HU224199B1 - Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina - Google Patents
Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina Download PDFInfo
- Publication number
- HU224199B1 HU224199B1 HU9903233A HU9903233A HU224199B1 HU 224199 B1 HU224199 B1 HU 224199B1 HU 9903233 A HU9903233 A HU 9903233A HU 9903233 A HU9903233 A HU 9903233A HU 224199 B1 HU224199 B1 HU 224199B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- nucleic acid
- prm
- vaccine
- virus
- Prior art date
Links
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 title description 12
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 title description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 39
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 30
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 29
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 206010057199 Flaviviral infections Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 abstract description 12
- 101800001127 Protein prM Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000120645 Yellow fever virus group Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas,csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcinára vonatkozik, amely olyannukleinsavat foglal magában, amely Flavivírusból származtatott Eproteint és prM/M proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz,teljes, natív formában. A találmány kiterjed Flavivírusbólszármaztatott E proteint és prM/M proteint kódolónukleinsavszekvenciát teljes, natív formában tartalmazó csupasznukleinsav alkalmazásaira is, gyógyszer, illetve Flavivírus-fertőzésekelleni vakcina előállítására.
Description
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 5 lap ábra)
HU 224 199 Β1
A találmány Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcinára vonatkozik, valamint csupasz nukleinsav alkalmazásaira.
A TBE-vírus (Tick-Borne-encephalitisvírus) számos európai országban, a volt Szovjetunióban és Kínában okoz endémiás járványokat. Néhány közép-európai országban, így Ausztriában, Németországban, Szlovákiában, Szlovéniában vagy Magyarországon, ahol minden évben több száz - kórházba felvett - esetet regisztrálnak, ez a betegség jelentős problémát jelent a közegészségügy számára [WHO: EURO Reports and Studies, 104, (1983)].
A TBE-vírus, amelynek nyugati, európai és távol-keleti szubtípus formái ismertek, a Flavivírusok családjához tartozik. Ezek a vírusok gömb alakú, lipidburokkal ellátott RNS-vírusok [lásd T. P. Monath: Flavioviruses, B. N. Fields: Virology, Raven Press, N. Y. (1990) 763-814. old.].
A Flaviovírus virion általánosságban egy olyan nukleokapszidból áll, amelyben az RNS-genom pozitív szála a virális kapszidproteinnel (C-protein) kapcsolódik. A nukleokapszidot egy lipidburok veszi körül, amely az E (50-60 KD) és M (7-8 KD) membránasszociált proteineket tartalmazza [van Regenmortel és Neurath (szerk.), „Immunochemistry of Viruses. II. The Basis fór Seradiagnosis and Vaccines” c. kiadványban (Elsevier Sciences, Amsterdam, 1990), Heinz és Roehrig, 289-305. old.].
Az E főburokprotein központi szerepet játszik a Flavivírusok biológiájában, mivel jelentős virális beépülési funkciókat közvetít, és a gazdában protektív immunválaszt vált ki. A TBE-vírus E burokproteinje szerkezetéről már jelentős mennyiségű információ áll rendelkezésre, és a számos biokémiai és immunológiai adat alapján szerkezetének modelljét is bemutatták [Mandl et al., J. Virol., 63, 564-571 (1989)].
A betegség eredményesen gátolható [Kunz, Ch. Acta leidensia, 60, 1-14 (1990)] egy megfelelően tisztított, formalininaktivált teljes vírust tartalmazó olyan oltóanyaggal való oltással (Kunz et al., J. Med. Virol, 6, 103-109 (1980)], amely a vírus szerkezeti proteinjeivel szemben immunválaszt indukál. Ez az oltóanyag bizonyult a legjobbnak, azonban az előállításával kapcsolatos eljárások folyamán nagy mennyiségű fertőző és potenciálisan veszélyes vírusszuszpenzióval kell foglalkozni, és ezért átfogó és drága biztonsági intézkedések alkalmazására van szükség.
Az antitestek vírusneutralizáló képessége attól függ, hogy milyen eredményesen ismerik fel a vírus felületén a proteinek eredeti szerkezetét. A TBE-vírusok és más Flavivírusok esetében tehát elsősorban az E proteinről van szó [Heinz és Mandl, APMISm 101, 735-745 (1994)]. Egy immunizálás folyamán a lehető leghatékonyabb ellenanyagok eredményes indukciója érdekében tehát megkívánt, hogy az oltóanyag ezt a proteint ugyanabban a formában tartalmazza, mint ahogyan ez a fertőző vírus felületén előfordul. A teljesvírus-oltóanyagoknak az a hátránya, hogy a szükséges inaktiválási eljárások az eredeti proteinszerkezet részleges megváltozásához vezethetnek.
A rekombináns DNS-technológia lehetőséget nyújt arra, hogy a teljesvírus-oltóanyagot olyan rekombináns proteinekkel helyettesítsük, amelyek az immunválaszt indukáló proteinek lényeges részét tartalmazzák. Az egyes vírusproteinek géntechnológiai kifejezése kapcsán azonban nincs rögzítve, hogy ezen rekombináns proteinek antigénszerkezete megfelel-e a vírus felületén lévő megfelelő proteinekének.
A TBE-vírusok rekombináns felületi proteinjeinek expressziójáról például Allison és munkatársai [Gemeinsame Jahrestagung ÖBG-ÖGGGT (1993) 114. old.] számoltak be. Megállapították, hogy az E protein és az M protein, meghatározott feltételek mellett történő rekombináns expressziójuk esetén, különböző formában - beleértve a nem fertőző szubvirális partikulákat - szekretálódnak.
Ilyen szubvirális partikulák a TBE-vírusok távoli rokonainál, így a japán encephalitisvírusnál (JEV), a sárgaláz vírusainál és a Dengue-láz vírusainál [Konishi et al., Virology, 188, 714-720 (1992); WO 92/03545] ismertek.
Konishi és munkatársai ugyan leírták, hogy az ilyen szubvirális partikulák, amelyeket komplett Freund-adjuvánssal emulgeáltak, és az egész E proteint tartalmazták, egerekben bizonyos immunválaszt váltanak ki, másrészt azonban kimutatták, hogy egy olyan E proteinnel, amelyet C-terminális részénél részben megrövidítettek, lényegesen hatékonyabb védelmet lehet elérni egy Flavivírus-fertőzés ellen, mint a teljes E proteinnel (WO 92/03161).
A találmány feladata tehát az, hogy a Flavivírus-fertőzések, például a TBE-fertőzések ellen javított oltóanyagot biztosítson.
Meglepő módon azt találtuk, hogy azok a nukleinsavak, amelyek a Flavivírusból származtatott E proteint és prM/M proteint kódoló szekvenciákat tartalmazzák, mint ilyenek, Flavivírus-fertőzések, például TBE-vírus-fertőzések elleni immunizálásra használhatók.
Ismeretes, hogy „csupasz” DNS-ek egerekbe történő bevitele immunválaszt képes kiváltani. Például azokban az egerekben, amelyekbe az emberi növekedési hormon (hGH) egy genomiális másolatát tartalmazó plazmidot injiciálnak, emberi hGH elleni ellenanyagok képződnek [Natúré, 356, 152-154 (1992)].
Leírtak továbbá csupasz DNS-sel végzett eredményes „genetikai immunizálásokat”. Ezeket a genetikai immunizálásokat olyan DNS-sel végezték, amely egy vírus egy vagy több antigénjét kódolta, így tehát in vivő a megfelelő virális antigének szintetizálódtak, amelyek azután külön mindegyik ellen immunválaszt tudtak kiváltani, és ennek következtében a vírusfertőzésekkel szemben védelmet tudtak biztosítani. Leírták továbbá, hogy egerekben eredményes protektív immunitást értek el influenzavírus DNS intramuszkuláris injekciójával [Ráz et al., PNAS, 91, 9519-9523 (1994)]. Hasonlóan eredményesen immunizáltak patkányokat és egereket Hepatitis B vírus (HBV) felületi antigén ellen olyan plazmid-DNS intramuszkuláris injekciója révén, amely HBV felületi antigént kódoló szekvenciákat tartalmazott [Davis et al., Vaccine, 12,1503-1509 (1994)]. Patogén an2
HU 224 199 Β1 tigéneket kódoló csupasz DNS-sel végzett számos immunizálási kísérlet maradt azonban eredménytelen. Jóllehet leírtak például HÍV elleni immunizálási kísérleteket, amelyeket a szervezet sejtjeibe való közvetlen DNS-transzfer segítségével végeztek (WO 93/17706), azonban ezzel a módszerrel eddig mégsem lehetett eredményes vakcinához jutni. Egyébként úgy tűnik, hogy az eredményes immunizáló hatás szempontjából a tiszta DNS-vakcina - a DNS sejtekbe való bevitele mellett - különösen előnyös, mivel az immunválaszt kiváltó antigént natív formában mutatja be az immunrendszernek. A natív forma pontos szerkezetét, illetve azt a folyamatot, amely a natív forma és szerkezet kialakulásához szükséges, csak néhány patogén organizmus esetében rögzítették, így tehát a csupasz nukleinsavakkal való eredményes immunizálás sok esetben rendkívül nehezen volna kivitelezhető, ha egyáltalán - a pontos antigénszerkezet hiányos ismeretei alapján - megvalósítható lenne jelenlegi tudásunk szerint.
A találmánnyal összefüggésben kiderült, hogy egy olyan nukleinsavszekvenciával való immunizálás, amely TBE-fertőzéseknél a lényeges immunválaszt kiváltó E proteint kódolja, nem elégséges ahhoz, hogy olyan immunválaszt kapjunk, amely megvéd a megbetegedéstől.
Meglepő módon, csak olyan nukleinsavszekvenciák beadása révén tudtunk eredményes immunválaszt kapni, amelyek az E protein teljes natív formáját kódoló szekvencia mellett még a prM/M proteint kódoló szekvenciát is magukban foglalták. Kimutattuk továbbá, hogy egy olyan nukleinsavval, amelyben az E proteint kódoló szekvenciából az E protein horgonyszakaszát eltávolították, szintén nem lehet eredményes immunizálást elérni.
A találmány tárgya tehát Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina, amely olyan nukleinsavat foglal magában, amely Flavivírusból származtatott E proteint és prM/M proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz, teljes, natív formában.
A találmány további tárgyát képezik Flavivírusból származtatott E proteint és prM/M proteint kódoló nukleinsavszekvenciát teljes, natív formában tartalmazó csupasz nukleinsav alkalmazásai is, gyógyszer, illetve Flavivírus-fertőzések elleni vakcina előállítására.
A találmány egy további elemét egy olyan Tick-Borne-encephalitisvírus (TBE-vírus) fertőzés elleni immunizálásra szolgáló vakcina képezi, amely egy, a TBE-vírusból levezetett olyan nukleinsavat tartalmaz, amely az E proteint és prM/M proteint - legalábbis lényegében teljes eredeti formáikban - kódolja.
A találmány segítségével először sikerült Flavivírusok esetén általánosságban bemutatni a nukleinsavimmunizálást. A találmány szerinti immunizálási rendszer tehát elvben nemcsak a TBE-vírus-immunizáláshoz, hanem - az összes Flavivírusban az E protein és prM/M protein nagyfokú homológiája következtében [Chambers et al., Annual Review of Microbiology 44, 649-688 (1990) „Flavivirus Genome Organization, Expression and Replication” - általában a Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásokhoz is használható.
Egy, a TBE-vírussal szembeni immunizálásra alkalmas nukleinsawakcinánál lényeges, hogy a nukleinsav az E protein lényegében teljes natív formáját kódolja. Természetesen azok a vakcinák, amelyekben a nukleinsavak a genetikai kódok degenerációjából, továbbá a szerkezet szempontjából lényegtelen aminosavkodonok cseréjéből, vagy a természetes vagy laboratóriumban végzett mutációkból kifolyólag módosultak, szintén a találmány oltalmi köréhez tartoznak, amennyiben az E proteint kódoló szekvencia nukleinsavainak módosításával az eredményes immunizálás biztosítható. Azokat a vakcinákat, amelyek olyan nukleinsavakat tartalmaznak, amelyeknél az E proteint kódoló szekvenciákban deléciók vagy inszerciók fordulnak elő, de az E protein immunizáláshoz szükséges szerkezetét az antigénhatású epitóp területen lényegében változatlanul hagyták, ugyancsak a találmány oltalmi köréhez tartozónak tekintjük, mivel ezek is a TBE-vírus-szekvenciából származtatott szekvenciáknak számítanak. Természetesen ugyanez vonatkozik a prM/M protein kódolószekvenciájára is. Mivel a prM/M proteinnek a szubvirális partikulák megbízható képzésében és szekréciójában van jelentősége, így a prM/M protein vonatkozásában a szekvenciaeltéréseknek nincs olyan döntő jelentőségük, mint az E proteinnél, mindaddig, amíg a partikulák eredményes összeszerelése biztosított. A nukleinsav természete a találmány szempontjából nem lényeges. Egyformán alkalmazható az RNS és DNS, bár néhány alkalmazási területen a DNS előnyösebb, mivel az RNS-hez képest jobb a stabilitása. A nukleinsavak mind biológiai, mind kémiai szintézissel előállíthatok.
Előnyös, ha az E proteint kódoló nukleinsavakat a TBE-vírus európai vagy távol-keleti szubtípusaiból vezetjük le, mivel ezek a jobban elterjedt szubtípusok.
A különösen előnyös nukleinsavvakcináknál a nukleinsav egy plazmid. Azok a legalkalmasabb plazmidok, amelyek erős promotereket tartalmaznak. Ilyenek például a HSV-, RSV-, EBV-, β-aktin-, Adeno-, MMTV-, hsp- és hGH-promoterek. Az erős promoterek lehetővé teszik az eredményes génexpressziót.
A legalkalmasabb nukleinsavhordozókhoz, illetve promoterekhez tartoznak a pCMX/β plazmidból (MacGregor et al.) levezetett plazmidok, amelyek a CMV„immediate early’-promotert tartalmazzák.
A találmány szerinti nukleinsawakcinák nukleinsavai természetesen további kódoló- vagy nemkódoló szekvenciákat is tartalmazhatnak, főképpen ha a nukleinsavak mint nukleinsawektorok állnak rendelkezésre.
Ilyen további szekvenciák lehetnek még - a promoterek mellett - például a markergének és a transzkripcióval, transzlációval vagy poszttranszlációs módosításokkal kapcsolatos további szabályozószekvenciák stb. Ezeknél az összetettebb nukleinsavszerkezeteknél azonban arra kell vigyázni, hogy a nukleinsavnak a célsejtbe való bevitele után a nukleinsav transzlációja révén ne képződhessen fertőzővírus, és hogy a vakcina szintén „nem élő oltóanyag” legyen, illetve maradjon.
HU 224 199 Β1
A találmány szerinti nukleinsavvakcina legegyszerűbb formájában „csupasz” nukleinsavat - adott esetben alkalmas pufferrendszerben - tartalmaz. Tartalmazhat természetesen további alkotórészeket is, így gyógyszer-technológiai adalék anyagokat, hordozókat vagy speciális alkalmazásspecifikus anyagokat.
A találmány szerinti nukleinsawakcinák alkalmazása előnyösen injekcióval, főként intramuszkuláris, intradermális vagy szubkután injekcióval történik, de orálisan is beadhatók.
A találmány szerinti nukleinsawakcinákból beadott mennyiség a beadás módjától és az alkalmazott adjuvánstól függ. Intramuszkuláris alkalmazás esetén a beadott mennyiség rendszerint magasabb, mint egy intradermális alkalmazásnál, egy azonos protektív immunválasz eléréséhez. Az előnyös alkalmazandó mennyiség adagonként általában 0,01 ng-tól 10 mg-ig terjed, legelőnyösebb az 1 ng-tól 1 mg-ig terjedő tartomány dózisonként.
A találmány szerinti nukleinsawakcináknak az a lényeges előnye, hogy nem szükséges sejttenyésztési rendszereket használni a szubvirális partikulák előállításához, mivel a partikulák in vivő képződnek, és így közvetlenül képesek immunválaszt előidézni.
A találmány szerinti nukleinsawakcináknak a proteinalapú vakcinákkal ellentétben az a további előnyük, hogy nagyfokú stabilitást mutatnak, különösen ha a nukleinsav egy DNS. Ezáltal lehetővé válik, hogy vakcinákat is nagyon hosszú ideig tárolhassunk nagy költségigényű hűtés nélkül, mivel ilyen tárolás következtében lényeges aktivitásveszteségek nem keletkeznek. A nukleinsavakat, főként liofilizált formában, gyakorlatilag korlátlan ideig, akár szobahőmérsékleten is, károsodás nélkül tárolhatjuk. Egy liofilizált találmány szerinti nukleinsavvakcina újraoldása sokkal egyszerűbb, mint egy liofilizált proteinoldat feloldása, amely tapasztalat szerint a protein tulajdonsága miatt gyakran problémákat vethet fel.
A találmány szerinti nukleinsavvakcina további előnye abban van, hogy a hagyományos nem élő oltóanyag rendszerekkel szemben az immunizálóantigén in vivő szintetizálódik, amely hatékony celluláris immunválasz kialakulásához vezet [Science, 259, 1691-1692 (1993. márc. 19.), Research News: Naked DNA Points Way to Vaccines],
Egy további szempont szerint a találmány olyan nukleinsavakra vonatkozik, amelyek mint gyógyszerek felölelik a TBE-vírusból levezetett E és prM/M proteinek teljes kódolószekvenciáját. A technika mai állása szerint Flavivírus-DNS-sel eddig még egyetlen eredményes nukleinsavimmunizálást nem közöltek. Ezen nukleinsavak (vektorok) felhasználása az orvoslásban tehát meglepő, új felhasználási lehetőségeket teremt. A találmány szerint vektor alatt minden nukleinsavhordozót értünk, tehát elsősorban plazmidokat, vírusokat vagy transzpozonokat.
Eddig csak egyetlen SV40-ből származó olyan plazmidot írtak le, amely a TBE-vírusból levezetett prM/M és E proteinek proteinszekvenciáját tartalmazta [Allison et al., Virus-Genes, 8, 187-198 (1994)]. Azonban nem tárgyalták annak eshetőségét, hogy ezen SV40-plazmidnak immunizáló hatása lenne.
A találmány szerinti plazmidokat az különbözteti meg az eddig leírt plazmidoktól, hogy immunizálásra alkalmasak. Tehát a találmány szerinti plazmidok, mint beadásra kész oldatok vagy liofolizált készítmények, beadásra alkalmas fecskendőben vagy ampullában állnak rendelkezésre.
A plazmidoknál a találmány szerint azok a promoterek bizonyultak hatásosnak, amelyeket a CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, β-aktin-, Adeno-, MMTV-, hsp- és hGHpromoterekből álló csoportból választottunk ki, de legfőképpen a CMV-„immediate early”-promoter bizonyult a leghatékonyabbnak.
Egy további szempont szerint a találmány egy, a TBE-vírusból levezetett prM/M és E proteinek teljes kódolószekvenciáját tartalmazó nukleinsavnak vakcina előállítására való felhasználására vonatkozik.
A találmányt az alábbi példákon részletesebben ismertetjük.
Az ábrák leírása: az 1. ábrán az expressziós plazmidokban alkalmazott inszertumok vázlatos ábrázolása látható, a 2. ábra a pSX/β plazmid vázlatát mutatja be, amelyet az 1. ábrán bemutatott szerkezet expressziójához használtunk, a 3a., b. és c. ábrák az
1. ábrán bemutatott SV-PEwt szerkezet teljes nukleotid- és aminosavszekvenciáját tartalmazzák.
A találmányt a következő példákkal részletesebben szemléltetjük, anélkül azonban, hogy a példákkal a találmány oltalmi körét korlátoznánk.
1. példa
A partikulák előállítása
Erre a célra 4 expressziós plazmidot szerkesztettünk, amelyek az E proteint, illetve az E protein egy membránhorgonymentes formáját, vagy ezt a prM proteinnel együtt tartalmazták (1. ábra).
E plazmidok előállítására vonatkozó példát írtak le Allison és munkatársai [Vírus Genes, 8, 187-198 (1994)].
Az itt leírt ρδνβ kiindulási plazmidot a 2. ábra mutatja be.
Az expressziós kiónok szerkesztéséhez a pSV46 vektort alkalmaztuk. Ez a vektor az SV40-en alapuló eukarióta ρβνβ expressziós vektor (Clontech) - amelyből Notl-gyel való emésztéssel a β-galaktozidáz gént tartalmazó inszertumot [G. R. MacGregor, C. T. Caskey, Nucl. Acids Rés., 17, 2365 (1989)] eltávolítottuk és ligáltunk - egy származéka. A transzlációs stophelytől 3’-irányban elhelyezkedő polilinker egy részét Xbal-gyel és Hindlll-mal való emésztés, Klenow-betöltés és religálás révén szintén eltávolítottuk.
Ebbe a vektorba PCR-termékeket építettünk be, amelyekhez a következőképpen jutottunk.
Szintetikus oligonukleotidprimereket használtunk a TBE-vírus prM+E szakaszának vagy csak E szakaszának megfelelő eDNS-részek sokszorozásához. A Mandl és munkatársai [C. W. Mandl, F. X. Heinz, C. Kunz, Virology, 166, 197-205 (1988)] szerinti nukleotidkoordinátákat használtuk, amelyeket később úgy
HU 224 199 Β1 dolgoztak át, hogy a TBE-genom első 20 nukleotidját (C. W. Mandl, F. X. Heinz, E. Stockl, C. Kunz, Virology, 173,) tartalmazzák. A prM+E szerkezet és az E szerkezet 5’-primerei a következő 27mer szekvenciák voltak: AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA, illetve AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Mindkét szekvencia első 11 nukleotidja mesterséges szekvenciából áll, amely a Notl restrikciós enzim számára egy felismerőhelyet (GCGGCCGC) tartalmaz. Az ezt követő 16 tagú nukleotidszekvenciák a 388-403. (SV-PE-sor) vagy a 883-898. (SV-E-sor) nukleotidoknak felelnek meg. Mindkét esetben a megfelelő géntől 5’-felé egy természetben előforduló ATB kodont alkalmaztunk startkodonként, és a prímért úgy alakítottuk ki, hogy ez az ATB-t alkalmas összefüggésben tartalmazza (GCCGCCATGG) ahhoz, hogy COS-sejtekben hatékony transzláció induljon meg [M. Kozák, Cell., 44, 283-292 (1986); M. Kozák, 7. Mól. Bioi, 196, 947-950 (1980)]. A hasonló 28 nukleotidhosszú oligonukleotidot (ATGCGGCCGCTAGTCATACCATTCTGAG) mindkét szerkezetnél 3’-primerként alkalmaztuk. Ez a primer 3’-végén a 2535-2550. nukleotidokkal komplementer és 5’-végén egy Notl helyet tartalmaz, és egy TAG stopkodon komplementert (CTA) ugyanezen leolvasási keretben.
A PCR-sokszorozást lényegében standard körülmények mellett, a Cetus cég előirata szerint [R. K. Saiki, D. H. Gelfand, J. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich, Science, 239, 487-491 (1988)] végeztük. A reakcióelegyek összetétele 100 μΙ össztérfogatban a következő volt: 50 mM kálium-klorid, 10 mM trisz.HCI, pH 8,3, 1,5 mM magnézium-klorid, 200-200 μΜ dNTP, az egyes primerek 10 pg-ja, a cDNS-mátrix 1000-szeres hígításából 10 μΙ, 3 E AmpliTaq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus). A mintákra 100 μΙ paraffinolajat rétegeztünk. A mintákat hőmérsékletváltást biztosító Perkin-Elmer készülékben sokszoroztuk.
A mintákat 6,5 percig 94 °C-on tartottuk, ezután 40 °C-os hibridizációs hőmérsékletre hűtöttük, mielőtt a Taq polimerázt hozzáadtuk. Összesen 35 sokszorozóciklust végeztünk. Mindegyik ciklusban 1,5 percig 94 °C-ot, 3 percig 40 °C-ot és 7 percig 68 °C-ot alkalmaztunk. A mintákat fenol-kloroformos extrahálással tisztítottuk, etanollal kicsaptuk, és steril, kétszer desztillált vízben feloldottuk. A PCR-termékek minőségét és mennyiségét agarózgél-elektroforézissel határoztuk meg, és a mintákat -20 °C-on tároltuk, amíg ezt követően a klónozási lépéshez felhasználtuk.
A polimeráz-láncreakciót arra használtuk, hogy egy cDNS-plazmidklónokból álló, olyan inszertumokat tartalmazó minibankot kapjunk, amelyek a TBE-vírusgenom prM+E-szakaszának (S4-PE-sor), 388-2550. nukleotid, vagy E-szakaszainak (SV-E-sor), 883-2550. nukleotid, felelnek meg (1. ábra).
Minthogy a TBE-vírus szerkezeti proteinjei egy nagy poliproteinprekurzor kotranszlációs feldolgozása révén keletkeznek, a transzlációs start- és stopkodonokat úgy vezettük be, hogy azokat az oligonukleotidprimerbe építettük be. Mindegyik szerkezetbe egy termiszter ATG kodont - amely alkalmas kontextusban helyezkedett el ahhoz, hogy indítókodonként szerepeljen - vezettünk be a belső szignálszekvenciától 5’-irányban annak érdekében, hogy lehetővé tegyük a gazda szignaláza által történő természetes feldolgozást és a megfelelő rávitelt a szekréciós útra. Minden szerkezetben hasonló módon helyeztük el a TG stopkodont, a szignaláz hasítási helytől - amely az E protein karboxiterminális végét képezi - 3’-irányban. A NotT restrikciós enzim felismerő helyeket szintén a végeken építettük be, hogy a PCR-termékek ezután következő klónozását megkönnyítsük.
A PCR-DNS-eket Notl-gyel elhasítottuk és a pSV46 plazmidvektor Notl klónozóhelyére ligáltuk, ez lehetővé teszi, hogy a pontosan beépített gének a korai SVHO promoter szabályozása alatt fejeződjenek ki [g. R. MacGregor, C. T. Caskey, Nucl. Acids Rés., 17, 2365 (1989)]. A vektorban rendelkezésre áll egy poliadenilezőszignál is a hatékony expresszió érdekében és egy SVHO replikációs origó, hogy a transzfektált COS-sejtekben - amelyek konstitutív módon fejezik ki a nagy SVHO-T-antigént [Y. Gluzman, Cell., 23, 175-182 (1981)] - lehetővé tegye a rekombináns plazmidok replikációját.
A ligálóelegyeket használtuk fel E. coli HB101 sejtek transzformálására, majd az egyes ampicillinrezisztens telepeket - amelyek egyetlen kiónt képviselnek izoláltuk. A plazmidokban az inszertum irányát restrikciós enzimes emésztésekkel és agarózgél-elektroforézissel határoztuk meg. A megfelelő irányítottságú inszertumokat tartalmazó kiónokat tartottuk meg a további analízisekhez.
A helyes irányítottságú inszertumokat tartalmazó plazmidokat restrikciós analízissel azonosítottuk, és cézium-klorid-gradiensben való centrifugálással tisztítottuk.
Mindegyik plazmidszerkezetnél a DNS-szekvencia-meghatározáshoz készítményből származó tisztított kétszálú plazmid-DNS-t használtunk. A szekvenálási reakciókat hőmérsékletváltásra alkalmas Perkin-Elmer készülékben végeztük TBE-specifikus primerek, AmpliTaq Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) és fluoreszkáló színezékkel jelzett didezoxiterminátorok használatával, az előállító cég (Applied Biosystems) előírásai szerint. A szekvenálási reakciók termékeit az Applied Biosystems 373A automata DNS-szekvenátorával analizáltuk.
PCR-rel létrehozott mutációk analízise
Annak érdekében, hogy a klónozott inszertumokat részletesen analizáljuk, és hogy a Taq polimeráz által létrehozott mutagenizálás hatékonyságát megítéljük, kiválasztottunk 13 olyan egyedi E. coli kiónt, amelyek SV-PE-sorozatból származó plazmidot tartalmaztak, és 9 olyan kiónt, amelyek SV-E-sorozatból származó plazmidot tartalmaztak. A kiónok plazmid-DNS-ét tisztítottuk, és a klónozott inszertumok mindkét szálát teljes szekvenálással analizáltuk. A CDNS-szekvenciákat ezután a szülői vad típusú TBE-vírus Neudörfl törzs [C. W. Mandl, F. X. Heinz, C. Kunz, Virology, 166, 197-205 (1988)] megfelelő RNS-szekvenciával hasonlítottuk össze.
HU 224 199 Β1
Mint vártuk, az egyes plazmidklónok több nukleotidban különböztek a vad típusú TBE-vírus szekvenciájától. Néhány kivételtől eltekintve (lásd alább) e változások nagyobb részben olyan egyedi mutációk voltak, amelyeket nyilvánvalóan a PCR-sokszorozás vezetett be, és így csak egyetlen kiónban voltak megtalálhatók.
1. táblázat
A PCR által okozott mutációk összefoglalása
| Klón | Nukleotidvál- tozásoka> | Aminosawáltozásokb) | |
| prM | E | ||
| SV-PE | |||
| 01 | 945 G->A | ||
| 1122G^C | Gin 50->His | ||
| 1395 C^T | |||
| 2027 T^C | Val 352—>Ala | ||
| 2480 A->GC) | |||
| 02 | 551 T->A | Val 24->Glu | |
| 1080 G->A | |||
| 1153T->C | |||
| 1168T—>C | Ser 66-»Pro | ||
| 1690 A->G | Arg 240->Gly | ||
| 2458 G->del | Alá 495—> leolvasási keret eltolódás | ||
| 03 | 952 T->C | Cys158->Arg | |
| 976 C->T | Arg 2->Cys | ||
| 1163A->G | Lys 64->Arg | ||
| 1679 A^G | Asn 236^-Ser | ||
| 1889 T-»A | Met 306-»Lys | ||
| 04d> | 1434 C^T | ||
| 2275 A->T | Lys 435->Stop | ||
| 2364 G^A | |||
| 05°) | 701 T^C | Leu 74->Pro | |
| 1488 C^A | |||
| 1492 T->C | |||
| 1893 T-»A | Cys 307->Stop | ||
| 06 | 782 T->C | Leu 101 ->Pro | |
| 865 A—>G | Lys 129—>Glu | ||
| 1002 C^T | |||
| 1972 G->A | Gly 334->Arg | ||
| 07c> | 1327 G->del | Alá 119—> leolvasási keret eltolódás | |
| 2248 G->A | Alá 426->Thr | ||
| 08 | 701 T->A | Leu 74—>Gln | |
| 2092 A >G | Met 374^Val | ||
| 2124 T->C |
| Klón | Nukleotidvál- tozások3) | Aminosawáltozásokb> | |
| prM | E | ||
| 09 | 452 T^C | ||
| 960 A^T | |||
| 1746 A->G | |||
| 2086 A-»G | He 372->Val | ||
| 2142 T^C | |||
| 2290 G->A | Val 440—>lle | ||
| 2361 A-»G | |||
| SV-PE | |||
| 10c> | 1625 A->G | Asp 218->Gly | |
| 2475 T->C | |||
| 11c> | - | ||
| 12«=) | 1303 G->A | Met 77-4 le | |
| 13c> | 1366 T->C | Tyr132^His | |
| 1381 A^G | He 137->Val | ||
| 1728 G->A | Met 252->lle | ||
| SV-E | 2134 C->T | ||
| 01d> | 1239 C->T | ||
| 02 | 1093 A»T | Met 41->Leu | |
| 2301 C->T | |||
| 03 | 1321 G^A | Val 117^ He | |
| 1688A>G | Glu 239->Gly | ||
| 1717 G—>A | Alá 249->Thr | ||
| 2053 A->G | Asn 361 -^Asp | ||
| 2092 A->G | Met 374—>Val | ||
| 04 | 2073 T->C | ||
| 2438 C->T | Alá 489->Val | ||
| 05 | 938 T^C | (Leu 153->Pro)c> | |
| 973 T->C | Ser 1->Pro | ||
| 2401 T->G | Ser477->Ala | ||
| 06 | 891 C->T | ||
| 1151 G^A | Cys 60->Tyr | ||
| 1364 T—>C | Val 131^Ala | ||
| 1567 A^G | He 199->Val | ||
| 2045 T^C | He 358-»Thr | ||
| 07 | 1257 T-»C | ||
| 1694 T-»C | Leu 241->Pro | ||
| 1794 A->G | |||
| 2159 G-»T | Gly 396-> Val | ||
| 08 | 1806 A^G | ||
| 2205 A->G | |||
| 09 | 2491 A—>delc |
a) A nukleotidkoordináták a teljes TBE-genomra vonatkoznak
b) Az aminosavkoordináták a prM-re vagy E-re vonatkoznak
c) Aminosawáltozások az NS1 vagy C génben
HU 224 199 Β1
d) Az SV-PEOH új neve „SV-Pest” és az SV-EO1 új neve „SV-Ewt”
e) A PCR okozta mutációkon kívül más mutációkat nem említünk (vö. a szöveggel)
f) Ebben a szerkezetben a prM-nek csak a C-terminális része volt jelen
Amint az 1. táblázat mutatja, a 22 szekvenált inszertum (összesen 43 549 bázispár) 71 olyan egyedi nukleotidváltozást tartalmazott, amelyeket a Taq polimeráz hibájára vezettünk vissza. Ezek a változások 42 (59%) szubsztitúcióhoz vezettek a várt aminosavszekvenciában, és 3 deléciót okoztak, amelyeknek leolvasási keret eltolódás volt a következménye (2. táblázat).
2. táblázat
PCR-mutáció-gyakoriság
| Bázispárváltozások | Az előfordulások száma3) | Bázisonként! gyakoriság |
| G/C-> A/T | 20 (28%) | 4,59x10-* |
| G/C->T/A | 2 (2,8%) | 4,59x10-5 |
| G/C->C/G | 1 (1,4%) | 2,30x10-5 |
| A/T^G/C | 37 (52%) | 8,50x10-* |
| A/T-»C/G | 1 (1,4%) | 2,30x10-5 |
| A/T->T/A | 7 (9,9%) | 1,61x10-* |
| G/C deléció | 2 (2,8%) | 4,59x10-5 |
| A/T deléció | 1 (1,4%) | 2,30x10-5 |
| Átmenetek | 57 (80%) | 1,31x10-3 |
| Transzverziók | 11 (15%) | 2,53x10-* |
| Összes mutáció | 71 (100%) | 1,63x10-3 |
| Aminosavszubszti- túciók | 42 (59%) | 9,64x10-* |
| Csendes mutációk | 24 (34%) | 5,51x10-* |
| Leolvasási keret eltolódások | 3 (4,2%) | 6,89x10-5 |
| Terminátor kodonok | 2 (2,8%) | 4,59x10-5 |
a) 43 549 szekvenált bázispár
A mutációk eloszlása erősen eltolódott az A/T G/C és G/C A/T átmenetmutációk javára, amit előzőleg már mások is megfigyeltek [A. M. Dunning, P. Talmud, S. E. Humphries, Nucl. Acids Rés., 16, 10393 (1988); J. Chen, A. Sahota, P. J. Stambrook, J. A. Tischfield, Mutat. Rés., 249, 169-176 (1991); R. C. Cadwell, G. F. Joyce, PCR Methods Applic, 2, 28-33 (1992)]. Egy 35 ciklusú sokszorozásnál az összes mutáció gyakorisága bázispáronként 1,63*10~3 volt (4,7*10-5 per bázispár per ciklus), ami a Taq-Polymerase hibáinak gyakoriságáról közölt értékekkel megegyezik. Az átlagos aminosavszubsztitúciós arány prM-nél (164 aminosav hosszú) génenként 0,46 volt, és E-nél (496 aminosav hosszú) 1,59.
A 930. nukleotidnál egy csendes mutáció volt jelen minden kiónban, és így feltételezhető, hogy ez természetes mutáció gyanánt keletkezett a vírus szaporodása folyamán. Ezenkívül megállapítottuk, hogy az SV-PE-sorozat öt kiónjában - SV-PEO5, SV-PE07, SV-PE11, SV-PE12 és SV-PE13 - egyformán két azonos mutáció fordult elő a 849., 1285., 1346., 1404., 1909., 2247. és 2255. nukleotidnál. Az SV-PE10-et kivéve, amely e mutációk közül hármat (1909, 2247 és 2255) tartalmazott, ilyeneket nem találtunk a többi SV-PE kiónban, sem valamely SV-E kiónban. Az egyik ilyen változás - egy nukleotiddeléció az 1346. pozícióban - leolvasási keret eltolódást okozott az E génben, a 125. kodonnál, és azt vártuk volna, hogy ez egy működésre képtelen E proteint eredményez. Minthogy e két, azonos mutációkat tartalmazó klón közül egyet a külön CDNS- és külön PCR-előállításoktól függetlenül kaptunk meg (adatokat nem mutattunk be), úgy tűnik, hogy ez a variáns már a sokszorozás előtt jelen volt a vírus-RNS-populációban. Ezeket a sajátos mutációkat ezért nem vontuk be a PCR által okozott mutációk analízisébe.
Vad típusú és deletált E proteineket kódoló szerkezetek
Az egyes aminosavváltozásokat kódoló kiónokon kívül érdekeltek voltunk az olyan prM+E- és csak E-szerkezetek előállításában is, amelyek vad típusú és deletált proteineket kódolnak. Minthogy azonban az SV-PE-sorozatból mindegyik PCR-rel előállított klón olyan mutációkat tartalmazott, amelyek az aminosavszekvenciában változásokhoz vezettek volna, közvetlen szubklónozást alkalmaztunk egy olyan vad típusú szerkezet előállítására, amely a módosítatlan prM és E proteint, valamint a csak E-szerkezet egy deletált formáját kódolja.
Az SV-PEO4 plazmid DNS-szekvenciája két csendes mutáción kívül egy szubsztitúciót mutatott a 2275. nukleotidnál, amikor is az AT-re cserélődött, miáltal az E protein 435-ös lizinjének AAG kodonja TAG stopkodonná változott (1. táblázat). Ennélfogva előre látható volt, hogy az SVPEO4 egy vad típusú prM proteint és egy deletált E proteint kódol, amelyből a karboxiterminális 61 aminosavmaradék hiányzik, amely a valószínű membránt átszelő szakaszt foglalja magában [C. W. Mandl, F.Guirakhoo, H. Holzmann, F. X. Heinz, C. Kunz, J. Virol, 63, 564-571 (1989)]. Azt találtuk, hogy az SV-EO1 plazmid, amelyből a prM gén nagy része hiányzik, a génben csak egy csendes mutációt tartalmaz, miáltal egy vad típusú E proteint kódol.
Annak érdekében, hogy egy olyan prM+E szerkezethez jussunk, amely egy vad típusú aminosavszekvencia teljes hosszával rendelkezik, és egy prM nélküli csak E szerkezethez, de amely egy stopkodont tartalmaz a 2275. nukleotidnál, az SV-PEO4-ből és az SV-EO1-ből (elnevezésük a későbbiekben SV-PEst, illetve SV-Ewt) kapott restrikciós fragmentumokat kicseréltük. Erre a célra, a CfrIOI restrikciós enzim számára két hasítási helyet használtunk, az egyiket a 960. és 961. nukleotid között, a prM és E gén határához közel, a másikat a vektor ampicillinrezisztencia-génjében. A kapott plazmidszerkezetek közül egy, az SV-PEwt, tartalmazta az SV-PEst-ből származó vad típusú prM
HU 224 199 Β1 gént és az SV-Ewt-ből származó vad típusú E gént, míg a másik plazmidszerkezetből, az SV-Est-ből, a prM gén hiányzott, tartalmazta azonban az SV-PEst-ből származó, stopkodont tartalmazó E gént. Ezeket a változásokat a két plazmid inszertumainak a szekvenálásával igazoltuk. Ez a két szerkezet egy készletet tett teljessé négy expressziós plazmidból, a vad típusú szerkezetből (SV-PEwt) kifejeződött E proteinek szerkezetének és feldolgozásának az összehasonlítására olyanokéval, amelyekből a prM (SV-Ewt), az E-horgony szakasz (SV-PEst) vagy mindkettő hiányzott.
A PEwt inszertum teljes szekvenciáját a 3a., b. és c. ábrán mutatjuk be.
2. példa
Immunizálás csupasz DNS-sel
A csupasz DNS-sel végzett immunizáláshoz olyan plazmidokat használtunk, amelyek az 1. ábrán bemutatott inszertumokat a CMV-„immediate early”-promoterek szabályozása alatt tartalmazták. Ezeket a plazmidokat (CMV-PEwt, CMV-PEst, CMV-Ewt, CMV-Est) a leírt SV-PEwt, SV-PEst, SV-Ewt és SV-Est plazmidokból származó inszertumoknak a pCMVp (Clontech) plazmidba való átklónozásával kaptuk [MacGregor et al., Nucl. Acids Rés., IRL Press, 17. kötet, 2365. old.: „Construction of plasmids that express E. coli β-galactosidase in mammalian cells” (1989)], majd cézium-klorid sűrűséggradiens-centrifugálással tisztítottuk [Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)].
A CMV-PEwt a vad típusú prM és E protein szekvenciákat tartalmazza.
A CMV-PEst a vad típusú prM protein szekvenciáját és az E protein egy olyan deletált szekvenciáját tartalmazza, amelyből 61 karboxiterminális aminosav amelyek az E protein membránhorgonyát képezik - kodonjai hiányoznak.
A CMV-Ewt-ben a prM szekvencia nagy része nincs jelen, de a vad típusú E protein teljes szekvenciája benne van.
A CMV-Est nem tartalmaz prM szekvenciát, tartalmazza a CMV-PEst-ből való deletált E protein szekvenciát.
E négy plazmidot két koncentrációban (60 pg/ml és 300 pg/ml PBS-ben) használtuk egerek (Swiss albínó) immunizálására, amikor is minden egyes plazmidkészítményből 10 egeret (5 nőstény és 5 hím) oltottunk. Minden egeret kétszer oltottunk intradermálisan 100 μΙ mindenkori DNS-készítménnyel, 2 hét időköz kihagyással. Kontrollként a pCMV8 plazmidot használtuk 300 pg/ml koncentrációban, valamint PBS-t, azonos módon. Összehasonlításul 10 egérből álló csoportokat hagyományos módon, formalinnal inaktivált vírussal 1 pg/ml és 5 pg/ml koncentrációban - immunizáltunk, ugyanúgy kétszer, 2 hetes időközt hagyva. Az egereket 0,2 ml-rel oltottuk szubkután, és adjuvánsként 0,2% alumínium-hidroxidot használtunk. A második immunizáló oltás után az egerekből vért vettünk - specifikus antitestek ELISA vizsgálattal való kimutatásához -, és ezzel egy időben végeztük a challenge felülfertőzést intraperitoneálisan, 500 LD50 TBE-vírussal. A megfigyelési idő 3 hétig tartott. Az antitestkimutatás- és a védőhatás-vizsgálatok eredményét a 3. táblázatban foglaljuk össze. A táblázatból látható, hogy DNS-immunizálásnál a TBE-vírus halálos adagjával való fertőzéssel szembeni védelmet csak azzal a plazmiddal lehet elérni, amelyik a teljes prM és E proteint meghatározó gént tartalmazza. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy az olyan szubvirális partikulák felépítéséhez, amelyben az E protein immunogén formában van jelen, a prM/M protein jelenléte szükséges.
3. táblázat
Az egér védőhatás vizsgálat eredménye
| Immunogén | Védőhatás | Antitest- pozitív | |
| Plazmidok | |||
| PEwt | 60 mg/ml | 6a>/10b> | 1c>/10d> |
| PEwt | 300 mg/ml | 9/10 | 5/10 |
| Ewt | 60 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| Ewt | 300 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| PEst | 60 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| PEst | 300 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| Est | 60 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| Est | 300 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| CMV-b | 300 mg/ml | 0/10 | 0/10 |
| Kontrollok | |||
| HCOH vírus | 1 mg/ml | 4/10 | 4/10 |
| HCOH vírus | 5 mg/ml | 10/10 | 10/10 |
| PBS | 0/10 | 0/10 |
a) Védett egerek száma
b) Vizsgált egerek száma
c) ELISA-pozitív egerek száma
d) Vizsgált egerek száma
Claims (8)
1. Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina, amely olyan nukleinsavat foglal magában, amely Flavivírusból származtatott E proteint és prM/M proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz, teljes, natív formában.
2. Az 1. igénypont szerinti vakcina, amelyben az E és prM/M proteint kódoló szekvenciát Tick-Borne-encephalitis (TBE)-vírusból származtatjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti vakcina, amelyben az E és prM/M proteint kódoló szekvenciát az európai vagy távol-keleti TBE-vírus szubtípusból származtatjuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amelyben a nukleinsav egy plazmid.
5. A 4. igénypont szerinti vakcina, amelyben a plazmidot CMV8 plazmidból származtatjuk.
HU 224 199 Β1
6. Flavivírusból származtatott E proteint és prM/M proteint kódoló nukleinsavszekvenciát teljes, natív formában tartalmazó csupasz nukleinsav alkalmazása gyógyszer előállítására.
7. Flavivírusból származtatott E proteint és prM/M 5 proteint kódoló nukleinsavszekvenciát teljes, natív formában tartalmazó csupasz nukleinsav alkalmazása Flavivírus-fertőzések elleni vakcina előállítására.
8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav TBE-vírusból származtatott E proteint és prM/M proteint kódoló szekvenciákat tartalmaz.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0135294A AT402897B (de) | 1994-07-08 | 1994-07-08 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
| AT0087195A AT405607B (de) | 1995-05-23 | 1995-05-23 | Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung |
| HU9501832A HU219503B (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9903233D0 HU9903233D0 (en) | 1999-11-29 |
| HU224199B1 true HU224199B1 (hu) | 2005-06-28 |
Family
ID=25594155
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501832A HU219503B (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására |
| HU9903233A HU224199B1 (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Flavivírus-fertőzések elleni immunizálásra alkalmas, csupasz nukleinsavat tartalmazó vakcina |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501832A HU219503B (hu) | 1994-07-08 | 1995-06-21 | Javított vakcina TBE-vírusfertőzés elleni immunizálásra, valamint eljárás az előállítására |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0869184B1 (hu) |
| AT (2) | ATE198909T1 (hu) |
| CZ (1) | CZ282927B6 (hu) |
| DE (2) | DE59509667D1 (hu) |
| DK (2) | DK0869184T3 (hu) |
| ES (2) | ES2165109T3 (hu) |
| FI (2) | FI117974B (hu) |
| HU (2) | HU219503B (hu) |
| RU (1) | RU2150294C1 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69833388D1 (de) * | 1997-11-20 | 2006-04-13 | Us Army Medical Res Materiel C | Dna impfstoffe gegen zecken-flavivieren |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| EP1572941A4 (en) * | 2002-02-26 | 2009-03-18 | Maxygen Inc | NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES |
| CA2591665C (en) | 2004-12-20 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| US8052974B2 (en) | 2005-05-12 | 2011-11-08 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| US8211431B2 (en) | 2006-06-06 | 2012-07-03 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof |
| WO2010008411A1 (en) | 2007-11-09 | 2010-01-21 | The Salk Institute For Biological Studies | Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2074422T3 (es) * | 1987-03-20 | 1995-09-16 | Immuno Ag | Moleculas de adn y arn del subtipo accidental del virus fsma, polipeptidos, que son codificados por estas moleculas, y su uso. |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| WO1992003161A1 (en) | 1990-08-27 | 1992-03-05 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Flavivirus envelope proteins with increased immunogenicity for use in immunization against virus infection |
| DK0584348T3 (da) | 1992-03-11 | 2005-09-19 | Powderject Vaccines Inc | Genetisk vaccine mod immundefektvirusser |
-
1995
- 1995-06-21 HU HU9501832A patent/HU219503B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-21 HU HU9903233A patent/HU224199B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-06 AT AT95890132T patent/ATE198909T1/de active
- 1995-07-06 DE DE59509667T patent/DE59509667D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES98107383T patent/ES2165109T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 ES ES95890132T patent/ES2155510T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 AT AT98107383T patent/ATE206459T1/de active
- 1995-07-06 EP EP98107383A patent/EP0869184B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 EP EP95890132A patent/EP0691404B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-06 DK DK98107383T patent/DK0869184T3/da active
- 1995-07-06 DK DK95890132T patent/DK0691404T3/da active
- 1995-07-06 DE DE59508988T patent/DE59508988D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-07 FI FI953371A patent/FI117974B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 RU RU95113194/14A patent/RU2150294C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-07 CZ CZ951769A patent/CZ282927B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-17 FI FI20070041A patent/FI118222B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0869184T3 (da) | 2001-12-17 |
| HU9903233D0 (en) | 1999-11-29 |
| FI953371A0 (fi) | 1995-07-07 |
| CZ176995A3 (en) | 1996-01-17 |
| EP0869184A3 (de) | 1999-05-12 |
| HU219503B (hu) | 2001-04-28 |
| DK0691404T3 (da) | 2001-03-19 |
| RU2150294C1 (ru) | 2000-06-10 |
| DE59509667D1 (de) | 2001-11-08 |
| EP0691404B1 (de) | 2001-01-24 |
| EP0869184B1 (de) | 2001-10-04 |
| HU9501832D0 (en) | 1995-08-28 |
| CZ282927B6 (cs) | 1997-11-12 |
| FI117974B (fi) | 2007-05-15 |
| ES2165109T3 (es) | 2002-03-01 |
| ATE198909T1 (de) | 2001-02-15 |
| FI20070041A (fi) | 2007-01-17 |
| ES2155510T3 (es) | 2001-05-16 |
| EP0691404A2 (de) | 1996-01-10 |
| FI118222B (fi) | 2007-08-31 |
| FI953371A (fi) | 1996-01-09 |
| ATE206459T1 (de) | 2001-10-15 |
| EP0869184A2 (de) | 1998-10-07 |
| HUT72395A (en) | 1996-04-29 |
| DE59508988D1 (de) | 2001-03-01 |
| EP0691404A3 (de) | 1997-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10555997B2 (en) | Antigens and vaccines directed against human enteroviruses | |
| JP4504464B2 (ja) | キメラフラビウイルスワクチン | |
| US10227385B2 (en) | Chimeric poly peptides and the therapeutic use thereof against a flaviviridae infection | |
| US7507415B2 (en) | West nile virus vaccine | |
| US20150056244A1 (en) | Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses | |
| KR20060028384A (ko) | 만성 간염용 치료 백신으로서의 안정화된 ＨＢｃ 키메라입자 | |
| WO1994018234A1 (en) | Production of recombinant proteins containing multiple antigenic determinants linked by flexible hinge domains | |
| JP3510249B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な細胞障害性ｔ細胞を刺激するためのペプチド | |
| US4810492A (en) | Flavivirus antigen | |
| FI118222B (fi) | Parannettu rokote Flavivirusinfektioiden vastaiseen immunisointiin | |
| JPH01501357A (ja) | ヒト呼吸器系ウイルス用ワクチン | |
| AU3610293A (en) | Hepatitis therapeutics | |
| BRPI0914846A2 (pt) | novas proteínas de fusão, e sua aplicação na preparação de vacinas contra a hepatite c | |
| EP0614979B1 (en) | Hog cholera virus vaccine and diagnostic | |
| Lee et al. | Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus: the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system | |
| EP0728015B1 (en) | Method of producing a set of combinatorial polypeptide antigens | |
| US5439814A (en) | DNA encoding infectious rubella virus | |
| EP3820997A1 (en) | Viral-vectored vaccine for malaria | |
| JPH05503937A (ja) | ヒトのマラリアの寄生虫に関連したポリペプチドおよびこれをコードするｄｎａ | |
| Bae | Sang-Gu Lee, Dae-You Kim, Byung-Hwa Hyun and | |
| TW201002343A (en) | Flavivirus NS1 subunit vaccine | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050421 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |