FI118222B - Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin - Google Patents
Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin Download PDFInfo
- Publication number
- FI118222B FI118222B FI20070041A FI20070041A FI118222B FI 118222 B FI118222 B FI 118222B FI 20070041 A FI20070041 A FI 20070041A FI 20070041 A FI20070041 A FI 20070041A FI 118222 B FI118222 B FI 118222B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- virus
- nucleic acid
- prm
- tbe
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 32
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 title claims abstract description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims description 33
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims abstract description 14
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 73
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 59
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 claims description 51
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 claims description 11
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010057199 Flaviviral infections Diseases 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000132179 Eurotium medium Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- -1 Nucleotide Amino Acid Chemical class 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 241000031091 Synodontis clarias Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100040250 Transcription elongation factor A protein-like 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
118222 1 ·,'·.ι
Parannettu rokote Flavivirusxnfektioiden vastaiseen immunisointiin 5 Keksintö koskee parannettua rokotetta, joka immunisoi TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmää sen valmistamiseksi.
TBE (Tick-Borne-Encephalitis)-virus on endeeminen monessa Euroopan maissa, entisessä Neuvostoliitossa ja Kiinassa.
10 Sairaus muodostaa merkittävän ongelman yleisen terveyden kannalta eräissä Keski-Euroopan maissa, kuten Itävallassa,
Tsekissä, Slovakiassa, Sloveniassa ja Unkarissa, joissa joka vuosi rekisteröidään useita satoja sairaalatapauksia (WHO: EURO Reports and Studies, 104, 1983).
15 TBE-virus, josta on olemassa läntinen, eurooppalainen, ja kaukoidän alatyyppi, kuuluu Flavivirussukuun, jotka virukset ovat pallomaisia lipidivaippaisia RNA-viruksia (Monath, T.P.: Flaviviruses. In: Fields, B.N. (ed.) Virology, Raven 20 Press, N.Y. 1990, s. 763-814).
Flavivirusvirioni koostuu yleensä nukleokapsidista, joka ·:* sisältää positiivisäikeisen-RNA-genomin liitettynä viraa- liseen kapsidi-(C)-proteiiniin. Nukleokapsidia ympäröi • · · 25 lipidivaippa, joka sisältää membraaniin assosioidut pro- ;·. teiinit E (50-60 kD) ja M (7-8 kD) (Heinz ja Roehrig in: • «* ]... van Regenmortel ja Neurath (ed. ) "Immunochemstry of Viruses • Φ "* II. The Basis for Seradiagnosis and Vaccines. Elsevier
Sciences, Amsterdam (1990), 289-305).
*" 30 * * · *...* Pääasiallisesti vaippaproteiini E:llä on keskeinen merkitys ·;·· Flavivirusten biologiassa, koska se välittää tärkeitä .·". viraalisia sisääntunkeutumisfunktioita ja laukaisee isän- • * · nässä suojaavan immuunivasteen. On jo olemassa huomattava » : ** 35 määrä tietoa koskien TBE-viruksen vaippaproteiini E:n * · rakennetta ja on ehdotettu rakennemalli lukuisiin bio kemiallisiin ja immunologisiin tietoihin perustuen (Mandi -ä 118222 2 ,; et ai., J. Virol. 63 (1989), 564-571).
Sairaus voidaan tehokkaasti estää rokottamalla erittäin puhtaalla formaliinilla inaktivoidulla kokovirusrokotteella 5 (Kunz et ai., J. Med. Virol. 6 (1980), 103-109), joka indusoi immuunivasteen viruksen rakenneproteiinia vastaan (Kunz, Ch. Acta leidensia 60 No.2, 1-14, 1992). Tämä rokote on osoittautunut hyväksi, mutta valmistusprosessin aikana suuria määriä infektoivia ja potentiaalisesti vaarallisia 10 virussuspensioita täytyy kuitenkin käsitellä. Siten tarvitaan laajat ja kalliit turvallisuustoimenpiteet.
Virusta neutraloivien vasta-aineiden toimintakyky riippuu siitä, miten tehokkaasti ne tunnistavat viruksen pinnassa 15 olevien proteiinien natiivit rakenteet. TBE-virusten ja muiden Flavivirusten tapauksessa on tällöin kyse erityisesti proteiini E:stä (Heinz ja Mandi, APMIS, 101 (1994), 735-745). Immunisoimalla indusoitujen mahdollisimman tehokkaasti vaikuttavien vasta-aineiden saamiseksi on siten toivot-20 tavaa, että rokote sisältää tätä proteiinia samanmuotoisena kuin se on infektoivan viruksen pinnassa. Kokoviruskuollut- * '·**” rokotteiden haittana on, että pakollinen inaktivointimene- *:* telmä saattaa johtaa osittain muutettuun proteiinirakentee- • * * · seen verrattuna natiiviin muotoon.
• · · 25 • · * m · ;·. Rekombinantti-DNA-tekniikka tarjoaa mahdollisuuden korvata t «· ]... kokoviruskuollutrokotteet rekombinanttiproteiineilla, jotka • · *'* sisältävät immuunivastetta indusoivien proteiinien olennai set osat. Yksittäisten virusproteiinien geeniteknisen • · : " 30 ilmentämisen avulla ei ole varmaa, että näin muodostuneiden
* M
rekombinanttiproteiinien antigeenirakenne vastaa jokaista ····· vastaavaa proteiinia viruksen pinnassa.
* · * * · * * TBE-virusten rekombinanttipintaproteiinien ilmentäminen * * : ** 35 tunnetaan esimerkiksi julkaisusta Allison et ai., Gemein- * * same Jahrestagung ÖBG-ÖGGT (1993) P114. Tästä käy ilmi, että ilmennettäessä vakio-olosuhteissa proteiini E ja 118222 1 ' 3 'i proteiini M erittyvät erimuotoisina mm. myös ei-infektoi-vina subviraalisina partikkeleina.
Tällaisia subviraalisia partikkeleita tunnetaan TBE-5 virusten kaukaisissa sukulaisissa, nimittäin Japanin Encephalitisviruksessa (JEV), keltakuumeviruksessa ja Dengue-viruksessa (Konishi et ai., Virology 188 (1992), 714-720 tai WO 92/03545).
10 Konishi et ai. ovat tosin esittäneet, että tällaiset subviraaliset partikkelit, jotka on emulsifioitu Freudin täydellisellä adjuvantilla ja sisältävät koko proteiini E:n, aikaansaavat tietyn immuunivasteen hiirissä. Toisaalta osoitettiin, että C-terminaalista osittain lyhennetyllä 15 proteiini E:llä voidaan aikaansaada huomattavasti tehokkaampi suoja Flaviviruksen infektiota vastaan kuin koko proteiini E:n avulla (WO 92/03161).
EP-hakemusjulkaisussa 0 284 791 on kuvattu DNA- ja RNA- 20 sekvenssejä elävän rokotteen valmistamiseksi, jolloin elävä rokote on Vaccinia-rekombinanttivirus, joka sisältää TBEV- , proteiineja koodaavaa DNA:ta. Julkaisussa on myös esitetty rekombinanttivirus, jota käytetään elävänä rokotteena. Tätä •••5 elävää rokotetta ei kuitenkaan käytetä "paljaana • * « *...* 25 nukleiinihappona" suoraan immunisointiin.
* « · * · ♦ · • * ·
Esillä olevan keksinnön tehtävänä on saada aikaan ;***; parannettu rokote Flavivirusten infektioita, etenkin TBE- • · * * infektioita, vastaan.
30 • · · ,···. Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti rokotteen • · ”* avulla, joka immunisoi Flavivirusten infektioita vastaan, ja joka käsittää ei-infektoivaa subviraalista partikkelia, * * * .
ϊ,..: joka sisältää täydellisessä, natiivissa muodossa olevaa 35 proteiini E:tä ja proteiini prM/M:ää, jotka proteiinit on • · johdettu Flaviviruksesta.
* · 4 . : 118222 i ;ϊ
Huomattiin yllättäen, että nukleiinihappoa, joka käsittää mainittuja koodaussekvenssejä, voidaan käyttää sellaisenaan immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan.
5 Tekniikan tason mukaan tiedetään, että paljaan DNA:n vieminen hiiriin voi aikaansaada immuunivasteen. Esimerkiksi hiiret pystyivät tuottamaan vasta-aineita ihmisen kasvuhormonia (hGH) vastaan, kun hiiriin oli injisoitu plasmidi, joka sisälsi hGH:n genomikopion (Nature 356 (1992), 152-10 154).
On edelleen kuvattu muutamia onnistuneita "geneettisiä immunisointeja" paljaan DNA:n avulla. Tässä geneettisessä immunisoinnissa annettiin DNA:ta, joka koodaa yhtä tai 15 useampaa virusantigeeniä, jolloin vastaavat virusantigeenit syntetisoituivat in vivo, jotka virusantigeenit jokainen erikseen saivat aikaan immuunivasteen ja voivat siten sen jälkeen suojata virusinfektioita vastaan. Onnistuneen suojaavan immuniteetin aikaansaanti hiirissä injektoimalla 20 lihaksensisäisesti influenssaviruksen DNA:ta on kuvattu julkaisussa PNAS 91 (1994), s. 9519-9523 (Raz et ai.).
·;··· Julkaisussa Vaccine 12 (16), (1994), s. 1503-1509 (Davis et ai.) on myös kuvattu onnistunut rottien ja hiirien immuni- 4 9 · « .···. sointi hepatiitti B-viruksen (HBV) -pinta-antigeenia vastaan • · 25 injektoimalla lihaksensisäisesti plasmidi-DNA:ta, joka • · ,*** sisältää HBV-pinta-antigeeniä koodaavan sekvenssin. Monet • · • I* yritykset immunisoida paljaalla patogeenistä antigeeniä _*.···* koodaavalla DNA: 11a eivät kuitenkaan onnistuneet. On esi merkiksi kuvattu (WO 93/17706) immunisointikokeita HIV:ia ·« : *** 30 vastaan suoran DNA-siirron avulla kehon soluihin; onnistu- • · · nutta rokotetta ei kuitenkaan tällä menetelmällä ole vielä saatu aikaan. Vaikuttaa erityisesti siltä, että puhtaan • * .···. DNA-rokotteen onnistuneen immunisoivan vaikutuksen aikaan- • · saamiseksi on erityisen edullista - DNA:n soluun viemisen • ’*· 35 ohella - että immuunivastetta aikaansaava antigeeni esiin- *"*ί tyy immuunijärjestelmässä natiivimuodossaan. Natiivin muodon tai natiivin muodon ja rakenteen muodostamiseksi 118222 -. .,-5 vaadittavan biosynteettisen muodon täsmällinen rakenne tunnetaan vain harvoille patogeeneille, joten tehokas immunisointi paljaan nukleiinihapon avulla osoittautuu monessa tapauksessa erittäin vaikeaksi, ellei - johtuen 5 puuttuvista täsmällisistä tiedoista antigeenirakenteesta -jopa mahdottomaksi nykyisen tiedon valossa.
Esillä olevan keksinnön puitteissa ilmeni, että immunisointi nukleiinihapposekvenssin avulla, joka koodaa ainoas-10 taan olennaisen immuunivasteen TBE-infektioissa aikaansaavaa proteiini E:ta, ei riitä suojaavan immuunivasteen aikaansaamiseksi sairautta vastaan.
Yllättäen voitiin aikaansaada onnistunut immuunivaste 15 ainoastaan antamalla nukleiinihapposekvenssiä, joka käsittää täydellisessä, natiivissa muodossaan olevan proteiini E:n koodaussekvenssin ohella myös proteiini prM/M:n koodaussekvenssin. Osoittautui lisäksi, ettei onnistunutta immunisointia voitu saada aikaan myöskään 20 nukleiinihapolla, joka sisältää proteiini E:n koodaus- sekvenssin, jossa proteiini E:n ankkurialue on deletoitu.
• ·
Esillä oleva keksintö koskee edelleen rokotetta • * · · .···. immunisointiin tick-borne-encephalitis-viruksen (TBE- * « 25 viruksen) infektioita vastaan, käsittäen nukleiinihapon, • · .1" joka koodaa proteiini E:n ja proteiini prM/M:n, jotka on • · johdettu TBE-viruksesta ja jotka vähintään ovat olennai- • · *··*! sesti täydellisessä, natiivissa muodossaan.
• · .* ·* 30 Esillä olevan keksinnön avulla pystyttiin ensimmäistä * · * kertaa osoittamaan nukleiinihappoimmunisoinnin yleisesti ....: Flaviviruksia vastaan. Keksinnön mukainen immunisointi- * · ,···, järjestelmä on siten periaatteessa käyttökelpoinen ei • · "* ainoastaan immunisointiin TBE-virusta vastaan, vaan - * · : '** 35 johtuen kaikkien Flavivirusten suuresta homologiasta kos- kien proteiini E:tä ja prM/M:ää (Chambers et ai., Annual Review of Microbiology, Voi. 44, (1990), s. 649-688: Flavi- 6 118222 virus Genome Organisation, Expression and Replication) -yleisesti immunisointiin Flavivirusten infektioita vastaan.
TBE-virusta vastaan immunisoivalle nukleiinihapporokot-5 teelle on olennaista, että proteiini E koodautuu olennaisesti täydellisessä, natiivissa muodossaan nukleiinihaposta. Luonnollisesti esillä olevaan keksintöön kuuluvat myös nukleiinihapporokotteet, joissa esiintyy geneettisen koodin degeneraatiota, joissa ei-rakenteellisesti tärkeitä amino-10 happokodoneja vaihtuu ja joissa on luonnollisia tai labora toriossa aikaansaatuja mutaatioita, edellyttäen, että proteiini E:n koodaussekvenssin nukleiinihappomodifikaatiot pystyvät aikaansaamaan onnistuneen immuunivasteen. Keksinnön piiriin kuuluvat myös rokotteet, joissa on nukleiini-15 happoja, joissa on deleetioita tai insertioita proteiini E:n koodaussekvenssissä, jotka säilyttävät proteiini E:n immunisointiin vaadittavan rakenteen antigeenisen epi-tooppialueen olennaisesti muuttumattomana, kunhan nämä modifikaatiot voidaan pitää johdettuna TBE-viruksen 20 sekvenssistä. Vastaavaa koskee luonnollisesti myös proteiini prM/M:n koodaussekvenssiä. Proteiini prM/M on tärkeä subviraalisen partikkelin luotettavan muodostumisen ja erittymisen kannalta, jolloin sekvenssipoikkeamat koskien * proteiini prM/M:ää eivät ole niin ratkaisevia kuin koskien • * 25 proteiini Eitä, kunhan vain partikkeleiden onnistunut · ...
["* kokoaminen voidaan taata. Nukleiinihapon luonne ei ole • · : olennainen keksinnön kannalta. Sekä RNA:ta että DNA:ta * * * *,«* voidaan yhtä hyvin käyttää monella käyttöalueella, jolloin DNA paremman stabiilisuutensa johdosta on edullisempi kuin ·· i *'· 30 RNA. Nukleiinihappo voidaan valmistaa joko biologisesti tai • * · kemiallisen synteesin avulla.
* • · ,··*. Proteiini E:tä koodaava nukleiinihappo on edullisesti • · "* johdettu TBE-viruksen eurooppalaisesta tai kaukoidän ala- • · i ’·* 35 tyypistä, koska nämä ovat erityisen laajasti esiintyviä « *”*! alatyyppejä.
118222 S
7 5
Erityisen edullisia nukleiinihapporokotteita ovat sellaiset, joissa nukleiinihappo on plasmidivektori.
Erityisen sopiviksi ovat osoittautuneet ne plasmidi-vektorit, joissa on tehokkaita promoottoreita, kuten 5 esimerkiksi HSV-, RSV-, EBV-, β-aktiini-, Adeno-, MMTV-, hsp- ja hGH-promoottori. Tehokkaat promoottorit mahdollistavat tehokkaan geeniekspression.
Sopivimpia vektoreita tai promoottoreita ovat plasmidista 10 pCMVB (MacGregor et ai.) johdettuja plasmideja, joissa on CMV-"Immediate Early"-promoottori.
Luonnollisesti keksinnön mukaisten nukleiinihapporokottei-den nukleiinihapot voivat käsittää myös muita koodaavia tai 15 ei-koodaavia sekvenssejä, erityisesti jos nukleiinihappona käytetään nukleiinihappovektoria.
Esimerkkeinä muista sekvensseistä - promoottoreiden ohella - mainitaan vielä markkerigeeni, muita transkription, 20 translaation ja posttranslaatiomodifikaation ym. säätäjiä.
Näiden monimutkaisempien nukleiinihapporakenteiden suhteen ··..) on kuitenkin aina huomioitava, että siinä yhteydessä kun nukleiinihappo viedään kohdesoluun ei infektoivaa virusta « voi muodostua nukleiinihapon translaation avulla, eli että · 25 rokote on "kuollutrokote" ja pysyy sellaisena.
• i • 1 * « 1 * *
Keksinnön mukainen nukleiinihapporokote voi yksinkertai- • 1 j*·'·'1- simmassa muodossaan sisältää "paljaan" nukleiinihapon, mahdollisesti sopivassa puskurissa. Voi tietenkin esiintyä • · : *' 30 myös muita aineosia, kuten lääkeaineteknisiä lisäaineita, kantaja-aineita tai erityisiä antotapaan liittyviä aineita.
* • · .***, Keksinnön mukaisia nukleiinihapporokotteita annetaan edul- • · · lisesti injektiona, erityisesti lihaksensisäisesti, ihon- • · ' " 35 sisäisesti tai ihonalaisesti, mutta sitä voidaan antaa myös · suun kautta.
118222 ί β
Annettu määrä keksinnön mukaista nukleiinihapporokotetta on riippuvainen antomuodosta ja käytetystä adjuvantista. Saman suojaavan immuunivasteen aikaansaamiseksi tarvitaan yleensä suurempi annos lihaksensisäisesti kuin ihonalaisesti. Edul-5 linen määrä on alueella 0,01 ng - 10 mg/annos, yleensä edullisesti alueella 1 ng - 1 mg/annos.
Keksinnön mukaisella nukleiinihapporokotteella on se olennainen etu, ettei tarvita soluviljelyjärjestelmää sub-10 viraalisten partikkeleiden valmistamiseksi, vaan partikkelit muodostuvat in vivo ja voivat siten suoraan aikaansaada immuunivasteen.
Keksinnön mukaisella nukleiinihapporokotteella on lisäksi 15 se etu, että ne, verrattuna proteiinipohjaisiin rokotteisiin, omaavat suuren stabiilisuuden, erityisesti jos nukleiinihappo on DNA. Siten on mahdollista varastoida rokotetta pitkiksi ajoiksi ilman suuria jäähdytyskustan-, nuksia, jolloin aktiivisuuden olennaista alenemista ei ole 20 odotettavissa. Nukleiinihappoa erityisesti lyofilisoidussa muodossa voidaan varastoida pilaantumatta jopa huoneen ·;··· lämpötilassa käytännöllisesti katsottuna rajoittamattomaksi .1. ajaksi. Lyofilisoidun keksinnön mukaisen nukleiinihappo- • · * · ,··*, rokotteen rekonstituutio on paljon helpommin toteutetta- • a "I 25 vissa kuin lyofilisoidun proteiiniliuoksen rekonstituutio, * · joka kokemuksen mukaan usein voi osoittautua ongelmal- * « liseksi proteiinin luonteesta johtuen.
t · • ·
Keksinnön mukaisen nukleiinihapporokotteen etuna on edel- : *** 30 leen, verrattuna perinteisiin kuollutrokotteisiin, että • · ·
immunisoiva antigeeni syntetisoituu in vivo ja johtaa tehokkaan solutason immuunivasteen kehittymiseen (Science ,···, voi. 258, 19.3.1993, s. 1691-1692, Research News: Naked DNA
* t *J* Points Way to Vaccines) .
!**·· 35
Edelleen toisen näkökohdan mukaan keksintö koskee nukleiinihapposekvenssiä, erityisesti nukleiinihappo- 118222 9 ΐ vektoreita, käsittäen TBE-viruksesta johdettujen proteiinien E ja prM/M koko koodaussekvenssin, lääkeaineena. Toistaiseksi ei tekniikan tasossa ole mainintaa ainoastakaan onnistuneesta nukleiinihappoimmunisoinnista 5 Flaviviruksen DNA:11a. Näiden nukleiinihappojen (nukleiini-happovektoreiden) lääkinnällinen käyttö muodostaa siten yllättävän uuden käyttömahdollisuuden. Keksinnössä vektorilla ymmärretään mitä tahansa nukleiinihappo-vehikkeliä, eli erityisesti plasmideja, viruksia tai 10 transposoneja.
Tähän asti on kuvattu ainoastaan SV40:stä johdettu plasmi-divektori, joka sisältää TBE-viruksesta johdettujen proteiinien prM/M ja E proteiinisekvenssin (Allison et ai., 15 Virus-Genes 8 (3), (1994), s. 187-198). Näiden SV40-plas- midien yhteydessä ei kuitenkaan keskusteltu mahdollisuudesta aikaansaada immunisointitehoa.
Keksinnön mukaiset plasmidivektorit eroavat aikaisemmin 20 kuvatuista plasmidivektoreista erityisesti koska ne ovat sopivia immunisointiin. Siten keksinnön mukaiset *i"; plasmidivektorit esiintyvät erityisesti käyttövalmiina *·· liuoksina tai lyofilisaatteina ruiskuissa tai ampulleissa.
»Ml «M • * ft a • · · ,*··, 25 Keksinnön mukaisesti plasmidivektoreina toimii tehokkaita * « promoottoreita, valittuna ryhmästä CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, ft ·« \,t β-aktiini-, Adeno-, MMTV-, hsp- ja hGH-promoottori, jolloin I t -**··*' erityisesti CMV-"Immediate Early"-promoottori on osoittau- tunut tehokkaaksi.
: *·· 30 • · ♦ *...: Edelleen toisen näkökohdan mukaan esillä oleva keksintö > ·...: koskee nukleiinihapon, käsittäen TBE-viruksesta johdettujen .···, proteiinien E ja prM/M koko koodaussekvenssin, käyttämistä Γ rokotteen valmistamiseksi.
: *" 35 • · · * ** · Keksintöä valaistaan jäljempänä olevien suoritusesimerkkien avulla viittaamalla kuvioihin: 118222 ίο
Kuvio 1 on ilrnentämisplasmideissa käytettyjen inserttien kaaviomainen esitys. Kuvio 2 on kuviossa 1 esitettyjen rakenteiden ilmentämiseen käytetyn plasmidin pSVft kaaviomainen esitys. Kuviossa 3a, b ja c on kuviossa 1 esitetyn 5 rakenteen SV~PEwt koko nukleotidi- ja aminohapposekvenssi. Kuviossa 4 on sekä kuviossa 1 esitettyjen rakenteiden avulla transfektoitujen että TBE-viruksen avulla infektoidun (COS/TBE) Triton X-100:lla solubilisoitujen solulysaattien immunopresipitaatio. Kuvio 5 esittää käyrää, joka osoittaa 10 proteiini E:n läsnäoloa 4-kerros-ELISA:11a määritettynä kuviossa 1 olevilla rakenteilla transfektoitujen COS-solujen viljelyalustassa. Kuviossa 6 on SV-PEwt:llä ja SV-PEst:llä transfektoitujen COS-solujen viljelyalustasta tehty immunopresipitaatio. Kuviossa 7 on COS-soluviljely-15 alustasta tehty sedimentaatioanalyysikäyrä, jolloin COS-solut on transfektoitu SV-PEwt:llä tai SV-PEst:llä tai infektoitu TBE-viruksella. Sedimentaatiosuunta on vasemmalta oikealle. Kuviossa 8 on rSP:n (SV-PEwt) sedimentaa-tioanalyysi ilman Triton käsittelyä ja 0,5 %:n Triton X-100 20 käsittelyn jälkeen. Sedimentaatiosuunta on vasemmalta oikealle. Kuviossa 9 on kuva puhdistetun TBE-viruksen ja *·*·; puhdistettujen rSPrien SDS-PAGE-analyysista; Coomassie-
Blue-värjäys. Kuviossa 10 on vertailu COS-solujen rSP:ien ««*· .··*, ja stabiilisti transfektoidun CHO-solulinjan rSP:ien t***% 25 välillä. Kuvio 11 esittää 19 proteiini E-spesifisen • 1 .!’* monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuutta 4-kerros- • · ELISA: 11a TBE-viruksen, formaliinilla inaktivoidun TBE- « « *♦·.·* viruksen, rSP:n ja rE*:n kanssa. Kuvio 12 esittää TBE-
viruksen ja rSP:n reaktiivisuuden 4-kerros-ELISA:11a • * J
• · ί ** 30 monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja C6 kanssa * * · ilman käsittelyä (pH 8,0) ja käsittelyn jälkeen pH-arvossa 6,0. Kuvio 13 esittää pE*:n reaktiivisuuden 4-kerros- • » .···, ELISA: 11a monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja C6 • · "* kanssa ilman käsittelyä (pH 8,0) ja käsittelyn jälkeen pH- • · i '** 35 arvossa 6,0.
* ♦ t · · « * ·
Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavilla esimerkeillä.
11 "...
118222 1. Partikkeleiden valmistus
Valmistettiin neljä ilmentämisplasmidia, jotka sisältävät 5 joko proteiini E:n tai proteiini E:n membraaniankkurivapaan muodon pelkästään tai yhdessä prM:n kanssa (kuvio 1).
Esimerkin näiden plasmidien valmistuksesta on kuvannut Allison et ai., Virus Genes 8 (3) (1994) s. 187-198.
10
Siinä kuvattu lähtöplasmidi pSVft on esitetty kuviossa 2.
Ilmentämiskloonien konstruoimiseksi käytettiin vektorina pSV46. Tämä vektori on SV40:een perustuvan eukaryoottisen 15 ilmentämisvektorin pSVft:n (Clontech) johdannainen, josta on poistettu β-galaktosidaasigeeniä sisältävä insertti (MacGregor G. R. ja Caskey C. T., Nucleic Acids Res 17, 2365, 1989) pilkkomalla restriktioentsyymillä Notl. Osa polylinkkeristä, joka sijaitsee translaation lopetuskohdas- 20 ta alavirtaan, poistettiin myös restriktioentsyymeillä Xbal ja Hindlll, Klenowin täydennyksellä ja ligatoitiin ····· uudelleen.
·· • · · · .*··. Tähän vektoriin sisällytettiin PCR-tuotteita, jotka saatiin • · 25 seuraavalla tavalla: • · * * ·*· · · ··
Synteettisiä oligonukleotidialukkeita käytettiin cDNA:n • ♦ *···* monistamiseen, joka cDNA vastaa joko TBE-viruksen prM+E- aluetta tai ainoastaan E-aluetta. Mandi et ai. (Mandi C.
·♦ : ** 30 W., Heinz F. X. ja Kunz C., Virology 166, 197-205, 1988) on ··· tutkinut käytettyjä nukleotidikoordinaatteja, ja ne sisäl- tävät TBE-genomin 20 ensimmäistä nukleotidiä (Mandi C. W., ,··*, Heinz F. X., Stockl E. ja Kunz C., Virology 173). 5'- • · *i* Alukkeet prM+E- ja ainoastaan-E-rakenteille olivat 27-
: ** 35 meerejä joiden sekvenssit ovat AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA
ja AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Kummankin sekvenssin 11 ensimmäistä nukleotidiä ovat keinotekoisia ja sisältävät 12 118222 restriktioentsyymin NotI tunnistuskohdan (GCGGCCGC) ja sen jälkeen seuraa 16 nukleotidiä pitkä sekvenssi, joka vastaa joko nukleotidejä 388-403 (SV-PE-ketju) tai 883-898 (SV-E-ketju), Luonnossa esiintyvää ATG-kodonia käytettiin molem-5 missä tapauksissa aloituskodonina sijoitettuna vastaavaan geeniin nähden ylävirtaan, ja aluketta muotoiltiin siten, että ATG on sijoitettu sopivaan ympäristöön (GCCGCCATGG) tehokkaan translaatioinitiaation kannalta COS-soluissa v (Kozak M., Cell 44, 283-292, 1986; Kozak M., J Mol Biol 10 196, 947-950, 1987). Molemmissa rakenteissa käytettiin samaa 28 nukleotidiä pitkää oligonukleotidiä (ATGCGGCCGC TAGTCATACC ATTCTGAG) 3'-alukkeena. Tämä aluke oli 3'-päästään komplementaarinen nukleotideille 2535-2550 ja sisälsi 5'-päässään Notl-kohdan ja TAG-lopetuskodonin 15 komplementin (CTA) samassa lukukehyksessä.
-v PCR-monistuminen suoritettiin olennaisesti standardiolo-suhteissa Cetus-protokollan mukaisesti (Saiki R* K.,
Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn 20 G. T., Mullis K. B. ja Erlich H. A., Science 239, 487-491, 1988). Reaktioseokset sisälsivät 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, joskus 200 μΜ dNTP, 10 ng jokaista aluketta, 10 μΐ cDNA-matriisin 1000-kertaista laimennosta φ ja 3 E AmpliTaq-polyrneraasia (Perkin Elmer Cetus) kokonais- • · 25 tilavuudessa 100 μΐ. Näytteet peitettiin 100 piillä para- * · ]"·’ fiiniöljyä Perkin Elmerin termisessä kierrätyslaitteessa.
♦ · * · · • · · Näytteet pidettiin 6,5 min 94 °C:ssa, sitten jäähdytettiin liittämislämpötilaan 40 °C ennen kuin Taq-polymeraasia • · : *·* 30 lisättiin. Kaikenkaikkiaan suoritettiin 35 monistussykliä.
• · Φ
Jokainen sykli koostui 1,5 minuutista 94 °C:ssa, 3 minuu-tista 40 °C:ssa ja 7 minuutista 68 °C:ssa. Näytteet puhdis- • · tettiin uuttamalla fenolilla ja kloroformilla, saostamalla T etanolilla ja uudelleenliuottamalla steriiliin kahteen : *·· 35 kertaan tislattuun veteen. PCR-tuotteiden laatu ja määrä selvitettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja näytteet säilytettiin -20 °C:ssa kunnes niitä käytettiin seuraavassa 13 118222 kloonausvaiheessa.
Polymeraasiketjureaktiota käytettiin cDNA-plasmidikloonien minipankin muodostamiseksi, jotka kloonit sisältävät in-5 serttejä, jotka vastaavat TBE-virusgenomin joko prM+E- aluetta (SV-PE-ketju), nukleotidit 388-2550, tai E-aluetta (SV-E-ketju), nukleotidit 883-2550 (Kuvio 1).
Normaalisti TBE-viruksen rakenneproteiineja tuotetaan suur-10 ten polyproteiiniesiasteiden kotranslaation kautta; nyt tuotiin kuitenkin translaation aloitus- ja lopetuskohdat PCR-tuotteen päihin sisällyttämällä näitä kohtia oligo-nukleotidialukkeisiin. Jokaiseen rakenteeseen lisättiin luonnollinen ATG-kodoni, joka sijoitettiin sopivaan 15 ympäristöön, jotta se toimisi initiointikodonina, sisäiseen signaalisekvenssiin nähden ylävirtaan, luonnollisen prosessoinnin mahdollistamiseksi isännän signalaasin avulla ja oikean erittymistien aikaansaamiseksi. Vastaavalla tavalla sijoitettiin TAG-lopetuskodoni jokaiseen rakenteeseen 20 signalaasi-pilkkomiskohtaan nähden alavirtaan, joka pilkko-miskohta muodostaa proteiini E:n karboksipään. Päihin sisällytettiin myös restriktioentsyymin NotI tunnistus-kohdat PCR-tuotteiden seuraavaksi suoritettavan kloonauksen helpottamiseksi.
• · • · *“25 • · · ]"** PCR-DNA:t katkaistiin Notlillä ja ligatoitiin plasmidi- • · : ’’ vektorin pSV46 Notl-kloonauskohtaan, mikä mahdollisti sen, • · · *'...' että oikein insertoidut geenit ilmentyivät aikaisen SV40- promoottorin ohjauksen alaisena (MacGregor G.R. ja Caskey ·· : *** 30 C. T., Nucleic Acids Res 17, 2365, 1989). Vektori tarjosi • · · :...ϊ myös käyttöön polyadenylointisignaalin tehokasta ilmentä- mistä varten ja SV40-replikointilähteen rekombinantti- • * #···. plasmidien replikaation mahdollistamiseksi transfektoi- • · *" duissa COS-soluissa, jotka konstitutiivisesti ilmentävät : **· 35 suuren SV40-T-antigeenin (Gluzman Y., Cell 23, 175-182, *:*·: 1981) .
4 14 118222
Ligatointiseosta käytettiin E. colin HB 101 transformaatioon ja yksittäisiä ampicilliiniresistenttejä pesäkkeitä eristettiin, jotka vastaavat yksittäisiä klooneja. Insert-tien orientoituminen jokaisessa plasmidissa määritettiin 5 pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja agaroosigeelielektro-foreesilla. Oikein orientoutuneita inserttejä sisältävät kloonit säilytettiin lisäanalysointia varten. ;
Oikein orientoutuneita inserttejä sisältävät plasmidit 10 identifioitiin restriktioanalyysin avulla ja puhdistettiin I
CsCl-gradienttisentrifugoinnin avulla. i
Jokaisesta plasmidirakenteesta käytettiin yksittäisestä 1 preparaatista puhdistettua kaksisäikeistä plasmidi-DNA:ta 15 DNA-sekvenssimääritystä varten. Sekvensointireaktiot suoritettiin Perkin-Elmerin termisessä kierrätyslaitteessa käyttämällä TBE-spesifisiä alukkeita, AmpliTaq-polymeraasia ; (Perkin Elmer Cetus) ja fluoresoivalla väriaineella merkittyjä dideoksiterminaattoreita valmistajan ohjeiden mukai-20 sesti (Applied Biosystems). Sekvensointireaktion tuotteet analysoitiin Applied Biosystemsin automaattisella DNA- # sekvensointilaitteella 373A.
·**»· • · ···'· PCR:llä tuotettujen mutaatioiden analysointi • · « 25 ··«
Valittiin 13 yksittäistä E. coli-kloonia, jotka sisältävät I'·. SV-PE-sarjan plasmideja, ja 9, jotka sisältävät SV-E-sarjan plasmideja, kloonattujen inserttien tarkan analyysin * · ...
suorittamiseksi ja Taq-polymeraasilla tapahtuvan mutatoin-30 nin tehokkuuden arvioimiseksi. Plasmidi-DNA jokaisesta * ·· * .···. kloonista puhdistettiin ja analysoitiin kloonattujen in- ♦ · *’* serttien molemmat säikeet täydellisellä sekvensoinnilla. :
Sitten verrattiin cDNA-sekvensse jä vastaaviin emo kantana toimivan villityypin TBE-viruskannan Neudorfl'n RNA-35 sekvensseihin (Mandi C. W., Hein2 F. X. ja Kunz C., • ·
Virology 166, 197-205, 1988).
• · 15 118222
Jokaisen plasmidikloonin nukleotidisekvenssissä oli odotetusti useita eroja verrattuna villityypin TBE-virussekvens-siin. Nämä muutokset olivat muutamin poikkeuksin (ks. jäljempänä) yleensä yksittäismutaatioita, joita ilmeisesti 5 muodostui PCR-monistuksen aikana ja jotka oli löydettävissä ainoastaan yksittäisissä klooneissa.
* ····· • · • · · * ··· • · • · ··· ··· « · • · ··· ♦ * • * • · · « ·*· • · ♦ · « · · ·· • · ...
• · · * * • · • * · ··* • * • * * * * * · • · · * « · · · « • « 16 118222
Taulukko 1. Yhteenveto PCR:llä tuotetuista mutaatioista
Nukleotidi- Aminohappomuutoksetb Klooni muutokset^ prM E
5
SV-PE
01 945 G->A
1122 G->C Gin 50->His
1395 C->T
10 2027 T->C Vai 352->Ala 24 80 A->GC i 02 551 T->A Vai 24->Glu
1080 G~>A
1153 T->C
15 1168 T->C Ser 66->Pro 1690 A->G Arg 240->Gly 2458 G->del Ala 495->lukukehyksen 03 952 T->C Cysl58->Arg siirtymä 976 C->T Arg 2->Cys 20 1163 A->G Lys 64->Arg 1679 A->G Asn 236->Ser 1889 T->A Met 306->Lys
04d 1434 C->T
2275 A->T Lys 435->lopetus
25 2364 G->A
05c 701 T->C Leu 74->Pro
1488 (»A 1492 T->C
1893 T->A Cys 307~>lopetus 30 06 782 T->C Leul01->Pro 865 A->G Lysl29->Glu
, 1002 C->T
·:**.* 1972 G->A Gly 334->Arg tlm 07c 1327 G->del Ala 119->luku. siir.
..." 35 2248 G->A Ala 426->Thr 08 701 T->A Leu 74->Gln 2092 A->G Met 374->Val
2124 T->C
09 4 52 T->Cc
: “ 40 960 Λ->T
1746 A >G
··*.. 2086 A->G Ile 372->Val
2142 T->C
:·. 2290 G->A Vai 440->Ile
45 2361 A->G
: : SV-PE
10c 1625 A->G Asp 218->Gly
·:*·: 2475 T->C
llc 50 12c 1203 G->A Met 77->Ile 13c 1366 T->C Tyr 132->His ; *·· 1381 A->G Ile 137->Val 1728 G->A Met 252->Ile
* ‘ 2134 C->T
55 5 118222 π
Nukleotidi- Aminohappomuutoksetb ;
Klooni muutokset3 prM E
SV-E
01d 1239 C->T
02 1093 A->T Met 41->leu
2301 C->T
10 03 1321 G->A Vai 117->Ile 1688 A->G Glu 239->Gly 1717 G->A Ala 249->Thr 2053 A->G Asn 361->Asp 2092 A->G Met 374->Val
15 04 2073 T->C
2438 C->T Ala 489->Val 05 938 T->C (Leul53->Pro)f 973 T->C Ser l->Pro 2401 T->G Ser 477->Ala
20 06 891 C->T
1151 G->A Cys 60->Tyr 1364 T->C Vai 131->Ala 1567 A->G Ile 199->Val 2045 T->C Ile 358->Thr
25 07 1257 T->C
1694 T->C Leu 241->Pro
1794 A->G
2159 G->T Gly 396->Val
08 1806 A->G
30 2205 A->G
09 2491 A->delc ···»· a Nukleotidikoordinaatit koskien koko TBE-genomia
^*ί* 35 b Aminohappokoordinaatit koskien prM tai E
c Aminohappomuuutokset NS1- tai C-geenissä d SV-PE04 uudelleennimitetty "SV-PEst”: ksi ja SV-E01 "SV-.***. Ewt" : ksi e Muita mutaatioita kuin PCR:llä aikaansaatuja ei ole i 40 esitetty (vrt. teksti) f Tässä rakenteessa oli vain prM:n C-terminaalinen osa ···*_ läsnä : *·· 45 « · *...· Kuten taulukossa 1 on esitetty 22 sekvensoidussa insertissä (yhteensä 43549 emäsparia) oli 71 yksittäistä nukleotidi- ♦ * ,···. muutosta, joita voitiin lukea Taq-polymeraasin virheiksi.
* ♦ "* Näistä muutoksista 42 (59 %) johti substituutioihin ennus- » · : *·· 50 tetussa aminohapposekvenssissä ja 3 johti deleetioihin, jotka aiheuttivat lukukehyksen siirtymisen (taulukko 2) .
18 118222
Taulukko 2. PCR-mutaatioiden yleisyys
Esiintyminen3 Yleisyys
Emäsparin muutokset kpl(%) (per emäspari) 5 G/C->A/T 20 (28 %) 4,59 x 10'4 G/C->T/A 2 (2,8 %) 4,59 x 10'5 G/C->C/G 1 (1,4 %) 2,30 x 10-5 A/T->G/C 37 (52 %) 8,50 x 10'4 10 A/T->C/G 1 (1,4 %) 2,30 x 10-5 A/T->T/A 7 (9,9 %) 1,61 x 10"4 G/C deleetio 2 (2,8 %) 4,59 x 10"5 A/T deleetio 1 (1,4 %) 2,30 x 10~5
Siirtymiä 57 (80 %) 1,31 x 10”3 15 Transversioita 11 (15 %) 2,53 x 10~4
Kaikki mutaatiot 71 (100 %) 1,63 x 10“3
Aminohapposubstituut. 42 (59 %) 9,64 x 10"4
Hiljaisia mutaatioita 24 (34 %) 5,51 x 10~4
Lukukehyksen siirtymiä 3 (4,2 %) 6,89 x 10"5 20 Lopetuskodoneja 2 (2,8 %) 4,59 x 10‘5 a43549 emäsparia sekvensoitiin 25 Mutaatioiden jakauma oli kääntynyt voimakkaasti A/T->G/C-ja G/C->A/T-siirtymämutaatioiden eduksi, kuten jo aikaisemmin on todettu (Dunning A. M., Talmudd P. ja Humphries S. E., Nucleic Acids Res 16, 10393, 1988; Chen J., Sahota •I": A., Stambrook P-· J. ja Tischfield J. A., Mutat Res 249, ··· 30 169-176, 1991; Cadwell R. C. ja Joyce G. F., PCR Methods » · · *
Applic 2, 28-33, 1992). Kokonaismutaatioiden yleisyys oli *·· _3 ,··. 1,63 x 10 per emäspari 35-syklisessä monistuksessa (4,7 x • · ."* 10~5 per emäspari ja sykli), mikä vastaa Taq-polymeraasin • · · *... virheiden yleisyydestä julkistettuja arvoja (15,32). Keski- * · ·*’·' 35 määräinen aminohapposubstituutiomäärä oli 0,46 per geeni .. prMrlle (164 aminohappoa pitkä) ja 1,59 E: lie (496 amino- • t :,,2 happoa pitkä).
• * • · • •t ·:·*: Hiljainen mutaatio nukleotidin 930 kohdalla esiintyi 40 kaikissa klooneissa ja on oletettu, että se on muodostunut * · · ,.i luonnollisena mutaationa viruskasvatuksen aikana. Lisäksi • · * " todettiin, että SV-PE-sarjan viidessä kloonissa, SV-PE05, : : SV-PE07, SV-PEll, SV-PE12 ja SV-PE13, oli seitsemän yhteistä identtistä mutaatiota nukleotideissä 849, 1285, 19 ' f 118222 1346, 1404, 1909, 2247 ja 2255. Kloonissa SV-PE10 oli kolme näistä mutaatioista (1909, 2247 ja 2255), mutta muissa SV-PE-klooneissa ei ollut mutaatioita näissä kohdissa eikä - yhdessäkään SV-E-kloonissa. Eräs näistä muutoksista, 5 nukleotidin deleetio kohdassa 1346, aiheuttaa lukukehyksen siirtymisen E-geenin kodonissa 125, ja on siten odotettavissa, että tästä muodostunut E-proteiini ei ole toimiva.
Koska klooni, jossa on eräs näistä seitsemästä mutaatiosta, saatiin riippumatta siitä, mistä erillisistä cDNA- ja PCR-10 preparaateista se valmistettiin (ei esitetty tuloksia), vaikuttaa siltä, että nämä variantit esiintyivät jo virus- j RNA-populaatiossa ennen monistumista. Näitä erikoisia mutaatioita ei siten ole sisällytetty PCR:llä saatujen mutaatioiden analyyseihin.
15
Rakenteita, jotka koodaavat villityypin ja deletoituja E- proteiineja
Yksittäisiä aminohappomuutoksia koodaavien kloonien lisäksi 20 olimme myös kiinnostuneita prM + E- ja ainoastaan-E-raken-teiden valmistuksesta, jotka rakenteet koodaavat villi-tyypin ja deletoituja proteiineja. Koska kuitenkin kaikki .·. PCR:llä saaduissa SV-PE-sarjan klooneissa oli mutaatioita, jotka johtaisivat aminohappomuutoksiin, käytettiin suoraa » · "* 25 subkloonausta villityyppi-rakenteen valmistamiseksi, joka • · *"·* rakenne kodaa modifioimattomia prM- ja E-proteiineja sekä ; ♦ * ί ** ainoastaan-E-rakenteen deletoitua muotoa.
• m* .
• · o * ···
Plasmidin SV-PE04 DNA-sekvenssissä oli kahden hiljaisen ·♦ : *·· 30 mutaation lisäksi A/T-substituutio nukleotidissä 2275, ·♦· ί,,,ί jolloin AAC-kodoni, joka vastaa proteiini E:n lysiiniä 435, muuttui TAG-lopetuskodoniksi (taulukko 1) . On siten ennus- * · 4...t tettu, että SV-PE04 koodaa villityyppi-prM-proteiinia ja • · *1* deletoitua E-proteiinia, josta karboksipään 61 aminohappo- • · * • ’·· 35 jäännöstä puuttuu, joka puuttuva osa sisältää oletetun *!’*: membraaniin kiinnittyvän alueen (Mandi C. W., Guirakhoo F.,
Holzmann H., Heinz F. X. ja Kunz C., J Virol 63, 564-571, 20 ‘ 118222 1989) . Osoittautui, että plasraidissa SV-E01, josta suurin osa prM-geenistä puuttuu, on vain hiljainen mutaatio E-geenissä, jolloin se koodaa villityyppi-E~proteiinia.
5 Villityypin aminohapposekvenssin koko pituuden käsittävän prM + E-rakenteen ja lopetuskodonin nukleotidikohdassa 2275 omaavan, ilman prM:ää olevan ainoastaan-E-rakenteen luomiseksi siirrettiin restriktiofragmentteja SV-PE04:stä ja SV-E01:stä (tästä lähtien nimetty SV-PEst:ksi ja SV-Ewt:ksi).
10 Tätä tarkoitusta varten käytettiin kahta restriktio- entsyymin CfrlOl katkaisukohtaa, toinen nukleotidien 960 ja 961 välissä, lähellä prM- ja E-geenien rajaa, ja toinen vektorin ampicilliiniresistenssigeenissä. Toinen aikaansaaduista plasmidirakenteista, SV-PEwt, sisältää villityyp-15 pi-prM-geenin SV-PEst:stä ja villityyppi~E-geenin SV-Ewt:stä, kun toinen, SV-Est, josta puuttuu prM-geeni, sisältää lopetuskodonin sisältävän E-geenin SV-PEst:stä.
Nämä muutokset vahvistettiin sekvensoimalla molempien plasmidien insertit. Näiden rakenteiden avulla saatiin 20 neljä ilmentämisplasmidia, joiden avulla voitiin verrata ilmennettyjen E-proteiinien muokkaamista ja rakenteita, ....Ϊ joka vertailuproteiini on saatu villityyppi-rakenteesta (SV-PEwt) ja vertailun kohteena olevat proteiinit, ovat proteiineja, joista puuttuu prM (SV-Ewt), E-ankkurialue *" 25 (SV-PEst) tai molemmat (SV-Est).
9 · • · · 91 9 9 • 1' PEwt-insertin koko sekvenssi on esitetty kuviossa 3a, b ja **# • « * 1 n 9 9 9 · • · : ’·· 30 COS-soluja transfektoitiin sopivilla plasmideilla ja * Φ · !,..ϊ rekombinanttiproteiinien ilmentyminen analysoitiin seuraavalla tavalla: • · · 9 9 9
21 J
118222 (Gibco-BRL) täydennettynä 10 %:lla fetaalista naudan-seerumia, penisilliinillä (100 E/ml) ja streptomysiinillä (100 pg/ml) 37 °C:ssa ja 5 %:ssa CO2.
5 Kloonattuja TBE-geenejä sisältävät plasmidit tuotiin COS-1-soluihin liposomivälitteisellä transfektiolla käyttämällä modifikaatiota Feigner et al:n menetelmästä (Feigner P. L.,
Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M.,
Northrop J. P., Ringold G. M. ja Danielsen M., Proc Natl 10 Acad Sei USA 84, 7413-7417, 1987) BioRad Gene Pulser-
laitteen avulla. Lipofectin-reagenssi (Gibco-BRL) laimennettiin pitoisuuteen 20 pg/ml Opti-MEM-I-puutteiseen seerumialustaan (Gibco-BRL) ja sekoitettiin vastaavaan tilavuuteen OptiMEM-I:tä, joka sisältää 8 pg/ml kyseessä 15 olevaa plasmidi-DNA:ta. Transfektointiin käytettiin 5 pg Lipofektiniä ja 2 pg plasmidi-DNA:ta. Seoksen annettiin seistä 15 min huoneenlämmössä DNA-Lipofectin-kompleksien muodostamiseksi ja 0,5 ml tätä seosta lisättiin solu-viljelylevyn (Nunc) jokaiseen 24 syvennykseen, joissa oli 20 soluja, jotka oli pesty kaksi kertaa 1 ml:lla OptiMEM
kasvualustan seerumijäänteiden poistamiseksi. Solut in-····! kuboitiin DNA-Lipofectin-seoksen kanssa 5 h 37 °C:ssa, 5 • j, %:ssa CO2, jonka jälkeen lisättiin 1 ml täydellistä COS- ]···, alustaa ja inkubointia jatkettiin yön yli. 24 h trans- « · V/. 25 fektion jälkeen alusta poistettiin ja korvattiin uudella • · COS-alustalla, ja inkubaatiota jatkettiin n. 46 h trans- • ' t • fektion jälkeen, jolloin solut joko preparoitiin immuno- 1 · *··.* fluoresenssianalyysia varten tai liuotettiin intrasellu- laaristen antigeenien analysoimiseksi ELISA:11a.
ί **· 30 ···
Menetelmä COS-solujen infektoimiseksi TBE-viruksella « immunofluoresenssin vertailunäytteen tekemiseksi suori-,··*. tettiin olennaisesti samalla tavalla kuin transfektointi, kuitenkin sillä erolla, että plasmidi-DNA:n ja Lipofectinin • · i 35 sijasta käytettiin TBE-virusta hiiri-imettäväisen aivo- * suspension muodossa, joka oli laimennettu 100 kertaa OptiMEM-1-alus taan.
22 118222
Ilmennettyjen proteiinien analysointi a. Solulvsaattien immunopresipitaatio 5
Transfektoidut solut merkittiin 35S-kysteiinillä, solu-bilisoitiin Triton X-100:lla ja tehtiin immunopresipitaatio polyklonaalisen kaniseerumin kanssa, joka oli spesifinen TBE-viruksen proteiineille E ja prM. Kuten kuviosta 4 10 nähdään, rakenteiden SV-PEwt ja SV-Ewt ilmentäminen johti autenttisen kokoisen proteiinin E syntetisointiin. SV-PEst:stä ja SV-Est:stä syntetisoidut proteiinit olivat, kuten odotettavissa oli, hieman pienempiä kuin villityyppi-E-proteiini johtuen niiden lyhennetystä C-terminaalista.
15 b. Rekombinanttiproteiinin erityksen analysoiminen solujen kasvatusalustasta
Proteiini E:n läsnäolo transfektoitujen solujen kasvatus-20 alustasta analysoitiin kvantitatiivisesti päivinä 0-4 transfektion jälkeen käyttämällä neljäkerroksista ELISA:a, :··.· kuten Heinz et ai., J. Biol. Stand. (1986), 14: 133-141 on kuvannut. Kuviossa 5 annetut tulokset osoittavat, että vain ···· ,·*·, ne rakenteet, jotka myös ilmentävät prM-proteiinia, johti- • · 25 vat proteiini E:n erittymiseen. Kasvualustan immunopresi- • · .’** pitaatio (kuvio 6) vahvisti sen, että eristetyt proteiinit • · olivat samankokoisia vastaavien solunsisäisten proteiinien *···* kanssa (vrt. kuvio 4).
ί ** 30 Rekombinanttiproteiinien erittyminen on valtavaksi hyödyksi • · · \..J tuotantoa ajatellen, koska silloin voidaan välttää solujen rikkominen ja kontaminoivan solumateriaalin poistaminen .···. halutun proteiinin saamiseksi. Sopivissa olosuhteissa tämä • » mahdollistaa myös rekombinanttiproteiinin jatkuvan saannin * · : ** 35 soluja rikkomatta.
• · · · « ♦ ·
23 I
118222 c. Eristyneiden rekombinanttiproteiinien karakterisointi <
Kuviossa 5 esitetyt kasvualustat sakkaroosi-tiheys- gradientti-vyöhykesentrifugoitiin käyttämällä 5-30 % 5 (paino/paino) sakkaroosigradienttia ja Beckmanin SW-40- roottoria. Sentrifugointi suoritettiin 38000 U/min ja 4
°C:ssa 100 min. Gradientit fraktioitiin ja proteiini E
määritettiin kvantitatiivisesti jokaisesta fraktiosta neljäkerroksisella ELISA:11a (ks. Heinz et ai., J. Biol.
10 Stand. (1986) 14: 133-141). Viruksella infektoitujen solujen kasvualustaa käytettiin kontrollina, joka antoi kaksi proteiini E-pitoista piikkiä (kuvio 7), joista toinen vastaa koko virusta ja toinen vastaa nk. ei-infektoivaa "hitaasti sedimentoivaa hemagglutiniinia" ("slowly- 15 sedimenting hemagglutinin" (SHA)) (ks. Russel et ai.
(1980), Chemical and antigenic structure of Flaviviruses.
In: Schlesinger, R. W. (ed.) The Togaviruses, 503-529,
Academic Press). SV-PEwt:llä transfektoitujen solujen kasvatusalusta sisälsi E:n partikulaarisen muodon, jonka 20 sedimentaationopeus vastaa viraalisen SHA:n nopeutta, kun taas C-terminaalista lyhennetty proteiini E, joka oli saatu SV-PEst:stä, ei muodostanut stabiilia partikkelia ja jäi *·· gradientin yläpuolelle.
····· * t 1 • » » · ,··, 25 SV-PEwt:stä saatua partikulaarista muotoa kutsuttiin • 1 "rekombinanttiseksi subviraaliksi partikkeliksi" (rSP) ja "... SV-PEst:stä saatua liukoista muotoa "rekombinantti-E1: ksi" ( r E 1) .
• · J 2 30 Käsittelemällä rSP:tä 0,5 %:lla Triton X-100 partikkelit • · · ·...1 dissosioituivat, kuten käy ilmi kuvion 8 sedimentaatio- % analyysista, mikä viittaa lipidimembraanin läsnäoloon.
·«· • · • · • · » \ • · * 1
M
· · · « 2 * 1 24 118222 rSP:n ja rE*:n preparointi a. r5P:n puhdistus 5 SV-PEwt:llä transfektoitujen COS-solujen kasvualusta selkeytettiin sentrifugoimalla 30 min 10000 U/min 4 °C:ssa Sorvailin korkeanopeussentrifugilla ja partikkelit saatiin sitten sentrifugoimalla 120 min 44000 U/min 4 °C:ssa, jolloin käytettiin Beckmanin Ti45-roottoria. rSP-pitoinen 10 pelletti-fraktio resuspendoitiin TAN-puskuriin, pH 8,0 ja vietiin 5-20 % sakkaroosigradienttiin, joka oli tehty samaan puskuriin. Sentrifugoimisen jälkeen Beckmanin SW40-roottorissa (90 min, 38000 U/min ja 4 °C) näytteet fraktioitiin, ja piikin muodostavat fraktiot identifioitiin 15 testaamalla HA-aktiivisuus (Clarke ja Casals, 1958, Aver.
J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573). Vyöhykegradientista saadut piikki-fraktiot puhdistettiin edelleen tasapaino-sentri-fugoimalla (35000 U/min, 4 °C, yön yli), ja fraktiot identifioitiin taas HA:n avulla. Proteiini E:n kokonais-20 määrä määritettiin kvantitatiivisesti 4-kerroksisella ELISArlla ja puhtaus määritettiin SDS-PAGE:n avulla käyttä- * *ί**ϊ mällä Coomassie-Blue-värjäystä (kuvio 9) .
• · · * »··· b. rE*:n preparointi • · · 25 ;”* SV-PEst:llä transfektoitujen COS-solujen seerumivapaita • * · *... kasvatusalustoja selkeytettiin kuten yllä on kuvattu ja • * -*·· konsentroitiin n. 15-kertaiseksi ultrasuodattamalla.
·· • · ; ’* 30 Kromosomaalisesti integroitua prM- ja E-qeeniä sisältävien • ·» _ ~ 1 1 *...* solulinjojen valmistus % • · · · * • · .··. Stabiilisti transfektoitujen rSP:itä tuottavien solujen • t valmistamiseksi käytettiin dihydrofolaattireduktaasi : ** 35 (DHFR)-selektiojärjestelmää (Current Protocols in Molecular **”· Biology, John Wiley & Sons, Inc.) sekä jokaista rakennetta, joka sisältää proteiinien prM ja E koko geenit (kuvio 1) ja '25 : : 118222 joka johtaa rSP:iden syntetisointiin ja erittymiseen. DHFR-geenin siirto tapahtui plasmidin pSV2-dhfr (Subramani et ai., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864, 1981) avulla, prM- ja E-geenien siirto tapahtui plasmidin CMV-PEwt avulla, joka oli 5 valmistettu uudelleenkloonaamalla plasmidista SV~PEwt saatu insertti plasmidissa pCMVB (Clontech).
DHFR-puutteellista hamsterisolulinjaa CHO-DG44 (Som. Cell.
Mol. Get. 12, 555-666, 1986) kasvatettiin HAM:n Fl2-alus-10 tässä, johon oli lisätty 10 % fetaalista vasikanseerumia (FVS) ja transfektoitiin pCMV-PEwt:llä ja pSV2-dhfr:llä v ' suhteessa 20:1 elektroporaatiolla käyttämällä BioRad Gene Pulser-laitetta. Sen jälkeen transfektoidut solut kasvatettiin edelleen 2 päivää HAM:n F12-alustassa + 10 % FVS, 15 trypsinisoitiin, laimennettiin paljon ja siirrettiin selektioalustaan (MEM-a ilman ribo- ja deoksiribonukleo-tidejä + 10 % dialysoitua FVS) Petrimaljoihin yksittäisten DHFR ja prM+E ilmentävien solukloonien eristämiseksi. Noin 10 päivän jälkeen siirrettiin mikroskoopissa näkyviä yksit-20 täisiä solupesäkkeitä pieniin soluviljelyastioihin ja kasvatettiin edelleen. Ne solukloonit, jotka tuottavat $ *ϊ*’ί FSME-spesifista antigeeniä, identifioitiin analysoimalla ;· solukasvatusalustaa ELISA: 11a.
«··· • · * • « • · • · « 25 Erästä näistä soluklooneista (CHO-37) käytettiin tuotta- * · » ··, miensa rSPrien eristämiseen ja karakterisointiin. Sen • ·« ]... lisäksi solut kasvatettiin yllä mainitussa selektio- • « -·**’" alustassa ja rSP:t puhdistettiin siitä samalla tavalla kuin COS-soluista eristettyjen rSP:ien osalta on kuvattu.
Φ · 30 Sakkaroosi-tiheysgradienttisentrifugoinnin tulos on • · ’···* esitetty kuviossa 10, jossa on verrattu COS-soluista ·;··· saatuja rSPiitä stabiilisti transfektoidusta solulinjasta CHO-37 saatuihin rSP:hin. Käytetyt sentrifugointiolosuhteet • * * ..· olivat seuraavat: 20-50 % sakkaroosi, Beckman TI-40- • * • 35 roottori, 35000 UpM yli yön. Sentrifugoinnin jälkeen ' * fraktioitiin gradientit ja yksittäiset fraktiot analysoi tiin hemagglutinaatiokokeella ja ELISA:11a FSME-virus- 26 118222 d spesifisellä antigeenillä. Kuten kuviosta ilmenee, preparaattien sedimentaatioreaktiot eivät spesifisen tiheyden eivätkä spesifisen hemagglutinaatioaktiivisuuden i suhteen eronneet toisistaan.
5 2, Karakterisointi verrattuna natiiviin proteiinirakenteeseen Tällä tavalla valmistetut preparaatit analysoitiin 10 seuraavalla tavalla: a. antigeenirakenteen analyysi käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, b. kyky happoindusoituihin konformaatiomuutoksiin c.
15 hemagglutinaatioaktiivisuus a. Antigeenirakenne
Formaliinilla inaktivoidun kokoviruksen antigeenirakennetta 20 verrattiin natiivin infektoivan viruksen antigeenirakenteeseen käyttämällä 19 spesifistä vasta-ainetta proteiini E:tä , vastaan (Mandi et el. 1989, J. Virol. 63: 564-571; omat kokeet). Jokaisen yksittäisen monoklonaalisen vasta-aineen * * ...ί reaktiivisuus analysoitiin yllä olevien preparaattien **♦ *...· 25 avulla 4-kerroksisen ELISA:n avulla kuten Heinz et ai. on kuvannut J. Biol. Stand. (1986), 14: 133-141. Tällöin :*·,♦ käytettiin kaikista antigeenipreparaateista proteiini E:n j“*j suhteen ennestään määritettyä vakiopitoisuutta 1 pg/ml ja ··· käytettiin sellaista vasta-aineen laimennosta, jossa on :·, 30 jokaista monoklonaalista vasta-ainetta sen verran, että • «· *.·· saadaan natiivin infektoivan viruksen kanssa ekstinktio- • · • · arvo, joka on alueella 0,5-1,6.
• · · * f ·
Kuten kuviosta 11 käy ilmi, monoklonaalisten vasta-aineiden 35 reaktiomallit rSP:n ja infektoivan viruksen kanssa ovat • * käytännöllisesti katsoen identtiset, joten on oletettavaa, • · että proteiini E esiintyy samassa natiivissa muodossa 27 118222 rSPiissä kuin infektoivassa viruksessa.
Formaliini-inaktivointi vaikuttaa sitä vastoin merkittävästi antigeenirakenteeseen, jossa myös esiintyy epitoop-5 peja, jotka sitovat neutraloivia vasta-aineita. Tämä koskee sekä neutraloivaa monoklonaalista vasta-ainetta i2 (Mandi et ai.,'1989, J. Virol. 63: 564-571), jonka epitooppi tuhoutuu formaliinikäsittelyssä, että myös epitooppeja domeeni A:n ja domeeni B:n alueella (Mandi et ai., 1989, J. 10 Virol. 63: 564-571), joiden reaktiivisuus on ainakin pienentynyt. Tämä analyysi osoittaa myös sen, että E*:n rakenne ei ollenkaan vastaa viruspinnassa olevaa natiivia proteiini E:tä.
15 b. Happoindusoidut konformaatiomuutokset TBE-virus tunkeutuu soluihin reseptorivälitteisen endo-sytoosin avulla ja pääsee siten endosomeihin, joiden hapan pH (<6,4) indusoi spesifisen konformaatiomuutoksen, joka 20 vaaditaan virusmembraanin ja endosomimembraanin fuusioimiseksi ja siten viruksen infektiivisyyden aikaansaamiseksi. ····; Nämä rakenteelliset muutokset voivat olla seurausta siitä, että yksittäisten monoklonaalisten vasta-aineiden reak- t·*· ,**·, tiivisuus muuttuu (Heinz et ai., 1994, Virology 198: 109- • · 25 117) ja vaikuttaa mm. epitooppeihin i2 ja IC3 (reaktiivi-
«I
suuden voimakas lasku) ja C6 (voimistunut reaktiivisuus), *ti|* mutta ei epitooppiin B3.
• f * · ·«· Nämä muutokset ovat olennaisia proteiini E:n toiminnalle.
• · • "·· 30 Kyky reagoida esitetyllä tavalla happamassa pH:ssa on siten • · · ϊ.,.ϊ myös merkki siitä onko proteiini E natiivissa muodossa, joka vastaa infektoivaa virusta. rSP:tä, rE*:tä ja infek- • · toivaa virusta sisältävät preparaatit trietanoliamiini- * « .
puskurissa pH 8,0 sekoitettiin puskuriin, jossa oli 0,05 m • · • *·· 35 mES, 0,1 m NaCl ja 0,1 % naudanalbumiinia, siten että *:**: saatiin pH-arvo 6,0, inkuboitiin 10 min 37 °C:ssa ja tri- etanoliamiinin avulla säädettiin sitten pH-arvo uudestaan 28 118222 8,0:ksi. Sitten analysoitiin näiden preparaattien reaktiivisuus ennen inkubointia ja inkuboinnin jälkeen happamassa pH:ssa monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja C6 kanssa 4-kerroksisen ELISA:n avulla kuten kohdassa 5 "Antigeenirakenne" on kuvattu. Tulokset on esitetty kuvioissa 12 ja 13 ja ne osoittavat, että hapan pH aiheuttaa vastaavia rakenteellisia muutoksia rSPiiden proteiini E:ssä kuin infektoivan viruksen proteiini E:ssä (ks. kuvio 12), mutta että vastaava analyysi rE*:n osalta ei osoita 10 minkäänlaista viittausta vastaavanlaisesta muunnoksesta (ks. kuvio 13) .
c. Spesifinen hemaqqlutinaatioaktiivisuus 15 Infektoivalle FSME-virukselle tyypillinen ominaisuus on kyky tietyissä olosuhteissa agglutinoida hanhenerytro-syyttejä (hemagglutinaatioaktiivisuus). Proteiini E välittää tämän ominaisuuden virukselle ja ominaisuus on siten toinen indikaattori proteiinin natiivin toiminnallisen 20 rakenteen esiintymisestä. Hemagglutinaatiotestit suoritettiin kuten Clarke ja Casals (1958), Amer. J. Trop. Med.
···· Hyg. 7: 561-573 ovat kuvanneet käyttämällä hanhenerytro- ·:. syyttejä pH-arvossa 6,4.
··· • · • · 25 Infektoivan viruksen, formaliini-inaktivoidun viruksen, .2** rSP:n ja rE :n ELISArlla määritetyt antigeenipitoisuudet *„]* säädettiin arvoon 5 pg/ml ja analysoitiin hemagglutinaa- *···* tiotestillä. Tulos on esitetty oheisessa taulukossa 3.
Siitä ilmenee, että rSPillä on vastaava spesifinen hem- : *** 30 agglutinaatioaktiivisuus kuin infektoivalla viruksella, ja ··· että tämä proteiini E:n avulla välitetty aktiivisuus häviää melkein kokonaan formaliini-inaktivoinnin johdosta. Prepa- .···. raatilla rE" ei ole mitattavissa olevaa määrää HA-aktiivi- * · "* suutta.
:**·· 35 * « 29 . ; 118222
Taulukko 3. HA-aktiivisuus
Valmiste HA-tiitteri 5 infektoiva virus 512 formaliini-inakt. virus 4 rSP 512 rE* < 2 10 3. Immunogeenisyys hiirissä
Immunisoimalla hiirissä analysoitiin seuraavien antigeeni-preparaattien immunogeenisyys: - formaliini-inaktivoitu puhdistettu virus
15 - rSP
- rE*
Proteiini E:n pitoisuus havaittiin entsyymi-immunotestillä (Heinz et ai., 1986, J. Biol. Stand. 14: 133-141) ja kaik-20 kien preparaattien antigeenipitoisuus säädettiin samaan arvoon 5 pg/ml. Kuten jo käytössä olevassa TBE-rokotteessa (FSME-ImmunR) käytettiin myös tässä laimennuspuskurina PBSrää pH 7,4, joka sisältää 0,1 % humaanialbumiinia ja adjuvanttina lisättiin 0,2 % AI (OH)3.
*:· 25 • « · · :*[]: rSP:n ja rE*:n immunogeenisyys testattiin myös ilman adju- vantin lisäystä.
• * · • · ···: .·♦·, Immunisointiprot okolla: ***** 30 ··, Kymmenen 15 g painavan Swiss albino hiiren (5 naarasta ja 5 * ·· \*;m urosta) ryhmät immunisoitiin ihonalaisesti kaksi kertaa 14 *** päivän välein jokaisella preparaatilla, jolloin hiirtä ja immunisointia kohti annettiin 0,2 ml antigeeniä. Viikko 35 toisen immunisoinnin jälkeen otettiin verinäyte ja kaikki :·* hiiret infektoitiin intraperitonaalisesti 500 LD50 hiiri- t ·« patogeenisellä TBE-viruskannalla Hypr (Challenge-testi) .
• *
Kuolemaan johtavan enkefaliitin esiintymistä hiirissä tarkkailtiin 14 päivän ajan.
118222 Ϊ 30
Sama määrä seerumia otettiin jokaisesta yksittäisestä hiirestä kymmenen ryhmästä, jotka kaikki kymmenen oli immunisoitu samalla immunogeenillä, ja analysoitiin TBE-5 virus-spesifinen vasta-ainepitoisuus entsyymi-immuno- testillä (ELISA), hemagglutinaation estotestillä (HHT) ja neutralointitestillä.
ELISA suoritettiin käyttämällä puhdistettua TBE-virusta 10 antigeeninä kuten Heinz et ai. on kuvannut J. Gen. Virol.
(1984) 65: 1921-1929. HHT tehtiin kuten Clark ja Casals (1958), Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573 ovat kuvanneet, jolloin käytettiin hanhenerytrosyyttejä lopullisessa pH-arvossa 6,4. Neutralointitestejä varten käytettiin BHK-21-15 soluja ja käytetty viruspitoisuus oli 500 infektoivaa yksikköä.
Immunisointikokeilun tulokset on esitetty taulukossa 4.
Siitä käy ilmi, että rSP sekä ilman adjuvanttia että 20 adjuvantin kanssa kuten myös formaliini-inaktivoitu kokovirus suojasi kaikki hiiret tappavaa annosta TBE- *;··; virusta vastaan. Sitä vastoin kun oli immunisoitu rE*:llä ·;· ei suojavaikutusta ollut havaittavissa (ilman adjuvanttia) ««*· .*··. tai suojavaikutus oli olematon (adjuvantin kanssa) .
25 • * • * .*** Verrattaessa vasta-aineinduktiota rSP:t olivat jopa yli- * · · *... voimaisia formaliini-inaktivoituun virukseen nähden, eri- • · *♦··.*.. tyisen selvästi käytettäessä AI (OH) 3 adjuvanttina. Tämä koskee sekä ELISA:11a osoitettuja virusta sitovia vasta- • · • *" 30 aineita että - suojaavaa immuunivastetta ajatellen vielä • · *·..* tärkeämpiä - HHT:ssä ja NT:ssä mitattuja vasta-aineita, t ·;*·· jotka siten estävät viruksen spesifisiä toimintoja .·**. (hemagglutinaatio ja infektiivisyys) .
• · · \ * * * * : ** 35 Suojaavan toiminnan puuttuminen tai olemattoman vaikutuksen * * olemassaolo sopii hyvin yhteen sen kanssa, että vasta-aine- induktio rE*:llä oli hyvin pieni tai ei ollut osoitetta- 118222 * 31 'i vissa.
On siten osoitettu, että rSP:t ovat erinomaisia immuno-geenejä, jotka suojaavat muuten tappavalta enkefaliitiltä 5 ja ovat jopa ylivoimaisia formaliini-inaktivoituun koko-virukseen nähden kun verrataan toiminnallisten virusta neutraloivien vasta-aineiden induktiota.
Taulukko 4. Hiirien immunisointi 10
Challenge- Vasta-ainetiitteri testi elossa kautta kokonaismäärä ELISA HHT NT 15 (lkm/10) formali i ni-inakt.
virus + adjuv. 10/10 10000 40 20-40 20 rSP ilman adjuv. 10/10 12000 80-160 40-80 rSP + adjuv. 10/10 30000 160 160 rE1 ilman adjuv. 0/10 100 <10 <10 25 rE1 + adjuv. 1/10 4000 <10 < 10-10 ..,.ϊ puskurikontrolli 0/10 neg <10 <10 ·2 *::: 30 • · · I" 4. Immunisointi paljaan DNA:n avulla * · • · * · 1 • 1 * · •t"‘ Immunisoitaessa paljaalla DNArlla käytettiin plasmideja, jotka sisältävät kuviossa 1 esitetyt insertit CMV-35 "Immediate Early"-promoottorin ohjauksen alaisena. Nämä ·» ·· plasmidit (CMV-PEwt, CMV-PEst, CMV~Ewt, CMV-Est) valmistet- ··· tiin uudelleenkloonaamalla kuvattujen plasmidien SV-PEwt, SV-PEst, SV-Ewt ja SV-Est insertit plasmidissa pCMVfi
,♦♦♦. (Clontech) (Mac Gergor et ai., Nucleic Acids Research, IRL
‘i1 40 Press, Voi. 17, No. 6, 1989, s. 2365: "Construction of ·» 2 : 1·· plasmids that express E. coli β-galactosidase in mammalian cells") ja puhdistettiin CsCl-tiheysgradienttisentrifugoin-nin avulla (Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Labora- 32 118222 tory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982).
CMV-PEwt sisältää proteiinien prM ja E villityypin sekvens-5 sit.
CMV-PEst sisältää proteiinin prM villityypin sekvenssin ja proteiinin E deletoidun sekvenssin, josta 61 karboksipään aminohapon kodonit puuttuvat, jotka aminohapot muodostavat 10 proteiini E:n membraaniankkurialueen.
CMV-Ewt:ssä suurin osa prM-sekvenssistä ei ole läsnä mutta villityyppi-proteiini E:n koko sekvenssi on.
15 CMV-Est ei sisällä prM-sekvenssiä mutta sisältää deletoidun proteiini E:n sekvenssin CMV-PEst:stä.
Jokaisesta näistä neljästä plasmidista käytettiin kahta konsentraatiota (60 pg/ml ja 300 pg/ml PBS:ssä) hiirien 20 (Swiss albino) immunisointiin, jolloin käytettiin 10 hiirtä (5 naarasta ja 5 urosta) jokaista plasmidivalmistetta ....j kohti. Jokaiseen hiireen injisoitiin ihonsisäisesti kaksi kertaa 100 μΐ kyseessä olevaa DNA-preparaattia kahden
.···. viikon välein. Kontrolleina käytettiin plasmidia CMVB
• · 25 konsentraatiossa 300 pg/ml ja PBS:ää vastaavalla tavalla.
·
Vertailuksi immunisoitiin perinteisellä tavalla 10 hiiren • · • ” ryhmät formaliini-inaktivoidulla viruksella konsentraatios- • · *··.’- sa 1 pg/ml ja 5 pg/ml myös kaksi kertaa kahden viikon välein, jolloin injisoitiin ihonalaisesti 0,2 ml per hiiri • * ! ** 30 ja käytettiin 0,2 % AI(OH)3 adjuvanttina. Kun toisen immu- ♦·· :.,.J nisoinnin jälkeen oli kulunut viikko otettiin hiiristä verinäyte spesifisten vasta-aineiden osoittamiseksi .*··. ELISA: 11a ja samanaikaisesti suoritettiin intraperito- • * *1' naalinen Challenge-infektio käyttämällä 500 LD50 TBE- : ·· 35 virusta. Seuranta-aika kesti 3 viikkoa. Taulukossa 5 on esitetty vasta-aineiden määritysten ja suojakokeiden tulosten yhteenveto. Kuten siitä ilmenee DNA-immunisoinnilla :3 118222 pystyttiin aikaansaamaan suoja tappavaa TBE-viruksen infektiota vastaan ainoastaan sellaisella plasmidilla, joka sisältää täydellisiä proteiineja prM ja E koodaavat geenit. Tämä on luultavasti tulkittavissa siten, että proteiinin 5 prM/Μ läsnäolo on välttämätön subviraalisten partikkeleiden kokoamiseksi, joissa partikkeleissa proteiini E on immuno-geenisessä muodossa.
Taulukko 5: Hiirien suojakokeiden tulokset 10
Immunogeeni Suoja Vasta-aine-positiivi
Plasmidit PE-wt 60 pg/ml 6a/10b lc/lOd 15 PE-wt 300 μ g/ml 9/10 5/10 E-wt 60 pg/ml 0/10 0/10 E-wt 300 pg/ml 0/10 0/10 20 PE-st 60 pg/ml 0/10 0/10 PE-st 300 pg/ml 0/10 0/10 E-st 60 pg/ml 0/10 0/10 E-st 300 pg/ml 0/10 0/10 25 CMV-β 300 μ g/ml 0/10 0/10 . Vertailut ··«·« • 1 30 HCOH-virus 1 μg/ml 4/10 4/10 ...Ϊ HCOH-virus 5 μg/ml 10/10 10/10 ♦ 1 pbs o/io o/io • · * · :·! 35 : 2 a suojattujen hiirien lukumäärä j1"j b tutkittujen hiirien lukumäärä „1·1— c ELISA-positiivisten hiirien lukumäärä d tutkittujen hiirien lukumäärä • · * · • ·· 40 • · • 1 • 1 # " 1 ♦ ···♦ • · • · • ♦ ♦·· .
• ♦ • · • ·· «2·· 2 • ·
Claims (8)
1. Flavivirusinfektioita vastaan immunisoiva paljas rokote, tunnettu siitä, että se käsittää proteiinia E ja 5 proteiinia prM/M koodaavan nukleiinihapon, joka on johdettu Flaviviruksesta, täydellisessä, natiivissa muodossaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokote, tunnettu siitä, että proteiinia E ja prM/M koodaava sekvenssi on 10 johdettu Tick-Borne-Encephalitis-viruksesta (TBE-viruksesta).
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen rokote, tunnettu siitä, että proteiinia E ja prM/M koodaava sekvenssi on 15 johdettu TBE-viruksen eurooppalaisesta tai kaukoidän alatyypistä.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen rokote, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on plasmidi- 20 vektori.
·;··· 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen rokote, tunnettu siitä, että plasmidivektori on CMVBista johdettu plasmidi-,···, vektori. 25
• · • * „*** 6. Sellaisen paljaan nukleiinihapon käyttö lääkeaineen * · *it] valmistamiseksi, joka käsittää Flaviviruksesta johdettujen • · *»»·*- proteiinien prM/M ja E koko, natiivissa muodossaan olevan koodaussekvenssin. I-·- 30
*...* 7. Sellaisen paljaan nukleiinihapon käyttö ..*.ί Flavivirusinfektioiden vastaisen rokotteen valmistamiseksi, • * ' .·**. joka käsittää Flaviviruksesta johdettujen proteiinien prM/M • » ^ ja E koko, natiivissa muodossaan olevan koodaussekvenssin. : *** 35
« ***** 8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että nukleiinihappo sisältää TBE- 118222 viruksesta johdettuja, proteiinia E ja proteiinia prM/M koodaavia sekvenssejä1 ' i >. * 1 * « · · • 1 · • M • · * · ··· * · · • * 1 • · 1 • · * · * · * m • · * · ·· ·· • · « ·· *·· • · • · * · · • · 1 1 • 1 • · * 1 · * • 1 • · • · · * 118222
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0135294A AT402897B (de) | 1994-07-08 | 1994-07-08 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
| AT135294 | 1994-07-08 | ||
| AT87195 | 1995-05-23 | ||
| AT0087195A AT405607B (de) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20070041A FI20070041A (fi) | 2007-01-17 |
| FI118222B true FI118222B (fi) | 2007-08-31 |
Family
ID=25594155
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI953371A FI117974B (fi) | 1994-07-08 | 1995-07-07 | Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi |
| FI20070041A FI118222B (fi) | 1994-07-08 | 2007-01-17 | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI953371A FI117974B (fi) | 1994-07-08 | 1995-07-07 | Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0869184B1 (fi) |
| AT (2) | ATE206459T1 (fi) |
| CZ (1) | CZ282927B6 (fi) |
| DE (2) | DE59508988D1 (fi) |
| DK (2) | DK0691404T3 (fi) |
| ES (2) | ES2155510T3 (fi) |
| FI (2) | FI117974B (fi) |
| HU (2) | HU219503B (fi) |
| RU (1) | RU2150294C1 (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69833388D1 (de) | 1997-11-20 | 2006-04-13 | Us Army Medical Res Materiel C | Dna impfstoffe gegen zecken-flavivieren |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| EP1572941A4 (en) * | 2002-02-26 | 2009-03-18 | Maxygen Inc | NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES |
| AU2005318171B2 (en) | 2004-12-20 | 2011-09-29 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing West Nile virus and uses thereof |
| EP1879921B1 (en) | 2005-05-12 | 2011-04-27 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| HUE027099T2 (hu) | 2006-06-06 | 2016-08-29 | Crucell Holland Bv | Humán kötõmolekulák staphylococcus elleni ölõaktivitással és alkalmazásuk |
| EP2902495B1 (en) | 2007-11-09 | 2019-12-25 | The Salk Institute for Biological Studies | Use of tam receptor activators as immunosuppressors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0284791B1 (de) * | 1987-03-20 | 1995-05-03 | IMMUNO Aktiengesellschaft | DNA- und RNA-Moleküle des westlichen Subtyps des FSME-Virus, Polypeptide, die von diesen Molekülen codiert werden, und deren Verwendung |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| WO1992003161A1 (en) | 1990-08-27 | 1992-03-05 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Flavivirus envelope proteins with increased immunogenicity for use in immunization against virus infection |
| EP0584348B1 (en) | 1992-03-11 | 2005-05-18 | Powderject Vaccines, Inc. | Genetic vaccine for immunodeficiency viruses |
-
1995
- 1995-06-21 HU HU9501832A patent/HU219503B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-21 HU HU9903233A patent/HU224199B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 AT AT98107383T patent/ATE206459T1/de active
- 1995-07-06 DK DK95890132T patent/DK0691404T3/da active
- 1995-07-06 ES ES95890132T patent/ES2155510T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES98107383T patent/ES2165109T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 EP EP98107383A patent/EP0869184B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 EP EP95890132A patent/EP0691404B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DK DK98107383T patent/DK0869184T3/da active
- 1995-07-06 DE DE59508988T patent/DE59508988D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 AT AT95890132T patent/ATE198909T1/de active
- 1995-07-06 DE DE59509667T patent/DE59509667D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-07 RU RU95113194/14A patent/RU2150294C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 FI FI953371A patent/FI117974B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 CZ CZ951769A patent/CZ282927B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-17 FI FI20070041A patent/FI118222B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0691404A2 (de) | 1996-01-10 |
| RU2150294C1 (ru) | 2000-06-10 |
| DK0869184T3 (da) | 2001-12-17 |
| DE59509667D1 (de) | 2001-11-08 |
| EP0869184B1 (de) | 2001-10-04 |
| FI953371A (fi) | 1996-01-09 |
| DE59508988D1 (de) | 2001-03-01 |
| DK0691404T3 (da) | 2001-03-19 |
| ES2155510T3 (es) | 2001-05-16 |
| EP0691404A3 (de) | 1997-11-12 |
| ATE198909T1 (de) | 2001-02-15 |
| ATE206459T1 (de) | 2001-10-15 |
| FI20070041A (fi) | 2007-01-17 |
| HU219503B (hu) | 2001-04-28 |
| EP0869184A3 (de) | 1999-05-12 |
| HU9501832D0 (en) | 1995-08-28 |
| CZ176995A3 (en) | 1996-01-17 |
| FI953371A0 (fi) | 1995-07-07 |
| CZ282927B6 (cs) | 1997-11-12 |
| EP0691404B1 (de) | 2001-01-24 |
| FI117974B (fi) | 2007-05-15 |
| HUT72395A (en) | 1996-04-29 |
| HU224199B1 (hu) | 2005-06-28 |
| ES2165109T3 (es) | 2002-03-01 |
| HU9903233D0 (en) | 1999-11-29 |
| EP0869184A2 (de) | 1998-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10555997B2 (en) | Antigens and vaccines directed against human enteroviruses | |
| US11718647B2 (en) | Virus-like particles and methods of use | |
| JP2024050973A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ｍＲＮＡドメインワクチン | |
| FI118222B (fi) | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin | |
| Wu et al. | Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus | |
| JP4504464B2 (ja) | キメラフラビウイルスワクチン | |
| EP1078092B1 (en) | Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same | |
| KR100602553B1 (ko) | 구제역에 대한 합성 펩티드 백신 | |
| US20150056244A1 (en) | Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses | |
| JP3510249B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な細胞障害性ｔ細胞を刺激するためのペプチド | |
| JP3694299B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスに対する細胞障害性ｔリンパ球の応答を誘発するペプチド | |
| JP5290576B2 (ja) | 修飾されたｈｉｖ−１エンベロープタンパク質 | |
| WO1998028004A1 (en) | Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen | |
| AU2003216046A1 (en) | Construction of west nile virus and dengue virus chimeras for use in a live virus vaccine to prevent disease caused by west nile virus | |
| CA2370278C (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 118222 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |