14, 1992). Tämä rokote on osoittautunut hyväksi, mutta valmistusprosessin aikana suuria määriä infektoivia ja potentiaalisesti vaarallisia 10 virussuspensioita täytyy kuitenkin käsitellä. Siten tarvitaan laajat ja kalliit turvallisuustoimenpiteet.
Virusta neutraloivien vasta-aineiden toimintakyky riippuu siitä, miten tehokkaasti ne tunnistavat viruksen pinnassa 15 olevien proteiinien natiivit rakenteet. TBE-virusten ja muiden Flavivirusten tapauksessa on tällöin kyse erityisesti proteiini E:stä (Heinz ja Mandi, APMIS, 101 (1994), 735-745). immunisoimalla indusoitujen mahdollisimman tehokkaasti vaikuttavien vasta-aineiden saamiseksi on siten toivot-20 tavaa, että rokote sisältää tätä proteiinia samanmuotoisena kuin se on infektoivan viruksen pinnassa. Kokoviruskuollut-rokotteiden haittana on, että pakollinen inaktivointimene-telmä saattaa johtaa osittain muutettuun proteiinirakentee- • · seen verrattuna natiiviin muotoon.
: ’·’ 25 • · ·* Rekombinantti-DNA-tekniikka tarjoaa mahdollisuuden korvata ·» · : kokoviruskuollutrokotteet rekombinanttiproteiineilla, jotka • · *.· * sisältävät immuunivastetta indusoivien proteiinien olennai- ♦ · · ί set osat. Yksittäisten virusproteiinien geeniteknisen 30 ilmentämisen avulla ei ole varmaa, että näin muodostuneiden I rekombinanttiproteiinien antigeenirakenne vastaa jokaista • · · · vastaavaa proteiinia viruksen pinnassa.
• t · • · * • · · *' * TBE-virusten rekombinanttipintaproteiinien ilmentäminen • * · 35 tunnetaan esimerkiksi julkaisusta Allison et ai., Gemein-same Jahrestagung ÖBG-ÖGGT (1993) P114. Tästä käy ilmi, • · että ilmennettäessä vakio-olosuhteissa proteiini E ja * · 117974 3 proteiini M erittyvät erimuotoisina mm. myös ei-infektoi-vina subviraalisina partikkeleina.
Tällaisia subviraalisia partikkeleita tunnetaan TBE-5 virusten kaukaisissa sukulaisissa, nimittäin Japanin Encephalitisviruksessa (JEV), keltakuumeviruksessa ja Dengue-viruksessa (Konishi et ai., Virology 188 (1992), 714-720 tai W0 92/03545).
10 Konishi et ai. ovat tosin esittäneet, että tällaiset subviraaliset partikkelit, jotka on emulsifioitu Freudin täydellisellä adjuvantilla ja sisältävät koko proteiini E:n, aikaansaavat tietyn immuunivasteen hiirissä. Toisaalta osoitettiin, että C-terminaalista osittain lyhennetyllä 15 proteiini E:llä voidaan aikaansaada huomattavasti tehokkaampi suoja Flaviviruksen infektiota vastaan kuin koko proteiini E:n avulla (W0 92/03161).
Esillä olevan keksinnön tehtävänä on tarjota käytettäväksi 20 parannettua rokotetta TBE-infektioita vastaan.
Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti rokotteen , avulla, joka immunisoi Tick-Borne-Encephalitis-virus (TBE- • · ,, virus) -infektioita vastaan, ja joka käsittää ei-infektoi- • · ·’* 25 vaa subviraalista partikkelia, joka olennaisesti sisältää * · täydellisessä, natiivissa muodossa olevaa proteiini E:tä ja : *.· mahdollisesti proteiini prM/M:ää, jotka proteiinit on joh- ♦ * $.· · dettu TBE-viruksesta. Olennaista on tällöin, että proteiini : : J E on täydellisessä, natiivissa muodossaan, koska ainoastaan 30 silloin voidaan aikaansaada tehokas suoja. Keksinnön mukai- j sessa rokotteessa voitiin vahvistaa proteiini E:n natiivi- • · · · ,·;·. muoto erilaisten analyysien avulla, nimittäin • · · a) antigeenirakenteen analyysi käyttämällä mono- f i * V * klonaalisia vasta-aineita, • * · ·...· 35 b) kyky happoindusoituihin konformaatiomuutoksiin .·. : ja • ·· • · c) hemagglutlnaatioaktiivisuus '4 117974
Tosiasia, että keksinnön mukainen rokote ei koostumuksensa johdosta voi olla infektoiva, on tärkeä näkökohta rokotteen turvallisuuden kannalta verrattuna tunnettuihin rokotteisiin.
5
Proteiini E ja mahdollinen proteiini prM/M ovat edullisesti rekombinanttiproteiineja.
Erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan proteiini E on 10 johdettu TBE-viruksesta, jolloin - käyttöalueen mukaan -käytetään sekä läntistä (eurooppalaista) että kaukoidän alatyyppiä. Rokote käsittää edullisesti myös lipidikom-ponentin, joka edullisesti on vesikulaarisessa muodossa.
15 On osoittautunut - vastoin ammattimaailman käsitystä - että TBE-viruksesta johdettu rekombinanttiproteiini E voi tarjota riittävän immunisoinnin infektioita vastaan ainoastaan tämän ei-infektoivan subviraalisen partikkelin muodossa. Osittain lyhennettyä proteiini E-muotoa, josta, kuten 20 julkaisussa W0 92/03161 on kuvattu, C-terminaalinen memb-raaniankkuri on poistettu, ei voida käyttää tehokkaan rokotteen valmistamiseksi. Keksinnön mukainen rokote sisäl-tää edullisesti ei-infektoivia partikkeleita, jotka olen- • · naisesti ovat vapaita PCR:n avulla havaittavissa olevista * * •t ” 25 TBE-viruksesta peräisin olevista nukleiinihapoista. Tämä on • · ·* esimerkiksi osoitettavissa menetelmillä, joita on kuvannut »· * i *.* Konishi et ai.
» * * · · I » · » · t ·
Toisen näkökohdan mukaan keksintö koskee menetelmää TBE-30 rokotteen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että Ϊ - tarjotaan käyttöön soluviljelyjärjestelmä, joka t * · · sisältää proteiinien prM ja E koodaussekvenssit, • * · *· jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta, ·.’· ‘ - proteiini E ilmennetään täydellisessä, natiivissa ··· *...· 35 muodossaan, jolloin : - muodostuu subviraalisia ei-infektoivia partikke- • · · ♦ · tt<>; leita, jotka olennaisesti sisältävät rekombi- 5 1 1 7974 nanttiproteiini E:tä täydellisessä, natiivissa muodossaan ja mahdollisesti rekombinanttiproteiini prM/M:ää ja - partikkelit kerätään ja niitä käytetään suoraan 5 immunisointiin tarkoitetun koostumuksen valmista miseksi.
Keksinnön mukaisen menetelmän suuri etu on, ettei virusten inaktivointivaihe, esimerkiksi formaliinilla, ole välttämä-10 tön, mikä toisaalta huomattavasti parantaa rokotteen laatua (proteiini E on natiivimuodossa eikä formaliinikäsittelyssä muutetussa ainakin osittain denaturoidussa muodossa) ja toisaalta tämän rokotteen valmistus yksinkertaistuu selvästi teknisesti, koska partikkeleita voidaan suoraan käyttää 15 (siis ilman formaliinikäsittelyä) farmaseuttisen valmisteen tuottamiseksi.
Erityisen edullista menetelmän toteuttamisessa on, että käytetään soluviljelyjärjestelmää, joka sisältää rekombi-20 nanttiproteiinien prM ja E koodaussekvenssit TBE-viruksesta kromosomaalisesti integroidussa muodossa.
. On kuitenkin olemassa myös keksinnön mukaisten partikkelei- den valmistukseen tarkoitettuja soluviljelyjärjestelmiä, * f * I1 2 3 25 joissa käytetään viraalisia vektoreita, tai soluviljelyjär- 1 jestelmiä, joissa työskennellään ilman virusta, esimerkiksi *» · i plasmidivektorin avulla.
* » · * 1 · • · » · ι]ί I Menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaan sekä proteiinien 30 ilmentäminen että partikkeleiden muodostuminen tapahtuvat I jatkuvasti.
» 1 » J
4 '1 · - » 1 * · · * 1 ·
Toisen näkökohdan mukaan keksintö käsittää ei-infektoivien 2 4·· 4 « · * subviraalisten partikkeleiden käyttämisen rokotteen valmis- 3 35 tamiseksi aktiiviseen immunisointiin TBE-virusinfektioita ♦ .•• I vastaan, jotka partikkelit olennaisesti sisältävät täydel- * · ,,,.1 lisessä, natiivissa muodossa olevaa proteiini Eitä ja * · 117974 6 mahdollisesti proteiini prM/M:ää, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta.
Tällöin proteiini E ja mahdollinen proteiini prM/M ovat 5 edullisesti rekombinanttiproteiineja.
Keksintö käsittää edelleen ei-infektoivien subviraalisten partikkeleiden lääkinnällisen käyttämisen, erityisesti anti-TBE-virusimmunoglobuliinia sisältävien valmisteiden 10 tuottamiseksi, jotka partikkelit olennaisesti sisältävät täydellisessä, natiivissa muodossa olevaa proteiini E:tä ja mahdollisesti proteiini prM/M:ää, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta. Myös tällöin on edullista, jos proteiini E ja mahdollinen proteiini prM/M ovat rekombinantti-15 proteiineja.
Huomattiin yllättäen, että nukleiinihappoa, joka käsittää mainittuja koodaussekvenssejä, voidaan käyttää sellaisenaan immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan.
20
Tekniikan tason mukaan tiedetään, että paljaan DNA:n vieminen hiiriin voi aikaansaada immuunivasteen. Esimerkiksi . hiiret pystyivät tuottamaan vasta-aineita ihmisen kasvu- ««·· • · ,, hormonia (hGH) vastaan, kun hiiriin oli injisoitu plasmidi, « · '' ’* 25 joka sisälsi hGH:n genomikopion (Nature 356 (1992), 152- V 154). * ·· I m « * i ♦ * * t * !.·j On edelleen kuvattu muutamia onnistuneita "geneettisiä li l immunisointeja" paljaan DNA:n avulla. Tässä geneettisessä 30 immunisoinnissa annettiin DNA:ta, joka koodaa yhtä tai i useampaa virusantigeeniä, jolloin vastaavat virusantigeenit ( »· « syntetisoituivat in vivo, jotka virusantigeenit jokainen » · • erikseen saivat aikaan immuunivasteen ja voivat siten sen > i*· ^ * * f ' jälkeen suojata virusinfektioita vastaan. Onnistuneen • s * 35 suojaavan immuniteetin aikaansaanti hiirissä injektoimalla * ,*. ί lihaksensisäisesti influenssaviruksen DNA:ta on kuvattu
f M
julkaisussa PNAS 91 (1994), s. 9519-9523 (Raz et ai.).
P f .
117974 7
Julkaisussa Vaccine 12 (16), (1994), s. 1503-1509 (Davis et ai.) on myös kuvattu onnistunut rottien ja hiirien immunisointi hepatiitti B-viruksen (HBV)-pinta-antigeenia vastaan injektoimalla lihaksensisäisesti plasmidi-DNA:ta, joka 5 sisältää HBV-pinta-antigeeniä koodaavan sekvenssin. Monet yritykset immunisoida paljaalla patogeenistä antigeeniä koodaavalla DNA:11a eivät kuitenkaan onnistuneet. On esimerkiksi kuvattu (W0 93/17706) immunisointikokeita HIV:iä vastaan suoran DNA-siirron avulla kehon soluihin; onnistu-10 nutta rokotetta ei kuitenkaan tällä menetelmällä ole vielä saatu aikaan. Vaikuttaa erityisesti siltä, että puhtaan DNA-rokotteen onnistuneen immunisoivan vaikutuksen aikaansaamiseksi on erityisen edullista - DNA:n soluun viemisen ohella - että immuunivastetta aikaansaava antigeeni esiin-15 tyy immuunijärjestelmässä natiivimuodossaan. Natiivin muodon tai natiivin muodon ja rakenteen muodostamiseksi vaadittavan biosynteettisen muodon täsmällinen rakenne tunnetaan vain harvoille patogeeneille, joten tehokas immunisointi paljaan nukleiinihapon avulla osoittautuu 20 monessa tapauksessa erittäin vaikeaksi, ellei - johtuen puuttuvista täsmällisistä tiedoista antigeenirakenteesta -jopa mahdottomaksi nykyisen tiedon valossa.
• • · · · ' Esillä olevan keksinnön puitteissa ilmeni, että immuni- * · ' ** 25 sointi nukleiinihapposekvenssin avulla, joka koodaa ainoas- • .* taan olennaisen immuunivasteen TBE-infektioissa aikaan- · » • *.· saavaa proteiini E:tä, ei riitä suojaavan immuunivasteen • · : : ; aikaansaamiseksi sairautta vastaan.
·*· · • ·* • · · • · · 30 Yllättäen voitiin aikaansaada onnistunut immuunivaste ; .·. ainoastaan antamalla nukleiinihapposekvenssiä, joka » · * ...^ käsittää täydellisessä, natiivissa muodossaan olevan • ♦ ♦ proteiini E:n koodaussekvenssin ohella myös proteiini • · · ·.* * prM/M:n koodaussekvenssin. Osoittautui lisäksi, ettei • · t 35 onnistunutta immunisointia voitu saada aikaan myöskään .·* : nukleiinihapolla, joka sisältää proteiini E:n koodaus- * · * \ sekvenssin, jossa proteiini E:n ankkurialue on deletoitu.
• •M
• « 8 117974
Esillä oleva keksintö koskee siten edelleen rokotetta immunisointiin tick-borne-encephalitis-viruksen (TBE-viruksen) infektioita vastaan, käsittäen nukleiinihapon, joka koodaa proteiini E:n ja proteiini prM/M:n, jotka on 5 johdettu TBE-viruksesta ja jotka vähintään ovat olennaisesti täydellisessä, natiivissa muodossaan.
Esillä olevan keksinnön avulla pystyttiin ensimmäistä kertaa osoittamaan nukleiinihappoimmunisoinnin yleisesti 10 Flaviviruksia vastaan. Keksinnön mukainen immunisointi- järjestelmä on siten periaatteessa käyttökelpoinen ei ainoastaan immunisointiin TBE-virusta vastaan, vaan -johtuen kaikkien Flavivirusten suuresta homologiasta koskien proteiini Että ja prM/M:ää (Chambers et ai., Annual 15 Review of Microbiology, Voi. 44, (1990), s. 649-688: Flavi-virus Genome Organisation, Expression and Replication) -yleisesti immunisointiin Flavivirusten infektioita vastaan.
TBE-virusta vastaan immunisoivalle nukleiinihapporokot-20 teelle on olennaista, että proteiini E koodautuu olennaisesti täydellisessä, natiivissa muodossaan nukleiinihaposta. Luonnollisesti esillä olevaan keksintöön kuuluvat myös nukleiinihapporokotteet, joissa esiintyy geneettisen koodin degeneraatiota, joissa ei-rakenteellisesti tärkeitä amino- • · : ·* 25 happokodoneja vaihtuu ja joissa on luonnollisia tai labora- • · •*.· toriossa aikaansaatuja mutaatioita, edellyttäen, että pro- ·· · tteiini E:n koodaussekvenssin nukleiinihappomodifikaatiot : pystyvät aikaansaamaan onnistuneen immuunivasteen. Keksin- ««· · ;*·*; nön piiriin kuuluvat myös rokotteet, joissa on nukleiini- 30 happoja, joissa on deleetioita tai insertioita proteiini j ,·, E:n koodaussekvenssissä, jotka säilyttävät proteiini E:n • · · immunisointiin vaadittavan rakenteen antigeenisen epi- • · * *. tooppialueen olennaisesti muuttumattomana, kunhan nämä l(t V * modifikaatiot voidaan pitää johdettuna TBE-viruksen 35 sekvenssistä. Vastaavaa koskee luonnollisesti myös pro-f*\ i teiini prM/M:n koodaussekvenssiä. Proteiini prM/M on tärkeä • i» ! subviraalisen partikkelin luotettavan muodostumisen ja • « 117974 9 erittymisen kannalta, jolloin sekvenssipoikkeamat koskien proteiini prM/M:ää eivät ole niin ratkaisevia kuin koskien proteiini E:tä, kunhan vain partikkeleiden onnistunut kokoaminen voidaan taata. Nukleiinihapon luonne ei ole 5 olennainen keksinnön kannalta. Sekä RNArta että DNA:ta voidaan yhtä hyvin käyttää monella käyttöalueella, jolloin DNA paremman stabiilisuutensa johdosta on edullisempi kuin RNA. Nukleiinihappo voidaan valmistaa joko biologisesti tai kemiallisen synteesin avulla.
10
Proteiini E:ta koodaava nukleiinihappo on edullisesti johdettu TBE-viruksen eurooppalaisesta tai kaukoidän alatyypistä, koska nämä ovat erityisen laajasti esiintyviä alatyyppejä.
15
Erityisen edullisia nukleiinihapporokotteita ovat sellaiset, joissa nukleiinihappo on plasmidivektori.
Erityisen, sopiviksi ovat osoittautuneet ne plasmidi-vektorit, joissa on tehokkaita promoottoreita, kuten 20 esimerkiksi HSV-, RSV-, EBV-, β-aktiini-, Adeno-, MMTV-, hsp- ja hGH-promoottori. Tehokkaat promoottorit mahdollistavat tehokkaan geeniekspression.
• · « * * » .. Sopivimpia vektoreita tai promoottoreita ovat plasmidista • * · t ' •# 25 pCMVB (MacGregor et ai.) johdettuja plasmideja, joissa on • * ' CMV-"Immediate Early"-promoottori.
• · · • · · • * • « t · ·.* : Luonnollisesti keksinnön mukaisten nukleiinihapporokottei- • · · : den nukleiinihapot voivat käsittää myös muita koodaavia tai 30 ei-koodaavia sekvenssejä, erityisesti jos nukleiinihappona t ·*· käytetään nukleiinihappovektoria.
*··· • · * * * · • Esimerkkeinä muista sekvensseistä - promoottoreiden ohella • * · *·* * - mainitaan vielä markkerigeeni, muita transkription, • · · ^ .
35 translaation ja posttranslaatiomodifikaation ym. säätäjiä.
Näiden monimutkaisempien nukleiinihapporakenteiden suhteen * · on kuitenkin aina huomioitava, että siinä yhteydessä kun • · 117974 10 nukleiinihappo viedään kohdesoluun ei infektoivaa virusta voi muodostua nukleiinihapon translaation avulla, eli että rokote on "kuollutrokote" ja pysyy sellaisena.
5 Keksinnön mukainen nukleiinihapporokote voi yksinkertaisimmassa muodossaan sisältää "paljaan” nukleiinihapon, mahdollisesti sopivassa puskurissa. Voi tietenkin esiintyä myös muita aineosia, kuten lääkeaineteknisiä lisäaineita, kantaja-aineita tai erityisiä antotapaan liittyviä aineita.
10
Keksinnön mukaisia nukleiinihapporokotteita annetaan edullisesti injektiona, erityisesti lihaksensisäisesti, ihonsisäisesti tai ihonalaisesti, mutta sitä voidaan antaa myös suun kautta.
15
Annettu määrä keksinnön mukaista nukleiinihapporokotetta on riippuvainen antomuodosta ja käytetystä adjutantista. Saman suojaavan immuunivasteen aikaansaamiseksi tarvitaan yleensä suurempi annos lihaksensisäisesti kuin ihonalaisesti. Edul-20 linen määrä on alueella 0,01 ng - 10 mg/annos, yleensä edullisesti alueella 1 ng - 1 mg/annos.
. Keksinnön mukaisella nukleiinihapporokotteella on se olen- ·ι·ι nainen etu, ettei tarvita soluviljelyjärjestelmää sub- • · • ** 25 viraalisten partikkeleiden valmistamiseksi, vaan partik- * · kelit muodostuvat in vivo ja voivat siten suoraan aikaan- • · » • '.· saada immuunivasteen.
• · f * * • · · • · * *
Keksinnön mukaisella nukleiinihapporokotteella on lisäksi * 30 se etu, että ne, verrattuna proteiinipohjäisiin rokottei- : siin, omaavat suuren stabiilisuuden, erityisesti jos • · * * « « · ,···, nukleiinihappo on DNA. Siten on mahdollista varastoida « i » rokotetta pitkiksi ajoiksi ilman suuria jäähdytyskustan- • · * *.* * nuksia, jolloin aktiivisuuden olennaista alenemista ei ole ·*« ϊ,.,ϊ 35 odotettavissa. Nukleiinihappoa erityisesti lyofilisoidussa ; muodossa voidaan varastoida pilaantumatta jopa huoneen • · · lämpötilassa käytännöllisesti katsottuna rajoittamattomaksi * « '11 117974 ajaksi. Lyofilisoidun keksinnön mukaisen nukleiinihappo-rokotteen rekonstituutio on paljon helpommin toteutettavissa kuin lyofilisoidun proteiiniliuoksen rekonstituutio, joka kokemuksen mukaan usein voi osoittautua ongelmal-5 liseksi proteiinin luonteesta johtuen.
Keksinnön mukaisen nukleiinihapporokotteen etuna on edelleen, verrattuna perinteisiin kuollutrokotteisiin, että immunisoiva antigeeni syntetisoituu in vivo ja johtaa 10 tehokkaan solutason immuunivasteen kehittymiseen (Science voi. 258, 19.3.1993, s. 1591-1692, Research News: Naked DNA Points Way to Vaccines).
Edelleen toisen näkökohdan mukaan keksintö koskee 15 nukleiinihapposekvenssiä, erityisesti nukleiinihappo- vektoreita, käsittäen TBE-viruksesta johdettujen proteiinien E ja prM/M koko koodaussekvenssin, lääkeaineena. Toistaiseksi ei tekniikan tasossa ole mainintaa ainoastakaan onnistuneesta nukleiinihappoimmunisoinnista 20 Flaviviruksen DNA:11a. Näiden nukleiinihappojen (nukleiini- happovektoreiden) lääkinnällinen käyttö muodostaa siten . yllättävän uuden käyttömahdollisuuden. Keksinnössä .. ’ vektorilla ymmärretään mitä tahansa nukleiinihappo- • · I ** vehikkeliä, eli erityisesti plasmideja, viruksia tai • * · ϊ ·* 25 transposoneja.
·· * • · * • · · ♦ · « · ·.· · Tähän asti on kuvattu ainoastaan SV40:stä johdettu plasmi- : divektori, joka sisältää TBE-viruksesta johdettujen pro teiinien prM/M ja E proteiinisekvenssin (Allison et ai., 30 Virus-Genes 8 (3), (1994), s. 187-198). Näiden SV40-plas- .···. midien yhteydessä ei kuitenkaan keskusteltu mahdollisuudes- • · • · « • ta aikaansaada immunisointitehoa.
• * · • · · * * • * »*· *...· Keksinnön mukaiset plasmidivektorit eroavat aikaisemmin « 35 kuvatuista plasmidivektoreista erityisesti, koska ne ovat ....: sopivia immunisointiin. Siten keksinnön mukaiset • · plasmidivektorit esiintyvät erityisesti käyttövalmiina 117974 12 liuoksina tai lyofilisaatteina ruiskuissa tai ampulleissa.
Keksinnön mukaisesti plasmidivektoreina toimii tehokkaita promoottoreita, valittuna ryhmästä CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, 5 β-aktiini-, Adeno-, MMTV-, hsp- ja hGH-promoottori, jolloin erityisesti CMV-"Immediate Early"-promoottori on osoittautunut tehokkaaksi.
Edelleen toisen näkökohdan mukaan esillä oleva keksintö 10 koskee nukleiinihapon, käsittäen TBE-viruksesta johdettujen proteiinien E ja prM/M koko koodaussekvenssin, käyttämistä rokotteen valmistamiseksi.
Keksintöä valaistaan jäljempänä olevien suoritusesimerkkien 15 avulla viittaamalla kuvioihin:
Kuvio 1 on ilmentämisplasmideissa käytettyjen inserttien kaaviomainen esitys. Kuvio 2 on kuviossa 1 esitettyjen rakenteiden ilmentämiseen käytetyn plasmidin pSVB kaaviomainen esitys. Kuviossa 3a, b ja c on kuviossa 1 esitetyn 20 rakenteen SV-PEwt koko nukleotidi- ja aminohapposekvenssi.
Kuviossa 4 on sekä kuviossa 1 esitettyjen rakenteiden avulla transfektoitujen että TBE-viruksen avulla infektoidun , (COS/TBE) Triton X-100:lla solubilisoitujen solulysaattien • · ♦ · \ immunopresipitaatio. Kuvio 5 esittää käyrää, joka osoittaa • · • '* 25 proteiini E:n läsnäoloa 4-kerros-ELlSA:11a määritettynä • · .* kuviossa 1 olevilla rakenteilla transfektoitujen COS- «· · • *.* solujen viljelyalustassa. Kuviossa 6 on SV-PEwt:llä ja SV- • ·
Jil PEst:llä transfektoitujen COS-solujen viljelyalustasta tehty immunopresipitaatio. Kuviossa 7 on COS-soluviljely-30 alustasta tehty sedimentaatioanalyysikäyrä, jolloin COS- • ,·, solut on transfektoitu SV-PEwt:llä tai SV-PEst:llä tai • · t“t-f infektoitu TBE-viruksella. Sedimentaatiosuunta on vasem- ; • * * malta oikealle. Kuviossa 8 on rSP:n (SV-PEwt) sedimentaa- • · # ·.· * tioanalyysi ilman Triton käsittelyä ja 0,5 %:n Triton X-100 ··· 35 käsittelyn jälkeen. Sedimentaatiosuunta on vasemmalta X : oikealle. Kuviossa 9 on kuva puhdistetun TBE-viruksen ja • *· #*X puhdistettujen rSPrien SDS-PAGE-analyysi s ta; Coomassie- « 13 117974
Blue-värjäys. Kuviossa 10 on vertailu COS-solujen rSP:ien ja stabiilista transfektoidun CHO-solulinjan rSPiien välillä. Kuvio 11 esittää 19 proteiini E-spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuutta 4-kerros-5 ELISA:11a TBE-viruksen, formaliinilla inaktivoidun TBE-viruksen, rSP:n ja rE*:n kanssa. Kuvio 12 esittää TBE-viruksen ja rSP:n reaktiivisuuden 4-kerros-ELISA:11a monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja C6 kanssa ilman käsittelyä (pH 8,0) ja käsittelyn jälkeen pH-arvossa 10 6,0. Kuvio 13 esittää pE*:n reaktiivisuuden 4-kerros- ELISA :11a monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja C6 kanssa ilman käsittelyä (pH 8,0) ja käsittelyn jälkeen pH-arvossa 6,0.
15 Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavilla esimerkeillä.
1. Partikkeleiden valmistus
Valmistettiin neljä ilmentämisplasmidia, jotka sisältävät 20 joko proteiini E:n tai proteiini E:n membraaniankkurivapaan muodon pelkästään tai yhdessä prM:n kanssa (kuvio 1).
. Esimerkin näiden plasmidien valmistuksesta on kuvannut
Allison et ai., Virus Genes 8 (3) (1994) s. 187-198.
S···· 25 • * • ♦ ·* Siinä kuvattu lähtöplasmidi pSV8 on esitetty kuviossa 2.
·· · • · · * · • * *.·· Ilmentämiskloonien konstruoimiseksi käytettiin vektorina pSV46. Tämä vektori on SV40:een perustuvan eukaryoottisen 30 ilmentämisvektorin pSV0:n (Clontech) johdannainen, josta on : /. poistettu β-galaktosidaasigeeniä sisältävä insertti .·♦·, (MacGregor G. R. ja Caskey C. T., Nucleic Acids Res 17, • ♦ · 2365, 1989) pilkkomalla restriktioentsyymillä Notl. Osa ·«· *.* * polylinkkeristä, joka sijaitsee translaation lopetuskohdas- ·** 35 ta alavirtaan, poistettiin myös restriktioentsyymeillä Xbal .·. : ja Hindlll, Klenowin täydennyksellä ja ligatoitiin • · · uudelleen.
• * 1 1 7974 14 Tähän vektoriin sisällytettiin PCR-tuotteita, jotka saatiin seuraavalla tavalla:
Synteettisiä oligonukleotidialukkeita käytettiin cDNArn 5 monistamiseen, joka cDNA vastaa joko TBE-viruksen prM+E-aluetta tai ainoastaan E-aluetta. Mandi et ai. (Mandi C.
W., Heinz F. X. ja Kunz C., Virology 166, 197-205, 1988) on tutkinut käytettyjä nukleotidikoordinaatteja, ja ne sisältävät TBE-genomin 20 ensimmäistä nukleotidiä (Mandi C. W., 10 Heinz F. X-, Stockl E. ja Kunz C., Virology 173). 5'-Alukkeet prM+E- ja ainoastaan-E-rakenteille olivat 27-meerejä joiden sekvenssit ovat AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA ja AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Kummankin sekvenssin 11 ensimmäistä nukleotidiä ovat keinotekoisia ja sisältävät 15 restriktioentsyymin NotI tunnistuskohdan (GCGGCCGC) ja sen jälkeen seuraa 16 nukleotidiä pitkä sekvenssi, joka vastaa joko nukleotidejä 388-403 (SV-PE-ketju) tai 883-898 (SV-E-ketju). Luonnossa esiintyvää ATG-kodonia käytettiin molemmissa tapauksissa aloituskodonina sijoitettuna vastaavaan 20 geeniin nähden ylävirtaan, ja aluketta muotoiltiin siten, että ATG on sijoitettu sopivaan ympäristöön (GCCGCCATGG) tehokkaan translaatioinitiaation kannalta COS-soluissa . (Kozak M., Cell 44, 283-292, 1986; Kozak M., J Mol Biol * ·«· r r r r • · ,, 196, 947-950, 1987). Molemmissa rakenteissa käytettiin * ·
\ 25 samaa 28 nukleotidiä pitkää oligonukleotidiä (ATGCGGCCGC
'1 TAGTCATACC ATTCTGAG) 3'-alukkeena. Tämä aluke oli 3'- ; päästään komplementaarinen nukleotideille 2535-2550 ja ; sisälsi 5'-päässään Notl-kohdan ja TAG-lopetuskodonin • * · !t: ! komplementin (CTA) samassa lukukehyksessä.
30 t PCR-monistuminen suoritettiin olennaisesti standardiolo- ·«· · suhteissa Cetus-protokollan mukaisesti (Saiki R. K., f · ·
Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn V * G. T., Mullis K. B. ja Erlich H. A., Science 239, 487-491, • · * 35 1988). Reaktioseokset sisälsivät 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, .*.J pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, joskus 200 μΜ dNTP, 10 ng jokaista aluketta, 10 μΐ cDNA-matriisin 1000-kertaista laimennosta • · 117974 15 ja 3 E AmpliTaq-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus) kokonaistilavuudessa 100 μΐ. Näytteet peitettiin 100 pl:lla parafiiniöljyä Perkin Elmerin termisessä kierrätyslaitteessa.
5 Näytteet pidettiin 6,5 min 94 °C:ssa, sitten jäähdytettiin liittämislämpötilaan 40 °C ennen kuin Taq-polymeraasia lisättiin. Kaikenkaikkiaan suoritettiin 35 monistussykliä.
Jokainen sykli koostui 1,5 minuutista 94 °C:ssa, 3 minuutista 40 °C:ssa ja 7 minuutista 68 °C:ssa. Näytteet puhdis-10 tettiin uuttamalla fenolilla ja kloroformilla, seostamalla etanolilla ja uudelleenliuottamalla steriiliin kahteen kertaan tislattuun veteen. PCR-tuotteiden laatu ja määrä selvitettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja näytteet säilytettiin -20 °C:ssa kunnes niitä käytettiin seuraavassa 15 kloonausvaiheessa.
Polymeraasiketjureaktiota käytettiin cDNA-plasmidikloonien minipankin muodostamiseksi, jotka kloonit sisältävät in-serttejä, jotka vastaavat TBE-virusgenomin joko prM+E-20 aluetta (SV-PE-ketju), nukleotidit 388-2550, tai E-aluetta (SV-E-ketju), nukleotidit 883-2550 (Kuvio 1).
Normaalisti TBE-viruksen rakenneproteiineja tuotetaan suur- • m ,, ten polyproteiiniesiasteiden kotranslaation kautta; nyt • « * #* ' . 25 tuotiin kuitenkin translaation aloitus- ja lopetuskohdat *' PCR-tuotteen päihin sisällyttämällä näitä kohtia oligo- II» ' .* nukleotidialukkeisiin. Jokaiseen rakenteeseen lisättiin • * :,! i luonnollinen ATG-kodoni, joka sijoitettiin sopivaan «it V I ympäristöön, jotta se toimisi initiointikodonina, sisäiseen ' 30 signaalisekvenssiin nähden ylävirtaan, luonnollisen proses- ·’· soinnin mahdollistamiseksi isännän signalaasin avulla ja * · · f oikean erittymistien aikaansaamiseksi. Vastaavalla tavalla f · sijoitettiin TAG-lopetuskodoni jokaiseen rakenteeseen '·’ ’ signalaasi-pilkkomiskohtaan nähden alavirtaan, joka pilkko- • « * s,..· 35 miskohta muodostaa proteiini E:n karboksipään. Päihin * .\4| sisällytettiin myös restriktioentsyymin NotI tunnistus- « « kohdat PCR-tuotteiden seuraavaksi suoritettavan kloonauksen • f 117974 16 helpottamiseksi.
PCR-DNA:t katkaistiin NotI;llä ja ligatoitiin plasmidi-vektorin pSV46 Notl-kloonauskohtaan, mikä mahdollisti sen, 5 että oikein insertoidut geenit ilmentyivät aikaisen SV40-promoottorin ohjauksen alaisena (MacGregor G.R. ja Caskey C. T., Nucleic Acids Res 17, 2365, 1989). Vektori tarjosi myös käyttöön polyadenylointisignaalin tehokasta ilmentämistä varten ja SV40-replikointilähteen rekombinantti-10 plasmidien replikaation mahdollistamiseksi transfektoi- duissa COS-soluissa, jotka konstitutiivisesti ilmentävät suuren SV40-T-antigeenin (Gluzman Y., Cell 23, 175-182, 1981).
15 Ligatointiseosta käytettiin E. colin HB 101 transformaatioon ja yksittäisiä ampicilliiniresistenttejä pesäkkeitä eristettiin, jotka vastaavat yksittäisiä klooneja. Insert-tien orientoituminen jokaisessa plasmidissa määritettiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja agaroosigeelielektro-20 foreesilla. Oikein orientoutuneita inserttejä sisältävät kloonit säilytettiin lisäanalysointia varten.
,,,j Oikein orientoutuneita inserttejä sisältävät plasmidit « i .# identifioitiin restriktioanalyysin avulla ja puhdistettiin • ·% , 25 CsCl-gradienttisentrifugoinnin avulla.
f ( * « « » • * · ! ·* Jokaisesta plasmidirakenteesta käytettiin yksittäisestä * i : preparaatista puhdistettua kaksisäikeistä plasmidi-DNA:ta i «i ί,ϊ! DNA-sekvenssimääritystä varten. Sekvensointireaktiot suori- 30 tettiin Perkin-Elmerin termisessä kierrätyslaitteessa käyt- « .*« tämällä TBE-spesifisiä alukkeita, ArnpliTaq-polymeraasia ·« · , j*. (Perkin Elmer Cetus) ja fluoresoivalla väriaineella merkit- i i * • tyjä dideoksiterminaattoreita valmistajan ohjeiden mukai- i * * " · V ’ sesti (Applied Biosystems). Sekvensointireaktion tuotteet ι«· 35 analysoitiin Applied Biosystemsin automaattisella DNA- 9 ,·. : sekvensointilaitteella 373A.
t ·ι ··*#« } .
117974 17 PCR:llä tuotettujen mutaatioiden analysointi
Valittiin 13 yksittäistä E. coli-kloonia, jotka sisältävät SV-PE-sarjan plasmideja, ja 9, jotka sisältävät SV-E-sarjan 5 plasmideja, kloonattujen inserttien tarkan analyysin suorittamiseksi ja Taq-polymeraasilla tapahtuvan mutatoin-nin tehokkuuden arvioimiseksi. Plasmidi-DNA jokaisesta kloonista puhdistettiin ja analysoitiin kloonattujen in-serttien molemmat säikeet täydellisellä sekvensoinnilla.
10 Sitten verrattiin cDNA-sekvenssejä vastaaviin emokantana toimivan villityypin TBE-viruskannan Neudorfl'n RNA-sekvensseihin (Mandi C. W., Heinz F. X. ja Kunz C.,
Virology 166, 197-205, 1988).
15 Jokaisen plasmidikloonin nukleotidisekvenssissä oli odote tusti useita eroja verrattuna villityypin TBE-virussekvens-siin. Nämä muutokset olivat muutamin poikkeuksin (ks. jäljempänä) yleensä yksittaismutaatioita, joita ilmeisesti muodostui PCR-monistuksen aikana ja jotka oli löydettävissä 20 ainoastaan yksittäisissä klooneissa.
• * • · • · • ·· .
• · • · « · • # * • ♦ ♦ · • « • # ·♦·.·.· ··· ··* · • ♦« • · * • * · • * ♦ ♦ * * · · ··· * • · · • · * • · · ♦ * · · *♦··-.· • * · • · · • · * · • · * • · . t • · • * · • ·» ··· ·*··· 117974 18
Taulukko 1. Yhteenveto PCR:llä tuotetuista mutaatioista
Nukleotidi- Aminohappomuutokset13 Klooni muutokset3 prM E
5
SV-PE
01 945 G->A , 1122 G->C Gin 50->His
1395 C->T
10 2027 T->C Vai 352->Ala
2480 A · >GC
02 551 T->A Vai 24->Glu
1080 G ->A 1153 T->C
15 1168 T >C Ser 66->Pro 1690 A->G Arg 240->Gly 2458 G->del Ala 495->lukukehyksen 03 952 T->C Cysl58->Arg siirtymä 976 C->T Arg 2->Cys 20 1163 A->G Lys 64->Arg 1679 A->G Asn 236->Ser 1889 T->A Met 306->Lys
04d 1434 C->T
2275 A->T Lys 435->lopetus
25 2364 G->A
05c 701 T >C Leu 74->Pro
1488 C->A 1492 T >C
1893 T->A Cys 307->lopetus 30 06 782 T->C Leul01->Pro 865 A->G Lysl29->Glu
1002 C->T
. 1972 G->A Gly 334->Arg • *· 07c 1327 G->del Ala 119->luku.siir.
:*. 35 2248 G ->A Ala 426->Thr < : ** 08 701 T->A Leu 74->Gln 2092 A->G Met 374->Val
2124 T->C
ί V 0 9 4 52 T->Cc
t .·. 40 960 A- >T
1746 A->G
2086 A->G Ile 372->Val
2142 T >C
2290 G->A Vai 440->Ile
I .*. 45 2361 A- >G
:·*·/· SV-PE
10c 1625 A->G Asp 218->Gly
2475 T >C
1 ϊ · ϋ 50 12c 1203 G - >A Met 77->Ile ·...* 13c 1366 T->C Tyr 132->His 1381 A->G Ile 137->Val 1728 G- >A Met 252 · >IJ e
2134 C_>T
• t 19 5 117974
Nukleotidi- Aminohappomuutoksetb Klooni muutokset3 prM E
SV-E
01d 1239 C->T
02 1093 A->T Met 41->leu
2301 C->T
10 03 1321 G->A Vai 117->Ile 1688 A->G Glu 239->Gly 1717 G->A Ala 249->Thr 2053 A->G Asn 361->Asp 2092 A->G Met 374->Val
15 04 2073 T->C
2438 C->T Ala 489->Val 05 938 T->C (Leul53->Pro)£ 973 T->C Ser l->Pro 2401 T->G Ser 477->Ala
20 06 891 C->T
1151 G->A . Cys 6 0 ->Tyr 1364 T->C Vai 131->Ala 1567 A->G Ile 199->Val 2045 T ->C Ile 358->Thr
25 07 1257 T->C
1694 T->C Leu 241->Pro
1794 A->G
2159 G->T Gly 396->Val
08 1806 A->G
30 2205 A->G
09 2491 A->delc i·1: a Nukleotidikoordinaatit koskien koko TBE-genomia
.. 35 b Aminohappokoordinaatit koskien prM tai E
: ’·· c Aminohappomuuutokset NS1- tai C-geenissä V. d SV-PE04 uudelleennimitetty "SV-PEst" :ksi ja SV-E01 "SV- ·1 Ewt" :ksi j e Muita mutaatioita kuin PCR:llä aikaansaatuja ei ole \ \m 40 esitetty (vrt. teksti) : f Tässä rakenteessa oli vain prM:n C-terminaalinen osa läsnä * 1 1 . ^ 45 !.i ί Kuten taulukossa 1 on esitetty 22 sekvensoidussa insertissä • · · V : (yhteensä 43549 emäsparia) oli 71 yksittäistä nukleotidi- » muutosta, joita voitiin lukea Taq-polymeraasin virheiksi.
t 1 · f1.1t Näistä muutoksista 42 (59 %) johti substituutioihin ennus- • · *11 50 tetussa aminohapposekvenssissä ja 3 johti deleetioihin, • · jotka aiheuttivat lukukehyksen siirtymisen (taulukko 2) .
· 117974 20
Taulukko 2. PCR-mutaatioiden yleisyys
Esiintyminen* Yleisyys
Emäsparin muutokset kpl(%) (per emäspari) 5 G/C->A/T 20 (28 %) 4,59 x 10-4 G/C->T/A 2 (2,8 %) 4,59 x 10'5 G/C->C/G 1 (1,4 %) 2,30 x 10'5 A/T->G/C 37 (52 %) 8,50 x 10'4 10 A/T->C/G 1 (1,4 %) 2,30 x 10'5 A/T->T/A 7 (9,9 %) 1,61 x 10'4 G/C deleetio 2 (2,8 %) 4,59 x 10’5 A/T deleetio 1(1,4%) 2,30 x 10'5
Siirtymiä 57 (80 %) 1,31 x 10"3 15 Transversioita 11 (15 %) 2,53 x 10‘4
Kaikki mutaatiot 71 (100 %) 1,63 x 10‘3
Aminohapposubstituut. 42 (59 %) 9,64 x 10-4
Hiljaisia mutaatioita 24 (34 %) 5,51 x 10'4
Lukukehyksen siirtymiä 3 (4,2 %) 6,89 x 10"5 20 Lopetuskodoneja 2 (2,8 %) 4,59 x 10-5 *43549 emäsparia sekvensoitiin 25 Mutaatioiden jakauma oli kääntynyt voimakkaasti A/T->G/C-ja G/C->A/T-siirtymämutaatioiden eduksi, kuten jo aikaisemmin on todettu (Dunning A. M., Talmudd P. ja Humphries S. E., Nucleic Acids Res 16, 10393, 1988; Chen J., Sahota A., Stambrook P. J. ja Tischfield J. A., Mutat Res 249, :*4i 30 169-176, 1991; Cadwell R. C. ja Joyce G. F., PCR Methods • · • ’·· Applic 2, 28-33, 1992). Kokonaismutaatioiden yleisyys oli 1,63 x 10'3 per emäspari 35-syklisessä monistuksessa (4,7 x ·***: 10'5 per emäspari ja sykli), mikä vastaa Taq-polymeraasin • · I virheiden yleisyydestä julkistettuja arvoja (15,32). Keski- • · · · 35 määräinen aminohapposubstituutiomäärä oli 0,46 per geeni » * t prM:lle (164 aminohappoa pitkä) ja 1,59 E:lle (496 amino- , . happoa pitkä).
* · · • « « • « · *·[ Hiljainen mutaatio nukleotidin 930 kohdalla esiintyi 40 kaikissa klooneissa ja on oletettu, että se on muodostunut t”‘; luonnollisena mutaationa viruskasvatuksen aikana. Lisäksi • * · . todettiin, että SV-PE-sarjan viidessä kloonissa, SV-PE05, • · · ** *· SV-PE07, SV-PE11, SV-PE12 ja SV-PE13, oli seitsemän yhteistä identtistä mutaatiota nukleotideissä 849, 1285, 117974 21 1346, 1404, 1909, 2247 ja 2255. Kloonissa SV-PE10 oli kolme näistä mutaatioista (1909, 2247 ja 2255), mutta muissa SV-PE-klooneissa ei ollut mutaatioita näissä kohdissa eikä yhdessäkään SV-E-kloonissa. Eräs näistä muutoksista, 5 nukleotidin deleetio kohdassa 1346, aiheuttaa lukukehyksen siirtymisen E-geenin kodonissa 125, ja on siten odotettavissa, että tästä muodostunut E-proteiini ei ole toimiva. Koska klooni, jossa on eräs näistä seitsemästä mutaatiosta, saatiin riippumatta siitä, mistä erillisistä cDNA- ja PCR-10 preparaateista se valmistettiin (ei esitetty tuloksia), vaikuttaa siltä, että nämä variantit esiintyivät jo virus-RNA-populaatiossa ennen monistumista. Näitä erikoisia mutaatioita ei siten ole sisällytetty PCR:llä saatujen mutaatioiden analyyseihin.
15
Rakenteita, jotka koodaavat villityypin ja deletoituja E-proteiineja
Yksittäisiä aminohappomuutoksia koodaavien kloonien lisäksi 20 olimme myös kiinnostuneita prM + E- ja ainoastaan-E-raken- teiden valmistuksesta, jotka rakenteet koodaavat villi- tyypin ja deletoituja proteiineja. Koska kuitenkin kaikki ···· PCRrllä saaduissa SV-PE-sarjan klooneissa oli mutaatioita, !*. jotka johtaisivat aminohappomuutoksiin, käytettiin suoraa V, 25 subkloonausta villityyppi-rakenteen valmistamiseksi, joka ..^t rakenne kodaa modifioimattomia prM- ja E-proteiineja sekä * * * * I ainoastaan-E-rakenteen deletoitua muotoa.
f · · • * · • « · · • ·· • · · ** * Plasmidin SV-PE04 DNA-sekvenssissä oli kahden hiljaisen 30 mutaation lisäksi A/T-substituutio nukleotidissä 2275, • · : jolloin AAC-kodoni, joka vastaa proteiini E:n lysiiniä 435, * · · :: · muuttui TAG-lopetuskodoniksi (taulukko 1). On siten ennus- tettu, että SV-PE04 koodaa villityyppi-prM-proteiinia ja * * * deletoitua E-proteiinia, josta karboksipään 61 aminohappo- I ( "* 35 jäännöstä puuttuu, joka puuttuva osa sisältää oletetun • · membraaniin kiinnittyvän alueen (Mandi C. W., Gulrakhoo F., *!*’! Holzmann H., Heinz F. X. ja Kunz C., J Virol 63, 564-571, 117974 22 1989), Osoittautui, että plasmidissa SV-E01, josta suurin osa prM-geenistä puuttuu, on vain hiljainen mutaatio E-geenissä, jolloin se koodaa villityyppi-E-proteiinia.
5 Villityypin aminohapposekvenssin koko pituuden käsittävän prM + E-rakenteen ja lopetuskodonin nukleotidikohdassa 2275 omaavan, ilman prM:ää olevan ainoastaan-E-rakenteen luomiseksi siirrettiin restriktiofragmentteja SV-PE04:stä ja SV-E01:stä (tästä lähtien nimetty SV-PEst:ksi ja SV-Ewt:ksi).
10 Tätä tarkoitusta varten käytettiin kahta restriktio- entsyymin CfrlOI katkaisukohtaa, toinen nukleotidien 960 ja 961 välissä, lähellä prM- ja E-geenien rajaa, ja toinen vektorin ampicilliiniresistenssigeenissä. Toinen aikaansaaduista plasmidirakenteista, SV-PEwt, sisältää villityyp-15 pi-prM-geenin SV-PEst:stä ja villityyppi-E-geenin SV-Ewt:stä, kun toinen, SV-Est, josta puuttuu prM-geeni, sisältää lopetuskodonin sisältävän E-geenin SV-PEst:stä.
Nämä muutokset vahvistettiin sekvensoimalla molempien plasmidien insertit. Näiden rakenteiden avulla saatiin 20 neljä ilmentämisplasmidia, joiden avulla voitiin verrata ilmennettyjen E-proteiinien muokkaamista ja rakenteita, joka vertailuproteiini on saatu villityyppi-rakenteesta :*·; (SV-PEwt) ja vertailun kohteena olevat proteiinit, ovat !*·,. proteiineja, joista puuttuu prM (SV-Ewt), E-ankkurialue *.·, 25 (SV-PEst) tai molemmat (SV-Est).
·· · «·* * · I PEwt-insertin koko sekvenssi on esitetty kuviossa 3a, b ja t * .
“* * c.
• ·* v# m m m l 0 Λ 9 30 COS-soluja transfektoitiin sopivilla plasmideilla ja • · i«: ί rekombinanttiproteiinien ilmentyminen analysoitiin #*♦ V * seuraavalla tavalla: ·«· • « · DNA-transf ektio ' j : ----- :* 35 ,
COS-l-solut (Gluzman Y., Cell 23, 175-182, 1981) pidettiin ’·"· COS-alustassa, joka koostuu alustasta Dulbecco's MEM
117974 23 (Gibco-BRL) täydennettynä 10 %:lla fetaalista naudan-seerumia, penisilliinillä (100 E/ml) ja streptomysiinillä (100 pg/ml) 37 °C:ssa ja 5 %:ssa C02.
5 Kloonattuja TBE-geenejä sisältävät plasmidit tuotiin C0S-1-soluihin liposomivälitteisellä transfektiolla käyttämällä modifikaatiota Feigner et ai:n menetelmästä (Feigner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. VJ., VJenz M., Northrop J. P., Ringold G. M. ja Danielsen M., Proc Natl 10 Acad Sei USA 84, 7413-7417, 1987) BioRad Gene Pulser-
laitteen avulla. Lipofectin-reagenssi (Gibco-BRL) laimennettiin pitoisuuteen 20 pg/ml Opti-MEM-X-puutteiseen seerumialustaan (Gibco-BRL) ja sekoitettiin vastaavaan tilavuuteen OptiMEM-I:tä, joka sisältää 8 pg/ml kyseessä 15 olevaa plasmidi-DNA:ta. Transfektointiin käytettiin 5 pg Lipofektiniä ja 2 pg plasmidi-DNA:ta. Seoksen annettiin seistä 15 min huoneenlämmössä DNA-Lipofectin-kompleksien muodostamiseksi ja 0,5 ml tätä seosta lisättiin solu-viljelylevyn (Nunc) jokaiseen 24 syvennykseen, joissa oli 20 soluja, jotka oli pesty kaksi kertaa 1 ml:11a OptiMEM
kasvualustan seerumijäänteiden poistamiseksi. Solut in-kuboitiin DNA-Lipofectin-seoksen kanssa 5 h 37 °C:ssa, 5 f*: %:ssa C02, jonka jälkeen lisättiin 1 ml täydellistä COS- ί\, alustaa ja inkubointia jatkettiin yön yli. 24 h trans- « 25 fektion jälkeen alusta poistettiin ja korvattiin uudella * •V, COS-alustalla, ja inkubaatiota jatkettiin n. 46 h trans- * · I *.t fektion jälkeen, jolloin solut joko preparoitiin immuno- tl· "*.* fluoresenssianalyysia varten tai liuotettiin intrasellu- • J · laaristen antigeenien analysoimiseksi ELISA:11a.
30 • · :.t ϊ Menetelmä COS-solujen infektoimiseksi TBE-viruksella ·· · · immunofluoresenssin vertailunäytteen tekemiseksi suori- tettiin olennaisesti samalla tavalla kuin transfektointi, · · ···. kuitenkin sillä erolla, että plasmidi-DNA:n ja Lipofectinin 1 · 35 sijasta käytettiin TBE-virusta hiiri-imettäväisen aivo- • · *.*·: suspension muodossa, joka oli laimennettu 100 kertaa Opti- MEM-l-alustaan.
117974 24
Ilmennettyjen proteiinien analysointi a. Solulysaattien immunopresipitaatio 5 Transfektoidut solut merkittiin 35S-kysteiinillä, solu- bilisoitiin Triton X-100:lla ja tehtiin immunopresipitaatio polyklonaalisen kaniseerumin kanssa, joka oli spesifinen TBE-viruksen proteiineille E ja prM. Kuten kuviosta 4 nähdään, rakenteiden SV-PEwt ja SV-Ewt ilmentäminen johti 10 autenttisen kokoisen proteiinin E syntetisointiin. SV-PEstistä ja SV-Est:stä syntetisoidut proteiinit olivat, kuten odotettavissa oli, hieman pienempiä kuin villityyppi-E-proteiini johtuen niiden lyhennetystä C-terminaalista.
15 b. Rekomblnanttlproteiinin erityksen analysoiminen solujen kasvatusalustasta
Proteiini Ein läsnäolo transfektoitujen solujen kasvatus-alustasta analysoitiin kvantitatiivisesti päivinä 0-4 20 transfektion jälkeen käyttämällä neljäkerroksista ELISA:a, kuten Heinz et ai., J. Biol. Stand. (1986), 14: 133-141 on kuvannut. Kuviossa 5 annetut tulokset osoittavat, että vain ;·*: ne rakenteet, jotka myös ilmentävät prM-proteiinia, johti- ί*·ι# vat proteiini E:n erittymiseen. Kasvualustan immunopresi- V, 25 pitaatio (kuvio 6) vahvisti sen, että eristetyt proteiinit olivat samankokoisia vastaavien solunsisäisten proteiinien • « I I kanssa (vrt. kuvio 4).
• · · t · « t« · · • * · • * · '·' Rekombinanttiproteiinien erittyminen on valtavaksi hyödyksi 30 tuotantoa ajatellen, koska silloin voidaan välttää solujen • · : rikkominen ja kontaminoivan solumateriaalin poistaminen * « · · halutun proteiinin saamiseksi. Sopivissa olosuhteissa tämä ,··,·, mahdollistaa myös rekombinanttiproteiinin jatkuvan saannin • · · soluja rikkomatta.
*:·' 35 ♦ · ♦ f »» • · ···♦· « · 117974 25 c. Eristyneiden rekombinanttiproteiinien karakterisointi
Kuviossa 5 esitetyt kasvualustat sakkaroosi-tiheys- gradientti-vyöhykesentrifugoitiin käyttämällä 5-30 % 5 (paino/paino) sakkaroosigradienttia ja Beckmanin SW-40- roottoria. Sentrifugointi suoritettiin 38000 U/min ja 4
°C:ssa 100 min. Gradientit fraktioitiin ja proteiini E
määritettiin kvantitatiivisesti jokaisesta fraktiosta neljäkerroksisella ELISArlla (ks. Heinz et ai., J. Biol.
10 Stand. (1986) 14: 133-141). Viruksella infektoitujen solujen kasvualustaa käytettiin kontrollina, joka antoi kaksi proteiini E-pitoista piikkiä (kuvio 7), joista toinen vastaa koko virusta ja toinen vastaa nk. ei-infektoivaa "hitaasti sedimentoivaa hemagglutiniinia" ("slowly- 15 sedimenting hemagglutinin" (SHA)) (ks. Russel et ai.
(1980), Chemical and antigenic structure of Flaviviruses.
In: Schlesinger, R. W. (ed.) The Togaviruses, 503-529,
Academic Press). SV-PEwt:llä transfektoitujen solujen kasvatusalusta sisälsi E:n partikulaarisen muodon, jonka 20 sedimentaationopeus vastaa viraalisen SHA:n nopeutta, kun taas C-terminaalista lyhennetty proteiini E, joka oli saatu SV-PEst:stä, ei muodostanut stabiilia partikkelia ja jäi ί**ϊ gradientin yläpuolelle.
· \ ♦· V. 25 SV-PEwt:stä saatua partikulaarista muotoa kutsuttiin !·,*, "rekombinanttiseksi subviraaliksi partikkeliksi" (rSP) ja « i SV-PEst:stä saatua liukoista muotoa "rekombinantti-E*:ksi" 'll* (rE*).
• · » · * 30 Käsittelemällä rSP:tä 0,5 %:lla Triton X-100 partikkelit * · 9 * ♦ UI : dissosioituivat, kuten käy ilmi kuvion 8 sedimentaatio- * · V · analyysista, mikä viittaa lipidimembraanin läsnäoloon.
♦ • « * • · t • « · • # ·*·, rSP:n ia rE :n preparointi :· 35 * · V*: a. rSPtn puhdistus • · · « · • · 117974 26 SV-PEwt:llä transfektoitujen COS-solujen kasvualusta selkeytettiin sentrifugoimalla 30 min 10000 U/min 4 °C:ssa Sorvaliin korkeanopeussentrifugilla ja partikkelit saatiin sitten sentrifugoimalla 120 min 44000 U/min 4 °C:ssa, 5 jolloin käytettiin Beckmanin Ti45-roottoria. rSP-pitoinen pelletti-fraktio resuspendoitiin TAN-puskuriin, pH 8,0 ja vietiin 5-20 % sakkaroosigradienttiin, joka oli tehty samaan puskuriin. Sentrifugoimisen jälkeen Beckmanin SW40-roottorissa (90 min, 38000 U/min ja 4 °C) näytteet frak-10 tioitiin, ja piikin muodostavat fraktiot identifioitiin testaamalla HA-aktiivisuus (Clarke ja Casals, 1958, Aver.
J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573). Vyöhykegradientista saadut piikki-fraktiot puhdistettiin edelleen tasapaino-sentri-fugoimalla (35000 U/min, 4 °C, yön yli), ja fraktiot 15 identifioitiin taas HA:n avulla. Proteiini E:n kokonaismäärä määritettiin kvantitatiivisesti 4-kerroksisella ELISA:11a ja puhtaus määritettiin SDS-PAGE:n avulla käyttämällä Coomassie-Blue-värjäystä (kuvio 9).
20 b. rE*:n preparointi SV-PEst:llä transfektoitujen COS-solujen seerumivapaita ;·»· kasvatusalustoja selkeytettiin kuten yllä on kuvattu ja V. konsentroitiin n. 15-kertaiseksi ultrasuodattamalla.
25 * .«β·, Kromosomaalisesti integroitua prM- la E-aeeniä sisältävien • · * * solulinioien valmistus $ * t · *»» ♦ ·
Stabiilista transfektoitujen rSP:itä tuottavien solujen 30 valmistamiseksi käytettiin dihydrofolaattireduktaasi ς (DHFR)-selektiojärjestelmää (Current Protocols in Molecular vt· V · Biology, John Wiley & Sons, Inc.) sekä jokaista rakennetta, « • *i*j joka sisältää proteiinien prM ja E koko geenit (kuvio 1) ja joka johtaa rSP:iden syntetisointiin ja erittymiseen. DHFR-
»M
/ , 35 geenin siirto tapahtui plasmidin pSV2-dhfr (Subramani et i · · *’ ** ai., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864, 1981) avulla, prM- ja E- C » 4 * * geenien siirto tapahtui plasmidin CMV-PEwt avulla, joka oli 27 ' 117974 valmistettu uudelleenkloonaamalla plasmidista SV-PEwt saatu insertti plasmidissa pCMVB (Clontech).
DHFR-puutteellista hamsterisolulinjaa CH0-DG44 (Som. Cell.
5 Mol. Get. 12, 555-666, 1986) kasvatettiin HAM:n Fl2-alus-tassa, johon oli lisätty 10 % fetaalista vasikanseerumia (FVS) ja transfektoitiin pCMV-PEwt:llä ja pSV2-dhfr:llä suhteessa 20:1 elektroporaatiolla käyttämällä BioRad Gene Pulser-laitetta. Sen jälkeen transfektoidut solut kasvatet-10 tiin edelleen 2 päivää HAM:n Fl2-alustassa + 10 % FVS, trypsinisoitiin, laimennettiin paljon ja siirrettiin selektioalustaan (ΜΕΜ-α ilman ribo- ja deoksiribonukleo-tidejä + 10 % dialysoitua FVS) Petrimaljoihin yksittäisten DHFR ja prM+E ilmentävien solukloonien eristämiseksi. Noin 15 10 päivän jälkeen siirrettiin mikroskoopissa näkyviä yksit täisiä solupesäkkeitä pieniin soluviljelyastioihin ja kasvatettiin edelleen. Ne solukloonit, jotka tuottavat FSME-spesifistä antigeeniä, identifioitiin analysoimalla solukasvatusalustaa ELISA:11a.
20
Erästä näistä soluklooneista (CHO-37) käytettiin tuotta-miensa rSP:ien eristämiseen ja karakterisointiin. Sen lisäksi solut kasvatettiin yllä mainitussa selektio- • · .. alustassa ja rSP:t puhdistettiin siitä samalla tavalla kuin • * • · · . 25 COS-soluista eristettyjen rSP:ien osalta on kuvattu.
* · ^ · Sakkaroosi-tiheysgradienttisentrifugoinnin tulos on • · * ϊ ·* esitetty kuviossa 10, jossa on verrattu COS-soluista J saatuja rSP:itä stabiilisti transfektoidusta solulinjasta • · V * CHO-37 saatuihin rSP:hin. Käytetyt sentrifugointiolosuhteet 30 olivat seuraavat: 20-50 % sakkaroosi, Beckman TI-40- • ;*: roottori, 35000 UpM yli yön. Sentrifugoinnin jälkeen • · * * fraktioitiin gradientit ja yksittäiset fraktiot analysoi-4*. tiin hemagglutinaatiokokeella ja ELISA: 11a FSME-virus- • » t *-* * spesifisellä antigeenillä. Kuten kuviosta ilmenee, • · *.·.* 35 preparaattien sedimentaatioreaktiot eivät spesifisen tiheyden eivätkä spesifisen hemagglutinaatioaktiivisuuden • · ..··· suhteen eronneet toisistaan.
1 17974 28 2. Karakterisointi verrattuna natiiviin proteiinirakenteeseen Tällä tavalla valmistetut preparaatit analysoitiin 5 seuraavalla tavalla: a. antigeenirakenteen analyysi käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, b. kyky happoindusoituihin konformaatiomuutoksiin 10 c. hemagglutinaatioaktiivisuus a. Antigeenirakenne
Formaliinilla inaktivoidun kokoviruksen antigeenirakennetta 15 verrattiin natiivin infektoivan viruksen antigeenirakenteeseen käyttämällä 19 spesifistä vasta-ainetta proteiini E:tä vastaan (Mandi et el. 1989, J. Virol. 63: 564-571; omat kokeet). Jokaisen yksittäisen monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuus analysoitiin yllä olevien preparaattien 20 avulla 4-kerroksisen ELISA:n avulla kuten Heinz et ai. on kuvannut J. Biol. Stand. (1986), 14: 133-141. Tällöin käytettiin kaikista antigeenipreparaateista proteiini E:n • · .. suhteen ennestään määritettyä vakiopitoisuutta 1 pg/ml ja • * *# ' käytettin sellaista vasta-aineen laimennosta, jossa on • · · : ·* 25 jokaista monoklonaalista vasta-ainetta sen verran, että • * * I I · : saadaan natiivin infektoivan viruksen kanssa ekstinktio- * · ;.* · arvo, joka on alueella 0,5-1,6.
• · · • · · • · ·
Kuten kuviosta 11 käy ilmi, monoklonaalisten vasta-aineiden ·*·,. 30 reaktiomallit rSP:n ja infektoivan viruksen kanssa ovat käytännöllisesti katsoen identtiset, joten on oletettavaa, • * · että proteiini E esiintyy samassa natiivissa muodossa * * * : ·' rSP:issä kuin infektoivassa viruksessa.
* · · t * • · • » · ·’·*; 35 Formaliini-inaktivointi vaikuttaa sitä vastoin merkittä- « ....: västi antigeenirakenteeseen, jossa myös esiintyy epitoop- peja, jotka sitovat neutraloivia vasta-aineita. Tämä koskee 117974 29 sekä neutraloivaa monoklonaalista vasta-ainetta 12 (Mandi et ai., 1989, J. Virol. 63: 564-571), jonka epitooppi tuhoutuu formaliinikäsittelyssä, että myös epitooppeja doraeeni A:n ja domeeni B:n alueella (Mandi et ai., 1989, J.
5 Virol. 63: 564-571), joiden reaktiivisuus on ainakin pienentynyt. Tämä analyysi osoittaa myös sen, että E*:n rakenne ei ollenkaan vastaa viruspinnassa olevaa natiivia proteiini E:tä.
10 b. Happoindusoidut konformaatiomuutokset TBE-virus tunkeutuu soluihin reseptorivälitteisen endo-sytoosin avulla ja pääsee siten endosomeihin, joiden hapan pH (<6,4) indusoi spesifisen konformaatiomuutoksen, joka 15 vaaditaan virusmembraanin ja endosomimembraanin fuusioimiseksi ja siten viruksen infektiivisyyden aikaansaamiseksi. Nämä rakenteelliset muutokset voivat olla seurausta siitä, että yksittäisten monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus muuttuu (Heinz et ai., 1994, Virology 198: 109-20 117) ja vaikuttaa mm. epitooppeihin i2 ja IC3 (reaktiivi suuden voimakas lasku) ja C6 (voimistunut reaktiivisuus), mutta ei epitooppiin B3.
···· • · :*. Nämä muutokset ovat olennaisia proteiini E:n toiminnalle.
• ·· ·.·, 25 Kyky reagoida esitetyllä tavalla happamassa pH:ssa on siten ..! myös merkki siitä onko proteiini E natiivissa muodossa, • * · * * \ joka vastaa infektoivaa virusta. rSP:tä, rE :tä ja infek- * · · ··;;/ toivaa virusta sisältävät preparaatit trietanoliamiini- • ♦ * V puskurissa pH 8,0 sekoitettiin puskuriin, jossa oli 0,05 m 30 mES, 0,1 m NaCl ja 0,1 % naudanalbumiinia, siten että • * ·.· · saatiin pH-arvo 6,0, inkuboitiin 10 min 37 °C:ssa ja tri- : etanoliamiinin avulla säädettiin sitten pH-arvo uudestaan ,·!·, 8,0:ksi. Sitten analysoitiin näiden preparaattien reak- « ' * *... tiivisuus ennen inkubointia ja inkuboinnin jälkeen happa- • · *·· 35 massa pH:ssa monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja • · ϊ *·ί C6 kanssa 4-kerroksisen ELISA:n avulla kuten kohdassa • · *:··: "Antigeenirakenne" on kuvattu. Tulokset on esitetty 117974 30 kuvioissa 12 ja 13 ja ne osoittavat, että hapan pH aiheuttaa vastaavia rakenteellisia muutoksia rSP:iden proteiini E:ssä kuin infektoivan viruksen proteiini E:ssä (ks. kuvio 12), mutta että vastaava analyysi rE*:n osalta ei osoita 5 minkäänlaista viittausta vastaavanlaisesta muunnoksesta (ks. kuvio 13).
c. Spesifinen hemaaolutinaatioaktiivisuus 10 Infektoivalle FSME-virukselle tyypillinen ominaisuus on kyky tietyissä olosuhteissa agglutinoida hanhenerytro-syyttejä (hemagglutinaatioaktiivisuus). Proteiini E välittää tämän ominaisuuden virukselle ja ominaisuus on siten toinen indikaattori proteiinin natiivin toiminnallisen 15 rakenteen esiintymisestä. Hemagglutinaatiotestit suoritet tiin kuten Clarke ja Casals (1958), Amer. J. Trop. Med.
Hyg. 7: 561-573 ovat kuvanneet käyttämällä hanhenerytro-syyttejä pH-arvossa 6,4.
20 Infektoivan viruksen, formaliini-inaktivoidun viruksen, rSP:n ja rE*:n ELISA:11a määritetyt antigeenipitoisuudet säädettiin arvoon 5 pg/ml ja analysoitiin hemagglutinaa-tiotestillä. Tulos on esitetty oheisessa taulukossa 3.
• * .•t Siitä ilmenee, että rSP:llä on vastaava spesifinen hem- ,,
l M
*. . 25 agglutinaatioaktiivisuus kuin infektoivalla viruksella, ja
* S
*m että tämä proteiini E:n avulla välitetty aktiivisuus häviää • · · • ·' melkein kokonaan formaliini-inaktivoinnin johdosta. Prepa- Ϊ.Ι I rastilla rE* ei ole mitattavissa olevaa määrää HA-aktiivi- • * · * suutta.
30 : Taulukko 3. HA-aktiivisuus ··* · ---- • · « * *
Valmiste HA-tiitteri • · ♦ • · · • ,···, 35 infektoiva virus 512 *···* formaliini-inakt. virus 4 . rSP 512 » » » * *. ·: rE < 2 * » · · » • * 31 117974 3. Immunooeenisws hiirissä
Immunisoimalla hiirissä analysoitiin seuraavien antigeeni-preparaattien immunogeenisyys: 5 - formaliini-inaktivoitu puhdistettu virus
- rSP
- rE
Proteiini E:n pitoisuus havaittiin entsyymi-immunotestillä 10 (Heinz et ai., 1986, J. Biol. Stand. 14: 133-141) ja kaikkien preparaattien antigeenipitoisuus säädettiin samaan arvoon 5 pg/ml. Kuten jo käytössä olevassa TBE-rokotteessa (FSME-ImmunR) käytettiin myös tässä laimennuspuskurina PBS:ää pH 7,4, joka sisältää 0,1 % humaanialbumiinia ja 15 adjuvanttina lisättiin 0,2 % A1(0H)3.
rSP:n ja rE1:n immunogeenisyys testattiin myös ilman adju-vantin lisäystä.
20 Immunisointiprotokolla:
Kymmenen 15 g painavan Swiss albino hiiren (5 naarasta ja 5 :··· urosta) ryhmät immunisoitiin ihonalaisesti kaksi kertaa 14 päivän välein jokaisella preparaatilla, jolloin hiirtä ja * ·.·, 25 immunisointia kohti annettiin 0,2 ml antigeeniä. Viikko toisen immunisoinnin jälkeen otettiin verinäyte ja kaikki • · 1 I hiiret infektoitiin intraperitonaalisesti 500 LD50 hiiri- t · · ***,’ patogeenisellä TBE-viruskannalla Hypr (Challenge-testi).
• ♦ · *·1 Kuolemaan johtavan enkefaliitin esiintymistä hiirissä 30 tarkkailtiin 14 päivän ajan.
• · • · · • · · • ·· · • 1 Sama määrä seerumia otettiin jokaisesta yksittäisestä .···. hiirestä kymmenen ryhmästä, jotka kaikki kymmenen oli · · immunisoitu samalla immunogeenillä, ja analysoitiin TBE- * 1 *11 35 virus-spesifinen vasta-ainepitoisuus entsyymi-immuno- • · ♦,’·· testillä (ELISA), hemagglutinaation estotestillä (HHT) ja 5**! neutralointitestillä.
117974 32 ELISA suoritettiin käyttämällä puhdistettua TBE-virusta antigeeninä kuten Heinz et ai. on kuvannut J. Gen. virol. (1984) 65: 1921-1929. HHT tehtiin kuten Clark ja Casals (1958), Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573 ovat kuvanneet, 5 jolloin käytettiin hanhenerytrosyyttejä lopullisessa pH- arvossa 6,4. Neutralointitestejä varten käytettiin BHK-21-soluja ja käytetty viruspitoisuus oli 500 infektoivaa yksikköä.
10 Immunisointikokeilun tulokset on esitetty taulukossa 4. Siitä käy ilmi, että rSP sekä ilman adjuvanttia että adjuvantin kanssa kuten myös formaliini-inaktivoitu kokovirus suojasi kaikki hiiret tappavaa annosta TBE-virusta vastaan. Sitä vastoin kun oli immunisoitu rE*:llä 15 ei suojavaikutusta ollut havaittavissa (ilman adjuvanttia) tai suojavaikutus oli olematon (adjuvantin kanssa).
Verrattaessa vasta-aineinduktiota rSP:t olivat jopa ylivoimaisia formaliini-inaktivoituun virukseen nähden, eri-20 tyisen selvästi käytettäessä A1(0H)3 adjuvanttina. Tämä koskee sekä ELISA:11a osoitettuja virusta sitovia vasta-aineita että - suojaavaa immuunivastetta ajatellen vielä ·»·· tärkeämpiä - HHT:ssä ja NT:ssä mitattuja vasta-aineita, ;·. jotka siten estävät viruksen spesifisiä toimintoja 25 (hemagglutinaatio ja infektiivisyys).
·· · ♦ · · • ’ * Suojaavan toiminnan puuttuminen tai olemattoman vaikutuksen | · * ··· · olemassaolo sopii hyvin yhteen sen kanssa, että vasta-aine- * * * * *.* * induktio rE :llä oli hyvin pieni tai ei ollut osoitetta- 30 vissa.
• · • * * I I » J »· ·
On siten osoitettu, että rSP:t ovat erinomaisia immuno- .1. geenejä, jotka suo jaavat muuten tappavalta enkefaliitiltä • · · ja ovat jopa ylivoimaisia formaliini-inaktivoituun koko- t « ·;·' 35 virukseen nähden kun verrataan toiminnallisten virusta ♦ · ί neutraloivien vasta-aineiden induktiota.
• · 1 * MMI f ♦ 33 117974
Taulukko 4. Hiirien immunisointi
Challenge- Vasta-ainetiitteri testi 5 elossa kautta kokonaismäärä ELISA HHT NT (lkm/10) formaliini-inakt.
10 virus + adjuv. 10/10 10000 40 20-40 rSP ilman adjuv. 10/10 12000 80-160 40-80 rSP + adjuv. 10/10 30000 160 160 15 rE* ilman adjuv. 0/10 100 <10 <10 rE* + adjuv. 1/10 4000 <10 < 10-10 20 puskurikontrolli 0/10 neg <10 <10 4. Immunisointi paljaan DNA:n avulla 25 Immunisoitaessa paljaalla DNA:11a käytettiin plasmideja, jotka sisältävät kuviossa 1 esitetyt insertit CMV- "Immediate Early"-promoottorin ohjauksen alaisena. Nämä plasmidit (CMV-PEwt, CMV-PEst, CMV-Ewt, CMV-Est) valmistet- ...» tiin uudelleenkloonaamalla kuvattujen plasmidien SV-PEwt, ··, 30 SV-PEst, SV-Ewt ja SV-Est insertit plasmidissa pCMVfi • ··
(Clontech) (Mac Gergor et ai., Nucleic Acids Research, IRL
’ Press, Voi. 17, No. 6, 1989, s. 2365: "Construction of • « · 9 · * * plasmids that express E. coli β-galactosidase in mammalian j j * ;j· cells") ja puhdistettiin CsCl-tiheysgradienttisentrifugoin- i * * »* * 35 nin avulla (Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Labora tory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982).
«t ♦ * t * j · · *····' ,···, CMV-PEwt sisältää proteiinien prM ja E villityypin sekvens- 40 sit.
9 · » · · · « ♦ t *’.*·· CMV-PEst sisältää proteiinin prM villityypin sekvenssin ja proteiinin E deletoidun sekvenssin, josta 61 karboksipään 117974 34 aminohapon kodonit puuttuvat, jotka aminohapot muodostavat proteiini E:n membraaniankkurialueen.
CMV-Ewt:ssä suurin osa prM-sekvenssiStä ei ole läsnä mutta 5 villityyppi-proteiini E:n koko sekvenssi on.
CMV-Est ei sisällä prM-sekvenssiä mutta sisältää deletoidun proteiini E:n sekvenssin CMV-PEst:stä.
10 Jokaisesta näistä neljästä plasmidista käytettiin kahta konsentraatiota (60 pg/ml ja 300 pg/ml PBS:ssä) hiirien (Swiss albino) immunisointiin, jolloin käytettiin 10 hiirtä (5 naarasta ja 5 urosta) jokaista plasmidivalmistetta kohti. Jokaiseen hiireen injisoitiin ihonsisäisesti kaksi 15 kertaa 100 μΐ kyseessä olevaa DNA-preparaattia kahden viikon välein. Kontrolleina käytettiin plasmidia CMV3 konsentraatiossa 300 pg/ml ja PBS:ää vastaavalla tavalla. Vertailuksi immunisoitiin perinteisellä tavalla 10 hiiren ryhmät formaliini-inaktivoidulla viruksella konsentraatios-20 sa 1 pg/ml ja 5 pg/ml myös kaksi kertaa kahden viikon välein, jolloin injisoitiin ihonalaisesti 0,2 ml per hiiri ja käytettiin 0,2 % A1(0H)3 adjuvanttina. Kun toisen inunu- * nisoinnin jälkeen oli kulunut viikko otettiin hiiristä • · ,, verinäyte spesifisten vasta-aineiden osoittamiseksi \ · *t " 25 ELISArlla ja samanaikaisesti suoritettiin intraperito- 9 9 ·’ naalinen Challenge-infektio käyttämällä 500 LD50 TBE- S virusta. Seuranta-aika kesti 3 viikkoa. Taulukossa 5 on i * ?,· : esitetty vasta-aineiden määritysten ja suojakokeiden tulos- *·* »ti ? ten yhteenveto. Kuten siitä ilmenee DNA-immunisoinnilla 30 pystyttiin aikaansaamaan suoja tappavaa TBE-viruksen infek-***; tiota vastaan ainoastaan sellaisella plasmidilla, joka «d · sisältää täydellisiä proteiineja prM ja E koodaavat geenit.
f S" Tämä on luultavasti tulkittavissa siten, että proteiinin ' l » *·' ' prM/Μ läsnäolo on välttämätön subviraalisten partikkeleiden M· 35 kokoamiseksi, joissa partikkeleissa proteiini E on immuno-geenisessä muodossa.
• · • ι·«·ι t « 35 117974
Taulukko 5; Hiirien suojakokeiden tulokset
Immunoqeeni Suoja Vasta-aine-positiivi
Plasmidlt 5 PE-wt 60 pg/ml 6a/10b l°/10d PE-wt 300 gg/ml 9/10 5/10 E-wt 60 gg/ml 0/10 0/10 10 E-wt 300 μg/ml 0/10 0/10 PE-st 60 pg/ml 0/10 0/10 PE-st 300 gg/ml 0/10 0/10 15 E-st 60 pg/ml 0/10 0/10 E-st 300 pg/ml 0/10 0/10 CMV-β 300 pg/ml 0/10 0/10 20 Vertailut HCOH-virus 1 gg/ml 4/10 4/10 HCOH-virus 5 yg/ml 10/10 10/10 25 PBS 0/10 0/10 a suojattujen hiirien lukumäärä b tutkittujen hiirien lukumäärä 30 c ELISA-positiivisten hiirien lukumäärä d tutkittujen hiirien lukumäärä • • Φ · 1 • · • · • 1 • · • · * • · · • 1 1 * · • t • · * 1 · * · 1 • 1 · · • « · • · · • 1 · • · · • « 1 ···· • 1 1 ! * · · • · 1 • · · • · · • · 1 • · · • · • · • 1 • · · • 1 · * 1 · · · 1 • 1
Claims (15)
1. Rokote immunisointiin tick-born-encephalitis-virus (TBE-5 virus)-infektioita vastaan, tunnettu siitä, että se käsittää ei-infektoivaa, subviraalista partikkelia, joka olennaisesti sisältää proteiini E:n täydellisessä, natii-vissa muodossaan ja mahdollisesti proteiini prM/M:n, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokote, tunnettu siitä, että proteiini E ja mahdollinen proteiini prM/M ovat rekombinanttiproteiineja.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen rokote, tunnettu siitä, että rekombinanttiproteiini E on johdettu eurooppalaisesta tai kaukoidän alatyypin TBE-viruksesta.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen rokote, 20 tunnettu siitä, että ei-infektoiva partikkeli käsittää myös lipidikomponentin, joka edullisesti on . vesikulaarisessa muodossa.
• · « · • · • * • · ** 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen rokote, • · ·' 25 tunnettu siitä, että ei-infektoiva partikkeli on ΐ ·· · : *.* olennaisesti vapaa PCR:n avulla detektoitavissa olevista, * · ·.· ; TBE-viruksista johdetuista nukleiinihapoista. * * * • « · • · · *
6. Menetelmä TBE-rokotteen valmistamiseksi, tunnettu ! .*. 30 siitä, että « * · * · * * - tarjotaan käyttöön soluviljelyjärjestelmä, joka • · * sisältää proteiinien prM ja E koodaussekvenssit, • Φ · *.· * jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta, * · * . *...· - proteiini E ilmentyy täydellisessä, natiivissa : 35 muodossaan, jolloin • ·« • · - muodostuu subviraalisia, ei-infektoivia partik- ♦ · keleita, jotka olennaisesti sisältävät rekombi- 117974 nanttiproteiinin E täydellisessä, natiivissa muodossaan ja mahdollisesti rekombinanttipro-teiinin prM/M ja - partikkelit kerätään sekä käsitellään suoraan 5 sopivan koostumuksen saamiseksi immunisointia varten.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että tarjotaan käyttöön soluviljelyjärjestelmä, 10 joka sisältää proteiinien prM ja E koodaussekvenssit kromo-somaalisesti integroidussa muodossa, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-15 t u siitä, että soluviljelyjärjestelmässä käytetään viraalisia vektoreita.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelyjärjestelmässä työskennellään 20 ilman viruksia.
. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet- • · · · • * .. t u siitä, että käytetään plasmidivektoria. I • * • · · ♦ ♦ · ·'·.► « · ·* 25
11. Jonkin patenttivaatimuksen 6-10 mukainen menetelmä, • m m ' 7 :*.* tunnettu siitä, että proteiinien ilmentyminen ja • · ·.·· partikkeleiden muodostuminen tapahtuu jatkuvasti. • ·* • · · • * ♦
12. Ei-infektoivien, subviraalisten partikkeleiden käyttö I30 rokotteen valmistamiseksi aktiivista immunisointia varten • · · • *♦ · TBE-virusinfektioita vastaan, tunnettu siitä, että » i · • partikkelit sisältävät olennaisesti proteiini E:n täydel-« · · *·* * lisessä, natiivissa muodossaan ja mahdollisesti proteiini • · · 5.,.* prM/M:n, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta. 35 • · · * ·
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu * ♦ siitä, että proteiini E ja mahdollinen proteiini prM/Μ ovat 117974 rekombinanttiproteiineja.
14. Ei-infektoivien, subviraalisten partikkeleiden käyttö anti-TBE-virus-immunoglobuliini-preparaattien valmistami-5 seksi, tunnettu siitä, että partikkelit sisältävät olennaisesti proteiini E:n täydellisessä, natiivissa muodossaan ja mahdollisesti proteiini prM/M:n, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että proteiini E ja mahdollinen proteiini prM/M ovat rekombinanttiproteiineja. • · • · • · • ♦1 • · 1 • · • · • · · • · · • · • · • · • » · • · · • · · · · *·· * · · *··. ♦ • · * ♦ • · · • · • 1 · ····· ♦ · • · ♦ • · • · » • · * · • · · « 117974
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0135294A AT402897B (de) | 1994-07-08 | 1994-07-08 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
| AT135294 | 1994-07-08 | ||
| AT87195 | 1995-05-23 | ||
| AT0087195A AT405607B (de) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI953371A0 FI953371A0 (fi) | 1995-07-07 |
| FI953371A FI953371A (fi) | 1996-01-09 |
| FI117974B true FI117974B (fi) | 2007-05-15 |
Family
ID=25594155
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI953371A FI117974B (fi) | 1994-07-08 | 1995-07-07 | Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi |
| FI20070041A FI118222B (fi) | 1994-07-08 | 2007-01-17 | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20070041A FI118222B (fi) | 1994-07-08 | 2007-01-17 | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0869184B1 (fi) |
| AT (2) | ATE206459T1 (fi) |
| CZ (1) | CZ282927B6 (fi) |
| DE (2) | DE59508988D1 (fi) |
| DK (2) | DK0691404T3 (fi) |
| ES (2) | ES2155510T3 (fi) |
| FI (2) | FI117974B (fi) |
| HU (2) | HU219503B (fi) |
| RU (1) | RU2150294C1 (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69833388D1 (de) | 1997-11-20 | 2006-04-13 | Us Army Medical Res Materiel C | Dna impfstoffe gegen zecken-flavivieren |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| EP1572941A4 (en) * | 2002-02-26 | 2009-03-18 | Maxygen Inc | NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES |
| AU2005318171B2 (en) | 2004-12-20 | 2011-09-29 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing West Nile virus and uses thereof |
| EP1879921B1 (en) | 2005-05-12 | 2011-04-27 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| HUE027099T2 (hu) | 2006-06-06 | 2016-08-29 | Crucell Holland Bv | Humán kötõmolekulák staphylococcus elleni ölõaktivitással és alkalmazásuk |
| EP2902495B1 (en) | 2007-11-09 | 2019-12-25 | The Salk Institute for Biological Studies | Use of tam receptor activators as immunosuppressors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0284791B1 (de) * | 1987-03-20 | 1995-05-03 | IMMUNO Aktiengesellschaft | DNA- und RNA-Moleküle des westlichen Subtyps des FSME-Virus, Polypeptide, die von diesen Molekülen codiert werden, und deren Verwendung |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| WO1992003161A1 (en) | 1990-08-27 | 1992-03-05 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Flavivirus envelope proteins with increased immunogenicity for use in immunization against virus infection |
| EP0584348B1 (en) | 1992-03-11 | 2005-05-18 | Powderject Vaccines, Inc. | Genetic vaccine for immunodeficiency viruses |
-
1995
- 1995-06-21 HU HU9501832A patent/HU219503B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-21 HU HU9903233A patent/HU224199B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 AT AT98107383T patent/ATE206459T1/de active
- 1995-07-06 DK DK95890132T patent/DK0691404T3/da active
- 1995-07-06 ES ES95890132T patent/ES2155510T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES98107383T patent/ES2165109T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 EP EP98107383A patent/EP0869184B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 EP EP95890132A patent/EP0691404B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DK DK98107383T patent/DK0869184T3/da active
- 1995-07-06 DE DE59508988T patent/DE59508988D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 AT AT95890132T patent/ATE198909T1/de active
- 1995-07-06 DE DE59509667T patent/DE59509667D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-07 RU RU95113194/14A patent/RU2150294C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 FI FI953371A patent/FI117974B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 CZ CZ951769A patent/CZ282927B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-17 FI FI20070041A patent/FI118222B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI118222B (fi) | 2007-08-31 |
| EP0691404A2 (de) | 1996-01-10 |
| RU2150294C1 (ru) | 2000-06-10 |
| DK0869184T3 (da) | 2001-12-17 |
| DE59509667D1 (de) | 2001-11-08 |
| EP0869184B1 (de) | 2001-10-04 |
| FI953371A (fi) | 1996-01-09 |
| DE59508988D1 (de) | 2001-03-01 |
| DK0691404T3 (da) | 2001-03-19 |
| ES2155510T3 (es) | 2001-05-16 |
| EP0691404A3 (de) | 1997-11-12 |
| ATE198909T1 (de) | 2001-02-15 |
| ATE206459T1 (de) | 2001-10-15 |
| FI20070041A (fi) | 2007-01-17 |
| HU219503B (hu) | 2001-04-28 |
| EP0869184A3 (de) | 1999-05-12 |
| HU9501832D0 (en) | 1995-08-28 |
| CZ176995A3 (en) | 1996-01-17 |
| FI953371A0 (fi) | 1995-07-07 |
| CZ282927B6 (cs) | 1997-11-12 |
| EP0691404B1 (de) | 2001-01-24 |
| HUT72395A (en) | 1996-04-29 |
| HU224199B1 (hu) | 2005-06-28 |
| ES2165109T3 (es) | 2002-03-01 |
| HU9903233D0 (en) | 1999-11-29 |
| EP0869184A2 (de) | 1998-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020200303B9 (en) | Novel multivalent nanoparticle-based vaccines | |
| JP2024050973A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡドメインワクチン | |
| Konishi et al. | Mice immunized with a subviral particle containing the Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection | |
| EP1078092B1 (en) | Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same | |
| AU692152B2 (en) | Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments | |
| CN112469661A (zh) | 具有新结构组分的纳米粒疫苗 | |
| FI118222B (fi) | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin | |
| JP3510249B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な細胞障害性ｔ細胞を刺激するためのペプチド | |
| KR20010053042A (ko) | 구제역에 대한 합성 펩티드 백신 | |
| JP3694299B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスに対する細胞障害性ｔリンパ球の応答を誘発するペプチド | |
| Sakamoto et al. | Studies on the structures and antigenic properties of rabies virus glycoprotein analogues produced in yeast cells | |
| JP5290576B2 (ja) | 修飾されたｈｉｖ−１エンベロープタンパク質 | |
| US5840303A (en) | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus | |
| WO1998028004A1 (en) | Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen | |
| PT671947E (pt) | Composicoes para produzir respostas de linfocitos t citotoxicas contra virus | |
| US20020086403A1 (en) | Pro-apoptotic fragments of the dengue virus envelope glycoproteins | |
| EP1324770A2 (en) | Non-replicative particulate vaccine delivery system and methods of making and using same | |
| KR960015513B1 (ko) | 한국형 c형 간염 진단시약 및 백신 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 117974 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |