CN107522777B - 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途，属于生物技术领域。该用于预防或治疗流感病毒的多肽，其为如下a)、b)或c)中的任一种：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的多肽；b)将序列表中的序列1所示的多肽的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽。此多肽是基于流感病毒M2e蛋白的高度保守性设计得到的，可作为活性成分用于制备预防或治疗流感病毒的药品。本发明还提供一种免疫原性偶联物，其能够提高免疫原性以及其对构象依赖性位点的抗原的免疫效果。

Description

用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于预防或治疗 流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途。
背景技术
甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒最容易发生变异， 甲型流感病毒的亚型则被人们称为“禽流感”，禽流感(Bird Flu)是由 禽流感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类， 感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重 的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。甲型 流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至 今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、 H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、 H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。
目前，针对甲型流感病毒的疫苗主要为合成肽疫苗(Synthetic peptidevaccine)，即用化学方法合成的病毒保护性抗原多肽疫苗，其 安全性好，不会受到病原微生物的污染，且易保存和控制质量。但是 合成肽疫苗一般分子量较小且只针对单一抗原位点，免疫原性较差， 对序列依赖性的抗原位点免疫效果较好，对构象依赖性位点则较差。鉴于此，研发对甲型流感病毒具有较好免疫效果的疫苗具有重大意 义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于预防或治疗流感病毒的多 肽，此多肽是基于流感病毒M2e蛋白的高度保守性设计得到的，可 作为活性成分用于制备预防或治疗流感病毒的药品。
本发明的第二目的在于提供一种免疫原性组合物，其包括上述多 肽，可用于制备对流感免疫效果较佳的药品。
本发明的第三目的在于提供一种免疫原性偶联物，其采用交联剂 将上述多肽偶联到载体蛋白上，增大其分子量，提高免疫原性以及其 对构象依赖性位点的抗原的免疫效果。
本发明的第四目的在于提供一种流感疫苗，用于预防或治疗流感 病毒。
本发明的第五目的在于提供上述多肽、免疫原性组合物、以及免 疫原性偶联物在制备用于预防或治疗流感病毒的药品中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于预防或治疗流感病毒的多肽，该多肽为如下a)、b)或 c)中的任一种：
a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的多肽；
b)将序列表中的序列1所示的多肽的N端和/或C端连接标签 得到的融合蛋白质；
c)将序列表中的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽。
一种免疫原性组合物，其包括上述多肽和至少一种药物载体或赋 形剂。
一种免疫原性偶联物，其包括上述多肽，免疫原性偶联物是通过 采用交联剂将载体蛋白与多肽交联后制得。
一种流感疫苗，其活性成分包括：上述多肽、免疫原性组合物、 或免疫原性偶联物。
一种上述多肽、免疫原性组合物、或免疫原性偶联物在制备用于 预防或治疗流感病毒的药品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
甲型流感病毒保守的M2抗原，特别是M2e，在各种甲型流感病 毒中具有极高的保守性，且可诱导特异性保护抗体产生。动物模型显 示，针对M2e产生的IgG抗体能够降低动物模型中流感的发病率， 有效地防止流感病毒引发的死亡。鉴于此，本发明提供的多肽是基于 流感病毒M2e蛋白的高度保守性设计得到的，可作为活性成分用于 制备预防或治疗流感病毒的药品，比如流感疫苗。
本发明还提供一种免疫原性偶联物，其采用交联剂将上述多肽偶 联到载体蛋白上，能够增大分子量，提高免疫原性，提高其对构象依 赖性位点的抗原的免疫效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下 将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为多肽M2A5的纯度检测。
图2为多肽M2A5的分子量检测。
图3为载体蛋白CRM197标品的SDS-PAGE图。
图4为载体蛋白CRM197与多肽M2A5结合前样品的SDS-PAGE 图。
图5为免疫原CRM197-M2A5的SDS-PAGE图。
图6为CRM197载体蛋白、CRM197-M2A5结合物和marker的 电泳图谱。
图7为多肽M2A5、CRM197包板检测CRM197-M2A5结合疫苗 免疫血清ELISA抗体效价。
图8为感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线 图。
图9为感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠体重变化 图。
图10为感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线 图。
图11为感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠体重变化 图。
图12为感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存 曲线图。
图13为感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠体重 变化图。
图14为感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲 线图。
图15为感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠体重变 化图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市售购买获得的常规产品。
本实施方式提供一种用于预防或治疗流感病毒的多肽，该a)、b) 或c)中的任一种：
a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的多肽；
b)将序列表中的序列1所示的多肽的N端和/或C端连接标签 得到的融合蛋白质；
c)将序列表中的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽。
甲型流感病毒保守的M2抗原，特别是M2e，在各种甲型流感病 毒中具有极高的保守性，且可诱导特异性保护抗体产生。动物模型显 示，针对M2e产生的IgG抗体能够降低动物模型中流感的发病率， 有效地防止流感病毒引发的死亡。由于流感病毒M2e蛋白的高度保 守性而成为通用型流感疫苗的研究靶点。
鉴于此，发明人通过从NCBI中共比对约13000条流感毒株的序 列，设计了一条多肽M2A5，其氨基酸序列如序列1所示，并将其命 名为多肽M2A5，该多肽可作为流感疫苗等药品的有效成分，对流感 病毒具有广谱的免疫效果。
该多肽M2A5可通过人工合成得到，合成方法简单、易于实现。 可选的，采用多肽固相合成法合成多肽M2A5，基于Fmoc化学合成， 先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个 不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的 起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一 过程，由C端向N端合成，即可得到多肽M2A5。该合成方法简单、 易于实现。
一种免疫原性组合物，其包括上述的多肽和至少一种药物载体或 赋形剂。这种免疫原性组合物以多肽M2A5为活性成分，可用于制 备对流感免疫效果较佳的药品。
一种免疫原性偶联物，其包括上述多肽，该免疫原性偶联物是通 过采用交联剂将载体蛋白与多肽交联后制得。
将载体蛋白与多肽M2A5偶联后得到的免疫原性偶联物，相比 于单独的多肽M2A5，免疫原性提高，且其对构象依赖性位点的抗原 的免疫效果较高。
进一步的，载体蛋白选自白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197。
CRM197(cross-reacting materials 197)是白喉毒素丧失了毒性的 一种突变体，它由野生型白喉毒素的碱基序列中有一个碱基G突变 为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU。CRM197不具 有酶活性和细胞毒性，但具有白喉毒素的免疫原性。因此，CRM197 可被用作免疫蛋白载体交联多肽M2A5一起得到偶联物，以提高多 肽M2A5的免疫效果。
该偶联物以白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197为载体蛋白， 通过交联剂与多肽M2A5相交联，得到免疫原CRM197-M2A5。通过 实验证明：将制备的免疫原CRM197-M2A5作为流感疫苗的有效成 分，并以适宜的免疫佐剂作为辅料制成的药物有很好的免疫效果。且该载体蛋白适合于大规模工业化生产的优点，同时交联率高，制备时 间短，降低了生产成本。
进一步的，白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197是如下d)或e) 或f)的蛋白质：
d)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
e)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签 得到的融合蛋白质；
f)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
进一步的，多肽、载体蛋白和交联剂的摩尔比为： (5～10):1:(50～80)，或者为(7～10):1:(60～80)，或者为(8～10):1:(70～80)， 或者为(9～10):1:(75～80)，或者为10：1：80。
进一步的，交联剂选自SMCC、sulfo-SMCC、AMAS或BMPA中的至 少一种。其中，SMCC为4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀 酰亚胺酯；sulfo-SMCC为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸 基琥珀酰亚胺酯钠盐；AMAS为马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯；BMPA为3-马来酰亚胺基丙酸。较为优选的，交联剂为SMCC。
进一步的，多肽与载体蛋白的结合率为3～5:1或者为4：1。本实 施方式所指的结合率是指每一个载体蛋白(例如CRM197)上所结合 的多肽M2A5分子的个数，是通过毛细管电泳(CE)来分析计算得 到的。
一种流感疫苗，其活性成分包括：多肽M2A5、免疫原性组合物、 或免疫原性偶联物。
进一步的，流感疫苗还包括医药学上可接受的佐剂，活性成分与 佐剂的质量比为1：10～25，或者为1：15～25；或者为1：20～25；或 者为1：25。较为优选的，该佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或者CpG(即 胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-寡脱氧核苷酸)中的至少一种，可选的，该佐剂为氢氧化铝，或者该佐剂为氢氧化铝和CpG。
一种上述多肽、免疫原性组合物、或免疫原性偶联物在制备用于 预防或治疗流感病毒的药品中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
多肽M2A5的设计及合成：
一、多肽M2A5的设计
由于流感病毒M2e蛋白的高度保守性而成为通用型流感疫苗的 研究靶点。本发明通过从NCBI中共比对约13000条流感毒株的序列， 设计了一条多肽M2A5，其氨基酸序列如序列1所示，并将其命名为 多肽M2A5。
二、多肽M2A5的合成
具体步骤如下：
1、树脂选择：使用Rink-Amide MBHA树脂，取代度为 0.58mmol/g，树脂用量为86mg。
2、氨基酸连接：每轮氨基酸连接的步骤和条件如下：
①脱保护：向反应器中加入3mL体积分数为20％哌啶溶液(哌 啶溶液为将哌啶溶于DMF中得到的溶液)，氮气鼓泡搅拌反应2min， 然后排干哌啶溶液；再次向反应器中加入3mL体积分数为20％哌啶 溶液，氮气鼓泡搅拌反应2min，然后排干哌啶溶液。
②DMF洗涤：向反应器中加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应 1min，然后排干DMF；再次加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min， 然后排干DMF，重复5次。
③先加入2mL浓度为100mM Fmoc氨基酸溶液(Fmoc氨基酸 溶于DMF中得到的溶液)，然后再加入2mL 100mM HCTU溶液(HCTU和N-甲基吗啉溶于DMF中得到的溶液，N-甲基吗啉浓度为 200mM)，氮气鼓泡搅拌反应10min，然后排干溶液。
④DMF洗涤：向反应器中加入5mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应 1min，然后排干DMF。
⑤先加入2mL浓度为100mM Fmoc氨基酸溶液，然后再加入2mL 100mM HCTU溶液，氮气鼓泡搅拌反应10min，然后排干溶液。
⑥DMF洗涤：向反应器中加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应 1min，然后排干DMF；再次加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min， 然后排干DMF，重复5次。
3、切割多肽条件：多肽序列中的所有氨基酸连接完成后，按 1mL/10mg树脂的比例加入切割液。切割液组成：三氟乙酸：水：苯 甲醚：乙二硫醇＝95:2:2:1(体积比)，氮气鼓泡搅拌反应2h。
4、收集粗肽：切割反应结束后，收集切割液，按5毫升无水乙 醚/毫升切割液的比例加入经过预冷的无水乙醚，加入无水乙醚后， 摇匀，-20℃冰箱中静置8h。然后5000rpm，离心10min，倒去上清 液；向沉淀中加入40mL无水乙醚，摇床上震荡洗涤2h；然后5000rpm，离心10min，倒去上清液，下层沉淀使用氮气吹干，然后37℃烘箱中 干燥12h，即可获得粗肽。
5、粗肽纯化与冻干：使用安捷伦1260制备色谱仪纯化粗肽，柱 子为AgilentC18column(21.2×150mm)；流动相A：含0.1％TFA的 水，流动相B：含0.1％TFA的乙腈；流速10mL/min，梯度洗脱条件 为乙腈浓度30min内由16％升至72％，检测器波长为214nm，280nm； 收集目标多肽(保留时间约12min时的组分)。收集的目标多肽50℃ 减压除去乙腈后立刻-80℃冷冻，然后冷冻干燥，干燥后多肽贮存于 -80℃备用。
三、多肽纯度和分子量检测：
使用电喷雾质谱仪(Waters ZQ2000质谱仪)检测步骤5纯化获 得的多肽的分子量，并使用Waters HPLC检测纯化后的多肽的纯度， 柱子SunfireTM C18 column(5μm，250×4.6mm)，流速0.5mL/min， 梯度洗脱条件为乙腈浓度20min内由30％升至60％。
多肽的纯度的检测结果如图1所示。根据图1可以看出：合成的 多肽M2A5的纯度为99％。
多肽分子量的检测结果如图2所示。根据图2可以看出：合成的 多肽M2A5的分子量为2723。
实施例2
免疫原性偶联物CRM197-M2A5及其制备方法：
一、免疫原CRM197-M2A5的制备：
1、溶液的制备
(1)载体蛋白溶液的制备：以CRM197蛋白(CRM197蛋白的 氨基酸序列如序列表中序列2所示)作为载体蛋白，PBS缓冲液 (20mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.4)作为溶剂，制备载体蛋白 溶液，得到浓度为5g/mL的载体蛋白溶液。
(2)SMCC溶液的制备：按80×过量计算，称取6.69mg的异 型双功能交联剂SMCC溶于334μL的DMF溶液中，得到浓度为 20mg/mL的SMCC溶液；
(3)目的肽溶液的制备：按10×计算，称取6.81mg的上述实 施例1制备的多肽M2A6溶于2.27mL的PBS缓冲液，得到浓度为3 mg/mL的目的肽溶液。
2、分别取载体蛋白溶液1mL至编号为1、2、3的2mL EP管中， 再取500μL样品作为对照；
3、向编号为1、2、3的2mL EP管中分别加入111μL SMCC溶 液，常温反应2h或4度过夜；
4、利用G25一次性脱盐柱除去过量SMCC溶液，按照0.5mL/ 管收集洗脱液，并使用紫外分光光度计检测样品蛋白浓度，收集合并 目标产物；
5、收集后的样品同样对应编号为1、2、3，浓度约为2mg/mL， 分别加入目的肽溶液756μL，常温反应3h或4度过夜，得到反应液。 其中，多肽M2A5、载体蛋白CRM197和SMCC的摩尔比为10:1:80， 在其他实施例中该三者的摩尔比也可以为5：1：50，或者为7：1： 60。
6、将步骤5的反应液于12000rpm、4℃离心10min去除沉淀。
7、使用30kDa超滤管除去杂肽，得到免疫原CRM197-M2A5。
8、利用SDS-PAGE检测免疫原CRM197-M2A5，结果如图3所 示。其中M：marker；1：载体蛋白CRM197标品，上样量 1.5mg/mL×5μL＝7.5μg；2：载体蛋白CRM197与多肽M2A5结合前样品，上样量1.0mg/ml×7μL＝7μg；3：免疫原CRM197-M2A5，上样 量1.5mg/mL×5μL＝7.5μg。从图中可以看出：免疫原CRM197-M2A5 的大小为68-75kDa。
二、结合率的测定
通过毛细管电泳(CE)来分析计算CRM197蛋白与多肽M2A5 的结合率。具体检测的条件如下：30.2cm×50μm裸毛细管；进样条 件为60s，5.0kV；分离条件为30min，15.0kV；检测波长为：220nm， 检测温度为25℃。处理好的样品含有蛋白的最终浓度应为0.2-2 mg/mL。
以载体蛋白CRM197、CRM197-M2A5免疫原和marker的电泳 图谱结果如图4～图6所示。其中图4峰值分别为：10kDa(a)、20kDa (b)、35kDa(c)、50kDa(d)、100kDa(e)、150kDa(f)、225kDa (f)。从图4中可以看出：载体蛋白CRM197的检测图谱线是典型的 毛细管电泳图谱(图5)，有单体吸收峰59kDa；当CRM197作为一 个载体与M2A5多肽结合形成一个新的结合蛋白即CRM197-M2A5 免疫原的检测图谱如图6所示，与单纯的载体蛋白CRM197图谱相 比较，CRM197-M2A5免疫原出现了新吸收峰，CRM197-M2A5免疫 原(CRM197蛋白与多肽M2A5形成的结合蛋白)比单纯一个CRM197 蛋白分子其分子量增加了约10～12kDa，这说明一个CRM197蛋白结 合了大约4个M2A5多肽分子。
实施例3、CRM197-M2A5疫苗的制备及其免疫效果
一、CRM197-M2A5结合疫苗的制备
用PBS缓冲液(20mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.4)将步 骤一制备得到的免疫原CRM197-M2A5进行稀释，使其浓度为 250μg/mL，然后再缓慢加入氢氧化铝佐剂，确保氢氧化铝佐剂终浓 度为2.5mg/mL，滴加过程中同时缓慢摇晃样品。加完氢氧化铝后， 密封好样品，置于2～8℃缓慢摇晃吸附16h后，将其稀释至抗原终浓 度为100μg/mL，得到CRM197-M2A5结合疫苗。
二、抗体滴度的检测
(1)免疫方式
采用腹腔注射的免疫方式注射步骤1制备的CRM197-M2A5结 合疫苗。免疫剂量50μg/0.5mL/只/次。实验动物信息如表1所示。
表1、实验动物信息表
动物品系 性别 体重 周龄 数量(只)
Balb/c小鼠 雌性 18～22g 6～8周 10
(2)免疫程序
A.动物数量：使用CRM197-M2A5结合疫苗免疫Balb/c小鼠， 共10只；
B.免疫方式及剂量：腹腔注射，50μg/0.5mL/只/次；
C.免疫程序：0d、14d两针免疫，21d采血。
(3)检测
采用酶联免疫吸附法(ELISA法)进行检测，分别使用多肽M2A5 和载体蛋白CRM197包板检测CRM197-M2A5结合疫苗免疫小鼠血 清ELISA抗体效价(IgG)。具体为：取96孔酶标板，用0.05M Tris-NaCl (pH8.5)缓冲液将抗原(CRM197/M2A5分别包板进行检测)稀释 至2.5μg/mL，100μL/孔，2～8℃过夜包被。洗板2次。加封闭液200μL/ 孔、37℃封闭2.5h。洗板2次。加入一抗：一抗为检测用Balb/c小 鼠血清，从300倍开始梯度稀释，方法如下：血清样品各150μL加 入包被板的第1行中，其余所有孔均加入100μL样品稀释液，之后 从第1行吸取50μL各样品从上到下进行3倍倍比梯度稀释，至最后 一行混匀后吸取50μL弃去。共稀释8个梯度，37℃反应1h。洗板5 次。加入二抗：HRP-IgG鼠二抗：1:10K稀释，37℃反应1h。洗板5次。显色，终止。使用酶标仪在OD450处读数并计算Cutoff值 ＝2.1×OD450值。结果判定：ELISA效价的计算方法：大于Cutoff值 判为阳性。使用Excel及GraphPad Prism 5软件对实验结果进行分析。
(5)结果分析
结果如图7所示：从图中可以看出，使用多肽M2A5包板检测 CRM197-M2A5结合疫苗免疫小鼠血清ELISA抗体效价(IgG)，其 GMT为151638；使用载体蛋白CRM197包板检测CRM197-M2A5 结合疫苗免疫小鼠血清ELISA抗体效价(IgG)，其GMT为72900。 结果表明：使用本发明所制备的CRM197-M2A5结合疫苗以100μg 蛋白/只的剂量经腹腔免疫接种Balb/c小鼠后产生了高滴度的IgG抗 体。说明本发明所制备的疫苗能够刺激机体产生较强的免疫原性。
三、攻毒保护检测
1、攻击毒株
攻击毒株1为流感毒株A/FM/1/47(H1N1)(血凝滴度1:1280)， 批号：W-A1201301，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株 对Balb/c小鼠的毒力：4.0lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。
攻击毒株2为流感毒株A/PR/8/34(H1N1)(血凝滴度1:16)，批 号：PR/8-3，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株对Balb/c 小鼠的毒力：3.0lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。
攻击毒株3为流感毒株A/Victoria/3/75(H3N2)(血凝滴度1:640)， 批号：W-A3201401，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株 对Balb/c小鼠的毒力：2.6lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。
攻击毒株4为流感毒株A/Aichi/2/68(H3N2)鼠肺适应株(滴度： 3.8×106PFU/ml)，批号：20141222，公众可从华兰生物疫苗有限公 司获得。该毒株对Balb/c小鼠的毒力：2.6lgMLD50/mL；攻毒剂量： 100μL/只。
2、实验方法
①动物分组：根据免疫样品及攻击毒株不同将小鼠随机分为8 组(动物分组如表3所示)，10只/组，全雌，实验动物信息如表2 所示。免疫样品分别为CRM197-M2A5结合疫苗组和PBS溶剂组 (PBS溶剂的配方：20mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.4)；攻击 毒株为上述4株病毒：攻击毒株1、攻击毒株2、攻击毒株3和攻击 毒株4。
表2实验动物信息表
动物品系 性别 体重 周龄 数量(只)
Balb/c小鼠 雌性 18～22g 6～8周 80
表3实验分组表
Figure BDA0001407036430000171
②疫苗免疫方式及剂量：腹腔注射，50μg/0.5mL/只/次；
③实验操作：0天、14天两针免疫，首次免疫后21天，小鼠经 乙醚麻醉后鼻腔攻毒，逐日观察并记录攻毒后14天内小鼠的体重变 化和死亡情况。
3、结果分析
图8和图9分别为感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小 鼠生存曲线图和体重变化图。由图8、图9可知，攻毒后， CRM197-M2A5结合疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；PBS 溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第13天小鼠全部死亡。
图10和图11分别为感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小 鼠生存曲线图和体重变化图。由图10、图11可知，攻毒后， CRM197-M2A5结合疫苗组小鼠体重先降低后升高，且小鼠90％存 活；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第12天小鼠全部死亡。
图12和图13分别为感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各 组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图12、图13可知，攻毒后， CRM197-M2A5结合疫苗组小鼠体重下降，且部分小鼠无法抵抗病毒 的攻击而死亡，至攻毒后第7天，小鼠体重开始上升，攻毒观察期结束，小鼠存活率为60％；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后 第7天全部死亡。
图14和图15分别为感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组 小鼠生存曲线图和体重变化图。由图14、图15可知，攻毒后， CRM197-M2A5结合疫苗苗组小鼠体重稍有下降后上升，且小鼠 100％存活；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第11天小鼠全 部死亡。
综上所述，CRM197-M2A5结合疫苗以100μg蛋白/只的剂量经 腹腔免疫接种Balb/c小鼠，首免后21天分别滴鼻感染A/FM/1/47 (H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Victoria/3/75(H3N2)和A/Aichi/2/68 (H3N2)流感病毒，生存率分别为100％、90％、60％、100％。说明CRM197-M2A5结合疫苗可以保护90％以上的小鼠抵抗致死量 A/FM/1/47(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2) 三种流感病毒的感染，可以部分保护小鼠抵抗A/Victoria/3/75(H3N2) 流感病毒的感染。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在 不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修 改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有 这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 华兰生物疫苗有限公司;华兰基因工程有限公司;华兰生物工程股份有限公司;华兰生物工程技术（北京）有限公司
<120> 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
<210> 2
<211> 535
<212> PRT
<213> 白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
<400> 2
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
385 390 395 400
Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His
405 410 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
435 440 445
His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
465 470 475 480
Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
485 490 495
Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu
500 505 510
Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser
515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535

Claims (4)

1.一种免疫原性偶联物，其特征在于，其包括多肽，所述免疫原性偶联物是通过采用交联剂将载体蛋白与所述多肽交联后制得；所述多肽为将序列表1中的SEQ ID NO.1所示的多肽的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述载体蛋白选自白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197：
所述白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197是如下d）或e）或f）的蛋白质：
d）氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
e）在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述多肽、所述载体蛋白和所述交联剂的摩尔比为：（5~10):1:(50~80)；所述交联剂选自SMCC、sulfo-SMCC、AMAS或BMPA中的至少一种；所述多肽与所述载体蛋白的结合率为3~5:1。
2.一种流感疫苗，其特征在于，其活性成分包括：如权利要求1所述的免疫原性偶联物。
3.根据权利要求2所述的流感疫苗，其特征在于，所述流感疫苗还包括医药学上可接受的佐剂，所述活性成分与所述佐剂的质量比为1：10~25。
4.一种如权利要求1所述的免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗流感病毒的药品中的应用，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114057848B (zh) * 2020-08-07 2023-11-21 清华大学 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057847B (zh) * 2020-08-07 2024-04-02 清华大学 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057844A (zh) * 2020-08-07 2022-02-18 清华大学 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1838967A (zh) * 2002-12-10 2006-09-27 洛伦蒂斯有限公司 稳定的免疫原性HBc嵌合体颗粒
CN101080239A (zh) * 2003-02-21 2007-11-28 洛伦蒂斯有限公司 作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒
CN101309699A (zh) * 2005-08-31 2008-11-19 塞尔德克斯医疗有限公司 稳定化的病毒样颗粒和表位展示系统
CN102807621A (zh) * 2011-06-01 2012-12-05 厦门大学 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1838967A (zh) * 2002-12-10 2006-09-27 洛伦蒂斯有限公司 稳定的免疫原性HBc嵌合体颗粒
CN101080239A (zh) * 2003-02-21 2007-11-28 洛伦蒂斯有限公司 作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒
CN101309699A (zh) * 2005-08-31 2008-11-19 塞尔德克斯医疗有限公司 稳定化的病毒样颗粒和表位展示系统
CN102807621A (zh) * 2011-06-01 2012-12-05 厦门大学 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Immunogenicity of Haemophilus influenzae-diphtheria CRM197 protein conjugate vaccine (HbOC) in Libyan infants;M. Hadida 等;《Tropical Medicine and International Health》;19980228;第3卷(第2期);第95-99页 *
Universal vaccines: shifting to one for many or shooting too high too soon!;MAWIEH HAMAD;《APMIS》;20111231;第119卷;第565-573页 *
流感病毒M2e与白喉毒素无毒突变体CRM197融合蛋白的抗原性和免疫原性分析;李琼 等;《病毒学报》;20170630;第33卷(第4期);第483-493页 *

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