KR20060028384A - 만성 간염용 치료 백신으로서의 안정화된 ＨＢｃ 키메라입자 - Google Patents

만성 간염용 치료 백신으로서의 안정화된 ＨＢｃ 키메라입자 Download PDF

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Abstract

T 세포-촉진량의 백신을 환자에게 투여함을 포함하는 만성 B형 간염을 치료하는 방법이 기재되어 있다. 백신은, 자가 어셈블리된 입자의 안정성을 증강시키고, 이들 입자에 의한 핵산 결합이 실질적으로 부재하도록 공학적으로 처리된 면역원량의 키메라 카복시-말단의 절단된 B형 간염 바이러스 뉴클레오캡시드(코어) 단백질(HBc)을 포함한다. 키메라 단백질 분자는 HBc의 N-말단, 면역원성 루프내 또는 C-말단 중의 하나 이상과 펩티드 결합된 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포함할 수 있다. 자가 어셈블리된 입자의 증강된 안정성은 키메라 분자의 아미노-말단 및 카복시-말단 중 하나 또는 둘다의 근처에 하나 이상의 이종 시스테인 잔기의 존재에 의해 수득된다.
만성 B형 간염, 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자, 면역원성 입자, 자가 어셈블리된 입자, 면역원성 에피토프

Description

만성 간염용 치료 백신으로서의 안정화된 ＨＢｃ 키메라 입자{Stabilized HBc chimer particles as therapeutic vaccine for chronic hepatitis}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은, 2002년 2월 21일자로 출원된 특허원 제10/080,299호의 부분 연속 출원이고, 2002년 2월 22일자로 출원된 특허원 제10/082,014호의 부분 연속 출원인, 2003년 2월 21일자로 출원된 특허원 제10/372,076호의 부분 연속 출원이고, 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명은 면역학 분야와 단백질 공학 분야의 공통 부분에 관한 것이고, 특히, B형 간염 바이러스에 대한 면역 반응을 증강시킴으로써 만성 간염인 환자의 치료용 백신에서 면역원으로서 유용하고, C-말단 및 N-말단 시스테인 잔기 중의 하나 또는 둘다를 통하여 자가 어셈블리된 입자의 안정성이 증강되도록 공학적으로 처리된 키메라 B형 간염 바이러스(HBV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질에 관한 것이다.
전세계 3억 5천만명 이상의 사람들이 만성적으로 감염된 B형 간염(HBV) 보균자이다. HBV는 간에 감염되는 바이러스로 만성 간염의 위험율 증가, 간경화증 및 간세포 암종(간암)을 야기한다. B형 간염은 80% 이상의 간세포 암종의 원인으로, 매년 전세계 100 내지 200만 사람들의 생명을 앗아가고 있으며, 중요한 공중 보건 접종을 나타내고, 신규 치료제용 시장이 성장하고 있다.
B형 간염 감염의 중증도는 감염시 감염된 사람의 면역계의 상태에 달려있다. B형 간염은 출생시 모체에서 아기로 전염되는 경우 가장 쇠약하게 하며, 이는 유아의 면역계는 전형적으로 바이러스에 대해 효과적인 반응을 갖출수 없기 때문이다. 그 결과, 만성 감염은 출생시 감염된 90%의 유아에서 발생하고, 간세포 암종의 위험율도 훨씬 높다(20% 내지 30%). 1살 내지 5살에 감염되는 경우, 만성 감염의 위험율은 25 내지 50%까지 떨어진다. 후기 아동기 및 성인기에 감염되는 경우, 만성 감염율은 단지 2 내지 6%이다. 간세포 암종은 성인이 되어 만성적으로 감염된 사람에서는 거의 발생하지 않는다.
만성 보균자는 상당한 전염성을 가지며, 2종류의 일반적 종류로 나뉘어진다: (1) 무증성 만성 지속성 B형 간염(여기서, 대다수의 만성 보균자는 그들 상태에 대한 의학적 주의를 기울이지 않는다), 및 (2) 보다 중증이지만 만성적 내성 감염보다는 보다 덜 통상적인 만성 활성형 B형 간염. 무증상 만성 지속성 HBV인 환자에서 증상이 존재하는 경우, 이들 증상은 피로, 복통, 쇠약, 열, 및 지방 및 알코올에 대한 불내증과 같이 비교적 경미할 수 있다. 이들 질환은 일반적으로 중증 간 질환으로 진행되지는 않지만, 몇몇 환자에서는 만성 활동성 B형 간염을 일으킬 수 있다. 만성 활동성 B형 간염은 간경화증 및 원발성 간세포 암종(PHC)을 유발한다. 간경화증에서, 섬유 조직이 형성되고 손상된 간 세포를 교체시킨다. 이어서, 간은 경화되고, 비대해지며, 왜곡되어, 결국 기능이 상실될 수 있다. PHC는 낮은 B형 간염 풍토성 지역에서는 상대적으로 드물지만, 높은 풍토성 지역에서는 상당히 일반적이고, 종종 사망까지 야기한다.
만성 B형 간염의 최근의 치료는 4개월 동안 인터페론 알파-2를 주사하는 것을 포함한다. 미국에서 승인된 4개 제품의 인터페론 알파-2가 있다: Schering Plough사의 Intron
Figure 112005045808790-PCT00001
A, Amgen사의 Infergen, Hoffmann-La Roche사의 Roferon, 및 GlaxoSmithKline사의 Wellferon. Intron
Figure 112005045808790-PCT00002
A는 B형 간염용으로 승인된 유일한 형태의 알파 인터페론이고, 다른 것들은 오직 C형 간염용으로 승인된 것이다.
인터페론 알파는 간세포의 표면상에 MHC 클래스 I 분자수를 증가시켜 감염된 간세포를 인지하고 파괴하는 면역 세포능을 증가시키는 것으로 여겨진다. 또한, 인터페론 알파는 간세포에서 HBV-RNA를 절단하는 리보뉴클레아제 효소량을 증가시켜 HBV 증식을 지연시킨다.
인터페론 알파는 몇몇 사람에서 만성 B형 간염 감염을 완전하게 제거할 수 있지만, 모든 환자의 반 이상이 치료에 반응하지 않기 때문에 이의 용도는 제한적이다. 만성 B형 간염인 사람에서, 인터페론 알파는 사람 체내에 바이러스 양을 감소시킴으로써 질환을 지연시키고, 이들의 간에 대한 손상을 지연시킬 수 있다.
인터페론 알파-2 치료의 부작용으로 상당히 쇠약해질 수 있으므로, 환자들은 치료를 시작하고는 1 또는 2주 일을 쉬도록 권고받는다. 가장 통상적인 부작용은 독감 증상 - 피로, 열, 근육통, 전신 통증, 오한 및 메스꺼움이다. 경미한 모발 성김증 및 건조증, 가려운 피부가 또한 발생할 수 있다.
인터페론 알파 치료의 무효증 및 부작용으로 인하여 가능한 대안적 치료 선택으로서 항바이러스제 및 치료 백신이 연구되고 있다. 라미부딘 및 팜시클로비어와 같은 2차 생성 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 희망적인 결과가 관찰되었다. 뉴클레오시드 역전사효소 억제제인 Zeffix
Figure 112005045808790-PCT00003
(라미부딘)는 만성 B형 간염용 치료제로서 희망적인 단일 약물 후보자이고, FDA의 시판 승인을 받아 1999년 미국에서 팔렸다. 평가된 기타 항바이러스제로는 BMS200, 475, 간시클로비어 및 아데포비어 디피복실이 포함된다. 상기 후보자들과 인터페론 알파와의 배합 치료가 또한 연구되고 있다.
Hoffman La Roche사 및 Schering Plough Corporation사는 최근에 미국 식품의약품안전청(FDA)에 PEGASYSTM(Hoffman La Roche사) 및 PEG-INTRONTM(Schering Plough Corp.사)라는 명칭의 소위 페그(pegylated) 인터페론의 변형물에 대한 시판 승인을 신청하였다. 페그 인터페론은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 변형시킨 알파 인터페론으로, 이들은 1주 1회 제공되어 환자내에서 지속된 수준의 인터페론을 제공할 수 있다. 페그 제형은 정점과 저점의 인터페론 수준 및 1주 3회 제공되는 경우 발생하는 인터페론 부작용을 피할 수 있다. 페그 인터페론은 단일 치료 또는 배합 치료후 재발된 환자에게 특히 유리할 수 있다.
만성 간염 치료를 위한 백신 접근법이 시도되었다. Couillin과 동료들은, B 형 간염 표면 항원(HBsAg)을 사용한 예방접종이 만성 간염인 환자에서 HBsAg 내성을 극복할 수 있는지 여부를 평가하였다[참조: Couillin et al. (1999) J. of Infect. Dis., 180: 15-26]. 이들은, HBsAg가 약간의 집단에 효과적이었음을 결정하였다.
또한, 면역 반응이 질환의 동물 모델에서 유도될 수 있는지 여부를 동물 모델에서 연구하였다. 따라서, Bocher 및 동료들은, 사람화된(삼량체) 마우스 모델에서 예방접종에 대한 면역반응을 평가하였다[참조: Bocher et al. (2001) E. J. of Immun., 31: 2071-2079]. 질환의 모델로서, 이들 저자들은 PBMC를 B형 간염으로 만성적으로 감염된 환자로부터 마우스내로 전이시킨 후, 마우스에게 B형 간염 코어 단백질(HBc) 또는 B형 간염 코어 단백질을 암호화하는 DNA를 예방접종하였다. 저자들은, 마우스를 HBc 또는 HBC를 암호화하는 DNA로 면역화시키는 경우, HBc-특이적 T-헬퍼-세포 및 B-세포 반응이 유도되었음을 주지하였다. 저자들은, HBc 단백질 또는 HBc-암호화 DNA가 만성 B형 간염 감염에 대한 치료적 예방접종을 위한 후보자 백신을 나타낼 수 있다는 것을 주지하였다. 이들 연구에서, 면역 반응을 유도하기 위해서 상당한 투여량의 HBc가 요구되었다는 것을 주지하여야 한다. 감염된 개체로부터 PBMC 이식된 마우스에서의 면역 반응은 면역자극성 올리고뉴클레오티드(ISN)를 첨가함으로써 더욱 증강될 수 있었다.
능동적 예방접종 연구 이외에도, 수동적 면역 전이가 시도되었다: Lau 및 동료들은, HBV-면역 개체로부터 만성적으로 감염된 개체로의 골수 전이가 감염 치유를 야기하였음을 증명하였다[참조: Lau et al. (2002) Gastroenterology, 122: 614-624]. 당해 치유는 HBc 반응성인 T-세포의 전이와 관련된 것으로, 이들 저자들에게 HBc 단백질 또는 [HBc-암호화] DNA를 사용한 치료적 면역화가 만성 B형 간염 감염인 환자에서 연구할 가치가 있는 것으로 가정하도록 하였다.
따라서, B형 간염 코어 단백질(HBc)은 만성 B형 간염 감염에 대한 치료적 예방접종에 잠재적으로 유용한 항원으로서 인정되었다. 그러나, 잠재성을 실제로 전환시키기 위해서는 수개의 문제점들이 극복되어야 한다: HBc 재조합 생성은 곤란하다. 하기 논의되는 바와 같이, 생성 수율은 어쩌면 HBc 단백질의 고유의 핵산 결합 특성으로 인하여 상당히 낮고, 수득한 바이러스-유사-입자(VLP)는 감독 위원회에 허용되는 수준으로 정제하기에 더욱 곤란하다.
HBc 제조와 관련된 곤란함으로 인하여, HBV로 만성적으로 감염된 개체에서 HBc에 대한 면역 반응을 유도하는 대안적 접근법이 추구되었다. 따라서, 예를 들면, Hultgren 및 Sallberg에 양도된 WO 제01/16163호에는 HBc의 위치 1 내지 183 서열을 스패닝하는 수개의 아미노산 잔기를 포함하는 다중 중복 합성 펩티드의 사용을 제안하고 있다. 이들 발명자들은, 전체 단백질을 스패닝하는 펩티드 혼합물을 사용한 면역화가 만성적으로 감염된 개체 치유를 촉진시키는 면역 반응을 유도할 수 있다고 주장하고 있다. HBc 단백질을 암호화하는 DNA가 HBV로 감염된 침팬치를 면역화하는데 사용되었다[참조: Sallberg et al., (1998) Human Gene Therapy 10: 1719-1729]. 단백질을 암호화하는 DNA를 사용하여 단백질 정제의 필요성은 극복되었지만, DNA-예방접종은 사람에서 유의적인 성공율과 관련있지 않았다.
Thoma의 미국 특허 제6,020,167호에는 만성 HBV 감염을 치료하는데 유용한 것으로 알려진 백신이 기재되어 있다. 이 백신은, 폴리펩티드를 표시할 수 있는 수송체에 결합된 하나 이상의 HBV pre-S1 또는 HBV 코어 T-세포 활성화 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 완전한 HBV 코어 또는 HBV 코어의 실질적인 부분을 함유한 입자-형성 수송체가 바람직한 것으로 관찰되었고, 표면 단백질(각각, HBc 및 HbsAg)이 수송체로 청구되었다. 하기 논의되는 바와 같이, 완전 코어 단백질은 핵산과 결합하는 경향이 있고, 이는 백신 제조에 있어서 문제가 될 수 있다. 또한, 카복시-말단을 절단하여 핵산 결합을 경감시킨 코어 분자는 불안정할 수 있고, 백신에서 이종 혼합물을 제공할 수 있다.
헤파드나비리대(hepadnaviridae) 과는 사람에게서 B형 간염을 유발시킬 수 있는 외피 DNA-함유 동물 바이러스(HBV)이다. 이러한 헤파드나비리대 과에는 기타 포유류의 B형 간염 바이러스, 예를 들면, 우드척(woodchuck; WHV), 땅 다람쥐(GSHV), 및 오리(DHV) 및 백로(HeHV)에서 발견되는 조류 바이러스가 포함된다. 본원에서 사용된 B형 간염 바이러스(HBV)는, 이에 대한 논의가 비-포유류 바이러스의 특정 예로 나타내어지지 않는 한, 조류 숙주를 감염시키는 바이러스와 비교해서 포유류를 감염시키는 헤파드나비리대 과의 구성원을 나타낸다.
포유류 B형 간염 바이러스(HBV 또는 헤파드나바이러스)의 뉴클레오캡시드 또는 코어는 바이러스 아형에 따라서 183 또는 185개 아미노산 잔기 서열을 함유하는 반면, 오리 바이러스 캡시드는 262개 아미노산 잔기를 함유한다. 몇몇 헤파드나비리대의 B형 간염 코어 단백질 단량체는 감염된 세포에서, B형 간염 코어 단백질 입자(HBc 입자)로서 공지된 안정한 응집체로 자가 어셈블리된다. 2가지의 3차원적 구조물이 HBc 입자에 대해 보고되었다. 소수 집단을 차지하는 첫번째 것은 이량체로서 HBc 서브유닛 단백질의 90개 복사물을 함유하거나 180개의 개별적인 단량체성 단백질을 함유하고; 대다수 집단을 차지하는 두번째 것은 이량체로서 HBc 서브유닛 단백질의 120개 복사물을 함유하거나 240개의 개별적인 단량체성 단백질을 함유한다. 이들 입자는 각각 T=3 또는 T=4 입자로서 지칭되는데, 여기서 "T"는 삼각 측량수(triangulation number)이다. 사람 감염성 바이러스(사람 바이러스)의 이들 HBc 입자는 직경이 각각 약 30 또는 34nm이다[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74; and Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590].
문헌[참조: Conway et al., (1997) Nature, 386:91-94]에는 극저온-전자 현미경으로부터 측정된 바와 같이, 9Å 해상능에서의 사람 HBc 입자의 구조가 기재되어 있다. 문헌[참조: Bottcher et al. (1997), Nature, 386:88-91]에는 사람 HBc 단량체에 대한 폴리펩티드 폴딩이 기재되어 있고, 알파-나선상 영역과 이들의 연결성 루프 영역이 형성되는 아미노산 잔기에 대한 대략적인 넘버링 도식이 제공되어 있다. 문헌[참조: Zheng et al. (1992), J. Biol. Chem., 267(13):9422-9429]에는, 코어 입자 형성이 하나 이상의 시스테인이 결여된 돌연변이체 단백질에 관한 연구와 C-말단-절단된 단백질에 관한 기타 연구[참조: Birnbaum et al., (1990) J. Virol. 64, 3319-3330] 결과에 근거한 디설파이드 결합 형성이나 핵산 결합, 또는 아르기닌 풍부한 C-말단 도메인에 좌우되지 않는다고 보고되어 있다.
B형 간염 뉴클레오캡시드 또는 바이러스 코어 단백질(HBc)은 면역된 숙주 동 물의 T 세포 반응을 자극하는 면역원성 수송체 잔기로서 보고된 바 있다[참조: 미국 특허 제4,818,527호, 제4,882,145호 및 제5,143,726호]. 특히 유용한 상기 수송체의 적용 특성은 해당 단백질의 아미노 말단(N-말단)으로부터 약 잔기 위치 70 내지 90, 보다 통상적으로는 약 위치 75 내지 85로 언급되는 잔기에 존재하는 면역우성 루프의 부위에 외래 또는 이종 B 세포 에피토프를 표시할 수 있는 상기 수송체의 능력이다[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318].
바이러스 복제 동안, HBV 뉴클레오캡시드는 바이러스성 RNA 프리-게놈, 바이러스성 역전사효소(Pol) 및 말단 단백질(Pol로부터 유도됨)과 연합하여 복제 적격한 코어를 형성한다. 상기 뉴클레오캡시드와 바이러스성 RNA 프리-게놈과의 연합은 카복실 말단(C-말단)에서의 아르기닌-풍부한 도메인에 의해 매개된다. 이종 발현 시스템, 예를 들면, 바이러스성 RNA 프리-게놈이 존재하지 않는 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되는 경우, 프로타민-유사 C-말단, 즉 위치 150 내지 183에서의 잔기는 이. 콜라이 RNA와 결합할 수 있다[참조: Zhang et al. (1992) JBC, 267(13) 9422-29].
백신 잔기로서 적용하는 경우에는, HBV 뉴클레오캡시드가 해당 숙주로부터 유도된 핵산과 결합하지 않는 것이 바람직하다. 문헌[참조: Birnbaum et al. (1990) J. Virol., 64:3319-3330]에는, HBV 뉴클레오캡시드의 프로타민-유사 C-말단 도메인이 바이러스-유사 입자로 어셈블리시킬 수 있는 상기 단백질의 능력을 방해하지 않으면서 결실될 수 있다는 사실이 보고되었다. 따라서, 약 위치 144에서 절단된 단백질, 즉 위치 1에서부터 약 144까지의 HBc 서열을 함유하는 단백질은 자가 어셈블리할 수 있는 반면, 잔기 139 범위를 넘어선 결실물은 캡시드 어셈블리를 상실한다고 보고되었다[참조: Birnbaum et al., (1990) J. Virol., 64:3319-3330; Seifer et al., (1995) Intervirology, 38: 47-62].
문헌[참조: Zlotnick et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561]에는 완전한 길이의 HBc 단백질과 절단된 HBc 단백질을 입자로 어셈블리하는 것에 관해 연구되어 있다. 완전한 길이의 분자에 관한 논의 이외에도, 상기 문헌의 저자는 위치 1에서부터 149까지의 HBc 서열[여기서, 위치 48, 61 및 107에서의 시스테인이 각각 알라닌으로 대체되고, 특정의 시스테인 잔기가 C-말단(위치 150)에 부가되었다]을 함유하는 절단된 단백질의 제조 방법에 관해 보고하였다. C-말단 머캅탄은 전자 현미경에서의 표지화를 위해 금 원자 클러스터(cluster)에 연결하기 위해 사용되었다.
보다 최근에, 문헌[참조: Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590]에는, 사람 바이러스성 서열의 위치 138의 프롤린(Pro-138 또는 P138)이 입자 형성에 요구된다고 보고되었다. 상기 저자는 또한, 카복시 말단에서 142 및 140 잔기 길이로 절단된 입자의 어셈블리 능력에도 영향을 미친다고 보고하였는데, 이러한 어셈블리 능력은 139 내지 137 잔기 길이로 절단되는 경우에는 완전히 상실된다.
몇몇 그룹을 대상으로 한 연구에서는, 절단된 입자가 표준 B형 간염 코어 입자에 비해 저하된 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌는데[참조: Galena et al. (1989) J. Virol., 63:4645-4652; Inada, et al. (1989) Virus Res., 14:27-48], 이는 정제된 제제 내에서의 입자 단편의 존재 여부와 입자 크기의 가변성으로써 명백히 알 수 있다[참조: Maassen et al., (1994) Arch. Virol., 135:131-142]. 따라서, 상기 Metzger 등의 보고서가 발표되기 이전의 문헌[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74]에는, 자가 어셈블리에 요구되는 HBc 서열에 대한 카복시 말단 경계가 아미노산 잔기 139와 144 사이에 위치하고, 제1의 2개 또는 3개의 아미노 말단 잔기가 다른 서열로써 대체될 수 있지만, 4개 또는 11개 아미노 말단 잔기를 없애면, 형질전환된 이. 콜라이 세포 내에서의 키메라 단백질이 완전히 소멸되는 결과가 초래된다고 보고되었다.
각종 삽입된 폴리펩티드 서열을 함유하는 내부 삽입물을 보유하는 재조합으로 생성된 하이브리드 HBc 입자(당해 분야에서는 HBc 키메라 입자 또는 HBc 키메라로서 지칭됨)가, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis), 백시니아(Vaccinia), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한 광범위한 유기체에서의 이종 발현에 의해 제조되었다[참조: 예를 들면, Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74, 및 몇가지 조사 그룹 연구 결과를 나타내는 인용문헌].
이러한 HBc 키메라는 종종, 전자 현미경으로 분석한 경우에, 이종 에피토프가 결여된 입자와 비교해서 덜 정렬된 구조를 나타내는 것으로 보인다[참조: Schodel et al., (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]. 몇몇 경우에는, 이종 에피토프를 C-말단적으로 절단된 HBc 입자 내로 삽입하는 것이, 하이브리드 입자를 이종 발현 후에 회수할 수 없도록 하는 극적인 탈안정화 효과를 나타낸다[참조: Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62: 1669-1676]. 따라서, 많은 키메라 HBc 입자는 너무 불안정하여, 이들이 회수 불가능한 정도 또는 이들이 극히 불량한 안정성 특징을 나타내는 정도로 정제 동안 격리되기 때문에, 이들을 대상으로 하여 백신 개발하는데 있어 문제가 있다.
상기 Pumpens 등의 보고서[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74]에는, 상기 삽입된 폴리펩티드 서열이 N-말단, C-말단 및 상기 말단들 사이에 존재하는 입자-형성 키메라가 열거되어 있다. 상기 문헌에 보고된 삽입물 길이는 N-말단에서 24 내지 50개 잔기, 내부적으로 7 내지 43개 잔기, 및 C-말단에서 11 내지 741개 잔기이다.
최근, 문헌[참조: Kratz et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920]에는 238-잔기 그린 형광성 단백질(GFP)과 내부적으로 융합된 절단된 HBc 서열로 구성된 키메라 HBc 입자의 이. 콜라이 발현이 기재되어 있다. 이러한 키메라는 HBc의 아미노산 잔기 79 및 80을 대체하는 한쌍의 글라이신 풍부한 유연성 링커 암(arm)에 의해 플랭킹된 상기 삽입된 GFP 서열을 함유하고 있다. 상기 입자는 숙주 동물로서 래빗 내의 본래의 GFP에 대한 항체를 효율적으로 유발시키는 것으로 언급된다.
미국 특허 제5,990,085호에는 (i) 잔기 78과 79 사이의 면역우성 루프와 융합되고, (ii) 카복시 말단 절단된 HBc의 잔기 144 다음에 융합된 항원성 소 인히빈(inhibin) 펩티드로부터 형성된 2가지 융합 단백질이 기재되어 있다. 발현된 융합 단백질은 숙주 동물 내에 투여되는 경우에 항-인히빈 항체의 생성을 유도시키는 것으로 언급되어 있다. 상기 특허에 보고된, 면역시킨지 30일 후의 역가는 비교적 낮은데, 루프 삽입물을 갖는 융합 단백질의 경우에는 1:3000 내지 15,000이고 잔기 144 다음의 삽입물의 경우에는 1:100 내지 125이다.
미국 특허 제6,231,864호에는 합텐에 연결되어 있는 전략적으로 변형된 B형 간염 코어 단백질의 제조 방법과 용도가 교시되어 있다. 이와 같이 변형된 코어 단백질은 합텐이 펜던트하게 연결되어 있는 화학적 반응성 아미노산 잔기를 함유하는, 1 내지 약 40개 잔기 길이의 삽입물을 함유한다.
WO 제01/27281호에는, HBc에 대한 면역 반응이 본래 분자의 C-말단 시스테인-함유 서열의 존재 또는 부재에 의해 각각 Th1 반응에서 Th2 반응으로 변할 수 있다는 것이 교시되어 있다. 상기 명세서는 또한, C-말단 시스테인에 의한 디설파이드 형성이 상기 입자를 안정화시키는데 도움을 줄 수 있다는 의견을 나타낸다. C-말단 시스테인의 바로 상단부에 본래 HBc 서열의 수개의 잔기가 존재한다는 것이 바람직한 것으로 언급되었지만, 반드시 요구되지는 않는다. 절단된 C-말단 HBc 서열을 대체시키기 위해 사용될 수도 있는 이러한 한 가지 대체 방안은, C-말단 시스테인과 HBc 이외의 단백질로부터의 에피토프를 규정하는 임의 서열을 포함하는 것으로 언급되었다.
PCT 공개공보 WO 제01/98333호에는, C-말단 시스테인 잔기는 유지시키면서, 본래 HBc의 C-말단에 존재하는 4개의 아르기닌 반복체 중의 1개 이상 서열의 결실이 교시되어 있다. 상기 출원에는 또한, 이와 같이 결실된 영역을 HBc 이외의 단 백질로부터의 에피토프로 대체시켜, 이와 같이 형성된 분자의 HBc 부분이 부가된 에피토프에 대한 수송체로서 작용하도록 할 수 있다는 사실이 교시되어 있다.
PCT/US01/25625에 상응하는 PCT 공개공보(2002년 2월 21일 공개된 WO 제02/13765 A2호) 및 PCT/US01/41759에 상응하는 PCT 공개공보(2002년 2월 21일에 공개된 WO 제02/14478 A2호)에는, 입자로 어셈블리되는 키메라 단백질 중에 1개 이상의 부가된 시스테인 잔기를 사용함으로써, C-말단적으로 절단된 HBc 입자를 안정화시킬 수 있다고 교시되어 있다. 이러한 부가된 시스테인 잔기는 상기 키메라 단백질의 C-말단에 또는 C-말단 근처에 존재하는 것으로 교시되어 있다.
완전한 길이의 HBc 입자의 핵산 결합 능력은 없애면서도, 완전한 길이의 HBc 입자의 안정성을 보존시킬 수 있는 구조상의 특징이, 헤파드나바이러스성 뉴클레오캡시드 전달 시스템을 사용한 백신 개발에 상당히 유리할 것이다. 실제로, 외래 에피토프에 대한 수송체로서의 HBc 키메라의 용도에 관한 최근의 연구 결과[참조: Ulrich et al., Adv. Virus Res., vol. 50(1998) Academic Press]는, 이들 키메라를 사람 백신에 사용하기 위해서는 해결해야 할 3가지 잠재적인 문제점이 있다고 지적하고 있다. 첫번째 잠재적인 문제점은 키메라 백신 내의 핵산이 면역 숙주에게 의도하지 않게 전이되는 것이다. 두번째 잠재적인 문제점은 HBc에 대한 기존의 면역으로부터의 간섭이다. 세번째 잠재적인 문제점은 장기간 저장에 견딜 수 있는 본래의 키메라 입자를 재생가능한 수준으로 제조할 필요가 있다는 것이다.
상기 4가지 PCT 공개공보는 Ulrich 등에 의해 보고된 잠재적 문제점을 극복하기 위해 사용될 수 있는 교시를 함유하는 것으로 보인다. 후술되는 바와 같이, 본 발명은 예상밖의 높은 항체 역가를 제공해주는 또다른 HBc 키메라를 제공하며, 하나의 양태에서는 HBc 키메라 안정성의 문제점 뿐만 아니라 해당 작제물의 핵산 결합 능력의 실질적인 부재에 대한 해결책을 제공해주기도 한다. 또한, 본원에 고려된 재조합 키메라는 기존의 항-HBc 항체에 대해, 존재하는 경우 최소한의 항원성을 나타낸다.
상기 입자 불안정성 발견이 N-말단 절단된 HBc 키메라 분자와 관련이 있음에도 불구하고, 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10): 1157-1163]에는 잔기 5에서 완전한 길이의 HBc와 융합된 인플루엔자 M2 단백질의 N-말단 24-잔기 부분을 함유하고 있는 HBc 키메라의 이. 콜라이 발현에서 입자 형성이 일어났다고 보고되었다.
상기 논의된 백신 적용을 위해 절단된 C-말단을 수반한 하이브리드 HBc 단백질을 사용하는 것은 이들의 완전한 길이의 대응물에 비해 몇가지 이점을 제공해주는데, 이에는 발현 수준 증강 및 결합된 이. 콜라이 RNA의 결여가 포함된다. 그러나, 이종 에피토프를 표시하기 위해 공학적으로 처리된 C-말단적으로 절단된 입자는 종종 불안정하여, 발현 후 안정한 미립형 구조물로 연합되지 못하거나 또는 정제 동안 및/또는 정제 후 비-미립형 구조물로 용이하게 해리되는 입자가 생성된다. 이러한 안정성 결여는 HBc 위치 149에 대해 C-말단적으로 절단되고 상기 잔기 위치 1 내지 24의 인플루엔자 A M2 단백질을 함유하기도 하는 키메라 HBc 분자로 구성된 입자로써 나타난다.
기타 문헌에는, 야생형 헤파드나바이러스성 코어 항원에서는 HBcAg 개시 코 돈의 상단부 시스테인 잔기가 입자 형성 방지에 직접적으로 관여한다고 보고되었다[참조: Schodel et al. (Jan. 15, 1993) J. Biol. Chem., 268(2): 1332-1337; Wasenauer et al. (Mar. 1993) J. Virol., 67(3): 1315-1322; and Nassal et al. (Jul. 1993) J. Virol., 67(7):4307-4315]. 3가지 그룹 모두는 야생형 HBeAg에서, 코어 유전자가 위치 -30에서 상단부 개시인자 메티오닌으로부터 해독되는 경우에 존재하는, 프리-코어 서열의 위치 -7에서의 시스테인 잔기가 입자 형성 방지에 관여하므로, 미립형 HBcAg가 분비된 비-미립형 HBeAg로 전이되는 것을 촉진시킨다고 보고되었다.
하기 논의되는 본 발명의 하나의 양태는, B형 간염 바이러스로 만성적으로 감염된 개체에게 투여하기 위한, 상기 언급된 제조 및 오염의 문제점을 극복한 단백질 면역원을 제공하는 것이다. 추가로, 당해 단백질은 물리적 안정성을 유지하면서 현존하는 B형 간염 바이러스로 감염된 체내를 치유하는데 특히 유용한 면역 반응을 유도하도록 공학적으로 처리되었다.
하기 상세하게 기재된 본 발명은 상기 관찰된 수개의 백신 문제점들을 극복한 만성 간염을 치료하기 위한 백신을 제공한다. 따라서, 본원에 고려된 백신은, 현존하는 B형 간염 바이러스 감염된 체내를 치유하는데 특히 유용한 T 세포 활성화를 제공함으로써 증강된 면역 반응을 유도하고, 핵산 결합을 실질적으로 함유하지 않으면서 안정하고 균질한 수송체 분자를 사용한다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 만성 B형 간염 바이러스 감염된 환자에게 재조합의 절단되고 안정화된 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 입자로 구성된 백신을 바이러스에 대한 면역 반응을 증강시키기에 충분한 양으로 투여함으로써 B형 간염 바이러스에 만성적으로 감염된 개체를 치료하는 방법이 고려된다. 단독 또는 다른 요법과 배합하여 바이러스에 대한 이러한 면역 반응을 증강시키는 것은 개체의 체내로부터 바이러스를 제거하고, 더이상 감염성이 없도록 할 수 있다. 재조합의 절단되고 안정화된 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 숙주-핵산을 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다.
당해 방법은 재조합 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질; 즉, B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질[또한, 본원에서 키메라 B형 간염 코어 단백질 분자, HBc 키메라 분자 또는 단순히 키메라로서 지칭됨]로 구성된 백신을 사용하고, 이는 숙주 세포에서 발현 후 입자로 자가 어셈블리되고, 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 용해되거나 분산되어 있다. 고려된 키메라 분자는, C-말단이 통상적으로 약 잔기 위치 183에 있는 본래 코어 분자를 기준으로 하여 적어도 C-말단에서 절단된다. 고려된 키메라 분자를 함유하는 입자는 바람직하게는 N- 및 C-말단의 하나 또는 둘다에 위치하거나 또는 이들 근처에 위치한 시스테인 잔기에 의해 안정화된다. 고려된 키메라 분자는 HBc의 N-말단 165개 아미노산 잔기 중 약 125개 내지 모두를 함유하고, 하나 이상의 기타 아미노산 잔기 또는 전형적으로는 HBV의 B 또는 T 세포 에피토프인 잔기 서열, 또다른 병원체 또는 소 인히빈과 같은 또다른 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 고려된 만성 간염을 치료하는 방법은 만성 B형 간염 바이러스에 감염된 환자에게 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 용해되거나 분산된 면역원성 입자로 구성된 백신을 항-HBc T 세포-자극하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 면역원성 입자는 바람직하게는 면역자극성 아쥬반트와 함께 투여된다. 바람직한 면역자극성 아쥬반트로는, 지질-A 유사체, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A 또는 합성 아미노알킬 글루코사미드 포스페이트가 포함된다. 면역자극성 분자는 바람직하게는 미립자 수송체, 예를 들어 수중유 에멀젼 또는 미립자 미네랄 염, 예를 들어 수산화알루미늄 겔과 배합된다. 면역원성 입자는 그자체가 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자로 이루어져 있고, 이 키메라 단백질 분자의 길이는 아미노산 잔기 약 550개 이하이다. 이들 키메라 단백질 분자는, (a) HBc 분자의 N-말단 165개 아미노산 잔기 중 약 125개 내지 모든 HBc 서열을 함유하고, 잔기 위치 4에서 약 75까지 및 약 85에서 약 140까지의 HBc 서열을 함유한다. HBc 키메라 분자 서열은 (a') 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프(즉, 잔기 위치 약 76에서 약 85 사이) 및 C-말단 중의 하나 이상에서 면역원성 에피토프를 함유하는 펩티드-결합된 아미노산 서열, (b') 1 내지 약 40개의 아미노산 잔기 길이를 갖고 접합된 합텐에 대한 화학-반응성 링커 잔기를 함유하는 HBc 면역우성 루프 중의 삽입물, 또는 (c') 위치 76 내지 85의 서열 잔기 0 내지 모두를 임의로 포함한다.
키메라 단백질 분자는 또한, (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키 메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘다를 함유한다.
키메라 단백질 분자는 HBc 서열 내에 약 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, 입자로 자가 어셈블리된다. 이들 입자는 바람직하게는 숙주 세포에서 발현시 실질적으로 핵산과 결합하지 않지만(하기 논의되는 바와 같이, 약 1.2 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타낸다), 280nm 대 260nm의 흡광도 비가 약 0.9 내지 1.15가 되도록 결합된 핵산의 최소량을 포함할 수 있다. 따라서, 약 0.9 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내는 입자가 본원에 사용될 수 있다. 당해 입자는 (i) 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들) 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 또는 (ii) 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정하다.
환자는 HBc에 대한 T 세포 활성화를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지된다. 본 발명의 다른 양태에서, 환자를 항바이러스 약제, 예를 들어 라미부딘으로 치료하여 바이러스 존재량을 감소시킨다. 항바이러스제를 사용한 치료는 예방접종과 동시에 이루어지거나, 예방접종보다 선행될 수 있다. 본 발명의 고려된 양태는 환자 투여용으로 의도된 HBc 키메라 및 항바이러스 약제 둘다로 구성된 키트를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 당해 환자는 HbsAg를 함유하는 혈청을 갖고, 당해 치료로 환자 혈청내의 항원의 양이 감소된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 환자의 혈청은 HBeAg를 함유하고, 당해 치료로 환자 혈청내의 HBeAg 항원의 양이 감소된다.
바람직한 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자는, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명되는, N-말단으로부터 4개의 펩티드 연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하는 약 135 내지 약 525개 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
상기 키메라 분자의 도메인 I은 약 71 내지 약 110개 아미노산 잔기를 포함하고, 이의 서열에는 (i) 적어도 HBc의 위치 5 내지 위치 약 75의 잔기 서열, (ii) HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 있는 0 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) HBc 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드 결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 면역원성 에피토프가 포함된다.
상기 키메라 분자의 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드 결합된 약 255개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 (i) HBc 위치 약 76에서 약 85까지의 서열 중의 0 내지 모든 잔기가, (ii) 접합된 에피토프에 대한 링커 잔기 또는 면역원성 에피토프를 구성하는 임의로 존재하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기 서열과 펩티드 결합되어 존재한다.
도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 약 86에서부터 위 치 135까지의 HBc 서열이다.
키메라 분자 도메인 IV는, (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 165까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 30개 잔기, (ii) 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 0 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) 위치 165에서부터 C-말단까지의 HBc에 존재하는 서열 이외의 면역원성 서열 중의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 키메라 분자는, (i) 아미노산 잔기의 약 10% 이하가 해당 키메라의 HBc 서열에서 치환되는 아미노산 잔기 서열을 갖고, (ii) 숙주 세포에서 발현시 입자로 자가 어셈블리된다. 당해 입자는 실질적으로 핵산과 결합하지 않으며, 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성되고, (i) N-말단 시스테인 잔기(들)이 결여되었거나, (ii) 고려된 키메라 분자내 존재하는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정적이다.
몇몇 양태에서, 도메인 I의 HBc 서열이 위치 5 내지 위치 75의 잔기와 함께 적어도 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 기타 양태에서, 고려된 키메라 분자가 N-말단 시스테인 잔기를 함유할 뿐만 아니라, 단독으로 존재하거나 아미노산 잔기 서열 중에 존재하는, 상기 언급된 바와 같은 도메인 IV 내의 1개의 시스테인 잔기를 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 다른 양태에서, 바람직한 키메라 분자는 단지 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기 만을 함유하고, 도메인 I은 비-HBc 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. 시스테인 잔기는 도 1의 HBc 서열 각각 의 위치 약 61에 존재한다.
고려된 방법은, 전형적으로는 물을 또한 함유하는 약제학적으로 허용되는 희석제 조성물 중에 용해되거나 분산된 상기 언급된 자가 어셈블리된 키메라 분자 입자를 포함하는 백신을 사용한다. 도메인 I, II 및 III 중의 하나 이상에서 고려된 키메라 분자내에 존재하는 특히 바람직한 비-HBc 에피토프는 B형 간염 표면 단백질(HBs)의 preS1 또는 preS2 영역으로부터의 면역원성 서열이다.
본 발명은 몇 가지 이익과 이점을 갖는다.
본 발명의 특별한 이점은 상당한 T 세포 활성화를 제공하는 치료 백신으로서의 이의 용도이다.
본 발명의 또다른 이점은, 재조합 면역원이 익히 공지된 배양 기술을 사용하여 용이하게 제조된다는 것이다.
본 발명의 이점은, 면역원이 익히 공지된 재조합 기술을 사용하여 용이하게 제조된다는 것이다.
본 발명의 또다른 이점은, 핵산을 실질적으로 함유하지 않으면서 제조시 바람직한 면역원은 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기의 하나 또는 둘다가 결여된 기타 HBc 키메라보다 우수한 안정성을 나타낸다는 것이다.
추가의 이익과 이점은 다음 기재 내용으로부터 당해 기술분야 숙련가에게는 명백할 것이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성한다.
도 1A 및 도 1B의 2개 패널로서 제시된 도 1은 6개 바이러스로부터의 포유류 HBc 단백질에 대해 공개된 6개 서열을 정렬한 것이다. 제1(서열번호 1), 사람 바이러스성 서열은 ayw 아형의 서열이고, 이는 문헌[참조: Galibert et al. (1983) Nature, 281: 646-650]에 공개되었고; adw 아형의 제2 사람 바이러스성 서열(서열번호 2)는 문헌[참조: Ono et al.(1983) Nucleic Acids Res., 11(6): 1747-1757]에 공개되었고; 제3 사람 바이러스성 서열(서열번호 3)은 adw2 아형의 서열이며, 이는 문헌[참조: Valenzuela et al., Animal Virus Genetics, Field et al. eds., Academic Press, New York (1980) pages 57-70]에 공개되었고; 제4 사람 바이러스성 서열(서열번호 4)은 adyw 아형의 서열이고, 이는 문헌[참조: Pasek et al. (1979) Nature, 282: 575-579]에 공개되었고; 제5 서열(서열번호 5)은 우드척 바이러스 아형의 서열이고, 이는 문헌[참조: Galibert et al. (1982) J. Virol., 41: 51-65]에 공개되었으며; 제6 포유류 서열(서열번호 6)은 땅 다람쥐의 서열이고, 이는 문헌[참조: Seeger et al. (1984) J. Virol., 51: 367-375]에 공개되었다.
도 2는 재조합 HBc 키메라를 제조하기 위해 본원에 사용된 플라스미드 벡터 pKK223-3N을 제조하는데 있어서 시판용 플라스미드 벡터 pKK223-3에 대해 만들어진 변형을 도시한 것이다. 이와 같이 변형된 서열(서열번호 7)은 시판용 벡터의 서열(서열번호 8) 아래에 제시된다. 부가된 NcoI 부위의 염기가 소문자로 제시되고, 부가된 염기는 이중으로 밑줄쳐져 있는 반면, 결실된 염기는 대시(-)로서 제시된다. 이러한 서열 절편에 존재하는 2개의 제한 부위(NcoI 및 HindIII)가 지시된다.
도 3은 ICC-1603 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이고, 여기서, 세로축은 280nm에서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 시간(초)를 나타낸다.
도 4는 도 3에서 논의된 바와 같은 ICC-1590 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다.
도 5는 도 3에서 논의된 바와 같은 ICC-1560 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다.
도 6은 도 3에서 논의된 바와 같은 ICC-1605 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다.
도 7은 도 3에서 논의된 바와 같은 ICC-1604 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다.
도 8은 도 3에서 논의된 바와 같은 ICC-1438 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다.
도 9는 도 3에서 논의된 바와 같은 ICC-1492 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다.
도 10은 입자 제조후 환원 조건하에서의 SDS-PAGE 분석도이고, 여기서, 숙성후 ICC-1438 단량체 작제물(레인 2)은 ICC-1492 작제물(레인 3)과 비교하여 불안정하였고, HBc-149(레인 1), ICC-1475(레인 4) 및 ICC-1473(레인 5)는 추가의 분자량 대조군으로서 작용한다.
PCT/US01/25625호(ICC-102.2)로부터 취한 도 11은 (I) 설포-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산 1-카복실레이트(설포-SMCC)를 사용하여 합텐을 키메라 B형 간염 코어 단백질(sm-HBc) 입자에 펜던트하게 연결하기 위한 활성화 수송체를 형성한 다음, (II) 설프하이드릴-종결화(시스테인-종결화) 합텐을 상기 활성화 수송체에 연결하여 접합체 입자를 형성하는 2가지 반응 순서를 도시한 반응식(반응식 1)을 예시한다. 상기 sm-HBc 입자는 단일 펜던트 아미노 그룹을 갖는 박스(명확하게 도시하기 위함)로서 도시되는 반면, 설프하이드릴-종결화 합텐은 SH 그룹으로 종결된 라인으로 도시된다.
정의
HBc 키메라와 연계해서 사용된 숫자는 아미노산 잔기 서열에 대한 부가물 또는 결실물이 존재하는지의 여부와는 상관없이, 하나 이상의 잔기를 해당 서열에 부가시키거나 이러한 서열로부터 결실시킨 서열번호 1의 HBc ayw 아미노산 잔기 서열 내의 위치를 지시한다. 따라서, HBc149는 키메라가 잔기 149에서 종결된다는 것을 지시해주는 반면, HBc149 + C150은 동일한 키메라가 서열번호 1의 서열번호를 기준으로 하여 HBc 위치 150에서 시스테인 잔기를 함유한다는 것을 지시해준다.
용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합될 수 있는, 면역글로불린으로 불리우는 글리코실화 단백질 계열의 구성원인 분자를 지칭한다.
용어 "항원"은 항체 또는 수용체에 의해 결합되는 실재물(entity)을 명명하 고, 또한 항체 생성을 유도시키는 실재물을 명명하기 위해 역사적으로 사용되어 왔다. 보다 최근의 활용은 항원의 의미를 항체 또는 수용체에 의해 결합된 실재물로 제한하고 있는 반면, 항체 생성을 유도시키거나 수용체와 결합하는 실재물에 대해서는 "면역원"이란 용어가 사용되고 있다. 본원에 논의된 실재물이 면역원성이면서 항원성인 경우에는, 이의 목적하는 활용도에 따라서 면역원 또는 항원으로 지칭된다.
"항원 결정기"는 항체 결합 부위 또는 T 세포 수용체에 의해 면역학적으로 결합되는, 항원의 실제적인 구조 부분을 지칭한다. 상기 용어는 또한, "에피토프"와 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 항원 결정기는 항체 생성 또는 T 세포 활성화를 자극하는 구조물이고, 이러한 구조물의 존재는 항체에 의해 결합되거나 T 세포 활성화를 유도시키는 구조물을 결정함으로써 확인할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접합체"는 아미노산 잔기 측쇄를 통해서와 같이, 수송체 단백질에 작동적으로 연결된 합텐을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 유사한 또다른 잔기로 대체시킨 것을 의미한다. 보존적 치환의 예에는 하나의 소수성 잔기를 또다른 소수성 잔기, 예를 들면, 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌으로 치환하는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 또다른 잔기로 치환하는 것, 예를 들면, 아르기닌과 라이신 간의 치환, 글루탐산과 아스파르트산 간의 치환, 또는 글루타민과 아스파라긴 간의 치환 등이 포함된다.
펩티드 서열과 관련해서 사용된 이의 각종 문법적 형태의 용어 "상응하는"은 기재된 펩티드 서열에, 아미노 말단과 카복시 말단 중의 어느 하나 또는 둘다에 3개 이하의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실되고, 해당 폴리펩티드 서열을 따라 특정한 아미노산 잔기 내에 보존적 치환물 만을 함유하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "도메인"은 문헌[참조: Galibert et al., (1979) Nature, 281:646-650(서열번호 1)]에 보고된 바와 같은 HBcAg 아형 ayw의 위치 번호에 기준한 잔기 위치 넘버링으로써 확인되는 재조합 HBc 키메라 분자의 일정 부분을 의미한다. 적어도 키메라 도메인 I, II 및 III의 폴리펩티드 부분은, 천연 HBcAg의 상응하는 서열과 유사한 3차 형태로 존재하는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 각각의 카복시 말단 아미노산 잔기와 아미노 말단 아미노산 잔기 간의 펩티드 결합에 의해 함께 말단-대-말단(헤드-대-테일)으로 작동적으로 연결되는, 천연에서는 함께 연결된 것이 통상적으로 발견되지 않는 둘 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 융합 단백질은, 아미노산 잔기 서열에서 이러한 융합 단백질의 폴리펩티드 부분에 상응하는 폴리펩티드와 면역반응되는 항체 생성을 유도시키는 HBc 키메라 분자이다.
본원에 사용된 용어 "B형 간염"은 이의 가장 광범위한 맥락에서, 앞서 논의된 바와 같은 포유류 헤파드나비리대 과의 모든 구성원을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용되며, 이는 인접한 아미노산의 알파-아미노 그룹과 카복시 그룹 간의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 선형 시리즈의 아미노산 잔기를 지칭한다. 폴리펩티드는 중성(전하를 띠지 않음) 형태 또는 염 형태의 각종 길이일 수 있다. 아미노산 잔기 서열이 산성 및 염기성 그룹을 함유한다는 사실과, 펩티드에 의해 나타낸 특별한 이온화 상태가, 이러한 펩티드가 용액 중에 존재하는 경우에는 주변 매질의 pH 값, 또는 상기 펩티드가 고체 형태인 경우에는 이를 수득하는 매질의 pH 값에 의존적이란 사실은 당해 분야에 널리 인지되어 있다. 따라서, "폴리펩티드" 또는 이의 등가 명칭은 참조된 적당한 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에서 항상 좌측에서 우측으로, 아미노 말단(N-말단)에서부터 카복시 말단(C-말단)까지의 방향으로 제시된다.
용어 "잔기"는 아미노산 잔기와 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 동정된 모든 아미노산 잔기는 천연 상태 또는 L-배위이다. 표준 폴리펩티드 명명법에 따라서[참조: J. Biol. Chem., 243:3557-59(1969)], 아미노산 잔기에 대한 약어가 다음 표에 제시된 바와 같다:
해당 표
1문자 3문자 아미노산
Y Tyr L-티로신
G Gly 글라이신
F Phe L-페닐알라닌
M Met L-메티오닌
A Ala L-알라닌
S Ser L-세린
I Ile L-이소루신
L Leu L-루신
T Thr L-트레오닌
V Val L-발린
P Pro L-프롤린
K Lys L-라이신
H His L-히스티딘
Q Gln L-글루타민
E Glu L-글루탐산
Z Glx L-글루탐산 또는 L-글루타민
W Trp L-트립토판
R Arg L-아르기닌
D Asp L-아스파르트산
N Asn L-아스파라긴
B Asx L-아스파르트산 또는 L-아스파라긴
C Cys L-시스테인
HBc 키메라와 연계해서 사용된 숫자는 아미노산 잔기 서열에 대한 부가물 또는 결실물이 존재하는지의 여부와는 상관없이, 하나 이상의 잔기를 해당 서열에 부가시키거나 이러한 서열로부터 결실시킨 서열번호 1의 HBc ayw 아미노산 잔기 서열 내의 위치를 지시한다. 따라서, HBc149는 키메라가 잔기 149에서 종결된다는 것을 지시해주는 반면, HBc149 + C150은 동일한 키메라가 서열번호 1의 서열번호를 기준으로 하여 HBc 위치 150에서 시스테인 잔기를 함유한다는 것을 지시해준다.
본 발명에서는 만성 B형 간염 감염을 치료하는 방법이 고려된다. 고려된 방법은 숙주 세포에서 발현후 입자로 자가 어셈블리되는 키메라 재조합 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질; 즉, B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자를 포함하는 백신을 사용한다. 고려된 키메라 분자는, C-말단이 통상적으로 도 1의 ayw 아형에 있어서 잔기 위치 183에 있는 본래 코어 분자를 기준으로 하여 적어도 C-말단에서 절단된다. 고려된 키메라 분자를 함유하는 입자는 C- 및 N-말단의 하나 또는 둘다에 위치하거나 또는 이들 근처에 위치한 시스테인 잔기에 의해 안정화되고, 바람직하게는 하기 논의되는 바와 같이 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다.
고려된 키메라 분자는 HBc의 N-말단 165개 아미노산 잔기중 약 125개 이상, 보다 바람직하게는 약 135개 이상, 내지 모두를 함유하고, 전형적으로 HBV의 B 또는 T 세포 에피토프, 또다른 병원체 또는 소 인히빈과 같은 또다른 단백질인 하나 이상의 아미노산 잔기 서열을 포함할 수 있다. 키메라 분자내에 혼입될 수 있는 비-HBV 단백질로부터의 B 세포 및 T 세포 에피토프의 예는 하기 표 A 및 B에 예시되어 있다. B형 간염 바이러스로부터 분화되고, 바람직하게는 키메라 분자내로 혼입되는 B-세포 에피토프의 예로는 표면 항원 Pre-S2 서열 144-160이 있다. 키메라 분자내에 혼입될 수 있는 비-HBV 단백질로부터의 B 세포 및 T 세포 에피토프의 예는 하기 표 A 및 B에 예시되어 있다. B형 간염 바이러스로부터 분화되고, 바람직하게는 키메라 분자내로 혼입되는 B-세포 에피토프의 예로는 표면 항원 Pre-S2 서열 130-144이 있다.
고려된 만성 간염을 치료하는 방법은 만성 B형 간염 바이러스에 감염된 환자에게 약제학적으로 허용되는 희석제에 용해되거나 분산된 면역원성 입자로 구성된 백신을 항-HBc T 세포를 자극하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 면역원성 입자는 바람직하게는 아쥬반트와 함께 투여된다.
본원에 사용된 바람직한 아쥬반트는 톨(toll)-유사 수용체와 상호작용하는 분자이다. 가장 바람직한 아쥬반트는 지질-A 유사체, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A 및 아미노알킬 글루코사미드 포스페이트이다. 기타 바람직한 아쥬반트로는 사포닌 및 화학적으로 개질된 알킬화 사포닌이 포함된다. 아쥬반트는 미립자 수송체, 예를 들어 수중유 에멀젼 또는 미네랄 염을 추가로 포함할 수 있다.
면역원성 입자는 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자이고, 키메라 단백질 분자의 길이는 아미노산 잔기 약 550개 이하이다. 이들 키메라 단백질 분자(a)는 잔기 위치 4에서부터 약 75까지 및 약 85에서부터 약 140까지의 HBc 서열을 함유하는 HBc 분자의 N-말단 165개 아미노산 잔기 중 약 125개 이하 내지 모든 HBc 서열을 함유한다.
HBc 키메라 분자 서열은 (a') 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프(즉, 잔기 위치 76과 85 사이) 및 C-말단 중의 하나 이상에서 면역원성 에피토프를 함유하는 펩티드-결합된 아미노산 서열, (b') 1 내지 약 40개의 아미노산 잔기 길이를 갖고, 접합된 합텐에 대한 화학-반응성 링커 잔기 또는 화학적 비-반응성 잔기를 포함하는 HBc 면역우성 루프 중의 삽입물, 또는 (c') 위치 76 내지 85의 서열 잔기 0 내지 모두를 임의로 포함한다.
키메라 단백질 분자는 또한, (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘다를 함유한다.
키메라 단백질 분자는 HBc 서열 내에 약 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, 숙주 세포에서 발현시 입자로 자가 어셈블리된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 당해 입자는 실질적으로 핵산과 결합하지 않고, 약 1.2 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내는 반면, 다른 양태에서, 입자는 최소 초과의 핵산 결합이 존재하며, 약 0.9 내지 약 1.15의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타낸다. 따라서, 대체로 고려된 입자의 280nm 대 260nm의 흡광도 비는 약 0.9 내지 약 1.7일 수 있다. 핵산 결합은 하기 논의된다. 입자는 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들) 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 또는 (ii) 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정하다.
백신이 투여된 환자를 HBc에 대한 활성화된 T 세포를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지시킨다. 다른 양태에서, 당해 방법은 혈류내 HBsAg 순환을 갖는 환자에서 수행되고, 환자를 순환하는 HBsAg의 양을 감소시키기에 충분한 시간 기간 동안 유지시킨다. 본 발명의 추가의 양태에서, 환자의 혈청은 HBeAg를 함유하고, 치료에 의해 환자의 혈청내 HBeAg 항원의 양을 감소시킨다. 당해 기술분야 숙련가는 HBc/HbeAg 및 HBsAg에 대한 T 세포 활성화 각각을 분석하기 위한 공지된 방법을 익히 알고 있다.
키메라 단백질은 N-말단, HBc 면역원성(면역우성) 루프 또는 C-말단에서 하나 이상의 면역원성 에피토프를 표시할 수 있거나, 상기 면역원성 루프에서 B 세포 또는 T 세포 에피토프에 대한 링커 잔기 또는 비-반응성(이종) 잔기를 표시할 수 있거나, 또는 위치 76 내지 85의 잔기 0 내지 모두를 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 키메라 단백질이 자가 어셈블리된 입자로의 형성시 안정성 증강을 부여하는 하나 이상의 N-말단 시스테인 잔기(들)를 함유한다.
또다른 양태에서, 상기 키메라 단백질이 자가 어셈블리된 입자로의 형성시 안정성 증강을 부여하는 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기(들)를 함유한다. 또한, 고려된 키메라 단백질 분자는 N-말단과 C-말단 둘다에 또는 이들 근처에 시스테인 잔기를 함유할 수도 있는데, 즉 키메라 단백질 분자는 상기 정의된 바와 같이, N-말단 시스테인 잔기와 C-말단 시스테인 잔기 둘다를 함유할 수 있다.
몇몇 바람직한 양태에서, 고려된 키메라 단백질은 HBc 잔기 위치 149(로부터 카복시-말단을 향해)의 하단부에 아르기닌 및/또는 라이신 잔기를 충분히 함유하지 않기 때문에, 자가 어셈블리된 입자는 실질적으로 핵산 결합을 포함하지 않는다. 다른 양태에서는, 아르기닌-풍부 반복 서열 중의 2개를 포함하는, 위치 149에서부터 위치 약 163까지의 HBc 서열이 존재한다(도 1 참조). 또란, 다른 양태에서는, 1개의 아르기닌-풍부 서열을 함유하는, 위치 약 156까지의 HBc 서열이 존재한다. 기타 양태에서는, C-말단 HBc 서열이 HBc 위치 140과 149 사이에서 종결되고, 키메라 분자는 위치 150에서부터 C-말단까지의 도 1의 본래 HBc 서열 내에 존재하는 아르기닌 반복 서열을 함유하지 않거나, 또는 아르기닌 잔기들 중의 하나 이상 대신 라이신 잔기를 함유하는 유사한 서열을 함유하지 않는다. 핵산 결합이 실질적으로 존재하지 않는다는 것은 다음에 논의되고, 이는 용이하게 결정된다.
검토의 용이성을 위해, 본원에 지칭된, 고려된 키메라 서열 및 서열 위치 번호는 서열번호 1에 제시된 아형 ayw의 사람 B형 간염 코어 단백질의 서열 및 위치 넘버링에 기준한 것이다[참조: Galibert et al. (1979) Nature, 281:646-650]. 그러나, 당해 기술분야 숙련가들에게 널리 공지되어 있는, 포유류 헤파드나바이러스 캡시드 단백질 서열들 간의 상당한 유사성과, 이러한 단백질에 의해 나타난 유사한 입자 형성 측면에서 보면, 사람 HBc 아형 ayw에 관한 논의 역시 아형 adw에도 적용할 수 있을 뿐만 아니라 우드척 및 땅 다람쥐 단백질에게도 적용 가능하는 것을 인지해야 한다. 이러한 상당한 유사성으로 인해, HBc 서열은 달리 언급되지 않는 한, 일반적으로 본원에서 "HBc" 서열로서 언급된다.
또다른 양태에서, 고려된 HBc 키메라는 약 550개 이하 잔기 길이를 갖고, 이는,
(a) 잔기 위치 5 내지 약 75 및 약 85 내지 약 140의 HBc 서열을 포함하는, HBc 분자의 N-말단 165개 아미노산 잔기의 약 125개 이상 내지 모두의 HBc 서열, (a') 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 또는 C-말단 중의 하나 이상에서 펩티드-결합된 면역원성 에피토프, (b') 1 내지 약 40개의 아미노산 잔기 길이를 갖고 접합된 합텐에 대한 화학-반응성 링커 잔기 또는 화학적 비-반응성 잔기를 함유하는 HBc 면역우성 루프 중의 삽입물, 또는 (c') 위치 76 내지 85의 서열 잔기 0 내지 모두를 포함한다.
키메라 단백질 분자는 또한, (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘다를 함유한다.
키메라 단백질 분자는 HBc 서열 내에 약 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, 숙주 세포에서 발현시 입자로 자가 어셈블리된다. 당해 입자는 (i) 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들) 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 또는 (ii) 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정하다. 이미 주지된 바와 같이, 당해 입자는 몇몇 양태에서 실질적으로 핵산과 결합하지 않고, 다른 양태에서는 비-최소량으로 핵산과 결합한다.
환자는 HBc에 대한 T 세포 활성화를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지된다. 다른 양태에서, 환자를 우선 항바이러스 약제, 예를 들어 라미부딘으로 바이러스 존재량이 감소하기에 충분한 시간 동안 치료한 후, 임의로 아쥬반트와 함께 허용되는 부형제 중에 투여된 고려된 키메라 분자를 하나 이상 투여한다. 추가의 양태에서, 당해 방법은 혈류내 HBsAg 순환을 갖는 환자에서 수행되고, 환자를 순환하는 HBsAg의 양을 감소시키기에 충분한 시간 기간 동안 유지시킨다. 본 발명의 추가의 양태에서, 환자의 혈청은 HBeAg를 함유하고, 치료에 의해 환자의 혈청내 HBeAg 항원의 양을 감소시킨다.
고려된 키메라 분자는 (i) 도 1 및 서열번호 1에 예시되어 있는 HBc의 N-말단을 기준으로 하여 약 -20 내지 약 +1의 위치한 시스테인 잔기, 또는 (ii) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향하여 위치한 시스테인 잔기를 하나 또는 둘다 함유한다. 음성 아미노산 위치의 개념은 리더 서열, 예를 들면, HBc의 프리코어 서열과 통상 연관이 있다. 이러한 개념은 HBc의 위치 +1의 출발 메티오닌 잔기에 상응하는 키메라의 위치를 결정하기 위해, 서열번호 1의 서열과 소정의 키메라 분자 서열을 간단히 정렬할 수 있다는 점에서 본원에서 유사하게 사용된다.
아미노산 잔기 서열은 통상적으로 좌측에서 우측으로, N-말단에서부터 C-말단까지의 방향으로 제시되기 때문에, HBc 출발 메티오닌에 의해 점유될 수 있는 위치의 좌측으로 정렬된 임의의 키메라 분자 잔기도 음성 위치를 갖는다. 고려된 시스테인 잔기는 출발 메티오닌에 상응하는 위치에 대해 정렬된 HBc의 출발 메티오닌의 좌측까지 약 20개 잔기 위치에 존재할 수 있다.
하나의 양태에서, 바람직한 HBc 키메라는 약 135 내지 약 525개 L-α-아미노산 잔기 서열을 가지며, 4가지 일련의 펩티드 연결된 도메인, 즉 도메인 I, II, III 및 IV를 함유한다. 이들은 본래의 단백질과 동일한 방식으로 함께 연결되는데; 즉 이들 4가지 도메인은 α-아미노산 이외의 잔기를 함유하므로 펩티드 결합을 형성할 수 없는 폴리펩티드, D-아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드, 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 아미노산 잔기 측쇄를 통하여 작동적으로 연결되는 올리고펩티드 접합체와 비교해서, 서로 펩티드 결합된다. 따라서, 고려된 키메라 HBc 단백질은, 통상적인 재조합 기술 방법을 사용하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 키메라 분자의 도메인 I은 약 71 내지 약 110개 아미노산 잔기를 포함하고, 이의 서열에는 (i) 적어도 HBc의 위치 5 내지 위치 약 75의 잔기 서열, (ii) HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1, 바람직하게는 아미노산 위치 -14 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 존재하는 0 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) 면역원성 에피토프를 포함하는 HBc 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드 결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 임의 서열이 포함된다. 이러한 면역원성 서열은 존재하는 경우에, 전형적으로 항-B형 간염 면역 반응을 유도시키는데 사용되는 에피토프이다.
상기 키메라 분자의 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드 결합된 약 255개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 (i) HBc 위치 76에서 85까지의 서열 중의 0 내지 모든 잔기가, (ii) 면역원성 에피토프를 구성하는 임의로 존재하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기 서열과 펩티드 결합되어 존재하거나, (iii) 접합된 합텐에 대한 화학-반응성 링커 잔기 또는 화학적 비-반응성 잔기를 함유하는 1 내지 약 40개 아미노산 잔기 길이를 갖는 HBc 면역우성 루프 중의 삽입물과 펩티드 결합되어 존재한다. 위치 76 내지 85의 10개 잔기의 서열(위치 76 내지 85 서열)이 존재하지만, 에피토프- 또는 링커-함유 서열의 1 내지 약 245개 잔기에 의해 차단된 것이 보다 바람직하다.
도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 약 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이다.
키메라 분자 도메인 IV는, (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기, (ii) 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 0 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc에 존재하지 서열 이외의 면역원성 서열 중의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 도메인 IV는 상기 HBc 위치들이 부재하는 서열 중의 0 내지 약 50개 아미노산 잔기 서열, 보다 바람직하게는 0 내지 약 25개 잔기 서열을 함유한다. 도메인 IV는 또한 바람직하게는, 하나의 C-말단 시스테인 잔기를 함유한다.
키메라 분자는, (i) 아미노산 잔기의 약 10% 이하가 해당 키메라의 HBc 서열에서 치환되는 아미노산 잔기 서열을 갖고, (ii) 숙주 세포에서 발현시 입자로 자가 어셈블리된다. 당해 입자는 실질적으로 핵산과 결합하지 않으며, 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성되고, (i) N-말단 시스테인 잔기(들)이 결여되었거나, (ii) 고려된 키메라 분자내 존재하는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정적이다.
하나의 양태에서, 고려된 키메라 분자는 HBc 잔기 2-5 중의 하나와 펩티드 결합된 N-말단에서 에피토프를 포함하는 서열을 함유한다. 또다른 양태에서, 고려된 키메라 분자는 면역우성 루프 내의 HBc 잔기 76과 85 사이에 위치한 분자 중앙 근처에 펩티드 결합된 링커 잔기-함유 서열, 에피토프-함유 서열을 함유한다. 추가의 양태에서, 에피토프-함유 서열이 HBc 잔기 136-149 중의 하나와 펩티드 결합된 키메라 분자의 C-말단 부분에 위치한다. 또한, 다른 양태에서, 2개 또는 3개의 에피토프-함유 서열이 상기 위치에 존재하거나, 또는 1개 또는 2개의 에피토프-함유 서열이 에피토프에 대한 링커 잔기와 함께 존재한다. 이들 키메라 분자 각각은 또한, 상기 논의된 바와 같이 N-말단 또는 C-말단 시스테인 잔기(들) 중의 하나 또는 둘다를 함유한다. 이들 키메라 분자 및 이들의 자가 어셈블리된 입자의 몇 가지 구체적인 예는 하기 논의된다.
이미 언급된 바와 같이, 본 양태의 고려된 HBc 키메라 분자는 약 135 내지 약 525개 아미노산 잔기를 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서, HBc 잔기 4가 존재하는 반면, 잔기 2-5는 기타 바람직한 양태에 존재하기 때문에, 도메인 I은 HBc 잔기 4 또는 2에서 시작하여 잔기 75까지 지속될 수 있는데, 즉 HBc 위치 75에서의 HBc 잔기까지 지속된다. 잔기 1은 DNA 출발 코돈의 아미노산인 메티오닌이다. HBc의 위치 1에 통상적으로 존재하는 본래의 메티오닌이 부재하여, 단지 1개의 출발 시그널 만이 암호화 DNA 또는 RNA에 존재하도록 하는 것이 바람직하다.
도메인 II의 면역우성 루프 내에 또는 도메인 I 내에 존재할 수 있는 이종 면역원성 에피토프는 바람직하게는, 약 15 내지 약 50개 잔기를 함유하지만, 약 6개 아미노산 잔기 정도로 짧은 에피토프가 유도될 수 있고, 항원 및 T 세포 수용체에 의해 인식될 수 있으므로 유용하다.
본 발명의 또다른 양태에서, 하나 이상의 화학적 비-반응성(이종) 아미노산 잔기는 도메인 II에 삽입되어 B-에피토프로서 작용하지는 않지만 B형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈액내 항체 순환에 의한 키메라 입자의 인식을 감소시킨다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 키메라 분자는 잔기 위치 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 또는 82에서, 및 가장 바람직하게는 잔기 위치 77에서 단일 아미노산 삽입물을 함유한다. 이러한 삽입된 화학적 비-반응성 잔기는 알라닌, 루신 또는 이소루신일 수 있고, 가장 바람직하게는 알라닌 잔기이다. 입자에게 본래 HBc 입자보다 항원성을 덜 부여하는 것, 즉, HBV 감염으로부터 야기된 항-HBc 항체에 의해 보다 덜 인지되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 당해 기술분야 숙련가는 도메인 II내로 삽입된 임의의 수의 아미노산 잔기 및 서열을 사용하여 항원성을 감소시킬 수 있다.
하나 이상의 기타 잔기에 의해 개입 차단되긴 하지만, 위치 76에서부터 위치 85까지의 도메인 II의 HBc 잔기 모두가 존재하는 것이 바람직하다. 도메인 II는 발현 또는 사용을 방해하지 않는 어떠한 서열도 가질 수 있지만, 바람직하게는 위치 75 내지 85 잔기 사이 서열의 일부인 4개 이상의 서열을 함유해야만 한다.
도메인 III은 잔기 85와 펩티드 결합된 HBc 잔기 86 내지 135를 함유한다.
도메인 IV는 (i) 잔기 135와 펩티드-결합된 HBc 위치 136에서부터 140까지, 및 바람직하게는 잔기 149까지의 잔기 서열과, (ii) 0 내지 3개의 시스테인 잔기로 구성된 5개 이상의 잔기 서열을 함유하지만, (iii) 특히 HBc 서열이 잔기 140에서 종결되는 경우에는, 약 100개 이하 잔기의 면역원성 에피토프 서열을 임의로 함유할 수 있지만, 약 25개 이하 정도로 더 짧은 서열이 보다 바람직하다. 상기 도메인 IV 면역원성 서열은 바람직하게는 HBc 서열과는 이종이고, 위치 약 163에서부터 HBc C-말단까지의 HBc 서열 이외이다. 도메인 IV에 존재하는 경우의 면역원성 서열은 바람직하게는 T 세포 에피토프이지만, 도메인 I 및 II 중의 어느 하나 또는 다른 하나에 통상적으로 존재하는 바와 같은 B 세포 에피토프일 수도 있다. HBc 서열 및 B형 간염 표면 단백질(HBs 또는 HBsAg)의 preS1 및 preS2 영역으로부터의 T 세포 에피토프의 예가 다음 표 A 및 B에 제공되어 있다.
도메인 IV는 또한, 0 내지 3개의 시스테인 잔기를 함유할 수 있고, 이러한 Cys 잔기는 키메라 분자의 카복시-말단(C-말단)의 약 30개 잔기 내에 존재한다. 바람직하게는, 1개의 시스테인(Cys) 잔기가 존재하고, 이러한 Cys는, T 세포 에피토프가 도메인 IV의 일부로서 존재하지 않는 한 카복시-말단(C-말단) 잔기로서 존재하는 것이 바람직하다. 이러한 T 세포 에피토프가 존재하는 경우, 상기 바람직한 Cys가 HBc 키메라의 C-말단 마지막 5개 잔기 내에 존재하는 것이 바람직하다.
하나의 양태에서, 특히 바람직한 키메라는 2개의 면역원성 에피토프를 함유한다. 이들 2개의 면역원성 에피토프는 도메인 I과 II, 또는 II와 IV, 또는 I와 IV에 존재한다. 이러한 2개의 면역원성 에피토프 중의 하나가 몇몇 양태에서는 바람직한 B 세포 에피토프이다. 기타 양태에서, 상기 2개의 면역원성 에피토프 중의 하나가 T 세포 에피토프이다. 보다 바람직하게는, 2개의 면역원성 에피토프 둘다가 동일하거나 상이한 T 세포 에피토프이다. 또한, 다수의 T 세포 에피토프가 T 세포 에피토프 위치에 존재할 수 있는 바와 같이, 다수의 B 세포 에피토프가 B 세포 에피토프 위치에 존재할 수 있다.
키메라 분자가 도메인 II 중에 면역원성 에피토프를 함유하는 양태에서, 상기 서열이 하나 이상의 B 세포 에피토프를 함유하고, 아미노산 잔기 76 내지 85 사이의 HBc 서열이 존재하지만, 면역원성 에피토프(들)에 의해 개입 차단되며, 키메라가 HBc 잔기 140-165 중의 하나와 펩티드 결합된 도메인 IV 중의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
이와 동일한 선호도는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 도메인 II에 존재함으로써 도메인 II에 하나 이상의 면역원성 에피토프를 제공해주는데, 잔기 76 내지 85가 존재하지만, 상기 이종 링커 잔기에 의해 개입 차단되고, HBc 잔기 140-165 중의 하나와 펩티드 결합된 T 세포 에피토프가 존재하는 키메라 분자에 대해서도 유지된다. 이러한 키메라 분자로부터 형성된 입자는 전형적으로 접합된 에피토프 대 C-말단 펩티드 결합된 T 세포 에피토프의 비율 약 1:4 내지 1:1를 함유하는데, 약 1:2의 비율이 통상적이다.
상기 기재된 키메라 분자의 예시적 구조에서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 도메인 II에 존재하고 T 세포 에피토프가 도메인 IV에 존재하는데, 부가의 B 세포 에피토프는 도메인 II에 전혀 존재하지 않는다. 이러한 키메라는 하기 논의되는 바와 같은 ELISA 검정에서 항-루프 모노클로날 항체의 결합에 의해 측정된 바와 같이 최소한의 HBc 항원성을 나타내면서, T 세포 에피토프의 면역원성을 나타낸다.
고려된 바람직한 HBc 키메라 분자는 약 135 내지 약 525개 잔기 서열을 함유한다. 각각 약 15 내지 약 50개 잔기의 바람직한 길이를 갖는 1개 또는 2개의 면역원성 에피토프를 함유하고, 약 140 내지 약 165개 잔기의 바람직한 HBc 부분 길이를 함유할 수 있는 바람직한 HBc 키메라 분자는 약 170 내지 약 250개 아미노산 잔기 서열 길이를 갖는다. 1개 또는 2개의 면역원성 에피토프를 함유하는 특히 바람직한 키메라 분자는 약 190 내지 약 210개 잔기 길이를 갖는다. 부가된 면역원성 에피토프를 함유하지 않는 특히 바람직한 키메라 분자는 약 140 내지 약 165개 잔기 길이를 가질 수 있다. N-말단 및 C-말단 HBc 위치 길이가 다양하고, 면역원성 루프 내에 삽입될 수 있는 몇 가지 고려된 에피토프의 길이가 상이하다는 측면에서 보면 광범위한 키메라 분자 길이가 고려된다는 것을 이해해야 한다.
숙주 세포에서 발현 후, 고려된 재조합 단백질은 자가 어셈블리하여 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자를 형성한다. 고려된 HBc 키메라 입자는 일반적으로 구형이고, 소정의 제제에 대해 크기 면에서 통상 균질하다. 따라서, 이들 키메라 입자는 유사한 외형과 크기를 갖는 본래의 HBc 입자를 닮았으므로, 감염된 환자로부터 회수할 수 있다.
고려된 키메라 입자는 상기 논의된 키메라 분자를 포함한다. 보다 광범위하게 언급하면, 상기 키메라 입자는 N-말단 165개 잔기 중의 약 125개 이상의 서열을 갖는 키메라 C-말단 절단된 HBc 단백질을 포함하고, (i) N-말단, C-말단 또는 면역우성 루프 내의 하나 이상과 펩티드 결합된 면역원성 에피토프, 또는 면역우성 루프 중의 에피토프에 대한 이종 비-반응성 잔기 또는 링커 잔기, 및 (ii) 상기 기재된 바와 같이 N-말단 및 C-말단 중의 하나 또는 둘다에서의 1 내지 3개의 시스테인 잔기, 및 위치 135로부터의 5개 이상의 HBc 잔기 서열을 함유한다.
고려된 입자는 도메인 IV 중에 아르기닌 및/또는 라이신 잔기를 충분히 함유하지 않기 때문에, 자가 어셈블리된 입자는 실질적으로 핵산 결합을 포함하지 않고, 다음에 논의되는 바와 같이 약 1.2 내지 약 1.7의 280:260 흡광도 비를 나타낸다. 따라서, 고려된 키메라 단백질은 위치 155와 183 사이의 HBc 서열을 함유하지 않고, 보다 바람직하게는 위치 155와 183 사이의 HBc 서열을 함유하지 않는다.
상기 논의된 N-말단 시스테인 잔기(들)가 존재하는 것이, 안정한 면역원성 입자를 형성할 수 있는 키메라 분자의 능력을 기대이상으로 증강시켜 준다(하기 논의됨). 따라서, 고려된 HBc 키메라 입자 면역원은 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이 수집 및 초기 정제시 함께 체류하는 입자를 형성하는 경향이 있고, 이에 대한 상세한 기재는 다음에 논의된다.
고려된 입자는 (i) C-말단 시스테인 잔기(들)이 결여되었거나, (ii) 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체되고 또한 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자보다 안정하다. 몇몇 예에서, 입자들은 N-말단이 존재하지 않는 경우 형성되지 않는다. 두가지 유형 모두의 서열에 대한 증강된 안정성의 예는 하기 실시예에 예시되어 있다.
고려된 N-말단 시스테인 잔기를 함유하는 입자는 또한 전형적으로 N-말단 시스테인이 결실된 키메라 분자로부터 어셈블리된 입자보다 우수한 수율로 제조된다. 수율에서의 이러한 증가는 수득된 입자 질량 또는 하기 논의되는 바와 같이 Superose
Figure 112005045808790-PCT00004
6 HR을 사용한 분석적 겔 여과로부터 관찰될 수 있다.
고려된 입자에 의해 나타난 핵산 결합의 실질적 부재는 280 및 260nm 둘다에서 측정된 수용액 중에서의 해당 입자의 흡광도, 즉 280:260 흡광도 비를 비교함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 고려된 입자는 단백질을 발현하기 위해 사용된 유기체의 세포 내에 본래 존재하는 올리고머성 및/또는 중합체성 DNA 및 RNA 종인 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 핵산은 260nm에서 흡광도를 나타내고, 280nm에서는 비교적 덜한 흡광도를 나타내는 반면, 고려된 키메라와 같은 단백질은 260nm에서는 비교적 덜한 흡광도를 나타내고 280nm에서는 보다 큰 흡광도를 나타낸다.
따라서, 당해 분야에서 프로타민 영역으로서 종종 지칭되는 잔기 위치 150-183(또는 150-185)에서 아르기닌- 및 라이신-풍부 서열을 함유하는 재조합으로 발현된 HBc 입자 또는 키메라 HBc 입자는 260nm에서의 흡광도에 대한 280nm에서의 흡광도 비(280:260 흡광도 비)가 약 0.8을 나타낸다. 반면, 자가 어셈블리된 입자가 실질적으로 핵산 결합을 함유하지 않도록 도메인 IV 중에 아르기닌 및 라이신 잔기를 충분히 함유하지 않는 입자, 예를 들면, 약 10개 미만, 바람직하게는 약 6개 미만 및 보다 바람직하게는 약 3개 미만의 아르기닌 또는 라이신 잔기, 또는 서로 인접한 이의 혼합물을 함유하는 입자와 같이 천연 HBc의 아르기닌-풍부 핵산 결합 영역을 함유하지 않는 입자. 약 HBc 잔기 위치 165, 바람직하게는 약 155 및 보다 바람직하게는 약 위치 140 내지 위치 149에서 종결되는 본래 또는 키메라 서열을 갖는 예시적 단백질은 280:260 흡광도 비가 약 0.9 내지 약 1.7을 나타낸다. 보다 전형적인 280:260 흡광도 비는, 위치 약 165에서 종결된 서열에 있어서는 약 0.9 내지 약 1.0이고, 위치 약 155에서 종결된 서열에 있어서는 약 1.1 내지 약 1.2이며, 위치 약 140 내지 약 149에서 종결되는 서열에 있어서는 약 1.4 내지 약 1.7이다. 이러한 범위는 소정의 키메라 HBc 입자의 도메인 II 및 IV에 존재하는 방향족 아미노산 잔기의 수에 상당 부분 기인된 것이다.
고려된 바람직한 키메라 HBc 단백질의 도메인 I은 적어도 아미노산 잔기 위치 4에서부터 위치 75까지의 HBc의 아미노산 잔기 서열로 구성되고, 도메인 III은 위치 86에서부터 위치 137까지의 HBc 서열로 구성된다. 임의의 포유류 헤파드나바이러스로부터의 서열은 도메인 I 및 III 중의 어느 하나에 대해 사용할 수 있으며, 둘 이상의 바이러스로부터의 서열을 하나의 키메라에 사용할 수 있다. 작제를 용이하게 하기 위해서는, 바람직하게는 사람 ayw 서열을 키메라 전반에 걸쳐 사용한다.
제1의 3개의 아미노-말단(N-말단) 잔기의 결실 보다 더 많은 것을 함유하는 도메인 I을 갖는 HBc 키메라는 이. 콜라이 세포에서 HBc 키메라 단백질의 완전한 소멸을 초래하는 것으로 보고되어 있다[참조: Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]. 한편, 인플루엔자 M2 단백질로부터의 면역원성 23량체 폴리펩티드를 HBc N-말단 서열에 융합시킨 최근의 연구 결과는, 이로써 생성된 융합 단백질이, 본래의 HBc 서열의 잔기 1-4를 대체시킨 경우에 입자를 형성하였다고 보고되었다[참조: Neirynck et al. (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]. 따라서, 상기 분야는, 부가된 아미노산 서열이 HBc의 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드-결합되는 경우에 입자가 형성될 수 있는 반면, 부가의 서열이 전혀 존재하지 않고 잔기 1-3 보다 더 많은 것이 HBc의 N-말단으로부터 결실되는 경우에는 입자가 형성되지 않는다고 교시하고 있다.
HBc의 제1의 5개 N-말단 잔기 중의 하나와 펩티드-결합된 N-말단 에피토프 서열은 면역원성 서열을 포함하는 약 30개 이하의 잔기 서열 또는 단일 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 1 내지 3개의 시스테인 잔기가 상기 서열 중의 편리한 위치에 존재할 수 있지만, 전형적으로는 부가된 서열의 C-말단 근처에 존재하므로, 부가된 N-말단 시스테인 잔기(들)는 서열번호 1에 제시된 바와 같이 HBc N-말단을 기준으로 하여 약 -20 내지 약 +1의 위치, 보다 바람직하게는 약 -14 내지 약 +1의 위치에 존재한다. 이러한 서열의 예에는 하기 논의되고 예시되는 바와 같은(각각 표 A 및 B) B 세포 또는 T 세포 에피토프; 2개의 시스테인 잔기와, 약 6개 이상의 잔기를 함유하는 상기 서열의 변이체를 포함하는, 상기 Neirynck 등의 인플루엔자 M2 단백질로부터의 23량체 폴리펩티드; 및 사용된 발현 시스템의 결과로서 융합 단백질에서 생성될 수 있는 바와 같은 β-갈락토시다제 등의 또다른(이종) 단백질의 서열; 또는 또다른 B형 간염-관련 서열, 예를 들면, PreS1 또는 PreS2 영역으로부터의 서열 또는 주요 HbsAg 면역원성 서열이 포함된다.
도메인 II는 약 5개 내지 약 250개 아미노산 잔기 서열이다. 이들 잔기 중에서, 0개(없음), 바람직하게는 4개 이상의 잔기, 및 보다 바람직하게는 8개 이상의 잔기가 위치 약 76에서부터 85까지의 HBc 서열 부분으로 구성되고, 1 내지 약 245개 잔기 및 바람직하게는 1 내지 약 50개 잔기가 HBc에 대해 이종(외래)이거나, 또는 면역원성 HBc 서열, 예를 들어 B 또는 T 세포 에피토프에 상응한다.
따라서, 적어도 HBc 잔기 75 및 85는 각각 도메인 I 및 II에 존재한다. 이들 잔기는, (i) B 세포 또는 T 세포 에피토프와 같은 에피토프에 대한 이종 링커 잔기, 또는 (ii) 바람직하게는 6 내지 약 50개, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 50개, 및 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 30개 아미노산 잔기를 함유하는 면역원성 B 또는 T 세포 에피토프로 구성되고, 이들은, 이들이 HBc 서열의 위치 76에서부터 86까지의 잔기들 중의 0개, 또는 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 8개 이상, 또는 이들 잔기 전부와 펩티드 결합되도록 위치된다. 면역원성 B 세포 에피토프는, 바람직하게는 HBc 서열 내로 펩티드 결합되거나, 또는 링커 잔기에 의해 상기 위치에서 결합되며, B 세포 에피토프의 사용은 다음에 예시적으로 논의된다.
상기 바람직한 4개 이상의 HBc 잔기는 하나의 서열, 예를 들면, 잔기 82-85에 전부 존재할 수 있거나, 또는 이종 링커 잔기(들)의 (플랭크) 중의 어느 한 면 상에서 분할될 수 있어, 잔기 76-77과 84-85가 존재하거나 잔기 76과 83-85가 존재한다. 더욱 바람직하게는, 도메인 II는 잔기 76에서부터 85까지의 HBc 서열 중의 8개 이상의 잔기를 함유한다. 가장 바람직하게는, 위치 76에서부터 85까지의 모든 10개 잔기 서열이 당해 키메라에 존재한다.
HBc 루프 서열에 부가된 1 내지 약 245개 잔기는 HBc 서열에 대해 이종일 수 있거나, 또는 HBc 서열의 하나 이상의 면역원성 부분에 상응할 수 있다. 부가된 단일 이종 잔기는 상기 논의된 바와 같이, B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기이다. 보다 긴 서열, 전형적으로는 전술된 바와 같은 6개 이상 아미노산 잔기 길이 내지 약 50개 아미노산 잔기 길이, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 50개의 잔기 길이가, 제한 부위에 의해 암호화된 이종 잔기를 제외하고는 B 세포 또는 T 세포 에피토프와 같은 면역원을 포함하는 서열 내에 존재한다.
키메라의 N-말단, 면역원성 루프 내에 또는 C-말단 중의 하나 이상에서 HBc 키메라 내에서의 발현에 유용하고, 고려된 키메라의 발현 후 링커 잔기에 대한 양 연결에도 유용한 펩티드 B 세포 에피토프의 예가, 해당 서열을 생성시킨 유전자에 대해 제공된 통상 명칭, 공개된 에피토프에 대한 인용 참조문헌 또는 특허, 및 서열번호와 함께, 다음 표 A에 제시되어 있다:
Figure 112005045808790-PCT00005
Figure 112005045808790-PCT00006
Figure 112005045808790-PCT00007
Figure 112005045808790-PCT00009
Figure 112005045808790-PCT00010
Figure 112005045808790-PCT00011
서열번호 32의 상기 인플루엔자 A M2 서열에서,
잔기 X1 내지 X8은 부재 또는 존재하고, 존재하는 경우, 각각 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는, 메티오닌, 세린, 루신, 루신, 트레오닌, 글루탐산, 발린 및 글루탐산 잔기이고, 단 하나의 아래첨자 X 잔기가 존재하는 경우, 8까지 중에서 보다 높은 숫자의 아래첨자를 갖는 임의의 잔여 아래첨자 X가 또한 존재하며;
잔기 X15 및 X16은 존재 또는 부재하고, 존재하는 경우, 각각 트립토판 및 글라이신이고;
잔기 X17 및 X19는 존재 또는 부재하고, 존재하는 경우, 독립적으로 시스테인, 세린 또는 알라닌이며;
잔기 X18은 존재 또는 부재하고, 존재하는 경우, 이는 아르기닌이고;
잔기 X20 내지 X24는 존재 또는 부재하고, 존재하는 경우, 각각 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는, 아스파라긴, 아스파르트산, 세린, 세린 및 아스파르트산 잔기이고, 단 하나의 아래첨자 X 잔기가 존재하는 경우에는, 15 아래 중에서 보다 낮은 숫자의 아래첨자를 갖는 임의의 잔여 아래첨자 X가 또한 존재한다.
이종 잔기 또는 서열 중의 어느 한 면 상에 존재하는 도메인 II의 잔여 잔기는 HBc 위치 76 내지 위치 85의 잔기이다. 따라서, 전형적인 예에서 잔기 78 내지 82를 대체시킨 경우, 도메인 II 중의 키메라 서열이 76 내지 77이고, 이어서 제한 부위-암호화된 잔기, 면역원성(에피토프) 서열, 추가의 제한 부위-암호화된 잔기, 및 이어서 HBc 서열 84 내지 85가 위치한다. 잔기 78과 79 사이의 삽입 전략에 의해 제조된 키메라의 전형적인 예시 서열은 위치 2부터 78까지의 HBc 서열에 이어, 제한 부위-암호화된 잔기, 면역원성 서열, 추가의 제한 부위-암호화된 잔기, 및 HBc 서열 79 내지 85이다. 도메인 I 및 II를 통하여 고려된 기타 키메라 서열은 이들 예시와 후술되는 예시로부터 명백할 것이며, 일일이 열거할 필요는 없다.
상기 인지된 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) B 세포 에피토프 서열의 C-말단에서 펩티드 결합된 약 5 내지 약 9개 잔기 길이를 갖고 다수의 글라이신 잔기를 함유하는 짧은 친수성 펩티드가 상기 서열을 함유하는 키메라 입자의 발현을 촉진시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 서열번호 144의 서열 GSGDEGG를 갖는 하나의 유용한 짧은 펩티드가 문헌[참조: Karpenko et al., Amino Acids (2000) 18: 329-337]에 기재되어 있다.
앞서 인지된 바와 같이, 접합된 에피토프에 대한 링커 또는 이종 화학적 비-반응성 잔기는 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열 내의 특정 위치에서 펩티드-결합될 수 있다. 면역원성 에피토프에 대한 경우와 같이, 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 바람직하게 존재하지만, 부가된 잔기 또는 잔기들에 의해 차단된다. 이러한 키메라는 바람직하게는, 위치 4에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc 서열과, 해당 키메라 단백질의 N-말단 또는 C-말단 근처에서의 시스테인 잔기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 위치 1에서부터 149까지의 HBc 서열이 존재하지만, 이는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커에 의해 잔기 76 내지 85가 차단되고, 키메라 분자는 C-말단 시스테인을 함유한다.
화학적 비-반응성 잔기는 상기 논의되었다. 접합된 에피토프에 대한 이종 링커는 가장 바람직하게는 라이신(K) 잔기이다. 티로신 및 시스테인 잔기가 링커로서 사용될 수 있는 바와 같이, 글루탐산 또는 아스파르트산, 티로신 및 시스테인 잔기도 링커 잔기로서 사용될 수 있다. 하나 이상의 링커, 예를 들면, 3개의 라이신 서열이 존재할 수 있지만, 이러한 용도는 바람직하지 못한데, 이는 이러한 용도로부터, 접합된 합텐이 제1 키메라 중의 하나의 링커 및 제2 키메라 분자 중의 상이한 링커에 결합되는 이종 접합체가 형성될 수 있기 때문이라는 사실에 주목해야 한다. 미국 특허 제6,231,864 B1호에는 하나 이상의 연결성 잔기를 함유하지만, 안정화시키는 N-말단 시스테인 잔기가 결여된 HBc 키메라 분자가 기재되어 있다.
고려된 HBc 키메라에 존재하는 삽입된 화학적 비-반응성 잔기, 링커 잔기 또는 면역원성 에피토프 함유 서열이, 면역원성(에피토프) 서열을 (플랭킹시키는) 한 측면 또는 양 측면 상의 "가요성 링커 암"에 의해 HBc 서열 잔기로부터 분리될 수도 있다는 것에 또한 주목해야 한다. 이는 특히, 면역원성 서열이 약 30개 아미노산 잔기 길이 보다 큰 경우에 해당된다. 예시되는 가요성 링커 암 서열은 전형적으로, 약 4 내지 약 10개 글라이신 잔기를 함유하는데, 이는 삽입된 서열이 그 밖의 벌징(bulging) 루프 서열로부터 외향적으로 "벌지"되도록 해주고 해당 작제물에 추가의 안정성을 부가해주는 것으로 사료된다. 이들 가요성 링커 암은 나이세리아 메닝기티디스 B 세포 에피토프 서열과 관련하여 앞서 논의된 것, 예를 들면, 서열번호 125의 펩티드와 유사하다. 예시되는 기타 가요성 링커 암 서열이 문헌[참조: Kratz et al. (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96: 1915-1920]에 기재되어 있고, 이는 다음 아미노산 잔기 서열로써 예시된다:
GGGGSGGGGT (서열번호: 155)
GGGGSGGGG (서열번호: 156).
바로 아래의 서열은 삽입된 에피토프-함유 서열의 C-말단에서 활용되는 반면, 그 다음의 서열은 삽입된 면역원성 서열의 N- 및 C-말단 각각에서 사용된다:
GSGDEGG (서열번호: 154)
GGGGSGGG (서열번호: 157).
앞서 인지된 바와 같이, 도메인 III은 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열로 구성된다. 결과적으로, 도메인 I 및 II에 대해 상기 논의된 예시적인 키메라의 서열은 연장될 수 있는데, 이로써 첫번째 논의된 키메라가 위치 84에서부터 위치 140까지의 HBc 서열을 갖고, 두번째 논의된 키메라가 위치 79에서부터 위치 140까지의 HBc 서열을 갖는다.
도메인 IV는 (i) 위치 136에서부터 위치 140까지의 HBc 서열을 포함하고, 임의로는 위치 149까지의 HBc 서열을 포함하고, (ii) 0개 내지 3개 이하의 시스테인 잔기를 함유하며, (iii) 위치 163 내지 C-말단에서 HBc에 대해 바람직하게는 이종인 면역원성 서열 내에 약 100개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 서열이고, 단, 도메인 IV는 위치 136에서부터 140까지의 HBc 서열 중의 5개 이상의 아미노산 잔기를 함유한다. 도메인 IV 면역원성 서열은 보다 바람직하게는, 약 50개 이하의 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게는 약 25개 이하의 아미노산 잔기를 함유한다. 따라서, 도메인 IV 서열은 위치 약 165에서부터 C-말단까지의 C-말단 HBc 서열을 제외하고는, 실질적으로 임의의 서열일 수도 있다.
도메인 IV 서열의 길이는 5개 잔기, 즉, 위치 136에서부터 140까지의 잔기, 총 3개 이하의 시스테인을 포함한 약 125개 이하 아미노산 잔기(HBc 위치 약 183 이하 + 면역원성 서열의 약 75개 이하의 면역원성 잔기)일 수 있고, 이의 길이는 고려된 키메라 단백질의 총 길이가 약 135 내지 약 525개 잔기를 갖기에 충분해야 한다. 도메인 I 또는 II 중의 하나 또는 둘다와 펩티드 결합된 에피토프가, 이들 에피토프에 대한 바람직한 경우 처럼 각각 약 30 또는 약 50개 이하의 잔기를 함유하는 경우에는, 도메인 IV 에피토프를 포함한, 해당 키메라 분자의 보다 바람직한 길이가 약 170 내지 약 250개 잔기이다. 2개의 면역원성 에피토프를 함유하는 특히 바람직한 키메라 분자는 길이가 약 190 내지 약 210개 잔기이다. 이로써 생성된 입자에 핵산 결합이 존재하지 않는다는 것은 앞서 논의된 바와 같은 280:260 흡광도 비를 측정함으로써 결정된다.
도메인 IV 서열은 0개 내지 3개 이하의 Cys 잔기를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 하나 이상의 Cys 잔기가 키메라 단백질 분자의 C-말단의 약 5개 아미노산 잔기에 또는 잔기 이내에 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 하나 이상의 Cys 잔기가 도메인 IV 서열 내에 존재하는 경우, 이들 Cys 잔기가 서로 인접해 있는 것이 바람직하다.
도메인 IV 서열이 T 세포 에피토프, 동일하거나 상이한 다수의 T 세포 에피토프, 또는 고려된 키메라가 면역원으로서 사용하도록 의도된 유기체에 대한 부가의 B 세포 에피토프를 구성 것이 바람직하다. 예시되는 도메인 IV T 세포 에피토프 서열이 표 A에서와 같이, 다음 표 B에 제공되는데, 부가된 예시 C-말단 시스테인 잔기는 밑줄쳐져 있다:
Figure 112005045808790-PCT00012
Figure 112005045808790-PCT00013
Figure 112005045808790-PCT00014
Figure 112005045808790-PCT00015
잔기 위치 4에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc의 아미노산 서열이, 고려된 키메라 분자 및 입자에 존재하는 것이 바람직하다. 위치 2에서부터 위치 149까지및 위치 약 165까지의 서열이 존재하는 것이 보다 바람직하다. B 세포 에피토프는 존재하는 경우, 잔기 76 내지 85에 존재하는 것이 바람직하다. 적어도 단일 시스테인 잔기가, 앞서 인지된 바와 같은 도메인 I 중의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 존재하거나, 또는 앞서 논의된 바와 같이 C-말단에 또는 C-말단 근처에 존재한다. 하나 이상의 T 세포 에피토프가 HBc 서열에 대한 N-말단 또는 C-말단 부가물로서 존재할 수도 있다. 고려된 재조합 HBc 키메라는 실질적으로 결합된 핵산을 함유하지 않는다. 부가된 N-말단 또는 C-말단 Cys 잔기를 함유하는 고려된 키메라 입자는 상기 부가된 Cys를 함유하지 않는 입자와 유사하다.
고려된 재조합 HBc 키메라 분자가 전형적으로 존재하고, 자가 어셈블리된 입자로서 사용된다. 이들 입자는 180 내지 240개 키메라 분자(90 또는 120개 이량체 쌍), 통상적으로 240개 키메라 분자로 구성되는데, 이는 디설파이드 환원제, 예를 들면, 2-머캅토에탄올의 존재하에 단백질 분자로 분리되므로, 개개의 분자는 주로 디설파이드 결합에 의해 입자로 함께 결합되는 것으로 사료된다.
이론에 의하면 결합될 것으로 기대되지는 않지만, 고려된 HBc 키메라에 있어서 관찰된 안정성 증강 및 몇몇 경우의 증강된 발현은 입자의 키메라 단백질 분자 사이의 N-말단 시스테인 디설파이드 결합에 기인한 것으로 사료된다. 시스테인 또는 시스틴으로서 존재하는지의 여부와는 상관없이, N-말단 시스테인(들) 잔기는 단백질 및 어셈블리된 입자를 발현시키는 핵산내에 존재하는 코돈에 의한 암호화용 잔기만큼의 시스테인으로서 지칭된다.
이들 입자는 HBV에 감염된 환자에게서 관찰된 입자와 유사하지만, 이들 입자는 비-감염성이다. 각종 원핵성 및 진핵성 숙주에서의 발현시, 개개의 재조합 HBc 키메라 분자는 숙주에서 입자로 어셈블리되는데, 이러한 입자는 숙주 세포로부터 용이하게 수거할 수 있으며, 경우에 따라 정제할 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, HBc 면역우성 루트는 통상적으로, 완전 단백질의 아미노-말단(N-말단)으로부터 약 위치 75 내지 85에 위치하는 것으로 언급된다. 도메인 II의 면역원성 에피토프-함유 서열은 상기 면역우성 루프 서열 내에 위치된다. 이러한 위치 설정으로 인해, 상기 어셈블리된 키메라 입자 내의 극도의 면역원성 위치에 면역원성 서열 또는 링커 잔기를 표시하면서도, HBc 루프 서열의 HBc 면역원성을 실질적으로 제거시킬 수 있다.
각종 에피토프 및 스페이서의 앞서 논의된 N- 및 C-절단물, 삽입물 이외에도, 고려된 키메라 분자는 HBc 도메인 I, II, III 및 IV를 구성하고 있는 아미노산 잔기 내에 보존적 치환물을 함유할 수도 있다. 보존적 치환물은 앞서 규정된 바와 같다. 예시적 보존적 치환은 위치 2 및 3의 잔기(아스파르트산 및 이소루신; DI)를, N-말단 시스테인 잔기를 포함한, 목적하는 N-말단 에피토프를 암호화하는 핵산을 부가하는데 사용되는 EcoRI 제한 부위에 의해 암호화되는 글루탐산 및 루신(EL) 잔기로 대체시킨 것으로 제시된다.
보다 드물게, "비-보존적" 변화, 예를 들면, 글라이신을 트립토판으로 대체시키는 것이 고려된다. 유사한 소수의 변화에는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 이들 둘다가 포함될 수도 있다. 생물학적 활성 또는 입자 형성을 없애지 않으면서도, 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시킬 수 있는지를 결정하는데 있어서, 당해 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE 소프트웨어(DNASTAR Inc., Madison, WI)를 사용하여 안내받을 수 있다.
본 발명의 키메라 분자의 HBc 부분, 즉 부가된 에피토프, 링커, 가요성 링커 암 또는 이종 잔기(들)(이는 제한 효소 인공물이다)의 서열 또는 잔기 이외의 HBc 서열을 갖는 부분은, 가장 바람직하게는 도 1에 제시되는 아형 ayw의 아미노산 잔기 서열(서열번호 1)을 가지고, 한 말단 또는 양 말단에서의 절단으로 인해 존재하지 않는 아형 ayw 서열의 일정 부분(들)은 덜 함유한다. 전형적으로, 상기 서열은 HBc 위치 2 내지 149의 서열이다. 도 1에 제시된 아형 adw, adw2 및 adyw의 상응하는 아미노산 잔기 서열(서열번호 2, 3 및 4)이 다소 덜 바람직하다. 도 1의 마지막 두 서열인, 정렬된 위치 2 내지 149에서의 우드척 및 땅 다람쥐의 서열(서열번호 5 및 6)이 또한 덜 바람직하다. 그 밖에 언급된 바와 같이, 상이한 포유류 HBc 단백질로부터의 상이한 서열 부분을 단일 키메라에 함께 사용할 수 있다.
상기 언급된 바와 같은 본 발명의 키메라 분자의 HBc 부분이 위치 2 내지 약 165에 상응하는 포유류 HBc 분자의 서열 이외의 것을 갖는 경우에는, 이러한 아미노산 잔기의 약 20% 이하가 위치 2 내지 165에서 서열번호 1과 비교해서 치환된다. 상기 아미노산 잔기의 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 약 5% 이하, 및 가장 바람직하게는 약 3% 이하가 위치 2 내지 165에서 서열번호 1과 비교해서 치환된다.
따라서, 164 HBc 잔기의 고려된 키메라는 위치 2 내지 165에서 서열번호 1과는 상이한 약 32개 이하의 잔기를 함유할 수 있다. 보다 바람직하게는, 약 8개 잔기가 잔기 위치 2 내지 165에서 ayw 서열(서열번호 1)과 상이하고, 가장 바람직하게는 약 5개 잔기가 상이하다. 도메인 II의 면역우성 루프 내 또는 말단에서의 치환 이외에, 해당 키메라 분자의 비-나선상 부분에서의 치환이 바람직하고, 이는 입자 형성 보장을 도와주기 위해 전형적으로 잔기 2 내지 약 15 및 잔기 24 내지 약 50에서 이루어진다[참조: Koschel et al., (1999) J. Virol., 73(3):2153-2160].
HBc 서열이 위치 165를 벗어난 C-말단, 또는 N-말단에서 절단되거나 또는 면역우성 루프 내에 하나 이상의 결실물을 함유하는 경우, 치환된 잔기의 수는 이와 비례적으로 더 적은데, 이는 상기 서열의 총 길이가 164 잔기 보다 적기 때문이다. 해당 분자 내의 그 밖의 결실은 계산 목적상 보존적 치환으로 간주된다.
또한, 본 발명의 또다른 양태에서, HBc 위치 48 및 107에서 하나의 시스테인 잔기 또는 바람직하게는 양쪽 시스테인 잔기가 상기 논의된 임의의 HBc 키메라 분자 내의 바람직한 세린 잔기와 같은 또다른 잔기로 대체된다. 이들 자가 어셈블리된 입자는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃로 14일 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자보다 더 안정적이다. 따라서, 잔기 위치 48 및 107에 하나의 시스테인, 또는 바람직하게는 둘다의 시스테인이 부재하는 것이 특정 입자의 저장 안정성을 증강시킬 수 있으며, 그렇치 않으면 N- 또는 C-말단 시스테인 또는 이들 둘다가 존재함으로써 상기 입자를 안정화시킬 수 있다.
따라서, 위치 48 및 107에 통상적으로 존재하는 HBc 시스테인 잔기들은 모든 고려된 키메라 분자내의 기타 잔기, 예를 들어 세린, 트레오닌, 루신, 이소루신, 아스파라긴 또는 글루타민으로 대체되고, 상기 고려된 키메라 분자는 본래의 HBc 서열이 아닌 하나 이상의 N- 또는 C-말단 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서, 몇몇 양태에서, 도메인 I의 HBc 서열이 위치 5 내지 위치 75의 잔기와 함께 적어도 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 고려된 키메라 분자가 N-말단 시스테인 잔기를 함유할 뿐만 아니라 상기 인지된 바와 같이 단독 또는 아미노산 잔기 서열중에 도메인 IV 내에 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 다른 양태에서, 바람직한 키메라 분자는 오직 하나 또는 그 이상의 C-말단 시스테인 잔기를 함유하고, 도메인 I은 비-HBc 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. HBc 시스테인 잔기는 도 1의 각각의 HBc 서열내 위치 약 61에 존재한다.
키메라 제조
고려된 키메라 HBc 면역원은, 전형적으로 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조한다. 따라서, 특정한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열을, HBc를 암호화하는 전구체 서열에 부가하고, 이로부터 결실시켜 고려된 키메라를 암호화하는 핵산을 형성시킨다.
고려된 예시적 키메라 면역원은, 전형적으로 N-말단 시스테인으로서 인플루엔자 A M2 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기를 활용한다. HBc 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 시험관내 돌연변이 유발에 의해 상기 키메라 분자를 제조하기 위한 프라이머는 다음에 논의된다. 시스테인-함유 M2 폴리펩티드 에피토프가 N-말단에 존재하지 않는 경우, M2 폴리펩티드 또는 간단한 N-말단 출발 서열, 예를 들면, Met-Cys- 또는 Met-Gly-Cys-의 시스테인-함유 부분만을 암호화하는 프라이머를 사용하여 시험관내 돌연변이 유발시킴으로써 N-말단 시스테인을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 또다른 양태에서, 재조합으로 생성된 면역원성 키메라 입자를 HBV-감염된 환자에게 재조합 B형 간염 표면 항원(HBsAg)과 동시에 투여한다. 재조합 B형 간염 표면 항원은 하나 또는 둘다의 PreS1 또는 PreS2 영역을 임의로 함유할 수 있다.
B형 간염 표면 항원의 제조방법은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있다. 효모에서의 재조합 B형 간염 표면 항원의 제조예는 미국 특허 제4,977,092호에 기재되어 있다. HBc 키메라 입자 및 HBsAg는 동일한 용기에 존재하거나, HBc 키메라 입자가 하나의 용기에 존재하고 HBsAg가 두번째 용기에 존재하여 두개를 주사에 앞서 혼합하는 키트로서 제공될 수 있다. 바람직한 HBsAg의 용량은 약 10 내지 약 100㎍이고, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 50㎍이다. HBsAg는 수산화알루미늄 겔 상에서 임의로 제형화된다. 바람직한 사용방법에서, 배합된 HBc 입자 및 HBsAg는 MPL 또는 RC-529와 같은 아쥬반트와 함께 투여된다.
일단 면역화된 경우, 환자는 HBc 키메라 입자에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 충분한 시간 기간 동안 유지된다. 유지 시간은 전형적으로는 약 3 내지 약 12주 동안 지속되고, 백신의 2차 면역화 투여인 부스터(booster)를 포함할 수 있다. 후속적인 부스터 투여가 또한 고려된다.
항-HBsAg 또는 기타 항체의 생성은 면역화된 사람으로부터 혈장 또는 혈청 샘플을 수득하여, 하기 기술된 ELISA 검정에서의 합성 HbsAg 폴리펩티드 항원과 같은 적합한 항원에 대한 이들의 결합능에 있어서 이들의 항체를 분석함으로써 또는 당해 기술분야 익히 공지된 웨스턴 블롯과 같은 또다른 면역분석에 의해 용이하게 확인된다.
2가지 전략 중의 한 가지 전략이 면역원성 에피토프 서열, 화학-반응성 링커 잔기 서열 또는 화학적 비-반응성 서열을 루프 서열 내에 위치시키는데 바람직하다. 첫번째 전략은 면역우성 루프의 일정 부분을 암호화하는 DNA를 절단한 다음, 이를 B 세포 에피토프 등의 면역원성 에피토프를 암호화하는 DNA로 대체시키는 대체 전략으로 지칭된다. 두번째 전략은 면역원성 에피토프를 루프 내의 인접한 잔기 사이에 삽입시키는 삽입 전략으로 지칭된다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용한 부위 지시된 돌연변이 유발을 한 가지 예시적인 대체 접근법에 사용하여, 면역우성 루프-암호화 DNA의 각 말단 근처에 있는 것인, 한 쌍의 상이한 제한 부위, 예를 들면, EcoRI 및 SacI를 암호화하는 키메라 HBc DNA 서열을 제공한다. 대체된 잔기의 예는 76 내지 81 잔기이다. 상기 루프 암호화 절편을 절단하고, 면역원성 B 세포 에피토프를 암호화하는 목적하는 서열을 상기 제한 부위에 연결하며, 이로써 생성된 DNA를 사용하여 상기 HBc 키메라를 발현시킨다. 이러한 기술의 용도 예에 대해서는 예를 들어, 문헌[참조: Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]의 표 2를 참조한다.
대안으로, 단일 제한 부위 또는 2개의 부위를 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 상기 영역 내로 암호화할 수 있고, 이러한 DNA를 제한 효소로 절단하여 "점착성" 말단을 제공할 수 있다. 점착성 말단을 연결에 사용하거나, 또는 엔도뉴클레아제 및 연결된 평활 말단화 이종 DNA 절편을 상기 절단된 영역에 연결시킨다. HBc 내로의 이러한 유형의 서열 대체의 예가 다음 문헌에 보고된 연구에서 발견될 수 있다[참조: Schodel et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 319-325; Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997 (98): p. 114-119 and Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180 (3): p. 1037-4]. 상기 문헌 중 후자의 2개 문헌에는 피. 요엘리(P. yoelii) 및 피. 베르그헤이(P. berghei) 각각에 대한 백신의 제조에 관해 논의되어 있다.
HBc 면역원성 루프 내의 삽입 위치와 루프 잔기의 존재가 해당 면역원의 활성에 중요할 수 있다. 따라서, 공개된 PCT 국제출원 PCT/US01/25625 및 PCT/US01/41759에 예시된 바와 같이, 말라리아성 B 세포 에피토프를 HBc 잔기 위치 78과 79 사이에 위치시키는 것은, 동일한 면역원이 잔기 76 내지 81의 절단 및 대체된 영역 내에 위치시키는 것 보다 10 내지 1000배 더 면역원성인 큰 미립형 면역원을 제공해준다. 또한, 동일한 말라리아성 면역원을 잔기 77과 78 사이에 위치시키는 것과 비교해서 잔기 78과 79 사이에 위치시키는 것이, 면역원성을 약 15배 정도 증강시키는 예상치 못한 결과를 가져다 준다.
따라서, 삽입이 일반적으로 바람직하다. 삽입 전략의 한 예시에서, 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 서로 인접해 있고 인접한 아미노산 잔기, 예를 들면, 잔기 위치 78 및 79에서의 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 2개의 제한 부위를 창출시킨다. 이러한 기술은 HBc 루프 내에서 이전에 인접한 잔기들 간의 4개의 아미노산 잔기(각 제한 부위에 대해 2개씩)를 암호화하는 12개 염기 쌍을 부가시킨다.
제한 효소로 절단시키고, 면역원성 B 세포 에피토프 서열을 암호화하는 DNA를 연결시키며, 이러한 DNA를 발현시켜 HBc 키메라를 형성시키면, HBc 루프 아미노산 서열이 이의 N-말단 면 상에서, 5' 제한 부위에 의해 암호화된 2개의 잔기에 의해 차단되고, 이어서 상기 면역원성 B 세포 에피토프에 의해 C-말단을 향하며, 3' 제한 부위에 의해 암호화된 2개 이상의 면역원성 비-루프 잔기가 그 다음을 따르며, 이어서 나머지 루프 서열이 이어지는 것으로 여겨진다. 이러한 동일한 전략을 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에 보고된 바와 같이 N-말단 시스테인 또는 N-말단 면역원성 서열의 도메인 I 내로 삽입하는데 사용할 수 있거나 또는 하나 이상의 시스테인 잔기 또는 T 세포 에피토프의 도메인 IV 내로 삽입하는데 사용할 수 있다. 잔기 82와 83 사이의 삽입을 이용한 유사한 전략이 다음 문헌에 보고되었다[참조: Schodel et al., (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 193-198].
보다 구체적으로는, C-말단 절단된 HBc 서열(예, HBc149)을 암호화하는 DNA 서열을 공학적으로 처리하여 잔기 78과 79 사이에 인접한 EcoRI 및 SacI 부위를 함유하도록 한다. 이러한 DNA를 양 효소로 절단하여, EcoRI 점착성 말단으로 3'-종결된 HBc 위치 1-78을 암호화하는 하나의 단편을 제공하는 반면, 다른 단편은 5' 말단 SacI 점착성 말단을 가지며 위치 79-149의 잔기를 암호화한다. 5' AATT 오버행(overhang)에 이어 목적하는 B 세포 에피토프를 암호화하는 서열 및 AGCT 3' 오버행을 갖는 합성 핵산을 연결하여, 통상적으로 EcoRI 부위는 파괴시키고 SacI 부위는 보존시키면서, 잔기 78과 79 사이에 2개의 이종 잔기[각각, GlyIle(GI) 및 GluLeu(EL)]에 의해 각 면 상에서 플랭킹된 B 세포 에피토프를 암호화하는 HBc 키메라 서열을 제공한다.
도메인 IV 내의 시스테인 함유 서열, 예를 들면, 위치 326에서부터 위치 345까지의 피. 팔시파룸 CS 단백질 서열을 함유하고 PF/CS326-345(Pf-UTC)로서 본원에 지칭되는 말라리아성 T 세포 에피토프를 삽입하기 위한 유사한 전략을 사용할 수 있다. 여기서, EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 아미노산 잔기 위치 149 다음의 HBc DNA 서열 내로 공학적으로 처리한다. EcoRI 및 HindIII로 분해시킨 후, 상기 AATT 5' 오버행에 이어 T 세포 에피토프 암호화 서열, 하나 이상의 정지 코돈 및 3' AGCT 오버행을 갖는 합성 DNA를 상기 분해된 서열에 연결시켜, HBc 잔기 1-149를 암호화하는 서열에 이어, 2개의 이종 잔기(GI), 정지 코돈 및 HindIII 부위를 형성시킨다.
SacI 제한 부위에 이어, 잔기 위치 79에서 시작하는 HBc를 암호화하는 서열을 갖는 정배향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨 다음, SacI 및 HindIII로 분해하여, HBc 위치 79-149를 암호화하는 서열 + 2개의 부가된 잔기 및 C-말단에서의 T 세포 에피토프를 제공한다. 작제물을 SacI 및 HindIII로 분해하면, 도 2C에 도시되는, N-말단으로부터 HBc 위치 1-78의 서열, 2개의 부가된 잔기, 말라리아성 B 세포 에피토프, 2개의 부가된 잔기, HBc 위치 79-149, 2개의 부가된 잔기 및 T 세포 에피토프를 갖는 목적하는 재조합 HBc 키메라 면역원을 암호화하는 완전한 유전자가 제공된다.
유사한 기술을 사용하여, B 세포 에피토프의 접합을 위한 이종 링커 잔기를 루프 영역 서열 내에 위치시킬 수 있다. 고려된 링커 잔기에는 라이신(Lys)(이것이 특히 바람직하다), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 시스테인(Cys) 및 티로신(Tyr)이 포함된다.
서열번호 1에 제시된 아미노산 잔기 서열이 위치 77 및 78에서 Glu 및 Asp 잔기를 함유하는 것에 주목해야 한다. 그럼에도 불구하고, 부가의 이종 카복실 함유 잔기를 도입하는 것이 여전히 고려된다. 존재하는 글루탐산 및 아스파르트산의 화학적 반응성을 기타 요인에 의해 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에서는, 이웃하는 프롤린, 예를 들면, 위치 79에서 발견되는 프롤린이 근접한 카복실 그룹의 화학적 반응성을 중화시킴으로써 이를 저하시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다.
여기서, 첫번째로 언급된 삽입 전략을 사용하여, 5개의 이종 잔기를 루프 서열 내에 위치시키는데; 하나의 잔기는 B 세포 에피토프를 접합시키기 위한 이종 링커 잔기이고, 2개의 잔기는 그 자체가 루프 서열 잔기에 인접해 있고 삽입된 제한 부위(제한 효소 인공물)의 발현 생성물인 상기 하나의 잔기의 어느 한 면 상에서 인접해 있다. B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 암호화하는 HBc 루프 서열 내로 단일 코돈을 부가하기 위해 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용할 수도 있다는 것에 주목해야 한다.
B 세포 또는 T 세포 에피토프를 (플랭킹하는) 어느 한 면 상에서의 2개의 이종 잔기의 바람직한 용도는 편의 사항이라는 것에 주목해야 한다. 그 결과로서, 삽입된 서열의 어느 한 면 또는 양면 상에서 HBc 서열의 일부가 아닌 0 내지 3개 이상의 부가된 잔기를 사용할 수도 있다. 상기 삽입물 및 HBc 핵산의 한 말단 또는 양 말단을 적당한 뉴클레아제(예: S1 뉴클레아제)로 "츄잉 백(chewed back)"하여 함께 연결될 수 있는 평활 말단을 제공할 수 있다. 삽입된 B 세포 또는 T 세포 에피토프의 일부가 아닐 뿐만 아니라 HBc 서열의 일부도 아닌 부가된 이종 잔기는, 후술되는 몇몇 작제물에서 잔기 GluLeu가 AspIle를 대체하는 경우처럼, 이들 잔기가 이미 존재하는 잔기를 보존적 대체하지 않는 한, 언급된 도메인에 존재하는 잔기 수로 계산되지 않는다.
니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 59 잔기 리불로스 비스-포스페이트 카복실라제-옥시게나제 시그널 펩티드를 암호화하는 177개 염기 쌍 DNA를 합성하기 위해 미국 특허 제5,656,472호에 예시 및 논의된 바와 같은 널리 공지된 합성 방법을 사용하여, 목적하는 재조합 HBc 키메라 핵산의 전부 또는 일부를 합성할 수도 있다는 것에 주목해야 한다. 예를 들면, 도메인 III 및 IV에 연결시킬 수 있는 "점착성 말단" 또는 평활 말단을 갖는 도메인 I 및 II를 합성하여, B 세포 에피토프의 0개 부가 잔기 내지 N-말단 면을 함유하고 C-말단 면 상에 또는 도메인 II/III 연결부 또는 몇몇 기타 목적하는 위치에 0 내지 3개의 부가 잔기를 함유하는 고려된 HBc 키메라를 발현하는 작제물을 제공할 수도 있다.
대안적 삽입 기술이 다음 문헌에 보고되었다[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318]. 여기서, 유전 암호 축퇴의 이점을 고려하여, 상기 연구자들은 잔기 위치 80 및 81에 존재하는 본래의 잔기를 암호화한 상기 위치에 상응하는 단일 제한 부위를 공학적으로 처리하였다. 이로써, 이들의 발현된 HBc 키메라는 제한 부위-암호화된 잔기를 전혀 함유하고 있지 않으며, 삽입된 서열에 바로 인접한 HBc 루프의 잔기를 함유하고 있다.
앞서 기재된 HBc 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열(절편) 또는 이러한 암호화 서열의 상보체가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 핵산 절편은 몇몇 바람직한 양태에서 분리 및 정제된 형태로 존재한다.
살아 있는 유기체에서, 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 서열은 유전 암호를 통하여, 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 데옥시리보핵산(DNA) 서열과 직접적인 관계가 있다. 따라서, 널리 공지된 유전 암호 축퇴를 통하여, 동일한 키메라 아미노산 잔기 서열을 암호화하지만, 두 서열이 고도로 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 것이 아니라 적당히 엄격한 조건 하에 하이브리드화되기에 충분한 수준으로 전술된 유전자 서열과 상이한 부가의 DNA 및 상응하는 RNA 서열(핵산)을 목적하는 바에 따라 제조할 수 있다.
고도로 엄격한 조건은 6XSSC에서 약 50 내지 55℃ 하에 하이브리드화하고 1-3XSSC에서 68℃ 하에 최종 세척하는 것을 포함하는 것으로 규정될 수 있다. 적당히 엄격한 조건은 0.2 내지 0.3M NaCl에서 약 50 내지 약 65℃ 하에 하이브리드화한 다음, 0.2XSSC, 0.1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)에서 약 50 내지 약 55℃ 하에 세척하는 것을 포함한다.
(1) 그 자체 또는 이의 상보체가, 잔기 위치 4에서부터 136까지의 HBc 부분(존재하는 경우)이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 것인 키메라 분자를 암호화하고; (2) 적어도 적당히 엄격한 조건(상기 논의됨) 하에서 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 또는 207의 DNA 서열과 하이브리드화되며; (3) 이의 HBc 서열이 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 및 207의 DNA 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 동일률을 나타내는 핵산(DNA 서열 또는 RNA 서열)이 DNA 변이체 서열로서 규정된다. 널리 공지된 바와 같이, 고려된 핵산 서열과 같은 핵산 서열은 본원에 논의된 바와 같은 적당한 발현 시스템에서 적당한 프로모터에 작동적으로 연결시킬 때 발현된다.
고려된 키메라 분자를 암호화하는 유사체 또는 유사한 핵산(DNA 또는 RNA) 서열이 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 키메라 유사체 핵산 서열 또는 이의 상보성 핵산 서열은, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 제시된 잔기 위치 4에서부터 잔기 위치 136까지의 HBc 서열 부분과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 HBc 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 이러한 DNA 또는 RNA는 본원에서, 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 및 207의 핵산 서열과 "유사하거나" 또는 이의 "유사체"로서 지칭되고, 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 및 207의 핵산 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드화된다. 적합한 형질감염 및 발현시, 유사한 서열을 암호화하는 핵산이 또한 고려된 키메라를 생성시킨다.
특별한 코돈을 특별한 아미노산 잔기를 암호화시키는데 사용하는데 있어서 상이한 숙주가 종종 선호된다. 이러한 코돈 선호도는 널리 공지되어 있고, 목적하는 키메라 서열을 암호화하는 DNA 서열을, 예를 들어, 시험관내 돌연변이 유발을 이용하여 변형시켜, 해당 효소를 발현시켜야 하는 특정한 숙주에 숙주-선호된 코돈을 활용한다. 또한, 유전 암호 축퇴를 사용하여, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 DNA 또는 이의 상보체와의 실질적인 동일성을 피하면서, 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 및 207의 서열의 HBc 부분을 암호화할 수 있다. 따라서, 유용한 유사한 DNA 서열은 적당히 엄격한 조건 하에서 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 및 207의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드화할 필요는 없지만, 이는 여전히 고려된 키메라 분자를 제공해줄 수 있다.
수용적격 숙주 유기체에서 해당 유전자의 발현을 구동시키기에 적합한 프로모터, 및 상기 언급된 바와 같은 고려된 키메라를 암호화하는 유전자를 규정하는 외인성 핵산 절편(예: DNA 절편 또는 서열)에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자(예: DNA 분자)가 또한 본 발명에서 고려된다. 보다 특히, 특정 키메라, 또는 서열번호 202, 203, 204, 205, 206 및 207의 키메라 유전자와 90% 이상의 동일률을 나타내고 적당히 엄격한 조건 하에서 상기 유전자와 하이브리드화되는 DNA 변이체의 HBc 부분에 대한 유전자를 규정하는 DNA 절편에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포에서 해당 키메라의 발현을 구동시키기 위한 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 고려된다.
서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열의 HBc 부분과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일률을 나타내는 HBc 키메라 부분의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 유사체 핵산 서열인 DNA 절편에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포에서 해당 키메라의 발현을 구동시키기 위한 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 추가로 고려된다. 상기 재조합 DNA 분자는 숙주 세포에서의 적합한 형질감염 및 발현시, 고려된 키메라 분자를 제공해준다.
땅 다람쥐의 30개 아미노산 잔기 N-말단 서열이 기타 임의의 HBc 서열과도 정렬되지 않기 때문에 이러한 서열 및 이의 암호화 핵산 서열 및 이의 상보체는 상기 동일률에 포함되지 않을 뿐만 아니라 하이브리드화 결정 방법에 사용된 30-잔기 서열 또는 이의 상보체를 암호화하는 핵산 부분도 포함되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 유사하게, HBc N- 및 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘다에서 절단되는 서열이 동일률 산정에 포함되지 않을 뿐만 아니라 면역우성 루프 잔기가 면역원성 에피토프의 삽입을 위해 제거된 서열도 포함되지 않는다. 따라서, 키메라 분자 내에 존재하는 HBc 서열 잔기 또는 HBc-암호화 염기 만이 동일률 산정에 포함되고 이러한 산정에서 정렬된 핵산 또는 아미노산 잔기 서열과 비교된다.
본원에 기재된 유전자에 대한 암호화 서열이 서열번호 172, 173, 174, 175, 176 및 177에 예시되기 때문에, 분리된 핵산 절편, 바람직하게는 DNA 서열, 이의 변이체 및 유사체는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Current Protocols In Molecular Biology, Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons (New York: 1987) p. 8.1.1-8.1.6]에 논의된 바와 같이, 특정 유전자에 대한 개시 ATG 코돈으로 시작하고 각 유전자에 대한 정지 코돈에서 종결시키거나 이러한 코돈 바로 하단에서 종결시키는 시험관내 돌연변이 유발에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 목적하는 제한 부위를 개시 코돈에서 또는 이러한 개시 코돈의 상단, 및 정지 코돈에서 또는 정지 코돈의 하단에서 공학적으로 처리하여, 기타 유전자를 제조, 절단 및 분리할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 요구되는 핵산, 예시적으로 DNA 서열이 존재하는 한(출발 및 정지 시그널 포함), 부가의 염기 쌍이 해당 절편의 어느 한 말단에 존재하고, 이러한 절편이 해당 단백질을 발현시키는데 여전히 활용될 수 있다. 물론, 이는 발현을 억제시키거나, 발현시키고자 하는 효소를 소모시키는 추가의 생성물을 발현시키거나, 상기 목적하는 효소에 의해 생성된 원하는 반응 생성물을 소모시키는 생성물을 발현시키거나 또는 상기 DNA 절편의 유전자의 발현을 간섭하는, 작동적으로 연결된 DNA 서열의 절편이 존재하지 않는다고 가정한 것이다.
따라서, 상기 DNA 절편에 이러한 차단성 DNA 서열이 존재하지 않는 한, 본 발명의 DNA 절편은 길이가 약 500 내지 약 15,000 염기 쌍일 수 있다. 복제 및 발현에 요구되는 최소 DNA 서열 전부가 경우에 따라 존재한다면, 재조합 DNA 분자, 특히 발현 벡터의 최대 크기는 대부분, 숙주 세포가 수용할 수 있는 벡터 크기에 의해 편의상 좌우된다, 최소 벡터 크기가 널리 공지되어 있다. 이러한 긴 DNA 절편은 바람직하지 않지만, 사용될 수는 있다.
전술된 키메라를 암호화하는 DNA 절편은 화학적 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185]의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성할 수 있다. 물론, 암호화 서열을 화학적으로 합성함으로써, 목적하는 임의의 변형물도, 본래의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 것을 적당한 염기로 치환함으로써 간단히 제조할 수 있다. 그러나, 전술된 서열을 포함한 DNA 절편이 바람직하다.
고려된 HBc 키메라는 형질전환된 다수의 숙주 시스템, 전형적으로 숙주 세포에서 생성(발현)될 수 있긴 하지만, 비세포성의 시험관내 시스템에서의 발현도 고려된다. 이들 숙주 세포성 시스템에는 미생물, 예를 들면, 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 세균; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스; 담배 모자이크 바이러스) 또는 세균성 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 적당하게 형질전환시킨 동물 세포 시스템, 예를 들면, CHO, VERO 또는 COS 세포가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 이용된 숙주 세포에 제한되는 것은 아니다.
HBc 키메라를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 절편은 바람직하게는, 이러한 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자(플라스미드 벡터)로부터 수득한다. HBc 키메라의 단백질 내로의 키메라 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터가 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
발현 벡터는 프로모터를 포함한 발현 제어 요소를 함유한다. 키메라 암호화 유전자가 상기 발현 벡터에 작동적으로 연결되어, 프로모터 서열이 상기 키메라 암호화 유전자의 RNA 폴리머라제 결합과 발현을 지시할 수 있게 해준다. 폴리펩티드 암호화 유전자를 발현하는데 있어서 유용한 것은 문헌[참조: Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3: 2719 and Odell et al. (1985) Nature, 313: 810]에 기재된 바와 같이 유도성, 바이러스성, 합성, 항상성 프로모터 뿐만 아니라 문헌[참조: Chua et al. (1989) Science, 244: 174-181]에 제시된 바와 같이 시간상 조절된, 공간상 조절된 및 시공간상 조절된 프로모터이다.
이. 콜라이 등의 원핵성 세포에 사용하는데 바람직한 한 가지 프로모터는 외부적으로 공급된 날리딕산에 의해 유도 가능한 Rec 7 프로모터이다. 보다 바람직한 프로모터는 외부적으로 공급된 이소프로필-β-D-티오갈락토-피라노시드(IPTG)에 의해 유도 가능한 플라스미드 벡터 JHEX25(공급원: Promega Corp., Madison WI)에 존재한다. 더욱 더 바람직한 프로모터인 tac 프로모터는 플라스미드 벡터 pKK223-3에 존재하고, 이는 또한, 외부적으로 공급된 IPTG에 의해 유도 가능하다. 상기 pKK223-3 플라스미드는 유도를 위해 약 25 내지 약 100μM IPTG를 사용하여, XL-1, TB1, BL21 및 BLR 등의 다수의 이. 콜라이 균주에서 성공적으로 발현될 수 있다. 놀랍게도, 약 25 내지 약 50μM IPTG 농도가 2L 진탕 플라스크 및 발효기에서 최적의 결과를 제공해주는 것으로 밝혀졌다.
살모넬라(Salmonella)와 같은 기타 미생물, 예를 들면, 에스. 티피(S. typhi) 및 에스. 티피무리움(S. typhimurium) 및 에스. 티피무리움-이. 콜라이 하이브리드, 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 포유류 세포, 예를 들어 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포, 일반적으로 모노콧(monocot) 및 디콧(dicot) 식물 둘다 및 특히 디콧 식물 저장 기관, 예를 들면, 뿌리, 씨앗 또는 열매(여기서, 경구 백신 또는 접종량이 바람직하다), 및 곤충 세포, 예를 들어 에스. 프루기페르다(S. frugiperda) 세포 또는 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV) 또는 바쿨로바이러스를 사용한 트리코플루시아(Trichoplusia)에서의 고려된 키메라 분자의 발현은 상기 언급된 공개공보 WO 제02/14478 A2호에서 상세히 논의되어 있다. 따라서, 비록 고려되었지만, 이들 발현 방법은 본원에 추가로 논의되지 않을 것이다.
DNA를 상보성 부착 말단 또는 평활 말단을 통하여 벡터에 작동적으로 연결시키기 위한 각종 방법이 개발되었다. 예를 들면, 상보성 단독중합체 트랙을, 벡터 DNA 내로 삽입시키고자 하는 DNA 절편에 부가할 수 있다. 이어서, 상기 벡터와 DNA 절편을 상기 상보성 단독중합체성 테일 사이의 수소 결합에 의해 연결시켜 재조합 DNA 분자를 형성시킨다.
대안으로, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커를 사용하여, DNA 절편을 전술된 바와 같이 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 평활-말단화 DNA 절편을, 평활-말단화 DNA 분자의 연결을 촉매할 수 있는 효소, 예를 들면, 박테리오파아지 T4 DNA 리가제의 존재하에 과량의 합성 링커 분자와 함께 항온 배양함으로써, 상기 합성 링커를 평활-말단화 DNA 절편에 부착시킨다.
따라서, 이러한 반응 생성물은 이들의 말단에 합성 링커 서열을 수반하는 DNA 절편이다. 이어서, 이들 DNA 절편을 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 상기 합성 링커와 혼화성인 말단을 생성시키는 효소를 사용하여 절단시킨 발현 벡터 내로 연결시킨다. 각종의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 다수의 공급원으로부터 시판중이다[New England BioLabs, Beverly, MA 포함]. 목적하는 DNA 절편은 또한, 정배향 및 역배향 프라이머가, 해당 유전자를 벡터 내로 삽입시킬 수 있도록 증폭 후 절단될 수 있는 목적하는 제한 부위을 함유하는 PCR 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 대안으로, PCR 생성물을, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, T-오버행을 함유하는 벡터(Promega Corp., A3600, Madison, WI) 내로 직접적으로 클로닝시킬 수 있다.
발현된 키메라 단백질은, 숙주 세포가 단일 세포든 아니면 다세포 숙주 내의 세포든지 간에 이러한 숙주 세포 내에서 입자로 자가 어셈블리된다. 상기 입자 함유 세포를 표준 과정을 이용하여 수거하고, 이 세포를 프렌치 압력 세포, 리소자임, 초음파기, 비드 비터 또는 미세유동화기(Microfluidics International Corp., Newton MA)를 사용하여 용해시킨다. 상기 용해물을 정화시킨 후, 입자를 45% 황산암모늄으로 침전시키고, 20mM 인산나트륨(pH 6.8)에 재현탁시키며, 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. 이와 같이 투석시킨 물질을 간단히 원심분리시킴으로써 정화시키고, 상등액을 대상으로 하여, Sepharose
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CL-4B를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피한다. 입자 함유 분획을 동정하고, 이를 대상으로 하여, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피하며, 황산암모늄으로 재침전시키고, 재현탁시키며, 투석시킨 다음, 멸균 여과시키고 -70℃에서 저장한다.
HBc 키메라 접합체
또한, 특정 물질이 화학적(공유적)으로 결합된 키메라 HBc 입자가 본 발명의 일부를 형성한다. 구체적으로는, HBV 표면 항원에 상응하는 펩티드 서열이 키메라 입자에 공유 결합될 수 있다. 또한, 유리하게는 비-HBV 서열이 HBc 키메라와 접합될 수 있다. 대안으로, 유리하게는 비-펩티드성 화합물이 HBc 키메라 입자와 연결될 수 있다. 이러한 비-펩티드성 화합물로는 올리고뉴클레오티드, 사카라이드, 면역자극성 알킬화 사카라이드가 포함될 수 있다.
임의의 화학-반응성 잔기(합텐)가 고려된 HBc 키메라 또는 키메라 입자, 예를 들면, 라이신, 글루탐산 또는 아스파르트산, 도메인 II의 루트 영역 내의 시스테인 또는 티로신과 같은 이종 링커 잔기를 함유하는 키메라 입자에 연결될 수 있다. 관심있는 분자는 전형적으로 B 세포 면역원이지만, 키메라 분자가 면역계 세포 또는 특이적 수용체를 표적으로 하게 하는 면역자극성 분자 또는 펩티드 서열일 수 있다. 공유 결합된 합텐은 폴리펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물(사카라이드, 즉 올리고- 또는 폴리사카라이드), 또는 비-폴리펩티드, 비-탄수화물 화학물질, 예를 들면 2,4-디니트로벤젠 또는 약물, 예를 들면 코카인 또는 니코틴일 수 있다.
이로써 형성된 HBc 키메라 입자 접합체는 하기 논의되는 바와 같이 접종물 또는 백신으로서 유용하다. 이러한 키메라 단백질은 발현시 자가 어셈블리되고 접합체가 발현 후에 형성되기 때문에, 접합체 형성은, 전형적으로는 유리 단백질 분자와 비교해서 상기 어셈블리된 입자를 사용하여 수행된다.
개개의 합텐 분자를 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 측쇄를 통하여 이러한 단백질 또는 폴리펩티드에 작동적으로 연결시켜 펜던트하게 연결된 면역원성 접합체, 예를 들면 측쇄 폴리펩티드 중합체를 형성시키는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2002년 2월 21일 공개된 PCT WO 제02/14478 A2호에 상세히 기재되어 있다.
접종물 및 백신
상기 기재된 재조합 HBc 키메라 면역원은 바람직하게는 미립 형태로 바람직하게는 수성인 약제학적으로 허용되는 비히클 조성물 중에 면역원성 유효량으로 용해되거나 분산되어 접종물 또는 백신을 형성한다. 항체를 유도시키고자 하는 숙주 동물 또는 만성 B형 간염 바이러스로 감염되어 면역시킬 필요가 있는 숙주 동물, 예를 들면, 포유류(예, 마우스, 개, 염소, 양, 말, 소, 원숭이, 아페 또는 사람) 또는 조류(예, 닭, 칠면조, 오리 또는 거위)에게 투여하는 경우, 접종물은 면역원에 존재하는 부가된 B 세포 에피토프, 예를 들어 Pre-S2 B 세포 에피토프와 면역반응하는 항체를 유도시킨다. 백신에서, 이러한 유도된 항체는 또한 바이러스 또는 바이러스-감염된 세포와 (결합하여) 생체내 면역반응을 하여 인플루엔자 감염으로부터 숙주를 보호하는 것으로 사료된다. 접종물은 면역화된 숙주 동물에서 활성화된 T 세포 생성을 유도할 수 있지만, 이러한 활성화된 T 세포는 보호성이 아닌 반면, 백신에 의해 유도된 활성화된 T 세포는 숙주를 보호한다.
따라서, 하나의 동물에서 백신인 조성물은 또다른 숙주에 있어서 접종물일 수 있고, 이때 항체는 인플루엔자 A에 감염되지 않는 2차 숙주에서 유도된다. 본 상황에서, HBV의 만성 보균자인 환자는 우선 활성화된 T 세포를 통하여 보호되는 것으로 사료된다.
각각의 면역화에 사용된 재조합 HBc 키메라 면역원의 양은 면역원성 유효량으로서 지칭되고, 특히, 하기 기재된 바와 같이 재조합 HBc 키메라 면역원, 면역시킨 동물 숙주 및 백신내 아쥬반트의 존재 여부에 따라서 광범위하게 다양할 수 있다. 백신 및 접종물에 대한 면역원성 유효량은 상기 논의된 바와 같이 각각 보호 또는 항체 활성을 제공한다.
백신 또는 접종물은 전형적으로, 1회 접종당(단위 용량당) 약 1㎍ 내지 약 1mg, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 50㎍의 재조합 HBc 키메라 면역원 농도를 함유한다. 마우스에서의 면역화는 전형적으로는 10 또는 20㎍의 키메라 입자를 함유한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 합텐이 펜던트하게 연결된 키메라 HBc 입자 또는 키메라 입자를 B형 간염 바이러스로 만성적으로 감염된 환자에게 투여하여 T-세포 활성화를 유도한다. 이러한 치료는 주사에 의한 반복된 투여를 포함한다. 가장 바람직한 투여 방법은 근육내 또는 피하 주사를 포함하지만, 대안적인 바람직한 방법으로는 피내 투여가 포함된다. 피내 투여는 Powderject Pharmaceuticals, Plc사(Oxford, England)에서 개발한 것과 같은 장치를 사용하는 미립 충격물로 이루어지거나, 또는 패치를 사용하여 이루어질 수 있다.
면역원성 입자 투여용으로 바람직한 패치는, 표피를 관통하는 약 50 내지 약 1000㎛ 길이의 여러개의 짧은 융기를 갖고, 패치로부터 진피로의 면역원성 입자의 통과를 제공한다. 바람직하게는, 랑게르한스섬 세포의 활성화제가 피내 투여와 함께 동시에 투여된다. 활성화제로는 캄포르, 디메틸 설폭사이드 및 디페닐 프탈레이트가 포함된다. 근육내 또는 피하 주사로 투여되는 경우, 키메라 HBc 분자 입자는 바람직하게는 Th-1 촉진 아쥬반트의 존재하에 투여된다.
환자에게 하나 이상의 용량의 키메라 입자를 투여한다. B형 간염 바이러스에 대한 T-세포 반응의 증강이 유도하기 위한 입자의 용량은 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 500㎍ 및 가장 바람직하게는 약 20㎍ 내지 약 100㎍이다. 바이러스에 대한 면역 반응의 증강은 T 세포 반응 및/또는 B 세포 반응에 의해 측정할 수 있다. 고려된 방법의 결과로 환자의 초기 치료전 반응과 비교하여 HBV에 대한 이들 반응중 하나 또는 둘다가 환자에서 증강된다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 면역화 섭식에는 Pre-S1 및 Pre-S2를 포함하는 HbsAg 분자의 전부 또는 일부가 포함될 수 있다. 이들 면역화는 함께, 동일한 날 또는 다른 날에 개별적으로, 또는 하나의 면역원으로 수회 면역화한 후, 다른 면역원으로 수회 면역화하는 시리즈로서 이루어질 수 있다.
T 세포 활성화는 다수의 기술로 측정할 수 있다. 통상적인 실행에서, 숙주 세포에 고려된 HBc 키메라 입자 백신 또는 접종물을 접종하고, 이후에 말초혈액 단핵세포(PMBC)를 수거한다. 이어서, 이들 PMBC를 T 세포 면역원의 존재하에 약 3 내지 5일 동안 시험관내 배양한다. HBV에 대한 T-세포 반응의 경우, T 세포 면역원은 HBsAg, HBc, 또는 이의 절편일 수 있다. 이어서, 배양된 PMBC를 사이토킨, 예를 들어 IL-2, GM-CSF 또는 IFN-γ의 분비 또는 증식에 대해 검정한다. T 세포 활성화에 대한 검정은 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,478,726호 및 이에 인용된 인용문헌].
B 세포 반응은 항체로서 측정한다. HBV의 경우, 항-표면 항원 항체(pre-S1 및 pre-S2) 영역의 출현이 증강된 면역 반응의 표시이다.
백신은 전형적으로 1회 접종당(단위 용량당) 약 1㎍ 내지 약 1mg, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 50㎍의 재조합 HBc 키메라 면역원 농도를 함유한다. 본 발명의 백신 또는 접종물에 속하는 바와 같은 용어 "단위 용량"은 동물에 대한 일단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하는데, 각 단위는 요구되는 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 연합하여 목적하는 면역원성 효과를 개별적으로 또는 집합적으로 가져다 주도록 산정된 활성 물질의 예정량을 함유한다.
백신물은 전형적으로 면역원, 바람직하게는 미립 형태의 면역원을 생리학적으로 관용되는(허용되는) 희석제 비히클, 예를 들면, 물, 인산염 완충 식염수(PBS), 아세테이트 완충 식염수(ABS), 5% 만니톨 용액, 링거액 등에 분산시켜 수성 조성물을 형성시킴으로써 회수된 재조합 HBc 키메라 면역원으로부터 제조한다. 이러한 희석제 비히클은 또한, 후술되는 바와 같은 유지성 물질, 예를 들면, 땅콩유, 스쿠알란 또는 스쿠알렌을 포함할 수 있다.
활성 성분으로서 단백질 함유 물질을 함유하는 백신 제제가 당해 기술분야에 익히 인식되어 있다. 전형적으로, 이러한 백신은 비경구용의 액상 용액제 또는 현탁제로서 제조되고; 주사하기에 앞서 액체 중에 용해 또는 현탁되기에 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다.
상기 면역원성 활성 성분을 종종, 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 혼화성인 부형제와 혼합한다. 적합한 부형제는, 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물이다. 또한, 경우에 따라, 접종물 또는 백신은 미량의 보조 물질, 예를 들면, 해당 조성물의 면역원성 효능을 증강시키는 pH 완충제, 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다.
고려된 백신은 유리하게는 아쥬반트를 포함하기도 한다. 본 발명의 백신 및 접종물에 적합한 아쥬반트는 해당 키메라의 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응을 증강시킬 수 있는 아쥬반트 뿐만 아니라 해당 키메라 내에 함유된 T 세포 에피토프에 대한 세포 매개된 반응을 증강시킬 수 있는 아쥬반트를 포함한다. 아쥬반트는 당해 기술분야에 익히 공지되어 있다[참조: Vaccine Design- The Subunit and 아쥬반트 Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M. F., and Newman, M. J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X].
아쥬반트의 예에는 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)(이는 사람에게 사용하지 못한다), 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA), 스쿠알렌, 스쿠알란 및 백반[예: Alhydorgel™(Superfos, Denmark)]이 포함되는데, 이는 당해 분야에 널리 공지된 물질이고 몇몇 공급원으로부터 시판중이다.
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 바람직한 아쥬반트에는 알루미늄 또는 칼슘 염(예를 들면, 하이드록사이드 또는 포스페이트 염)이 포함된다. 본원에서 사용하기에 특히 바람직한 아쥬반트는 수산화알루미늄 겔(예, Alhydrogel™)이다. 수산화알루미늄 겔의 경우, 당해 키메라 단백질을, 용량당 알루미늄 약 50 내지 약 800㎍, 바람직하게는 약 400 내지 약 600㎍이 존재하도록 상기 아쥬반트와 혼합한다. 인산칼슘 나노 입자(CAP)는 Biosante, Inc사(Lincolnshire, IL)에 의해 개발된 아쥬반트이다. 관심있는 면역원을 입자 외부에 피복시키거나, 또는 내부에 피막 형성시킬 수 있다[참조: He et al., (Nov. 2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7 (6):899-903].
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 특히 바람직한 또다른 아쥬반트는 에멀젼이다. 고려된 에멀젼은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있다. 면역원성 키메라 단백질 이외에도, 이러한 에멀젼은 널리 공지된 바와 같은 오일 상의 스쿠알렌, 스쿠알란, 땅콩유 등, 및 분산제를 포함한다. 비-이온성 분산제가 바람직하고, 이러한 물질에는 솔비탄 및 만니드의 모노- 및 디-C12-C24-지방산 에스테르, 예를 들면, 솔비탄 모노-스테아레이트, 솔비탄 모노-올레에이트 및 만니드 모노-올레에이트가 포함된다. 면역원 함유 에멀젼을 에멀젼으로서 투여한다.
바람직하게는, 이러한 에멀젼은 수성 상 중의 키메라 단백질 입자로 유화시킨, 임의로 스쿠알란과 함께, 스쿠알렌, 글리세롤 및 만니드 모노-올레에이트와 같은 계면활성제를 포함하는 유중수 에멀젼(Arlacel™ A)이다. 오일 상은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10%의, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 1%의 백신을 포함한다. 오일 상의 대안적 성분으로는 알파-토코페롤, 혼합된-쇄 디- 및 트리-글리세라이드 및 소르비탄 에스테르가 포함된다. 이러한 에멀젼의 익히 공지된 예에는 Montanide™ ISA-720, 및 Montanide™ ISA 703(Seppic, Castres, France)이 포함되고, 이들 각각은 스쿠알렌과 스쿠알란 둘다를 함유함을 인지해야 하는데, 스쿠알렌이 각각에서 더 우세하지만, Montanide™ ISA 703에서는 약간 덜한 정도로 존재한다. 가장 바람직하게는, Montanide™ ISA-720을 사용하고, 7:3 (w/w)의 오일 대 물 비가 사용된다. 기타 바람직한 수중유 에멀젼 아쥬반트에는 WO 제95/17210호 및 EP 제0 399 843호에 기재된 것들이 포함된다.
소분자 아쥬반트의 사용이 또한 본원에서 고려된다. 본원에 유용한 소분자 아쥬반트의 한 가지 유형은 미국 특허 제4,539,205호, 제4,643,992호, 제5,011,828호 및 제5,093,318호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 인용됨)에 기재된 7-치환된-8-옥소- 또는 8-설포-구아노신 유도체이다. 이들 물질 중에서, 7-알릴-8-옥소구아노신(록소리빈)이 특히 바람직하다. 상기 분자는 항원-(면역원-) 특이적 반응을 유도시키는데 특히 유효한 것으로 밝혀졌다.
바람직하고 유용한 아쥬반트에는 모노포스포릴 지질 A(MPL
Figure 112005045808790-PCT00017
); 제조업체 [Corixa Corp사(Seattle, WA), 구 Ribi Immunochem사(Hamilton, Montana)]에 의해 제조된 널리 공지된 아쥬반트인 3-데아실 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL
Figure 112005045808790-PCT00018
)가 포함된다. 이러한 아쥬반트는 세균으로부터 추출된 3가지 성분, 즉 모노포스포릴 지질(MPL
Figure 112005045808790-PCT00019
) A, 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 2% 스쿠알렌/Tween
Figure 112005045808790-PCT00020
80 에멀젼 중의 세포벽 골격(CWS)(MPL+TDM+CWS)를 함유한다. 이러한 아쥬반트는 GB 제2122204B호에 교시된 방법에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 형태의 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A는 직경이 0.2㎛ 미만인 작은 입자 크기를 갖는 에멀젼 형태이다(EP 제0 689 454 B1호).
가장 바람직한 것은 아미노알킬 글루코사미드 4-포스페이트(AGPs)로 불리우는 MPL
Figure 112005045808790-PCT00021
아쥬반트와 구조적으로 관련된 화합물, 예를 들면, Corixa Corp.사에서 시판중인 RC-529 명칭의 {2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-에틸-2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라-데카노일]-2-[(R)-3-테트라-데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-p-D-글루코피라노시드 트리에틸암모늄 염}이다. RC-529 아쥬반트는 Corixa Corp.사로부터 시판중인 RC-529SE로서 판매된 스쿠알렌 에멀젼으로, 및 RC-529AF로서 수성 제형으로 입수 가능하다[참조: 미국 특허 제6,355,257호 및 제6,303,347호; 미국 특허 제6,113,918호 및 미국 공개번호 제03-0092643호].
추가의 가장 바람직한 아쥬반트에는 Coley Pharmaceutical Group사로부터 입수 가능한 CpG(또한, ODN; 플랭킹 서열과 함께 CpG 뉴클레오티드 모티프를 1회 이상 함유하는 올리고뉴클레오티드); Aquila Biopharmaceuticals, Inc.사로부터 입수 가능한 QS21로 명명된 아쥬반트; 수중유 에멀젼인 QS21 및 MPL 이온을 함유하는 SKB사(현재, Glaxo-SmithKline사)에서 입수 가능한 SBAS2(현재, ASO2); 미국 특허 제4,767,842호에 기재되어 있는 소위 무라밀 디펩티드 유사체; 및 Chiron Corp.사에서 시판중인 MF59가 포함된다[참조: 미국 특허 제5,709,879호 및 제6,086,901호].
보다 특히, 남미산 나무 퀴랄자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 껍질로부터 유래된 아쥬반트 활성을 갖는 면역학적 활성의 사포닌 분획(예, Quil™ A)가 또한 유용하다. Quil™ A의 유도체, 예를 들어 QS21(Quil™ A의 HPLC 정제된 분획 유도체) 및 이의 제조 방법은 미국 특허 제5,057,540호에 기재되어 있다. QS21(또한, QA21로서 공지됨) 이외에, QA17과 같은 기타 분획물이 또한 기재되어 있다.
무라밀 디펩티드 아쥬반트에는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thur-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 지칭됨), 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미티올-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 1983A, MTP-PE로서 지칭됨)이 포함된다.
바람직한 아쥬반트 혼합물에는 3D-MPL과 QS21의 배합물(EP 제0 671 948 B1호), 3D-MPL과 QS21을 포함하는 수중유 에멀젼(WO 제95/17210호, PCT/EP98/05714), 기타 담체와 제형화시킨 3D-MPL(EP 제0 689 454 B1호), 콜레스테롤 함유 리포좀 중에 제형화시킨 QS21(WO 제96/33739호), 또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드(WO 제96/02555호)가 추가로 포함된다. 대안적 아쥬반트에는 WO 제99/52549호에 기재된 것, 및 폴리옥시에틸렌 에테르의 비-미립형 현탁제(UK 특허원 제9807805.8호)가 포함된다.
(a) 톨-유사 수용체-4(TLR-4)에 대한 효능제, 예를 들어 MPL
Figure 112005045808790-PCT00022
또는 구조적으로 관련된 화합물, 예를 들어 RC-529 아쥬반트 또는 지질 A 모사체, 및 (b) 톨-유사 수용체-9(TLR-9)에 대한 효능제, 예를 들어 비-메틸화 올리고 데옥시뉴클레오티드-함유 CpG 모티프 중의 아쥬반트 하나 또는 둘다를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 희석제 중에서 상기 언급된 면역원성 HBc-함유 입자 또는 이러한 면역원성 입자와 화학적으로 결합된 아쥬반트를 혼합하여 B형 간염 바이러스에 만성적으로 감염된 사람과 같은 적합한 숙주 동물을 면역시키는 경우, 이러한 아쥬반트는 면역화된 숙주에서 감마-생성 CD 8+, CD 4+ T 세포 및 세포독성 T 림프구의 생성을 증강시킨다. 또한, 백반이 이러한 아쥬반트 혼합물중에 존재할 수 있다. 초기 결과는, 백반은 IgG1-형의 항체 생성을 촉진시키는 Th2 면역 반응을 증강시키는 경향이 있는 반면, RC-529-유형의 아쥬반트는 IgG2a 및 IgG2b 항체의 생성을 촉진시키는 Th1 면역 반응, 및 HBc 입자가 면역원을 포함하는 경우에서와 같이 T 세포 면역원이 존재하는 경우 T 세포 반응을 촉진시키는 것으로 지시하고 있다.
가장 바람직한 아쥬반트 혼합물은 미국 특허 제6,113,918호에 기재된 바와 같이 아미노알킬 글루코사민 포스페이트를 추가로 함유하는 안정한 유중수 에멀젼을 포함한다. 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 중에서, RC-529로서 공지된 분자인 {(2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노] 에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시-테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-p-D-글루코피라노시드 트리에틸암모늄 염)}이 가장 바람직하다. 바람직한 유중수 에멀젼은 WO 제9956776호에 기재되어 있다.
바람직한 사용 방법에서, 아쥬반트 및 면역원은 키트 형태로 제공된다. 키트에는 재조합으로 제조된 면역원성 키메라 입자의 하나의 용기 및 아쥬반트의 용기가 포함된다. 2개 용기의 내용물은 사용전, 바람직하게는 환자에게 투여 직전 함께 혼합된다. 가장 바람직한 사용 방법에서, 재조합으로 제조된 키메라 입자는 동결건조된 케이크로서 제공된다. 동결건조된 케이트는 수성의 아쥬반트 제형과 함께 재구성된다.
아쥬반트는 아쥬반트 양으로 활용되는데, 해당 아쥬반트, 포유류 및 재조합 HBc 키메라 면역원에 따라서 다양할 수 있다. 전형적인 양은 면역시킬 때마다 약 1㎍ 내지 약 1mg으로 다양할 수 있다. 당해 기술분야 숙련가는 적당한 농도 또는 양을 용이하게 결정할 수 있다.
백신은 전형적으로 비경구 투여용으로 제형화된다. 예시되는 면역화는 피하(SC), 근육내(IM), 정맥내(IV), 복강내(IP) 또는 피내(ID)로 수행된다. 기타 투여 방식에 적합한 부가의 제형에는 좌제, 및 몇몇 경우에는, 경구용 제형이 포함된다. 문헌[참조: Neirynck et al., (Oct. 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에 논의된 바와 같이, 접종용 비내 분무제 사용이 또한 고려된다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체에는, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있으며; 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제형에는 통상적으로 이용된 부형제, 예를 들면 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등이 포함된다.
백신 조성물은 용액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방출 제형 또는 산제 형태로 제조되고, 활성 성분으로서, 바람직하게는 입자로서 면역학적 유효량의 HBc 키메라 또는 HBc 키메라 접합체를 함유한다. 전형적인 조성물에서, 바람직한 HBc 키메라 또는 HBc 키메라 접합체의 면역학적 유효량은 앞서 인지된 바와 같이, 용량당 활성 성분 약 1㎍ 내지 약 1mg, 보다 바람직하게는 약 5㎍ 내지 약 50㎍이다.
상기 HBc 키메라 입자 및 HBc 키메라 입자 접합체는 중성 또는 염 형태로서 백신으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가 염(해당 단백질 또는 합텐의 유리 아미노 그룹과 형성됨)이 포함되고, 이는 무기 산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 형성된 염이다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 및 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수도 있다.
또다른 양태에서, 고려된 HBc 키메라를 암호화하는 유전자를 적합하게 약독화된 장내 세균, 예를 들면 에스. 티피(S. typhi), 에스. 티피무륨(S. typhimurium), 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드 또는 이. 콜라이 내로 형질감염시킨 백신 또는 접종물이 고려된다. 약독화 또는 무독력 에스. 티피 및 에스. 티피무륨, 및 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드의 예가 전술된 참조문헌에 논의되어 있다. 이들 백신 및 접종물은, 특히 인플루엔자, 효모, 예를 들면 아스퍼질루스(Aspergillus) 및 캔디다(Candida), 바이러스, 예를 들면, 폴리오, 구제역, A형 간염, 및 세균, 예를 들면, 콜레라, 살모넬라 및 이. 콜라이, 및 IgG 전신 반응 이외에도 또는 이 반응 대신 점막성 IgA 반응이 요망되는 경우와 같이 코, 장기 및 생식기의 점막을 통하여 전염되는 질병 또는 감염 질병에 대항해 사용하도록 고려된다.
장내 세균을 동결 건조시키고, 무수 약제학적으로 허용되는 희석제와 혼합하며, 섭취용 정제 또는 캡슐제로 만든 다음, 통상의 고체 상 투약에서과 같이 숙주 동물에게 섭취시킨다. 또한, 이들 세균성 백신의 수성 제제를 경구, 비내, 직장 또는 질내 투여에 의해 점막성 면역에 사용하도록 적응시킨다.
고려된 키메라 분자 입자를 함유하는 식물 물질을 사용하여 경구 면역시키는 것은, 형질전환성 식물 조직, 예를 들면, 당근과 같은 뿌리, 또는 쌀 또는 옥수수와 같은 씨앗을 단순히 섭취함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 경우, 구강 또는 위장관 내의 물은, 면역시키기 위해 통상적으로 사용되는 수성 매질을 제공해주고, 주변 식물 조직은 약제학적으로 허용되는 희석제를 제공해준다.
백신은 제형과 혼화성인 방식으로, 및 치료적으로 유효하고 면역원성인 양으로 투여된다. 투여될 양은 치료될 대상체, 대상체의 면역계가 항체를 합성하는 능력, 및 목적하는 보호 정도에 따라 달라진다. 투여해야 하는 활성 성분의 정확한 양은 담당의의 판단에 따르며, 각각의 개인에게 대해 고유하다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 개개인 마다 수십㎍의 정도의 활성 성분이다. 초기 투여 및 부스터 투여에 적합한 섭생 또한 다양하지만, 초기 투여한 다음 일정한 간격(주 또는 개월)으로 후속 주사 또는 기타 투여하는 유형을 띤다.
HBV-감염된 개체에서 치료적 면역 반응을 유도하는 대안적 방법은, 면역원성 키메라 입자를 환자의 수지상 세포에 생체외 투여한 후, 수지상 세포를 환자에게 재투여하는 것이 주지되고 있다. 체내로부터 수지상 세포를 분리하는 방법 및 이들을 항원의 존재하에 배양하는 방법은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있다[참조: Nestle et al (2001) Nature Medicine 7, 761-765 및 인용문헌].
따라서, 본 발명의 또다른 양태는 HBV에 만성으로 감염된 환자에서 HBc에 대한 T 세포 반응을 유도하는 방법이다. 상기 방법은 환자의 체내로부터 수지상 세포를 분리하는 단계, 수지상 세포를 면역원성 키메라 입자와 접촉시키는 단계 및 상기 접촉을 유지시켜 활성화된 수지상 세포를 형성시키는 단계, 임의로 수지상 세포를 사이토킨, 예를 들어 GMCSF로 자극하는 단계에 이어 활성화된 수지상 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 다음 비-제한적 예로 예시된다.
실시예 1: B 세포 에피토프-함유 키메라 제조
A. pKK223-3의 변형된 형태인 플라스미드 벡터 pKK223-3N의 제조
플라스미드 벡터 pKK223-3(Pharmacia사)을 독특한 NcoI 제한 부위를 수립함으로써 변형시켜 NcoI-HindIII 제한 단편으로서 HBc 유전자의 삽입 및 이. 콜라이 숙주 세포에서의 후속적 발현을 가능하게 하였다. pKK223-3 플라스미드 벡터를 변형시키기 위해, PCR 프라이머 pKK223-3/433-452-F 및 pKK223-NcoI-mod-R, 및 주형으로서 pKK223-3을 사용하여 새로운 SphI-HindIII 단편을 제조하였다. 이러한 PCR 단편을 제한 효소 SphI 및 HindIII으로 절단하여 467bp의 단편을 제공하고, 이어서 이를 4106bp의 pKK223-3 벡터 단편과 연결하여 본래 480bp의 SphI-HindIII 단편을 효과적으로 대체시켰다. 따라서, 이로써 수득한 플라스미드(pKK223-3N)는 모 플라스미드보다 13bp 짧고, 도입된 NcoI 부위 상단에 변형된 뉴클레오티드 서열을 함유한다(도 1 참조. 여기서, 대쉬는 염기 부재를 나타낸다). 최종 플라스미드인 pKK223-3N의 크기는 4573bp이다. 플라스미드 pKK223-3N에서의 제한 부위는 도 1에 제시되어 있고, 플라스미드 pKK223-3N을 형성시키기 위해 pKK223-3에 변화시킨 뉴클레오티드는 하기 제시된 바와 같이 밑줄로 제시되어 있다.
Figure 112005045808790-PCT00023
B. V1 및 V2 클로닝 벡터의 제조
합성 dsDNA 단편의 면역우성 루프 영역 내로의 지향성 삽입을 수용할 수 있는 변형된 HBc149 유전자를 PCR을 사용하여 작제하였다. [아미노산 E77과 D78 사이에 삽입물을 수용하는 플라스미드는 V1로 명명되고, D78과 P79 사이에 삽입물을 수용하는 플라스미드는 V2로 명명된다]. 상기 HBc149 유전자를, 2개의 PCR 프라이머 쌍(이중 하나는 아미노 말단을 증폭시키고, 다른 하나는 카복실 말단을 증폭시킨다)을 사용하여 이등분으로 증폭시킨다. V1의 경우에는, PCR 반응 생성물(N-말단 및 C-말단)이 둘다 246bp의 단편이고; V2의 경우에는, 생성물이 249bp 단편(N-말단) 및 243bp 단편(C-말단)이다.
이와 같이 제조된 N-말단 단편을 NcoI 및 EcoRI로 분해하고, C-말단 단편을 EcoRI 및 HindIII로 분해하였다. 이어서, 상기 V1 및 V2 단편 쌍을 공통의 EcoRI 오버행에서 함께 연결하였다. 이어서, 이로써 생성된 NcoI-HindIII 단편을, NcoI 및 HindIII로 분해시켜 제조한 pKK223-3N 벡터 내로 연결시켰다.
B 세포 에피토프를 V1 및 V2 플라스미드 내로 삽입하기 위해, 플라스미드를 EcoRI 및 SacI 제한 효소로 분해시켰다. 이어서, 5' EcoRI 및 3' SacI 오버행을 함유하는 합성 dsDNA 단편을 삽입하였다. 모든 경우에서, 제한 부위에 의해서 암호화된 V1 및 V2, 글리신-이소루신(EcoRI) 및 글루탐산-루신(SacI) 아미노산 쌍은 상기 삽입된 B 세포 에피토프를 플랭킹한다. 이와 같이 삽입된 제한 부위는 다음 프라이머에서 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005045808790-PCT00024
Figure 112005045808790-PCT00025
면역우성 루프내에 피. 팔시파룸 유래의 CS-반복체 에피토프 및 N-말단 시스테인을 함유하는 키메라 입자를 발현시키기 위한 벡터
2개의 발현 벡터[V2.Pf1(N-MGCELDP) 및 V2.Pf1(N-MGCDIDP)]를 제조하여 키메라 입자를 안정화시키는 N-말단 시스테인 잔기의 능력을 측정한다. 벡터 V2.Pf1(N-MGCELDP)를 제조하기 위해서, 올리고뉴클레오티드 HBc(MGCELDP)-NcoI-F 및 HBc149/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pf1로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로서 수득한 528bp의 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 동일한 2개의 효소로 절단된 pKK-223-3N내로 삽입한다.
벡터 V2.Pf1(N-MGCDIDP)를 제조하기 위해서, 올리고뉴클레오티드 HBc(MGCDIDP)-NcoI-F 및 HBc149/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pf1로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로써 수득한 528bp의 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 동일한 2개의 효소로 절단된 pKK-223-3N내로 삽입한다.
Figure 112005045808790-PCT00026
C. V7 클로닝 벡터의 제조
T 세포 에피토프와 HBc 키메라의 C-말단이 융합할 수 있도록, 새로운 벡터 V7을 작제하였다. 독특한 EcoRI 및 SacI 제한 부위를 발린-149와 HindIII 부위 사이에 삽입하여 합성 dsDNA의 EcoRI-HindIII(또는 EcoRI-SacI) 제한 부위로의 지향 성 삽입을 촉진시켰다. 하기의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 아미노-말단에 NcoI 제한 부위를 함유하고, 카복실-말단에 EcoRI, SacI 및 HindIII 부위를 함유하는 HBc 149 유전자를 증폭시켰다. PCR 반응 생성물(479bp)을 NcoI/HindIII로 분해하고, pKK223-3N으로 클로닝하여 V7을 형성시켰다.
T 세포 에피토프를 삽입하기 위해서, 플라스미드(V7)를 EcoRI/HindIII(또는 EcoRI-SacI)로 분해하고, EcoRI/HindIII(또는 EcoRI/SacI) 오버행을 갖는 합성 dsDNA 단편을 V7내로 연결하였다. 모든 V7 작제물에 있어서, 본래의 HBc의 마지막 아미노산(발린-149)과 상기 삽입된 T 세포 에피토프의 제1 아미노산을, EcoRI 제한 부위를 형성하는 뉴클레오티드에 의해 암호화된 글리신-이소루신 디펩티드 서열에 의해 분리시킨다. EcoRI/SacI에 삽입된 에피토프에 있어서, 상기 SacI 부위에 의해 비롯된, T 세포 에피토프 다음, 종결 코돈 전에 부가의 글루탐산-루신 잔기가 존재한다. 또한, 제한 부위는 제시된 프라이머에서 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005045808790-PCT00027
D. V12 발현 작제물의 제조
아미노산 78과 79 사이에 B 세포 에피토프를 함유할 뿐만 아니라 발린-149의 T 세포 에피토프 하단을 함유하는 V12 벡터를 V2 및 V7 벡터로부터 작제한다. EcoRI/HindIII에 삽입된 T 세포 에피토프를 함유하는 V7 벡터의 카복실 말단을, 2개의 PCR 프라이머(HBc-P79/SacI-F 및 pKK223-2/4515-32R)를 사용하여 증폭시켜, SacI 및 HindIII 제한 부위로 플랭킹된, 아미노산 79-149에 상응하는 dsDNA 단편 + T 세포 에피토프를 제공한다.
상기 PCR 생성물을 SacI 및 HindIII로 절단한 다음, 이와 동일한 2개의 효소로 절단하여 제조한 목적하는 V2 벡터 내로 클로닝시킨다. PCR 프라이머는 HBc 유전자의 아미노산 149 다음에 존재하는 T 세포 에피토프에 상관없이, 모든 V7 유전자의 카복실 말단을 증폭할 수 있게 해준다.
이러한 접근의 보편성의 하나의 예외는 기존의 V12 작제물로부터 제조된, Pf-CS(C17A) 돌연변이를 함유하는 V12 작제물을 제조하는 경우에 있다. 이러한 경우, V12 작제물을 HBc149/NcoI-F(서열번호: 180) 및 C17A 돌연변이를 촉진시키는 미스-매치된 PCR 역프라이머(서열번호: 292)를 사용하여 증폭시켰다. 이로써 수득한 PCR 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해하고, pKK223-3N(미리 동일한 효소로 절단됨)내로 다시 클로닝시켰다. 제한 부위가 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005045808790-PCT00028
E. V2 내로 삽입된 피. 팔시파룸 CS-반복체 B 세포 에피토프
V2 및 V7 작제물에 있어서, 관심있는 B 세포 에피토프(V2) 또는 T 세포 에피 토프(V7)를 암호화하는 합성 dsDNA 단편을 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입한다. 관심있는 B 및 T 세포 에피토프를 암호화하는 합성 dsDNA 단편은, 상보성 일본쇄 DNA 올리고뉴클레오티드를 등몰 농도로 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열한 다음, -1℃/분의 비율로 실온으로 냉각시킴으로써 제조한다. 이러한 어닐링 반응을 TE 완충액에서 수행한다. 이본쇄 DNA가 상기 제시된 암호화된 에피토프 서열과 함께 다음에 제시된다. 파운드 부호 #는 정지 코돈의 존재를 지시하기 위해 몇몇 아미노산 잔기 서열에 사용된다.
Figure 112005045808790-PCT00029
Figure 112005045808790-PCT00030
Figure 112005045808790-PCT00031
Figure 112005045808790-PCT00032
Figure 112005045808790-PCT00033
Figure 112005045808790-PCT00034
Figure 112005045808790-PCT00035
Figure 112005045808790-PCT00036
실시예 2: 검정 과정
A. 항원성
1. 입자 ELISA
정제된 입자를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6)에서 10㎍/ml의 농도로 희석시키고, ELISA 스트립 웰 상으로 피복시켰다(50㎕/웰). 상기 ELISA 스트립을 실온에서 밤새 항온처리하였다(약 18시간). 그 다음 날, 상기 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4, 0.05% Tween
Figure 112005045808790-PCT00037
-20]으로 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시켰다(75㎕/웰). ELISA 스트립을 필요할 때까지 -20℃에서 무수 저장한다.
입자의 항원성을 결정하기 위해, PBS 중의 1% BSA를 사용하여 항혈청을 희석키고, 50㎕/웰을 항원-피복된 ELISA 웰에 가한다. 혈청을 1시간 동안 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 세척하고, 항-마우스(IgG)-HRP(The Binding Site사, San Diego, CA; HRP = 서양고추냉이 퍼옥시다제) 접합체(50㎕/웰) 또는 기타 적당한 항체를 사용하여 30분 동안 프로빙시킨다. ELISA 세척 완충액으로 세척한 후, TM 블루 기질(50㎕/웰)을 부가함으로써, 상기 반응을 가시화한다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 450nm에서 설정된 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독한다.
2. 합성 펩티드 ELISA
20개 아미노산 잔기 합성 펩티드(NANP)5를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6)에서 2㎍/ml의 농도로 희석시키고, ELISA 스트립 웰 상으로 피복시킨다(50㎕/웰). 후드에서 밤새(약 18시간) 항온처리함으로써, 펩티드를 상기 웰 상으로 건조시킨다. 그 다음날 아침, 상기 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.05% Tween
Figure 112005045808790-PCT00038
-20]으로 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시킨다(75㎕/웰). ELISA 스트립을 필요할 때까지 -20℃에서 무수 저장한다.
입자의 항체 항원성을 결정하기 위해, PBS 중의 1% BSA를 사용하여 항혈청(모노클로날 또는 폴리클로날)을 희석시키고, 50㎕/웰을 항원-피복된 ELISA 웰에 가한다. 혈청을 1시간 동안 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 세척하고, 항-마 우스(IgG)-HRP 접합체(50㎕/웰에서 상기와 같음) 또는 기타 적당한 항체를 사용하여 30분 동안 프로빙시키며, ELISA 세척 완충액으로 다시 세척한 후, TM 블루 기질(100㎕/웰)을 부가함으로써 가시화한다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 450nm에서 설정된 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독한다.
B. 입자의 면역원성
입자의 면역원성을 검정하기 위해, 프로인트 완전 아쥬반트 중의 20㎍의 입자를 사용하여 마우스를 복강내 면역시킨 다음, 4주 후에, 프로인트 불완전 아쥬반트 중의 10㎍를 사용하여 부스터시킨다. 2, 4, 6 및 8주째에 마우스로부터 채혈한다.
C. 열 안정성 프로토콜
50mM NaPO4, pH 6.8을 사용하여, 정제된 입자를 1mg/ml의 농도로 희석시키고, 아지드화나트륨을 0.02%의 최종 농도로 첨가하여 세균 증식을 예방한다. 입자를 37℃에서 항온처리하고, 목적하는 시점에서 분취량을 취한다. 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액(환원성)과 혼합하고 15% SDS-PAGE 겔 상에서 전개시킨다. Coomassie 블루를 사용하여 겔을 염색시킨 후 분석한다.
D. 하이브리드 입자의 분석적 겔 여과 분석
정제된 하이브리드 HBc 입자의 분석적 겔 여과 분석은 25ml Superose
Figure 112005045808790-PCT00039
6 HR 10/30 크로마토그래피 칼럼(Amersham Pharmacia # 17-0537-01) 및 BioCAD™ SPRINT 관류 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행한다. UV 검출기는 260 및 280nm의 파장 둘다를 모니터하도록 설정된다. 상기 칼럼을 0.75ml/분의 유속으로 완충액(50mM NaP04, pH 6.8)의 3 칼럼 용적(CV; 약 75ml)으로 평형시킨다.
분석하고자 하는 입자를 50mM NaP04, pH 6.8을 사용하여 1mg/ml의 농도가 되도록 희석시킨다. 이어서, 상기 샘플 200㎕를 200㎕ 루프 상에 부하하고, 상기 칼럼 상에 주사한다. 샘플을 0.75ml/분의 유속으로 50mM NaP04, pH 6.8을 이용하여 상기 칼럼으로부터 용출시킨다. BioCAD™ 소프트웨어(PerSeptive™)을 사용하여, 280nm 추적을 통합하고, 결과를 제공하였다.
실시예 3: 280:260 흡광도 비 결정
단백질 샘플을 인산염 완충액 식염수(PBS), pH 7.4를 사용하여 0.1 내지 0.3mg/ml의 농도로 희석시킨다. PBS를 사용하여 분광광도계를 블랭킹하고, 단백질 샘플의 흡광도를 260nm 및 280nm의 파장에서 측정한다. 이어서, 280nm에서 측정한 샘플에 대한 흡광도 값을 260nm에서 측정한 동일 샘플에 대한 흡광도 값으로 나누어 소정의 샘플에 대한 280:260 흡광도 비를 결정한다. 본래의 입자(HBc 183), 잔기 위치 149 다음에 절단된 HBc 입자(HBc 149), 및 그밖에 본원에서 동정된 수개의 HBc 키메라를 포함한, 몇몇 샘플에 대해 수득된 비가 다음 표 8에 제시되어 있다. 전장의 입자 ICC-1559는 문헌[참조: Neirynck et al., (Oct 1999) Nature Med., 5(10): 1157-1163]에 처음 보고된 입자의 제제인 반면, 전장의 입자 CV-1607은 폴 리펩티드 위치 17 및 19(서열번호 9의 X17 및 X19)에서 M2 폴리펩티드 시스테인을 세린 잔기로 돌연변이시킨 유사한 입자이다.
Figure 112005045808790-PCT00040
실시예 4: 절단된 HBc 입자의 C-말단에서의 시스테인
A. 시스테인 잔기를 하이브리드 HBc 입자의 C-말단에 부가
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여, 하이브리드 HBc 입자를 발현시키는 유전자를 N-말단에 부가된 시스테인을 함유하는 HBc 키메라의 C-말단에 시스테인 또는 시스테인-함유 펩티드를 도입하여 용이하게 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들면, 서열번호 287을 암호화하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 적합한 2차 프라이머와 함께 사용하여 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시키고, 시스테인 코돈을 코돈 V149와 정지 코돈 사이에 혼입시킬 수 있다. 예시적 작제물은 하기 논의되는 바와 같이 ICC-1492로서 지칭된다. 또한, 하기 논의되는 V2.Pf1[N-M2(17-24/C19S)]의 제조를 참조한다.
B형 간염 코어 입자를 183(또는 185, 바이러스 아형에 따라 다름)에서부터 140까지 절단하고, 미립자 바이러스-유사 입자로 어셈블리할 수 있는 능력을 보유시킬 수 있다. 다수의 그룹은, 아미노산 150이 아르기닌-풍부 C-말단 도메인의 첫번째 아르기닌 잔기를 나타내기 때문에 아미노산 149까지 절단된 입자를 사용하였다.
실시예 5: 인플루엔자 M2 작제물
최근에, 문헌[참조: Neirynck et al., (Oct 1999) Nature Med., 5(10): 1157-1163 and WO 99/07839]에는 아미노산 잔기 1-4가 결여된, 전장의 HBc 입자(HBc183)의 N-말단에 대한 M2의 24 아미노산 세포외 도메인의 융합물이 보고되었다. 본원에서 IM2HBc로서 지칭된 상기 작제물의 도시적 제시가 다음에 나타나 있으며, 여기서, 24량체가 HBc의 N-말단에 연결된다.
Figure 112005045808790-PCT00041
한 가지 예시적인 제조에서는, M2 에피토프를 B형 간염 코어의 면역우성 루프 내로 삽입하고, ICC-1475로서 지칭된 입자를 성공적으로 발현 및 정제하였는데, 이는 이러한 삽입 및 정제에 대해 전술된 기술을 사용하여 수행하였다. M2 본래의 위치 17 및 19에서의 2개의 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킨, M2 에피토프의 돌연변이된 변형물을 또한, 상기 면역우성 루프에서 발현시키고(ICC-1473 입자), 이로써 생성된 입자를 정제하였다. 이들 두 입자가 다음에 도식적으로 예시된다.
Figure 112005045808790-PCT00042
ICC-1473 입자 작제물은 본래의 서열(ICC-1475)과 비교할 때 대략 7배 정도 더 정제된 입자를 생성시켰다. 시스테인 잔기의 돌연변이가 해당 입자의 보호 효능을 변화시키는지를 결정해야 한다. 그러나, HBc의 면역우성 루프 상에 전달된 에피토프는 통상적으로, 이들이 다른 영역(N-말단 포함)과 융합되어 이로써 생성된 입자가 감소된 항-HBc 면역원성을 나타내는 경우와 비교해서 상당히 더 면역원성이다.
M2 N-말단 24량체 에피토프를 C-말단 절단된 B형 간염 코어 입자의 N-말단에 융합시킨 입자가 또한 제조되었다. 이러한 작제물(ICC-1438)은 또한, N-말단 프리코어 서열(서열번호 289)을 함유하였다. 하이브리드 단백질의 말단에 단일 시스테인 잔기를 함유하는 유사한 작제물(ICC-1492)을 제조하였는데, 이러한 경우 상기 시스테인 잔기는 HBc 유전자의 Val-149 바로 다음에 온다. 이들 작제물이 다음에 도식적으로 제시된다.
Figure 112005045808790-PCT00043
천연 HBc 개시인자 메티오닌으로부터 해독 개시에 대해 경계하기 위해서는, 상기 잔기에 대한 코돈을 이소루신 잔기를 암호화하도록 돌연변이시켰다는 것을 주지해야 한다. EcoRI(GI) 및 SacI(EL) 제한 부위로부터 비롯된 잔기가 밑줄쳐져 있다. 프리코어 서열은 밑줄쳐진 EL 잔기와 "-HBc(2-149)" 사이에 기재되어 있다.
SDS-PAGE에 의한 분석 결과, 제조시, ICC-1438 단량체 작제물이 도 10의 SDS-PAGE 겔 상의 부가의 분자량 대조군으로서 작용하는 ICC-1492(레인 3), HBc-149(레인 1), ICC-1475(레인 4) 및 ICC-1473(레인 5)와 비교해서 불안정한 것으로 나타났다. 이러한 ICC-1438 단량체의 불안정성은 해당 입자의 분석적 겔 여과를 이용해서는 명백하지 않았다.
ICC-1475(도 10, 레인 4)는 ICC-1438 및 ICC-1492 보다 분자량이 약간 더 작은 것으로 예상되는데, 이는 전자 2개의 작제물이 면역우성 루프 내에 직접적으로 삽입된 M2 에피토프를 함유하므로, ICC-1438 및 ICC-1498에 존재하는 프리코어 서열(서열번호 259)이 결여되어 있기 때문이다. 예상된 바와 같이, ICC-1492는 ICC-1475 및 ICC-1473 보다 더 크지만; ICC-1492 + C-말단 시스테인 잔기와 동일한 ICC-1438은 외견상 절단으로 인해, ICC-1475 및 ICC-1473 보다 더 크지 않다는 것은 명백하다.
HBc N-말단(도메인 I) 또는 루프(도메인 II)에 연결된 상기 논의된 바와 같은 M2 N-말단 세포외 서열을 함유하고, 또한 HBc의 C-말단(도메인 IV)에 시스테인 잔기를 함유하는 작제물이 또한 고려된다.
시스테인 잔기와, 최소의 M2-유래된 서열을 혼입시키기 위한 면역우성 루프 융합물을 함유하는 하이브리드 HBc 입자의 아미노-말단을 변형시키기 위해, 일련의 합성 올리고뉴클레오티드를 합성한다. V2.Pfl(N-M2(17-24/C17S)를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 M2(17-24/C17S)-NcoI-F 및 HBcl49/HindIII-R을 사용하여, 벡터 V2.Pfl로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로써 생성된 546bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 동일한 두 효소로 절단된 pKK-223-3N 내로 삽입시킨다.
V2.Pfl[N-M2(17-24/C19S)]를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 M2(17-24/C19S)-NcoI-F 및 HBcl49/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pfl에서 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로써 생성된 540bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 동일한 두 효소로 절단시킨 바 있는 pKK-223-3N 내로 삽입하였다.
Figure 112005045808790-PCT00044
실시예 6: 양 N-말단 및 C-말단 시스테인 잔기를 함유하거나 함유하지 않는 HBc 키메라 분자
잔기 149에서 이의 C-말단을 절단한 HBc의 N-말단에서 또는 근처에서 펩티드-결합된 인플루엔자 A, M2 단백질의 잔기 1-24를 함유하는, 일련의 HBc 키메라 분자-함유 입자를 제조하였다. 성분 키메라 단백질 분자는 M2 서열 또는 변이체를 포함한 상이한 N-말단 서열을 함유하였고, 몇몇은 C-말단 시스테인 잔기를 함유하였다.
다음 표 9에 열거된 정제된 모든 입자를 분석적 크기 배제 크로마토그래피함으로써 분석하여, 정제 후 미립형 구조물의 잔류 시간을 평가하였다. N-말단 시스테인 잔기를 전혀 함유하지 않는 ICC-1603으로 명명된 입자는 서브-미립형 구조물로 도로 분해(disassembly)되었다는 증거를 나타내었고, 이는 상기 단백질이 1500초 범위 내에서 용출되었기 때문이다(입자는 대략 1000초에서 용출된다).
N-말단 M2 서열에서 2개의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 돌연변이된 것을 제외하고는 ICC-1603 입자와 유사한 입자 ICC-1590을 유사하게 분석한 결과, 상기 작제물이 정제 후 여전히 미립형인 채로 유지된 것으로 밝혀졌고, 용출은 약 1000초에서 이루어졌으며, 이는 하이브리드 입자에 대해 전형적인 수치이다(도 4). ICC-1590 입자에 대한 분해 증거는 없었다.
이의 키메라 단백질이 또한 2개의 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 ICC-1560 입자를 분석한 결과, 이것이 어느 정도의 분해를 나타내긴 하였지만, 정제 후 또한 미립형인 것으로 밝혀졌고(도 5), 이는, 안정화가 ICC-1590 입자에 대해서 처럼 그렇게 강건하지는 않다는 것을 제시해준다. ICC-1590 입자의 N-말단 입체 배치와 ICC-1560 입자의 N-말단 입체 배치를 비교한 결과(다음 표 11), ICC-1560 입자에서 2개의 시스테인 잔기의 상대적 위치가, 3개 아미노산 잔기의 결실(DEL)을 통하여 ICC-1590 입자에 비해 3개 아미노산 잔기 만큼 이동되었다는 사실이 나타났고, 이는 상기 시스테인 잔기가, 최적으로 가교 결합할 수 있도록 코어 유전자 출발점으로부터 최소한의 거리로 떨어지는 것이 요구될 수 있다는 것을 지시해준다.
실시예 7: M2 또는 M2 변이체 서열과 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 입자
ICC-1603 입자는 정제 후 신속하게 분해되는 것으로 도 3에 도시되어 있다. ICC-1605 입자를 포함하는 HBc 키메라 분자는 ICC-1603 입자와 유사한데, 단, ICC-1605 성분 키메라 분자는 단일 C-말단 안정화 시스테인을 갖는다. ICC-1605 입자의 발현을 지시하는 플라스미드를 제조하여, C-말단 시스테인 잔기를 ICC-1603 입자에 부가하는 것이 이러한 입자에 보다 큰 안정성을 부여해줄 수 있는지를 결정하였다. 정제 후, ICC-1605 입자를 분석적 크기 배제 크로마토그래피하여 분석하였다(도 6).
본 연구 결과는, 입자 안정화가 ICC-1603 입자에 대해서 보다는 더 완전하지만, 2개의 아미노-말단 시스테인 잔기를 함유하고, C-말단 안정화 시스테인은 전혀 함유하지 않는 ICC-1590 입자와 비교해서는 불완전하다는 사실을 입증해주었다. 상당량의 ICC-1605가 미립형인 채로 잔존하긴 하였지만, 광범위하게 용출된 서브-미립형 구조물의 이종 혼합물이라는 증거가 있다. 이러한 관찰 결과는, 상기 하이브리드 입자(ICC-1603)의 경우에는 ICC-1605 입자에서 발견된 바와 같은 C-말단 안정화가, ICC-1590 입자에서 발견된 N-말단 안정화에 대한 것 보다 덜 완전하다는 사실을 제시해준다.
하이브리드 입자의 배합된 아미노-말단 시스테인 안정화와 카복실-말단 시스테인 안정화의 혼화성을 연구하기 위해, ICC-1604 입자의 발현을 지시하는 발현 플라스미드를 작제하였다. ICC-1604 입자의 성분 키메라 분자는 본래의 M2 폴리펩티드 서열에 존재하는 2개의 아미노-말단 안정화 시스테인 잔기를 모두 함유하고 있을 뿐만 아니라(ICC-1590에서와 같음) C-말단 안정화 시스테인도 함유하고 있다(ICC-1605 입자에서와 같음). ICC-1604 입자를 분석한 결과, 이들이 정제 후 균질한 미립형 상태를 유지한 것으로 나타났는데(도 7), 이는 2가지 안정화 방법이 상보적이고, 서로 함께 사용될 수 있다는 것을 지시해준다.
입자 ICC-1438 및 ICC-1492를 사용하여, HBc의 N-말단과 N-말단 시스테인 잔기 간의 또다른 링커 서열을 연구하였다. 이들 입자 둘다는 M2 융합물과 HBc의 아미노산 D4 사이에 아미노산 서열 ELLGWLWGIDI(서열번호 265)을 함유하고 있다. 상기 서열의 C-말단 9 아미노산 잔기는 HBc 프리코어 서열의 아미노산 -6에서 HBc의 아미노산 13까지 유래된 것이며, 이때 본 연구에 포함되는, 상기 위치에서의 해독 개시가 일어나지 못하도록 HBc의 개시인자 코돈을 이소루신으로 돌연변이시켰다. HBc 프리코어 서열은 위치 -7에 시스테인을 포함한다.
이들 입자는, ICC-1438 성분 키메라 분자가 HBc의 위치 149에서 종결된 반면, ICC-1492 성분 키메라 분자는 HBc의 149에서 종결되고 서열번호 1의 HBc에 기준하여 위치 150에서 말단 시스테인을 함유하였다는 사실에서만 상이하다. 전술된 방법에 대한 대체 방안이긴 하지만 이와 유사한 방법을 사용함으로써 입자를 대략 10분에 용출시켜, 분석적 겔 여과에 의해 분석할 경우에는, 양 작제물이 정제 후 미립형인 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구는, 절단된 입자의 아미노-말단 시스테인 안정화와 카복실-말단 시스테인 안정화의 화합성, 및 HBc 유전자의 출발부와 N-말단 시스테인 잔기 간의 거리 및 아미노산 서열 상의 실재적 가변성의 관용(tolerance)을 입증해주었다.
Figure 112005045808790-PCT00045
다음 표 10은 HBeAg의 N-말단의 입체 배치와, N-말단 융합물을 수반하는 입자를 예시하는 정렬을 나타낸다. 서열은 모든 작제물이 공유하고 있는 서열번호 1의 HBc의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 위치 4에 따라서 정렬된다. N-말단 시스테인 잔기가 존재하는 경우, 이는 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005045808790-PCT00046
다음 표 11은 본원에 고려된 N-말단 인플루엔자 A M2 서열 또는 변이체를 함유하는 입자에 대한 안정성을 평가한 결과를 표로 만든 것이다. 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단에 기준하여 위치 마이너스 14(-14)에 N-말단 시스테인 잔기를 함유하는 HBc 키메라 분자로부터 대략 N-말단 자체까지의 안정한 입자를 제조하였다.
Figure 112005045808790-PCT00047
실시예 8: 부분적으로 절단된 입자를 발현하기 위한 발현 벡터의 합성
부분적으로 절단된 HBc 입자를 발현하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위해, 단일 아미노 말단 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머(HBc149/NcoI-F)를 독특한 C-말단 프라이머와 조합하여 사용하였다. 예를 들어, HBc156(E.cR; ICC-1600 입자) 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156(E.cR)-H3-R을 사용한다. 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156C(E.cR)-H3-R을 사용하여 HBcl56(E.cR)+C (ICC-1601 입자) 발현 플라스미드를 제조하였다. 사용된 모든 프라이머의 서열이 다음에 표시된다.
입자를 절단하는 것 이외에, 및 C-말단 시스테인 잔기를 혼입시키는 몇몇 경우에는, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적인 코돈을 또한 사용하였다. 몇 가지 아르기닌 코돈, 특히 AGA 및 AGG는 이. 콜라이에 의해 드물게 사용되는 것으로 공지되어 있고, 이들은 해독시 폴리펩티드 합성의 실속(stalling)을 유발시켜 미성숙 종결을 가져다 줌으로써, 단백질을 이. 콜라이에서 효율적으로 발현시키는데 있어 문제가 있는 것으로 여겨진다. HBc의 150과 183 사이의 16개 아르기닌 코돈 중에서, 7개가 드문(rare) AGA 코돈에 의해 암호화되고, 2개가 극히 드문 AGG 코돈에 의해 암호화된다. 따라서, 본 연구에서는 모든 AGA 및 AGG 코돈을, 이. 콜라이에 의해 보다 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체시켰다. 드문 아르기닌 코돈을 순차적으로 대체시키기 위해서는, HBc156 유전자를 먼저 합성한 다음(ICC-1600 및 HBc156+C ICC-1601 입자), 이를 HBc163 작제물에 대한 주형으로서 사용하고(ICC-1634 및 HBc163+C ICC-1632 입자); 그 후, 이러한 HBcl63 작제물을 HBc171 작제물에 대한 주형으로서 사용하고(ICC-1642 및 HBc171+C ICC-1643 입자); 최종적으로, HBc 171 작제물을 아르기닌 코돈 최적화 HBc182 및 HBc183 작제물에 대한 주형으로서 사용하였다. 비-최적화 HBc182 작제물(ICC-1575)을 대조 목적으로 또한 제조하였다. 모든 PCR 생성물을 제한 효소 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 전술된 바와 동일한 효소로 절단시킨 발현 벡터 pKK223-3N 내로 클로닝하였다.
아미노-말단 프라이머 서열(NcoI 제한 부위가 밑줄쳐져 있다):
Figure 112005045808790-PCT00048
카복실-말단 프라이머 서열(HindIII 제한 부위가 밑줄쳐져 있다):
Figure 112005045808790-PCT00049
Figure 112005045808790-PCT00050
실시예 9: 입자 제형
Corixa 529-SE를 함유한 제형
정제후, 재조합 B형 간염 코어 입자 용액을 필터 멸균시킨다. 바람직한 용량의 면역원성 입자(전형적으로는 0.02 내지 0.2mg)를 함유하는 일정량의 용액을 바이얼에 첨가한다. Corixa 529-SE(Corixa Corp.사., WA에서 시판중)를 바람직한 농도(전형적으로는 0.01 내지 0.2mg)으로 첨가하고, 염수를 첨가하여 용적 1mL가 되게 한다. 수득한 혼합물을 상당히 균질하게 교반한다.
Alhydrogel 및 Corixa RC-529를 함유한 제형
Corixa RC-529(전형적으로는 0.02 내지 0.2mg; Corixa Corp.사, WA에서 시판중)를 수산화알루미늄 겔(1mg)에 첨가한다. 이어서, 재조합의 정제된 면역원성 키메라 입자를 (전형적으로는 0.02 내지 2mg의 용량으로) 첨가하고, 염수를 첨가하여 용적 1mL가 되게 한다. 수득한 혼합물을 상당히 균질하게 교반한다.
본원에 인용된 각각의 특허 및 문헌은 참조로서 인용된다. 단수, 복수가 나타나지 않은 경우는, 하나 이상을 포함하는 것으로 의도된다.
상기의 기재 및 예는 예시의 목적으로 의도된 것이고, 제한하고자 함은 아니다. 또한, 본 발명의 취지 및 범위내의 기타 변현이 가능하고, 당해 기술분야 숙련가에게 용이하게 이해될 것이다.
<110> LORANTIS LIMITED <120> STABILIZED HBc CHIMER PARTICLES AS THERAPEUTIC VACCINE FOR CHRONIC HEPATITIS <130> 4564/91569 <150> 10/677,074 <151> 2003-10-01 <150> 10/372,076 <151> 2003-02-21 <160> 308 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 3 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 4 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 5 <211> 183 <212> PRT <213> Marmota monax <400> 5 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu 1 5 10 15 Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp 20 25 30 Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu 50 55 60 Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln 65 70 75 80 Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys 85 90 95 Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln 100 105 110 His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser 145 150 155 160 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys 180 <210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> Spermophilus variegatus <400> 6 Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro 1 5 10 15 Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp 20 25 30 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe 35 40 45 Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala 50 55 60 Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro 65 70 75 80 His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr 85 90 95 Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg 100 105 110 Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln 115 120 125 Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gly His Thr Val 130 135 140 Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro 145 150 155 160 Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr 165 170 175 Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg 180 185 190 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 195 200 205 Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys 210 215 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pkk223 <400> 7 ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t 51 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pkk223 <400> 8 ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt 38 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 9 Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 35 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 10 Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val 20 25 30 Gln Gln Ala 35 <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Cryptosporidium parvum <400> 11 Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala 20 25 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 12 Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys 1 5 10 15 Asn <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 13 Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro 20 25 30 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 14 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 15 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20 <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 16 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 17 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser 20 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 18 Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile 1 5 10 15 Glu Leu Glu <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 19 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 20 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 21 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 22 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 23 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 24 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 25 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 26 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 26 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile 35 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 27 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 28 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 28 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 29 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 30 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 31 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine or absent. If asparagine or serine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <400> 32 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 33 Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile 1 5 10 15 Arg <210> 34 <211> 142 <212> PRT <213> Yersinia pestis <400> 34 Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala 1 5 10 15 Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys 20 25 30 Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn 50 55 60 Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser 85 90 95 Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys 100 105 110 Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys 115 120 125 Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp 130 135 140 <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 35 Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe 1 5 10 15 Gly Gly Tyr <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 36 Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu 1 5 10 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 37 Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 38 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 38 Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr 20 25 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 39 Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr 20 25 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 40 Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr 20 25 <210> 41 <211> 25 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 41 Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn 1 5 10 15 Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr 20 25 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 42 Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly 1 5 10 15 Thr Lys Tyr Val 20 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 43 Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Pro Ala 20 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 44 Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 <210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 45 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro 20 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 46 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro 20 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 47 Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro 20 <210> 48 <211> 28 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 48 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro 20 25 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 49 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Val 20 <210> 50 <211> 22 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 50 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Val Asp Pro 20 <210> 51 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 51 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala 20 <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 52 Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Val <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 53 Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Val Asp Pro 20 <210> 54 <211> 22 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 54 Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Val Asp Pro Asn Ala 20 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 55 Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val 1 5 10 15 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 56 Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val 1 5 10 15 Asp Pro <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 57 Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val 1 5 10 15 Asp Pro Asn Ala 20 <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 58 Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln 1 5 10 15 Pro Ala Gly <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 59 Arg Ala Asp Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Gln Pro 1 5 10 15 Ala Gly <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 60 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 61 Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 62 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 63 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 64 <211> 22 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 64 Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala Asn 1 5 10 15 Gln Glu Gly Gly Ala Ala 20 <210> 65 <211> 36 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 65 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp 20 25 30 Asp Gln Pro Gly 35 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium berghei <400> 66 Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn 1 5 10 15 <210> 67 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium yoelii <400> 67 Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro 20 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 68 Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 69 Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu 1 5 10 15 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Shigella flexneri <400> 70 Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys 1 5 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 71 Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys 1 5 10 15 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Entamoeba histolytica <400> 72 Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile 1 5 10 15 Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln 20 25 <210> 73 <211> 34 <212> PRT <213> Schistosoma japonicum <400> 73 Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg 20 25 30 Val Asp <210> 74 <211> 34 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <400> 74 Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg 20 25 30 Val Asp <210> 75 <211> 26 <212> PRT <213> Bovine Inhibin <400> 75 Ser Thr Pro Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu 1 5 10 15 Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala 20 25 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 76 Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr 1 5 10 15 Ala <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 77 His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val 1 5 10 15 Glu <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 78 Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Val Leu 1 5 10 15 Ile <210> 79 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 79 Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn 1 5 10 <210> 80 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 80 Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Asn <210> 81 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 81 Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Asn <210> 82 <211> 42 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 82 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 83 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 84 Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 1 5 10 <210> 85 <211> 33 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 85 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 86 Tyr Val Ala Val Glu Asn Gly Val Ala Lys Lys Val Ala 1 5 10 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 87 His Phe Val Gln Gln Thr Pro Lys Ser Gln Pro Thr Leu Val Pro 1 5 10 15 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 88 His Val Val Val Asn Asn Lys Val Ala Thr His Val Pro 1 5 10 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 89 Pro Leu Gln Asn Ile Gln Pro Gln Val Thr Lys Arg 1 5 10 <210> 90 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 90 Ala Gln Ala Ala Asn Gly Gly Ala Ala Ser Gly Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 91 Tyr Val Asp Glu Gln Ser Lys Tyr His Ala 1 5 10 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 92 His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Gln Pro Pro Thr Leu Val Pro 1 5 10 15 <210> 93 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 93 Lys Pro Ser Ser Thr Asn Ala Lys Thr Gly Asn Lys Val Glu Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 94 Tyr Trp Thr Thr Val Asn Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Thr Phe Val 1 5 10 15 Pro <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 95 Tyr Val Asp Glu Lys Lys Lys Met Val His Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 96 His Tyr Thr Arg Gln Asn Asn Ala Asp Val Phe Val Pro 1 5 10 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 97 Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Asn Asn Asn Leu Thr Leu Val Pro 1 5 10 <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 98 Pro Pro Gln Lys Asn Gln Ser Gln Pro Val Val Thr Lys Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 99 Pro Pro Ser Lys Gly Gln Thr Gly Asn Lys Val Thr Lys Gly 1 5 10 <210> 100 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 100 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gln Val Lys Val Thr Lys Ala 1 5 10 <210> 101 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 101 Gln Pro Gln Thr Ala Asn Thr Gln Gln Gly Gly Lys Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 102 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 102 Gln Pro Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Gly Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 103 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 103 Gln Pro Ser Lys Ala Gln Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 104 Pro Pro Ser Ser Asn Gln Gly Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gly Asn Thr 1 5 10 15 Val Thr Lys Ala 20 <210> 105 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 105 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Lys Thr Gly Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 106 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Thr Asn Asn Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 107 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gly Gln Val Lys Val Thr Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 108 <211> 24 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 108 Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Ser Thr Asn Gly Gln Thr Gly 1 5 10 15 Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 109 <211> 24 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 109 Gln Leu Gln Leu Thr Glu Ala Pro Ser Lys Ser Gln Gly Ala Ala Ser 1 5 10 15 Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 110 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 110 Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Val Tyr Val Asp Asn Lys Val Ala Lys 1 5 10 15 His Val Ala <210> 111 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 111 Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Asn Asn 1 5 10 15 Pro Thr Leu Val Pro 20 <210> 112 <211> 12 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 112 Val Glu Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu 1 5 10 <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 113 Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr Pro Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 22 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 114 Gln Leu Gln Leu Thr Glu Pro Pro Ser Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gln 1 5 10 15 Asn Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 115 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 115 Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu 1 5 10 15 <210> 116 <211> 31 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 116 Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His 20 25 30 <210> 117 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 117 Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp 1 5 10 15 Asp Glu <210> 118 <211> 17 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 118 Gly Arg Asn Ala Phe Glu Leu Phe Leu Ile Gly Ser Ala Thr Ser Asp 1 5 10 15 Gln <210> 119 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 119 Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile Arg Thr Lys Ile 1 5 10 15 <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 120 Thr Leu Val Pro Ala Val Val Gly Lys Pro Gly Ser Asp 1 5 10 <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 121 His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 1 5 10 15 Arg <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 122 Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 1 5 10 15 <210> 123 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 123 Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser 1 5 10 15 Gln Thr <210> 124 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 124 Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala 1 5 10 15 Gly Val Arg Val Lys 20 <210> 125 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 125 Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val 1 5 10 15 Gly Val Arg Val Lys 20 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu 1 5 10 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 1 5 <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 130 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Pro Gly Thr Ile Asn Ile 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Phe Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val 1 5 <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro 1 5 10 15 Ala <210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Met Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu 1 5 10 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Met Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 1 5 10 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Met Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Met Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Met Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Met Pro Gly Thr Ile Asn Ile 1 5 <210> 141 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Met Phe Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Met Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val 1 5 <210> 143 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Met Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp 1 5 10 15 Pro Ala <210> 144 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 144 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro 20 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 145 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 146 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 1 5 10 <210> 147 <211> 26 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 147 Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg 1 5 10 15 Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly 20 25 <210> 148 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 148 Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro 1 5 10 15 <210> 149 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 149 Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro 1 5 10 15 <210> 150 <211> 6 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 150 Gln Asp Pro Arg Val Arg 1 5 <210> 151 <211> 6 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 151 Gln Asp Gly Arg Val Arg 1 5 <210> 152 <211> 13 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 152 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 153 <211> 13 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 153 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 154 Gly Ser Gly Asp Glu Gly Gly 1 5 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker arm <400> 155 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker arm sequence <400> 156 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 157 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker arm sequence <400> 157 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 158 <211> 16 <212> PRT <213> HIV <400> 158 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys 1 5 10 15 <210> 159 <211> 17 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 159 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Cys <210> 160 <211> 25 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 160 Val Glu Ile Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys 1 5 10 15 Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys 20 25 <210> 161 <211> 19 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 161 Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu 1 5 10 15 Asn Asp Cys <210> 162 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 162 Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys 1 5 10 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 163 Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Cys 1 5 10 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 164 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Cys 1 5 <210> 165 <211> 21 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 165 Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Glu Ala Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asn Thr Cys 20 <210> 166 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 166 Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 167 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 167 Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys 1 5 10 15 <210> 168 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 168 Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ser Cys <210> 169 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 169 Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro 1 5 10 15 Cys Ser Val Thr 20 <210> 170 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 170 Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys 1 5 10 15 Ser Val Thr <210> 171 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium yoelii <400> 171 Glu Phe Val Lys Gln Ile Ser Ser Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Gln 1 5 10 15 Cys Ser Val Thr 20 <210> 172 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 172 Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys 1 5 10 15 <210> 173 <211> 17 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 173 Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu 1 5 10 15 Cys <210> 174 <211> 16 <212> PRT <213> Lymphocytic choriomeningitis virus <400> 174 Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys 1 5 10 15 <210> 175 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 175 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys 1 5 10 15 <210> 176 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 176 Ala Ile Trp Gln Val Glu Gln Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asp Ser 1 5 10 15 Gly Trp Cys <210> 177 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 177 Asn Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val Gln Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys 1 5 10 15 Arg His Cys <210> 178 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 178 His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg Phe Gly 1 5 10 15 Asn Val Cys <210> 179 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 179 Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Leu Val Asp Asp 1 5 10 15 Ala Asp Cys <210> 180 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 180 Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp 1 5 10 15 Phe Ile Cys <210> 181 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 181 Ala Phe Lys Tyr Ala Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asn Ala Phe Glu 1 5 10 15 Leu Phe Cys <210> 182 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 182 Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Cys 20 <210> 183 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 183 Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val Ala Asn Gln Cys 1 5 10 15 <210> 184 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 184 Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys 1 5 10 15 <210> 185 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 185 Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Arg Thr Cys 1 5 10 15 <210> 186 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 186 Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Cys 1 5 10 15 <210> 187 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 187 His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 <210> 188 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 188 Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Cys 1 5 10 15 <210> 189 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 189 Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Lys Cys 1 5 10 15 <210> 190 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 190 Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Cys 1 5 10 15 <210> 191 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 191 Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys 1 5 10 15 <210> 192 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 192 Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Cys 1 5 10 15 <210> 193 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 193 His Asp Asp Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Cys 1 5 10 15 <210> 194 <211> 27 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 194 Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp 1 5 10 15 Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys 20 25 <210> 195 <211> 24 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 195 Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala 1 5 10 15 Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys 20 <210> 196 <211> 26 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 196 Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys 20 25 <210> 197 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 197 Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Thr Pro Ala Cys 20 <210> 198 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 198 Thr Gly Ala Asn Asn Thr Ser Thr Val Ser Asp Tyr Phe Arg Asn Arg 1 5 10 15 Ile Thr Cys <210> 199 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 199 Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Asp Lys Phe Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Cys <210> 200 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 200 Leu Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Cys <210> 201 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 201 Asn Gly Trp Tyr Ile Asn Pro Trp Ser Glu Val Lys Phe Asp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Arg Cys <210> 202 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 202 atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240 tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420 tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgt 549 <210> 203 <211> 555 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 203 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180 tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca 240 tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 300 ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480 agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540 cgggaatctc aatgt 555 <210> 204 <211> 555 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 204 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180 tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca 240 tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta 300 ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480 agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540 cgggaatctc aatgt 555 <210> 205 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 205 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca 240 tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg 360 tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420 tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgt 549 <210> 206 <211> 549 <212> DNA <213> Marmota monax <400> 206 atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt 60 gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc 120 cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag 180 acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat 240 aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa 300 ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca 360 agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa 420 tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag 480 agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc 540 gcgtcgcag 549 <210> 207 <211> 651 <212> DNA <213> Spermophilus variegatus <400> 207 atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc 60 tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt 120 tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg 180 gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct 240 catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca 300 tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat 360 acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga 420 caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct 480 tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga 540 agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga 600 aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c 651 <210> 208 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 208 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Thr Gly <210> 209 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 209 gcgaagcttc ggatcccatg 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<223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 219 gcgccatggg gtgtgacatc gacccttata aagaatttgg 40 <210> 220 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 220 cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg 42 <210> 221 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 221 cgcgagctcc cagcgtctag agacctag 28 <210> 222 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 222 gtatcaggct gaaaatc 17 <210> 223 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 223 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Glu Leu <210> 224 <211> 57 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 224 aattaacgct aatccgaacg ctaatccgaa cgctaatccg aacgctaatc cggagct 57 <210> 225 <211> 49 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 225 ccggattagc gttcggatta gcgttcggat tagcgttcgg attagcgtt 49 <210> 226 <211> 31 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 226 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 25 30 <210> 227 <211> 93 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 227 aattaacgct aatccgaacg ttgacccgaa cgctaatccg aacgctaatc cgaacgctaa 60 tccgaacgtt gacccgaacg ctaatccgga gct 93 <210> 228 <211> 92 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 228 ggagctccgg attagcgttc gggtcaacgt tcggattagc gttcggatta gcgttcggat 60 tagcgttcgg gtccaacgtt cggattagcg tt 92 <210> 229 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 229 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 <210> 230 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 230 aattaacgcg aatccgaacg tggatccgaa tgccaaccct aacgccaacc caaatgcgaa 60 cccagagct 69 <210> 231 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 231 ctgggttcgc atttgggttg gcgttagggt tggcattcgg atccacgttc ggattcgcgt 60 t 61 <210> 232 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 232 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 <210> 233 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 233 aattaacgcg aatccgaatg ccaaccctaa cgccaaccca aacgtggatc cgaatgcgaa 60 cccagagct 69 <210> 234 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 234 ctgggttcgc attcggatcc acgtttgggt tggcgttagg gttggcattc ggattcgcgt 60 t 61 <210> 235 <211> 31 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 235 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 25 30 <210> 236 <211> 93 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 236 aattaacgcg aatccgaacg tggatccaaa tgccaaccct aacgctaatc caaacgccaa 60 cccgaatgtt gaccccaatg ccaatccgga gct 93 <210> 237 <211> 85 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 237 ccggattggc attggggtca acattcgggt tggcgtttgg attagcgtta gggttggcat 60 ttggatccac gttcggattc gcgtt 85 <210> 238 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 238 Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ala Asn Pro Asn Val Glu Leu 20 <210> 239 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 239 aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60 tgttgagct 69 <210> 240 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 240 caacattcgg gttggcgttg ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgttcggat 60 t 61 <210> 241 <211> 25 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 241 Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu 20 25 <210> 242 <211> 75 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 242 aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60 tgttgaccct gagct 75 <210> 243 <211> 67 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 243 cagggtcaac attcgggttg 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falciparum <400> 256 Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Glu Leu <210> 257 <211> 57 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 257 aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgagct 57 <210> 258 <211> 49 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 258 caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatc 49 <210> 259 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 259 Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Asp Pro Glu Leu 20 <210> 260 <211> 63 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 260 aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctga 60 gct 63 <210> 261 <211> 55 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 261 cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatc 55 <210> 262 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 262 Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu 20 <210> 263 <211> 69 <212> 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Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 298 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile Asp Ile Asp 35 <210> 299 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 299 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Ala 20 25 30 Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Thr 35 40 45 Cys Cys Gly Gly 50 <210> 300 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 300 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr 20 25 30 Cys Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly 35 40 45 Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly 50 55 <210> 301 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 301 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala 20 25 30 Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Cys 35 40 45 Gly <210> 302 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 302 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys 20 25 30 Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Thr Cys Gly 50 <210> 303 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 303 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly 1 5 10 15 Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala 20 25 30 Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly 35 40 45 Thr <210> 304 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 304 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala 1 5 10 15 Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr 20 25 30 Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Gly Thr 50 <210> 305 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 305 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr 20 25 30 Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys 35 40 45 Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly 50 55 60 Thr Cys 65 <210> 306 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 306 Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala 20 25 30 <210> 307 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 307 Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly 20 25 <210> 308 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 308 Cys Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys 20 25 30 Gly Gly Ala Ala Gly 35

Claims (51)

  1. 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 용해되거나 분산된, 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자를 포함하는 면역원성 입자를 포함하는 백신을 T-세포 촉진량으로 B형 간염 바이러스에 만성적으로 감염된 환자에게 투여하는 단계(a) 및 환자를 HBc에 대해 활성화된 T 세포를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계(b)를 포함하는데,
    해당 키메라 단백질 분자는 약 550개 이하의 아미노산 잔기 길이를 갖고,
    (i) 잔기 위치 4에서 약 75까지의 및 약 85에서 약 140까지의 HBc 서열을 포함하고, 임의로 (a') 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 및 C-말단 중의 하나 이상과 펩티드 결합된 면역원성 에피토프 또는 (b') 1 내지 약 40개 아미노산 잔기 길이를 갖고, HBc 면역우성 루프 내에 접합된 합텐에 대해 화학-반응성 링커 잔기를 함유하는 삽입물을 포함하는, HBc 분자의 N-말단 165개 아미노산 잔기 중 약 125개 이상의 HBc 서열,
    (ii) (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘다를 함유하며,
    이때, 해당 키메라 분자는, (a') HBc 서열 내에 약 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, (b') 숙주 세포에서 발현시, 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자로 자가 어셈블리되고,
    이때, 해당 입자는, 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들) 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자, 또는 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정한, 만성 간염을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 펩티드 결합된 면역원성 에피토프가 면역원성 에피토프인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 면역원성 에피토프가 B 세포 에피토프인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 제1로 명명된 면역원성 에피토프가 결합되어 있는 위치와 상이한 위치에서 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프내 또는 C-말단과 펩티드 결합된 제2 면역원성 에피토프를 함유하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, B 세포 에피토프가 아미노산 잔기 76과 85 사이의 HBc 서열내 위치에서 펩티드 결합되고, 위치 76 내지 85의 HBc 서열 중 5개 이상의 잔기가 존재하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 아미노산 잔기 76과 85 사이의 HBc 서열이 존재하지만, B 세포 에피토프에 의해 차단된 방법.
  7. 제2항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 제1로 명명된 면역원성 에피토프가 결합되어 있는 위치와 상이한 위치에서 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프내 또는 C-말단과 펩티드 결합된 면역원성 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, T 세포 면역원성 에피토프가 C-말단 HBc 아미노산 잔기와 펩티드 결합된 방법.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기(들)이 존재하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 키메라가 위치 4에서 적어도 위치 140까지의 비차단된 HBc 아미노산 잔기 서열 + HBc 키메라 단백질 분자의 N-말단에 시스테인 잔기를 함유하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 키메라가 위치 4에서 위치 149까지의 비차단된 HBc 아미노 산 잔기 서열을 함유하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 키메라가 면역우성 루프내에 존재하는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 함유하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 아미노산 잔기 76 내지 85 사이의 HBc 서열내의 위치에 펩티드 결합되어 있고, 위치 76 내지 85 사이의 HBc 서열 중의 4개 이상의 잔기가 존재하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 잔기 76 내지 85 사이의 HBc 서열이 존재하지만, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기에 의해 차단된 방법.
  15. 제14항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 위치 4에서 적어도 위치 140까지의 HBc 아미노산 잔기 서열을 함유하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 키메라가 위치 4에서 위치 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열을 함유하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 티로신 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방 법.
  18. 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 용해되거나 분산된 면역원성 입자의 면역원성 유효량을 포함하는 백신을 T-세포 촉진량으로 만성 B형 간염에 감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는데, 여기서, 면역원성 입자는, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명되는, N-말단으로부터 4개의 펩티드 연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하는 약 135 내지 약 525개 아미노산 잔기 길이를 갖고, 이때,
    (i) 도메인 I은 약 71 내지 약 110개 아미노산 잔기를 포함하고, 이의 서열에는 (a') 적어도 HBc의 위치 5에서 위치 75까지의 잔기 서열, (b') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 있는 0 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (c') HBc 잔기 2 내지 4 중의 하나와 펩티드 결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 면역원성 에피토프가 포함되고,
    (ii) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드 결합된 약 5 내지 약 250개 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 (a') HBc 위치 76에서 85까지의 서열 중의 0 내지 모든 잔기가, (b') 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 면역원성 에피토프를 구성하는 임의로 존재하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기 서열에 펩티드 결합되어 존재하고,
    (iii) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 약 85에서 위치 135까지의 HBc 서열이고,
    (iv) 도메인 IV는, (a') 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기, (b') 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 0 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (c') 위치 165에서 C-말단까지의 HBc와 이종인 면역원성 서열 중의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하고,
    해당 키메라 분자는, (i) 아미노산 잔기의 약 10% 이하가 해당 키메라의 HBc 서열에서 치환되는 아미노산 잔기 서열을 갖고, (ii) 숙주 세포에서 발현시 입자로 자가 어셈블리되며, (iii) 하나 이상의 N-말단 시스테인 잔기 또는 C-말단 시스테인 잔기를 함유하고, 이때, 해당 입자가, 실질적으로 핵산 결합을 함유하지 않고, (i) 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들) 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자, 또는 (iii) 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 (ii) 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정한, 만성 간염을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 2개의 면역원성 에피토프를 함유하는 방법
  20. 제19항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 도메인 I과 II, II와 IV 또는 I과 IV에 존재하는 2개의 면역원성 에피토프를 함유하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 2개의 면역원성 에피토프 중 하나가 B 세포 에피토프인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 2개의 면역원성 에피토프 중 하나가 T 세포 에피토프인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 2개의 면역원성 에피토프 중 하나가 동일하거나 상이한 T 세포 에피토프인 방법.
  24. 제18항에 있어서, 도메인 I이 HBc 잔기 2 내지 4 중의 하나와 펩티드 결합된 면역원성 에피토프를 포함하고, 에피토프가 T 세포 에피토프인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 도메인 II가 면역원성 에피토프를 함유하고, 에피토프가 B 세포 에피토프인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 위치 165에서 C-말단까지 HBc와 이종인 서열이 HBc 잔기 140 내지 149 중의 하나와 펩티드 결합된 면역원성 T 세포 에피토프인 방법.
  27. 제18항에 있어서, 도메인 II가 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 함 유하는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 키메라 분자의 C-말단의 약 30개 잔기 이내에 1 내지 3개의 C-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 도메인 II에 존재하는 B 세포 에피토프인 면역원성 에피토프를 함유하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, B 세포 에피토프가 6 내지 약 50개 아미노산 잔기를 함유하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, B 세포 에피토프가 20 내지 약 30개 아미노산 잔기를 함유하는 방법.
  32. 제28항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 1개의 시스테인 잔기를 함유하는 방법.
  33. 제28항에 있어서, 아미노산 잔기 76 내지 85 사이의 HBc 서열이 존재하지만, 면역원성 에피토프에 의해 차단된 방법.
  34. 제32항에 있어서, 시스테인 잔기가 키메라 단백질 분자의 C-말단의 약 5개 아미노산 잔기 이내에 위치하는 방법.
  35. 제18항에 있어서, 위치 165에서 C-말단까지의 HBc에 대한 이종 서열이 HBc 잔기 140 내지 149 중의 하나와 펩티드 결합된 면역원성 T 세포 에피토프인 방법.
  36. 제18항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 면역원성 에피토프가 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 티로신 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 재조합 HBc 키메라 단백질 분자가 HBc 키메라 단백질 분자의 C-말단에 단일 시스테인 잔기를 함유하는 방법.
  39. 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 용해되거나 분산된 면역원성 입자의 면역원성 유효량을 포함하는 백신을 T-세포 촉진량으로 만성 B형 간염에 감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는데, 여기서, 면역원성 입자는, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명되는, N-말단으로부터 4개의 펩티드 연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하는 약 170 내지 약 250개 아미노산 잔기 길이를 갖는 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자를 포함하고, 이때,
    (a) 도메인 I은 HBc의 위치 4에서 위치 75까지의 잔기 서열 뿐만 아니라 상기 서열의 아미노-말단 HBC 잔기와 펩티드-결합된 제1 서열에서 약 25개 잔기 이하의 제1 서열을 포함하고, 여기서, 약 25개 잔기 이하의 서열은 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -14 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 있는 0 내지 1개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기]를 함유하며,
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드 결합된 약 5 내지 약 55개 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 HBc 위치 76에서 85까지의 서열에서 4개 이상의 잔기가 약 50개 잔기 이하의 위치 76에서 85까지의 HBc에 이종인 임의의 제2의 서열과 펩티드 결합되어 있으며,
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 85에서 위치 135까지의 HBc 서열이고,
    (d) 도메인 IV는, (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기, (ii) 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 0 내지 1개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기], 및 (iii) 위치 165에서 C-말단까지의 HBc와 이종인 제3의 서열 중의 0 내지 약 50개 아미노산 잔기를 포함하고,
    해당 키메라 분자는, (i) 숙주 세포에서 발현시 입자로 자가 어셈블리되고, (ii) 하나 이상 또는 기타의 N-말단 시스테인 잔기 또는 C-말단 시스테인 잔기를 포함하며, (iii) 약 5% 이하의 아미노산 잔기가 서열번호 1의 HBc 서열에 제시된 서열을 기준으로 하여 당해 키메라의 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖고,
    이때, 해당 입자가, 280nm:260nm의 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.7을 나타내고, 상기의 N-말단 시스테인 잔기 또는 C-말단 시스테인 잔기가 결여되었지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자, 또는 해당 키메라 분자 내에 존재하는 N-말단 시스테인 잔기 또는 C-말단 시스테인 잔기가 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정한, 만성 간염을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 도메인 II의 제2 서열이 B 세포 에피토프로 정의되는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 제2 서열이 15개 내지 약 50개 아미노산 잔기를 함유하는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 제2 서열이 20개 내지 약 30개 아미노산 잔기를 함유하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 아미노산 잔기 76과 85 사이의 HBc 서열이 존재하지만, 제 2 서열에 의해 차단된 방법.
  44. 제40항에 있어서, B 세포 에피토프가 스트렙토코쿠스 뉴모니에(Streptococcus pneumonia), 크립토스포리듐 파르븀(Cryptosporidium parvum), HIV, 구제역 질환 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모디움 베르기(Plasmodium berghi), 플라스모디움 요엘리(Plasmodium yoelli), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), RSV, 플라스모디움 엔타모에바 히스톨리티카(Plasmodium Entamoeba histolytica), 쉬스토소마 만소니(Schistosoma japonicum), HBV 및 에볼라 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병원균에 존재하는 아미노산 서열인 방법.
  45. 위치 165에서 C-말단까지의 HBc에 대한 이종 서열이 HBc 잔기 140 내지 149 중의 하나와 펩티드 결합된 면역원성 T 세포 에피토프인, 제40항에 따른 재조합 HBc 키메라 단백질 분자.
  46. 제45항에 있어서, T 세포 에피토프가 HBV 유레인 재조합 HBc 키메라 단백질 분자.
  47. N-말단 시스테인 잔기가 키메라 단백질 분자의 N-말단의 약 5개 아미노산 잔기 내에 위치하는, 제40항에 따른 재조합 HBc 키메라 단백질 분자.
  48. (a) 톨-유사 수용체-4(TLR-4)에 대한 효능제(a), 및 톨-유사 수용체-9(TLR-9)에 대한 효능제(b) 중 하나 또는 둘다를 함유하는 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 용해되거나 분산된 면역원성 입자를 포함하는 백신을 T 세포-촉진량으로 B형 간염 바이러스에 만성적으로 감염된 환자에게 투여하는 단계, 및 (b) 환자를 HBc에 대해 활성화된 T 세포를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계를 포함하는데,
    해당 면역원성 입자는 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자를 포함하고,
    해당 키메라 단백질 분자는 약 550개 이하의 아미노산 잔기 길이를 갖고,
    (i) 잔기 위치 4에서 약 75까지의 및 약 85에서 약 140까지의 HBc 서열을 포함하고, 임의로 (a') 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 및 C-말단 중의 하나 이상과 펩티드 결합된 면역원성 에피토프 또는 (b') 1 내지 약 40개 아미노산 잔기 길이를 갖고, HBc 면역우성 루프 내에 접합된 합텐에 대해 화학-반응성 링커 잔기를 함유하는 삽입물을 포함하는, HBc 분자의 N-말단 165개 아미노산 잔기 중 약 125개 이상의 HBc 서열,
    (ii) (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘다를 함유하며,
    이때, 해당 키메라 분자는, (a') HBc 서열 내에 약 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, (b') 숙주 세포에서 발현시, 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자로 자가 어셈블리되고,
    이때, 해당 입자는, 임의의 상기 언급된 C-말단 시스테인 잔기(들) 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)을 함유하지 않지만 그밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자, 또는 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 C-말단 또는 N-말단 시스테인 잔기(들)이 또다른 잔기로 대체된 입자보다 안정한, B형 간염 바이러스에 대한 하나 이상의 감마-생성 CD 8+, CD 4+ T 세포 및 세포독성 T 림프구의 생성을 증강시키는 방법.
  49. 제48항에 있어서, TLR-4에 대한 효능제가 모노포스포릴 지질 A와 구조적으로 관련있는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 모노포스포릴 지질 A와 구조적으로 관련있는 효능제가 아 미노알킬 글루코사미드 포스페이트인 방법.
  51. 제48항에 있어서, TLR-4 효능제 및 TLR-9 효능제 중 하나 또는 둘다를 약제학적으로 허용되는 희석제 및 면역원성 입자와 혼합하는 방법.
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