CN116589566A - 一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用 - Google Patents

一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HIV‑1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用。本发明的一种HIV‑1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体，包括(a)重链恒定区，所述IgM重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(b)轻链恒定区，(c)重链可变区，(d)轻链可变区。本发明IgM改造后的中和抗体不仅提高了抗体的亲和力，同时间接提高了抗体的中和活性，为HIV‑1的预防和疫苗开发提供更多的策略。

Description

一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用
技术领域
本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用。
背景技术
自1983年人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus，HIV-1)发现至今，获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)即艾滋病在全球范围内广泛流行。全球HIV-1感染者每年新增约150万人。随着高效抗逆转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy,HAART)的应用大大提高了HIV-1感染者的生存率。它可以有效降低感染者体内的病毒载量，并持续提高T细胞的数量。但耐药性菌株的出现以及HIV-1病毒储存库的持久性，成为HAART治疗的障碍。而广谱中和抗体的发现为HIV-1被动免疫治疗和疫苗设计提供了新的策略和方法。
但广谱中和抗体仅在少数HIV-1慢性感染者体内产生并发育成熟，这类感染者被称为长期不进展者(long term non-progressors，LTNPs)。其感染HIV-1超过10年并且未进行抗逆转录病毒治疗，其体内CD4+T细胞的数量维持在正常水平。HIV-1感染者长期不进展可能有病毒和宿主两方面的原因，其中宿主的遗传因素和免疫机制显得更为重要。某些人类白细胞抗原以及HIV-1特异性的CD8+T细胞与HIV-1感染者长期不进展密切相关。由于其独特的遗传和免疫机制，LTNPs成为了分选广谱中和抗体的重要样本。
抗体的亲和力一定程度上决定了其抗原结合能力和中和活性。广谱中和抗体亲和力成熟的过程漫长且复杂。病毒逃逸和中和抗体之间复杂的共进化过程触发了广谱中和抗体的亲和力成熟过程。针对传播/始祖病毒(transmitted-founder virus，TF virus)的中和抗体不仅可以中和TF病毒，还能诱导产生亲和力更高、更成熟的中和抗体。大部分HIV-1感染者在感染后3个月左右出现针对TF病毒包膜糖蛋白(envelope glycoprotein，Env)的毒株特异性中和抗体。这种抗体无法中和早期的中和反应逃逸株和不同亚型的异源病毒。早期毒株特异性中和抗体对TF病毒的中和反应驱动了病毒逃逸。HIV-1病毒通过在Env序列中引入氨基酸突变、插入缺失、糖基化修饰等突变，逐步对自体血浆中和活性产生抵抗。随后，免疫系统也将针对逃逸病毒产生新的中和抗体反应。这种抗体和病毒间的相互竞争在感染多年后促使部分感染者中出现一类具有交叉中和活性的广谱中和抗体。这一过程中由于持续不断暴露在进化和突变的病毒中，B细胞受体积累了足够的体细胞超突变并对HIV-1上的保守位点出现了中和反应。因此，广谱中和抗体长时间的发育成熟可归因于缓慢的抗原依赖性亲和力成熟过程。
针对病原微生物典型的体液免疫反应包括初始阶段产生的IgM，以及之后几天到几周内类别转换和抗体成熟后产生的IgG。目前报道的大部分HIV-1广谱中和抗体均为IgG。但靶向HIV-1包膜gp120和gp41的IgG类抗体在HIV-1感染过程中无法有效激活补体系统并直接介导病毒裂解。甚至与靶向HIV-1 IgG类抗体结合的病毒颗粒可以通过其Fc段受体和补体C3b受体感染单核-巨噬细胞，形成除CD4+T细胞以外的HIV-1病毒储藏库。而且，随着广谱中和抗体产生带来的免疫压力，病毒中和逃逸逐步加深，多样性也逐渐丰富。这种中和逃逸突变毒株的产生，使得IgG型中和抗体可能失去对HIV-1突变表位的亲和力。而IgM型抗体的高亲和力可以弥补因突变表位不完全匹配导致的亲和力降低。目前在乙型流感病毒和新型冠状肺炎病毒的研究中已证明IgM抗体具有更强和更广谱的抗病毒活性。因此，与IgG型抗体相比IgM抗体有望中和更广泛的HIV-1突变毒株。
与IgG类抗体不同，IgM是所有脊椎动物中都存在的抗体类型。IgM以二聚体形式存在于B细胞表面作为B细胞受体，分泌到血清中时主要为通过J链连接的五聚体形式。IgM是体内分子量最大的抗体，在血清中的含量相对较高。已有研究证明IgM与IgG的发育成熟和调节B细胞发育密切相关。IgM是体液免疫过程中产生的第一批抗体，因此其亲和力往往低于IgG。但IgM独特的五聚体结构和多价抗原结合模式使其能高亲和力结合抗原。除此之外IgM具有强大的激活补体系统的潜力，可通过补体系统裂解病毒粒子和病毒感染的细胞，从而加速细胞和体液免疫反应。尽管IgM具有独特的特征，但在预防和治疗病毒感染中的作用仍未得到充分研究。
与其他病原体一样，IgM是HIV-1感染后最早出现的病毒特异性抗体类别。在HIV-1急性感染中，检测到病毒血症后平均5天内就可检测到血清抗HIV-1 IgM，并以IgM-病毒粒子复合物的形式存在。而IgG抗体则在感染后11天首次出现。目前第三代HIV-1检测试剂盒包含抗HIV-1 IgM的检测，缩短了窗口期。
IgG抗体可通过两个Fab段同时结合抗原来增加表观亲和力。但与甲型流感病毒、登革热病毒和乙型肝炎病毒相比HIV-1病毒表面的Env刺突数量较少且分布稀疏，迫使IgG抗体只能以单价形式结合Env刺突。而单价结合模式降低了抗体的亲和力和中和效力，在一定程度上使HIV-1病毒更容易对中和抗体免疫逃逸。而IgM抗体的五聚体结构、高亲和力以及多价抗原结合模式可增强对病毒的中和作用以及减少病毒的免疫逃逸。
与抗HIV-1 IgG或IgA不同，除了开发为诊断工具之外，关于抗HIV-1 IgM的研究相对较少。目前已有少数研究将HIV-1广谱中和抗体从IgG改造为IgM，并探究其在体外的功能活性。包括第一代广谱中和抗体2F5、4E10和2G12。也有研究报道在非人灵长类动物模型中探究抗HIV-1 IgM在预防黏膜传播中的潜力。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供了一种抗体的亲和力高的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体，包括(a)重链恒定区，所述IgM重链恒定区的氨基酸序列是SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；
(b)轻链恒定区，所述IgM轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(c)重链可变区，所述IgM-7D5重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述IgM-2E8重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(d)轻链可变区，所述IgM-7D5轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述IgM-2E8轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明制备所述的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体的方法。
本发明的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体的搭载小分子、毒素或核素的方法。
本发明的一种核酸分子，包括编码权利要求1或2中所述的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体。
进一步地，其IgM重链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，IgM轻链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
IgM-7D5重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，IgM-2E8重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
IgM-7D5轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，IgM-2E8轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
本发明在制备HIV-1被动免疫预防疫苗中的应用。
进一步地，诱导保护性IgM抗体为目标的疫苗中的应用。
有益效果：本发明IgM改造后的中和抗体不仅提高了抗体的亲和力，同时间接提高了抗体的中和活性，为HIV-1的预防和疫苗开发提供更多的策略。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)基于LTNPs作为HIV-1广谱中和抗体分选的重要样本，以及IgM抗体独特的五聚体结构、高亲和力和抗病毒特性，本发明将尝试分选靶向我国HIV-1流行株的中和抗体，并进一步鉴定其功能活性。在此基础上，采用分选抗体的可变区基因构建重组人抗HIV-1单克隆IgM抗体，并比较同种抗体IgG和IgM形式亲和力和中和活性的差异。为LTNPs分选广谱中和抗体提供一定的理论依据，并为设计诱导以IgM抗体为主的HIV-1疫苗提供新的思路和策略。
(2)本发明采用MST来检测抗体的亲和力。MST结果显示IgM-2E8对不同亚型的HIV-1抗原具有更高的亲和力，与IgG形式相比其亲和力提高了10倍左右。
(3)本发明IgM-2E8和IgM-7D5的中和活性虽然有提升但与其他已报道的HIV-1广谱中和抗体相比其在体外的抗病毒活性依然较弱。但不应低估其在体内抗HIV-1感染的作用。IgM抗体通过激活补体系统以裂解病毒和感染细胞方面具有强大的潜力。
附图说明
图1为本发明的特异性单个记忆B细胞流式分选图；图1A为本发明的淋巴细胞图；图1B为本发明的记忆B细胞图；图1C为本发明的CD20+CD27+YU2-gp140+AE1-gp140+细胞图。
图2为本发明单个记忆B细胞抗体可变区基因扩增图。图2A为本发明的重链可变区扩增结果；图2B为本发明的轻链κ链扩增结果图；图2C为本发明的轻链λ链扩增结果图。
图3为本发明的三轮Touch-down巢式PCR扩增结果图。图3A为本发明的巢式PCR扩增κ链图；图3B为本发明的touch down巢式PCR扩增κ链图。
图4为本发明的分选记忆B细胞重、轻链可变区基因序列分析图；图4A为本发明的重链可变区序列胚系基因种类图；图4B为本发明的轻链可变区序列胚系基因种类图；图4C为本发明的重链可变区序列突变率图；图4D为本发明的轻链可变区序列突变率图。
图5为本发明的293T细胞表达抗体WB检测结果图；图5A为本发明的细胞表达上清图；图5B为本发明的细胞裂解液图。
图6为本发明的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色鉴定纯化的IgG抗体蛋白图。
图7为本发明的抗体结合活性分析图；图7A为本发明的与YU2-gp140的结合实验结果图；图7B为本发明的与AE1-gp140的结合实验结果图；图7C为本发明的7D5线性表位(多肽)结合实验结果图；图7D为本发明的2E8线性表位(多肽)结合实验结果图。
图8为本发明的HIV-1感染者血浆线性表位结合能力分析图；图8A为本发明的HIV-1感染者血浆与5个线性表位的结合能力结果图；图8B为本发明的pt15号样本血浆与5个线性表位的结合能力结果图。
图9为本发明的IgM抗体表达质粒的构建图；图9A为本发明的IgM抗体轻、重链可变区扩增图；图9B为本发明的IgM表达载体PCR线性化图；图9C为本发明的IgM抗体表达质粒电泳结果图。
图10为本发明的WB验证重组人HIV-1特异性IgM抗体表达图。图10A为本发明的293T细胞培养上清图；图10B为本发明的293T细胞裂解液图。
图11为本发明的CHO-S细胞表达和纯化IgM抗体图；图11A为本发明的CHO-S细胞培养上清中的IgM抗体纯化图；图11B为本发明的纯化的IgM抗体SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色鉴定图；图11C为本发明的纯化的IgM抗体SDS-PAGE电泳后WB鉴定图。
图12为本发明的同一抗体IgG和IgM结合能力比较图；图12A为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8与YU2-gp140的结合能力比较图；图12B为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8与AE1-GP140结合能力比较图。
图13为本发明的MST检测同一抗体IgG和IgM的亲和力大小图。图13A为本发明的7D5和YU2-GP140的亲和力大小图；图13B为本发明的IgM-7D5和YU2-GP140的亲和力大小图；图13C为本发明的2E8和YU2-GP140的亲和力大小图；图13D为本发明的IgM-2E8和YU2-GP140的亲和力大小图。
图13E为本发明的7D5和AE1-GP140的亲和力大小图；图13F为本发明的IgM-7D5和AE1-GP140的亲和力大小图；图13G为本发明的2E8和AE1-GP140的亲和力大小图；图13H为本发明的IIgM-2E8和AE1-GP140的亲和力大小图。
图14为本发明的抗体中和假病毒的最大抑制率(％)图；图14A为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8中和398F1假病毒的最大抑制率(％)图；图14B为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8中和246F3假病毒的最大抑制率(％)图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明的一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体，包括(a)重链恒定区，所述IgM重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(b)轻链恒定区，所述IgM轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(c)重链可变区，所述IgM-7D5重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述IgM-2E8重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(d)轻链可变区，所述IgM-7D5轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述IgM-2E8轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明制备所述的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体的方法。
本发明的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体的搭载小分子、毒素或核素的方法。
本发明的一种核酸分子，包括编码权利要求1或2中所述的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体。其IgM重链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，IgM轻链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
IgM-7D5重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，IgM-2E8重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
IgM-7D5轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，IgM-2E8轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
本发明在制备HIV-1被动免疫预防疫苗中的应用。诱导保护性IgM抗体为目标的疫苗中的应用。
试验例1
本发明中使用的PBMC和血浆样本由北京协和医院感染科馈赠，中国医学科学院医学生物学研究所孙明实验室保存。来源于一组河南的HIV-1感染队列，感染者为1990年至1998年间通过血液途径传播感染HIV-1病毒，2003年确诊感染。本发明所用样本均通过了北京协和医院伦理委员会的审查，所有感染者均签署了知情同意书。
LTNPs入选标准：
(1)经初筛实验及蛋白免疫印迹检测确认HIV-1抗体结果均为阳性；(2)从基线开始计算，HIV-1感染超过10年；(3)未接受抗逆转录病毒治疗；(4)CD4+T细胞计数绝对值>400个/μl；(5)临床上未出现HIV-1感染相关疾病。
典型进展者(typical progressors，TPs)入选标准：(1)经初筛实验及蛋白免疫印迹检测确认HIV-1抗体结果均为阳性；(2)1990年至1998年之间通过血液传播感染；从基线开始计算，HIV-1感染6-8年；未接受抗逆转录病毒治疗；CD4+T细胞计数绝对值<200个/μl。本发明的排除标准：(1)年龄大于65岁或小于18岁；(2)随访时间点少于3个；(3)合并严重的机会性感染，造成重要脏器功能衰竭；(4)严重的肾脏和肝脏疾病；(5)活动性肿瘤患者；(6)妊娠及哺乳期患者。
1.2样本类型
本发明的样本为研究对象在2018年采集的外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)密度为1×107个/ml。采用细胞冻存液冻存于液罐氮中。
2实验材料
2.1实验细胞
HEK 293T细胞，由中国医学科学院医学生物学研究所孙明课题组保存。
CHO-S细胞，由武汉生物制品研究所赠送。
293F细胞，购于北京义翘神州科技有限公司。
TZM-bl细胞，由南开大学分子病毒学实验室赠送。
2.2HIV-1假病毒
HIV-1假病毒(Globalpanel)质粒由华大基因构建并合成，假病毒由本课题组转染制备。本发明使用的假病毒包括A亚型：398F1，B亚型：246F3。
2.3主要试剂
2.4主要耗材
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2.5主要仪器设备
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3实验方法
3.1特异性单个记忆B细胞分选
(1)分选抗原荧光标记：在10μl的HIV-1 gp140三聚体(AE1)和HIV-1 gp140三聚体(YU2)蛋白中分别加入1μl的LL-modifier并吹打混匀。在上述混合液中加入10μg荧光素冻干粉中，避光室温孵育过夜。次日使用前加入1μl LL-quencherFD于室温平衡半小时。采用APC标记YU2-gp140三聚体，perCP标记AE1-gp140三聚体；
(2)复苏PBMC：将液氮罐中冻存的PBMC取出，在37℃水浴中迅速融化。加入10ml预热的含10％FBS的RPMI 1640培养基，吹打重悬细胞，860×g离心5min后弃上清，用10ml预冷的PBS重悬细胞，860×g离心5min后弃上清，将标记后的抗原(YU2-gp140-APC、AE1-gp140-perCP)和抗体(CD20-PE,CD27-FITC)混合后加入PBMC中，冰上静置1h，使用前用10ml预冷的PBS洗涤一次，加入1ml预冷的PBS重悬；
(3)流式细胞分选：重悬的PBMC在BD FACSjazzTM Cell Sorter流式细胞仪上进行分选。将CD20+CD27+AE1gp140+YU2gp140+的单个记忆B细胞分入含有细胞裂解液(RNaseOut 0.5μl、Igepal 0.0625μl、0.1M DTT 1.25μl、5×first strandbuffer 5μl)的96孔板中，离心后迅速于干冰上冻存，-80℃冰箱保存。
3.2逆转录
(1)从-80℃冰箱中取出分选的96孔PCR板，于冰上解冻后加入1μl Carrier RNA，冰上静置10min；
(2)每孔中分别加入
random hexamers at 2μl
50ng/μl
dNTPmix,eachat 10mM 5μl
(3)65℃孵育5min后冰上静置1min
(4)加1ul SuperScript IV和0.5μl RNase Inhibitor(40U/μl)
(5)反应程序：23℃10min，50℃20min，80℃10min
3.3巢式PCR
3.3.1巢式PCR所用引物
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3.3.2H链可变区扩增
第一轮反应
第二轮反应
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3.3.3κ链可变区扩增
第一轮反应
第二轮反应
/>
第三轮反应
3.3.4λ链可变区扩增
第一轮反应
/>
第二轮反应
3.3.5κ链可变区扩增条件优化
κ链可变区基因扩增的阳性率较低，无法得到明确的目的条带。故对PCR反应体系和条件进行优化。优化后的反应体系和条件如下：
第一轮反应
/>
第二轮反应
第三轮反应
3.4抗体可变区PCR产物回收
(1)在吸附柱(放入收集管)中加入500μl平衡液BL，放置1-2min，12000rpm离心1min；
(2)PCR产物电泳后，在紫外光下从1％的琼脂糖凝胶中切下目的DNA片段放入1.5ml管中，称量重量；
(3)在1.5ml管中加入与胶块等体积的溶液PC(0.1g凝胶加入100μlPC)；
(4)45℃水浴锅中溶解胶块10min，期间颠倒混匀，确保胶块完全溶解；
(5)取出1.5ml管平衡至室温，将上述液体加入到吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，弃废液；
(6)在吸附柱中加入600μl漂洗液PW(加入无水乙醇)，静置2min，12000rpm离心1min，弃废液，重复该操作步骤；
(7)12000rpm离心2min，弃废液后将吸附柱盖子敞开，室温放置10min；
(8)将吸附柱放入一个干净的1.5ml管中，向吸附膜中央逐滴滴加20-30μl 65℃预热的纯水，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA洗脱液，将收集的DNA洗脱液再次逐滴滴加在吸附膜中央，室温放置2min，12000rpm离心2min，再次收集DNA洗脱液以提高得率
3.5构建抗体重链表达载体质粒
3.5.1重链表达载体CMVR-H+C双酶切
重链表达载体CMVR-H+C采用限制性内切酶EcoR I和Nhe I进行双酶切反应体系如下：
37℃酶切20min后，加入0.5μl quick CIP 37℃消化30min。酶切反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳后回收酶切后片段，方法同前。
3.5.2重链可变区PCR产物双酶切
酶切反应体系如下：
37℃酶切30min后，加入三倍体积的溶液PC，进行酶切后PCR产物回收，方法同前。
3.5.3重链表达载体和PCR产物酶切连接
连接反应体系如下：
3.5.4转化及单克隆菌落测序
(1)从-80℃冰箱中取出100μl DH5α感受态细胞至于冰上融化，待完全融化后均分为两只每只各50μl；
(2)取连接产物10μl轻轻加入感受态细胞中并轻轻吹打混匀；
(3)冰上静置30min，42℃热激45s，热激完成后迅速于冰上静置3min；
(4)加入500μl提前37℃预热的无抗生素的LB培养基；
(5)放入37℃，200rpm的摇床中复苏1h；
(6)取80μl复苏后的菌液均匀涂布在含有卡那霉素(重链/κ链)、氨苄霉素(λ链)、潮霉素(IgM)的固体LB培养基上，37℃培养箱中培养6-8h；
(7)在平板上挑取单个菌落，加入3-5ml含有相应抗生素的液体LB培养基中，220rpm摇床中培养6-8h；
(8)取700μl菌液送测序公司进行测序分析
3.6构建抗体轻链(κ链)表达载体质粒
3.6.1轻链(κ链)表达载体CMVR-L双酶切
轻链(κ链)表达载体CMVR-L采用限制性内切酶EcoR I和Pvu II进行双酶切反应体系如下：
37℃酶切20min后，加入0.5μl quick CIP 37℃消化30min。酶切反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳后回收酶切后片段，方法同前。
3.6.2轻链(κ链)可变区PCR产物双酶切
酶切反应体系如下：
37℃酶切30min，酶切反应结束后，加入三倍体积的溶液PC，进行酶切后PCR产物回收，方法同前。
3.6.3轻链(κ链)表达载体与PCR产物同源重组连接
连接反应体系如下：
反应条件：50℃反应25-30min
3.6.4连接产物转化及单克隆菌落测序同前
3.7构建抗体轻链(λ链)表达载体质粒
3.7.1轻链(λ链)表达载体PcDNA3.1-L单酶切
轻链(λ链)表达载体PcDNA3.1-L采用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，反应体系如下：
37℃酶切20min后，加入0.5μl quick CIP 37℃消化30min。酶切反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳后回收酶切后载体片段，方法同前。
3.7.2轻链(λ链)可变区PCR产物双酶切
酶切反应体系如下：
37℃酶切30min，酶切反应结束后加入三倍体积的溶液PC，进行酶切后PCR产物回收，方法同前。
3.7.3轻链(λ链)表达载体与PCR产物酶切连接
连接反应体系如下：
3.7.4连接产物转化及单克隆菌落测序同前
3.8IgG抗体的IgM改造
IgM表达载体pVITR01-IgM/κ为双启动子的抗体表达质粒，抗体H链和L链的可变区位于同一个质粒载体上。因此采取先将H链可变区连接到载体上，确认连接正确后再将L链可变区连接到载体上的策略进行IgM抗体表达质粒的构建。
3.8.1IgG抗体IgM改造所用引物
3.8.2抗体H链和L链可变区的扩增
(2)抗体可变区PCR扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收PCR产物，方法同前。
3.8.3H链可变区与IgM载体同源重组连接
(1)PCR线性化IgM载体：在IgM载体上H链可变区的两端设计特异性引物，通过touch up的方法PCR线性化IgM载体除VH的部分，反应体系如下：
/>
(2)DpnI消化模板，反应体系如下：
(3)DpnI消化后的PCR线性化载体进行1％的琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收线性化载体片段，方法同前。
(4)抗体H链可变区和线性化IgM载体同源重组连接，反应体系如下：
(5)连接产物转化及单克隆菌落测序同前
3.8.4抗体L链可变区与IgM载体同源重组连接
(1)PCR线性化H链可变区正确连接的载体IgM-H：将抗体H链可变区连接正确的IgM载体作为模板，在K链可变区的两端设计特异性引物，通过touch up的方法PCR线性化IgM载体除VK的部分，反应体系如下：
(2)DpnI消化模板，反应体系如下：
(3)DpnI消化后的PCR线性化载体进行1％的琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收线性化载体片段，方法同前。
(4)抗体L链可变区和线性化IgM-L载体同源重组连接，反应体系如下：
(5)连接产物转化及单克隆菌落测序同前
3.9质粒提取：
(1)使用前准备
1)将试剂盒中提供的RNase A和LyseBlue加入到溶液P1中，每瓶溶液P1中加入1支RNase A(使用前需瞬时离心)使终浓度为100μg/ml/，加入1支LyseBlue(使用前需瞬时离心)使稀释比例为1:1000；
2)在溶液PE中加入24ml无水乙醇；
3)检查溶液P2和BB是否因储存温度过低而出现沉淀，必要时可以在37℃水浴锅中溶解
(2)将在LB液体培养基(含抗生素)中过夜培养的菌液倒入50ml离心管中，8000rpm，4℃离心5min收集细菌；
(3)在离心管中加入4ml bufferP1，确保bufferP1中已添加了RNase A和LyseBlue，用漩涡振荡器或者吹打混匀使细菌完全重悬，确保没有细菌团块，此时溶液应呈蓝色；
(4)在离心管中加入4ml buffer P2，轻轻颠倒混匀，室温孵育3min，不超过5min，此时溶液应该变粘稠；
(5)在离心管中加入4ml buffer S3，立即颠倒混匀至溶液中蓝色消失，此时溶液中应出现白色疏松沉淀，8000rpm，4℃离心10min；
(6)将离心后的裂解液转移到QIAfilter滤芯中，将柱推筒轻轻插入QIAfilter滤芯中并将细胞裂解液过滤到新管中，过滤直到所有裂解液都通过QIAfilter滤芯，但不要用力过猛；
(7)向澄清的裂解液中加入2ml BufferBB并颠倒混合4-6次；
(8)将裂解液转移到QIAGEN Plasmid Plus Midi离心柱中，并在QIAvac 24Plus上连接一个延伸器；
(9)打开真空泵，施加大约300mbar的负压，使裂解液通过QIAGEN Plasmid PlusMidi离心柱，所有液体通过所有柱子后，关闭真空泵；
(10)加入0.7ml BufferETR后，打开真空泵。液体通过所有柱子后，关闭真空泵；
(11)加入0.7ml Buffer PE后，打开真空泵。液体通过所有柱子后，关闭真空泵；
(12)将QIAGEN Plasmid Plus Midi离心柱取出，12000rpm离心2min，室温放置10min去除残留的BufferPE；
(13)将QIAGEN PlasmidPlus Midi离心柱放入干净的1.5ml离心管中，在离心柱的中心加入400μl的65℃预热的灭菌水，静置2min，12000rpm离心1min；
(14)收集离心后的质粒DNA溶液，采用NanoDrop 2000测量浓度。
3.10抗体表达
3.10.1293T细胞表达系统
(1)细胞准备：从液氮罐中取出293T细胞，迅速在37℃水浴锅中融化，加入15ml GM培养基中(DMEM培养基+10％FBS+1％双抗)，1000rpm离心3min后弃上清，加15ml GM培养基复苏于T75细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养，至少传代3次且细胞活率大于90％以上可进行转染；
(2)将测序鉴定正确的阳性克隆且配对成功的重链和轻链质粒用试剂盒提取质粒，用0.22μm的针式过滤器过滤后备用；
(3)转染前24h将293T细胞均匀铺在12孔板中，每个孔0.35×106个细胞，转染前观察细胞密度，在70％-85％左右为益；
(4)在转染之前将12孔板中的培养基更换为无血清的DMEM培养基；
(5)取重、轻链质粒各1μg加入到50μl的DMEM培养基中吹打混匀，取8μlReagent加入到50μl的DMEM培养基中吹打混匀，室温静置5min；
(6)将上述稀释的DNA和Reagent按1:1体积比例混合，吹打混匀，室温静置10min；
(7)将100μl混合液逐滴滴加入12孔板中的293T细胞中，37℃，5％CO2培养；
(8)转染后48h收集细胞培养上清和细胞裂解液。
3.10.2293F细胞表达系统
(1)细胞准备：从液氮罐中取出293F细胞，迅速在37℃水浴锅中融化，加入30mlSMM293-T II培养基复苏于50ml细胞培养瓶中，37℃，5％CO2，150rpm培养，培养3-4天后计数细胞密度超过1×106个/ml，以0.5×106个/ml的密度传代，至少传代3次以上细胞活率大于90％以上可以进行转染；
(2)转染前3-5h计数细胞密度为2-3×106个/ml，用新鲜的SMM293-T II培养基调整细密度为1-1.2×106个/ml，取50ml细胞接于125ml细胞培养瓶中培养；
(3)转染液配置：0.15mM的NaCl溶液稀释重、轻链质粒各25μg共50μg DNA，终体积为1ml，用0.15mM的NaCl溶液稀释250μl sinofection转染试剂，终体积为1ml，室温静置5min，后将上述稀释液按体积比1:1混合后静置10min；
(4)将上述转染液逐滴滴加入293F细胞中，同时轻轻摇晃细胞培养瓶以混匀转染液，37℃，5％CO2，125rpm培养；
(5)转染后24h加入1ml的SMS 293-SUPI营养液，48h补加10ml新鲜的SMM293-T II培养基，继续培养5-6天后，4000rpm离心10min收集细胞培养上清。
3.10.3CHO-S细胞表达系统
(1)细胞准备：从液氮罐中取出CHO细胞，迅速在37℃水浴锅中融化，加入30ml CD-Forti无血清培养基复苏于50ml细胞培养瓶中，37℃，8％CO2，135rpm培养，培养2-3天后计数细胞密度超过1×106个/ml，以0.1×106个/ml的密度传代，至少传代3次以上细胞活率大于90％以上可以进行转染；
(2)转染前3-5h计数细胞密度为2-2.5×106个/ml，用新鲜的CD-Forti无血清培养基调整细胞密度为1-1.2×106个/ml，取50ml细胞于125ml细胞培养瓶中培养；
(3)转染液配置：用OptiPROTMSFMTM无血清培养基稀释重、轻链质粒各25μg共50μgDNA，终体积为1ml，用OptiPROTMSFMTM无血清培养基稀释50μl转染试剂FreeStyleTMMAX，终体积为1ml，室温静置5min，将上述稀释液按体积比1:1混合后静置10min；
(4)将上述转染液逐滴滴加入CHO-S细胞中，同时轻轻摇晃细胞培养瓶以混匀转染液；
(5)37℃，5％CO2，125rpm培养5-7天后，4℃，4000rpm离心10min收集细胞培养上清。
3.11IgG抗体纯化
(1)buffer A：20mM Na3PO4，150mM NaCl，pH7.0
缓冲液配制：
buffer B：50mM Na3PO4，pH3.0
(2)样本处理：4000rpm离心10min收集转染后细胞培养上清，用0.45μm的针式过滤器过滤去除细胞碎片，在100ml的细胞培养上清中加入约50μl的rProtein A Beads悬液和10ml的10×buffer A，25℃，50rpm摇床上孵育1.5-2h；
(3)IgG抗体纯化：
1)用3-5倍柱体积的1×buffer A润洗层析柱，加入大约150μl的rProtein ABeads悬液，用10-15倍柱体积的1×buffer A平衡层析柱；
2)将细胞培养上清缓慢加入到层析柱中，收集流出液，将流出液重复加到层析柱中，每个样品重复过柱2-3次；
3)用5-10倍柱体积的1×buffer A清洗层析柱，去除非特异性结合的杂蛋白；
4)加入2ml的buffer B洗脱IgG抗体，收集洗脱液；
5)在洗脱液中加入200μl的pH值为8.8的1.5M Tris-HCl
6)将中和后的洗脱液加入到超滤管中，4000rpm离心15min后用PBS置换蛋白缓冲体系，收集IgG抗体溶液；
7)用NanoDrop 2000测量所得IgG抗体溶液的浓度。
3.12IgM抗体纯化
(1)缓冲液配制：平衡液：800mM(NH4)2SO4，20mM NaH2PO4，
pH7.5
洗脱液：20mM NaH2PO4，pH 7.5
(2)样本处理：CHO-S或293F细胞转染后4000rpm离心10min收集培养上清，在培养上清中缓慢加入固体(NH4)2SO4直至终浓度为1M，4000rpm离心10min，用0.45μm的针式过滤器过滤；
(3)将IgM纯化柱连接到纯化仪上，用10-15倍柱体积的纯水清洗纯化柱中20％的乙醇；
(4)用10-15倍柱体积的平衡液平衡纯化柱，流速为2ml/min；
(5)用0.7ml/min的流速将样品加到纯化柱中；
(6)用10-15倍柱体积平衡液清洗纯化柱至基线平，流速为1ml/min；
(7)用3倍柱体积的洗脱液洗脱IgM抗体，流速为1ml/min；
(8)用10-15倍柱体积的纯水清洗纯化柱，流速为2ml/min；
(9)用10-15倍柱体积的20％乙醇清洗纯化柱，流速为2ml/min，纯化柱于4℃保存。
(10)用NanoDrop 2000测量所得IgM抗体溶液的浓度。
3.13Western Blot抗体鉴定
(1)取32μl细胞培养上清和细胞裂解液，加入8μl 5×的protein loadingbuffer，100℃加热10min；(2)样品冷却到室温后加入到10％的SDS-PAGE胶孔中，浓缩胶使用80V恒压电泳，分离胶使用130V恒压电泳，直到溴酚蓝指示剂完全电泳到胶外后停止电泳；(3)电泳完成后，按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序制作湿式转膜装置，避免出现气泡；(4)转膜盒插入转膜槽内后放置于冰浴中，400mA转膜90min；(5)转膜完成后取出PVDF膜，用0.05％的PBST洗膜2min。用5％的脱脂牛奶4℃过夜封闭；(6)弃封闭液，用15-20ml0.05％的PBST洗膜6次，每次洗5min，共洗涤30min；(7)加入10ml用2％脱脂牛奶按1:5000比例稀释的二抗，室温摇床上摇动孵育1h；(8)弃二抗，用15-20ml0.05％的PBST洗膜6次，每次洗5min，共洗涤30min；(9)加入1:1混合的ECL底物反应2-3min，在仪器上曝光。
3.14考马斯亮蓝染色
(1)样本处理和SDS-PAGE电泳同上；(2)电泳结束后取出凝胶放入大小合适的容器中，加入40-50ml双蒸水，加热至沸腾后维持30s-1min，摇床上室温摇动孵育5-10min；(3)弃双蒸水，加入40ml考马斯亮蓝染色液(A液40ml，B液800μl)，加热至沸腾后维持30s-1min，摇床上室温摇动孵育10-15min；(4)弃染色液，加入40-50ml双蒸水，加热至沸腾后维持30s-1min，摇床上室温摇动孵育10-15min；
(5)重复该步骤，直至凝胶背景变白，观察结果。
3.15酶联免疫吸附实验(ELISA)
3.15.1血浆特异性表位结合能力分析
(1)多肽包被：用PBS将多肽V1、V2、V3、CD4bs、MPER稀释至浓度为1μg/ml，100μl/孔加入酶标板，4℃过夜；(2)洗板：0.05％PBST(PBS+0.05％吐温-20)洗板4次，每次静置2min；(3)封闭：3％BSA(3％BSA+0.05％PBST)的封闭液，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育2h；(4)洗板：0.05％PBST洗板5次；(5)稀释血浆：用1％BSA+(1％BSA+0.05％PBST)将待测血浆样本进行2倍梯度稀释(28-215)，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；(6)洗板：0.05％PBST洗板5次；(7)二抗孵育：用1％BSA+(1％BSA+0.05％PBST)按1:10000的比例稀释酶标二抗，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；(8)洗板：0.05％PBST洗板5次；(9)显色：将显色液A和B按1:1混合后，100μl/孔加入酶标板，室温避光放置12-15min；(10)终止：50μl/孔终止液加入酶标板中；(11)读数：酶标仪在450nm处读数；(12)统计血浆抗体滴度：统计阴性对照组血浆读数的平均值和标准差(SD)，待测血浆读数大于对照组平均值+2乘SD的最大稀释倍数为该待测血浆的滴度。
3.15.2间接ELISA检测特异性抗原结合抗体
(1)包被抗原：将抗原HIV-1 gp120(bal)、HIV-1 gp140三聚体(YU2)、HIV-1 gp140三聚体(AE1)用PBS稀释至浓度为1μg/ml，100μl/孔加入酶标板，4℃过夜；
(2)封闭方法同上，2倍梯度稀释的抗体或细胞培养上清100μl/孔加入酶标板；
(3)其余方法同上血浆特异性表位结合能力分析。
3.16微量热泳动检测抗体亲和力
(1)gp140蛋白荧光标记：1.5ml离心管中加入90μl 10μM的待标记的蛋白(YU2-GP140、AE1-GP140)和300μM的RED-NHS二代染料，吹打混匀后，于室温避光孵育30min，在平衡好的B柱中加入100μl蛋白-染料混合反应液，将B柱放置于新的1.5ml离心管中，加入1000μl反应缓冲液，收集含有荧光蛋白标记的滤出液，并将浓度稀释为10nM；
(2)抗体的梯度稀释：将待测抗体从800nM的浓度开始，做2倍梯度稀释，总共进行16个梯度；
(3)将荧光标记的gp140蛋白以10nM的浓度，与梯度稀释的待测抗体按1:1的比例吹打混匀，总体系为20μl；
(4)将混匀好的样本通过虹吸作用吸入毛细管中，按照梯度稀释顺序放入样品槽中，将样品槽放入仪器中进行检测；
(5)打开MO.Control软件，选择RED PICO荧光通道，将LED power激发荧光调为20％-40％的medium，将荧光值控制在8000-12000之间；
(6)点击measurement进行检测，生成MST曲线，进行数据处理分析。
3.17HIV-1假病毒包被
(1)293T细胞用GM培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％双抗+12.5mM HEPES)复苏和传代培养，至少传代3次，细胞活率至少90％以上；
(2)在转染前4-6h在6孔细胞培养板中以2×106个/孔铺板子，37℃，5％CO2培养；
(3)将中提后Env蛋白表达质粒pCDNA3.1D用0.22μm的针式过滤器过滤菌；
(4)将0.36μg的Env蛋白表达质粒、1.1μg病毒骨架pSG3质粒、0.54μg的PIP2载体质粒总共2μg DNA用opti-MEM培养基稀释至总体积为100μl，将4μlReagent用opti-MEM培养基稀释至总体积为100μl，将上述两液体混合，吹打混匀后室温静置10min；
(5)将混合液绕圈逐滴滴加到铺有293T的6孔板中，37℃，5％CO2培养；
(6)培养48h后收集细胞培养上清，4000rpn离心10min后用0.45μm的针式过滤器过滤去除细胞碎片，-80℃冰箱保存。
3.18测定HIV-1假病毒TCID50
(1)TZM-bl细胞用GM培养基复苏和传代，至少传代3次，细胞活率大于90％；
(2)将GM培养基按100μl/孔加入到96孔透明底白边板中；
(3)在A行每孔中加入25μl假病毒原液，每种假病毒设置4个复孔作为对照，吹打混匀后取25μl加入B行，吹打混匀后取25μl加入C行，依次进行5倍梯度稀释，至G行混匀后弃25μl，H行作为细胞空白对照；
(4)TZM-bl细胞正常消化传代后，计数细胞，用新鲜GM培养基调整细胞密度为1.3×106个/ml，加入适量的DEAE dextran hydrochloride使其终浓度为20μg/ml；
(5)将稀释的TZM-bl细胞悬液混匀后，每孔100μl加入96孔板中，37℃，5％CO2培养48h；
(6)48h后弃培养液，200μl/孔的PBS清洗一次，加入20μl/孔的Lysis Solution，室温静置10min；
(7)reaction buffer和反应底物按50:1的比例稀释，100μl/孔加入到96孔板中，避光室温孵育1h，用酶标仪读取荧光值；
(8)组织半数感染量(median tissue culture infective dose，TCID50)计算：TCID50的计算采用Karber法，公式为：lgTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L：最高稀释度的对数，d：稀释度对数之差，s：阳性孔比率总和。荧光值高于细胞对照2.5倍的孔记为阳性孔。
3.19抗体中和实验
(1)TZM-bl细胞用GM培养基复苏和传代，至少传代3次，细胞活率大于90％；(2)在96孔细胞板中对待测抗体进行梯度稀释，每孔加入200μlGM培养基，调整待测抗体的初始浓度为100μg/ml，吹打混匀后取100μl转移到下一孔中，依次进行2倍梯度稀释，总共8个梯度，取100μl加入到96孔透明底白边板中；
(3)将解冻后的HIV-1假病毒用GM培养基稀释为2000TCID50/ml，取50μl(100TCID50)加入到96孔透明底白边板中；
(4)TZM-bl细胞正常消化传代后，计数细胞，用新鲜GM培养基调整细胞密度为1.3×106个/ml，加入适量的DEAE dextran hydrochloride使其终浓度为25μg/ml，取100μl加入到96孔透明底白边板中，37℃，5％CO2培养48h；
(5)用酶标仪读取荧光值后，采用Graphpad prism8.0计算抗体IC50值。
1HIV-1特异性单个记忆B细胞分选
本课题组前期的血浆中和实验已证明pt15号样本血浆中和活性和广谱度均较高。并且已成功从pt15号样本2014年采集的PBMC中分离和鉴定出具有一定结合活性和中和能力的HIV-1单克隆抗体。故选用pt15号样本2018年采集的PBMC细胞进行特异性HIV-1中和抗体分选。
本发明分选时首先采用CD20和CD27作为记忆B细胞表面特征分子划定出记忆B细胞群，再用YU2-gp140和AE1-gp140双抗原靶向分选特异性HIV-1记忆B细胞。如图1所示，首先根据前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的大小在PBMC中设门并圈出淋巴细胞群记为P1，然后在P1中根据antiCD20-PE和anti-CD27-FITC的大小设门圈出记忆B细胞记为P2，之后在P2中选择YU2 gp140-APC和AE1 gp140-prCP双阳性的记忆B细胞，分选到96孔PCR板中。共获得细胞大约180个。图1为本发明的特异性单个记忆B细胞流式分选图；图1A为本发明的淋巴细胞图；图1B为本发明的记忆B细胞图；图1C为本发明的CD20+CD27+YU2-gp140+AE1-gp140+细胞图。
2单个记忆B细胞基因扩增
2.1B细胞可变区基因扩增
分选获得的YU2-gp140和AE1-gp140阳性的特异性单个记忆B细胞通过逆转录和巢式PCR扩增得到抗体可变区基因。其中H链和λ链需要两轮巢式PCR，而κ链需要三轮巢式PCR。通过对PCR反应体系和条件的优化，H链可变区扩增阳性率约为90％，κ链可变区扩增阳性率约为63％，而λ链可变区扩增阳性率稍低约为37％。PCR产物大小经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定与预期相似，结果如图2所示。H链可变区大小约为380bp，κ链和λ链可变区大小约为310bp。
2.2κ链可变区基因扩增条件优化
κ链可变区基因扩增的阳性率较低，无法得到明确的目的条带。因此对PCR反应体系和条件进行的优化，首先更换PCR反应体系中的taq DNA聚合酶，采用HotStarTaq PlusDNA Polymeras替换PrimeSTAR Max Premix。其次在巢式PCR的每一轮均采用touch down的反应条件。调整反应体系和反应条件后，PCR产物大小经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图3所示。采用HotStarTaq Plus DNA Polymeras和touch down的方法可扩增得到特异性的目的片段，阳性率有所提高。图2为本发明单个记忆B细胞抗体可变区基因扩增图。图2A为本发明的重链可变区扩增结果；图2B为本发明的轻链κ链扩增结果图；图2C为本发明的轻链λ链扩增结果图。图3为本发明的三轮Touch-down巢式PCR扩增结果图。图3A为本发明的巢式PCR扩增κ链图；图3B为本发明的touch down巢式PCR扩增κ链图。
3单个记忆B细胞抗体可变区序列分析
将PCR扩增得到的轻、重链可变区基因片段进行胶回收和酶切纯化后，与酶切后的重链表达载体CMVR-H+C、κ链表达载体CMVR-L和λ链载体PcDNA3.1-L进行酶切连接或者同源重组连接。连接产物转化大肠杆菌感受态后挑取单克隆菌落送生物信息公司测序，结果返回后进行基因序列分析。图4为本发明的分选记忆B细胞重、轻链可变区基因序列分析图；图4A为本发明的重链可变区序列胚系基因种类图；图4B为本发明的轻链可变区序列胚系基因种类图；图4C为本发明的重链可变区序列突变率图；图4D为本发明的轻链可变区序列突变率图。
采用NCBI-IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)和Bioedit软件进行序列分析。如图4A所示，本发明共分选得到重链可变区基因序列123条，属于不同的4个胚系基因，分别为IGHV1-2、IGHV1-69、IGHV3-30和IGHV3-15。IGHV1-2在重链可变区胚系基因中所占比例最高为34.15％，其余3种胚系基因IGHV1-69、IGHV3-30和IGHV3-15所占比例分别为28.46％、21.95％、和15.45％。如图4B所示，分选得到轻链可变区基因序列共95条，其中64条为κ链的可变区基因序列，31条为λ链可变区基因序列。95条序列属于不同的4个胚系基因分别为IGLV3-19、IGLV1-44、IGKV1-5和IGKV3-11。IGKV1-5在轻链可变区胚系基因中所占比例最高为54％，其余3个胚系基因IGLV3-19、IGLV1-44和IGKV3-11所占比例分别为26.2％、6.32％和10.53％。如图4C所示，重链可变区基因序列与其胚系基因相比突变率在2.4％-32.4％之间，其中胚系基因为IGHV1-2的重链可变区突变率最高为32.4％，其次是IGHV3-15突变率为21.26％。而IGHV1-69和IGHV3-30突变率较低为2.4％和9.9％。轻链κ和λ的不同类型其突变率也不相同。如图4D所示，κ链胚系基因为IGKV1-5和IGKV3-11的可变区序列突变率较低为3.6％和5.2％，而λ链可变区序列突变率均高于κ链，IGLV3-19和IGLV1-44的突变率分别为15.2％和27.9％。
4分选抗体表达和纯化
4.1293T细胞小量表达
随后将同一个分选细胞来源的轻重链进行配对，并将构建的轻重链抗体表达质粒按照1:1的摩尔比共转染293T细胞。采用western blot的方法鉴定细胞裂解液和培养上清中抗体的表达情况。如图5所示，在55KD和25KD的位置可见明显条带，即为抗体的轻重链。但只有部分抗体可在上清中检测到表达，可用于后续的293F细胞表达并纯化。初步确认表达的抗体为2C5、2E8、3C10和3D9。
对表达抗体的基因序列进行分析，结果如表1所示。4个表达抗体的轻链均为κ链，轻链为λ链的抗体未表达分泌到上清。4个抗体重链的突变率均较低，均未超过10％。其中轻、重链突变率较高的为2E8。图5为本发明的293T细胞表达抗体WB检测结果图；图5A为本发明的细胞表达上清图；图5B为本发明的细胞裂解液图。
293T细胞表达抗体序列特征如表1所示：
表1
4.22E8抗体的大量表达纯化
挑选在293T细胞上清中确认分泌并且突变率较高的抗体2E8，在293F细胞中进行大量表达。收集细胞培养上清后用rProtein A琼脂糖凝胶亲和层析的方法纯化细胞上清中的IgG抗体。纯化的IgG抗体表达量为0.53mg/ml。如图6所示，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色鉴定纯化的IgG抗体蛋白，其纯度较好无明显杂带。图6SDS-PAGE电泳鉴定纯化IgG抗体图；
5抗体结合活性分析
5.1单克隆抗体结合活性分析
本课题组前期实验已从pt15号2014年随访采集的样本中成功分离和鉴定出具有一定结合能力和中和活性的单克隆抗体，本发明从中选取结合活性较好并具有一定中和能力的单克隆抗体7D5与本发明分选的抗体2E8进行基于时间的抗原结合能力纵向比较。
本发明通过间接ELISA的方法比较7D5和2E8与YU2-gp140和AE1-GP140的结合能力。如图8A和8B所示，7D5与YU2-GP140和AE1-GP140均有较强的结合能力，并且与AE1-GP140的结合能力强于YU2-GP140。2E8的结合能力与7D5相比较弱，且与7D5不同2E8与YU2-GP140结合能力强于AE1-GP140。
识别中和抗体的结合表位对于理解其活性十分重要，因此本发明对7D5和2E8的结合位点进行探究。采用间接ELISA的方法分析7D5和2E8与5个HIV-1表位(CD4bs，V1、V1、V3和MPER)的结合能力。2E8和7D5均与V2有较强的结合能力，而与其余4个表位结合能力较弱。图7为本发明的抗体结合活性分析图；图7A为本发明的与YU2-gp140的结合实验结果图；图7B为本发明的与AE1-gp140的结合实验结果图；图7C为本发明的7D5线性表位(多肽)结合实验结果图；图7D为本发明的2E8线性表位(多肽)结合实验结果图。
5.2血浆结合活性分析
为了探究7D5和2E8与V2较强的结合能力是否与分选样本血浆的结合能力存在一定的关联，本发明进一步分析分选样本血浆与5个HIV-1表位的结合能力。
首先本发明对队列中HIV-1感染者血浆的结合表位进行分析。根据本发明的纳入和排除标准，2007-2011年共有45名HIV-1感染者入组随访队列，其中长期不进展者(longterm non-progressors，LTNPs)17例，典型进展者(typical progressors，TPs)28例。对所有入组的45名HIV-1感染者血浆采用ELISA的方法分析其与5个表位的结合能力。所采用的的5个表位均为HIV-1广谱中和抗体的识别表位。结果如图7A所示，本队列中的LTNPs与TPs相比，其血浆中的抗体对V3肽段的结合能力显著高于TPs，而其余4个表位的结合无显著差别。
接下来对pt15号2018年采集的的血浆样本2倍梯度稀释，稀释倍数从28至215。进行梯度稀释后的血浆样本分别与5个线性表位进行ELISA实验，确认其与V3肽段和其余4个肽段的结合能力。结果如图7B所示，pt15号2018年采集的血浆样本与V3肽段和MPER的结合能力较强，其抗V3和MPER的血清效价较高。图8为本发明的HIV-1感染者血浆线性表位结合能力分析图；图8A为本发明的HIV-1感染者血浆与5个线性表位的结合能力结果图；图8B为本发明的pt15号样本血浆与5个线性表位的结合能力结果图。
6IgG抗体的IgM改造
综合对抗体结合能力分析的结果，无论7D5还是2E8其抗原结合能力均较弱。因此，进一步将7D5和2E8改造为IgM形式。以期通过IgM改造在提高亲和力的同时改善中和活性。
6.1重组人源IgM抗体质粒构建
如图9A所示，PCR扩增得到7D5和2E8抗体轻、重链的可变区。随后如图9B所示，PCR扩增除重链可变区外的IgM载体片段IgM-L。7D5和2E8的重链可变区与IgM-L连接正确后PCR扩增除轻链可变区外的IgM载体片段IgM-7D5-H和IgM-2E8-H，再将7D5和2E8的轻链可变区片段与其连接，得到完整的IgM表达质粒。如图9C所示，对构建的IgM表达质粒进行琼脂糖凝胶电泳，在9000bp左右有明显条带，表明IgM质粒大小正确。图9为本发明的IgM抗体表达质粒的构建图；图9A为本发明的IgM抗体轻、重链可变区扩增图；图9B为本发明的IgM表达载体PCR线性化图；图9C为本发明的IgM抗体表达质粒电泳结果图。
6.2重组人源IgM抗体的表达
6.2.1293T细胞小量表达IgM抗体
将构建好的IgM表达质粒转染293T细胞，收集细胞培养上清和细胞裂解液进行WB检测，验证IgM抗体是否能正常表达。如图10所示，在75KD和25KD可见明显条带，即为IgM抗体重、轻链。确认重组人HIV-1特异性IgM抗体可在293T细胞中表达并分泌。图10为本发明的WB验证重组人HIV-1特异性IgM抗体表达图。图10A为本发明的293T细胞培养上清图；图10B为本发明的293T细胞裂解液图。
6.2.2CHO-S细胞大量表达IgM抗体
将在293T细胞上清中确认表达的IgM抗体，在CHO-S细胞中进行无血清高密度表达。收集细胞培养上清后采用IgM focurose 6HP层析柱在纯化仪上对细胞上清中的IgM抗体进行纯化。如图11A所示，平衡液平衡纯化柱时可见电导明显升高，平衡至A280吸收峰和电导与基线基本平齐时上样。在上样过程中可见A280吸收峰明显的升高。所有样本均通过纯化柱后加入洗脱液，可见一明显的洗脱峰，洗脱峰面积约为320-380。
纯化IgM抗体的表达量为1.54-0.97mg/ml。如图11B和11C所示，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色和WB鉴定纯化的IgM抗体蛋白，其纯度较好无明显杂带。与IgG类抗体比较IgM抗体的重链分子量较大为75KD。图11为本发明的CHO-S细胞表达和纯化IgM抗体图；图11A为本发明的CHO-S细胞培养上清中的IgM抗体纯化图；图11B为本发明的纯化的IgM抗体SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色鉴定图；图11C为本发明的纯化的IgM抗体SDS-PAGE电泳后WB鉴定图。
7IgM抗体功能鉴定
7.1IgM抗体结合能力分析
抗体与抗原的特异性识别和结合能力是抗体的功能基础。本发明采用间接ELISA的方法比较同一抗体的IgG和IgM形式与YU2-gp140和AE1-gp140结合能力的差别。如图12所示，IgM-7D5和IgM-2E8与IgG形式相比与YU2-gp140和AE1-gp140的结合能力均有提升。但7D5因其本身的结合能力较强改造为IgM后，结合能力的提升与2E8相比较低。图12为本发明的同一抗体IgG和IgM结合能力比较图；图12A为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8与YU2-gp140的结合能力比较图；图12B为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8与AE1-GP140结合能力比较图。
7.2抗体亲和力检测
基于前期抗体与抗原的结合能力结果，本发明进一步采用微量热涌动(microscale thermophoresis，MST)的方法评价同一抗体的IgG和IgM形式与YU2-gp140和AE1-gp140亲和力的差别。MST的结果表示为解离常数(dissociation constant，Kd)，Kd值越小表示相应抗体的亲和力越大。如表2和图13所示，7D5和2E8进行IgM改造后其亲和力大小均有一定的提升。尤其是IgM-2E8，其与YU2-gp140和AE1-gp140的亲和力均有近10倍的提升，而IgM-7D5与YU2-gp140的亲和力仅仅有2倍的提升，而与AE1-gp140的亲和力却有一定程度的降低。抗体亲和力检测如表2所示：
表2
/>
图13为本发明的MST检测同一抗体IgG和IgM的亲和力大小图。图13A为本发明的7D5和YU2-GP140的亲和力大小图；图13B为本发明的IgM-7D5和YU2-GP140的亲和力大小图；图13C为本发明的2E8和YU2-GP140的亲和力大小图；图13D为本发明的IgM-2E8和YU2-GP140的亲和力大小图；图13E为本发明的7D5和AE1-GP140的亲和力大小图；图13F为本发明的IgM-7D5和AE1-GP140的亲和力大小图；图13G为本发明的2E8和AE1-GP140的亲和力大小图；图13H为本发明的IIgM-2E8和AE1-GP140的亲和力大小图。
7.3IgM抗体中和能力检测
在体外进行多种亚型HIV-1假病毒的中和实验是评价广谱中和抗体外抗病毒活性的重要标准。本发明采用global panel中398F1和246F3两种亚型的假病毒进行体外TZM-bl中和实验，对7D5和2E8抗体的中和能力进行评价。结果如表3所示，7D5和2E8抗体对A亚型和B的两种毒株均有一定的中和能力，IC50值为14-20μg/ml。但中和能力较弱，需要较高的抗体浓度才能对假病毒起到一定的中和作用。IgM-7D5和IgM-2E8的中和能力均有一定提升，IC50值有2倍左右的降低，但仍然大于8μg/ml。除此之外如图14所示，改造后的IgM-7D5和IgM-2E8对398F1和246F3的最大抑制率(％)均有所提高。抗体中和能力检测如表3所示：
表3
图14为本发明的抗体中和假病毒的最大抑制率(％)图；图14A为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8中和398F1假病毒的最大抑制率(％)图；图14B为本发明的7D5、IgM-7D5、2E8和IgM-2E8中和246F3假病毒的最大抑制率(％)图。
HIV-1感染的LTNPs由于病毒和宿主免疫等多种因素的影响，机体免疫功能在感染后较长时间内维持在正常水平，提示LTNPs可能成为HIV-1广谱中和抗体分选的重要样本。并且随着抗原特异性分选、逆转录和巢式PCR等技术在人源性单克隆抗体分离中的应用，已成功分离鉴定出上百种广谱中和抗体。但分选得到的广谱中和抗体仍然面临HIV-1病毒免疫逃逸和病毒储藏库难以清除等问题，并且至今无法通过有效疫苗诱导广谱中和抗体在体内产生。而在HIV-1急性感染早期的出现的特异性IgM抗体，由于其独特的多价抗原结合模式有望更有效地抑制病毒吸附和进入细胞。目前国内外研究尚未明确HIV-1特异性IgM抗体的功能特点，尚需大量研究探讨IgM型抗体在HIV-1感染中的作用，以及为HIV-1疫苗设计和免疫治疗提供理论依据。
广谱中和抗体只在少部分HIV-1感染者中产生，并且需要经历长期高水平的抗原刺激和复杂的B细胞亲和力成熟过程。因此，本发明采用血浆具有高中和活性LTNPs的PBMCs作为抗原特异性记忆B细胞流式分选的样本。分选所用的特异性抗原采用了可溶性Env三聚体，包括AE1-GP140和YU2-GP140。其与天然的Env构象相似，包括了抗体识别的大多数构象表位和线性表位。本发明采用了AE1和B亚型两种抗原双阳性的分选策略，以提高分选抗体的特异性和交叉反应能力。
本发明通过流式分选获得抗原双阳性的记忆B细胞，经过逆转录和巢式PCR后得到抗体轻、重链可变区的基因序列。在扩增κ链可变区时，无法扩增出明显的目的条带。因此，本发明对反应体系和条件进行了优化。首先引入Touch down的反应条件，在高于Tm值的退火温度下使引物与模板特异性结合，扩增出特异性较好目的片段但其得率较低。随着PCR循环数的增加退火温度也逐步降低至Tm值附近。而随着退火温度的降低，和前期扩增出的特异性片段作为模板，使最后的到的特异性目的片段产物量增加。其次将PrimeSTAR MaxPremix反应体系更换为HotStarTaq Plus DNA Polymeras反应体系。HotStarTaq Plus DNAPolymeras与PrimeSTAR Max Premix反应体系相比阳性率较高但其特异性相对较低，容易出现假阳性的情况。因此采用了touch down的反应条件。通过HotStarTaq Plus DNAPolymeras反应体系和touch down反应条件对巢式PCR的优化，κ链可变区的扩增阳性率的到了很大的提高，但与重链和λ链相比其阳性率依然相对较低。
HIV-1广谱中和抗体仅在少部分感染者中产生，部分原因为广谱中和抗体亲和力成熟的路径漫长且复杂，往往需要经历多轮亲和力成熟过程。产生广谱中和抗体的初始B细胞谱系，在HIV-1病毒免疫逃逸的持续刺激下反复经历体细胞超突变和亲和力成熟的过程。因此，目前大多数广谱中和抗体具有不同寻常的特征，如特殊的胚系基因、高频体细胞超突变、长的重链第三决定互补区等。部分HIV-1广谱中和抗体具有相同的特殊胚系基因，例如靶向CD4bs的VRC01抗体谱系，其重链胚系基因均为IGHV1-2*01，提示该谱系的广谱中和抗体可能来源于同一个初始B细胞谱系。本发明中得到的重链和轻链序列集中于少数几个胚系基因。高频体细胞超突变是HIV-1广谱中和抗体的基因特征之一，与其亲和力和中和活性密切相关。一般抗体的重链突变率为10％左右，而广谱中和抗体一般具有更高的突变率，如VRC01为为32％。本发明中的重链胚系基因突变率除IGHV3-30外，其余重链的突变率均接近或大于10％。
本发明中轻链的突变率与重链相比相对较小，其中κ链的突变率均小于10％。人类正常抗体的CDR H3区一般由16个氨基酸组成，而广谱中和抗体大多具有较长的CDR H3区，如PG9、PG16和PGT121的CDR H3区长度均超过了25个氨基酸。这种较长的CDR H3区能辅助广谱中和抗体插入Env表面的某些聚糖屏蔽，识别内部的隐蔽位点。除此之外，CDR H3区较长的抗体大多表现为较高的多反应性和自身反应性，而多反应性抗体可高亲和力结合gp140的同时，低亲和力结合HIV-1分子上另一个非gp140位点。通过这种异源二价结合来弥补HIV-1表面gp140分布稀疏导致的亲和力降低。本发明中未分选到CDR H3区超过25个氨基酸的序列，其中胚系基因为IGHV3-15*05的序列CDR H3区最长，但仅为22个氨基酸。表达CDRH3区较长的抗体的初始B细胞，在发育的过程中易被清除，是本发明未获得CDR H3区较长的序列的重要原因之一，也是无法通过HIV-1疫苗诱导广谱中和抗体产生的原因之一。
本发明在293T细胞系统中共有4个抗体能表达分泌，并且轻链均为κ链。λ链抗体配对后在293T细胞中不表达的原因可能为λ链表达载体的构建过程出现错配。其中2E8重链的胚系基因为IGHV1-69*06，在表达的4个抗体中SHM水平相对较高，为9.6％。因此本发明挑选了2E8进行后续的表达纯化和功能验证。经ELISA检测，2E8与HIV-1不同亚型的抗原均有一定的结合能力但较低，可能与重链SHM水平较低有关。较低的SHM水平无法满足抗体亲和力成熟所需的突变和亲和力的提升。
除了对分选抗体的序列特征进行分析外，本发明进一步探究其对GP140的三聚体和不同表位的结合能力。7D5为本课题组前期研究分选的HIV-1特异性中和抗体，与2E8来源于同一LTNPs在随访的不同时间点采集的PBMCs样本。首先，分析2E8和7D5与5个保守表位的结合能力。2E8和7D5均表现出与V2肽段的特异性结合能力。其次，进一步探究PT15号血浆样本与HIV-1的5个保守表位的结合能力，发现与V3肽段的结合能力较强。虽然分选抗体和血浆样本与保守表位的结合能力不一致，但在侧面验证了高血浆结合能力的样本可分选得到高结合活性的单克隆抗体。
与2E8相比，7D5的重链SHM水平较高，与VRC01具有相同的胚系基因VH1-2*01。本课题组前期研究显示7D5与HIV-1不同亚型的抗原具有较高的特异性结合能力，但中和活性和广谱度相对较低。因此，本发明将分选得到的抗体2E8和7D5进行IgM改造，以期提高其亲和力大小和中和活性。
由于IgM抗体特殊的5聚体大分子结构，其表达和纯化仍然面临着巨大的挑战。哺乳动物细胞可保留大部分表达蛋白的糖基化修饰和生物学特性，因此常作为IgM表达的宿主细胞。而CHO-S最常用于IgG抗体表达的哺乳动物细胞，并且在过去30年间得到极大的改进。本发明成功在CHO-S细胞中表达了人源重组IgM抗体，并经过后续鉴定具有一定的功能活性。与IgG不同，IgM不与重组protein A结合，因此无法用重组protein A亲和层析的方法纯化。本发明采用IgM focurose 6HP层析柱对IgM进行纯化，其基本原理为亲硫吸附色谱。通过该方法成功纯化得到了IgM-7D5和IgM-2E8抗体蛋白。但该方法的到的IgM抗体包含部分杂蛋白，并且得率不高。
从IgG到IgM的转换使2E8和7D5与抗原的相互作用均有不同程度的影响。与同一抗体的IgG形式相比，IgM-7D5和IgM-2E8显示出与HIV-1不同亚型抗原结合能力的增强，其IC50有大约2倍的增加。但本发明发现IgM抗原结合位点与IgG相比有5倍的增加，但结合能力并没有同样增加5倍。可能由于空间位阻，在ELISA反应体系中，每个IgM只有一个结合位点可与抗原反应。就摩尔浓度而言，在相同的摩尔浓度下，IgM的质量浓度为IgG的5倍。因此，为避免上述因素对亲和力检测的影响，本发明采用MST来检测抗体的亲和力。MST结果显示IgM-2E8对不同亚型的HIV-1抗原具有更高的亲和力，与IgG形式相比其亲和力提高了10倍左右。而IgM-7D5与YU2-gp140的亲和力仅有2倍的提升，而与AE1-gp140的亲和力不但没有改善甚至降低了5倍。由于7D5与YU2-gp140和AE1-gp140的亲和力本身较高且大于2E8，改造为IgM后其亲和力提升的程度相对较小。而IgM-7D5与AE1-gp140亲和力的降低可能是由于IgM抗体分子在抗原结合位点附近有较大的空间位阻，或者是蛋白质构象稳定性降低间接导致表观亲和力的降低。IgM分子通常构象稳定性较差，而且高水平的SHM在提高抗体亲和力的同时可使稳定性降低。7D5的SHM水平比2E8高，使7D5自身的构象稳定性较低，改造为IgM后构象稳定性降低带来的亲和力下降更为明显，是IgM-7D5与AE1-gp140亲和力降低的原因之一。除此之外，IgM-7D5亲和力提升不明显甚至降低的原因有可能是抗体制备和纯化过程中存在杂蛋白以及浓度定量不准导致的。
抗体中和活性的大小通常与高亲和力有关，IgM的5聚体结构非常适合抗体结合病毒表面的蛋白，在提高亲和力的同时也增强了抗病毒活性。目前已有IgG型广谱中和抗体改造为IgM的研究报道，包括2F5、4E10和2G12。2F5和4E10是靶向MPER的广谱中和抗体，改造为IgM后中和活性明显降低。而靶向gp120聚糖的2G12改造为IgM后中和活性却有近20倍的提升。导致改造后中和活性差异如此巨大的原因可能与靶向的表位不同有关。IgG抗体靶向的表位越易接近、越保守，提示改造后的IgM抗体中和活性提升的可能性更高。本发明中和实验表明从IgG到IgM的同型转换，对抑制病毒的感染具有重要意义。改造后的IgM-2E8和IgM-7D5对不同亚型的HIV-1假病毒均有一定的中和作用，其IC50值与IgG形式相比均有2倍左右的提升。并且对两种亚型的假病毒最大抑制率百分比也有明显的提升。IgM的聚合形式对其强大的中和活性至关重要。MST实验已证明五聚体形式的IgM-2E8和IgM-7D5比其单体形式的IgG具有更高的亲和力。因此由于空间位阻和高亲和力，中和活性的提升可能是由于更多的抗原结合位点为IgM提供了更多的机会识别病毒从而阻止病毒与细胞接触和吸附，甚至更有效地抑制病毒感染。本次改造的IgM-2E8和IgM-7D5的中和活性虽然有提升但与其他已报道的HIV-1广谱中和抗体相比其在体外的抗病毒活性依然较弱。但不应低估其在体内抗HIV-1感染的作用。IgM抗体通过激活补体系统以裂解病毒和感染细胞方面具有强大的潜力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体，其特征在于：包括
(a)重链恒定区，所述IgM重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(b)轻链恒定区，所述IgM轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(c)重链可变区，所述IgM-7D5重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述IgM-2E8重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(d)轻链可变区，所述IgM-7D5轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述IgM-2E8轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
2.制备权利要求1所述的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体的方法。
3.权利要求1的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体的搭载小分子、毒素或核素的方法。
4.一种核酸分子，包括编码权利要求1或2中所述的HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其IgM重链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，IgM轻链恒定区的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
IgM-7D5重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，IgM-2E8重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
IgM-7D5轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，IgM-2E8轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
6.权利要求1在制备HIV-1被动免疫预防疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：诱导保护性IgM抗体为目标的疫苗中的应用。
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