CN111655284B - 流感病毒疫苗及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了流感血凝素茎部多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述核酸的载体以及包含它们的药物组合物，以及它们的使用方法，特别是在预防和/或治疗流感病毒感染中的使用方法。
Description
引言
本发明涉及医学领域。本文提供了甲型流感血凝素(HA)茎部结构域多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述多肽的药物组合物及其使用方法。
背景技术
流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸系统疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重性范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效应随流感株系的毒力以及宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变。据估计每年世界范围内有约10亿人经历流感病毒感染，导致3百万至5百万例严重疾病，并且估计有300,000至500,000例流感相关死亡。这些感染大多数可以归因于携带H1或H3血凝素亚型的甲型流感病毒，较小贡献来自乙型流感病毒，因此在季节性疫苗中通常包括这些的代表。当前的免疫实践依赖于流行的流感病毒的早期鉴定以允许及时生产有效的季节性流感疫苗。除了在预测将在下一季节期间占主导的株系方面的固有困难以外，抗病毒抗性和免疫逃逸也在当前疫苗预防发病和死亡的失效中起作用。另外，由源自动物宿主并重配以增加人-人传播的高毒力病毒株系引起大范围流行病的可能性也仍然对全球健康造成严重且现实的威胁。
流感病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。其基因组由八个单链RNA区段组成，这些单链RNA区段编码11种不同的蛋白质：一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)、两种基质蛋白(M1和M2)、三种非结构蛋白(NS1、NS2和PB1-F2)以及两种外部糖蛋白-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。
甲型流感病毒在自然界中分布广泛，并且可以感染多种鸟类和哺乳动物。这些病毒是基于HA和NA蛋白的抗原结构的差异来分类的，其不同组合代表独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为具体的流感病毒株系。虽然所有已知亚型都可以在鸟类中发现，但是当前流行的人甲型流感亚型是H1N1和H3N2。甲型流感病毒的系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要的所谓系统发育类别：尤其是在系统发育类别1(1类病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育类别2(2类病毒)中的H3、H4和H7亚型。
乙型流感病毒株系严格地是人株系。乙型流感病毒株系内HA中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的那些。乙型流感病毒的两种遗传性和抗原性不同的谱系在人体中循环，以B/山形/16/88(也称为B/山形)和B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系为代表。虽然由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但是对于乙型流感病毒感染仍经常观察到需要住院的严重疾病。
已知中和流感病毒的抗体主要针对血凝素(HA)。血凝素或HA是一种三聚体糖蛋白，该三聚体糖蛋白锚定在病毒膜中并且具有双重功能：它负责与细胞表面受体唾液酸结合，并且在吸收后，它介导病毒膜和内体膜的融合，从而导致病毒RNA释放到靶细胞的细胞溶质中。HA包括较大的头部结构域和较小的茎部结构域。茎部结构域通过C-末端跨膜结构域序列锚定到病毒膜中。该蛋白经翻译后裂解，产生两个HA多肽，HA1和HA2(完整序列称为HA0)(图1A)。膜远端头部区域主要源自HA1，而膜近端茎部区域主要源自HA2。需要裂解HA前体分子HA0来激活病毒的感染性，并且活化蛋白酶在宿主中的分布是流感病毒致病性的决定因素之一。哺乳动物和非致病性禽病毒的HA在细胞外裂解，这限制了它们在宿主中向遇到适当蛋白酶的组织的扩散。另一方面，致病性病毒的HA被普遍存在的蛋白酶在细胞内裂解，因此具有感染多种细胞类型并引起全身感染的能力。
季节性流感疫苗必须每年更新的原因是该病毒的变异性很大。在HA蛋白中，这种变异特别表现在头部结构域中，在头部结构域中，抗原性漂移和转变产生大量不同的变体。由于这也是免疫显性区域，因此大多数中和抗体都针对该结构域，并通过干扰受体结合而起作用。头部结构域的免疫显性和较大变异的组合解释了感染特定株系不会对其他株系产生免疫的原因：首次感染引发的抗体只能识别有限数量的与首次感染的病毒密切相关的株系。
近来，缺乏完整的流感血凝素球状头部结构域或其实质部分的流感血凝素茎部多肽已有描述，并且已经用于产生针对该茎部结构域多肽的一个或多个保守表位的免疫应答。据信，茎部多肽的表位的免疫原性低于球状头部结构域的高免疫原性区域，并且茎部多肽中不存在球状头部结构域可能允许发展针对茎部多肽的一个或多个表位的免疫应答(Steel等人，2010)。因此，Steel等人通过使A/波多黎各/8/1934(H1N1)和A/香港/1968(H3N2)株系的HA1结构域缺失氨基酸残基53至276，并用较短的柔性连接序列GGGG替换该缺失序列，产生了流感HA茎部多肽。小鼠接种H3HK68构建体不会引发与1类HA交叉反应的抗血清。另外，如WO 2013/079473中所示，茎部多肽是不稳定的并且未采用如缺乏抗体的结合所证明的正确构象，这些抗体经证实可以与茎部区域中的保守表位结合。
Bommakanti等人(2010)描述了一种基于HA2的多肽，该多肽包含氨基酸残基330-501(HA2)、7-氨基酸接头(GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基16-55、6-氨基酸接头GSAGSA，随后是HA1的残基290-321，在HA1中具有突变V297T、I300E、Y302T和C305T。该设计基于H3HA(A/香港/1968)的序列。该多肽仅针对H3亚型(A/Phil/2/82)内的另一种流感病毒株系而不针对H1亚型(A/PR/8/34)提供交叉保护作用。在Bommakanti等人(2012)的最新论文中，描述了基于来自H1N1 A/波多黎各/8/1934(H1HA0HA6)的HA的茎部多肽。在这种多肽中，氨基酸残基48至288的等效物已经缺失，并且产生了突变I297T、V300T、I302N、C305S、F392D、F395T和L402D。基于H3和H1两者的多肽均在大肠杆菌(E.coli)中表达，因此缺乏作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚糖。
最近，Lu等人(2014)还描述了源自H1N1 A/加利福尼亚/05/2009的HA的可溶性茎部多肽。在最终设计中，氨基酸残基52至277缺失(也不存在前导序列)，并且在该蛋白质的B环中引入了两个突变，即F392D和L402D。此外，该多肽含有C-末端三聚结构域(折叠子(foldon))。另外，引入了两个单体间二硫桥，一个在三聚体折叠子结构域的区域中，一个在位置416和417处(即H3编号中的G416C和F417C)。该多肽是在基于大肠杆菌的无细胞系统中产生的(因此其缺乏作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚糖)，并以变性形式回收，使用前需要再折叠。经再折叠的蛋白无法结合正与保守构象茎部表位结合的广泛中和抗体(bnAb)CR6261。没有示出来自流感攻击的免疫学数据或保护数据。
在另一篇论文中，Mallajosyula等人(2014)也描述了流感HA茎部多肽。在这种设计中，基于来自H1N1 A/波多黎各/8/1934的HA，不但大部分HA1序列缺失(残基48至289，H3编号)，而且HA2的大部分N-末端和C-末端序列也缺失(分别为残基323至369和443至末端)。该多肽在C-末端含有折叠子三聚结构域，并且也是在大肠杆菌中产生的，因此其缺乏病毒HA上天然存在的聚糖。经证实该多肽结合bnAb CR6261、F10和FI6v3，并且保护小鼠免受致死性流感病毒(H1N1 A/波多黎各/8/1934的1LD90)攻击。源自H1N1 A/新喀里多尼亚/20/1999和H1N1 A/加利福尼亚/04/2009的HA的等效多肽也可以提供部分保护。在这种攻击模型中，源自H5N1 A/越南/1203/2004的多肽仅产生有限的保护作用。而且，所用的攻击模型是温和的，施用的剂量相对较低(1-2LD90)。
最后，Yassine等人(2015)也描述了源自H1N1 A/新喀里多尼亚/20/1999的HA的稳定HA茎部多肽的开发。在这种设计中，大部分HA1序列(残基43至313，H3编号)和HA2序列(残基504至末端)已经缺失。另外，该设计在HA2中含有两个稳定化突变(K380M和E432L)，并且该设计与幽门螺杆菌(H.pylori)的铁蛋白亚基遗传融合，以产生展示稳定的HA茎部多肽的自组装纳米颗粒。如果不与铁蛋白亚基融合，稳定的HA茎部多肽似乎是不溶的或无功能的。组装成纳米颗粒的HA茎部-铁蛋白多肽在异源亚型H5N1 2004VN流感病毒攻击模型(在小鼠和白鼬中分别为25x LD50和1,000x TCID50)中进行了测试，并且可以保护小鼠免于死亡，而在白鼬中仅观察到部分保护作用。尚不清楚在人类中会诱导多少铁蛋白应答，以及多次施用会产生何种作用。
因此，仍然需要一种可以刺激产生强大的广泛中和抗体应答并针对大量当前和将来的流感病毒株系(季节性和流行性)提供保护作用的安全有效的“通用”疫苗，尤其需要一种针对系统发育类别1和/或类别2中的一种或多种甲型流感病毒亚型提供保护作用以有效预防和/或治疗流感的疫苗。
发明内容
本发明提供了源自流感血凝素(HA)的新型多肽，这些新型多肽包含流感HA茎部结构域而缺乏球状头部区域，在本文中称为流感血凝素(HA)茎部多肽。当施用于受试者，特别是人类受试者时，这些多肽诱导针对HA的免疫应答。本发明的多肽在膜远端头部结构域中存在的显性表位不存在的情况下，将HA分子的膜近端茎部的保守表位呈递给免疫系统。因此，HA0蛋白的一级序列的一部分(即构成头部结构域的部分)已缺失，而其余的氨基酸序列已直接重新连接或在一些实施例中通过引入短的柔性连接序列(“接头”)而重新连接以恢复氨基酸链的连续性。通过引入使HA分子其余部分的天然3维结构稳定的特异性修饰来进一步修饰所得的氨基酸序列。
在第一方面，本发明涉及包含HA1和HA2结构域的1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与包含HA1和HA2结构域的全长HA多肽的氨基酸序列相比包含：
(i)该HA1结构域中头部区域的缺失；
(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中的修饰，
(iii)至少2个(能够)形成单体内二硫桥的半胱氨酸残基；
(iv)至少2个(能够)形成单体间二硫桥的半胱氨酸残基；
其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且其中这些氨基酸位置的编号基于Winter等人(1981)中使用的H3编号。
在某些实施例中，本发明涉及包含HA1和HA2结构域的1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，其中所述HA茎部多肽包含的氨基酸序列与包含HA1和HA2结构域的全长HA多肽(HA0)的氨基酸序列相比包含：
(i)该HA1结构域中头部区域的缺失，所述缺失至少包含从与位置53处的氨基酸相对应的氨基酸直到并且包括与位置302处的氨基酸相对应的氨基酸的氨基酸序列；
(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中三聚区域的修饰，所述三聚区域包含从与位置405处的氨基酸相对应的氨基酸直到并且包括与位置419处的氨基酸相对应的氨基酸的氨基酸序列；
(iii)在与位置310相对应的氨基酸位置处的半胱氨酸和在与位置422相对应的位置处的半胱氨酸，这两者(能够)形成单体内二硫桥；
(iv)在与位置397相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置405相对应的位置处的半胱氨酸；或在与位置396相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置408相对应的位置处的半胱氨酸；或在与位置399相对应的位置处的半胱氨酸结合在位置405处的半胱氨酸；
其中在与位置392相对应的位置处的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且其中在与位置434相对应的位置处的氨基酸是Q；并且其中氨基酸位置的编号基于Winter等人(1981)中使用的H3编号。
根据本发明，令人惊讶地证实本发明的新型流感HA茎部多肽可以高水平表达，在细胞培养物上清液中绝大多数是三聚体，具有增高的解链温度，从而产生更高的稳定性。另外，本发明的HA茎部多肽通过稳定地呈递结合bnAb(如CR9114和/或CR6261)的HA茎部的表位来模拟全长HA的茎部。
在另一方面，本发明提供了编码流感HA茎部多肽的核酸分子。
在又另一方面，本发明提供了包含编码流感HA茎部多肽的核酸的载体，尤其是重组腺病毒载体。
在另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中诱导针对流感HA的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的流感HA茎部多肽、核酸分子和/或载体。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，这些药物组合物包含根据本发明的流感HA茎部多肽、核酸分子和/或载体，以及药学上可接受的载剂。
在另一方面，本发明提供了用作药物，尤其是用作预防和/或治疗由来自系统发育类别1和/或2的甲型流感病毒株系和/或乙型流感病毒株系引起的疾病或病症的疫苗的流感HA茎部多肽、编码所述流感HA茎部多肽的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体。
附图说明
图1.A.本发明多肽的示意总图；B.去除HA的头部区域产生本发明的茎部多肽(微型HA)；C.本发明的基于茎部的多肽的三维图示。
图2.基于A/布里斯班的亲本构建体5367的示意图。
图3.基于A/布里斯班的亲本构建体5369的示意图。
图4.本发明多肽的一个实施例的示意图，示出了B环中位置392处的氨基酸到P或R的新突变，位置434处的氨基酸到Q的突变以及位置442处到A的突变，并且还包含位置404处的氨基酸到Q的突变。
图5.本发明的几种多肽(灰色)和亲本设计(黑色)的表达水平和三聚体含量。A：通过OCTET(CR9114)测定的蛋白质表达水平；B和C：通过AlphaLISA测定的三聚体含量(值以相对于设为100％的多肽UFV160656的％表示；多肽5367的值基于蛋白质印迹(Western blot)的估计值)。实验进行了多次，这些数据是观测值的代表。左图中示出了稳定化突变。
图6.合并的通过尺寸排阻色谱法分离的亲和色谱洗脱级分；指出了聚集体、三聚体和单体(图A和B)。对合并的三聚体级分的SEC-MALS分析表明，本发明的多肽非常纯且在摩尔质量上均一(图C)。
图7.本发明的三聚体茎部多肽和Fab片段的SEC图谱。覆盖图示出了多肽(黑色)、Fab片段(虚线)和含有两者的样品(灰色)的色谱图。展示了多肽160656的结果。图A中的重叠峰表明用作阴性对照的Fab不与该多肽结合，而与Fab6261(图B)和Fab9114(图C)预孵育的多肽展示出峰移位(保留时间减少)，表明复合物形成(一个三聚体被三个Fab片段结合)。
图8.HA头部结构域(HA1)去除的示意图。在亲本设计中，去除了头部结构域并且两个HA1末端通过人工“GGGG-接头”连接(左图)。在本发明的多肽中，末端直接连接(替代性切割位置)或借助来源于头部结构域的同源接头序列连接。
图9.通过AlphaLISA测定的本发明多肽的表达水平、抗体结合和三聚体含量。A：表达水平，B：CR9114结合和C：三聚体含量。包括替代性切口的设计为灰色(左图)，包括替代性接头的设计为浅灰色。所有数据均相对于参考设计UFV160360(黑色)进行归一化。
图10.本发明多肽的表达水平和三聚。表达水平是通过OCTET测定的(图A)，而三聚体含量是通过AlphaLISA测定的(图B)。数据相对于参考多肽UFV150850进行归一化。
图11.归一化的表达水平、三聚体含量和CR9114结合。通过AlphaLISA对培养物上清液进行分析。参考构建体UFV160097含有GCN4样七肽重复序列，以黑色表示，而含有替代性七肽重复序列的多肽则为灰色。通过测定的表达水平将CR9114结合水平归一化。
图12.表达和抗体结合具有替代性C-末端截短的多肽变体。A：使用HA特异性单结构域抗体获得的蛋白质印迹。几乎所有样品在三聚体高度上均展示出清晰的条带，类似于两个参考多肽(UFV5367和UFV5369)。B：所示的通过OCTET测定的多肽与广泛中和抗体CR9114的结合是多肽与参考设计UFV5367和UFV5369相比的相对K结合值。
图13.归一化的表达水平、三聚体含量和CR9114结合。通过AlphaLISA对培养物上清液进行分析。参考构建体UFV160090以黑色表示，而在替代位置含有引入的半胱氨酸的多肽则为灰色。基于测定的表达水平，将三聚体含量和CR9114结合水平归一化。
图14：根据Winter等人(1981)的H3编号，H1 A/加利福尼亚/07/09和UFV160664的氨基酸位置编号。
图15：小鼠用本发明的多肽免疫接种后H1 A/布里斯班/59/07FL HA特异性抗体的滴度。虚线表示LLOQ(定量下限)，每组的水平线表示组中位数。
图16：上图：用本发明的多肽免疫接种的小鼠在H1N1 A/布里斯班/59/07攻击后的随访期内的存活比例。下图：用本发明的多肽免疫接种的小鼠在H1N1 A/布里斯班/59/07攻击后的随访期内的相对体重。相对于第0天来表示相对体重变化。通过计算曲线下面积(AUC)测定随访期间的累积体重减轻。误差线表示95％置信区间。
图17：上图：用本发明的多肽免疫接种的小鼠在H1N1 A/波多黎各/8/34攻击后的随访期内的存活比例。下图：用本发明的多肽免疫接种的小鼠在H1N1 A/波多黎各/8/34攻击后的随访期内的相对体重。相对于第0天来表示相对体重变化。通过计算曲线下面积(AUC)测定随访期间的累积体重减轻。误差线表示95％置信区间。
图18：白鼬用本发明的多肽免疫接种后H1 A/加利福尼亚/07/09FL HA特异性抗体的滴度。使用经过审查的方差分析(ANOVA)以及从最高剂量开始的事后t检验和Bonferroni多重比较调整，对不同剂量的本发明多肽和SOC与仅佐剂组的统计比较。虚线表示ULLOQ(定量上限)和LLOQ。每组的水平线表示组中位数。
图19：白鼬用本发明的多肽免疫接种后H1 A/加利福尼亚/07/09FL HA茎部特异性抗体的滴度。使用经过审查的方差分析(ANOVA)以及从最高剂量开始的事后t检验和Bonferroni多重比较调整，对不同剂量的本发明多肽和SOC与仅佐剂组的统计比较。每组的水平线表示组中位数。
图20：在用本发明的多肽免疫接种白鼬，随后用H1N1 A/NL/602/09进行攻击之后的随访期结束时(攻击后第4天)的肺部病毒载量滴度。每组的水平线表示组中位数，空心符号表示处于检测极限(LOD)的样品。
图21：用本发明的多肽、H5FL HA(阳性攻击对照)和仅佐剂(阴性攻击对照)免疫接种，随后用H5N1 A/印度尼西亚05/05进行攻击的白鼬在5天随访期内的存活率。
图22：在随访期间(第0至5天)由连续每日体重测量获得的各个动物的累积(AUC)体重减轻，其是相对于用本发明的多肽免疫接种白鼬，随后用H5N1 A/印度尼西亚/05/05进行攻击后第0天的体重。每组的水平线表示组中位数。
图23：在用本发明的多肽免疫接种白鼬，随后用H5N1 A/印度尼西亚/05/05进行攻击之后的死亡之日或随访期结束时(攻击后第5天)的肺部病毒载量滴度。每组的水平线表示组中位数，空心符号表示处于检测极限(LOD)的样品。
图24：在随访期间(第0至5天)由连续每日咽喉拭子获得的累积(AUC)咽喉病毒载量，其是相对于用本发明的多肽免疫接种白鼬，随后用H5N1 A/印度尼西亚/05/05进行攻击后第0天的体重。每组的水平线表示组中位数。
图25：小鼠用本发明的多肽免疫接种后H1 A/加利福尼亚/07/09FL HA特异性抗体的滴度。虚线表示LLOQ(定量下限)，空心符号表示处于LLOQ的样品，每组的水平线表示组中位数。
图26：小鼠用本发明的多肽免疫接种后H1 A/加利福尼亚/07/09FL HA茎部特异性抗体的滴度。虚线表示LLOQ(定量下限)，空心符号表示处于LLOQ的样品，每组的水平线表示组中位数。
图27：在用UFV160664肽体外刺激后，每百万免疫小鼠脾细胞中产生IFN-γ的T细胞数。虚线表示LLOQ(定量下限)，空心符号表示处于LLOQ的样品，每组的水平线表示组中位数。
图28：源自不同1类流感株系的EXPI-CHO表达的三聚体茎部多肽(其中转移了UFV160664构建体的突变)的培养物上清液的体外表征。A.通过OCTET(抗His2)测定的蛋白质表达水平；B.SEC图谱，三聚体和单体峰分别用“T”和“M”表示；C.通过AlphaLISA测定的多肽与mAb CR9114和MD3606的结合曲线。在株系A/加利福尼亚/07/09中本发明的三聚体茎部多肽的突变可转移至其他1类骨架；表达三聚体微型HA，并观察到茎部特异性抗体CR9114和多结构域MD3606的结合。
定义
以下给出如本发明中所用的术语的定义。
根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一种(像例如D-脯氨酸(脯氨酸的D-对映异构体))或非天然存在于蛋白质中的任何变体(像例如正亮氨酸)。标准氨基酸基于它们的特性可以分成若干类别。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些性质对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用很重要。一些氨基酸具有特殊的性质，例如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，其与多肽骨架形成循环；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔性。表12示出了标准氨基酸的缩写和特性。
如本文所用，术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“但不限于”。
如本文所用，术语“感染”意指通过流感病毒在细胞或受试者中繁殖和/或存在的入侵。在一个实施例中，感染是“活性”感染，即其中病毒在细胞或受试者中复制的一种感染。此类感染的特征在于病毒从最初被病毒感染的细胞、组织和/或器官传播到其他细胞、组织和/或器官。感染也可以是潜伏性感染，即其中病毒不复制的一种感染。在某些实施例中，感染是指由于病毒在细胞或受试者中的存在或由于病毒对细胞或受试者的入侵而引起的病理状态。
流感病毒通常分为流感病毒类型：甲型、乙型和丙型。如本文所用，术语“流感病毒亚型”是指以血凝素(H)和神经酰胺酶(N)病毒表面蛋白的组合为特征的甲型流感病毒变体。根据本发明，流感病毒亚型可以用其H号表示，例如像“包含H3亚型的HA的流感病毒”、“H3亚型的流感病毒”或“H3流感”，或用H号和N号的组合表示，例如像“流感病毒亚型H3N2”或“H3N2”。术语“亚型”具体包括每种亚型中的所有个体“株系”，这些“株系”通常是由突变引起的并且显示出不同的致病性谱，包括天然分离株以及人造突变体或重配体等。此类株系还可以称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，如本文所用，术语“株系”和“分离株”可以互换使用。人类流感病毒株系或分离株的当前命名法包括病毒的类型(属)(即甲型、乙型或丙型)、首次分离的地理位置、株系编号和分离年份，通常在括号中给出了HA和NA的抗原描述，例如A/莫斯科/10/00(H3N2)。非人类株系在命名法中还包括起源宿主。
这些甲型流感病毒亚型可以通过参考其系统发育类别进一步分类。系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要类别：尤其是在系统发育类别1(“1类”流感病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育类别2(“2类”流感病毒)中的H3、H4、H7和H10亚型。
如本文所用，术语“流感病毒疾病”或“流感”是指因流感病毒例如甲型或乙型流感病毒在受试者中的存在而引起的病理状况。如本文所用，术语“疾病”和“病症”可互换使用。在特定的实施例中，该术语是指由受试者感染流感病毒而引起的呼吸系统疾病。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链或双链的。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以进行化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(如不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等))、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和经修饰的键(例如，α异头核酸等)。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖具有其互补序列的其互补链。互补链也可用于例如反义疗法、杂交探针和PCR引物。
如本文所用，HA中氨基酸的编号基于H3编号，如Winter等人(1981)所述。因此，氨基酸残基或氨基酸位置的编号是指全长H3HA中的编号(尤其是，A/爱知/2/68中的氨基酸位置的编号)，如Winter等人(1981)所述和在图2中所示。该编号尤其是指SEQ ID NO:15中氨基酸位置的编号。例如，措词“在位置392处的氨基酸”或“与在位置392处的氨基酸相对应的氨基酸”(在本申请全篇中可互换使用)是指根据Winter等人(1981)的H3编号在位置392处的氨基酸残基。注意，因为在本发明的多肽中HA1结构域的一部分(头部结构域)已经缺失，所以如本文所用的编号不一定是指本发明的HA茎部多肽中的氨基酸的实际位置。技术人员将进一步理解，其他流感病毒株系和/或亚型如H1 HA中和本发明的茎部多肽中的等效氨基酸可以通过序列比对来确定(例如图14所示)。
如本领域技术人员已知的，“多肽”是指通过酰胺键连接的氨基酸的聚合物。如本文所用，该术语可以指通过共价酰胺键连接的单条多肽链。该术语还可以指通过非共价相互作用如离子接触、氢键、范德华接触和疏水性接触缔合的多条多肽链。本领域技术人员将认识到，该术语包括已被修饰的多肽，例如通过翻译后加工如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接和O-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的多肽。
“HA茎部多肽”是指不含天然存在的(或野生型)血凝素(HA)的头部结构域的HA衍生多肽。如本文所用，术语“野生型”是指来自天然循环的流感病毒的HA。
具体实施方式
流感病毒对全球公共卫生具有重大影响，造成每年数百万例的严重疾病、数千人死亡以及相当大的经济损失。当前的三价或四价流感疫苗会引发对疫苗株系和密切相关的分离株的有效中和抗体应答，但是很少扩展到亚型中更多不同的株系或其他亚型。另外，对适当的疫苗株系的选择呈现出许多挑战，并经常产生次优保护作用。此外，目前尚无法预测下一大流行病毒的亚型，包括其出现的时间和地点。
血凝素(HA)是来自流感病毒的主要包膜糖蛋白，是中和抗体的主要靶标。血凝素在进入过程中具有两种主要功能。首先，血凝素通过与唾液酸受体的相互作用介导病毒附着于靶细胞表面。其次，在病毒胞吞作用后，血凝素随后触发病毒膜和内体膜融合，以将其基因组释放到靶细胞的细胞溶质中。HA包含约500个氨基酸的大胞外域，该胞外域被宿主来源的酶裂解，生成2个仍通过二硫键连接的多肽(HA1和HA2)。大部分N-末端片段(HA1结构域，320-330个氨基酸)形成膜远端球状“头部结构域”，该膜远端球状“头部结构域”含有受体结合位点和大多数被病毒中和抗体识别的决定子。较小的C-末端部分(HA2结构域，约180个氨基酸)形成茎状结构，该茎状结构将球状结构域锚定至细胞膜或病毒膜。亚型之间的序列同一性程度在HA1多肽(亚型之间的同一性为34％-59％)中比在HA2多肽(同一性为51％-80％)中小。最保守的区域是蛋白酶裂解位点周围的序列，特别是HA2N端的23个氨基酸，该序列在所有甲型流感病毒亚型中都是保守的(Lorieau等人，2010)。该区域的一部分在HA前体分子(HA0)中以表面环的形式暴露，但是当HA0裂解为HA1和HA2时变得无法接近。
大多数中和抗体与围绕受体结合位点的环结合，从而干扰受体的结合和附着。由于这些环是高度可变的，因此靶向这些区域的大多数抗体具有株系特异性，从而解释了当前疫苗引发此类有限的株系特异性免疫的原因。然而，近来，生成了针对流感病毒血凝素的具有广泛交叉中和效力的全人单克隆抗体，像例如CR6261。功能和结构分析揭示，这些抗体会干扰膜融合过程，并针对1类流感HA蛋白茎部结构域中高度保守的表位(Throsby等人,2008；Ekiert等人2009,WO 2008/028946)。通过鉴定与许多1类和2类HA分子交叉反应的CR9114(如WO 2013/007770中所述)，很明显人类免疫系统有可能引发针对流感病毒的非常广泛的中和抗体。然而，考虑到每年疫苗接种方案的需要，在用亚型H1和/或H3的(季节性)流感病毒感染或疫苗接种后，这些抗体显然不被引发，或仅在非常低的程度上引发。
根据本发明，提供了新型HA茎部多肽，该新型HA茎部多肽模拟抗体CR6261(包含SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区)和/或抗体CR9114(包含SEQ IDNO:9的重链可变区和SEQ ID NO:10的轻链可变区)的特异性表位。当单独地或与其他预防性和/或治疗性治疗组合在体内施用时，本发明的多肽可用于引发流感病毒中和抗体，优选交叉中和抗体。“交叉中和抗体”意指能够中和来自系统发育类别1的至少两个，优选至少三个、四个或五个不同亚型的甲型流感病毒，或来自系统发育类别2的至少两个，优选至少三个、四个或五个不同亚型的甲型流感病毒，或至少两个不同亚型的乙型流感病毒的抗体，或意指能够中和至少一种1类流感病毒和至少一种2类流感病毒和/或至少一种乙型流感病毒的抗体。
稳定地呈递这些抗体的表位的流感HA茎部多肽先前已经在WO 2013/079473中进行了描述。这些HA茎部多肽中的至少一些能够稳定地呈递CR6261和/或CR9114的表位，并且经证实在小鼠中具有免疫原性。另外的能够稳定地呈递CR6261和/或CR9114的表位的HA茎部结构域多肽在WO 2014/191435、WO 2016/005480和WO 2016/005482中进行了描述。
与先前描述的HA茎部多肽相比，包含新型修饰的本发明的HA茎部多肽显示出在哺乳动物细胞中提高的表达水平、提高的三聚倾向(例如，通过AlphaLISA测量)和/或提高的热稳定性水平(例如，通过动态扫描荧光法/量热法(DSF/DSC)测量)。另外，所有测试的bnAb对本发明的多肽的亲和力均小于1nM(通过Octet和ELISA测量)，类似于抗体对全长HA的亲和力。这清楚地显示，这些多肽模拟天然全长HA的茎部。此外，新型HA茎部多肽不需要任何人工接头、标签，也不需要N或C-末端三聚结构域。
因此本发明提供包含HA1和HA2结构域的1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与包含HA1和HA2结构域的全长HA多肽(HA0)的氨基酸序列相比包含：
(i)该HA1结构域中头部区域的缺失；
(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中的修饰，
(iii)至少2个形成单体内二硫桥的半胱氨酸残基；
(iv)至少2个形成单体间二硫桥的半胱氨酸残基；
其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且其中这些氨基酸位置的编号基于根据Winter等人(1981)的H3编号。
因此，本发明提供了HA茎部多肽(即无头HA多肽)，这些HA茎部多肽包含：
该HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中的修饰，
至少2个形成单体内二硫桥的半胱氨酸残基；
至少2个形成单体间二硫桥的半胱氨酸残基；
其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且其中这些氨基酸位置的编号基于Winter等人(1981)中使用的H3编号。
在某些实施例中，本发明提供了包含HA1和HA2结构域的1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，其中所述HA茎部多肽包含的氨基酸序列与包含HA1和HA2结构域包含HA1和HA2结构域的全长HA多肽(HA0)的氨基酸序列相比包含：
(i)HA1结构域中头部区域的缺失，所述缺失至少包含从位置53处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列；
(ii)HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中三聚区域中的修饰，所述区域包含从与位置位置405处的氨基酸相对应的氨基酸直到并且包括与位置位置419处的氨基酸相对应的氨基酸的氨基酸序列；
(iii)位置310处的半胱氨酸和位置422处的半胱氨酸；
(iv)位置397处的半胱氨酸结合位置405处的半胱氨酸；或位置396处的半胱氨酸结合位置408处的半胱氨酸；或位置399处的半胱氨酸结合位置405处的半胱氨酸；
其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且其中与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q；其中氨基酸位置的编号基于根据Winter等人(1981)的H3编号。
在某些实施例中，本发明提供了1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，这些多肽包含：
(i)HA1结构域中头部区域的缺失，所述缺失至少包含从位置53处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列；
(ii)HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中三聚区域中的修饰，所述区域包含从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸的氨基酸序列；
(iii)位置310和422处的氨基酸到C的突变；
(iv)位置397处的氨基酸到C的突变和位置405处的氨基酸到C的突变；或位置396处的氨基酸到C的突变和位置408处的氨基酸到C的突变；或位置399处的氨基酸到C的突变和位置405处的氨基酸到C的突变；
其中这些多肽还包含在B环中的至少一个突变，所述B环包含从位置385处的氨基酸直到并且包括位置404处的氨基酸的氨基酸序列，其中B环中的所述至少一个突变是位置392处的氨基酸到P、R或Y的突变，优选到P或R的突变；并且其中这些多肽包含位置434处的氨基酸到Q的突变；
其中氨基酸位置的编号基于Winter等人(1981)中使用的H3编号。
根据本发明，令人惊奇地发现例如通过在B环中引入在位置392处的氨基酸到Y、P或R，优选P或R的突变而在位置392处具有氨基酸残基Y、P或R，优选P或R；结合例如通过引入在位置434处的氨基酸到Q的突变而在位置434处具有氨基酸位置Q的HA茎部多肽，与先前描述的HA茎部多肽相比，显示出提高的表达水平、提高的三聚倾向和/或提高的稳定性。另外，本发明的HA茎部多肽能够诱导针对流感病毒的免疫应答。
如本领域技术人员已知的，全长流感血凝素(HA0)通常包含HAl结构域和HA2结构域。茎部结构域由HAl结构域的两个区段和大部分或整个HA2结构域形成。在一级序列中，HAl结构域的两个片段被球状头部结构域隔开。如本文所述，与野生型全长HA多肽(HA0)的氨基酸序列，尤其是1类HA的氨基酸序列相比，本发明的HA茎部多肽包含的氨基酸序列在HA1和/或HA2结构域中包含若干修饰。
因此，流感HA多肽的HA1结构域中的至少一部分高度可变的免疫显性头部已从全长HA(HA0)蛋白中缺失以产生也称为“微型HA”的茎部多肽(图1A，第二种设计)，所述部分至少包含从位置53处的氨基酸开始直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列。HA1结构域的其余部分直接连接或通过1至10个氨基酸的接头连接。因此，例如，当从位置53处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列缺失时，位置52处的氨基酸与位置303处的氨基酸直接连接或通过用1至10个氨基酸的接头替换所缺失的头部区域来连接。在HA1结构域中从位置53处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列的缺失是最小的缺失(图1A，第二种设计)。根据本发明，还可以缺失HA1结构域的较大部分，例如，从位置46处的氨基酸开始直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列，如图1A所示，第三种设计。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置46处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置48处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置49处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置50处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置51处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置52处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置53处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置53处的氨基酸直到并且包括位置305处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置48处的氨基酸直到并且包括位置304处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置48处的氨基酸直到并且包括位置305处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置46处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置46处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置48处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置49处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置50处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置51处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置52处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1结构域中的缺失包含从位置53处的氨基酸直到并且包括位置308处的氨基酸的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，HA1结构域中的缺失至少包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，HA1结构域中的缺失由从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，HA1结构域中的缺失已被1至10个氨基酸的连接序列替换。
另外，本发明的HA茎部多肽包含HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中的修饰，以便在头部区域缺失之后改善HA茎部多肽的三聚。根据本发明，HA2结构域中的所述修饰是增强HA茎部多肽的三聚的修饰。
在某些实施例中，所述修饰包括在C-螺旋中引入异源三聚结构域。通常应理解，C-螺旋包含从位置405处的氨基酸直到并且包括位置434处的氨基酸的氨基酸序列(H3编号)。在一个优选的实施例中，所述异源三聚结构域已经在与从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸的氨基酸序列相对应的位置处引入(图1A)。因此，在某些实施例中，HA2结构域中从位置405直到位置419的原始(wt)氨基酸序列已被相同长度(即具有相同数目的氨基酸)的异源三聚序列替换。
在某些实施例中，异源三聚结构域是GCN4序列。
在某些优选的实施例中，异源三聚序列包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:18)；
RIKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:19)；
RMEALEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:20)；
RIEALEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:21)；
RMENLEKKVDDIEEK(SEQ ID NO:22)；以及
RIENLEKKVDDIEEK(SEQ ID NO:23)。
在一些实施例中，异源三聚序列的至少一个氨基酸已突变到C，使得能够形成单体间的半胱氨酸桥。
在某些优选的实施例中，异源三聚序列因此包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:24)；
CIKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:25)；
CMEALEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:26)；
CIEALEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:27)；
RMECLEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:28)；以及
RIECLEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:29)。
在一个优选的实施例中，异源三聚序列包含氨基酸序列CMKQIEDKIEEIESK(SEQ IDNO:24)。
在某些实施例中，修饰包括对C-螺旋中，优选三聚区域中的七肽重复序列的优化，该七肽重复序列包含从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸的氨基酸序列。表示为[abcdefg]n的七肽重复序列通常在a和d处具有疏水性残基，并且在e和g处具有极性/带电荷的残基。这些基序是大多数卷曲螺旋结构的基础，卷曲螺旋结构是蛋白质中的结构基序，其中α-螺旋像绳的各股一样卷绕在一起(二聚体和三聚体是最常见的类型)(Ciani等人，2010)。
作为进一步的修饰，根据本发明的HA茎部多肽包含至少两个(能够)形成单体内半胱氨酸(或二硫)桥的半胱氨酸残基。可以通过使至少一个残基(如果另一个已经是半胱氨酸)突变，但通常是通过使空间上靠近的两个残基突变成半胱氨酸来引入工程化半胱氨酸桥，半胱氨酸将自发地或通过主动氧化在这些残基的硫原子之间形成共价键。在一个优选的实施例中，多肽在位置310处包含半胱氨酸并且在位置422处包含半胱氨酸，从而使得能够形成单体内半胱氨酸桥。在某些实施例中，多肽在位置310和422处包含氨基酸到C的突变，从而形成所述单体内半胱氨酸桥。因此这些半胱氨酸残基形成稳定蛋白质的单体内半胱氨酸(或二硫)桥(参见图4)。
此外，为了获得稳定的三聚体HA茎部多肽，本发明的多肽包含至少两个形成单体间(原聚体间)半胱氨酸桥的半胱氨酸残基。因此，在某些实施例中，多肽包含位置397处的半胱氨酸结合位置405处的半胱氨酸；或位置396处的半胱氨酸结合位置408处的半胱氨酸；或位置399处的半胱氨酸结合位置405处的半胱氨酸。
在某些实施例中，多肽包含位置397处的氨基酸到C的突变和位置405处的氨基酸到C的突变；或位置396处的氨基酸到C的突变和位置408处的氨基酸到C的突变；或位置399处的氨基酸到C的突变和位置405处的氨基酸到C的突变，从而在第一单体的位置397处的半胱氨酸与第二单体的位置405处的半胱氨酸之间；或在第一单体的位置396处的半胱氨酸与第二单体的位置408处的半胱氨酸之间；或在第一单体的位置399处的半胱氨酸与第二单体的位置405处的半胱氨酸之间形成单体间半胱氨酸桥。注意，在一些实施例中，位置405和408处的氨基酸在异源三聚序列内。
在一个优选的实施例中，多肽在位置397处包含半胱氨酸并且在位置405处包含半胱氨酸，从而在第一单体的位置397处的半胱氨酸与第二单体的位置405处的氨基酸之间形成单体间半胱氨酸桥。
在某些优选的实施例中，多肽包含位置397处的氨基酸到半胱氨酸的突变和位置405处的氨基酸到半胱氨酸的突变，从而在第一单体的位置397处的半胱氨酸与第二单体的位置405处的氨基酸之间形成单体间半胱氨酸桥。
此外，在某些实施例中，已在所谓的B环中引入至少一个突变，该B环包含从位置385处的氨基酸开始直到并且包括位置404处的氨基酸的氨基酸序列(参见图1C)。根据本发明，该至少一个突变是位置392处的氨基酸到P、R或Y，优选R或P的突变。在去除头部结构域之后，到R(带电荷的氨基酸)的突变消除了原始暴露的疏水性氨基酸(在大多数流感HA中为F)，并提高了表达的茎部多肽的溶解性和表达。到P氨基酸的突变降低了B环的螺旋倾向。在某些实施例中，B环中的该至少一个突变是位置392处的氨基酸到R的突变。在某些实施例中，B环中的该至少一个突变是位置392处的氨基酸到P的突变。
此外，在本发明的多肽的某些实施例中，与位置395处的氨基酸相对应的氨基酸是I，与位置399处的氨基酸相对应的氨基酸是Y或C，优选是Y，与位置400处的氨基酸相对应的氨基酸是P，与位置401处的氨基酸相对应的氨基酸是K，与位置402处的氨基酸相对应的氨基酸是S，和/或与位置404处的氨基酸相对应的氨基酸是R或Q(再次根据H3编号进行编号)。在某些实施例中，位置392处的氨基酸是P或R，位置395处的氨基酸是I；位置399处的氨基酸是Y；位置402处的氨基酸是S；并且位置404处的氨基酸是R或Q。
在优选的实施例中，与野生型HA多肽相比，这些多肽因此在B环中包含至少一种选自由以下组成的组的附加突变：
-与位置395处的氨基酸相对应的氨基酸到I的突变；
-与位置399处的氨基酸相对应的氨基酸到Y或C，优选Y的突变；
-与位置400处的氨基酸相对应的氨基酸到P的突变；
-与位置401处的氨基酸相对应的氨基酸到K的突变；
-与位置402处的氨基酸相对应的氨基酸到S的突变；以及
-与位置404处的氨基酸相对应的氨基酸到Q或R的突变。
在某些实施例中，与野生型HA多肽相比，这些多肽包含位置392处的氨基酸到P或R的突变，或位置395处的氨基酸到I的突变；位置399处的氨基酸到Y的突变；位置402处的氨基酸到S的突变；以及任选地位置404处的氨基酸到Q或R的突变。
在某些实施例中，位置392处的氨基酸是P或R，位置395处的氨基酸是I；位置399处的氨基酸是Y；位置401处的氨基酸是K；位置402处的氨基酸是S；以及任选地位置404处的氨基酸是R或Q。
在另一个优选的实施例中，与野生型HA多肽相比，这些多肽包含位置392处的氨基酸到P或R的突变，或位置395处的氨基酸到I的突变；位置399处的氨基酸到Y的突变；位置401处的氨基酸到K的突变；位置402处的氨基酸到S的突变；以及任选地位置404处的氨基酸到R或Q的突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包含B环，该B环包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
IEKMNTQYTAIGKEYNKSER(SEQ ID NO:126)；
IEKMNTQYTAIGCEYNKSER(SEQ ID NO:127)；
IEKMNTQPTAIGCEYNKSEQ(SEQ ID NO:128)；
IEKMNTQRTAIGCEFNKSEQ(SEQ ID NO:129)；
IEKMNTQPTAIGCEYNKSER(SEQ ID NO:130)；
IEKMNTQPTAIGCEFNKSEQ(SEQ ID NO:131)；
IEKMNTQRTAIGCEYNKSER(SEQ ID NO:132)；
IEKMNTQRTAICKEYPKSEQ(SEQ ID NO:133)；以及
IEKMNTQRTAIGKECNKSER(SEQ ID NO:134)。
此外，根据本发明，位置434处的氨基酸是Q。在某些实施例中，HA茎部多肽因此包含位置434处的氨基酸到Q的突变，该突变改善了其氢键相互作用。在某些实施例中，位置434处的氨基酸是Q，位置442处的氨基酸是A。在某些实施例中，多肽包含位置434处的氨基酸到Q的突变，以及位置442处到A的突变。这些突变改善了D和E螺旋以及附近的融合肽和B2B3环中的三聚体界面相互作用。
再次值得注意的是，如本文所用，氨基酸位置的编号基于根据Winter等人(1981)的H3编号。还要再次注意的是，如本文所用的氨基酸位置的编号基于全长H3HA多肽(HA0)中的位置编号。因此，如本文所用，“位置434处的氨基酸”是指H3HA0中位置434处的氨基酸。因此，由于头部区域的缺失，该编号不是指本发明的HA茎部多肽中氨基酸的实际位置(参见图14)。
此外，在某些实施例中，与位置323处的氨基酸相对应的氨基酸是K和/或与位置326处的氨基酸相对应的氨基酸是K。在一个优选的实施例中，位置323处的氨基酸是K并且位置326处的氨基酸是K。
在某些实施例中，与位置339处的氨基酸相对应的氨基酸是T。
在某些实施例中，与位置438处的氨基酸相对应的氨基酸是E和/或与位置442处的氨基酸相对应的氨基酸是I。
因此，在某些实施例中，与野生型HA多肽相比，这些HA茎部多肽在HA1和/或HA2结构域中还包含一个或多个附加突变。
在某些实施例中，这些多肽包含与位置323处的氨基酸相对应的氨基酸到K的突变和/或与位置326处的氨基酸相对应的氨基酸到K的突变。这些突变增加了分子的溶解性和表达。在另一个实施例中，本发明的茎部多肽包含位置323处的氨基酸到K的突变和位置326处的氨基酸到K的突变。
在某些实施例中，多肽包含与位置339处的氨基酸相对应的氨基酸到T的突变。该突变去除了融合肽环(FP环)中溶剂暴露的疏水性氨基酸，从而增加了分子的溶解性。
在某些优选的实施例中，位置323处的氨基酸是K，位置326处的氨基酸是K，位置339处的氨基酸是T，位置392处的氨基酸是Y、P或R，优选P或R，位置395处的氨基酸是I，位置399处的氨基酸是Y，位置402处的氨基酸是S，位置404处的氨基酸是Q或R，位置434处的氨基酸是Q。
在某些优选的实施例中，多肽包含位置323处的氨基酸到K的突变，位置326处的氨基酸到K的突变，位置339处的氨基酸到T的突变，位置392处的氨基酸到P或R的突变，位置395处的氨基酸到I的突变，位置399处的氨基酸到Y的突变，位置402处的氨基酸到S的突变，位置404处的氨基酸到Q或R的突变，以及位置434处的氨基酸到Q的突变。
在某些优选的实施例中，位置323处的氨基酸是K，位置326处的氨基酸是K，位置339处的氨基酸是T，位置392处的氨基酸是P或R，位置395处的氨基酸是I，位置399处的氨基酸是Y，位置402处的氨基酸是S，位置404处的氨基酸是Q或R，位置434处的氨基酸是Q，以及位置442处的氨基酸是A。
在某些优选的实施例中，多肽包含位置323处的氨基酸到K的突变，位置326处的氨基酸到K的突变，位置339处的氨基酸到T的突变，位置392处的氨基酸到P或R的突变，位置395处的氨基酸到I的突变，位置399处的氨基酸到Y的突变，位置402处的氨基酸到S的突变，位置404处的氨基酸到Q或R的突变，位置434处的氨基酸到Q的突变，以及位置442处的氨基酸到A的突变。
在某些实施例中，多肽包含至少一种选自由以下组成的组的另外的突变：与位置438处的氨基酸相对应的氨基酸到E的突变，作为可能替代性的带负电荷的氨基酸；以及与位置442处的氨基酸相对应的氨基酸到I的突变，以增加三聚体界面中的疏水性。
根据本发明，HA茎部多肽是1类HA多肽。因此，根据本发明，本文所述的修饰已被引入来自系统发育类别1的流感病毒(如包含H1、H2或H5亚型的HA的流感病毒)的HA中，从而产生了本发明的HA茎部多肽。在某些实施例中，HA茎部多肽是H1 HA多肽。因此，在某些实施例中，HA茎部多肽源自包含H1亚型的HA的甲型流感病毒的HA，如源自甲型流感病毒/布里斯班/59/2007(H1N1)(具有氨基酸序列SEQ ID NO:1)或A/加利福尼亚/07/09(H1N1)(具有SEQID NO:2的氨基酸序列)。技术人员将理解，本发明的多肽也可以源自类别1的其他甲型流感病毒株系的HA，这些甲型流感病毒株系包括但不限于A/德克萨斯/UR06-0526/2007(H1N1)(SEQ ID NO:3)、A/纽约/629/1995(H1N1)(SEQ ID NO:4)、A/AA_马顿/1943(H1N1)(SEQ IDNO:5)、A/波多黎各/8/1934(H1)、A/密歇根/45/2015(H1)、A/足立/2/57(H2N2)(SEQ ID NO:6)、A/新加坡/1/57(H2N2)(SEQ ID NO:7)，或源自包含H5亚型的HA的流感病毒，包括但不限于A/越南/1203/2004(H5N1)(SEQ ID NO:8)或A/香港/156/97(H5)。
如上所述，茎部多肽可以包含或不包含替换缺失的HA1序列从而连接两个剩余的HA1部分的1-10个氨基酸残基的连接序列。在某些实施例中，连接序列包含1至5个氨基酸。在某些实施例中，连接序列包含2、3或4个氨基酸。连接序列可以是异源连接序列，即在天然存在的或野生型HA中不存在的氨基酸序列，例如但不限于G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG和GSGSGSG。
在优选的实施例中，连接序列是同源连接序列，即源自缺失的相应头部区域的氨基酸序列，例如但不限于AGSG、AGS、GSG、HAGA、DQEG、DTPV、FPKT、EPGD、EPG、TGNL、TPSS、TPS、ATGN、YPGD。
在优选的实施例中，多肽不包含连接序列。
如上所述，流感HA0蛋白(在HA1和HA2中)的裂解是其活性所必需的，通过引起宿主内体膜与病毒膜的融合而促进病毒基因组进入靶细胞。
在某些实施例中，本发明的多肽包含天然蛋白酶裂解位点。因此，已知跨越HA1和HA2的Arg(R)-Gly(G)序列(即氨基酸位置329和330)是胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶的识别位点，并且通常被裂解以激活血凝素(图1A)。
在某些实施例中，多肽不包含蛋白酶裂解位点。因此，在某些优选的实施例中，通过使位置329处的氨基酸残基突变为除精氨酸(R)或赖氨酸(K)以外的任何氨基酸，去除了蛋白酶裂解位点。在某些实施例中，位置329处的氨基酸残基不是精氨酸(R)。在一个优选的实施例中，多肽包含位置329处的氨基酸到谷氨酰胺(Q)的突变。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包含裂解位点敲除突变R329Q，以防止在施用后体外或体内产生期间对分子的推定裂解。
在其他实施例中，多肽包含多元裂解位点，例如弗林蛋白酶裂解位点(如实例6中所述)。因此，多肽可以在细胞内被弗林蛋白酶样蛋白酶裂解以产生经裂解的微型HA，类似于天然折叠并加工的HA。
在某些实施例中，多肽不包含信号序列。信号序列(有时称为信号肽、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)是存在于预定进入分泌途径的大多数新合成的蛋白质的N端的短肽(通常长度为16至30个氨基酸)。信号序列的作用是促使细胞将蛋白质易位，通常易位至细胞膜。在许多情况下，包含信号肽的氨基酸一旦达到其最终目的地，就会从蛋白质上裂解下来。在流感HA中，信号序列通常包含全长HA0的氨基酸序列的前16个氨基酸(对应于根据H3编号从位置-6到位置10的氨基酸)。
在某些实施例中，多肽包含信号序列(的一部分)。多肽可包含野生型信号序列(的一部分)或者可包含替代信号序列的(一部分)，例如但不限于选自由以下组成的组的信号序列：
MGSTAILGLLLAVLQGVCA(SEQ ID NO:136)和
MGMTSALLALLALALKPGAWA(SEQ ID NO:137)。
在某些实施例中，多肽包含HA2结构域，该HA2结构域包含跨膜和细胞质结构域(对应于从与位置515处的氨基酸相对应的氨基酸开始直到并且包括与位置550处的氨基酸相对应的氨基酸的氨基酸序列(H3编号))。
为了产生分泌的(可溶性)茎部多肽，在某些实施例中，多肽不包含跨膜和细胞质结构域。因此，在某些实施例中，多肽包含截短的HA2结构域，尤其是在C-末端处截短的HA2结构域。因此，根据本发明的截短的HA2结构域因缺失在HA2结构域C末端处的一个或多个氨基酸残基而比全长HA2序列短。
在某些实施例中，从与位置516处的氨基酸相对应的氨基酸开始的HA2结构域的C-末端部分已缺失，从而基本上去除了整个跨膜和细胞质结构域。
在某些实施例中，C-末端螺旋的一部分也已缺失。根据本发明，已经发现，即使当HA2结构域的较大部分缺失时，也可以提供稳定的可溶性HA茎部多肽。因此，在某些实施例中，从位置500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514或515处的氨基酸序列开始的HA2结构域的C-末端部分已经缺失(再次根据如Hinter等人(同上)所述的H3编号进行编号)，以在细胞中表达后产生可溶性多肽(图12)。
在一个优选的实施例中，从对应于516的位置开始的HA2结构域的C-末端部分已经缺失。
任选地，异源氨基酸序列(即在流感HA中非天然存在的氨基酸序列)已经与(截短的)HA2结构域连接。
因此，在某些实施例中，His-标签序列，例如HHHHHH(SEQ ID NO:113)或HHHHHHH(SEQ ID NO:114)或FLAG标签(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:115)或这些的组合已连接至(任选截短的)HA2结构域的C-末端氨基酸，用于检测和/或纯化的目的。在某些实施例中，异源氨基酸序列如His标签序列可以通过接头与(截短的)HA2结构域连接。在某些实施例中，接头可含有蛋白水解裂解位点(的一部分)，例如氨基酸序列IEGR(SEQ ID NO:116)或LVPRGS(SEQID NO:117)，以在纯化后酶促去除His-标签序列。
在某些实施例中，与(截短的)HA2结构域的C-末端氨基酸连接的异源氨基酸序列包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(折叠子)，(SEQ ID NO:118)，
SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(Flag-折叠子-His标签)，(SEQ ID NO:119)，
SGRDYKDDDDKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHHHHHH(FLAG-GS接头-His标签)，(SEQ ID NO:120)，
EGRAAAGGSGGGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAAAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEK(Nanoluc-Strep标签)，(SEQ ID NO:121)，
EGRAAAGGSGGGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGAAEPEA(Nanoluc-C标签)，(SEQ ID NO:122)，
EGRAAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEK(Strep标签，SEQ ID NO:154)，
EGRAAALPETGGGAAEPEA(分选酶-C标签)，(SEQ ID NO:123)，
SGRDYKDDDDKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSWSHPQFEKGAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEK(FLAG-GS接头-Strep标签)，(SEQ ID NO:124)和
EGRAAAEQKLISEEDLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSWSHPQFEKGAAWSHPQFEKGAAWSHPQFEK(Myc标签-GS接头-Strep标签)，(SEQ ID NO:125)。
在某些实施例中，异源三聚结构域已经连接至(任选截短的)HA2结构域的C-末端氨基酸，例如但不限于“折叠子”三聚结构域(如Letarov等人(1993)；S-Guthe等人(2004)所述)，
在某些实施例中，HA茎部多肽包含至少包含SEQ ID NO:30的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:52的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:54的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:56的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:58的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:60的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:62的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:64的氨基酸1-230的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:66的氨基酸1-232的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:67的氨基酸1-233的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:68的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:69的氨基酸1-235的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:70的氨基酸1-236的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:71的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:72的氨基酸1-238的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:73的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:74的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:75的氨基酸1-228的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:76的氨基酸1-229的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:77的氨基酸1-230的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:78的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:79的氨基酸1-232的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:80的氨基酸1-233的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:81的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:82的氨基酸1-235的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:83的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:84的氨基酸1-233的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:85的氨基酸1-235的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:86的氨基酸1-233的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:88的氨基酸1-233的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:90的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:91的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:92的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:94的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:95的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:96的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:97的氨基酸1-233的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:98的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:99的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:100的氨基酸1-232的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:101的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:102的氨基酸1-238的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:103的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:104的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:105的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:106的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:108的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:109的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:110的氨基酸1-231的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:111的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:112的氨基酸1-237的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:135的氨基酸1-234的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:147的氨基酸18-248的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:148的氨基酸18-248的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:149的氨基酸18-248的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:150的氨基酸17-247的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:151的氨基酸17-247的氨基酸序列；
至少包含SEQ ID NO:152的氨基酸16-246的氨基酸序列；或
至少包含SEQ ID NO:153的氨基酸18-248的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，多肽包含至少包含SEQ ID NO:103、104、109或110的氨基酸1-231的氨基酸序列。
在某些实施例中，多肽包含选自由SEQ ID NO:31、31、52-112和135组成的组的氨基酸序列。
在一个优选的实施例中，多肽包含选自由SEQ ID NO:103、104、109和110组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中，当在合适的细胞(例如哺乳动物细胞)中表达时，多肽被糖基化。多肽可以含有一个或多个天然糖基化基序。在某些实施例中，多肽包含至少一个附加/引入的糖基化基序。在某些实施例中，该至少一个糖基化基序已经通过使位置402处的氨基酸突变为S而引入。该突变将在位置400处引入n-连接的糖基化基序。
这些多肽还可以与纳米颗粒像例如聚合物、脂质体、病毒体、病毒样颗粒组合或缀合来施用。多肽可与纳米颗粒组合、包裹在纳米颗粒中或与纳米颗粒缀合(例如共价连接或吸附)
本发明还提供了编码本发明的流感HA茎部多肽的核酸分子。本领域技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术产生不影响由所描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核酸分子”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
在某些实施例中，对编码流感HA茎部多肽的核酸分子进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞如人细胞中表达。密码子优化的方法是已知的并且先前已经描述(例如WO 96/09378)。
在某些实施例中，编码流感HA茎部多肽的核酸分子包含选自SEQ ID NO:138-145的核酸序列。
流感血凝素茎部结构域多肽可以根据认为适合技术人员的任何技术(包括以下描述的技术)来制备。因此，本发明的多肽可以通过本领域已知的标准方法合成为DNA序列，并使用合适的限制酶和本领域已知的方法克隆并随后在体外或体内表达。
本发明还涉及包含编码本发明多肽的核酸分子的载体。因此，在某些实施例中，根据本发明的核酸分子是载体(例如质粒)的一部分。此类载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且例如被设计为能够在原核和/或真核细胞中复制。所使用的载体可以是适合克隆DNA并且可以用于转录目标核酸的任何载体。当使用宿主细胞时，优选载体是整合载体。替代性地，载体可以是游离复制载体。本领域技术人员能够选择合适的表达载体，并以功能性方式插入本发明的核酸序列中。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，本领域技术人员熟知，能够驱动表达的序列可以与编码多肽的核酸序列功能性连接，从而产生可表达形式的编码蛋白质或多肽的重组核酸分子。驱动表达的序列可以包括启动子、增强子等，及其组合。这些应能够在宿主细胞中起作用，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。本领域技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中基因的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同的来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或人工设计的。目标核酸的表达可以从天然启动子或其衍生物开始或从完全异源的启动子开始(Kaufman,2000)。在真核细胞中用于表达的一些熟知的并且常用的启动子包括源自病毒的启动子，如源自腺病毒的启动子，例如E1A启动子；源自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如CMV立即早期(IE)启动子(本文称为CMV启动子)(例如可从pcDNA获得，英杰公司(Invitrogen))；源自猿猴病毒40(SV40)的启动子(Das等人,1985)等等。合适的启动子也可以源自真核细胞，如金属硫蛋白(MT)启动子、延伸因子1α(EF-1α)启动子(Gill等人,2001)、泛素C或UB6启动子(Gill等人,2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。对启动子功能和启动子强度的测试是本领域技术人员的常规工作，并且通常例如可以涵盖在启动子序列后克隆测试基因如lacZ、荧光素酶、GFP等，并进行测试该测试基因的表达。当然，可以通过其中序列的缺失、添加、突变来改变启动子，并测试其功能性，以发现新的、减毒的或改良的启动子序列。根据本发明，优选在选择的真核细胞中产生高转录水平的强启动子。
可以使用本领域技术人员熟知的方法将构建体转染到真核细胞(例如植物、真菌、酵母或动物细胞)或合适的原核表达系统如大肠杆菌中。在一些情况下，可以将合适的“标签”序列(像例如但不限于his-、myc-、strep-、分选酶或flag-标签)或完全蛋白质(像例如但不限于麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶)添加到如上所述的本发明的序列上，以允许从细胞或上清液中纯化和/或鉴定多肽。任选地，可以包含含有特定蛋白水解位点的序列，以便之后通过蛋白水解消化去除标签。
在优选的实施例中，多肽在哺乳动物细胞中产生。
可以通过本领域已知的光谱方法(例如，圆二色光谱法、傅立叶变换红外光谱法和NMR光谱法或X射线晶体学)分析纯化的多肽，以研究所需结构如螺旋和β折叠的存在。ELISA、AlphaLISA、生物层干涉测量法(Octet)和FACS等可用于研究本发明的多肽与广泛中和抗体如CR6261和/或CR9114的结合。因此，可以选择具有正确构象的根据本发明的多肽。可以例如通过在非还原条件下使用SDS凝胶电泳、在广泛中和抗体如CR6261和/或CR9114的抗体Fab片段的存在下使用尺寸排阻色谱法，以及使用不同标记抗体的AlphaLISA来分析三聚体含量。可以如上所述在温度应力、冻融循环、增加的蛋白质浓度或搅动之后评估多肽的稳定性。可以通过差示扫描荧光法(DSF)和/或差示扫描量热法(DSC)进一步评估多肽的解链温度。
在某些实施例中，载体是人重组腺病毒。因此，本发明还提供了重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码根据本发明的HA茎部多肽的核酸分子。在一个优选的实施例中，编码茎部多肽的核酸分子包含选自由SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:145组成的组的核酸序列。
重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。如本文所用，针对腺病毒的术语“重组”暗示它已被人工修饰，例如其具有在其中以保持活性地克隆的经改变的末端和/或其包含异源基因，即它不是天然存在的野生型腺病毒。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一种必需基因功能中是有缺陷的，E1区域属于对病毒复制的必需腺病毒基因组。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在E1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述E1缺陷的，或E1、E3缺陷的腺病毒载体可以进一步在E4区域的至少一个必需基因和/或E2区域(例如，E2A区域和/或E2B区域)的至少一个必需基因上是有缺陷的。腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法在本领域中是熟知的，并且在例如美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913中有所描述。
在某些实施例中，该腺病毒是血清型26或35的人腺病毒。
本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的多肽、核酸和/或载体，以及药学上可接受的载剂。本发明尤其涉及包含治疗有效量的本发明的多肽、核酸和/或载体的药物组合物。这些药物组合物还包含药学上可接受的载剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins[肽和蛋白的制药配方开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[2000]；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients[药用辅料手册],第3版,A.Kibbe编辑,英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。术语“载剂”是指与多肽、核酸和/或载体一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液及右旋糖和甘油水溶液可以例如用作液体载剂，特别是对于注射液而言。
本发明还涉及用作药物的如本文所述的多肽、核酸和/或载体。
本发明尤其涉及用于诱导针对流感病毒的免疫应答的如本文所述的多肽、核酸和/或载体。
本发明还涉及在有需要的受试者中诱导针对甲型流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括向所述受试者施用如上所述的多肽、核酸分子和/或载体。根据本发明的受试者优选是能够感染流感病毒或以其他方式可以从诱导免疫应答受益的哺乳动物，此类受试者例如是啮齿类动物(例如小鼠、白鼬)，或是家畜或农场动物，或是非人类灵长类动物，或是人。优选地，该受试者是人类受试者。
在某些实施例中，本发明提供了诱导针对1类甲型流感病毒的免疫应答的方法。免疫应答可以包括体液(即诱导流感病毒中和抗体)和/或细胞免疫应答。在某些实施例中，本发明提供了诱导针对至少两种、三种、四种、五种或六种亚型的甲型流感病毒的免疫应答的方法。在某些实施例中，本发明提供了诱导针对包含H1亚型的HA的流感病毒的免疫应答的方法。
在某些实施例中，所诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由1类甲型流感病毒如包含H1亚型的HA的甲型流感病毒、和/或包含H2亚型的HA的甲型流感病毒、和/或包含H5亚型的HA的甲型流感病毒引起的流感病毒感染。在某些实施例中，所诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由包含H1亚型的HA的甲型流感病毒引起的流感病毒感染。
本发明还涉及用作流感疫苗的如本文所述的多肽、核酸和/或载体。
在某些实施例中，本发明的多肽、核酸分子和/或载体与佐剂组合施用。可以在本发明的多肽、核酸分子和/或载体施用之前、同时或之后施用佐剂。合适的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，像例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT、百日咳毒素PT或破伤风类毒素TT)；基质M；或其组合。另外，可以使用已知的免疫增强技术，如将本发明的多肽与本领域已知的蛋白质融合以增强免疫应答(例如破伤风类毒素、CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白等)，或将这些多肽包括在病毒体中，或其组合。
根据本发明的多肽、核酸分子和/或载体的施用可以使用标准的施用途径来进行。非限制性实例包括肠胃外施用，如静脉内、皮内、透皮、肌内、皮下等，或粘膜施用，例如鼻内、经口等。技术人员将能够确定施用根据本发明的多肽、核酸分子和/或载体以便诱导免疫应答的各种可能性。
在某些实施例中，多肽、核酸分子和/或载体施用一次以上，即以所谓的同源初免-加强方案进行施用。第二剂的施用可以例如在本发明的多肽、核酸分子和/或载体的第一剂施用后一周、在第一剂施用后两周、在第一剂施用后三周、在第一剂施用后一个月、在第一剂施用后六周、在第一剂施用后两个月、在第一剂施用后3个月或在第一剂施用后4个月或更久等直到在第一剂施用后数年进行。也可以将多肽、核酸辅助分子和/或载体施用两次以上，例如三次、四次等，以便在首次初免施用后再进行一次以上的加强施用。
多肽、核酸分子和/或载体还可以在异源初免-加强方案中作为初免来施用或作为加强来施用。
本发明还提供了在有需要的受试者中预防和/或治疗，优选预防流感病毒疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用如本文所述的多肽、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指多肽、核酸和/或载体有效预防、缓解和/或治疗因感染流感病毒而引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少流感病毒的传播或者抑制或减少与流感病毒感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如本文所用，改善可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。
需要治疗的受试者包括已经患有因感染流感病毒而引起的病状的受试者，以及其中要预防感染流感病毒的那些受试者。因此，可以将本发明的多肽、核酸和/或载体施用于原初受试者，即，未患有因流感病毒感染引起的疾病或尚未感染流感病毒和当前未感染流感病毒的受试者，或施用于已经感染了流感病毒的受试者。
在一个实施例中，预防和/或治疗可以针对易受流感病毒感染的患者群组。此类患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、免疫功能低下的受试者以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。
本发明的多肽、核酸分子和/或载体可以与一种或多种其他活性剂如替代性流感疫苗、单克隆抗体、抗病毒剂、抗菌剂和/或免疫调节剂组合施用于受试者。该一种或多种其他活性剂可有益于治疗和/或预防流感病毒疾病或者可改善与流感病毒疾病相关的症状或病症。在一些实施例中，该一种或多种其他活性剂是止痛药、退烧药或缓解或协助呼吸的治疗剂。
在以下实例和附图中进一步说明了本发明。这些实例并非旨在以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：本发明的基于茎部的多肽的制备
在WO 2013/079473中，描述了第一系列的流感血凝素茎部多肽、组合物和疫苗及其在预防和/或治疗流感中的使用方法，包括呈膜结合形式(具有天然跨膜结构域，WO2013/079473中的SEQ ID NO:45)和呈其可溶性形式s-H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(无天然跨膜结构域，WO 2013/079473中的SEQ ID NO:145)的多肽H1-mini2-簇1+5+6-GCN。
在WO 2014/191435中，描述了源自H1N1 A/布里斯班/59/2007的全长HA的其他茎部多肽，这些茎部多肽与H1-mini2-簇1+5+6-GCN4相比包含附加突变，并且还稳定地呈递CR6261和/或CR9114的广泛中和表位。
这些茎部多肽全部是通过使头部结构域，尤其是包含从位置46开始直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸的区域从HA1中缺失，并且用接头替换所缺失的区域而产生的，如WO 2013/079473中所述。值得注意的是，在WO 2013/079473中，氨基酸位置的编号基于甲型流感/布里斯班/59/2007的全长HA(即WO 2013/079473中的SEQ ID NO:1)的编号，而在本发明中使用Winter等人描述的H3编号。
头部结构域的去除使先前被水性溶剂屏蔽的分子部分暴露，从而使本发明多肽的结构不稳定。由于这个原因，使B环(即包含氨基酸385-404的区域(图1C))中一个或多个氨基酸残基突变以稳定多肽。类似地，在融合肽周围的区域中，许多疏水性残基暴露于溶剂，这是由下述事实引起的，与天然全长HA不同，这些多肽无法被裂解且无法经历将疏水性融合肽掩埋在蛋白质内部的相关构象变化。为了解决这个问题，与来自A/布里斯班/59/2007的野生型全长HA相比，位置323、326和339处的一些或全部疏水性氨基酸残基突变为亲水性残基。
此外，多肽因天然裂解位点的突变，例如位置329处的氨基酸到Q的突变，对蛋白酶裂解具有抗性。
在WO 2016/005480中，描述了另一系列的茎部多肽，其中在位置405至419处引入GCN4来源的序列RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:18)，像例如源自A/布里斯班/59/2007的命名为127H1-t2、s127H1-t2和s127H1-t2long的多肽。另外，使用来自不同流感株系的HA制备具有相同修饰的茎部多肽，例如基于源自H1N1 A/加利福尼亚/07/09株系的HA的多肽，如smH1Cali3964-127H1-t2和mH1 Cali3964-127H1-t2。
在WO 2016/005482中，描述了单体间半胱氨酸桥的引入，导致三聚体茎部多肽的量增加，三聚体茎部多肽包括命名为127H1-t2-cl18(也称为5367)的多肽和可溶性形式127H-t2-cl18long，这些多肽基于甲型流感/布里斯班/59/2007的HA。基于例如甲型流感病毒/加利福尼亚07/09的HA设计类似多肽，例如命名为mH1 Cali3964-127H1-t2-cl18(也称为5369)和smH1 Cali3964-127H1-t2-cl18long的多肽。这些茎部多肽尤其包含：头部区域的缺失，该头部区域包含从位置46处开始直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸，其中所得HA1结构域通过4-氨基酸接头(GGGG)连接；在位置405-419处的HA2结构域中引入的GCN4来源的序列RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:18)；以及位置329处的氨基酸到Q的突变，以使该多肽对蛋白酶裂解具有抗性。这些多肽还包含位置397处的氨基酸到C的突变和位置405处的氨基酸(即GCN4序列的第一个氨基酸)到C的突变，从而在第一单体的位置397处的半胱氨酸与第二单体的位置405处的氨基酸之间形成单体间半胱氨酸桥。
在产生本发明的研究中，先前描述的茎部多肽已经过优化。源自A/布里斯班/59/2007和或A/加利福尼亚/07/09的野生型HA的氨基酸序列分别是SEQ ID NO:1和2的序列。多肽UFV5367(SEQ ID NO:16)和UFV5369(SEQ ID NO:17)在本文中称为“亲本株系/构建体”(分别在图2和3中示意性地示出)。
这样设计了新型HA茎部多肽，包括例如UFV150558(SEQ ID NO:30)和UFV150850(SEQ ID NO:53)，这些多肽与先前描述的茎部多肽UFV5367(SEQ ID NO:16)和UFV5369(SEQID NO:17)相比，包含附加修饰。具体而言，多肽UFV150558和UFV150850包含B环中位置392处的氨基酸到P或R的突变，结合位置434处的氨基酸到Q的突变，或B环中位置392处的氨基酸到P或R的突变，结合位置434处的氨基酸到Q的突变以及位置442处的氨基酸到A的突变。
另外，设计了其他茎部多肽，其中未使用人工接头来替换所缺失的头部区域。茎部多肽UFV160655(SEQ ID NO:103)、UFV160656(SEQ ID NO:104)、UFV160664(SEQ ID NO:109)和UFV160665(SEQ ID NO:110)包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的头部区域的缺失，从而留下HA1结构域的第一部分和HA1结构域的第二部分，第一部分包含直到并且包括氨基酸46的氨基酸，第二部分包含从位置307处的氨基酸开始直到HA1结构域的C-末端氨基酸(即位置329处的氨基酸)的氨基酸。头部缺失后，第一HA1部分直接连接至第二HA1部分，即位置46处的剩余氨基酸(HA1结构域的第一部分的C-末端氨基酸)直接与位置307处的剩余氨基酸(HA1结构域的第二部分的N-末端氨基酸)连接。未引入人工接头(参见图1A，下部构建体)。这些肽还包含B环中位置392处的氨基酸到P或R的附加突变，结合位置434处的氨基酸到Q的突变，或结合位置434处的氨基酸到Q的突变与位置442处到A的突变(如图4所示)。
实例2：根据本发明的多肽的表达
哺乳动物细胞中的蛋白质表达
合成编码本发明的多肽UFV150558、UFV150850、UFV160655、UFV160656、UFV160664和UFV160665)的DNA片段(金斯瑞(Genscript))，并将其克隆到pcDNA2004质粒(具有增强型CMV启动子的内部修饰的pcDNA3载体)中。通过使用所制备的表达质粒的293fectinTM转染试剂(英杰公司(Invitrogen))进行瞬时转染，在FreestyleTM培养基中培养的HEK293F细胞中产生多肽。通过使用ExpiFectamineTM转染试剂(Gibco，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))进行瞬时转染，在ExpiCHOTM表达培养基中的Expi-CHO细胞培养物中产生多肽。对于Expi-CHO细胞培养物，在转染后1天添加ExpiFectamine CHO增强子和ExpiCHO饲料(Gibco，赛默飞世尔科技公司)。在第7-11天之间(对于ExpiCHO细胞而言)，通过离心收集含有分泌多肽的培养物上清液，然后在0.2μm瓶顶过滤器(康宁公司(Corning))上过滤。
培养物上清液分析
使用OCTET平台通过生物层干涉测量法评估收获的培养物上清液中表达的多肽的水平。简言之，将生物素化mAb CR9114固定在链霉亲和素(SA)生物传感器(颇尔·福特生物公司(Pall FortéBio))上，然后通过评估稀释系列的明确的纯化同源多肽的结合移位来建立标准曲线。随后，测量预先稀释的收获的含有本发明多肽(在动力学缓冲液中稀释为5-15μg/mL)的培养物上清液的结合移位，并使用所建立的标准曲线计算多肽的浓度。
在AlphaLISA中通过1.5nM CR9114和1.5nM链霉亲和素(Streptactin)标记的具有SEQ ID NO:13的序列的单结构域抗体(SD15016)的同时结合来评估培养物上清液中多肽的三聚体含量。在抗人IgG受体和链霉亲和素供体珠粒(珀金埃尔默(Perkin Elmer))的存在下，在室温下将多肽与抗体和单结构域抗体孵育2小时后，测量在615nm下的化学发光。两种抗体只同时结合展示出一个以上正确折叠的表位的三聚体分子，因此在该测定中产生信号(与单体和潜在聚集体大不相同)。正如通过OCTET所评估的，基于蛋白质浓度对多肽进行滴定。
结果与结论
在转染后第9天，对三种独立的70mL ExpiCHO转染物测定多肽表达水平和三聚体含量。结果如图5所示。与先前描述的构建体5367(SEQ ID NO:16)(其包含在HA1结构域中从位置46开始直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸的缺失，并且包含替换HA1结构域中所缺失部分的4G接头)(也称为亲本设计/构建体)相比，基于H1N1 A/布里斯班/07/59的多肽UFV160655(其包含在HA1结构域中从位置47开始直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸的缺失，并且不包含替换HA1结构域中所缺失部分的4G接头，包括点突变Y392P、R404Q、E434Q和S442A)(SEQ ID NO:103)明显地显示出提高的表达水平(高达40倍)，达到约500mg/L培养物上清液(图5A)。
H1N1 A/加利福尼亚/07/09来源的亲本多肽UFV5369(SEQ ID NO:17)以约350mg/L培养物上清液的水平表达。在设计上与多肽UFV5369类似并且还包括点突变Y392P、R404Q、E434Q和S442A的多肽UFV150558(SEQ ID NO:30)以约427mg/L的水平表达。多肽UFV160656(SEQ ID NO:104)(包含缺失，该缺失包含从位置47直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸，并且不包含替换HA1结构域中所缺失部分的4G接头，包含点突变Y392P、R404Q、E434Q和S442A)、UFV160664(包含相同的缺失，但仅包含点突变Y392R和E434Q)(SEQ ID NO:109)和UFV160665(包含相同的缺失并且包含点突变Y392P和E434Q)(SEQ ID NO:110)与5369相比以更高的水平表达，高达约800mg/L培养物上清液(图5A)。
关于三聚体含量，所有包含一个或多个附加新突变的多肽，不依赖于其株系骨架、头部缺失的大小以及是否存在替换HA1结构域的所缺失部分的4G接头，达到90％以上的水平，该水平显著高于亲本设计所获得的水平，对于亲本设计而言仅约25％表达的蛋白成功地形成三聚体(图5B)。
制备另外的多肽，包括UFV160302(SEQ ID NO:60)和UFV160303(SEQ ID NO:61)，这些多肽包含位置392处的氨基酸到Y、P或R的突变，结合位置434处的氨基酸到Q的突变。包含与多肽UFV160302类似的设计但不包含点突变Y392R的多肽UFV160304(SEQ ID NO:62)显示出较低的三聚体含量(约1,7倍)(图5C)。
总的来说，本实施例中描述的本发明的多肽(在位置392处包含Y、P或R，结合在位置434处包含Q)与亲本设计相比，展示出显著提高的蛋白质表达水平和三聚体含量(成功地形成的三聚体的百分比)。这些氨基酸在位置392和434处的存在使得在表达、三聚和稳定性方面得到显著改善。
实例3：本发明的三聚体多肽的纯化
纯化
通过两步方案纯化多肽。首先，将收获并澄清的培养物上清液装载到装有亲和树脂(捕获选择公司(Capture Select))的HiScale 16/20柱(通用电气医疗集团(GEHealthcare))上，该亲和树脂由固定在Poros珠粒上的HA特异性单结构域抗体(从赛默飞世尔科技公司获得)组成。该树脂对H1株系来源的血凝素蛋白具有高度特异性。故意使柱超载约15％，以改善三聚体的分离。在50mM Tris、0.5M NaCl(pH 7.4)中结合并平衡后，通过对0.1M Tris、2M MgCl2、40％丙二醇(pH 7.4)应用不连续梯度来洗脱多肽。根据紫外信号(A280)，合并洗脱级分并通过Millex-GV 0.22μm过滤器(默克密理博(Merck Millipore))过滤。随后，将收集的洗脱峰施加到在电泳缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl，pH 7.8)中平衡的Superdex 200pg 26/60柱(通用电气医疗集团)上进行精化，即去除最少量的多聚体和单体蛋白。合并三聚体级分，并在高效液相色谱(HPLC)Infinity 1260系列装置(安捷伦(Agilent))中通过分析型SEC-MALS对纯度进行评估。使各40μg的纯化多肽在TSK凝胶G3000SWxl柱(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))上运行(1mL/min)，并通过miniDAWNTreos多角度光散射检测器和Optilab T-rex差示折光计(怀雅特技术公司(WyattTechnology))测量洗脱物质的摩尔质量。通过Astra 6软件包分析数据，并从折射率信号推导分子量计算。
结果与结论
第二个纯化步骤(尺寸排阻色谱法)的洗脱图谱表明，亲和柱的合并洗脱级分中存在大量的非三聚体(聚集体和单体)多肽5367。相比之下，UFV160656的色谱图仅显示出少量聚集体，而存在的主要物质是三聚体多肽(图6A和B)。
亲本构建体UFV5367和UFV5369的收率分别为5和70mg/L，而本发明多肽的收率在120-240mg/L之间变化。通过比较培养物上清液和三聚体终产物中存在的蛋白质的量计算出的回收百分比大致为40％-60％。通过分析型SEC-MALS对合并的三聚级分的分析显示，经纯化的物质是纯的；在紫外信号中未观察到其他峰(图6B)。此外，计算的分子量约96-106kDa，与糖基化三聚体多肽的期望分子量相对应(图6C)。
以上数据表明，通过简单的2步方案实现了多肽的纯化，以高效率产生了非常纯的三聚体蛋白质，并且收率远高于100mg/L培养物上清液。
实例4：在结合Fab片段的存在下通过尺寸排阻色谱法对本发明多肽三聚的表征
表征
(i)通过在Fab片段的存在下进行SEC-MALS分析，(ii)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，和(iii)通过差示扫描荧光法(DSF)评估纯化多肽的折叠和温度稳定性。
Fab片段与本发明多肽(也称为“微型HA蛋白”)在溶液中的结合通过使用高效液相色谱系统(安捷伦)及与Optilab T-rEX折射率检测器(怀雅特技术公司)耦合的miniDAWNTREOS仪器，进行尺寸排阻色谱法(SEC)和多角度光散射(MALS)分析来监测。将总共40μg的多肽或mAb CR6261、CR9114的Fab片段和阴性对照抗体施加于在电泳缓冲液(150mM NaPi、50mM NaCl，pH 7.0)中平衡的TSK凝胶G3000SWxl柱(西格玛-奥德里奇)。通过分析在1.2倍摩尔过量的Fab片段的存在下孵育的多肽来验证复合物的形成。通过Astra 6软件包分析数据，并从折射率信号推导分子量计算。
使用Octet RED384(福特生物公司(ForteBio))，通过生物层干涉测量法评估CR6261和CR9114与多肽结合的亲合力(avidity)。生物素化抗体固定在链霉亲和素(SA)浸读(Dip and Read)动力学生物传感器(福特生物公司)上。通过将传感器施加于多肽在PBS稀释10倍的浓缩动力学缓冲液(福特生物公司)中的两倍稀释系列中测量实时结合曲线。多肽的起始浓度在0.15-10nM的范围内。假定bnAb与多肽的1:1结合模型，使用稳态分析来测定解离常数(KD)。
另外，通过ELISA评估抗体和单结构域抗体(SD)与本发明的茎部多肽的结合。首先在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中向OptiPlate-96高结合板(珀金埃尔默)的表面涂覆每孔50μg的蛋白质。在4℃下孵育过夜，洗涤(用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次)，封闭(在室温下用PBS+0.05％吐温-20+1％牛血清白蛋白封闭1.5小时)，再洗涤(用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次)后，将板在室温下与mAb和SD在起始浓度分别为70nM或100nM的三倍稀释系列中孵育1小时。再次洗涤(用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次)后，将与小鼠抗人IgG(杰克逊公司(Jackson))缀合的辣根过氧化物酶以1:1000的稀释度添加到封闭缓冲液(PBS+0.05％吐温-20+1％牛血清白蛋白)中。在室温下再孵育1小时并随后洗涤(用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次)后，添加BM化学发光ELISA底物(罗氏公司(Roche))，并且在孵育15分钟后，使用Synergy Neo酶标仪(珀金埃尔默)测量发光信号。通过Spotfire套件(Tibco软件公司(Tibco SoftwareInc.))计算半最大有效浓度(EC50)值。EC50与相应抗体的结合强度直接相关，从而与抗原质量的量度(即其正确的折叠和稳定性)相关。
通过在5x Sypro橙染料(赛默飞世尔科技公司)的存在下监测多肽溶液(6μg)的荧光发射，通过DSF测定蛋白质的温度稳定性。随着温度从25℃逐渐升高到95℃(每小时60℃)，多肽去折叠并且荧光染料与暴露的疏水性残基结合。使用ViiA7实时PCR机(应用生物系统公司(Applied BioSystems))测量解链曲线，并通过Spotfire套件(Tibco软件公司)计算Tm50值。Tm50值表示50％的蛋白质去折叠时的温度，因此是多肽温度稳定性的量度。另外，还通过DSC测定了热诱导的变性，其中通过使用MacriCal DSC系统(马尔文公司(Malvern))监测样品和参考细胞之间的能量输入差异来测定热转化中点(Tm)。在1mg/mL的浓度下，将样品逐渐从20℃加热到90℃(每小时100℃)，并通过Origin软件(马尔文公司)对运行物进行分析。基于温度(℃)与热容量(kcal/mol/℃)的关系图，计算Tm值。
结果与结论
仅基于氨基酸的三聚体多肽的理论分子量为约90kDa，但是，由于每种蛋白质含有5个N-连接的糖基化基序(NxT/S)，所以当在哺乳动物表达系统中产生时，分子量将会更高。经计算通过SEC-MALS分析测定的分子量在96-106kDa的范围内，表明蛋白质如预期的那样显著糖基化(表1)。
表1.通过SEC-MALS使用折射率信号测定的本发明的多肽(第二列)和与bnAbCR6261和CR9114的Fab片段复合的多肽(第三和第四列)的分子量。Fab6261和Fab9114的分子量(MW)经测定为约44kDa。
抗体与多肽的结合表明多肽正确折叠以及存在广泛中和抗体(bnAb)正确折叠的表位。如上所述，通过SEC-MALS分析来评估Fab片段CR9114、CR6261和非结合Fab(阴性对照)在溶液中的结合。Fab片段与多肽结合后，分子量增加将会在SEC中产生可见的峰移位(缩短保留时间)。此外，监测MALS信号使得能够计算形成的复合物的分子量。如预期的那样，用作阴性对照的Fab片段并未结合；即，在添加Fab片段后未观察到多肽的峰移位(图7A)。相比之下，在与其他两种Fab片段孵育后，观察到向较短保留时间的明显峰移位(图7B和C)。此外，复合物的分子量测定表明该多肽结合3个Fab片段(表1)，证实三聚体多肽内的三个单体全部正确折叠并且是抗体可及的。
为了进一步评估多肽的质量和折叠，通过生物层干涉测量法测定了bnAb CR6261和CR9114结合的解离常数(KD)(表2)。对于所有多肽，结合亲合力均低于1nM，表明三聚体多肽代表天然HA茎部表面。
表2.CR6261和CR9114与本发明的茎部多肽的结合。通过生物层干涉测量法和稳态分析测定CR6261和CR9114结合的KD值。将全长HA H1N1 A/布里斯班/59/07一起进行比较。
此外，通过ELISA评估抗体的结合。基于S曲线，计算EC50值，证实多肽的正确折叠。两种抗体均以低于1nM的EC50值非常牢固地结合(表3)。
表3.通过ELISA测定的抗体与纯化多肽的结合强度(3次独立测定的S曲线的平均EC50值(nM))。
| 多肽ID | CR6261 | CR9114 |
| UFV5367 | 0.417 | 0.410 |
| UFV160655 | 0.396 | 0.400 |
| UFV5369 | 0.391 | 0.389 |
| UFV160656 | 0.432 | 0.410 |
| UFV160664 | 0.395 | 0.379 |
| UFV160665 | 0.425 | 0.409 |
热稳定性是多肽暴露于应力复原力的量度，因此也是多肽稳定性的量度。在荧光染料的存在下，将本发明的多肽逐渐加热，该荧光染料在整个实验过程中与去折叠蛋白结合，并使用所产生的荧光强度变化计算Tm50值(表4)。尽管亲本设计(UFV5367和UFV5369)展示出分别为约52℃和约57℃的Tm50值，但惊人的是，本发明的多肽展示出显著更高的值(高达约7℃)，表明稳定性显著改善。对于通过DSC测定的Tm值，在亲本设计和本发明的多肽之间观察到类似差异。总的来说，Tm值(DSC)比Tm50值(DSF)高约2℃，这是由于测定这些值的方式不同所致；对于DSC，测定了最高峰处的温度，而对于DSF，测定了在1/2峰高处的温度。
表4.通过DSF和DSC测定的纯化多肽的Tm50值总览。
多肽的分子量，观察到的溶液中的Fab片段结合和Ab的牢固结合表明，亲本设计和本发明的多肽是三聚体并且折叠良好。此外，如通过计算出的Tm50/Tm值所表明的，与亲本设计相比，本发明的多肽对热应力的抵抗力明显更高。总的来说，结合数据和热稳定性数据表明，本发明的多肽在溶液中是三聚体，正确折叠(3个表位)，并且与其亲本设计相比展示出显著改善的热稳定性。
实例5：根据本发明的替代性缺失、接头和头部结构域序列
设计
以上描述的本发明的流感血凝素(HA)茎部多肽是通过使HA1结构域的一部分缺失而源自全长HA的，该部分包含从位置47直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸。未引入连接序列。在亲本设计中，缺失包含氨基酸46-306，缺失后的两个HA1末端通过人工“GGGG-接头”连接(图8)。
在该实例中，探索了头部的其他替代性切割位置和替代性同源接头。表5示出了去除HA1头部结构域的替代性切割位置。亲本设计中的HA1末端以灰色表示。构建体UFV160360(SEQ ID NO:63)包含从位置46处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的缺失和替换HA1结构域中的缺失部分的4G接头，并且还包含点突变Y392P、R404Q、E434Q和S442A。制备新的构建体，其中包括HA1结构域(HA1上链)即第一(N-末端)HA1结构域的多达7个附加氨基酸残基和HA1下链(第二或C-末端HA1结构域)的多达4个附加氨基酸残基，或最多2个氨基酸残基缺失，从而改变了头部缺失的大小。这些构建体也全部包含点突变Y392P、R404Q、E434Q和S442A。
表5：替代性头部结构域缺失，也参见图5。*表示游离半胱氨酸(C)突变为G。氨基酸位置的编号表示根据H3编号规定的氨基酸位置。
下表6示出了替代性同源接头。亲本设计中的HA1末端以深灰色表示。引入多达5个残基长的同源接头(即来源于HA1结构域)以连接HA1末端。同样，其他构建体也全部包含点突变Y392P、R404Q、E434Q和S442A。
表6：源自缺失的同源头部结构域的替代接头。氨基酸位置表示根据H3编号规定的氨基酸位置。
表征
合成编码表5和表6中所列的多肽的DNA片段(金斯瑞)，并将其克隆到pcDNA2004质粒(具有增强型CMV启动子的内部修饰的pcDNA3载体)中。包括用于筛选目的的C-末端FLAG-接头-His标签的多肽是在真核细胞系Expi293F细胞中微量产生的(200μL)。简言之，以96孔微孔板形式(格林纳公司(Greiner))将细胞以2.5E+06个活细胞(vc)/mL的细胞密度接种在Opti-MEM(Gibco)中。将细胞使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Gibco)进行瞬时转染，并在37℃、250rpm、8％CO2和75％湿度下孵育3天。使用白色的96孔滤板(0.22μm PVDF膜)通过离心(以400xg离心10分钟)收集培养物上清液，以去除聚集体和细胞碎片。
培养物上清液中存在的多肽量、蛋白质折叠和三聚体含量全部通过扩增均相测定法(AlphaLISA)评估。将曲线的线性范围内的适当多肽稀释液用于分析，并将所有数据相对于设为100％的构建体UFV160360(SEQ ID NO:63)进行归一化。
通过使用镍供体珠粒(珀金埃尔默)和抗Flag受体珠粒(珀金埃尔默)测定收获的培养物上清液中的相对多肽量。使用培养物上清液在曲线的线性范围内的适当稀释液来避免钩状效应。
类似地，通过评估抗体CR9114(2nM)和单结构域SD15004(2nM)的结合来验证表达的多肽的折叠。为了检测抗体结合，使用抗人IgG受体珠粒(珀金埃尔默)和镍供体珠粒(珀金埃尔默)，来检测链霉亲和素标记的单结构域抗His受体珠粒(珀金埃尔默)和链霉亲和素供体珠粒(珀金埃尔默)的结合。
使用类似于如实例2中所述的方案，通过CR9114(2nM)和链霉亲和素标记的SD15016(2nM)的同时结合来测量多聚体含量。正如通过OCTET所测定的，基于蛋白质浓度对多肽进行滴定。在这种测定中，只有提供两种抗体结合的三聚体分子才会产生信号(与单体、二聚体和潜在聚集体大不相同)。
结果与结论
总的来说，多肽以与参考蛋白(UFV160360)相似的水平表达，并且在具有替代性切割位置(即替代性头部结构域缺失)的设计与其中HA1末端以来源于头部结构域的接头连接的设计之间未观察到显著差异(图9A)。类似地，对于bnAb CR9114的结合而言未观察到显著差异(图9B)。
相比之下，观察到相对三聚体含量的一些差异(图9C)；这些设计不易形成三聚体微型HA。平均而言，对于引入替代性切口的设计观察到约2倍的降低，而在其中“GGGG-接头”被来自头部结构域的序列替换的设计中观察到约3倍的降低。
这些结果显示，尽管三聚体含量有所降低，但是获得了表达良好且稳定的茎部多肽，这些茎部多肽正确折叠以呈递广泛中和抗体CR9114的表位。
实例6：HA1/HA2裂解位点变异：敲除、一元和多元裂解位点
流感HA0蛋白(在HA1和HA2中)的裂解是其活性所必需的，通过引起宿主膜与病毒膜的融合而促进病毒基因组进入靶细胞。上述本发明的多肽全部表达为具有裂解位点敲除突变R329Q，以防止在体外和/或体内产生期间对分子的推定裂解。
在该实例中，表达了几种具有天然一元裂解位点或包括多元裂解位点例如弗林蛋白酶裂解位点的茎部多肽(表7)。多肽还包含在位置392和434处的突变。
表7.裂解位点变体。
| 多肽ID | 裂解位点 | 序列 |
| UFV150850 | 敲除 | R329Q |
| UFV160302 | 一元 | R329(野生型) |
| UFV160301 | 多元 | RRRKK |
| UFV160503 | 多元 | RKRR |
培养物上清液分析
如实例5所述合成编码表7中所列多肽的DNA片段。
使用OCTET平台通过生物层干涉测量法评估收获的培养物上清液中表达的多肽的水平。简言之，将生物素化mAb CR9114固定在链霉亲和素(SA)生物传感器(颇尔·福特生物公司(Pall FortéBio))上，然后通过评估稀释系列的明确的纯化同源多肽的结合移位来建立标准曲线。随后测量预先稀释的收获的含有多肽(在动力学缓冲液中稀释为5-15μg/mL)的培养物上清液的结合移位，并使用所建立的参考曲线计算浓度。
结果与结论
对于其中插入了一元(R)或多元裂解位点(RRRKK)的多肽，即分别为UFV160302和UFV160301，未观察到对表达水平的影响(图10)。与参考多肽UFV150850相比，两种多肽均以相似水平表达，并显示出相似的三聚体含量水平，参考多肽通过位置329处的氨基酸到Q的突变而对蛋白酶裂解具有抗性。
对于引入的第二引入多元裂解位点(RKRR)，观察到表达水平和三聚体含量降低约2倍(UFV160503)。
实例7：GCN4或替代性七肽重复三聚结构域的示例性序列
设计
在如上所述的本发明的多肽中，C-螺旋的N-端(分子的顶部，参见图1C)，尤其是从位置405处的氨基酸开始直到并且包括HA2结构域的位置419处的氨基酸的氨基酸序列，经SEQ ID NO:113的GCN4三聚结构域替换，以便改善分子的三聚倾向。在该实例中，通过优化C-螺旋的七肽重复序列成功地探索了卷曲螺旋界面的优化。表8示出了多肽UFV160090(SEQID NO:56)中的替代性三聚序列。C螺旋的N-末端区域中的突变以浅灰色突出显示。UFV160097的三聚序列(SEQ ID NO:58)与实例1中所述的多肽相同。C螺旋N-末端部分中七肽重复序列与野生型HA的差异以浅灰色突出显示。
表8：GCN4或替代性七肽重复三聚结构域的序列(针对A/加利福利亚/07/09HA来源的多肽)。顶部的数字表示根据H3编号规定的氨基酸位置。
培养物上清液分析
如以上实例5所述合成编码表8中所列多肽的DNA片段。
对收获的培养物上清液的所有评估均通过类似于实例5所述的AlphaLISA进行。在表达水平方面将CR9114结合数据归一化。
结果与结论
对收获的培养物上清液在多肽表达水平、三聚体含量和CR9114结合方面的AlphaLISA评估表明，C-螺旋三聚体界面(即，除了上述多肽中存在的GCN4样重复序列以外)的替代性优化是耐受的。观察到蛋白质表达水平有所提高(约2倍)，但是三聚体含量降低(约2倍)。CR9114的结合不受影响(图11)。
实例8：本发明的茎部多肽的C-末端的替代性截短
设计
血凝素是位于病毒颗粒表面的一种膜蛋白，该蛋白的C-末端部分嵌入病毒膜中。对于本发明多肽的可溶形式，通过在跨膜结构域(TM)的起点处截短而使跨膜结构域缺失。另外，还评估了替代性截短位置(表9和10)。
表9.HA2结构域C-末端的替代性截短(针对A/布里斯班/59/07HA来源的多肽)。顶部的数字表示根据H3编号规定的氨基酸位置。
表10.HA2结构域C-末端的截短(针对A/加利福利亚/07/09HA来源的多肽)。顶部的数字表示根据H3编号规定的氨基酸位置。
培养物上清液分析
如实例5所述合成编码表9和表10中所列多肽的DNA片段。
通过蛋白质印迹法分析收获的培养物上清液中表达的多肽的存在。将样品在非还原条件下于SDS-PAGE凝胶(4％-12％Bis-Tris)(赛默飞世尔科技公司)上电泳，并使用iBlot id 2.0系统(赛默飞世尔科技公司)转移到PVDF膜上。为了对应于多肽的条带可视化，将膜用0.2％封闭剂(奶粉-伯乐公司)的TBST溶液封闭，之后与H1株系特异性来源的血凝素蛋白和生物素化的单结构域抗体(流感6)一起充分稀释于封闭缓冲液中进行孵育。洗涤(TBST)后，将膜与HRP标记的链霉亲和素(贝迪医疗(Becton Dickinson)在封闭缓冲液中1:250稀释)一起孵育。随后，在另一个洗涤步骤(TBST)之后，通过与Trueblue过氧化物酶底物(KPL)一起孵育而使蛋白条带可视化。
使用OCTET平台，通过生物层干涉测量法评估收获的培养物上清液中广泛中和的单克隆抗体CR9114与表达的本发明多肽的结合。简言之，通过装有生物素化CR9114的链霉亲和素(SA)生物传感器(颇尔·福特生物公司)对在动力学缓冲液(颇尔·福特生物公司)中稀释两倍的上清液进行评估。在关联步骤的最初20秒钟内进行曲线拟合，以计算K结合值；将培养物上清液中多肽的浓度设为50mM，并将曲线以1:1模型拟合。包括MOCK样品作为阴性对照。
结果与结论
在多肽的表达水平上观察到替代性C-末端截短的最小影响。在对收获的培养物上清液的蛋白质印迹分析中，除UFV150565和UFV150574外，所有变体在三聚体高度处均展示出清晰的条带(图12A)。
Octet分析表明，几乎所有设计(UFV150575除外)都与固定的CR9114结合(图12B)，但是对于C-末端变体而言，与参考设计5367和5369相比，观察到整体较低的K结合值。这可能是部分由于假定所有设计的蛋白质浓度相同进行的基本曲线拟合程序所致；然而，多肽与抗体的结合显而易见。
结果清楚地显示，截短至位置502是可能的。
实例9：原聚体间二硫桥；替代位置
设计
从培养物上清液中纯化出为共价三聚体蛋白的本发明的多肽。在早前所述的多肽中，已经通过以下方式建立了共价连接：在B环(位置397)和C螺旋(位置405)中引入两个半胱氨酸残基，这两个半胱氨酸残基通过与相邻单体中的半胱氨酸残基配对形成二硫键(单体间二硫桥)。在该实例中，探索了这些原聚体间二硫桥的两个替代位置(表11)。
表11.形成原聚体间二硫桥的半胱氨酸残基的替代位置。*位置400处敲除的N-连接的聚糖基序(NxS)。
| 多肽ID | 引入半胱氨酸的氨基酸位置 | 亲本流感病毒株系 |
| UFV160090 | 397+405 | H1N1 A/加利福尼亚/07/09 |
| UFV160093 | 398+405 | H1N1 A/加利福尼亚/07/09 |
| UFV160088* | 396+408 | H1N1 A/布里斯班/59/07 |
培养物上清液分析
如上所述合成编码多肽的DNA片段。
对收获的培养物上清液的所有评估均通过如实例7所述的AlphaLISA进行。
结果与结论
对收获的培养物上清液在多肽表达水平、三聚体含量和CR9114结合方面的AlphaLISA评估表明，替代性原聚体间二硫桥展示出与参考多肽UFV160090相似或更好(图13)。这些数据表明在位置398和405处(UFV160093)及位置396和408处(UFV160088)引入半胱氨酸残基提供了由位置397和405处(UFV160090)引入的半胱氨酸形成原聚体间二硫桥的替代方法。
实例10：用本发明的多肽免疫接种原初小鼠之后对H1N1 A/布里斯班/59/07的致死性攻击的保护作用
在该实例中，评价一定剂量范围的佐以AlOH3的UFV160664与模拟免疫接种(PBS)的动物和固定剂量的UFV4900(探索性)相比的保护功效(基于随访期结束时的存活比例)。
将多组各8-11只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)以3周的间隔用一定剂量范围的佐以50μg AlOH3(配制为2％铝胶(Alyhydrogel))的可溶性三聚体UFV160664肌肉内免疫接种2次。该剂量范围由4种从30μg开始到0.03μg的10倍稀释液组成。将小鼠用30μg可溶性三聚体UFV4900免疫接种两次(n＝10)作为攻击模型的阳性对照，而用PBS免疫接种2次作为阴性对照(n＝11)。在最后一次免疫接种后四周，对小鼠放血以分析免疫应答(H1N1 A/布里斯班/59/07全长(FL)HA ELISA)，并于一天后，将小鼠用25x LD50小鼠适应性H1N1 A/布里斯班/59/07攻击病毒进行攻击，并监测(存活期、体重、临床评分)3周。随访结束时的存活比例是主要结果参数。
结果
已显示，佐以AlOH3的UFV160664具有免疫原性，因为对于测试的所有剂量而言，H1N1 A/布里斯班/59/07FL HA ELISA滴度与PBS组相比均显著增加(P<0.001；从最高剂量开始分步进行曼-惠特尼U检验和Bonferroni多重比较调整)。30μg UFV160664剂量免疫接种的动物的滴度与30μg UFV4900组相当(图15)。
另外，与PBS组相比，对于除0.03μg以外的所有剂量而言，佐以AlOH3的UFV160664均提供显著保护(P≤0.003；费希尔精确检验(Fisher’s exact test)、相对于构建体的Bonferroni校正以及从最高剂量开始的分步测试)。30μg UFV160664组(87.5％)的存活比例与30μg UFV4900组(90％)相当(图16；上图)。与PBS组相比，对于除0.03μg以外的所有剂量而言，体重减轻(由曲线下面积定义)均显著降低(P≤0.012；ANOVA、相对于构建体的2倍Bonferroni校正以及从最高剂量开始的分步测试)。30μg UFV160664组的体重减轻与30μgUFV4900组相当(图16；下图)。
结论
根据本发明，已显示佐以AlOH3的UFV160664具有免疫原性，并且在致死性H1N1 A/布里斯班/59/07小鼠攻击模型中提供保护作用。免疫原性和保护功效与佐以AlOH3的UFV4900相当。
实例11：用本发明的多肽免疫接种原初小鼠之后对H1N1 A/波多黎各/8/34的致死性攻击的保护作用
在该实例中，评价一定剂量范围的佐以2％Adjuplex的UFV160664与模拟免疫接种(PBS)的动物和固定剂量的UFV4900(探索性)相比的保护功效(基于随访期结束时的存活比例)。
同样，将多组各8-11只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)以3周的间隔用一定剂量范围的佐以2％(v/v)Adjuplex的可溶性三聚体UFV160664肌肉内免疫接种2次。该剂量范围由4种从30mcg开始到0.03μg的10倍稀释液组成。将小鼠用30μg可溶性三聚体UFV4900免疫接种两次(n＝10)作为攻击模型的阳性对照，而用PBS免疫接种2次作为阴性对照(n＝11)。在最后一次免疫接种后四周，将小鼠用12.5x LD50小鼠适应性H1N1 A/波多黎各/8/34攻击病毒进行攻击，并监测(存活期、体重、临床评分)3周。随访结束时的存活比例是主要结果参数。
结果
已显示，与PBS组相比，对于除0.03μg以外的所有剂量而言，佐以2％Adjuplex的UFV160664均提供显著保护(P≤0.003；费希尔精确检验、相对于构建体的Bonferroni校正以及从最高剂量开始的分步测试)。30μg UFV160664组(100％)的存活比例与30μg UFV4900组(100％)相同(图17；上图)。
与PBS组相比，对于所有剂量而言，体重减轻(由曲线下面积定义)均显著降低(P≤0.026；ANOVA、相对于构建体的2倍Bonferroni校正以及从最高剂量开始的分步测试)。30mcg UFV160664组的体重减轻与30mg UFV4900组相当(图17；下图)。
结论
根据本发明，已显示佐以2％Adjuplex的UFV160664在致死性H1N1 A/波多黎各/8/34小鼠攻击模型中提供保护作用。保护功效与佐以2％Adjuplex的UFV4900相当。
实例12：本发明的多肽具有免疫原性并且相对于标准护理疫苗在H1N1 A/荷兰/602/09原初白鼬攻击模型中显示出相当的功效
在该实例中，评价了在H1N1 A/荷兰/602/09原初白鼬攻击模型中两种剂量的UFV160664与仅佐剂免疫接种的动物和标准护理季节性流感疫苗相比的体内免疫原性和保护功效(基于随访结束时的肺部病毒载量)。
将多组(n＝6)原初雌性白鼬间隔3周用50或5μg佐以5％Adjuplex的UFV160664肌肉内免疫接种三次。阴性对照组仅用佐剂免疫接种。用市售的标准护理(SoC)季节性流感疫苗对代表标准护理的参考组进行免疫接种。最终免疫接种后四周，在第0天用106TCID50H1N1 A/荷兰/602/09气管内攻击动物。在4天的随访期期间，记录若干病毒学和临床参数。
结果
已显示，两种剂量的佐以5％Adjuplex的UFV160664诱导的H1 A/加利福尼亚07/09HA特异性抗体滴度与仅佐剂组的滴度相比显著更高(P<0.001；经过审查的方差分析(ANOVA)及事后t检验。Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)，而SoC没有(图18)。两种剂量的佐以5％Adjuplex的UFV160664诱导的H1 A/加利福尼亚07/09HA特异性抗体滴度与仅佐剂组的滴度相比显著更高(P<0.001；经过审查的方差分析(ANOVA)及事后t检验，Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)，而SoC没有(图18)。
另外，两种剂量的佐以5％Adjuplex的UFV160664诱导的H1 A/加利福尼亚07/09HA茎特异性抗体滴度(用CR9114竞争测定法测量的)与仅佐剂组的滴度相比显著更高(P<0.001；经过审查的方差分析(ANOVA)及事后t检验，Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)，而SoC没有(图19)。
50μg佐以5％Adjuplex的UFV160664的剂量和SoC与仅佐剂组的滴度相比显著降低了肺部病毒载量(50μg UFV160664：P<0.001，SoC：P<0.05；经过审查的方差分析(ANOVA)及事后t检验，Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)(图20)。
结论
根据本发明，已经显示两种剂量的佐以5％Adjuplex的UFV160664都具有免疫原性，并且50μg剂量提供与SoC疫苗参考组相当的保护作用。
实例13：本发明的多肽相对于阳性对照在H5N1 A/印度尼西亚/05/05原初白鼬攻击模型中显示出相当的功效
在该实例中，评价了在异源亚型H5N1 A/印度尼西亚/05/05原初白鼬攻击模型中两种剂量的UFV160664与仅佐剂免疫接种的动物和用与攻击株系同源的H5FL HA免疫接种的阳性对照组(探索性)相比的体内免疫原性和保护功效(基于随访结束时的肺部病毒载量)。
将多组(n＝6)原初雌性白鼬间隔3周用50或5μg佐以5％Adjuplex的UFV160664肌肉内免疫接种三次。阴性对照组仅用佐剂免疫接种。阳性对照组用佐以5％Adjuplex的与攻击株系同源的H5A/印度尼西亚/05/05 HA免疫接种。最终免疫接种后四周，在第0天用105TCID50 H5N1 A/印度尼西亚/05/05气管内攻击动物。在5天的随访期期间，记录若干病毒学和临床参数。
结果
已显示，用两种剂量的佐以5％Adjuplex的UFV160664免疫接种的动物和阳性对照组在随访期存活，而仅佐剂组的存活比例为25％(图21)。与仅佐剂组相比，用佐以5％Adjuplex的50μg UFV160664免疫接种的6只动物中有四只，随访期间的累积体重减轻减少。阳性对照组在体重减轻方面具有与50μg UFV160664组的四只动物同等的减少，并且体重减轻的减少与仅佐剂组相比显著更少(P<0.001；ANOVA、事后t检验、Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)(图22)。
佐以5％Adjuplex的50mcg UFV160664和阳性对照组与仅佐剂组相比显著降低了肺部病毒载量(50μg UFV160664：P<0.01，阳性对照：P<0.05；经过审查的方差分析(ANOVA)及事后t检验，Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)(图23)。
佐以5％Adjuplex的50μg UFV160664和阳性对照组两者与仅佐剂组相比显著降低了累积(每日拭子)咽喉病毒载量(50mcg UFV160664：P<0.05，阳性对照：P<0.001；ANOVA及事后t检验，Bonferroni多重比较校正和从最高剂量开始的分步测试)(图24)。
结论
根据本发明，显示5μg和50μg的UFV160664剂量均防止死亡。另外，与阳性对照组相比，50μg的UFV160664剂量减少了体重减轻并显著减少了肺部和咽喉病毒载量。
实例14：用表达本发明多肽的腺病毒载体免疫接种原初小鼠后的体液和细胞免疫原性
在该实例中，评价了一定剂量范围的含有表达本发明多肽(尤其是多肽UFV171590)的核酸的腺载体26(Ad26)的体液和细胞免疫原性。为了进行比较，用空的腺载体对对照小鼠进行免疫接种，对固定剂量的佐以2％Adjuplex的UFV160664蛋白，或UFV171590初免、有佐剂的UFV160664加强的异源免疫方案进行评价。
多组雌性BALB/c小鼠间隔四周接受两次肌肉内免疫接种。将三组各八只小鼠用108、109或1010个病毒颗粒(vp)的UFV171590免疫接种。作为阴性对照，四只小鼠接受用1010vp空的腺载体(Ad26_空)进行两次免疫接种。一组五只小鼠接受用30μg佐以2％Adjuplex的可溶性三聚体UFV160664进行两次蛋白质免疫接种。一组五只小鼠接受用1010vpUFV171590进行初免免疫，然后接受用30μg佐以2％Adjuplex的UFV160664进行加强免疫。加强免疫后三周，处死小鼠并分离血液和脾脏样品，以分别分析对H1 A/加利福尼亚/07/09的体液免疫应答(全长(FL)ELISA和茎竞争性ELISA)和对UFV160664肽的细胞免疫应答(T细胞ELISpot)。
结果
已显示与用空载体免疫接种相比，所有剂量的含有表达本发明多肽的核酸的腺载体均诱导显著的H1 A/加利福尼亚FL HA ELISA结合滴度(108vp、109vp和1010vp：p<0.001，基于似然比检验的Tobit回归模型)。(图25)。另外，与空载体相比，109和1010vp的UFV171590诱导了显著的HA茎特异性抗体滴度(用CR9114竞争测定法测量的)(p<0.001；基于似然比检验的Tobit回归模型)(图26)。用有佐剂的UFV160664进行初免-加强以及UFV171590初免、有佐剂的UFV160664加强，均诱导显著的H1 A/加利福尼亚/07/09FL HA结合滴度(图25)和HA茎特异性抗体滴度(p<0.001，基于似然比检验的Tobit回归模型)(图26)。
正如在用UFV160664肽刺激后通过T细胞ELISpot测量的那样，除显著的体液应答外，与空载体相比，UFV171590还诱导显著的IFN-γT细胞应答(图27)。所有剂量的UFV171590均诱导显著的T细胞应答(p<0.001；基于似然比检验的Tobit回归模型)，和接受UFV171590初免，然后接受UFV160664加强免疫的一组小鼠(p<0.001)一样。用有佐剂的UFV160664进行两次免疫接种未诱导可检测的IFN-γT细胞应答(图27)。
结论
已经显示，在同源免疫方案中或结合含佐剂的UFV160664加强，表达本发明多肽(UFV171590)的腺载体26在小鼠模型中诱导对H1 A/加利福尼亚/07/09FL HA的显著体液和细胞应答。有佐剂的UFV160664还诱导了显著的体液免疫应答，但在不存在UFV171590初免的情况下，未诱导可检测的T细胞应答。
实例15：突变从多肽160664到不同1类骨架的转移
哺乳动物细胞中的蛋白质表达
合成编码本发明的其他多肽(即基于不同的HA骨架，参见图28A)的DNA片段(金斯瑞(Genscript))，并将其克隆到pcDNA2004质粒(具有增强型CMV启动子的内部修饰的pcDNA3载体)中。通过使用ExpiFectamineTM(Gibco，赛默飞世尔科技公司)进行瞬时转染，在ExpiCHOTM表达培养基中的Expi-CHO细胞培养物中产生多肽。在转染后一天，向Expi-CHO细胞培养物中添加ExpiFectamine CHO增强子和ExpiCHO饲料(Gibco，赛默飞世尔科技公司)。在第7天，通过离心，然后0.2μm过滤来收集含有分泌的多肽的培养物上清液。
培养物上清液分析
使用OCTET平台通过生物层干涉测量法评估收获的培养物上清液中表达的多肽的水平。简言之，将生物素化mAb CR9114固定在链霉亲和素(SA)生物传感器(颇尔·福特生物公司)上，然后通过评估稀释系列的明确的纯化同源多肽的结合移位来建立标准曲线。随后测量预先稀释的收获的含有多肽(在动力学缓冲液中稀释为约5-15μg/mL)的培养物上清液的结合移位，并使用建立的校准曲线计算浓度。
其次，在高效液相色谱法(HPLC)Infinity 1260系列装置(安捷伦)中通过分析性SEC评估Expi-CHO培养收获物中本发明多肽的含量。使含有多肽约3μg蛋白上样量(除UFV180500(0.8μg)以外)的培养物上清液在TSK凝胶G3000SWxl柱(西格玛-奥德里奇)上运行(1mL/min.)，并通过UV检测(OD280，mAU)监测洗脱液。通过Astra 6软件包(怀雅特技术公司)分析SEC图谱。通过扩增均相测定法(AlphaLISA)评估多肽的折叠。这种溶液中和结合中的平衡测定法基于供体和受体珠粒两者与多肽的成功结合。当紧密靠近时，680nm激光辐照供体珠粒会产生单线态氧流，触发附近受体珠粒中的化学事件，从而导致615nm的化学发光发射。通过在存在CR9114(2nM)或MD3606(2nM)的培养物上清液中同时添加镍供体珠粒(10μg/mL)和抗人IgG受体珠粒(10μg/mL，两者均来自珀金埃尔默公司)来进行AlphaLISA测定。在从1667ng/mL开始的3倍稀释度范围内对含多肽的培养物上清液进行滴定。孵育2小时(室温)后，使用EnSightTM多模式酶标仪(珀金埃尔默公司)进行读出。
结果与结论
对35mL ExpiCHO转染物的分析显示，表达了His标记的多肽(图28A)。表达水平从42mg/L(骨架H5 A/越南/1203/04)到375mg/L(骨架H1 A/加利福尼亚07/09)变化，表明所有多肽均表达良好。此外，SEC图谱(图28B)显示，对于每种表达的多肽而言，可检测到大量的三聚体(T)和单体(M)级分。观察到相对三聚体和单体含量的差异，这取决于所利用的骨架品系。为了进一步评估多肽的正确折叠，通过AlphaLISA评估相关抗体(CR9114)和多结构域(MD3606)的结合。对于所有多肽，观察到针对CR9114和MD3606的特异性结合信号(图28C)。表达、SEC图谱和结合数据表明，根据本发明的突变(例如基于株系A/加利福尼亚/07/09的UFV160664的突变)可转移至其他1类骨架。因此，多肽UFV180496、UFV180497、UFV190498、UFV180499、UFV180500和UFV180501全部正确折叠并且是三聚体，并且分泌到培养物上清液中。
表12.标准氨基酸、缩写和特性
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序列
SEQ ID NO 1：H1全长(A/布里斯班/59/2007)
SEQ ID NO 2：H1全长(A/加利福尼亚/07/2009)
SEQ ID NO 3：A/德克萨斯/UR06-0526/2007(H1N1)
SEQ ID NO 4：A/纽约/629/1995(H1N1)
SEQ ID NO 5：A/AA_马顿/1943(H1N1)
SEQ ID NO 6：A/足立/2/57(H2N2)
/>
SEQ ID NO 7：A/新加坡/1/57(H2N2)
SEQ ID NO 8：A/越南/1203/2004H5N1)
>CR9114 VH蛋白(SEQ ID NO:9)
>CR9114 VL蛋白(SEQ ID NO:10)
>CR6261 VH蛋白(SEQ ID NO:11)
>CR6261 VL蛋白(SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO 13：SD15016
/>
SEQ ID NO:14：SD15004
SEQ ID NO:15CAA24269.1血凝素(甲型流感病毒(A/爱知/2/1968(H3N2))(不包括信号序列)
SEQ ID NO 16：UFV5367
SEQ ID NO 17：UFV5369
SEQ ID NO 135：UFV150553
SEQ ID NO 30：UFV150558
SEQ ID NO 31：UFV150559
SEQ ID NO 32：UFV150565
SEQ ID NO 33：UFV150566
SEQ ID NO 34：UFV150567
SEQ ID NO 35：UFV150568
SEQ ID NO 36：UFV150569
SEQ ID NO 37：UFV150570
SEQ ID NO 38：UFV150571
SEQ ID NO 39：UFV150572
SEQ ID NO 40：UFV150573
SEQ ID NO 41：UFV150574
SEQ ID NO 42：UFV150575
SEQ ID NO 43：UFV150576
SEQ ID NO 44：UFV150577
SEQ ID NO 45：UFV150578
SEQ ID NO 46：UFV150579
SEQ ID NO 47：UFV150580
SEQ ID NO 48：UFV150581
SEQ ID NO 49：UFV150582
SEQ ID NO 50：UFV150583
SEQ ID NO 51：UFV150584
SEQ ID NO 52：UFV150849
SEQ ID NO 53：UFV150850
SEQ ID NO 54：UFV150552
SEQ ID NO 55：UFV160088
SEQ ID NO 56：UFV160090
SEQ ID NO 57：UFV160093
SEQ ID NO 58：UFV160097
SEQ ID NO 59：UFV160301
SEQ ID NO 60：UFV160302
SEQ ID NO 61：UFV160303
SEQ ID NO 62：UFV160304
SEQ ID NO:63：UFV160360
SEQ ID NO 64：UFV160361
SEQ ID NO 65：UFV160362
SEQ ID NO 66：UFV160363
SEQ ID NO 67：UFV160364
SEQ ID NO 68：UFV160365
SEQ ID NO 69：UFV160366
SEQ ID NO 70：UFV160367
SEQ ID NO 71：UFV160368
SEQ ID NO 72：UFV160369
SEQ ID NO:73：UFV160370
SEQ ID NO 74：UFV160371
SEQ ID NO 75：UFV160372
SEQ ID NO 76：UFV160373
SEQ ID NO 77：UFV160374
SEQ ID NO 78：UFV160375
SEQ ID NO 79：UFV160376
SEQ ID NO 80：UFV160377
SEQ ID NO 81：UFV160378
SEQ ID NO 82：UFV160379
SEQ ID NO 83：UFV160380
SEQ ID NO 84：UFV160381
SEQ ID NO 85：UFV160382
SEQ ID NO 86：UFV160383
SEQ ID NO 87：UFV160384
SEQ ID NO 88：UFV160385
SEQ ID NO 89：UFV160386
SEQ ID NO 90：UFV160387
SEQ ID NO 91：UFV160388
SEQ ID NO 92：UFV160389
SEQ ID NO 93：UFV160390
SEQ ID NO 94：UFV160391
SEQ ID NO 95：UFV160392
SEQ ID NO:96：UFV160393
SEQ ID NO 97：UFV160394
SEQ ID NO 98：UFV160395
SEQ ID NO 99：UFV160396
SEQ ID NO 100：UFV160397
SEQ ID NO 101：UFV160503
SEQ ID NO 102：UFV160504
SEQ ID NO 103：UFV160655
SEQ ID NO 104：UFV160656
SEQ ID NO 105：UFV160657
SEQ ID NO 106：UFV160658
SEQ ID NO 107：UFV160659
SEQ ID NO:108：UFV160663
SEQ ID NO 109：UFV160664
SEQ ID NO 110：UFV160665
SEQ ID NO 11：UFV160666
SEQ ID NO 112：UFV160667
SEQ ID NO 138：UFV160655
SEQ ID NO 139：UFV160656
SEQ ID NO 140：UFV160664
SEQ ID NO 141：UFV160665
SEQ ID NO 142：UFV171588(UFV160655+TM)
SEQ ID NO 143：UFV171589(UFV160656+TM)
SEQ ID NO 144：UFV171590(UFV160664+TM)
SEQ ID NO 145：UFV171591(UFV160665+TM)
SEQ ID NO:146：MD3606蛋白
SEQ ID NO:147：UFV180496H1 A/加利福尼亚/07/09
SEQ ID NO:148：UFV180497H1 A/密歇根/45/2015
SEQ ID NO:149：UFV180498 H1 A/波多黎各/8/1934
SEQ ID NO:150：UFV180499 H5 A/香港/156/97
SEQ ID NO:151：UFV180500 H5 A/越南/1203/04
SEQ ID NO:152：UFV180501 H2 A/新加坡/1/57
SEQ ID NO:153：UFV171590(UFV160664+TM)
/>
Claims (25)
1.一种1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，其包含HA1和HA2结构域，所述HA茎部多肽包含的氨基酸序列包含：
(i)该HA1结构域中头部区域的缺失，其中所述HA1结构域中的缺失至少包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列；
(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰，其中三聚结构域的修饰包括在C-螺旋中引入异源三聚结构域，所述C-螺旋包含从位置405处的氨基酸直到并且包括位置434处的氨基酸的氨基酸序列；
(iii)在与位置310相对应的氨基酸位置处的半胱氨酸和在与位置422相对应的位置处的半胱氨酸；
(iv)在与位置397相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置405相对应的位置处的半胱氨酸；或在位置396处的半胱氨酸结合在位置408处的半胱氨酸；或在位置399处的半胱氨酸结合在位置405处的半胱氨酸；
其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，并且与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且其中这些氨基酸位置的编号基于SEQ ID NO:15的H3编号。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中该异源三聚结构域是GCN4序列。
3.根据权利要求1或2的多肽，其中所述异源三聚结构域由选自以下的氨基酸序列组成：
CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:24)；
CIKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:25)；
CMEALEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:26)；
CIEALEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:27)；
RMECLEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:28)；以及
RIECLEKKVDDIEKK(SEQ ID NO:29)。
4.根据权利要求1或2所述的多肽，其中与氨基酸392相对应的氨基酸是Y、P或R，与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且与位置442相对应的位置处的氨基酸是A。
5.根据权利要求1或2所述的多肽，该多肽包含在与位置397相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置405相对应的位置处的半胱氨酸。
6.根据权利要求1或2所述的多肽，其中：
-在与位置395相对应的位置处的氨基酸是I；
-在与位置399相对应的位置处的氨基酸是Y或C；
-在与位置400相对应的位置处的氨基酸是P；
-在与位置401相对应的位置处的氨基酸是K；
-在与位置402相对应的位置处的氨基酸是S；和/或
-在与位置404相对应的位置处的氨基酸是R或Q。
7.根据权利要求1或2所述的多肽，其中与位置323处的氨基酸相对应的氨基酸是K和/或与位置326处的氨基酸相对应的氨基酸是K。
8.根据权利要求1或2所述的多肽，其中与位置339处的氨基酸相对应的氨基酸是T。
9.根据权利要求1或2所述的多肽，其中该多肽不包含蛋白酶裂解位点。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中位置329处的氨基酸是谷氨酰胺。
11.根据权利要求1或2所述的多肽，其中该多肽包含天然裂解位点或多元裂解位点。
12.根据权利要求1或2所述的多肽，其中该多肽包含信号序列。
13.根据权利要求1或2所述的多肽，该多肽包含截短的HA2结构域。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中该多肽不包含跨膜结构域和细胞质结构域。
15.根据权利要求1或2所述的多肽，其中从与位置516处的氨基酸相对应的氨基酸开始的该HA2结构域的C-末端部分已缺失。
16.根据权利要求1或2所述的多肽，其中该HA1结构域中的缺失已被1-10个氨基酸的连接序列替换。
17.根据权利要求1或2所述的多肽，其由选自SEQ ID NO:103、104、109和110的氨基酸序列组成。
18.一种核酸，该核酸编码根据前述权利要求中任一项所述的多肽。
19.根据权利要求18所述的核酸，其由选自SEQ ID NO:138-145的核酸序列组成。
20.根据权利要求18或19所述的核酸，其由选自SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144和SEQ ID NO:145的核酸序列组成。
21.一种载体，该载体包含编码根据权利要求1-17中任一项所述的1类HA茎部多肽的核酸分子。
22.根据权利要求21所述的载体，其中该载体是重组腺病毒载体。
23.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1至17中任一项所述的多肽和/或根据权利要求18-20任一项所述的核酸，和/或根据权利要求21或22所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
24.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，根据权利要求18-20任一项所述的核酸，和/或根据权利要求21或22所述的载体在制备用于诱导针对I类甲型流感病毒的免疫应答的药物中的用途。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，和/或根据权利要求18-20任一项所述的核酸，和/或根据权利要求21或22所述的载体在制备针对I类甲型流感病毒的疫苗中的用途。
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