CN104066446A - 流感病毒疫苗及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中HA2域中的一或多个氨基酸已突变。亦提供编码这些多肽的核酸，包含这些多肽和/或核酸分子的组合物，以及其使用方法，尤其在检测、预防和/或治疗流感方面。
Description
前言
本发明是关于医药领域。本文提供流感血球凝集素主干域多肽，提供血球凝集素主干域多肽的方法，包含其的组合物，包含其的疫苗，及其使用方法，尤其在检测、预防和/或治疗流感方面。
背景
流感病毒为主要的人类病原体，其引起呼吸道疾病(通常称为“流感”或“流行性感冒”)，严重度可在无症状性感染(sub-clinical infection)至可引起死亡的原发性病毒性肺炎范围内。感染的临床作用随流感病毒株的毒性及宿主的暴露量、病史、年龄及免疫状态而变化。据估计在世界范围内每年约有10亿人经历流感病毒的感染，在3至5百万个病例中引起严重疾病，及引起估计300,000至500,000起流感相关死亡。大部分此等感染可归因于携带H1或H3血球凝集素亚型的A型流感病毒，小部分归因于B型流感病毒，且因此所有三者的代表株均包括于季节性疫苗中。当前免疫实践依赖于早期鉴别传播性流感病毒以允许及时制造有效的季节性流感疫苗。除在预测将在下一个季节期间占主导地位的病毒株方面存在固有的困难以外，抗病毒耐药性及免疫逃避亦在当前疫苗无法预防发病及死亡中起一定作用。除此以外，大流行病的可能性对全球健康造成重大及现实的威胁，该大流行病由来源于动物储存宿主的高毒性病毒株引起且经过再分类以增强人与人之间传播。
A型流感病毒在自然界中分布广泛且可感染多种禽类及哺乳动物。流感病毒为包膜RNA病毒，其属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)家族。其基因组由8个单链RNA区段组成，这些单链RNA区段编码以下11种不同的蛋白质：一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1及PB2)、两种基质蛋白(M1及M2)、三种非结构蛋白(NS1、NS2及PB1-F2)及两种外部糖蛋白：血球凝集素(HA)及神经胺酸酶(NA)。基于HA及NA蛋白的抗原结构的差异对病毒进行分类，且其不同组合表示独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为特定流感病毒株。尽管所有已知亚型均可见于禽类中，但目前传播的人类A型流感亚型为H1N1及H3N2。系统发生分析已展示血球凝集素再分成两个主要类群：尤其系统发生第1类群中的H1、H2、H5及H9亚型，及尤其系统发生第2类群中的H3、H4及H7亚型。
B型流感病毒株严格针对人类。B型流感病毒株内HA的抗原变异少于在A型病毒株内观察到的抗原变异。B型流感病毒的两种遗传上及抗原上不同的谱系在人类中传播，如由B/Yamagata/16/88(亦称为B/Yamagata)及B/Victoria/2/87(B/Victoria)谱系所表示(Ferguson等人，2003)。尽管由B型流感病毒引起的疾病谱与由A型流感病毒引起的疾病谱相比一般较温和，但在B型流感感染的情况下仍频繁地观察到需要住院治疗的严重疾病。
已知中和流感病毒的抗体主要是针对血球凝集素(HA)。血球凝集素或HA为三聚糖蛋白，其锚定至病毒外壳且具有双重功能：其负责结合至细胞表面受体唾液酸，及在吸收之后，其介导病毒与内体膜的融合，引起病毒RNA在细胞的胞溶质中的释放。HA包含较大头部域及较小主干域。对病毒膜的附着是由与主干域连接的C端锚定序列所介导。蛋白以指定环形式翻译后裂解，得到两种多肽HA1及HA2(完整序列称为HA0)。膜远程头部区主要来源于HA1，且膜近端干区主要来自HA2(图1)。
季节性流感疫苗必须每年更新的原因在于病毒的变异性较大。在血球凝集素分子中，此变异尤其表现于头部域中，其中抗原漂移(drift)及转移(shift)已产生大量不同的变异体。由于此头部域亦为免疫显性区，故大多数中和抗体是针对此域且藉由干扰受体结合来起作用。头部域的免疫显性与较大变异的组合亦解释经特定病毒株感染不引起对其他病毒株的免疫性的原因：由首次感染诱生的抗体仅识别与初次感染的病毒密切相关的有限数目的病毒株。
近来，已经描述了缺乏全部或实质上全部流感血球凝集素球状头部域的流感血球凝集素主干域多肽，且其用于对主干域多肽的一或多个保守抗原决定基产生免疫反应。相信主干域多肽的抗原决定基与球状头部域的高度免疫原性区相比免疫原性较低，因此，主干域多肽中不存在球状头部域可能允许针对主干域多肽的一或多个抗原决定基产生免疫反应(Steel等人，2010)。因此，Steel等人已藉由以下方式建立一种新的分子：使A/波多黎各(PuertoRico)/8/1934(H1N1)及A/香港(Hong Kong)/1968(H3N2)病毒株的HA1的氨基酸残基53至276自HA一级序列中缺失，且用较短柔性连接序列GGGG置换此缺失。用H3HK68构建体对小鼠进行疫苗接种不会诱生可与第1类群HA交叉反应的抗血清。此外，如以下实例中所示，这些主干域多肽高度不稳定且未采取正确构象，如由展示结合至干区中的保守抗原决定基的抗体不发生结合所证实。
此外，Bommakanti等人(2010)描述一种基于HA2的多肽，其包含HA2的氨基酸残基1至172、7氨基酸连接子(GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基7至46、6氨基酸连接子GSAGSA，后接HA1的残基290至321，其中在HA1中有突变V297T、I300E、Y302T及C305T。该设计是基于H3HA的序列(A/香港(Hong Kong)/1968)。该多肽仅针对H3亚型内另一流感病毒株(A/Phil/2/82)而非针对H1亚型(A/PR/8/34)提供交叉保护。
因此，仍存在对安全及有效的通用疫苗的需求，该通用疫苗刺激产生稳固的广泛中和抗体反应，且针对一组广泛的当前及未来流感病毒株(季节性及大流行性)提供保护，尤其针对系统发生第1类群和/或第2类群内的一或多种A型流感病毒亚型提供保护，以用于有效预防及治疗流感。
概述
本文提供流感血球凝集素主干域多肽，提供主干域多肽的方法，包含其的组合物，包含其的疫苗及其使用方法。
在第一方面中，本发明提供新颖免疫原性多肽，其包含流感血球凝集素主干域且缺乏球状头部，称为流感血球凝集素(HA)主干域多肽。多肽能够在投与个体(尤其为人类个体)时诱导免疫反应。本发明的多肽在膜远程头部域中存在的显性抗原决定基不存在的情况下，向免疫系统呈现膜近端主干域HA分子的保守抗原决定基。为此，移除构成头部域的HA0蛋白的一级序列的一部分，且将剩余氨基酸序列直接再连接或在一些实施例中藉由引入较短柔性连接序列(‘连接子’)而再连接，以恢复氨基酸链的连续性。所得序列藉由引入特定突变来进一步修饰，这些特定突变使HA0分子的剩余部分的天然3维结构稳定。免疫原性多肽不包含流感病毒的全长HA1和/或HA2。
流感血球凝集素主干域多肽是基于一般用于人类流感疫苗制造的流感病毒株的HA。具体而言，多肽是基于H1、H5和/或H3亚型的A型流感病毒的HA。
在某些实施例中，本发明提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段的HA1N端主干区段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中该血球凝集素主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解，且其中连接HA2的A螺旋与螺旋CD的氨基酸序列中的一或多个氨基酸与野生型流感HA2域相比已突变。HA1及HA2域优选地来源于选自由H1、H5及H3亚型组成的组的A型流感病毒。
如图1中所指示，本发明的多肽在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序列中包含一或多个突变。在某些实施例中，该HA2氨基酸序列中的一或多个疏水性氨基酸已由亲水性氨基酸(诸如极性和/或带电荷的氨基酸)或柔性氨基酸甘氨酸(G)取代。
在某些实施例中，HA1N端主干区段包含HA1的氨基酸1至x，且HA1C端主干区段包含HA1的氨基酸y至末端(亦即HA1的C端氨基酸)。因此，在某些实施例中，HA1区段中的缺失包含位置x+1处的氨基酸至并且包括位置y-1处的氨基酸的氨基酸序列。在某些实施例中，多肽不包含信号序列。因此，在某些实施例中，HA1N端区段包含HA1的氨基酸p至x，其中p为成熟HA分子的第一个氨基酸(例如在SEQ ID NO:1的情况下，p＝18)。普通技术人员将能在无信号肽(例如SEQ ID NO:1的氨基酸1至17)的情况下制备本文中所述的多肽。在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，本发明的多肽不包含HA的细胞内序列及跨膜域。在某些实施例中，已移除细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域的C端的氨基酸序列。
本发明的多肽不包含全长HA1。
在某些实施例中，多肽经糖基化。
在某些实施例中，免疫原性多肽实质上小于HA0，优选地缺乏HA的全部或实质上全部球状头部。免疫原性多肽长度优选地不大于360个、优选地不大于350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275或270个氨基酸。在某些实施例中，免疫原性多肽长度为约250至约350个、优选地约260至约340个、优选地约270至约330个、优选地约270至约330个氨基酸。
在某些实施例中，与HA1及HA2域所基于的HA的氨基酸序列相比，多肽在HA1和/或HA2域中另外包含一或多个其他突变。
本发明亦提供用于提供流感血球凝集素干多肽的方法，该方法包含以下一般步骤：
(a)提供流感HA0氨基酸序列；
(b)移除HA1与HA2之间的裂解位点；
(c)自HA0序列中移除球状头部域的氨基酸序列，尤其自位置x+1开始至y-1的氨基酸序列；
(d)在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列中引入一或多个突变；及
(e)在HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
可藉由这些方法获得的多肽亦为本发明的一部分。
在某些实施例中，多肽包含第1类群交叉中和抗体CR6261(如WO2008/028946中所揭示)和/或抗体CR9114(如下文及共同待决申请EP11173953.8中所述；一种能够结合及中和第1类群及第2类群A型流感病毒以及B型流感病毒的抗体)的保守主干域抗原决定基。因此，本发明的另一方面提供HA主干域多肽，其中这些多肽结合至抗体CR6261和/或抗体CR9114。在一实施例中，多肽不结合至CR8057(描述于WO 2010/130636中；一种仅结合至H3流感病毒的单克隆抗体)。在某些实施例中，多肽结合至抗体CR8020、CR8043和/或CR9114。本文提供的流感血球凝集素主干域多肽适用于免疫原性组合物(例如疫苗)，该免疫原性组合物能够针对复数种A型和/或B型流感病毒株产生免疫反应。在一实施例中，流感血球凝集素主干域多肽能够针对系统发生第1类群和/或第2类群的A型流感病毒株、尤其针对系统发生第1类群及第2类群两者的流感病毒株产生免疫反应。在一实施例中，多肽能够针对同源流感病毒株产生免疫反应。在一实施例中，多肽能够针对属于相同和/或不同亚型的异源流感病毒株产生免疫反应。在另一实施例中，多肽能够对系统发生第1类群及第2类群两者的流感病毒株及B型流感病毒株产生免疫反应。
本发明的多肽可用于例如独立治疗和/或预防和/或诊断由流感病毒、尤其系统发生第1类群或第2类群A型流感病毒和/或B型流感病毒引起的疾病或病状，或与其他预防性和/或治疗性治疗(诸如(现有或未来的)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体)组合。
在另一方面中，本发明提供编码流感HA主干域多肽的核酸分子。在另一方面中，本发明提供包含编码免疫原性多肽的核酸的载体。
在另一方面中，本发明提供在个体中诱导免疫反应的方法，该方法包含向个体投与本发明的多肽和/或核酸分子。
在另一方面中，本发明提供免疫原性组合物，其包含本发明的多肽和/或核酸分子。本文提供的免疫原性组合物可呈允许组合物投与个体(例如小鼠、雪貂或人类)的任何形式。在一特定实施例中，免疫原性组合物适于人类投与。多肽、核酸分子及组合物可用于预防和/或治疗流感病毒疾病的方法和/或用于诊断目的。组合物可另外包含医药学上可接受的载剂或赋形剂。在某些实施例中，本文中所述的组合物包含佐剂或与佐剂组合投与。
在另一方面中，本发明提供多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其用作疫苗。本发明尤其是关于免疫原性多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其在预防和/或治疗由系统发生第1类群和/或第2类群的A型流感病毒亚型和/或B型流感病毒引起的疾病或病状中用作疫苗。
由以下本发明的详细描述，将清楚本发明的多肽的各种实施例及用途。
附图简要说明
图1展示如存在于天然三聚体中的呈融合前状态的HA单体的模型。HA1以浅灰色展示，HA2以深灰色展示。如同连接此等二级结构组件的环一般，指示螺旋A(CR6261的抗原决定基的重要部分)及螺旋CD(三聚体界面的一部分)。
图2：如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及本发明的HA主干域多肽的结合。A：染色后阳性的细胞百分比。B：平均荧光强度。H1-全长(SEQID NO:1)、微型HA-cl1(SEQ ID NO:3)、微型HA-cl1+2(SEQ ID NO:4)、微型HA-cl1+3(SEQ ID NO:5)、微型HA-cl1+4(SEQ ID NO:6)、微型HA-cl1+2+3(SEQ ID NO:7)、微型HA-cl1+2+3+4(SEQ ID NO:8)。
图3：如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。A：染色后阳性的细胞百分比。B：平均荧光强度。H1-全长(SEQ IDNO:1)、微型HA(SEQ ID NO:2)、微型HA-cl1(SEQ ID NO:3)。
图4：血清抗体对HEK293F表达的全长HA及本发明的多肽的结合。A：平均荧光强度。B：染色后阳性的细胞百分比。H1-FL(SEQ ID NO:1)、CL1(SEQ ID NO:3)、CL1+2(SEQ ID NO:4)及CL1+4(SEQ ID NO:6)。cM2为阴性对照。
图5：如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。上图染色后阳性的细胞百分比。下图：平均荧光强度。H1-全长(SEQ IDNO:1)、微型HA-cl1(SEQ ID NO:3)、H1-微型1-cl11(SEQ ID NO:9)、H1-微型2-cl11(SEQ ID NO:10)、H1-微型3-cl11(SEQ ID NO:11)、H1-微型4-cl11(SEQ ID NO:12)、H1-微型1-cl11+5(SEQ ID NO:13)、H1-微型2-cl11+5(SEQ ID NO:14)、H1微型3-cl11+5(SEQ ID NO:15)及H1-微型4-cl11+5(SEQ ID NO:16)。
图6：在经编码HA A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)、微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)、微型2-聚簇11(SEQ ID NO:10)、微型1-聚簇11+5(SEQ ID NO:13)、微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)及cM2(共同M2序列)的DNA肌肉内免疫或编码HA A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQID NO:1)、微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)及cM2(共同M2序列)的DNA的基因枪免疫之后，血清抗体对来自A/布里斯班(Brisbane)59/2007的全长HA的胞外域的结合。图A：首次免疫后28天。图B：免疫49天后。
图7：如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。上图染色后阳性的细胞百分比。下图：平均荧光强度。H1-全长(SEQ IDNO:1)、微型HA(SEQ ID NO:2)、H1-微型2-cl11+5(SEQ ID NO:14)、H1-微型2-cl1+5(SEQ ID NO:48)、H1-微型2-cl1+5+6(SEQ ID NO:46)、H1-微型2-cl11+5+6(SEQ ID NO:47)、H1-微型2-cl1+5+6-三聚体(SEQ ID NO:44)、H1-微型2-cl1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)。
图8：如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。A：染色后阳性的细胞百分比。B：平均荧光强度。
图9：如由FACS分析的单克隆抗体对全长HA及HA主干域多肽的结合。A：染色后阳性的细胞百分比。B：平均荧光强度。
图10：基于香港(Hong Kong)/1/1968的构建体在细胞表面上的表达。
图11：本发明的若干多肽的纯化的SDS-PAGE(A至D)及蛋白质印迹(E至F)分析。在蛋白质印迹中，将针对his标记的抗体用于检测。
图12：如由Elisa检测的单克隆抗体CR9114(A)、CR8020(B)及多克隆抗H1 HA血清(C)对本发明的若干多肽的结合。
图13：本发明的多肽的糖基化的SDS-PAGE(A)及蛋白质印迹(B)分析。在去糖基化之后，扩散条带集中在预期分子量下。在蛋白质印迹中，将针对H1 HA的多克隆血清用于检测。
图14：本发明的多肽的SEC-MALS分析。迹线以SEQ ID NO标记。
图15：A：表达SEQ ID NO:145的细胞的上清液的蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹中，将针对his标记的抗体用于检测。B：如由Elisa检测的单克隆抗体CR9114(正方形)、CR6261(圆圈)、CR8020(向上三角形)及FI6v3(向下三角形)对SEQ ID NO:145的结合。
图16：来自培养物上清液的SEQ ID NO:145在His截留管柱上的纯化的洗脱概况。本发明的多肽分别在100mM(A峰)及200mM(B峰)咪唑下洗脱。
图17：A至B：SEQ ID NO:145藉由尺寸排阻层析(Superdex200)纯化的洗脱概况。A峰及B峰均含有本发明的多肽。C：来自尺寸排阻层析的部分的非变性PAGE分析。大部分经纯化的蛋白在与该蛋白的单体形式一致的分子量下运作。D：来自尺寸排阻层析的部分的SDS PAGE分析。
图18：作为本申请中所述的DNA免疫方案结果的对同源全长蛋白胞外域的IgG反应的时程。
图19：针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(A)及异源病毒株H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009(B)的全长血球凝集素的胞外域，对个别小鼠进行首次免疫后第7周时的IgG反应。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
图20：针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(A)、异源病毒株H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009(B)、异源亚型病毒株H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004(C)及异源亚型病毒株H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968(D)的全长血球凝集素的胞外域，对个别小鼠进行首次免疫后第7周时的IgG反应。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
图21：基于H3 HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光强度(A)及阳性细胞％(B)。
图22：针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(图A)、异源病毒株H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009(图B)及异源亚型病毒株H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004(图C)的全长血球凝集素，对个别小鼠进行首次免疫后第7周时的IgG反应。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
图23：单抗CR6261、CR9114、CR8020及CR9020以及多克隆抗H1血清对全长HA及本发明的相应多肽的FACS分析。上图平均荧光强度。实心条表示全长蛋白，条纹条表示本发明的多肽。全长HA及来源于该序列的本发明的相应多肽具有相同的背景色。
图24：实例21中所述的流感攻击实验的卡本-麦尔(Kaplan-Meier)存活曲线(A)、体重变化(B)及临床分数中值(C)。
图25：根据实例22选择的H1N1序列的比对。
图26：根据实例22选择的基于H1 HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光强度。
图27：如由生物层干涉术测定，呈三聚体及单体形式的全长H1 HA(SEQ ID NO 149)及s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)对经固定的单克隆抗体CR6261(A)、CR9114(B)及CR8020(C)的结合的动力学。
图28：稳态滴定s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)对经固定的CR6261(A)及CR9114(B)的结合，继而进行生物层干涉术。
图29：如由ELISA测定，在第49天时针对来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA的胞外域的IgG反应。实验详情描述于实例24中。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
图30：实例24中描述的流感攻击实验的卡本-麦尔存活曲线(A)、体重变化(B)及临床分数中值(C)。
图31：根据实例25选择的基于H1 HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光强度。
图32：如由来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(A)、A/香港(Hong Kong)/1/1968(B)及A/Perth/16/2009(C)的HA测定，49天后针对HA的胞外域的IgG反应。实验详情描述于实例26中。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
图33：如由ELISA测定，在49天后针对来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA的胞外域的IgG反应。实验详情描述于实例27中。空心符号对应于在分析检测限以下的值。
图34：根据实例28选择的基于H1 HA的主干域多肽的FACS分析。展示平均荧光强度。
定义
下文给出如本发明中所用的术语的定义。
本发明的氨基酸可为20种天然产生的氨基酸(或‘标准’氨基酸)中的任一者或其变异体(诸如D-脯氨酸(脯氨酸的D-对映异构体))、或并非天然可见于蛋白质中的任何变异体(诸如正亮氨酸)。标准氨基酸可基于其性质划分为数个组。重要因素为电荷、亲水性或疏水性、尺寸及官能基。此等性质对于蛋白质结构及蛋白质间相互作用很重要。一些氨基酸具有特殊性质，诸如半胱氨酸，其可对其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥键)；脯氨酸，其对多肽主链形成环；及甘氨酸，其与其他氨基酸相比柔性较大。表5展示标准氨基酸的缩写及性质。
术语“氨基酸序列一致性”是指一对经比对的氨基酸序列之间的一致性或相似性程度，通常以百分比形式表示。一致性百分比为在比对序列及引入空隙(如有必要)以获得最大序列同源性百分比之后，候选序列中与肽中相应氨基酸残基一致(亦即，在比对中在给定位置处的氨基酸残基为相同残基)或相似(亦即，如下文论述，在比对中在给定位置处的氨基酸取代为保守性取代)的氨基酸残基的百分比。序列同源性(包括序列一致性及相似性百分比)使用此项技术中熟知的序列比对技术(诸如藉由目视检查及数学计算)来测定，或更优选地，比较藉由使用计算机程序比较序列信息来进行。一种例示性优选的计算机程序为Genetics Computer Group(GCG；Madison,Wis.)威斯康辛州(Wisconsin)套装10.0版程序‘GAP’(Devereux等人(1984))。
“保守性取代”是指一个类别的氨基酸经相同类别的另一氨基酸置换。在特定实施例中，保守性取代不改变多肽的结构或功能或结构及功能两者。出于保守性取代的目的，氨基酸的类别包括疏水性(例如Met、Ala、Val、Leu)、中性亲水性(例如Cys、Ser、Thr)、酸性(例如Asp、Glu)、碱性(例如Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏者(例如Gly、Pro)及芳族(例如Trp、Tyr、Phe)。
如本文所用，术语“疾病”及“病症”可互换使用以指代个体中的病状。在一些实施例中，病状为病毒性感染，尤其为流感病毒感染。在特定实施例中，术语“疾病”是指由细胞或个体中存在病毒引起、或藉由病毒对细胞或个体的侵袭引起的病理状态。在某些实施例中，病状为个体中的疾病，其严重度藉由经由投与免疫原性组合物在个体中诱导免疫反应来降低。
如本文所用，术语“有效量”在向个体投与疗法的情形下是指具有预防性和/或治疗性作用的疗法的量。在某些实施例中，“有效量”在向个体投与疗法的情形下是指足以获得以下效果的疗法的量：降低或改善流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的严重度，诸如(但不限于)减少流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的持续时间；预防流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的发展；预防流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的发生或发作或复发；预防或减少流感病毒由一个个体传播至另一个体；减少个体的住院治疗和/或住院治疗持续时间；提高患有流感病毒感染或与其相关的疾病的个体的存活率；消除流感病毒感染或与其相关的疾病；抑制或减少流感病毒复制；降低流感病毒效价；和/或增强和/或改良另一疗法的预防性或治疗性作用。在某些实施例中，有效量不引起全面保护免于流感病毒疾病，但与未经治疗的个体相比引起流感病毒效价降低或数目减少。流感病毒的效价、数目或总负载降低的益处包括(但不限于)感染的症状严重度较低、感染的症状较少及与感染有关的疾病的持续时间减少。
如本文所用的术语“宿主”意欲指代已引入载体(诸如克隆载体或表达载体)的生物体或细胞。生物体或细胞可为原核或真核的。宿主优选地包含经分离的宿主细胞，例如培养中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅意味经修饰以用于本发明的多肽的(过度)表达的细胞。应理解术语宿主意欲不仅指代特定个体生物体或细胞，而且指代该生物体或细胞的子代。由于某些修饰可能因突变或环境影响而发生于继代中，故该子代可能实际上并非与亲本生物体或细胞一致，但仍包括于如本文中所用的术语“宿主”的范围内。
如本文所用的术语“包括(included或including)”视为后接措词“(但不限于)”。
如本文所用，术语“感染”意谓藉由病毒在细胞或个体中倍增和/或存在而侵袭。在一个实施例中，感染为“活性”感染，亦即，病毒在细胞或个体中复制的感染。该感染特征在于病毒自经病毒最初感染的细胞、组织和/或器官传播至其他细胞、组织和/或器官中。感染亦可为潜伏性感染，亦即，病毒不复制的感染。在某些实施例中，感染是指由细胞或个体中存在病毒引起、或藉由病毒对细胞或个体的侵袭引起的病理状态。
流感病毒分类成流感病毒类型：A属、B属及C属。如本文所用的术语“流感病毒亚型”是指A型流感病毒变异体，其特征在于血球凝集素(H)及神经胺酸酶(N)病毒表面蛋白质的组合。根据本发明，流感病毒亚型可利用其H号数称为诸如“包含H3亚型的HA的流感病毒”、“H3亚型的流感病毒”或“H3流感”，或利用H号数与N号数的组合称为诸如“流感病毒亚型H3N2”或“H3N2”。术语“亚型”特定言之包括各亚型内的所有个别“病毒株”，这些病毒株通常由突变产生且展示不同病原性概况，包括天然分离株以及人造突变株或重配株及其类似物。这些病毒株亦可称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，如本文所用，术语“病毒株”及“分离株”可互换使用。人类流感病毒株或分离株的现行命名法包括病毒类型(属)(亦即A、B或C)、首次分离的地理位置、病毒株号数及分离年份，通常在括号中给出HA及NA的抗原描述，例如A/Moscow/10/00(H3N2)。非人类病毒株亦在命名中包括起源宿主。A型流感病毒亚型可另外藉由参考其系统发生类群分类。系统发生分析已展示血球凝集素再分成两个主要类群：尤其系统发生第1类群(“第1类群”流感病毒)中的H1、H2、H5、H9亚型，及尤其系统发生第2类群(“第2类群”流感病毒)中的H3、H4、H7及H10亚型。
如本文所用，术语“流感病毒疾病”是指由细胞或个体中存在流感病毒(例如A型或B型流感病毒)或者流感病毒侵袭细胞或个体而产生的病理状态。在特定实施例中，术语是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。
如本文所用，术语“核酸”意欲包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)及RNA分子(例如mRNA)及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可为单链或双链的。如普通技术人员将轻易地了解，核酸分子可以化学方式或以生物化学方式修饰，或可含有非天然或经衍生的核苷酸碱基。这些修饰包括例如：标记；甲基化；用类似物取代一或多个天然产生的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如不带电荷的键联(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；侧接部分(例如多肽)；嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)；螯合剂；烷基化剂；及经修饰的键联(例如α变旋异构核酸等)。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖其互补链以及其互补序列。互补链亦适用于例如反义疗法、杂交探针及PCR引子。
如本文所用，在某些实施例中，HA中氨基酸的编号是基于野生型流感病毒的HA0中氨基酸的编号，例如H1N1流感病毒株A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)的氨基酸的编号。因此，如本发明中所用，措词“HA中位置“x”处的氨基酸”意谓对应于特定野生型流感病毒(例如A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1；其中HA2域的氨基酸已以斜体形式指示))的HA0中位置x处的氨基酸的氨基酸。普通技术人员将理解在其他流感病毒株和/或亚型中的等效氨基酸可藉由多重序列比对来测定(参见例如表8)。应注意，在贯穿本申请所用的编号系统中，1是指不成熟HA0蛋白(SEQ ID NO:1)的N端氨基酸。成熟序列起始于例如SEQ ID NO:1的位置18。在某些实施例中，等效氨基酸的编号是基于H3 HA0中氨基酸的编号，尤其基于H3N2流感病毒株A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ IDNO:89)的氨基酸的编号。其他H3 HA序列中的等效氨基酸可藉由比对来测定。普通技术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列(或信号序列；例如对应于SEQ ID NO:89的氨基酸1至17)一般不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包含不具有前导序列的氨基酸序列，亦即氨基酸序列是基于不具有信号序列的HA0的氨基酸序列。
如普通技术人员已知，“多肽”是指利用酰胺键键联的氨基酸的聚合物。如本文所用，该术语可指代利用共价酰胺键键联的单条多肽链。该术语亦可指代利用非共价相互作用(诸如离子接触、氢键、凡得瓦尔力(Van derWaals)接触及疏水性接触)缔合的多条多肽链。普通技术人员将认识到该术语包括例如藉由翻译后处理而经修饰的多肽，该翻译后处理诸如为信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如N连接型糖基化)、蛋白酶裂解及脂质修饰(例如S-棕榈酰化)。
“主干域多肽”是指多肽，其包含构成天然产生的(或野生型)血球凝集素(HA)的主干域的一或多条多肽链。主干域多肽通常为单条多肽链(亦即对应于血球凝集素HA0多肽的主干域)或两条多肽链(亦即对应于与血球凝集素HA2多肽缔合的血球凝集素HA1多肽的主干域)。根据本发明，与野生型HA分子相比，主干域多肽包含一或多个突变，特定言之野生型HA的一或多个氨基酸残基可能经其他氨基酸取代，这些其他氨基酸并非天然产生于特定野生型HA中的相应位置上。如下文所述，本发明的主干域多肽可另外包含一或多个连接序列。
术语“载体”表示核酸分子，其中可插入第二核酸分子以用于引入其将复制且在一些情况下表达的宿主中。换言之，载体能够转运其已连接的核酸分子。如本文所用，术语“载体”涵盖克隆载体以及表达载体。载体包括(但不限于)质体、黏质体、细菌人工染色体(BAC)及酵母人工染色体(YAC)及来源于噬菌体或植物或动物(包括人类)病毒的载体。载体包含由所提出的宿主识别的复制起点，且在表达载体的情况下，包含由宿主识别的启动子及其他调节区。某些载体能够在引入其的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起点的载体可在细菌中复制)。其他载体一旦引入宿主中后即可整合于宿主的基因组中，且藉此与宿主基因组一起复制。
如本文所用，术语“野生型”在病毒的情形下是指流行、自然传播且产生典型疾病爆发的流感病毒。
详细描述
流感病毒对全球公众健康具有重大影响，每年引起数百万例严重疾病、数以千计的死亡及可观的经济损失。当前三价流感疫苗对疫苗病毒株及密切相关的分离株诱发强力中和抗体反应，但极少扩展至亚型内分歧较大的病毒株或其他亚型。此外，选择适当疫苗病毒株存在许多挑战且经常引起欠佳的保护。另外，预测下一次大流行病毒的亚型(包括其将出现的时间及地点)在当前是不可能的。
血球凝集素(HA)为来自A型流感病毒的主要包膜糖蛋白，其为中和抗体的主要标靶。血球凝集素在进入过程期间具有两个主要功能。第一，血球凝集素经由与唾液酸受体相互作用来介导病毒对靶细胞表面的附着。第二，在病毒内吞之后，血球凝集素随后触发病毒与内体膜的融合以将其基因组释放至靶细胞的细胞质中。HA包含具有约500个氨基酸的较大胞外域，该胞外域由宿主来源的酶裂解，产生仍然利用二硫键键联的2条多肽。大部分N端片段(HA1，320至330个氨基酸)形成膜远程球状域，该膜远程球状域含有由病毒中和抗体识别的受体结合位点及大多数决定基。较小C端部分(HA2，约180个氨基酸)形成干样结构，该干样结构使球状域锚定至细胞或病毒膜。HA1多肽中亚型之间的序列同源性程度(亚型之间34％至59％同源性)与HA2多肽中(51％至80％同源性)相比较小。最保守的区域为裂解位点周围的序列，尤其为HA2 N端23个氨基酸，其在所有A型流感病毒亚型中均为保守的(Lorieau等人，2010)。此区域的一部分以HA前驱体分子(HA0)中的表面环形式暴露，但在HA0裂解成HA1及HA2时变得不可及。
大多数中和抗体结合至围绕受体结合位点的环且干扰受体结合及附着。由于此等环高度易变，故大多数靶向此等区的抗体为病毒株特异性的，解释当前疫苗诱发如此有限的病毒株特异性免疫的原因。然而，近来产生具有广泛交叉中和效能的针对流感病毒血球凝集素的完全人类单克隆抗体。功能及结构分析已揭示此等抗体干扰膜融合过程且针对流感HA蛋白的主干域中的高度保守抗原决定基(Throsby等人，2008；Ekiert等人2009；WO2008/028946；WO 2010/130636)。
根据本发明，已设计含有此等抗原决定基的新颖HA主干域多肽，以便建立基于通用抗原决定基的疫苗，该疫苗针对广泛范围流感病毒株诱发保护。基本上，首先自全长HA分子中移除高度易变且免疫显性的部分(亦即头部域)，产生主干域多肽(亦称为微型HA)。以此方式，免疫反应将对定位有针对广泛中和抗体的抗原决定基的主干域重定向。上述广泛中和抗体用于探查新建分子的正确折叠，并用于证实存在中和抗原决定基。
本发明的主干域多肽能够在膜远程头部域中存在的显性抗原决定基不存在的情况下，向免疫系统呈现膜近端主干域HA分子的保守抗原决定基。为此，移除构成头部域的HA0蛋白的一级序列的一部分，且直接再连接或在一些实施例中藉由引入较短柔性连接序列(‘连接子’)来再连接，以恢复多肽链的连续性。所得多肽序列藉由引入特定突变来进一步修饰，这些突变使HA0分子的剩余部分的天然3维结构稳定。
因此，本发明提供多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段的HA1N端主干区段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中HA2域中的一或多个氨基酸已突变。因此，在本发明的多肽中，HA2域与HA主干域多肽所基于的野生型流感血球凝集素的HA2域相比包含一或多个突变。
流感血球凝集素主干域多肽是基于一般用于人类流感病毒疫苗的A型流感病毒亚型的HA。在优选地实施例中，主干域多肽是基于包含H1、H5和/或H3亚型的HA的流感病毒的HA。
本发明特定言之提供流感血球凝集素主干域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中血球凝集素主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解，且其中连接HA2的A螺旋与螺旋CD的氨基酸序列中的一或多个氨基酸与野生型流感HA2域相比已突变。HA1及HA2域优选地来源于选自由H1、H5及H3组成的组的A型流感病毒亚型。
因此，如图1中所指示，本发明的多肽在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序列中包含一或多个突变。在某些实施例中，该HA2氨基酸序列中的一或多个疏水性氨基酸已由亲水性氨基酸(诸如极性和/或带电荷的氨基酸)或柔性氨基酸甘氨酸(G)取代。
本发明的多肽不包含全长HA1。
在某些实施例中，免疫原性多肽实质上小于HA0，优选地缺乏HA的全部或实质上全部球状头部。免疫原性多肽长度优选地不大于360个、优选地不大于350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275或270个氨基酸。在某些实施例中，免疫原性多肽长度为约250至约350个、优选地约260至约340个、优选地约270至约330个、优选地约270至约330个氨基酸。
在某些实施例中，与获得HA1及HA2域的HA的氨基酸序列相比，多肽在HA1和/或HA2域中另外包含一或多个其他突变。由此，进一步增强干多肽的稳定性。
根据本发明，“HA1 N端区段”是指对应于流感血球凝集素(HA)分子的HA1域的氨基端部分的多肽区段。在某些实施例中，HA1 N端多肽区段包含HA1域的位置1至位置x的氨基酸，其中位置x上的氨基酸为HA1内的氨基酸残基。术语“HA1 C端区段”是指对应于流感血球凝集素HA1域的羧基端部分的多肽区段。在某些实施例中，HA1 C端多肽区段包含HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中位置y上的氨基酸为HA1内的氨基酸残基。根据本发明，y大于x，因此，HA1 N端区段与HA1 C端区段之间(亦即HA1的位置x上的氨基酸与位置y上的氨基酸之间)的HA1域的区段已缺失，且在一些实施例中，经连接序列置换。
在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸1至x，且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸y至末端。因此，在某些实施例中，HA1区段中的缺失包含位置x+1处的氨基酸至且包括位置y-1处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，多肽不包含信号序列。因此，在某些实施例中，HA1N端区段包含HA1的氨基酸p至x，其中p为成熟HA分子的第一个氨基酸(例如在SEQ ID NO:1的情况下，p＝18)。普通技术人员将能在无信号肽(例如SEQID NO:1的氨基酸1至17)的情况下制备本文中所述的多肽。在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，本发明的多肽不包含HA的细胞内序列及跨膜域。在某些实施例中，已移除细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域的C端的氨基酸序列。
根据本发明，血球凝集素主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解。普通技术人员已知跨越HA1及HA2的Arg(R)-Gly(G)序列为胰蛋白酶及胰蛋白酶样蛋白酶的识别位点且通常裂解以达成血球凝集素活化。由于本文中所述的HA主干域多肽不应活化，故本发明的流感血球凝集素主干域多肽耐蛋白酶裂解。因此，根据本发明，移除蛋白酶裂解位点，或使跨越HA1及HA2的蛋白酶位点突变成耐蛋白酶裂解的序列。
在某些实施例中，HA1 C端主干区段的C端氨基酸残基为除精氨酸(R)或赖氨酸(K)以外的任何氨基酸。在某些实施例中，HA1 C端氨基酸为谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在某些实施例中，HA1 C端主干区段的C端氨基酸残基为谷氨酰胺(Q)。
在某些实施例中，多肽经糖基化。
流感血球凝集素主干域多肽可基于任何天然产生的A型流感血球凝集素病毒的HA，该A型流感血球凝集素病毒属于用于人类流感疫苗的亚型。一般用于流感疫苗的A型流感病毒亚型为H1、H3或H5亚型的A型流感病毒。“基于”意谓HA1域和/或HA2域的N端区段和/或C端区段与H1、H3和/或H5亚型的任何天然产生的流感血球凝集素的HA1和/或HA2域的相应N端和/或C端区段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性，该H1、H3和/或H5亚型为普通技术人员已知或后来发现的。在某些实施例中，流感血球凝集素主干域多肽是基于第1类群A型流感病毒的流感血球凝集素。在某些实施例中，流感血球凝集素主干域多肽是基于第2类群A型流感病毒的流感血球凝集素。在一些实施例中，流感血球凝集素主干域多肽为杂交或嵌合多肽，其包含以下或由以下组成：来自复数种流感病毒株或亚型的区段和/或域。举例而言，流感血球凝集素主干域多肽可包含来自不同A型流感病毒HA亚型的HA1 N端及HA1 C端主干区段和/或HA2域。
在某些实施例中，多肽是基于H1 HA。如下文所述，在一特定实施例中，多肽包含来自以下或基于以下的血球凝集素主干域：包含H1亚型的HA的A型流感病毒的HA，诸如来自流感病毒A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO:1)。普通技术人员将理解，亦可根据本发明使用包含H1亚型的HA的其他A型流感病毒。在某些实施例中，多肽包含基于选自表7的A型H1流感病毒的HA的血球凝集素主干域。
在某些实施例中，多肽包含HA1 N端多肽区段，该HA1 N端多肽区段包含H1 HA1域的位置1至位置x的氨基酸，其中x为位置46上的氨基酸与位置60上的氨基酸之间的任何氨基酸，诸如为位置47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59上的氨基酸，优选地其中x为52、53、55或59。多肽优选地包含不具有信号序列的HA1 N端区段，亦即包含HA1域的位置18(例如对于H1 HA而言，诸如SEQ ID NO:1；或其他H1流感病毒株中的等效位置)至位置x的氨基酸的HA1 N端区段。因此，在某些实施例中，HA1 N端区段包含HA1域的位置p(其中对于H1HA而言，在SEQ ID NO:1中，p＝18；或其他H1 HA上的等效位置)至位置x的氨基酸。
在某些实施例中，HA1 C端多肽区段包含H1 HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中y为H1 HA1的位置290上的氨基酸与位置325上的氨基酸之间的任何氨基酸，优选地其中y为291、303、318或321。根据本发明，HA2域在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序列中包含一或多个突变(图1)。在某些实施例中，该HA2氨基酸序列中的一或多个疏水性氨基酸已由亲水性氨基酸(诸如极性和/或带电荷的氨基酸)取代。在某些实施例中(例如对于H1 HA而言，诸如SEQ ID NO:1)，连接螺旋A的C端残基与螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序列包含流感HA2的残基402至418之间的氨基酸序列。在某些实施例中，连接螺旋A的C端残基与螺旋CD的N端残基的HA2氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQID NO:17)。
在某些实施例中，x为59且y为291。
在某些实施例中，x为52且y为321。
在某些实施例中，x为53且y为303。
在某些实施例中，x为55且y为318。
在一实施例中，使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列对应于：SEQ ID NO:1的HA2的位置402上的氨基酸与位置418上的氨基酸之间的氨基酸序列，其中多肽在跨越SEQ ID NO:1的氨基酸402至418的氨基酸序列中包含一或多个突变。血清型H1的流感HA的残基402至418之间的氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO:17)。在某些实施例中，血清型H1的流感HA的残基402至418之间的氨基酸序列包含氨基酸序列MNTQX1TAX2GKEX3N(H/K)X4E(K/R)。
因此，在某些实施例中，如表6中所指示，多肽在H1 HA2域中包含一或多个突变。在某些实施例中，位置406、409、413及416上的氨基酸中的一或多者(亦即氨基酸X1、X2、X3及X4中的一或多者)已突变(编号参考SEQ IDNO:1)。在某些实施例中，位置406上的氨基酸(亦即X1)已转变成选自由以下组成的组的氨基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E及G，优选地为S。在某些实施例中，位置409上的氨基酸(亦即X2)已转变成选自由以下组成的组的氨基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E及G，优选地为T、Q或G。在某些实施例中，位置413上的氨基酸(亦即X3)已转变成选自由以下组成的组的氨基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E、G，优选地为S。在某些实施例中，位置416上的氨基酸(亦即X4)已转变成选自由以下组成的组的氨基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E、G，优选地为S。亦可能为此等突变的组合。
在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至59，且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基291至343，其中位置343上的氨基酸(亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，HA1 N端区段由HA1的氨基酸残基1至59组成，且HA1 C端区段由HA1的氨基酸残基291至343组成。应注意氨基酸的编号是基于H1 HA0中氨基酸的编号，特定言之是基于H1N1流感病毒株A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)的氨基酸的编号。应注意由于不同流感亚型/病毒株的HA序列与彼此相比可能在头部区中具有插入或缺失，故编号未必总是相同。普通技术人员将能藉由序列比对来测定不同流感病毒株和/或亚型的HA序列中的等效氨基酸位置。
在某些实施例中，HA1 N端多肽区段不包含信号序列。在优选地实施例中，HA1 N端区段包含HA1域的位置18至位置59的氨基酸。在某些实施例中，HA1 N端区段由HA1域的氨基酸18至59组成。
在一些实施例中，本发明的多肽在HA1域和/或HA2域中包含一或多个其他突变(亦即氨基酸取代)。因此，在某些实施例中，HA1域另外包含以下突变中的一或多者：L58T、V314T及I316T。再次应注意氨基酸的编号是基于H1HA0中氨基酸的编号，特定言之是基于H1N1流感病毒株A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)的氨基酸的编号。普通技术人员将能测定其他H1流感病毒的HA中的等效氨基酸，且因此将能测定等效突变。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突变中的一或多者：F406S、V409T及L416S。
在某些实施例中，HA1域另外包含突变K321C且/或HA2域另外包含以下突变中的一或多者：Q405C、F413C、E421C及Y502S。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含突变：Q405C、F406S、V409T及L416S。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突变：F406S、V409T、F413C、L416S及E421C。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突变：F406S、V409T、L416S及Y502S。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含突变：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S及E421C。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含突变：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S、E421C及Y502S。
在其他实施例中，HA2域另外包含突变M420I及V421I中的一或多者或等效突变。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突变中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。
在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至52，优选地为HA1的氨基酸残基18至52，且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基321至343，其中位置343上的氨基酸(亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺(Q)，其中HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。在某些实施例中，HA1 N端主干区段由HA1的氨基酸残基1至52、优选地HA1的氨基酸残基18至52组成，且HA1 C端主干区段由HA1的氨基酸残基321至343组成。
在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至53，优选地为HA1的氨基酸残基18至53，且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基303至343，其中位置343上的氨基酸(亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，HA1 N端主干区段由HA1的氨基酸残基1至53、优选地HA1的氨基酸残基18至53组成，且HA1 C端主干区段由HA1的氨基酸残基303至343组成。在一特定实施例中，HA1域包含突变V314T及I316T，且HA2域包含以下突变中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。在一优选的实施例中，多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在某些实施例中，HA1 N端主干区段包含HA1的氨基酸残基1至55，优选地为HA1的氨基酸残基18至55，且HA1 C端主干区段包含HA1的氨基酸残基318至343，其中位置343上的氨基酸(亦即R343)已突变且为除R以外的氨基酸，优选地为谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，HA1 N端主干区段由HA1的氨基酸残基1至55、优选地HA1的氨基酸残基18至55组成，且HA1 C端主干区段由HA1的氨基酸残基318至343组成。在一实施例中，HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。
在某些实施例中，多肽另外包含以下突变：HA1域中的R324C及HA2域中的T436C。
在一特定实施例中，HA1域包含突变L58T、V314T、I316T及R324C，且HA2域包含以下突变中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在一实施例中，HA1域包含突变R324C，且HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在另一实施例中，HA1域包含突变V314T、I316T及R324C，且HA2域包含以下突变中的一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在一实施例中，HA1域包含突变R324C，且HA2域包含突变F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，已移除细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。在某些实施例中，藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:143)(‘折叠子’序列)，任选地经由连接子连接，使多肽进一步稳定。连接子任选地可含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记(HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。
在某些实施例中，已移除HA2域的位置530(或等效位置)至HA2域的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。在某些实施例中，细胞内及跨膜序列已由氨基酸序列AGRHHHHHHH(SEQ ID NO:81)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO:82)置换。
在某些实施例中，多肽选择性结合至抗体CR6261和/或CR9114。在一实施例中，多肽不结合至抗体CR8057。在一实施例中，CR6261包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；CR9114包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一实施例中，CR8057包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
如上所述，多肽包含流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段。连接序列不以天然产生的(或野生型)HA形式出现。在某些实施例中，连接子为包含以下的肽：1个氨基酸残基、2个或2个以下氨基酸残基、3个或3个以下氨基酸残基、4个或4个以下氨基酸残基、5个或5个以下氨基酸残基、10个或10个以下氨基酸残基、15个或15个以下氨基酸残基、或20个或20个以下氨基酸残基、或30个或30个以下氨基酸残基、或40个或40个以下氨基酸残基、或50个或50个以下氨基酸残基。在一特定实施例中，连接序列为选自由以下组成的组的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG及GSGSGSG。
本发明亦提供用于提供本发明的多肽、特定言之提供本发明的H1 HA主干域多肽的方法，以及利用此等方法可获得或获得的多肽。在某些实施例中，该方法包含以下步骤：
(a)提供流感HA0氨基酸序列，特定言之血清型H1的流感HA0氨基酸序列；
(b)移除HA1与HA2之间的裂解位点，优选地藉由使HA1的C端氨基酸突变成除精氨酸(R)或赖氨酸(K)以外的氨基酸；
(c)自HA0序列中移除球状头部域的氨基酸序列；此举藉由以下方式进行：使位置x上的氨基酸与位置y上的氨基酸之间的HA1域的区段缺失，且任选地经由具有0至50个氨基酸的连接序列将由此获得的HA1的N端区段(跨越HA1的位置1上的氨基酸至并且包括位置x上的氨基酸)与C端区段(跨越HA1的氨基酸y至C端氨基酸)再连接。在某些实施例中，x为位置46与60之间的任何位置上的氨基酸，优选地为HA1的位置52、53、55或59上的氨基酸，且其中y为位置290与325之间的任何位置上的氨基酸，优选地为HA1的位置291、303、318或321上的氨基酸。再次，所用编号参考SEQ ID NO:1。普通技术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列(或信号序列；例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至17)一般将不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包含不具有前导序列的HA1 N端区段。
(d)使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定，优选地藉由在以下中引入一或多个突变：使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列、优选地为跨越SEQ ID NO:1的氨基酸402至418的氨基酸序列(尤其包含MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列)。突变优选地包含将疏水性氨基酸残基取代成亲水性氨基酸残基。
(e)在HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
根据本发明，移除HA1与HA2之间的裂解位点可藉由在P1位置处使R(在少数情况下为K)突变成Q来达成(参见例如Sun等人，2010对于裂解位点(SEQ ID NO:1中的位置343)的命名的解释)。优选地突变成Q，但S、T、N、D或E为替代方案。
移除头部域可例如藉由使来自SEQ ID NO:1的氨基酸53至320、或来自其他流感病毒的HA中的等效位置处的氨基酸缺失来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置(x)(等效位置)处、例如在位置54、55、56、57或58处开始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52处切割以增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置(y)、诸如315、316、317、318或319(等效位置)处，或在位置321、322、323、324或325(等效位置)处以增加缺失长度。重要的是认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较长连接子匹配且反之亦然。本发明亦涵盖此等多肽。
根据本发明，增强A螺旋与CD螺旋之间的环的溶解度。此环由H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)中的残基402至418(等效残基)形成。因此，使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定。如可在以下表6中看出，此环在H1序列中高度保守。此举可例如藉由用亲水性对应物置换该环中的氨基酸I、L、F或V来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。突变成甘氨酸使融合后构象不稳定，因为此氨基酸的高度柔性引起欲利用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的稳定性降低。描述血清型H1的流感HA的残基402至418之间的环的共同序列为(SEQ ID NO:17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本发明的多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比对测定)处的氨基酸为极性(S、T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)或柔性(G)氨基酸。亦可能为此等位点处的突变的组合，例如F406S、V409T、L416S。在一些情况下，优选地为恢复共同氨基酸的突变，例如其中V或M在位置404处(突变成T)，V在408(突变成A)或410(突变成G)处，或I在414处(突变成N)；具有此等特定氨基酸的序列的发生率极低。表征本发明的多肽的上述突变的概述在表6中给出。
根据本发明，将一或多个二硫桥键引入主干域多肽中，优选地在H1A/布里斯班(Brisbane)/59/2007中的位置324与436(或等效位置)的氨基酸之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。根据本发明，可在位置418至433(等效位置)处将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列(例如IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO:83))引入本发明的多肽中。在某些实施例中，在位置419至433(等效位置)处引入来源于GCN4且亦已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:84)。在某些实施例中，藉由将M420、L423、V427、G430修饰成异亮氨酸来使三聚体界面稳定。
在某些实施例中，本发明的多肽含有H1 HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，已移除细胞内及跨膜序列，例如HA2域的位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，以在表达于细胞中之后产生可溶性多肽。在某些实施例中，藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:80)，任选地经由连接子连接，使多肽进一步稳定。连接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记(HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。在某些实施例中，细胞内及跨膜序列已由氨基酸序列AGRHHHHHHH(SEQ ID NO:97)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO:82)置换。
申请人先前已鉴别由来自经接种疫苗的个体的原代人类B细胞分离的广泛中和抗体，其中一些对第1类群具有特异性(例如CR6261，如WO2008/028946中所述)，且其中一些对第2类群流感病毒具有特异性(例如CR8020，如WO 2010/130636中所述)。此等单克隆抗体的抗原决定基的详细分析已揭露此等特异性抗体缺乏交叉反应性的原因。在两种情况下，聚糖存在于第1类群或第2类群HA分子中的不同位置上至少部分解释抗体具有类群特异性的事实。如下文所述，在鉴别与许多第1类群及第2类群HA分子交叉反应的CR9114样抗体的情况下，已清楚人类免疫系统有可能针对流感病毒诱生极广泛中和抗体。然而，鉴于对每年疫苗接种流程的需求，在经(季节性)H1和/或H3亚型的流感病毒感染或疫苗接种之后显然不诱生或仅在极低程度上诱生此等抗体。因此，在某些实施例中，本发明提供以构象正确方式呈现HA的干区的多肽，以便在不存在免疫显性可变区的情况下向免疫系统呈现诱生广泛中和抗体的抗原决定基。由于已知聚糖模式在H1与H3 HA之间不同，且此差异可引起较多类群限制性抗体反应，故在不同实施例中，本发明的多肽是基于第2类群HA分子(例如H3的HA)。如以下实例3中所示，与H3亚型相比，CR9114对H1亚型的活体外中和能力较高。因此，猜测与H3HA分子(其可归因于HA1中N38上为许多第2类群HA亚型所共有的聚糖)相比，CR9114的抗原决定基对H1较可及。在不希望受此理论束缚下，可推断若本发明的多肽是基于H1，则所得抗体很可能受第2类群HA分子上N38上的聚糖阻碍，且因此对第2类群流感病毒的活性稍低。因此，为了能够诱生以良好活性对第1类群及第2类群两者流感病毒起作用的广泛中和抗体，在某些实施例中，本发明的主干域多肽是基于H3 HA亚型。
人类经常受包含H1或H3亚型的HA的季节性流感病毒感染。显然尽管暴露于此等流感病毒，但在自然情况下通常不产生广泛中和抗体。除HA中存在易变头部区以外，此现象的原因之一可能为暴露于与先前所见亚型密切相关的新亚型不知何故使反应较不广泛。因此，优选地可使个体暴露于较无关的亚型序列。因此，在另一实施例中，本发明的主干域多肽是基于第2类群亚型的HA，该第2类群亚型在HA1中的位置38上含有天冬酰胺(N)(N38)且不为H3亚型。
在某些实施例中，多肽是基于A型流感病毒亚型。在某些实施例中，多肽不基于H7 HA。
如上所述，本发明的多肽不仅经设计基于来自第1类群的流感疫苗病毒亚型(诸如H1及H5)的亲本HA序列，而且亦可基于来自第2类群的流感亚型的HA序列，尤其用于流感疫苗的第2类群的流感病毒亚型(诸如H3)。根据本发明，多肽经构建保守CR8020及CR8043的抗原决定基，因为此等抗体能够中和多种第2类群病毒株(WO 2010/130636)。在此等多肽中，干区底部处的β片及其周围应尽可能的保守，因为此β片为CR8020及CR8043结合至H3 HA的区域。
在某些实施例中，HA域属于H3亚型，优选地属于A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ ID NO:89)或A/香港(Hong Kong)/1/1968(SEQ ID NO:121)。普通技术人员将理解，亦可根据本发明使用包含H3亚型的HA的其他A型流感病毒。
在某些实施例中，多肽包含HA1 N端多肽区段或由HA1 N端多肽区段组成，该HA1 N端多肽区段包含H3 HA1域的位置1至位置x的氨基酸，优选地包含HA1域的位置p至位置x的氨基酸，其中x为H3 HA1的位置56与69之间的任何氨基酸，诸如为57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68，优选地其中x为61、62、63或68。在某些实施例中，HA1C端多肽区段包含H3HA1域的位置y至且包括C端氨基酸的氨基酸，其中y为H3 HA1的位置292与325之间(且包括位置292及325)的任何氨基酸，优选地其中y为293、306、318或323。
在某些实施例中，HA域属于H3亚型，优选地属于A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ ID NO:89)或A/香港(Hong Kong)/1/1968(SEQ ID NO:121)。
根据本发明，头部域已藉由以下方式移除：使HA1序列的较大部分缺失，且经由较短连接子使N端及C端序列再连接。缺失长度可变化，但优选地HA1的N端序列的最后一个残基与C端序列的第一个残基在空间上紧靠在一起以避免经由连接序列引入病毒株。在H3序列中，可在S62至P322、S63至P305及T64至T317(等效位置)处引入缺失。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置63、64、65、66、67(等效位置)处开始来减少缺失中的残基数目，或藉由在位置57、58、59、60或61处切割来增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置317、318、319、320或321(等效位置)处，或在位置323、324、325、326或327(等效位置)处以增加缺失长度。重要的是认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较长连接子匹配且反之亦然。此等多肽亦包括于本发明中。
在某些实施例中，x为61且y为323。
在某些实施例中，x为62且y为306。
在某些实施例中，x为63且y为318。
在某些实施例中，x为位置62、63、64、65、66或位置56、57、58、59或60(等效位置)。
在某些实施例中，y为位置306、318、319、320、321或322(等效位置)，或位置324、325、326、327或328(等效位置)。
在一实施例中，使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列对应于：SEQ ID NO:89的HA2的位置400上的氨基酸与位置420上的氨基酸之间的氨基酸序列，或其他H3病毒株中等效位置上的氨基酸残基，其中多肽在以下中包含一或多个突变：使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列，亦即跨越SEQ ID NO:89的氨基酸400至420的氨基酸序列，或其他H3流感病毒株中的等效氨基酸残基。
在某些实施例中，使血清型H3的流感HA的螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。
根据本发明，多肽在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列中包含一或多个突变。在某些实施例中，多肽包含表8的一或多个突变、或H3亚型的其他流感病毒株中的等效突变。
根据本发明，已移除HA1与HA2之间的裂解位点。在某些实施例中，位置345(编号参考SEQ ID NO:89)处的裂解位点移除已突变(R345Q)，以防止自HA0形成HA1及HA2。任选地可再缺失残基347至351(IFGAI，融合肽的一部分)，以使疏水性残基对水性溶剂的暴露降至最低。裂解处的正电荷在H3中100％保守，且此突变可因此应用于所有序列中。
头部域的缺失留下现暴露于水性溶剂的残基400至420之间的B环。在H3HA中，此环高度保守(参见表9)。共同序列为：401I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421(SEQ ID NO:104；编号参考SEQ IDNO:89)。为了增加此环的溶解度以用于呈融合前构象的本发明的多肽且使融合后构象不稳定，一些疏水性残基必需修饰成极性(S、T、N、Q)、带电荷的氨基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突变成G来增加柔性。特定言之，在位置401、408、411、415、418(编号参考SEQ ID NO:89)处的突变将有助于本发明的多肽的稳定性。
为了使本发明的多肽的融合前构象稳定，在于一级序列中远离但在折叠的融合前构象中接近的两个部分之间引入共价键。为此，二硫桥键可在本发明的多肽中经工程化，优选地在H3A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ ID NO:89)中的位置326与438(等效位置)之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。藉由使此等残基突变成半胱氨酸，可在H3 A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ ID NO:89)中的位置334与393(等效位置)之间建立替代性半胱氨酸桥连基。在一些情况下，将位置321(等效位置)处的半胱氨酸修饰成甘氨酸以避免形成不当二硫桥键。
在某些实施例中，多肽包含以下突变中的一或多者：F408S、I411T、F415S、V418G、I401R、K326C、S438C、T334C、I393C、C321G。
天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。在位置421至441(等效位置)处引入用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK。为了避免妨碍在位置326与438之间形成二硫桥键，亦使用在位置421至435(等效位置)处的替代性较短序列IEAIEKKIEAIEKKI。一种替代方案为在位置421至441处引入来源于GCN4且已知三聚的序列RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN或在位置421至435处引入较短序列RMKQIEDKIEEIESK。
本发明的多肽可含有HA的细胞内序列及跨膜域，以便所得多肽在表达于细胞中时呈现于细胞表面上。在其他实施例中，移除位置522至C端(等效位置)的细胞质序列及跨膜序列，以便在表达于细胞中之后产生分泌型(可溶性)多肽。一些其他残基任选地可藉由自523、524、525、526、527、528或529(等效位置)缺失序列而包括于可溶性蛋白质中。藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:143)(‘折叠子’序列)，任选地经由连接子连接，可使可溶性多肽进一步稳定。连接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记(HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。
根据本发明，HA2域的位置530(编号根据SEQ ID NO:1)至C端氨基酸的氨基酸序列可经移除并置换为以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ IDNO:81)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO:82)。
在某些实施例中，HA1 N端主干区段不包含信号序列。普通技术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列(或信号序列；例如对应于SEQID NO:89的氨基酸1至17)一般将不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包含不具有前导序列的氨基酸序列。
根据本发明，多肽不基于B型流感的HA分子。B型流感病毒株严格地针对人类。B型流感病毒株内HA的抗原变异少于在A型病毒株内观察到的抗原变异。B型流感病毒的两种遗传上及抗原上不同的谱系在人类中传播，如由B/Yamagata/16/88(亦称为B/Yamagata)及B/Victoria/2/87(B/Victoria)谱系所表示(Ferguson等人，2003)。尽管由B型流感病毒引起的疾病谱与由A型流感病毒引起的疾病谱相比一般较温和，但在B型流感感染的情况下仍频繁地观察到需要住院治疗的严重疾病。
根据本发明，提供模拟CR6261及CR9114的特异性抗原决定基的多肽，且其可用作免疫原性多肽以例如在单独或与其他预防性和/或治疗性治疗组合活体内投与时诱生交叉中和抗体。在“交叉中和抗体”的情况下，抗体意谓能够中和：系统发生第1类群的A型流感病毒的至少两种、优选地至少三种、四种或五种不同亚型；和/或系统发生第2类群的A型流感病毒的至少两种、优选地至少三种、四种或五种不同亚型；和/或B型流感病毒的至少两种不同亚型，尤其由CR6261及CR9114中和的至少所有病毒株。
本发明的多肽不包含全长HA1。在某些实施例中，免疫原性多肽实质上小于HA0，优选地缺乏HA的全部或实质上全部球状头部。免疫原性多肽长度优选地不大于360个、优选地不大于350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275或270个氨基酸。在一实施例中，免疫原性多肽长度为约250至约350个、优选地约260至约340个、优选地约270至约330个、优选地约270至约330个氨基酸。
在某些实施例中，多肽选择性结合至抗体CR6261和/或CR9114。在一实施例中，多肽不结合至抗体CR8057。在一实施例中，CR6261包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；CR9114包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一实施例中，CR8057包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
如上所述，多肽包含流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1 C端主干区段的HA1 N端主干区段。连接序列不以天然产生的(或野生型)HA形式出现。在某些实施例中，连接子为包含以下的肽：1个氨基酸残基、2个或2个以下氨基酸残基、3个或3个以下氨基酸残基、4个或4个以下氨基酸残基、5个或5个以下氨基酸残基、10个或10个以下氨基酸残基、15个或15个以下氨基酸残基、或20个或20个以下氨基酸残基、或30个或30个以下氨基酸残基、或40个或40个以下氨基酸残基、或50个或50个以下氨基酸残基。在一特定实施例中，连接序列为选自由以下组成的组的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG及GSGSGSG。
本发明亦提供用于提供本发明的多肽、特定言之提供本发明的HA主干域多肽的氨基酸序列的方法，以及利用此等方法可获得或获得的多肽。在某些实施例中，该方法包含以下步骤：
-提供流感HA0氨基酸序列，例如血清型H1、H5或H3的流感HA0序列；
-移除HA1与HA2之间的裂解位点，优选地藉由使HA1的C端氨基酸突变成除精氨酸(R)或赖氨酸(K)以外的氨基酸；
-自HA0序列中移除球状头部域的氨基酸序列；此举藉由以下方式进行：使位置x上的氨基酸与位置y上的氨基酸之间的HA1域的区段缺失，且任选地经由具有0至50个氨基酸的连接序列将由此获得的HA1的N端区段(跨越HA1的位置1上的氨基酸至并且包括位置x上的氨基酸)与C端区段(跨越HA1的氨基酸y至C端氨基酸)再连接。
-使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定，优选地藉由在以下中引入一或多个突变；使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列、优选地为跨越H1 HA的氨基酸402至418的氨基酸序列(尤其包含MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO:17)或对于H3 HA的I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列)。突变优选地包含将疏水性氨基酸残基取代成亲水性氨基酸残基。
-在HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
根据本发明，移除HA1与HA2之间的裂解位点可藉由在P1位置处使R(在少数情况下为K)突变成Q来达成(参见例如Sun等人，2010对于裂解位点(SEQ ID NO:1中的位置343)的命名的解释)。优选地突变成Q，但S、T、N、D或E为替代方案。
移除头部域可例如藉由使来自SEQ ID NO:1的氨基酸53至320缺失来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置(x)(等效位置)处、例如在位置54、55、56、57或58处开始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52处切割以增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置(y)、诸如315、316、317、318或319(等效位置)处，或在位置321、322、323、324或325(等效位置)处以增加缺失长度。重要的是认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较长连接子匹配且反之亦然。本发明亦涵盖此等多肽。
根据本发明，增强A螺旋与CD螺旋之间的环的溶解度。此环由H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)中的残基402至418(等效位置)形成。因此，使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定。如可在以下表6中看出，此环在H1序列中高度保守。此举可例如藉由用亲水性对应物置换该环中的氨基酸I、L、F或V来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。突变成甘氨酸使融合后构象不稳定，因为此氨基酸的高度柔性引起欲利用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的稳定性降低。描述血清型H1的流感HA的残基402至418之间的环的共同序列为(SEQ ID NO:17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本发明的某些多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比对测定)处的氨基酸为极性(S、T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)或柔性(G)氨基酸。亦可能为此等位点处的突变的组合，例如SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:14中的F406S、V409T、L416S。在一些情况下，优选地为恢复共同氨基酸的突变，例如其中V或M在位置404处(突变成T)，V在408(突变成A)或410(突变成G)处，或I在414处(突变成N)；具有此等特定氨基酸的序列的发生率极低。表征本发明的多肽的上述突变的概述在表6中给出。
根据本发明，将一或多个二硫桥键引入主干域多肽中，优选地在H1A/布里斯班(Brisbane)/59/2007中的位置324与436(或等效位置)的氨基酸之间：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:16。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
利用该方法可获得的多肽亦为本发明的一部分。
天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。根据本发明，可在位置418至433(等效位置)处将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO:83)引入本发明的多肽中。在某些实施例中，在位置419至433(等效位置)处引入来源于GCN4且亦已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:84)。在某些实施例中，藉由将M420、L423、V427、G430修饰成异亮氨酸来使三聚体界面稳定。
在某些实施例中，多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:3至SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:119至SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:125、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:175及SEQ IDNO:177至SEQ ID NO:187。
在某些实施例中，多肽是选自由以下组成的组：SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:113及SEQ ID NO:130。
普通技术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列(或信号序列；例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至17)不存在于例如用于疫苗的最终多肽中。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包含不具有前导序列的氨基酸序列。
可根据视为适于熟习技术者的任何技术(包括下文描述的技术)制备流感血球凝集素主干域多肽。
因此，本发明的免疫原性多肽可藉由此项技术中已知的标准方法以DNA序列形式合成并克隆，且随后使用此项技术中已知的适合的限制酶及方法活体外或活体内表达。因此，本发明亦关于编码上述多肽的核酸分子。本发明另外关于包含编码本发明的多肽的核酸的载体。在某些实施例中，本发明的核酸分子为载体(例如质体)的一部分。这些载体可利用普通技术人员所熟知的方法来轻易地操作，且可例如经设计以能够在原核和/或真核细胞中复制。此外，许多载体可直接或以来自其的经分离的所需片段形式用于真核细胞转型，且将全部或部分整合至这些细胞的基因组中，产生在基因组中包含所需核酸的稳定宿主细胞。所用载体可为适于克隆DNA且可用于相关核酸转录的任何载体。当使用宿主细胞时，载体优选地为整合载体。或者，载体可为游离型复制载体。
普通技术人员能够选择适合的表达载体，且以功能方式插入本发明的核酸序列。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，普通技术人员熟知能够驱动表达的序列可功能性连接至编码多肽的核酸序列，产生编码呈可表达形式的蛋白质或多肽的重组核酸分子。通常，将启动子序列置放于应表达的序列的上游。此项技术中可利用许多表达载体，例如Invitrogen的pcDNA及pEF载体系列、来自BD Sciences的pMSCV及pTK-Hyg、来自Stratagene的pCMV-Script等，这些表达载体可用于获得适合的启动子和/或转录终止子序列、polyA序列及其类似序列。当参考控制所编码的多肽的转录及翻译的序列适当插入编码相关多肽的序列时，所得表达卡匣适用于制造相关多肽，称为表达。驱动表达的序列可包括启动子、强化子及其类似物及其组合。此等序列应能够在宿主细胞中起作用，藉此驱动与其功能性连接的核酸序列的表达。普通技术人员意识到各种启动子可用于获得基因在宿主细胞中的表达。启动子可为组成性的或经调节的，且可自各种来源(包括病毒、原核或真核来源)获得或经人工设计。相关核酸可自天然启动子或其衍生物或自完全异源的启动子表达(Kaufman，2000)。一些用于在真核细胞中表达的熟知且较常用的启动子包含：来源于病毒(诸如腺病毒)的启动子，例如E1A启动子；来源于细胞巨大病毒(CMV)的启动子，诸如CMV实时早期(IE)启动子(本文中称为CMV启动子)(可例如自pcDNA,Invitrogen获得)；来源于猴病毒40(SV40)的启动子(Das等人，1985)；及其类似启动子。适合的启动子亦可来源于真核细胞，诸如金属硫蛋白(MT)启动子、延长因子1α(EF-1α)启动子(Gill等人，2001)、泛素C或UB6启动子(Gill等人，2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子及其类似启动子。测试启动子功能及启动子强度为普通技术人员的常规事项，且通常可例如涵盖克隆在启动子序列后面的测试基因(诸如lacZ、荧光素酶、GFP等)，及针对测试基因的表达测试。当然，启动子可藉由其中序列的缺失、添加、突变来改变且针对功能性测试，以发现新型减弱或改良的启动子序列。根据本发明，优选地为在所选真核细胞中产生较高转录水平的较强启动子。
构建体可使用普通技术人员所熟知的方法转染至真核细胞(例如植物、真菌、酵母或动物细胞)或适合的原核表达系统(如大肠杆菌(E.coli))中。在一些情况下，可将适合的‘标记’序列(诸如(但不限于)his标记、myc标记、strep标记或flag标记)或完全蛋白质(诸如(但不限于)麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶)添加至本发明的序列中，以允许自细胞或上清液中纯化和/或鉴别多肽。任选地可包括含有特异性蛋白水解位点的序列以在之后藉由蛋白水解消化移除标记。
可藉由此项技术中已知的光谱学方法(例如圆二色性光谱学、傅里叶变换红外光谱学(Fourier Transform Infrared spectroscopy)及NMR光谱学或X射线晶体学)分析经纯化的多肽，以研究所需结构(如螺旋及β片)的存在。ELISA、Octet及FACS及其类似方法可用于研究本发明的多肽对前述广泛中和抗体(CR6261、CR9114、CR8057)的结合。因此，可选择具有正确构象的本发明的多肽。
本发明另外关于免疫原性组合物，其包含治疗有效量的本发明的多肽和/或核酸中的至少一者。在某些实施例中，组合物包含多肽，该多肽包含血球凝集素主干域，该血球凝集素主干域来自(或基于)一种流感亚型的HA，例如基于包含例如H1或H7亚型的HA的流感病毒的HA。在某些实施例中，组合物包含多肽，该多肽包含血球凝集素主干域，该血球凝集素主干域基于两种或两种以上不同流感亚型的HA，例如包含以下的组合物：包含基于H1亚型的HA的血球凝集素主干域的多肽、及包含基于H7亚型的HA的血球凝集素主干域的多肽两者。
免疫原性组合物优选地另外包含医药学上可接受的载剂。在本发明情形中，术语“医药学上可接受”意谓载剂在所用剂量及浓度下将不在其所投与的个体中引起不当或有害作用。这些医药学上可接受的载剂及赋形剂为此项技术中所熟知(参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编，Mack Publishing Company[1990]；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins,S.Frokjaer及L.Hovgaard编，Taylor及Francis[2000]；及Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe编，Pharmaceutical Press[2000])。术语“载剂”是指与组合物一起投与的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。可例如采用盐水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作为液体载剂，尤其用于可注射溶液。确切配方应适应投药模式。多肽和/或核酸分子优选地以无菌溶液形式调配并投与。无菌溶液藉由无菌过滤或藉由此项技术中本身已知的其他方法来制备。溶液可随后冻干或填充至药物剂量容器中。溶液的pH值一般在pH3.0至pH9.5(例如pH5.0至pH7.5)的范围内。
本发明亦关于在个体中诱导免疫反应的方法，该方法包含投与个体如上所述的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。本发明的个体优选地为哺乳动物，其能够受感染性致病因子(特定言之为流感病毒)感染或可得益于免疫反应的诱导，该个体例如为啮齿动物(例如小鼠、雪貂或家畜或农畜)、或非人类灵长类动物或人类。个体优选地为人类个体。因此，本发明提供在利用本文中所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物的个体中诱导对流感病毒血球凝集素(HA)的免疫反应的方法，该流感病毒血球凝集素(HA)尤其属于第1类群和/或第2类群A型流感病毒(诸如包含H1、H2、H3、H4、H5、H7和/或H10亚型的HA的流感病毒)和/或B型流感病毒。在一些实施例中，所诱导的免疫反应有效预防和/或治疗第1类群和/或第2类群A型流感病毒亚型和/或B型流感病毒引起的流感病毒感染。在一些实施例中，由本文中所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由A型流感病毒的两种、三种、四种、五种或六种亚型和/或B型流感病毒引起的A型和/或B型流感病毒感染。
由于已熟知较小蛋白质和/或核酸分子并不总是有效诱导强力免疫反应，故可能有必要藉由添加佐剂来增加多肽和/或核酸分子的免疫原性。在某些实施例中，本文中所述的免疫原性组合物包含佐剂或与佐剂组合投与。用于与本文中所述的组合物组合投与的佐剂可在该组合物投与之前、同时或之后投与。适合的佐剂的实例包括：铝盐，诸如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，诸如MF59(参见例如WO90/14837)；皂素调配物，诸如QS21及免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184；WO 96/11711；WO 2004/004762；WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰基脂质A(MPL)、3-O-脱酰MPL(3dMPL)、含有CpG基元的寡核苷酸、ADP核糖基化细菌毒素或其突变体(诸如大肠杆菌不耐热肠毒素LT、霍乱菌毒素CT、百日咳毒素PT或破伤风类毒素TT)、基质M(Isconova)。此外，可使用已知免疫增强技术，诸如将本发明的多肽融合至此项技术中已知的蛋白质以增强免疫反应(例如破伤风类毒素、CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白或其他)、或在病毒体中包括多肽或其组合。可使用的其他非限制性实例例如由Coffman等人(2010)揭示。
在一实施例中，将本发明的流感血球凝集素主干域多肽并入病毒样粒子(VLP)载体中。VLP一般包含通常来源于病毒的结构蛋白质的病毒多肽。VLP优选地不能够复制。在某些实施例中，VLP可能缺乏病毒的完整基因组或包含病毒的基因组的一部分。在一些实施例中，VLP不能够感染细胞。在一些实施例中，VLP在其表面上表达普通技术人员已知的病毒(例如病毒表面糖蛋白)或非病毒(例如抗体或蛋白质)靶向部分中的一或多者。
在一特定实施例中，本发明的多肽并入病毒体中。含有本发明的多肽的病毒体可使用普通技术人员已知的技术制造。举例而言，病毒体可藉由以下方式制造：破坏经纯化的病毒，提取基因组，及将粒子与病毒蛋白质(例如流感血球凝集素主干域多肽)及脂质一起重新装配以形成含有病毒蛋白质的脂质粒子。
本发明亦关于上述多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其用于在个体中针对流感HA诱导免疫反应，尤其用作疫苗。因此，本文中所述的流感血球凝集素主干域多肽、编码这些多肽的核酸或包含这些核酸或多肽的载体可用于针对流感病毒、例如针对流感病毒血球凝集素的干区诱生中和抗体。本发明尤其关于如上所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物，其在预防和/或治疗由系统发生第1类群和/或第2类群的A型流感病毒和/或B型流感病毒引起的疾病或病状中用作疫苗。在一实施例中，疫苗可用于预防和/或治疗由系统发生第1类群和/或第2类群的两种、三种、四种、五种、六种或六种以上不同亚型和/或B型流感病毒引起的疾病。本发明的多肽可在活体外或在适合的细胞表达系统(包括细菌及真核细胞)中合成之后使用，或者可藉由表达针对免疫原性多肽编码的核酸而在有需要的个体中活体内表达。这些核酸疫苗可采用任何形式，包括裸DNA、质体或病毒载体(包括腺病毒载体)。
可使用标准投药途径进行本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的投与。非限制性实例包括非经肠投与，诸如静脉内、皮内、经皮、肌肉内、皮下等；或经黏膜投与，例如鼻内、经口及其类似方式。普通技术人员应能够确定投与本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的各种可能性，以便诱导免疫反应。在某些实施例中，多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物(或疫苗)投与一次以上，亦即呈所谓同源初免-加强(prime-boost)方案形式。在某些实施例中，当不止一次投与多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物时，第二剂量的投与可在以下时间间隔之后进行：例如第一剂量投与之后1周或1周以上、第一剂量投与之后2周或2周以上、第一剂量投与之后3周或3周以上、第一剂量投与之后1个月或1个月以上、第一剂量投与之后6周或6周以上、第一剂量投与之后2个月或2个月以上、第一剂量投与之后3个月或3个月以上、第一剂量投与之后4个月或4个月以上等，直至多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的第一剂量投与之后数年。亦可能投与疫苗大于两次，例如三次、四次等，以便第一次初免投与继之以一次以上加强投与。在其他实施例中，仅投与一次本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。
多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物亦可在异源初免-加强方案中以初免或加强形式投与。
本发明另外提供在利用本文中所述的多肽、核酸和/或组合物的个体中预防和/或治疗流感病毒疾病的方法。如上所述，在一特定实施例中，一种在个体中预防和/或治疗流感病毒疾病的方法包含投与有需要的个体有效量的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。治疗有效量是指如本文所定义的多肽、核酸和/或组合物的量，该量有效预防、改善和/或治疗由第1类群或第2类群A型流感病毒和/或B型流感病毒感染引起的疾病或病状。预防涵盖抑制或减少流感病毒的传播、或抑制或减少与流感病毒感染有关的一或多种症状的发作、发生或发展。如本文中所用的改善可指代减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可量测的流感感染表达。
需要治疗者包括已遭受由经第1类群或第2类群A型流感病毒或B型流感病毒感染引起的病状者、以及欲预防流感病毒感染者。因此，本发明的多肽、核酸和/或组合物可投与未处理个体(亦即不患有由流感病毒感染引起的疾病或尚未及当前未经流感病毒感染感染的个体)或投与早已和/或已经受流感病毒感染的个体。
在一实施例中，预防和/或治疗可以容易受到流感病毒感染的患者群体为目标。这些患者群体包括(但不限于)例如老年人(例如≥50岁、≥60岁且优选地≥65岁)、年轻人(例如≤5岁、≤1岁)、住院治疗的患者及已用抗病毒化合物治疗但显示抗病毒反应不够的患者。
在另一实施例中，多肽、核酸和/或免疫原性组合物可与一或多种其他活性药剂组合投与个体，这些其他活性药剂诸如为现有或未来的流感疫苗、单克隆抗体和/或抗病毒剂、和/或抗细菌剂和/或免疫调节剂。一或多种其他活性药剂可有益于治疗和/或预防流感病毒疾病，或可改善与流感病毒疾病有关的症状或病状。在一些实施例中，一或多种其他活性药剂为疼痛舒解剂、抗发热药物、或缓和或辅助呼吸的疗法。
本发明的多肽和/或核酸分子的给药方案可经调整以提供最佳所需反应(例如治疗反应)。适合的剂量范围可例如为0.1毫克/公斤体重至100毫克/公斤体重，优选地为1毫克/公斤体重至50毫克/公斤体重，优选地为0.5毫克/公斤体重至15毫克/公斤体重。欲使用的多肽和/或核酸分子的精确剂量将例如视投药途径及由其引起的感染或疾病的严重度而定，且应根据医师的判断及各个体的情况来决定。举例而言，有效剂量视以下而改变：靶部位、患者的生理状态(包括年龄、体重、健康状态)以及治疗为预防性的抑或治疗性的。患者通常为人类，但亦可治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量经最佳滴定以使安全性及功效优化。
本发明的多肽亦可用于验证鉴别为潜在治疗候选物的单克隆抗体的结合。此外，本发明的多肽可用作诊断工具，例如藉由在个体的血清中确定是否存在能够结合至本发明的多肽的抗体来测试该个体的免疫状态。因此，本发明亦关于用于检测患者中存在流感感染的活体外诊断方法，该方法包含以下步骤：a)使自该患者获得的生物样本与本发明的多肽接触；及b)检测抗体-抗原复合物的存在。
本发明的多肽亦可用于鉴别新的结合分子或改良现有结合分子，诸如单克隆抗体及抗病毒剂。
本发明另外说明于以下实例及图中。实例不意欲以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：鉴别新颖第1类群及第2类群交叉中和抗体：CR9114
藉由静脉穿刺在EDTA抗凝血试样管中收集来自正常健康供体的周边血液。scFv噬菌体呈现文库基本上如WO 2008/028946中所述获得，该专利以引用的方式并入本文中。针对以下A型流感亚型的重组血球凝集素(HA)进行选择：H1(A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99)、H3(A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005)、H4(A/鸭/香港(Hong Kong)/24/1976)、H5(A/鸡/越南(Vietnam)/28/2003)、H7(A/荷兰(Netherlands)/219/2003)及H9(A/HongKong/1073/99)。进行连续两轮选择，随后分离个别单链噬菌体抗体。在第二轮选择之后，使用个别大肠杆菌群落来制备单克隆噬菌体抗体。在ELISA中验证在上述筛检中获得的含有单链噬菌体抗体的所选上清液的特异性，亦即对不同HA抗原的结合。为此目的，将以下涂布至MaxisorpTMELISA盘：杆状病毒表达的重组H1(A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99)、H3(A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005)、H5(A/越南(Vietnam)/1203/04)、H7(A/荷兰(Netherlands)/219/2003)及B(B/Ohio/01/2005)HA(Protein Sciences,CT,USA)。在所获得的单链噬菌体抗体中，单链噬菌体抗体SC09-114展示特异性结合重组A型流感H1、H3、H5、H7及B型流感HA。藉由FACS分析验证SC09-114的结合及特异性。为此目的，使全长重组A型流感亚型H1(A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及H7(A/荷兰(Netherlands)/219/2003)HA表达于PER.C6细胞的表面上。SC09-114展示特异性结合至A型流感亚型H1、H3及H7 HA。如先前所述克隆scFv的重链及轻链可变区(WO2008/028946)。编码人类IgG1重链及轻链的所得表达构建体短暂组合表达于293T细胞中，且使用标准纯化程序获得及制造含有人类IgG1抗体CR9114的上清液。CR9114的重链及轻链的CDR的氨基酸序列在表1中给出。以下给出重链及轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列。
实例2：CR9114的交叉结合反应性
在ELISA中验证CR9114的结合特异性，亦即对不同HA抗原的结合。为此目的，将以下涂布至MaxisorpTM ELISA盘：杆状病毒表达的重组H1(A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/1999)、H3(A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005)、H5(A/越南(Vietnam)/1203/04)、H7(A/荷兰(Netherlands)/219/2003)及H9(A/HongKong/1073/99)HA(Protein Sciences,CT,USA)。使用无关IgG CR4098作为对照。CR9114展示对所测试的所有重组HA均具有异源亚型交叉结合活性。参见表2。
另外，藉由FACS分析来测试抗体的异源亚型结合。为此目的，使全长重组A型流感亚型H1(A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及H7(A/荷兰(Netherlands)/219/2003)HA表达于PER.C6细胞的表面上。将细胞与CR9114一起培育1小时，随后用PBS+0.1％BSA进行三个洗涤步骤。使用PE结合的抗人抗体检测所结合的抗体。使用未经转染的PER.C6细胞作为对照。CR9114展示对A型流感亚型H1、H3及H7HA而非野生型PER.C6细胞的交叉结合活性。参见表2。
实例3：CR9114的交叉中和活性
为了测定CR9114是否能够阻断多种A型流感病毒株，进行另外的活体外病毒中和分析(VNA)。在MDCK细胞(ATCC CCL-34)上进行VNA。将MDCK细胞培养于MDCK细胞培养基(补充以抗生素、20mM Hepes及0.15％(w/v)碳酸氢钠的MEM培养基(完全MEM培养基)，补充以10％(v/v)胎牛血清)中。将以下用于分析的病毒株均稀释至5.7×103TCID50/ml(每毫升50％组织培养感染剂量)的效价，其中效价根据Spearman及Karber的方法计算：H1(A/WSN/33、A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/1999、A/所罗门群岛(Solomon Islands)/IVR-145(A/所罗门群岛(Solomon Islands)/3/2006的高生长性重配株)、A/布里斯班(Brisbane)/59/2007、A/NYMC/X-181(A/加利福尼亚(California)/07/2009的高生长性重配株))、H2(A/Env/MPU3156/05)、H3(A/香港(Hong Kong)/1/68、A/约翰尼斯堡(Johannesburg)/33/94、A/巴拿马(Panama)/2000/1999、A/广岛(Hiroshima)/52/2005、A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005及A/布里斯班(Brisbane)/10/2007)、H4(A/WF/HK/MPA892/06)、H5(PR8-H5N1-HK97(A/香港(Hong Kong)/156/97及A/PR/8/34的6:2重配株)及A/赤颈鸭/MPF461/07)、H6(A/赤颈鸭/MPD411/07)、H7(NIBRG-60(A/绿头鸭/荷兰(Netherlands)/12/2000的6:2重配株)及PR8-H7N7-NY(A/纽约(NewYork)/107/2003(H7N7)及A/PR/8/34的7:1重配株))、H8(A/赤颈鸭/MPH571/08)、H9(A/香港(Hong Kong)/1073/99及A/鸡/HK/SSP176/09)、H10(A/鸡/德国(Germany)/N/49)及H14(PR8-H14N5(A/绿头鸭/阿斯特拉罕(Astrakhan)/263/1982(H14N5)及A/PR/8/34的6:2重配株))。在一式四份孔中在完全MEM培养基中连续2倍稀释(1:2至1:512)IgG制备物(200μg/ml)。将25μl各别IgG稀释液与25μl病毒悬浮液(100TCID50/25μl)混合，且在37℃下培育1小时。随后将悬浮液一式四份地转移至含有汇合MDCK培养物于50μl完全MEM培养基中的96孔盘上。使用前，MDCK细胞以3×104个细胞/孔接种于MDCK细胞培养基中，生长直至细胞已达至汇合为止，用300μl至350μl PBS(pH7.4)洗涤，且最后向各孔中添加50μl完全MEM培养基。在37℃下将所接种的细胞培养3至4天，且每日观察细胞病变作用(CPE)的发展。将CPE与阳性对照比较。
CR9114展示对所有测试的A型流感亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9及H10病毒的代表病毒株均具有异源亚型交叉中和活性。参见表3。
实例4：基于H1HA设计包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原决定基的主干域多肽
先前已鉴别针对流感病毒血球凝集素的具有广泛交叉中和效能的完全人类单克隆抗体。CR6261(如WO 2008/028946中所述)展示具有针对系统发生第1类群的A型流感病毒的广泛交叉中和活性。此外，上述CR9114已显示能够结合及中和系统发生第1类群及第2类群两者的A型流感病毒以及B型流感病毒。功能及结构分析已揭示此等抗体干扰膜融合过程且针对流感HA蛋白的主干域中的高度保守抗原决定基(Throsby等人(2008)；Ekiert等人(2009)；WO 2008/028946；及共同待决申请号EP11173953.8)。
在引向本发明的研究中，设计了包含含有此等抗原决定基的HA的主干域的新颖分子，以便建立基于通用抗原决定基的免疫原性多肽，这些多肽可例如用作针对广泛范围流感病毒株诱发保护的疫苗。基本上，首先自全长HA分子中移除高度易变且免疫显性的部分(亦即头部域)，以产生HA主干域多肽(亦称为“微型HA”)。以此方式，免疫反应将对定位有针对广泛中和抗体的抗原决定基的主干域重定向。抗体CR6261及CR9114用于探查新建分子的正确折叠，并用于证实存在中和抗原决定基。
因此，本发明的多肽在膜远程头部域中存在的显性抗原决定基不存在的情况下，向免疫系统呈现膜近端主干域HA分子的保守抗原决定基。为此，移除构成头部域的HA0蛋白的一级序列的一部分，且直接再连接或藉由引入较短柔性连接序列(‘连接子’)来再连接，以恢复多肽链的连续性。所得序列藉由引入特定突变来进一步修饰，这些突变使HA0分子的剩余部分的天然3维结构稳定。
病毒中HA分子的功能为结合至细胞表面受体唾液酸，及在吸收于内体中之后，介导病毒与内体膜的融合，引起病毒RNA释放至细胞中。融合过程中的基本步骤为HA分子的较大构象变化，该构象变化使分子的二级结构组件重排以使融合肽暴露。因此，HA分子存在的两种构象(融合前及融合后)在其三级结构方面极其不同。由于病毒HA蛋白质主要以融合前状态暴露于免疫系统，故重要的是确保本发明的多肽采用此构象。此要求可藉由使融合前构象稳定且同时使融合后构象不稳定来满足。由于融合前构象为介稳态且采用融合后构象可产生稳定构象(亦即能量最低)(Chen等人，1995)，故需要此稳定/去稳定作用。
在此实例中，采用来自H1N1A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的HA(SEQ ID NO:1)作为一级(或野生型)序列来建立本发明的多肽。
在第一步骤中，本发明的多肽的构建法是移除在位置59与291之间的HA1序列(编号参考HA0序列中的位置，如SEQ ID NO:1中所示。在某些实施例中，HA1部分包含氨基酸18至343，且HA2部分包含氨基酸残基344至565；由于SEQ ID NO:1包含信号肽，故HA1部分起始于位置18)。此结果为移除HA0的残基60至290。此等残基被GGGG连接序列置换。接着，藉助于Brugel计算融合前及融合后构象中各残基的可利用表面积(Delhaise等人，1984)。如Samantha等人(2002)中所述，测定各残基的暴露及隐藏程度，其中着重于在融合前构象中暴露且在融合后构象中隐藏的残基。此等残基的进一步分析指示一些此等氨基酸残基可依一定方式突变，该方式使得突变不会影响融合前构象，但会使融合后构象不稳定。此等残基通常具有疏水性侧链且参与形成融合后构象中的卷曲螺旋。使此等氨基酸残基突变成亲水性氨基酸将扰乱卷曲螺旋性质(卷曲螺旋中螺旋之间的接触通常为疏水性)，且因此使融合后构象不稳定。
依据此推断，在序列的HA2部分中引入一些突变：Phe 406突变成Ser(F406S)、Val 409突变成Thr(V409T)、Leu 416突变成Ser(L416S)及Tyr502突变成Ser(Y502S)。此等突变为自HA表面移除疏水性残基的突变。应注意到L416突变成S或T时亦引入共同N-糖基化位点(共同序列为NX(S/T))。此位置处的糖基化将进一步增强此区域的溶解度。此外，Leu58突变成Thr(L58T)、Val 314突变成Thr(V314T)且Ile 316突变成Thr(I316T)；此等突变均在HA1域中，亦即对应于在天然HA0链裂解后的HA1的序列部分。后两个突变维持侧链的β分支，但自表面移除疏水性残基。如以下将展示，将一些此等突变引入所有变异体中，在各别多肽中测试其他此等突变，以研究这些突变是否以不合需要的方式彼此影响。
为了增强多肽的稳定性，研究两个二硫桥键以将HA锁定为融合前构象。二硫桥键形成于在空间上彼此相隔适当距离(在全长HA分子中)的残基之间，且这些残基使其已在正确位置处的C-β原子形成二硫桥键。所提出的第一二硫桥键是在位置321(HA1域)与位置405(HA2域)之间。在HA2域内，二硫桥键产生于位置413与421之间。
由于在位置R343处裂解HA为构象变化能够进行的基本步骤，故在本发明的多肽中，藉由引入Arg(R)至Gln(Q)的突变来移除裂解位点。本发明的另一解决方案为将Arg变为Gln且使残基345至350(HA2的融合肽的一小部分)缺失。此等(疏水性)序列的移除将使多肽进一步稳定。
在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，移除HA2的位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的细胞质序列及跨膜序列，以便在表达于细胞中之后制造可用于例如疫苗的分泌型(可溶性)多肽。藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQID NO:143)，任选地经由连接子连接，使可溶性多肽进一步稳定。连接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记(HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。根据本发明，HA2域的位置530(编号根据SEQ ID NO:1)至C端氨基酸的氨基酸序列可经移除并置换为以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ ID NO:81)，包含较短连接子及his标记；或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO:82)，包含凝血酶裂解位点、三聚域及his标记。
将上述突变根据其功能及在HA干多肽的3维结构中的位置集合成聚簇。所有多肽均含有H1 HA序列1至59及291至565及R343Q突变，具有以下其他突变：L58T、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S(SEQ ID NO:3；命名为聚簇1)。此外，制得具有其他突变的变异体：
聚簇2：K321C、Q405C(SEQ ID NO:4)
聚簇3：F413C、E421C(SEQ ID NO:5)
聚簇4：HA2Y502S(SEQ ID NO:6)
另外，制得含有聚簇1序列且此外含有聚簇2及3(SEQ ID NO:7)或聚簇2、3及4(SEQ ID NO:8)的突变的两种变异体。
合成编码上述蛋白质序列的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。出于比较的原因，将全长序列(SEQ IDNO:1)以及由Steel等人(2010)描述的序列(H1-PR8-dH1；SEQ ID NO:24，其是基于H1N1A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934序列)包括于实验中。
使用40μl 293 transfectin作为转染试剂用表达载体(1μg/ml)转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞(106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞，等分试样(0.3ml，约3×105个细胞)，且将等分试样以针对H1 HA产生的多克隆血清处理以探查表达或以HA特异性单克隆抗体(5微克/毫升)及用于染色的二级抗体处理。随后，使用针对H1 HA产生的多克隆血清，针对膜连接的本发明的HA主干域多肽的表达，藉由荧光结合细胞分选(FACS)分析细胞以探查表达。将具有结合全长蛋白质的已知特异性的单克隆抗体小组(例如CR6261及CR9114)用于探查保守抗原决定基的存在，且根据推理探查全长HA及本发明的微型HA多肽的正确折叠。结果表示为阳性细胞百分比及平均荧光强度，且展示于图2中。
结果展示所有构建体均表达于细胞表面上，因为与对于未经转染的细胞的约4％相比，与多克隆血清(抗H1多克隆)的反应引起所分析的全部细胞的75％或75％以上为阳性。此结果由平均荧光强度(MFI)的值证实，这些值对于以多克隆血清处理之后的所有构建体而言为类似的。不存在IgG、仅使用经标记的抗人IgG或不相关单抗的对照实验均为阴性的。A/布里斯班(Brisbane)/59/2007及A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934全长HA蛋白质均由单克隆抗体CR6261、CR6254、CR6328(均已知结合并中和H1 HA；Throsby等人(2008)；WO 2008/028946)、CR9114(上述)、CR8001(结合至H1HA，但不中和H1；描述于WO 2010/130636中)而非CR8057(仅结合至某些H3病毒株，亦描述于WO 2010/130636中)及CR6307(Throsby等人(2008)；WO 2008/028946)识别。
考虑CR6261抗原决定基的不连续性及构象特征(Ekiert等人2009)，推断出两种全长蛋白质均以其天然3维构象形式存在。对于在此实验中测试的新设计的本发明多肽而言，观察到由单克隆抗体小组识别的相同模式：由CR6261、CR6254、CR6328、CR9114及CR8001而非CR6307及CR8057结合。此现象在阳性细胞百分比的数据中最明显，但亦在平均荧光强度数据中观察到。就细胞阳性％以及平均荧光强度而言，均在微型HA-聚簇1的情况下获得最佳结果。
添加其他修饰，诸如上述二硫桥键(聚簇2及3)及聚簇4的Y502S突变或此等突变的组合，引起阳性细胞百分比降低及平均强度降低。此实验中所用的任何抗体均未在背景水平以上识别含有头部域缺失但缺乏其他修饰的由Steel等人(2010)描述的构建体(SEQ ID NO:24)。因此，推断出在DNA转染之后，此蛋白未以其在HA中具有的天然3维构象形式展示。
上述结果预示聚簇1突变的重要性，这些聚簇1突变增强环的亲水性特征，该环由HA分子的连接A螺旋及较长骨架螺旋(CD)的残基402至418及周围区域形成。为了进一步确定聚簇1突变对本发明的多肽的稳定性及折叠的有益作用，在另一实验中比较微型HA(SEQ ID NO:2；根据Steel的多肽，但基于A/布里斯班(Brisbane))及微型HA_聚簇1(本发明的多肽；SEQ ID NO:3)(图3)。
尽管约60％经微型HA-聚簇1转染的细胞在结合CR6261、CR6254、CR6328及CR9114之后为阳性，但用微型HA(根据Steel的多肽，但基于A/布里斯班(Brisbane)；SEQ ID NO:2)转染引起极接近于背景水平的值(1％至3％)。我们推断出聚簇1的突变与缺乏此等突变的未经修饰的微型HA蛋白(SEQ ID NO:2)相比，有利地促进本发明的多肽的正确折叠及稳定性。
Steel等人藉由以下方式建立一种新的分子：使H1 A/波多黎各(PuertoRico)/8/1934及H3 HK68病毒株的HA1的氨基酸残基53至276自一级序列中缺失，且用较短柔性连接子置换此缺失。如此实例中所示，此举产生高度不稳定的分子，该分子并未调整正确构象，如由先前展示结合至干区中的保守抗原决定基的抗体不发生结合所证实。不正确折叠由较大区域的溶剂暴露引起，该较大区域通常由全长HA分子中的球状头部遮蔽。由于此区域本质为疏水性的，故分子不再稳定且因此必需改适。
如已在本发明多肽中进行的疏水性残基调换为亲水性残基抵消此作用且使HA主干域多肽稳定。藉由以下方式来达成主干域的天然3维折叠的进一步稳定：在适当位置处引入二硫桥键，以使在天然三级结构中空间上接近但在一级结构中分离的残基紧密连接。
实例5：实例4的HA主干域多肽的免疫原性
为了评估主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ ID NO:1)、微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)、微型HA-聚簇1+2(SEQ ID NO:4)及微型HA-聚簇1+4(SEQ ID NO:6)。出于比较的原因，亦将由Steel等人(2010)设计的微型HA(微型PR8；SEQ ID NO:24)及来自A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934的相应全长蛋白质HA包括于实验中。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天、第21天及第42天用50μg构建体+50μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。藉由FACS分析来分析血清。使用40微升293transfectin作为转染试剂用表达载体(1微克/毫升)转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞(106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞，等分试样(0.3ml，约3×105个细胞)，且将等分试样以构建体特异性血清处理，用二级抗体染色且藉由荧光结合细胞分选进行分析。结果展示于图4中。
正如所料，如由阳性细胞％及MFI表明，cM2特异性血清(阴性对照)识别cM2，但全长HA或主干域多肽中没有一者识别cM2。相比之下，全长HA特异性血清染色表达相应全长HA(SEQ ID NO:1)的细胞，而且染色表达微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)、微型HA-聚簇1+2(SEQ ID NO:4)及微型HA-聚簇1+4(SEQ ID NO:6)的细胞，但在较低水平下(约40％阳性细胞相对于针对全长的约80％，MFI约1000相对于针对全长的约7000)。反过来亦是正确的：对微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)、微型HA-聚簇1+2(SEQ ID NO:4)及微型HA-聚簇1+4(SEQ ID NO:6)具有特异性的血清识别表达相应构建体以及全长HA(SEQ ID NO:1)的细胞。结果概述于下表4中。
与上述针对微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)、微型HA-聚簇1+2(SEQ IDNO:4)及微型HA-聚簇1+4(SEQ ID NO:6)的结果对比，自经全长PR8免疫的小鼠获得的血清并未很好地结合至经H1-PR8-dH1(SEQ ID NO:24)转染的细胞。与针对微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)及微型HA-聚簇1+2(SEQ IDNO:4)的40％至50％相比，细胞阳性百分比为约20％。在所观察的几乎不在背景水平以上的平均荧光强度中亦反映该结果。
总之，数据展示本发明的多肽能够诱导针对全长HA的免疫反应。特定言之，在残基402与418(编号根据SEQ ID NO:1)之间的区域中的修饰对建立稳定分子很重要。
实例6：制备第二代主干域多肽
实例4中所述的主干域多肽的平均荧光强度在所有情况下均低于针对相应全长蛋白质所观察到的平均荧光强度；实际上，最佳设计微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)在与单克隆抗体结合之后具有全长构建体的约10％平均强度的强度。由此指示细胞表面上主干域多肽的表达和/或折叠低于针对全长蛋白质所观察到的表达和/或折叠，且可进一步改良设计。自第一代获得的结果展示改良第一代构建体为可能的且因此启动第二轮设计。
实例4中所述的多肽是基于HA0链的相同缺失，亦即残基L60至K290(微型1；编号参考来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA0中的位置；SEQ ID NO:1)。此方法产生现不再连接于头部域的较长非结构化环。推断此环并不有助于整体蛋白稳定性，且可在不影响多肽的其他部分折叠的情况下大大缩短。设计三种其他缺失，且用如前所述的GGGG连接子序列置换且与上述聚簇1的突变组合。缺失为S53至P320(微型2)、H54至I302(微型3)、G56至G317(微型4)。引入与上述聚簇1一致的其他修饰(L58T、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S)。属于此聚簇的一些残基为所缺失的序列的一部分，且因此可不再经修饰(参见下文)。此外，在于融合前状态中形成三聚卷曲螺旋的较长螺旋C中建立两种其他突变。此项技术中熟知三聚卷曲螺旋利用在七价重复序列的位置420 a及d处的Ile稳定，该七价重复序列为此结构基元的标志(Suzuki等人，(2005)；Woolfson等人(2005))。藉由在位置420(M420I)及427(V427I)处引入Ile来应用此知识。此两种突变与聚簇1的突变的组合指定为聚簇11；为了阐明，以下列出组合：
为了使主干域多肽的融合前状态进一步稳定，在位置324与436(聚簇5：R324C、T436C)之间引入另一二硫桥键且与不同缺失突变体组合。合成以下组合且如上所述在FACS分析中测试结合：
微型1-聚簇11(SEQ ID NO:9)
微型2-聚簇11(SEQ ID NO:10)
微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)
微型4-聚簇11(SEQ ID NO:12)
微型1-聚簇11+5(SEQ ID NO:13)
微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)
微型3-聚簇11+5(SEQ ID NO:15)
微型4-聚簇11+5(SEQ ID NO:16)
出于比较的原因，实验中亦包括微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)。结果展示于图5中。
如由用多克隆抗H1血清处理之后的阳性细胞百分比表明(90％或90％以上)，在所有情况下，主干域多肽在表达载体转染至HEK293F细胞中之后均呈现于细胞表面上。
此实验中的所有HA主干域多肽均由CR6261、CR6254、CR6328及CR9114而非CR8057识别；后者正如所料，因为此单抗对H3 HA具有特异性。然而，不同抗体在细胞阳性百分比及MFI方面存在明显差异。最佳表征的抗体为CR6261，其抗原决定基详细已知。该抗原决定基为不连续及构象的，且此抗体的结合因此可视为HA主干域多肽的正确折叠的严格测试。CR9114广泛中和，涵盖来自第1类群及第2类群两者的病毒株(表3)。在CR6328及CR6254的抗原决定基中，已知详情较少，但基于针对阳性细胞％及MFI发现的较高值，以及数据中的较小展开，此等抗体的结合与CR6261相比似乎为正确折叠的较低敏感性探查。
比较阳性细胞百分比(考虑所有抗体的数据)，可将微型1至微型4构建体排序(最高％至最低％)。
对于与聚簇11的组合，微型2>微型1>微型4>微型3；及
对于与聚簇11+5的组合，微型2>微型1＝微型4>微型3
此排序亦反映在MFI上的数据中，且得出结论微型2构建体的缺失S53至P320引起来自此组的最高水平蛋白质以正确构象形式展示于细胞表面上。
比较微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)与微型1-聚簇11(SEQ ID NO:9)，其他突变M420I、V427I似乎并未引起构建体的另外稳定；若有，则其引起较低阳性细胞百分比及MFI值，但差异较小。
引入二硫桥键R324C、T436C(聚簇5)引起细胞表面上正确折叠的蛋白质对于微型2-聚簇11(SEQ ID NO:10)及微型4-聚簇11(SEQ ID NO:12)而言增多，但对于微型1-聚簇11(SEQ ID NO:9)及微型3-聚簇11(SEQ IDNO:11)而言极少或无改良。总体而言，在微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)的情况下获得更佳结果。此结果自MFI值来看尤其明显，此构建体的MFI值为全长构建体的值的约50％。
在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，移除HA2的位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的细胞质序列及跨膜序列，且任选地藉由引入已知形成三聚体结构的序列(亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:143))置换，任选地经由连接子连接。连接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记HHHHHHH。根据本发明，HA2域的位置530(编号根据SEQ ID NO:1)至C端氨基酸的氨基酸序列可经移除并置换为SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82。
实例7：第二代HA主干域多肽的免疫原性
为了评估实例6的主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ IDNO:1)、微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)、微型2-聚簇11(SEQ ID NO:10)、微型1-聚簇11+5(SEQ ID NO:13)、微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天、第21天及第42天用50μg构建体+50μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。亦使用约10μg构建体+约2μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)及相同免疫流程，藉由基因枪投与不同组小鼠全长HA0(SEQ ID NO:1)、阴性对照cM2及微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)。使用来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007病毒株的全长HA的重组胞外域(自Protein SciencesCorporation,Meriden,CT,USA获得)作为抗原，藉由Elisa分析血清。简言之，在4℃下用50ng HA涂布96孔盘隔夜，随后在室温下与阻断缓冲液(100μl PBS(pH7.4)+2％脱脂牛奶)一起培育1小时。用PBS+0.05％Tween-20洗涤盘，且自血清的20倍稀释液开始添加100μl在阻断缓冲液中的2倍稀释系列。使用HRP结合的山羊抗小鼠IgG，使用此项技术中公认的标准方案检测结合的抗体。效价与使用单抗3AH1 InA134(Hytest,Turku,Finland)的标准曲线相比，得出Elisa单位/毫升(EU/ml)。
28天及49天后的Elisa结果分别展示于图6A及图6B中。在使用基因枪免疫后28天及49天后以及在肌肉内免疫49天后，自以编码微型2-聚簇11+5(SEQID NO:14)的DNA免疫的小鼠获得的血清展现明确结合至胞外域全长HA。对于微型2-聚簇11(SEQ ID NO:10)及微型1-聚簇11+5(SEQ ID NO:13)，在4只小鼠中的1只中检测到反应，而对于微型HA-聚簇1(SEQ ID NO:3)，未检测到结合。
总之，数据展示本发明的多肽能够诱导针对全长HA的免疫反应。特定言之，在残基402与418(编号根据SEQ ID NO:1)之间的区域中的修饰、缺失S53至P320与二硫桥键R324C、T436C组合对建立稳定分子很重要。
实例8：第三代主干域多肽的制备
为了进一步改良主干域多肽的设计，实施第三轮设计。在位置413处引入增强隐藏于全长HA中的表面而非主干域多肽的亲水性的另一突变F413G(编号根据SEQ ID NO:1)，且命名为聚簇6。此聚簇与微型2的缺失(S53至P320)、聚簇5的二硫桥键(R324C、T436C)及聚簇1(亦即F406S、V409T、L416S；SEQ ID NO:46)或聚簇11(M420I、V427I、F406S、V409T、L416S；SEQ ID NO:47)的突变组合。微型2缺失(S53至P320)与聚簇1(F406S、V409T、L416S)及聚簇5(R324C、T436C)的组合亦包括于此实验中以用于参考(SEQ ID NO:48)。
天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。根据本发明，可在H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007中的位置418至433(等效位置)处(编号根据SEQ ID NO:1)将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO:83)引入本发明多肽中(SEQID NO:44)。一种替代方案为将来源于GCN4且已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:84)引入位置419至433处(SEQ IDNO:45)。
如由用多克隆抗H1血清处理之后的阳性细胞百分比(90％或90％以上)表明，在由SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:48描述的主干域多肽的情况下，所有蛋白质在表达载体转染至HEK293F细胞中之后均呈现于细胞表面上。结果展示于图7中。
此实验中的所有HA主干域多肽(其中例外为微型HA(SEQ ID NO:2))均由CR6261、CR6328及CR9114而非CR8020识别；后者正如所料，因为此单抗对H3 HA具有特异性。对于使用CR6261、CR6328及CR9114用于染色的主干域多肽，阳性细胞百分比为约80％，其中例外为微型HA，其仅由多克隆抗H1血清识别。再次，此结果指示此特定构建体不发生正确折叠。然而，不同抗体在MFI方面存在明显差异。最佳表征的抗体为CR6261，其抗原决定基详细已知。该抗原决定基为不连续及构象的，且此抗体的结合可因此视为HA主干域多肽的正确折叠的严格测试。CR9114广泛中和，涵盖来自第1类群及第2类群两者的病毒株(表3)。在CR6328的抗原决定基中，已知详情较少，但在对全长HA的结合实验中，观察到与CR6261的竞争。
H1-微型2-cl11+5(SEQ ID NO:14)、H1-微型2-cl1+5(SEQ ID NO:48)、H1-微型2-cl1+5+6(SEQ ID NO:46)及H1-微型2-cl11+5+6(SEQ ID NO:47)的MFI极类似，与实验中所用单克隆抗体无关。与不具有三聚域的等效序列(亦即H1-微型2-聚簇1+5+6；SEQ ID 46)相比，共同三聚域(SEQ IDNO:44)的纳入使MFI降低3至4倍，但结果仍明显优于在头部域缺失之后干多肽不存在修饰的情况(参照微型HA结果)。GCN4三聚序列(SEQ ID NO:45)的添加使MFI提高至可与全长蛋白质相当的水平。
实例9：设计包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原决定基的其他主干域多肽
根据上述程序设计的本发明的多肽可经进一步修饰以增强稳定性。可引入这些修饰以在单聚和/或二聚物内增强本发明多肽的三聚形式的形成。如上所述，天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。
根据本发明，可在H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007中的位置418至433(等效位置)处(编号根据SEQ ID NO:1)将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO:83)引入本发明多肽中(SEQ IDNO:44)。或者，可将IEAIEKKIEAIEKKI(SEQ ID NO:85)引入419至433处(SEQ ID NO:49)，或将IEAIEKKIEAIEKK(SEQ ID NO:86)引入420至433处(SEQ ID NO:50)。一种替代方案为将来源于GCN4且已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:84)引入位置419至433处(SEQ IDNO:45)。或者，可将MKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:87)引入位置420至433处(SEQ ID NO:51)，或将RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:88)引入位置417至433处(SEQ ID NO:52)。类似地，三聚体界面藉由将M420、L423、V427、G430修饰成异亮氨酸来强化(SEQ ID NO:53)。
所有肽均展示结合CR9114及CR6261。
如先前所述，在某些实施例中，本发明的多肽不含有HA的信号序列和/或细胞内序列及跨膜域。
实例10：基于H7 HA设计包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原决定基的主干域多肽
亦将设计本发明多肽的上述程序应用于H7。在此实例中，描述基于血清型H7设计本发明的多肽。将H7流感病毒A/绿头鸭/荷兰(Netherlands)/12/2000的HA(SEQ ID NO:31)用作亲本序列，但普通技术人员将理解使用其他H7序列将同样可能，因为这些序列充分保守，尤其在干区中。
序列中的第一个修饰为藉由使R突变成Q(R339Q)来移除位置339(编号参考SEQ ID NO:31)处的裂解位点，以防止自HA0形成HA1及HA2。任选地可再缺失残基341至345(LFGAI，融合肽的一部分)，以使疏水性残基对水性溶剂的暴露降至最低。裂解处的正电荷在H7中100％保守，且此突变可因此应用于所有序列中。
第二个修饰为藉由以下方式移除头部域：使HA1序列的较大部分缺失，且经由较短连接子使N端及C端序列再连接。缺失长度可变化，但优选地HA1的N端序列的最后一个残基与C端序列的第一个残基在空间上紧靠在一起以避免经由连接序列引入病毒株。在H7序列中，可在H7 A/绿头鸭/荷兰(Netherlands)/12/2000(SEQ ID NO:31)的R53至P315(等效位置)处引入缺失(微型2；SEQ ID NO:33)。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。
SEQ ID NO:40描述含有缺失T54至C314的本发明的该多肽(微型5；SEQID NO:40)。上述缺失确保由残基280至310形成的非结构化区域亦得以移除；此举有益于本发明的多肽的总体稳定性。对来源于H1序列的本发明的多肽(参见上文)观察到类似作用。
头部域的缺失留下现暴露于水性溶剂的残基394至414之间的环。在H7HA中，此环高度保守(参见表7)。共同序列为：LI(E/D/G)KTNQQFELIDNEF(N/T/S)E(I/V)E(Q/K)(SEQ ID NO:32)。
为了增加此环在融合前构象中的溶解度且使融合后构象不稳定，将一些疏水性残基修饰成极性(S、T、N、Q)、带电荷的氨基酸(R、H、K、D、E)，或藉由突变成G来增加柔性。特定言之，在位置402、404、405、409、412(编号参考SEQ ID NO:31)处的突变将有助于本发明的多肽的稳定性。
对于位置F402及F409，优选地突变成S，但其他极性(T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置404(96％L)，优选地突变成N或S；后一个氨基酸亦自然出现，但频率较低，且此位置的突变在这些情况下不必要。其他极性(T、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置405(99％I)，优选地突变成T或D。D亦自然出现，且此位置的突变因而不必要。其他极性(S、N、Q)、带电荷的(R、H、K)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置412(I或V)，优选地突变成N，但亦可能为其他极性(S、T、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)或柔性(G)残基。因此，多肽含有上述突变中的至少一者。亦已应用一个以上突变的组合，如例如SEQID NO:34至SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:43中所示。
为了使本发明的多肽的融合前构象稳定，在于一级序列中远离但在折叠的融合前构象中接近的两个部分之间引入共价键。为此，二硫桥键可在本发明的多肽中经工程化，优选地在H7 A/绿头鸭/荷兰(Netherlands)/12/2000(SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43)中的位置319与432(等效位置)之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
如上所述，天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。此项技术中熟知三聚卷曲螺旋利用在七价重复序列的位置a及d处的Ile稳定，该七价重复序列为此结构基元的标志。此处，藉由在位置419、423、426及430(等效位置)(SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:43)处引入Ile来应用此知识。或者，将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列EAIEKKIEAI引入位置417至426(等效位置)处(SEQ ID NO:39)。
对此等序列(SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:43)进行上述荧光结合细胞分选分析。然而，未可检测到单克隆抗体CR8020、CR8043、CR9114或CR8957的结合。我们推断此等序列不呈现此等抗体的抗原决定基，且因此如呈现于细胞膜上的蛋白质并不折叠成其天然3维结构。
实例11：基于H3 HA设计包含CR8020、CR8043及CR9114的保守主干域抗原决定基的主干域多肽
在第一步骤中，使用来自H3 A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的HA作为亲本序列(SEQ ID NO:89)，以与由Steel及同事(Steel等人2010)所述类似的方式构建表示本发明多肽的序列。藉由自氨基酸D69至氨基酸K292缺失一部分HA1来移除HA的头部。
此等残基可经3或4个Gly置换。4Gly连接子由Steel及同事测试，且得到良好表达结果，且被此处采用以建立微型H3(SEQ ID NO:90)。为了防止多肽链裂解(全长HA蛋白质的正常翻译后处理步骤)，将位置345处的裂解位点(精氨酸)突变成谷氨酰胺(R345Q)。
接着，藉助于Brugel计算经构建的微型HA及融合后构象中各残基的可及表面积。测定各残基的暴露及隐藏程度，如Samantha及同事(Samantha等人，2002)中所述。测定集中于在融合前构象中暴露且在融合后构象中隐藏的残基。此等残基的进一步分析指示一些此等残基可以一定方式修饰，该方式使得突变对融合前构象不具有作用，但使融合后构象不稳定。此等残基通常具有疏水性侧链且参与形成融合后构象中的卷曲螺旋。使此等残基突变成包含亲水性侧链将扰乱卷曲螺旋性质(卷曲螺旋中螺旋之间的接触通常为疏水性)，且因此使融合后构象不稳定。自在融合构象前中暴露至在融合后构象中隐藏且预期突变后对后者构象具有去稳定作用的残基为L397、I401及L425(编号根据SEQ ID NO:89)。此处包括L397K及I401T。
使螺旋A(残基383至400)与中心螺旋CD(残基421至470)连接的环(B环，残基401至420)一旦采用融合后状态即改变构象；其变为螺旋且成为扩大的三聚卷曲螺旋的一部分。为了使此连接子的融合前环构象稳定和/或使融合后构象不稳定，推断使参与卷曲螺旋核心形成的所有残基突变应足够。对于位置N405，设计数种突变，尤其携带负电荷(Asp及Glu，N405D、N405E)的残基，因为此额外电荷将增强在融合前构象中观察到的离子网络。此研究中亦包括突变成中性Ala(N405A)。我们亦使Phe408突变成Thr、His409突变成Ser及Val418突变成Ser(编号根据SEQ ID NO:89；F408T、H409S、V418S)，以在移除头部域之后进一步增强新暴露表面的溶解度。
设计五个二硫桥键以将HA锁定为融合前构象。此等桥连基形成于在空间上彼此相隔适当距离的残基之间，且这些残基使其已在正确位置处的Cβ原子形成二硫桥键。其在位置320与406(A320C、E406C；编号根据SEQ IDNO:89)之间、326与438(K326C、S438C)之间及在415与423(F415C、Q423C)之间引入。前两者在链的HA1与HA2部分之间交联，而最后一者以共价方式将B环顶部连接在一起。K326C、S438C二硫桥键伴随有Asp 435突变成Ala(D435A)。二硫桥键F347C/N461C及S385C/L463C获自Bommakanti等人(2010)的论文且亦用于此研究中。
为了自溶剂移出新暴露的疏水性残基，设计数种其他突变。将位置67(编号根据SEQ ID NO:89)处的Ile突变成Thr(I67T)。此突变维持侧链的β分支，但自表面移除疏水性残基。同样适用于Ile 298突变成Thr(I298T)。在位置316处(天然序列中的异亮氨酸)引入另一突变。直观地，我们将提出使此残基突变成Thr维持β分支但自表面移除疏水性。然而，此突变将引起额外N-糖基化位点(位置314为Asn)的引入，且因此引入成为Gln的突变(I316Q)。
Gly495亦突变成Glu(G495E)。此突变经设计以引入离子桥，因为在环境中存在正电荷。自然已在此位置处提供某些H3病毒株以Glu。
HA的重要残基为位置345(Arg)，因为此位置为发生蛋白酶裂解使得能够蛋白融合的位置。此Arg突变成Gln(R345Q)防止裂解发生，藉此将蛋白锁定为融合前状态。
如下文所述将上述突变分聚簇：
聚簇1：I67T、I98T、I316Q、F408T、H409S、V418S
聚簇2：A320C、E406C
聚簇3：K326C、D435A、S438C
聚簇4：L397K、I401T
聚簇5：N405D或N405E或N405A
聚簇6：F415C、Q423C
聚簇7：G495E
聚簇8：F347C、S385C、N461C、L463C
为了得到本发明的多肽，根据下文所述流程，使聚簇与缺失D69至K292及R345Q突变组合。
H3微型HA聚簇1(SEQ ID NO:91)
H3微型HA聚簇1+2(SEQ ID NO:92)
H3微型HA聚簇1+3(SEQ ID NO:93)
H3微型HA聚簇1+4(SEQ ID NO:94)
H3微型HA聚簇1+5N405A(SEQ ID NO:95)
H3微型HA聚簇1+5N405D(SEQ ID NO:96)
H3微型HA聚簇1+5N405E(SEQ ID NO:97)
H3微型HA聚簇1+6(SEQ ID NO:98)
H3微型HA聚簇1+7(SEQ ID NO:99)
H3微型HA聚簇1+2+3+4+5+6+7-N405E(SEQ ID NO:100)
H3微型HA聚簇1+2+3+4+5+6+7-N405A(SEQ ID NO:101)H3微型HA聚簇1+2+3+4+5+6+7-N405D(SEQ ID NO:102)
H3微型HA聚簇1+8(SEQ ID NO:103)。
合成编码上述蛋白质序列的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。出于比较原因，将H3A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的全长HA序列以及含有裂解位点突变R343Q的H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA序列包括于实验中。
使用40μl 293transfectin作为转染试剂用表达载体(1μg/ml)转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞(106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞，等分试样(0.3ml，约3×105个细胞)，且将等分试样以针对H3 HA产生的多克隆血清(Protein Sciences Corp,Meriden,CT,USA)处理以探查表达或以HA特异性单克隆抗体(5微克/毫升)及用于染色的二级抗体处理。随后，使用针对H3 HA或H1 HA产生的多克隆血清，针对膜连接的本发明的HA主干域多肽的表达，藉由荧光结合细胞分选(FACS)分析细胞以探查表达。将具有结合全长蛋白质的已知特异性的单克隆抗体小组(CR8020、CR8043及CR9114)用于探查保守抗原决定基的存在，且根据推理探查全长HA及本发明的微型HA多肽的正确折叠。单克隆抗体CR6261(已知不结合至H3HA)及CR8057(结合至来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的HA的头部域)亦包括于实验中。结果表示为阳性细胞百分比，且展示于图8中。
结果展示所有构建体均表达于细胞表面上，因为与对于未经转染的细胞的4％以下相比，与H3多克隆血清的反应引起所分析的全部细胞对于基于H3的序列80％至90％及对于全长H1序列50％以上为阳性。使用抗H1多克隆，除接近100％的全长H1序列以外，全部细胞的60％至70％为阳性。不存在IgG、仅使用经标记的抗人或抗兔IgG的对照实验均为阴性的。A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005及A/布里斯班(Brisbane)/59/2007全长HA蛋白均由已知能够中和两种病毒株的单克隆抗体CR9114识别。A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005全长HA另外结合CR8020、CR8043及CR8057(仅结合至某些H3病毒株，描述于WO 2010/130636中)而非CR6261(Throsby等人(2008)；WO 2008/028946)。对于来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA而言，事实恰恰相反：其结合至CR6261而非CR8020、CR8043及CR8057。
如由图8中缺乏背景以上的信号表明，如SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:103中所述的多肽在任何这些情况下均不能够结合至CR8020、CR8043及CR9114。因此推断出此等序列不呈现此等抗体的抗原决定基，且因此如呈现于细胞膜上的蛋白不折叠成其天然3维结构。
实例12：基于H3 HA设计包含CR8020、CR8043及CR9124的保守主干域抗原决定基的其他主干域多肽
在此实例中，描述基于血清型H3设计本发明的其他多肽。将H3流感病毒A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ ID NO:89)及A/香港(HongKong)/1/1968(SEQ ID NO:121)的HA用作亲本序列。
序列中的第一个修饰为藉由使R突变成Q(R345Q)来移除位置345(编号参考SEQ ID NO:89)处的裂解位点，以防止自HA0形成HA1及HA2。任选地可再缺失残基347至351(IFGAI，融合肽的一部分)，以使疏水性残基对水性溶剂的暴露降至最低。裂解处的正电荷在H3中100％保守，且此突变可因此应用于所有序列中。
第二个修饰为藉由以下方式移除头部域：使HA1序列的较大部分缺失，且经由较短连接子使N端及C端序列再连接。缺失长度可变化，但优选地HA1的N端序列的最后一个残基与C端序列的第一个残基在空间上紧靠在一起以避免经由连接序列引入病毒株。在H3序列中，可在S62至P322(微型2；SEQ IDNO:105)、S63至P305(微型3；SEQ ID NO:119)及T64至T317(微型4；SEQID NO:120)(等效位置)处引入缺失。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置63、64、65、66、67(等效位置)处开始来减少缺失中的残基数目，或藉由在位置57、58、59、60或61处切割来增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置317、318、319、320或321(等效位置)处，或在位置323、324、325、326或327(等效位置)处以增加缺失长度。重要的是认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较长连接子匹配且反之亦然。此等多肽亦包括于本发明中。
头部域的缺失留下现暴露于水性溶剂的残基400至420之间的B环。在H3HA中，此环高度保守(参见表9)。共同序列为：401 I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421(SEQ ID NO:104；编号参考SEQ IDNO:89)。为了增加此环的溶解度以用于呈融合前构象的本发明的多肽且使融合后构象不稳定，一些疏水性残基必需修饰成极性(S、T、N、Q)、带电荷的氨基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突变成G来增加柔性。特定言之，在位置401、408、411、415、418(编号参考SEQ ID NO:89)处的突变将有助于本发明的多肽的稳定性。
对于位置F408及F415，优选地突变成S，但其他极性(T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置411(I)，优选地突变成T；其他极性(S、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用且因此亦包括于本发明中。对于位置418(V)，优选地突变成G。其他极性(S、T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)将具有相同作用且因此亦包括于本发明中。对于位置401(I)，优选地突变成R，但其他极性(S、T、N、Q)、带电荷的(H、K、D、E)或柔性(G)残基亦为可能的。因此，本发明的多肽含有上述突变中的至少一者。亦可能为一个以上突变的组合，如例如SEQ ID NO:123至SEQID NO:127及SEQ ID NO:129至SEQ ID NO:131中所示。
为了使本发明的多肽的融合前构象稳定，在于一级序列中远离但在折叠的融合前构象中接近的两个部分之间引入共价键。为此，二硫桥键在本发明的多肽中经工程化，优选地在H3A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQID NO:89)中的位置326与438(等效位置)之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。藉由使此等残基突变成半胱氨酸，可在H3A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(SEQ ID NO:89)中的位置334与393(等效位置)之间建立替代性半胱氨酸桥连基。在一些情况下，将在位置321(等效位置)处的半胱氨酸修饰成甘氨酸以避免形成不当二硫桥键。
天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。在位置421至441(等效位置)处引入用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE。为了避免妨碍在位置326与438之间形成二硫桥键，亦使用在位置421至435(等效位置)处的替代性较短序列IEAIEKKIEAIEKKI。一种替代方案为在位置421至441处引入来源于GCN4且已知三聚的序列RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN或在位置421至435处引入较短序列RMKQIEDKIEEIESK。
本发明的多肽可含有HA的细胞内序列及跨膜域，以便所得多肽在表达于细胞中时呈现于细胞表面上。在其他实施例中，移除位置522至C端(等效位置)的细胞质序列及跨膜序列，以便在表达于细胞中之后产生分泌型(可溶性)多肽。一些其他残基任选地可藉由自523、524、525、526、527、528或529(等效位置)缺失序列而包括于可溶性蛋白质中。藉由引入已知形成三聚体结构的序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:143)(‘折叠子’序列)，任选地经由连接子连接，可使可溶性多肽进一步稳定。连接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记(HHHHHHH)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下添加连接子及his标记序列。
HA的重要残基为位置345(Arg)，因为此位置为发生蛋白酶裂解使得能够蛋白融合的位置。此Arg突变成Gln(R345Q)防止裂解发生，藉此将蛋白锁定为融合前状态。
如下文所述将上述突变分聚簇：
或在位置421至435处的RMKQIEDKIEEIESK
三聚体 在位置421至441处的IEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK
或在位置421至435处的IEAIEKKIEAIEKKI
使用来自H3N2 A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的全长HA的序列作为起点，将上述聚簇与S62至P322缺失组合(微型2；SEQ ID NO:105)以得到本发明的多肽。
SEQ ID NO:105：H3-微型2
SEQ ID NO:106：H3-微型2-cl9+10
SEQ ID NO:107：H3-微型2-cl9+11
SEQ ID NO:108：H3-微型2-cl9+10+11
SEQ ID NO:109：H3-微型2-cl9+10+11-三聚体(在位置421至441处的三聚体序列)
SEQ ID NO:110：H3-微型2-cl9+10+11-GCN4(在位置421至441处的GCN4序列)
SEQ ID NO:111：H3-微型2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO:112：H3-微型2-cl9+10+12
SEQ ID NO:113：H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(在位置421至435处的较短GCN4序列)
SEQ ID NO:114：H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚体(在位置421至435处的较短三聚体序列)
SEQ ID NO:115：H3-微型2-cl9+13
SEQ ID NO:116：H3-微型2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO:117：H3-微型2-cl9+10+11+13-GCN4(在位置421至441处的GCN4序列)
SEQ ID NO:118：H3-微型2-cl9+10+11+13-三聚体(在位置421至441处的三聚体序列)
此外，缺失S63至P305(微型3)及T64至T317(微型4)与聚簇9、10、11及14组合以建立本发明的多肽。
SEQ ID NO:119：H3-微型3-cl9+10+11+12+14
SEQ ID NO:120：H3-微型4-cl9+10+11+12+14
使用来自H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长HA的序列作为起点，将上述聚簇与S62至P322缺失组合以得到本发明的多肽
SEQ ID NO:121：H3全长A/香港(Hong Kong)/1/1968
SEQ ID NO:122：HK68 H3m2-cl9
SEQ ID NO:123：HK68 H3m2-cl9+10
SEQ ID NO:124：HK68 H3m2-cl9+10+11
SEQ ID NO:125：HK68 H3m2-cl9+10+12
SEQ ID NO:126：HK68 H3m2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO:127：HK68 H3m2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO:128：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚体(在位置421至435处的较短三聚体序列)
SEQ ID NO:129：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-三聚体(在位置421至441处的三聚体序列)
SEQ ID NO:130：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4(在位置421至435处的较短GCN4序列)
SEQ ID NO:131：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-GCN4(在位置421至441处的GCN4序列)。
合成编码上述蛋白质序列的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。出于比较原因，将H3 A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005和/或H3 A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长HA序列包括于实验中。
使用40μl 293transfectin作为转染试剂用表达载体(1μg/ml)转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞(106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞，等分试样(0.3ml，约3×105个细胞)，且将等分试样以针对H3 HA产生的多克隆血清(Protein Sciences Corp,Meriden,CT,USA)处理以探查表达或以HA特异性单克隆抗体(5微克/毫升)及用于染色的二级抗体处理。随后，使用针对H3 HA或H1 HA产生的多克隆血清，针对膜连接的本发明的HA主干域多肽的表达，藉由荧光结合细胞分选(FACS)分析细胞以探查表达。将具有结合全长蛋白质的已知特异性的单克隆抗体小组(CR8020、CR8043及CR9114)用于探查保守抗原决定基的存在，且根据推理探查全长HA及本发明的微型HA多肽的正确折叠。单克隆抗体CR6261(已知不结合至H3HA)及CR8057(结合至来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的HA的头部域)亦包括于实验中。结果表示为阳性细胞百分比，且针对基于A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的H3HA的序列展示于图9中，及针对基于A/香港(Hong Kong)/1/1968的H3HA的序列展示于图10中。
结果展示所有基于A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的构建体(图9)均表达于细胞表面上，因为与对于未经转染的细胞的5％以下相比，与H3多克隆血清的反应引起所分析的全部细胞的80％或80％以上为阳性。不存在IgG、仅使用经标记的抗人或抗兔IgG的对照实验均为阴性的。A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005全长HA由已知能够结合至此蛋白的单克隆抗体CR8020、CR8043、CR8057(仅结合至某些H3病毒株，描述于WO2010/130636中)及CR9114识别，而不由单抗CR6261识别。相比之下，大部分主干域多肽不由CR8020、CR8043或CR9114识别，其中有一些值得注意的例外。包含聚簇12突变的多肽由CR8020和/或CR8043识别。H3-微型2-cl9+10+11+12(SEQ ID NO:111)、H3-微型2-cl9+10+12(SEQ ID NO:112)、H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO:113)及H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚体(SEQ ID NO:114)展示由CR8020(阳性细胞百分比％在约10至60范围内)及CR8043(40％至70％)识别(由箭头指示)。在4种阳性构建体中，H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO:113)在此分析中展现最大反应。自平均荧光强度获得的相同结果展示于图B(图9)中。H3-微型2-cl9+10+11+12(SEQ ID NO:111)、H3-微型2-cl9+10+12(SEQ ID NO:112)、H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO:113)及H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚体(SEQ ID NO:114)在暴露于CR8020及CR8043并染色之后展现远在背景以上的平均荧光强度，其中H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ IDNO:113)的反应最高。基于来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的HA的多肽中没有一者能够识别CR9114。
图10展示所有基于A/香港(Hong Kong)/1/1968的构建体(图10)均表达于细胞表面上，因为与对于未经转染的细胞的5％以下相比，对于大多数构建体与H3多克隆血清的反应引起所分析的全部细胞的约40％至60％为阳性。不存在IgG、仅使用经标记的抗人或抗兔IgG的对照实验均为阴性的。在用多克隆血清处理之后来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长蛋白的阳性细胞百分比较低(约10％)，但自CR8020、CR8043及CR9114的结合获得的较强信号指示蛋白呈现于细胞表面上。CR8057并不识别基于A/香港(Hong Kong)/1/1968的序列，仅识别来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的全长蛋白。如由阳性细胞％(15％或15％以上)及明显在背景以上的MFI所指示，CR8020及CR8043识别四种构建体(含有聚簇12突变)，亦即HK68H3m2-cl9+10+12(SEQ ID NO:125)、HK68H3m2-cl9+10+11+12(SEQ ID NO:126)、HK68H3m2-cl9+10+11+12-三聚体(SEQ ID NO:128，在位置421至435处含有缩短的三聚体序列)及HK68H3m2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO:130，在位置421至435处含有较短GCN4序列)。针对HK68H3m2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO:130)获得最强信号(MFI)；此主干域多肽构建体亦展示对CR9114的可检测结合。
总之，我们已展示根据上述方法，可针对第2类群的血清型、尤其H3亚型的A型流感病毒获得本发明的主干域多肽。
实例13：包含保守主干域抗原决定基的可溶性主干域多肽的设计、表达及部分纯化
在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域，以便所得多肽在表达于细胞中时呈现于细胞表面上。在其他实施例中，移除HA2的位置523、524、525、526、527、528、529或530(或等效位置)至C端(编号根据SEQ ID NO:1)的细胞质序列及跨膜序列，以便表达于细胞中产生可用于例如疫苗的分泌型(可溶性)多肽。藉由引入已知形成三聚体结构的序列(亦称为’折叠子’)，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:143)，任选地经由连接子(例如GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)连接，可使可溶性多肽进一步稳定。连接子可任选地含有裂解位点以用于在根据普通技术人员所熟知的方案纯化后处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的组氨酸标记(6或7个连续的组氨酸)。在一些实施例中，在不存在折叠子序列的情况下，添加连接子及组氨酸标记。
根据本发明，来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA的位置530(编号根据SEQ ID NO:1)至HA2域的C端氨基酸的氨基酸序列经移除且由以下序列置换：包含较短连接子及组氨酸标记的EGRHHHHHHH(SEQ IDNO:81)。将此调换应用至：SEQ ID NO:44：H1-微型2-聚簇1+5+6-三聚体(产生SEQ ID NO 144：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-三聚体)；SEQ ID NO:45：H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(产生SEQ ID NO:145：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4)；SEQ ID NO:46：微型2-聚簇1+5+6(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)(产生SEQ ID NO:146：s-H1-微型2-聚簇1+5+6)；SEQ ID NO:47：微型2-聚簇11+5+6(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)(产生SEQ IDNO:147：s-H1-微型2-聚簇11+5+6)；SEQ ID NO:48：微型2-聚簇1+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)(产生SEQ ID NO:148：s-H1-微型2-聚簇1+5)。
类似地，出于比较原因，将调换应用至SEQ ID NO1：H1全长(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)，且此外藉由将精氨酸343修饰成谷氨酰胺(R343Q突变)来使HA裂解位点受损，得到SEQ ID NO:149：s-H1全长(R343Q)。此外，在HA1的N端与C端部分之间用不同连接子建立两种本发明的多肽：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:150)及s-H1-微型2-聚簇1+5+6-nl2(SEQ ID NO:151)。
合成编码上述蛋白质序列的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004neo中。根据此项技术中熟知的方案，使用293transfectin作为转染试剂，用表达载体转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞，且允许再增殖7天。藉由离心使细胞与培养基分离并丢弃，同时收集含有本发明的可溶性多肽的上清液以用于进一步处理。上清液藉由固定化金属亲和层析法在Ni-NTA管柱上纯化，以使本发明的经His标记的多肽结合至树脂并收集穿流液。用以下洗涤管柱：3至10管柱体积的20mM磷酸钠(pH7.4)、500mM NaCl、10mM咪唑(‘洗液’)；5至15管柱体积的20mM磷酸钠(pH7.4)、500mM NaCl、100mM咪唑(‘严格洗液’)，并用20mM磷酸钠(pH7.4)、500mM NaCl、500mM咪唑洗脱。在个别情况下，调适缓冲液组成或所用体积以提高纯度或产率，或使用线性梯度代替分段梯度。全程收集各部分并在SDS-PAGE及蛋白质印迹(Western blot)上分析，使用多克隆抗H1 HA血清用于检测(参见图11A至11H)。结果指示与起始物质相比，本发明的多肽在洗脱液中明显富集。
为了证实本发明的经纯化的多肽的正确折叠及功能性，针对单克隆抗体CR9114的结合测试制备物。为此，藉由向各孔中施加100微升的1μg/ml抗体溶液并在4℃下培育隔夜，将能够结合蛋白C端处的His标记(6或7个连续的组氨酸)的单克隆抗体涂布于标准96孔盘上。在移除过量溶液并洗涤之后，在室温下用150微升2％脱脂牛奶溶液将盘阻断1小时。移除阻断剂并洗涤之后，添加100微升的1μg/ml本发明的多肽溶液以及相应全长蛋白的胞外域(SEQID NO:149)，且在室温下培育2小时。移除过量的本发明多肽之后，以在2μg/ml与20μg/ml范围内变化的浓度添加单抗CR9114、单抗CR8020(阴性对照)或在兔中针对H1 HA产生的多克隆血清(阳性对照)，且在室温下培育2小时。使用此项技术中熟知的方案，经由HRP结合的抗人抗体检测结合。
结果(图12)展示单克隆抗体CR9114结合至本发明的经纯化的可溶性多肽以及全长胞外域(图12a)，而单克隆抗体CR8020不结合(图12b)。多克隆抗H1血清亦以极类似方式结合至本发明的多肽及全长胞外域(图12c)。因此，推断CR9114的广泛中和抗原决定基保留于本发明的多肽中，且考虑此抗原决定基的不连续性及构象本质，主干域已适当折叠且采用与天然全长HA中的构象等同或极相似的三维构象。
如由SDS-PAGE及蛋白质印迹结果确定，本发明的多肽的制备物的尺寸不均一。我们猜测该变化归因于个别蛋白质分子之间的蛋白糖基化模式中的变化。为了证实此猜测，在37℃下用3个单位的N-糖苷酶F(自天冬酰胺残基移除N连接的碳水化合物部分的酶)处理蛋白制备物的较小等分试样持续18小时且藉由SDS-PAGE及蛋白质印迹分析。结果(图13a及图13b)展示用N-糖苷酶处理使本发明多肽的扩散条带集中至在由氨基酸序列计算的预期分子量下的单一条带。由此明显表明所观察到的尺寸不均一性实际上产生于糖基化模式中的变化。
利用HP-SEC进一步表征本发明的多肽的制备物。为此，将体积在43与63μl之间的约40μg本发明的多肽(多肽浓度在0.64mg/ml与0.93mg/ml之间)施加至与多角度光散射检测器连接的Tosoh TSK-凝胶G2000 SWxl管柱中。结果展示于图14中。主峰由本发明的多肽产生(滞留时间约8分钟)，且与较大种类较好地分离，指示可达成进一步纯化。基于多角度光散射检测器的资料，视所研究的本发明多肽而定，主峰对应于分子量在50千道尔顿与80千道尔顿之间的分子种类(参见图9)。根据上述尺寸不均一性及多肽糖基化中的变化，以及结果对分子流体动力学形状的依赖性，此等数字应仅视为指示。
实例14：包含单克隆抗体CR9114、CR6261及FI6v3的保守主干域抗原决定基的可溶性主干域多肽的表达及部分纯化
为了获得本发明的多肽的高度纯的制备物，用含有编码s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)的基因的表达载体pcDNA2004转染HEK293F细胞。普通技术人员将理解在制造期间引导蛋白质转运的前导序列(或信号序列；例如对应于SEQ ID NO:145的氨基酸1至17)将不存在于分泌型最终多肽中。为此，藉由将HEK293F细胞(Invitrogen)在300g下旋降5分钟，且经由SF1000再悬浮于300mL预温热的FreestyleTM培养基来接种1.0×106个活细胞/毫升。在multitron培育箱中将此培养物在37℃、10％CO2下在110rpm下培育1小时。1小时后，将质体DNA移液于9.9mL Optimem培养基中，达至300mL培养物体积中1.0μg/ml的浓度。平行地，将440μL移液于9.9mLOptimem培养基中且在室温下培育5分钟。5分钟后，将质体DNA/Optimem混合物添加至/Optimem混合物中，且在室温下培育20分钟。培育后，向细胞悬浮液中逐滴添加质体混合物。在multitron培育箱中将经转染的培养物在37℃、10％CO2及110rpm下培育。在第7天，藉由离心(在3000g下30分钟)使细胞与培养基分离，同时在0.2μm瓶顶过滤器上过滤含有本发明的可溶性多肽的上清液以用于进一步处理。
为了验证存在本发明的多肽，使用针对用于检测的His标记的单克隆抗体，藉由蛋白质印迹分析上清液的较小等分试样(图15a)。在37kDa与50kDa之间的表观分子量下观察到数个条带，该表观分子量接近或高于基于蛋白的氨基酸组成计算的分子量。尺寸不均一性由糖基化模式中的变化引起，因为先前实验已展示用N-糖苷酶F处理此蛋白以自蛋白中移除所连接的N连接的聚糖，引起条带集中于预期分子量下。
使用广泛中和抗体CR6261、CR9114及FI6v3作为探针，藉由ELISA证实本发明的多肽上存在广泛中和抗原决定基。出于比较原因，在实验中亦包括单克隆抗体CR8020作为阴性对照；此抗体能够结合至来自第2类群(例如H3及H7 HA)而非来自第1类群(例如H1及H5 HA)病毒的HA分子。为此，藉由向各孔中施加100微升的1μg/ml抗体溶液并在4℃下培育隔夜，将能够结合蛋白C端处的His标记(6或7个连续的组氨酸)的单克隆抗体涂布于标准96孔盘上。在移除过量溶液并洗涤之后，在室温下用150微升2％脱脂牛奶溶液将盘阻断1小时。移除阻断剂并洗涤之后，添加100微升上清液并在室温下培育2小时。移除过量的本发明多肽之后，添加起始于5μg/ml浓度呈1:2稀释系列的单抗CR9114，并在室温下培育2小时。使用此项技术中熟知的方案，经由HRP结合的抗人抗体检测结合。观察到CR9114、FI6v3及在较低程度上CR6261明显结合至本发明的多肽，而对于CR8020未观察到反应，指示所观察到的结合对所测试的单克隆抗体具有特异性(图15b)。
出于纯化目的，向5ml His-截留管柱中施加250ml培养物上清液，用75ml洗涤缓冲液(20mM TRIS、500mM NaCl，pH7.8)洗涤，且用分段梯度的咪唑(10mM、50mM、100mM、200mM、300mM及500mM于洗涤缓冲液中)洗脱。层析图(16)展示多个峰，其中本发明的多肽在100mM咪唑(A峰)及200mM咪唑(B峰)下洗脱。收集两个峰，浓缩，并施加至尺寸排阻管柱以用于进一步纯化(Superdex200)。洗脱概况展示于图17a及图17b中。收集各部分并于SDS-PAGE上分析(图17c及图17d)。自A峰及B峰获得的部分3含有高度纯的本发明多肽。最终得到约10μg/ml的培养物上清液。经纯化的批次不含内毒素(以5mg/kg投药；<1EU/mg；Chromogenic LAL)且生物负载低于1CFU/50μg。
实例15：基于B型流感HA设计包含CR9114的保守主干域抗原决定基的主干域多肽
设计本发明多肽的上述程序亦应用于B型流感。在此实例中，描述基于自两种已知谱系的病毒株(亦即B/Florida/4/2006(B/Yamagata lineage)及B/Malaysia/2506/2004(B/Victoria lineage))采集的HA序列的本发明的多肽。普通技术人员将理解亦可能使用其他B型流感HA序列，因为这些序列较好地保守，尤其在干区中。因此，本发明亦涵盖根据以下描述自其他B型流感HA序列获得的多肽。
B/Florida(佛罗里达)/4/2006的HA序列中的第一个修饰为藉由使R(或在有限数目情况下为K)突变成Q(R361Q)来移除位置361(编号参考SEQID NO:132)处的裂解位点，以防止自HA0形成HA1及HA2。任选地可再缺失残基363至367(GFGAI，融合肽的一部分)，以使疏水性残基对水性溶剂的暴露降至最低。裂解处的正电荷在来自B型流感的HA中100％保守，且此突变可因此应用于所有序列中。
第二个修饰为藉由以下方式移除头部域：使HA1序列的较大部分缺失，且经由较短连接子使N端及C端序列再连接。缺失长度可变化，但优选地HA1的N端序列的最后一个残基与C端序列的第一个残基在空间上紧靠在一起以避免经由连接序列引入病毒株。在B序列中，可在B/Florida/4/2006(SEQ IDNO:132)的P51至I336(等效位置)处引入缺失(m2；SEQ ID NO:133)。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。
SEQ ID NO:133描述含有缺失P51至I332的该本发明多肽(m2；SEQ IDNO:133)。上述缺失确保由P51与N58之间及E306与I337之间的残基形成的非结构化区域亦得以移除；此举有益于本发明的多肽的总体稳定性。对来源于H1序列的本发明的多肽观察到类似作用(参见上文)。
头部域的缺失留下现暴露于水性溶剂的残基416至436之间的环。在B HA中，此环高度保守(参见表10)。共同序列为：LSELEVKNLQRLSGAMDELHN。
为了增加此环在融合前构象中的溶解度且使融合后构象不稳定，将一些疏水性残基修饰成极性(S、T、N、Q)、带电荷的氨基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突变成G来增加柔性。特定言之，在位置421、424、427、434(编号参考SEQ ID NO:132)处的突变将有助于本发明的多肽的稳定性。
对于位置V421及L427，优选地突变成T，但其他极性(S、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置424，优选地突变成S。其他极性(N、T、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置L434，优选地突变成G。其他极性(S、T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)将具有相同作用。制得含有上述突变中的至少一者的多肽。亦可能为一个以上突变的组合，如例如SEQ ID NO:134至SEQ ID NO:136中所示。
为了使本发明的多肽的融合前构象稳定，在于一级序列中远离但在折叠的融合前构象中接近的两个部分之间引入共价键。为此，二硫桥键在多肽中经工程化，优选地在来自B/Florida/4/2006(SEQ ID NO:134至SEQ IDNO:136)的HA中的位置K340与S454(等效位置)之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。自GCN4获得的支持三聚卷曲螺旋形成的序列在位置436至452(等效位置)处引入(RRMKQIEDKIEEILSKI(SEQ IDNO:135))或者在位置436至451处引入(RMKQIEDKIEEILSKI(SEQ ID NO:136))。
对于来自B/Malaysia/2506/2004(SEQ ID NO:137)的HA遵循相同程序以提供多肽。与来自B/Florida/4/2006的HA相比，如可在两种序列的比对中轻易看出，此HA具有插入于位置178处的另一天冬酰胺残基。因此，裂解位点在位置362处，且防止裂解的相应突变为R362Q。在此情况下移除头部区的缺失例如为P51至I337(m2；SEQ ID NO:138)。再次，序列的剩余部分可直接连接，或者可引入柔性连接子。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。
SEQ ID NO:138描述含有缺失P51至I332的该多肽(m2；SEQ IDNO:138)。上述缺失确保由P51与N58之间及E307与I338之间的残基形成的非结构化区域亦得以移除；此举有益于本发明的多肽的总体稳定性。对来源于H1序列的本发明的多肽观察到类似作用(参见上文)。
头部域的缺失留下现暴露于水性溶剂的残基L420至H436之间的环。在BHA中，此环高度保守(参见表x)。共同序列为：LSELEVKNLQRLSGAMDELHN。
为了增加此环在融合前构象中的溶解度且使融合后构象不稳定，将一些疏水性残基修饰成极性(S、T、N、Q)、带电荷的氨基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突变成G来增加柔性。特定言之，测试在位置422、425、428、435(编号参考SEQ ID NO:137)处的突变。
对于位置V422及L428，优选地突变成T，但其他极性(S、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置425，优选地突变成S。其他极性(N、T、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)及高度柔性氨基酸(G)将具有相同作用。对于位置L435，优选地突变成G。其他极性(S、T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)将具有相同作用。制得含有上述突变中的至少一者的多肽。亦可能为一个以上突变的组合，如例如SEQ ID NO:139至SEQ ID NO:141中所示。
为了使本发明的多肽的融合前构象稳定，在于一级序列中远离但在折叠的融合前构象中接近的两个部分之间引入共价键。为此，二硫桥键在本发明的多肽中经工程化，优选地在来自B/Malaysia/2506/2004(SEQ ID NO:139至SEQ ID NO:141)的HA中的位置K341与S455(等效位置)之间。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
如上所述，天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的大部分相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强稳定性。在主干域中，三聚藉由形成三聚卷曲螺旋基元来介导。藉由强化此基元，可产生较稳定三聚体。自GCN4获得的支持三聚卷曲螺旋形成的序列在位置437至453(等效位置)处引入(RRMKQIEDKIEEILSKI(SEQ IDNO:135))或者在位置437至452处引入(RMKQIEDKIEEILSKI(SEQ IDNO:136))。
藉由如上所述荧光结合细胞分选，针对CR9114的抗原决定基的存在，测试基于B型流感血球凝集素的多肽SEQ ID NO:133至SEQ ID NO:136及SEQ IDNO:138至SEQ ID NO:141。然而，针对此等构建体未观察到单抗CR9114的结合。
实例16：第三代HA主干域多肽的免疫原性
为了评估主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ ID NO:1)、微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)、微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)、微型2-聚簇1+5(SEQ ID NO:48)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ ID NO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)及微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天、第21天及第42天用50μg构建体+50μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。使用来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007及A/加利福尼亚(California)/07/2009病毒株的全长HA的重组胞外域(自Protein SciencesCorporation,Meriden,CT,USA获得)作为抗原，藉由Elisa分析血清。简言之，在4℃下用50ng HA涂布96孔盘隔夜，随后在室温下与阻断缓冲液(100μl PBS(pH7.4)+2％脱脂牛奶)一起培育1小时。用PBS+0.05％Tween-20洗涤盘，且自血清的20倍稀释液开始添加100μl在阻断缓冲液中的2倍稀释系列。使用HRP结合的山羊抗小鼠IgG，使用此项技术中公认的标准方案检测结合的抗体。效价与使用单抗3AH1 InA134(Hytest,Turku,Finland)的标准曲线相比，得出Elisa单位/毫升(EU/ml)。
由上述免疫程序诱导的对同源全长蛋白胞外域的IgG反应的时程展示于图18中。4周后，对用编码全长蛋白(SEQ ID NO:1)的DNA免疫的小鼠，已可观察到较高反应。如自在7周时增加的效价展示，反应藉由加强注射增强。用编码以下的DNA免疫引起中等效价：本发明的多肽微型2-聚簇11+5(SEQID NO:14)、微型2-聚簇1+5(SEQ ID NO:48)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ IDNO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)及微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)，如由第7周时的效价表明，这些中等效价在加强免疫后进一步增强。用编码微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)及阴性对照cM2的DNA免疫在此分析中不引起可检测反应。
图19展示在针对来自同源病毒株H1N1A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(图A)及异源病毒株H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009的全长血球凝集素的胞外域对个别小鼠进行首次免疫之后，在第7周时的IgG反应。由编码以下的DNA诱导的抗体同样较好地结合至自同源及异源病毒株获得的血球凝集素的胞外域：本发明的多肽微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)、微型2-聚簇1+5(SEQ ID NO:48)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ ID NO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)及微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)。相比之下，用编码全长蛋白(SEQ ID NO:1)的DNA免疫引起针对同源血球凝集素的较高效价(比对用编码本发明多肽的DNA免疫观察到的效价高一个数量级以上)，但引起针对异源血球凝集素的胞外域的较低效价。用编码微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)及阴性对照cM2的DNA免疫在此分析中不引起针对任一血球凝集素胞外域的可检测反应。
总之，针对以下产生的抗体能够识别全长血球凝集素：本发明的多肽微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)、微型2-聚簇1+5(SEQ ID NO:48)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ ID NO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)及微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)。其抗原决定基必定位于血球凝集素主干域上且在来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007与H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009的全长血球凝集素之间保守。
实例17：第三代HA主干域多肽微型2-聚簇1+5+6-GCN4的免疫原性
为了进一步评估本发明的主干域多肽的免疫原性，用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)的表达载体对小鼠进行小鼠一次免疫(初免)，且在三周时间间隔下用经纯化的蛋白s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)加强两次。出于比较原因，在三周时间间隔下对不同组进行三次免疫，用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)以及来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ ID NO:1)的表达载体免疫。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天时用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)的1000μg构建体+100μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)，及在第21天及第42天时用佐以10μgMatrix-M的s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145；100μg经纯化的蛋白)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内(i.m.)免疫。一组接受第2次及第3次皮下免疫，而另一组接受第2次及第3次肌肉内免疫。此外，第三组如上在第1天时用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)的100μg构建体+100μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)初免，且在第21天及第41天时接受佐以Montanide ISA-720(1:1v/v)的s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQIDNO:145；100μg经纯化的蛋白)的加强免疫。为了比较，在第1天、第21天及第42天时用佐以100μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)的编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)、来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ ID NO:1)或cM2的100μg构建体对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。
在第49天，进行最终取血且收集血清。使用来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007、H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009、H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004及H3N2 A/香港(Hong Kong)//1968病毒株的重组全长HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA获得)作为抗原，藉由ELISA分析血清。简言之，在4℃下用50ng HA涂布96孔盘隔夜，随后在室温下与阻断缓冲液(100μl PBS(pH7.4)+2％脱脂牛奶)一起培育1小时。用PBS+0.05％ Tween-20洗涤盘，且自血清的20倍稀释液开始添加100μl在阻断缓冲液中的2倍稀释系列。使用HRP结合的山羊抗小鼠IgG，使用此项技术中公认的标准方案检测结合的抗体。将效价与由结合至HA抗原的小鼠单克隆抗体的连续稀释液组成的标准曲线比较，且表示为ELISA单位/毫升(EU/ml)。图20展示在针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(图A)、异源病毒株H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009(图B)、异源亚型病毒株H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004(图C)及异源亚型病毒株H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968(图D)的全长血球凝集素的胞外域对个别小鼠进行首次免疫之后，在第7周时的IgG反应。藉由用编码本发明的多肽微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)的DNA免疫而诱生的抗体能够识别H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007、H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009及在较低程度上H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的HA。藉由用编码来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ IDNO:1)的DNA免疫而诱生的抗体极好地识别同源蛋白，但识别来自H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009的异源HA及来自H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的异源亚型HA较差，如由图17B及图17C中的较低效价表明。小鼠群组用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45；初免)的DNA免疫，随后用s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)蛋白加强免疫，展示针对自同源H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007、异源H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009及异源亚型H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004获得的HA的胞外域的较高效价。
图20D展示在第7周时针对来自H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA的胞外域的IgG反应。不同于自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(属于流感第1类群的病毒株)的HA获得的微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ IDNO:45)及s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)，H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968属于流感第2类群，且因此在系统发生学上远离用于设计此实验中所用的本发明多肽的亲本序列。用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)或来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA(SEQ ID NO:1)的DNA免疫三次并不引起针对此抗原的可由ELISA检测的IgG水平。相比之下，用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)的DNA免疫继而用经纯化的蛋白s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ IDNO:145)加强免疫两次，引起针对来自H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA的较高效价。此结果独立于所用免疫途径(亦即肌肉内相对于皮下)或添加至蛋白加强免疫中的佐剂(Matrix-M或Montanide ISA-720)获得。
总之，用本发明的多肽免疫可诱生能够识别来自广泛范围流感病毒株的HA的IgG，这些流感病毒株包括来自流感第1类群的同源、异源及异源亚型病毒株以及来自流感第2类群的病毒株。相比之下，用全长HA免疫引起针对同源病毒株的HA的较高效价、针对异源及异源亚型病毒株的较低效价、及在针对来自流感第2类群的病毒株的在检测限以下的IgG水平。
实例18：设计包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原决定基的其他主干域多肽
根据上述程序设计的本发明的多肽可经进一步修饰以增强稳定性。可引入这些修饰以在单聚和/或二聚物内增强本发明多肽的三聚形式的形成。如所述，天然HA以三聚体的形式存在于细胞表面上。使三聚体保持在一起的个别单体之间的许多相互作用位于头部域。移除头部之后，三级结构由此去稳定，且因此增强截断的分子中的单体之间的相互作用将增强三聚体形式的稳定性。三聚藉由形成三聚体来介导。藉由强化主干域中的卷曲螺旋基元，可获得较稳定三聚体形式。
根据本发明，可在H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007中的位置418至433(等效位置)处(编号根据SEQ ID NO:1)将用于形成三聚卷曲螺旋的共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO:83)引入本发明多肽中(SEQ IDNO:44)。或者，可将IEAIEKKIEAIEKKI(SEQ ID NO:85)引入419至433处(SEQ ID NO:49)，或将IEAIEKKIEAIEKK(SEQ ID NO:86)引入420至433处(SEQ ID NO:50)。一种替代方案为将来源于GCN4且已知三聚的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:84)引入位置419至433处(SEQ IDNO:45)。或者，可将MKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO:87)引入位置420至433处(SEQ ID NO:51)，或将RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO:88)引入位置417至433处(SEQ ID NO:52)。类似地，三聚体界面可藉由将M420、L423、V427、G430修饰成异亮氨酸来强化(SEQ ID NO:53)。
在某些实施例中，本发明的多肽含有H1 HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，移除HA2的位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的细胞质序列及跨膜序列，以便制造分泌型(可溶性)多肽。可如上所述使可溶性多肽进一步稳定。
描述连接子变异体
合成编码上述蛋白质序列(SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:46；SEQ IDNO:49至SEQ ID NO:53及SEQ ID NO:152至SEQ ID NO:157)的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。出于比较原因，将编码全长序列(SEQ ID NO:1)以及cM2的表达载体包括于实验中
使用40μl 293-transfectin作为转染试剂用表达载体(1μg/ml)转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞(106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞；等分试样(0.3ml，约3×105个细胞)，且将等分试样以针对H1 HA产生的多克隆血清处理以探查表达或以HA特异性单克隆抗体(5微克/毫升)及用于染色的二级抗体处理。随后，使用针对H1 HA产生的多克隆血清，针对膜连接的本发明的HA主干域多肽的表达，藉由荧光结合细胞分选(FACS)分析细胞以探查表达。将具有结合全长蛋白质的已知特异性的单克隆抗体小组(CR6261、CR9114、CR9020及CR8020)用于探查保守抗原决定基的存在，且根据推理探查全长HA及本发明的微型HA多肽的正确折叠。结果表示为阳性细胞百分比及平均荧光强度，且展示于图21中。
结果展示所有测试的变异体均表达于细胞表面上，如由来自多克隆抗H1血清的阳性反应证明。H3 HA特异性抗体CR8020并不识别实验中所包括的任何构建体，而CR9020(其结合至H1 HA的头部域)明显仅识别全长蛋白。本发明的所有多肽以及全长蛋白由CR6261及CR9114识别，指示相应抗原决定基以与野生型蛋白中相同的构象存在于本发明的多肽中。在螺旋CD(参见图1)中包括另一三聚基元的本发明多肽中，与含有SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:85及SEQ ID NO:86的共同三聚序列的SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50相比，含有GCN4来源的序列SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88的SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:52分别引起相等或较高反应(MFI)。
本发明的多肽中连接氨基酸52与321(编号参考SEQ ID NO:1)的连接子的组成变化并不在单克隆抗体CR6261及CR9114识别方面引起重大变化。当SEQ ID NO:46中的GGGG经HNGK置换，产生SEQ ID NO:152时，观察到最大变化，其引起对CR6261的反应稍微降低，但并不影响对CR9114的反应。移除连接子并引入SEQ ID NO:1的氨基酸53至56(SHNG)，亦即在无连接子的情况下在SEQ ID NO:46(产生SEQ ID NO:153)、SEQ ID NO:45(产生SEQ IDNO:154)或SEQ ID NO:50(产生SEQ ID NO:155)中建立本发明的多肽并未影响FACS分析中的反应，指示连接子序列并非至关重要。
SEQ ID NO:156藉由引入突变I337N、I340N及F352Y而自SEQ ID NO:46获得，而SEQ ID NO:157在位置353处含有另一突变，亦即I353N。此等突变并不在图21中所示的FACS分析中引起对CR6261及CR9114的反应的改良。
在某些实施例中，本发明的多肽含有HA的细胞内序列及跨膜域。在其他实施例中，移除HA2的位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2的C端(编号根据SEQ ID NO:1)的细胞质序列及跨膜序列，且任选地藉由引入已知形成三聚体结构的序列(亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO:143))置换，任选地经由连接子连接。连接子可任选地含有裂解位点以用于之后根据普通技术人员所熟知的方案处理。为了促进可溶性形式的纯化，可添加标记序列，例如经由较短连接子(例如EGR)连接的his标记HHHHHHH。根据本发明，HA2域的位置530(编号根据SEQ ID NO:1)至C端氨基酸的氨基酸序列可经移除并置换为SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82。
实例19：第三代HA主干域多肽的免疫原性
为了评估主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长H1(SEQ ID NO:1)、微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)、微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ ID NO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)、微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)、微型2-聚簇1+5+6-nl2(SEQ ID NO:153)、微型2-聚簇1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO:154)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO:51)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO:52)、微型2-聚簇1+5+6+12(SEQ ID NO:156)及微型2-聚簇1+5+6+12+13(SEQ IDNO:157)。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天、第21天及第42天用100μg构建体+100μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。使用来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007、H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009及H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004病毒株的重组全长HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA获得)作为抗原，藉由ELISA分析血清。简言之，在4℃下用50ng HA涂布96孔盘隔夜，随后在室温下与阻断缓冲液(100μl PBS(pH7.4)+2％脱脂牛奶)一起培育1小时。用PBS+0.05％Tween-20洗涤盘，且自血清的50倍稀释液开始添加100μl在阻断缓冲液中的2倍稀释系列。使用HRP结合的山羊抗小鼠IgG，使用此项技术中公认的标准方案检测结合的抗体。将效价与由结合至HA抗原的小鼠单克隆抗体的连续稀释液组成的标准曲线比较，且表示为ELISA单位/毫升(EU/ml)。
图22展示在针对来自同源病毒株H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(图A)、异源病毒株H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009(图B)及异源亚型病毒株H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004(图C)的全长血球凝集素对个别小鼠进行首次免疫之后，在第7周时的IgG反应。藉由用编码以下的DNA免疫诱生的抗体同样较好地结合至自同源H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007及异源H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009病毒株获得的血球凝集素的胞外域(图22A及图22B)：本发明的多肽微型2-聚簇11+5(SEQ IDNO:14)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ ID NO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQID NO:45)、微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)、微型2-聚簇1+5+6-nl2(SEQ ID NO:153)、微型2-聚簇1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO:154)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO:51)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t3(SEQ IDNO:52)、微型2-聚簇1+5+6+12(SEQ ID NO:156)及微型2-聚簇1+5+6+12+13(SEQ ID NO:157)。对微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ IDNO:45)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO:51)及微型2-聚簇1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO:154)观察到最高效价。相比之下，用编码全长蛋白(SEQ ID NO:1)的DNA免疫引起针对同源血球凝集素的较高效价(比对用编码本发明多肽的DNA免疫观察到的效价高一个数量级以上)，但引起针对异源血球凝集素的胞外域的较低效价(一个数量级以上)。用编码微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)及阴性对照cM2的DNA免疫在此分析中不引起针对任一血球凝集素胞外域的可检测反应。
针对来自H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的异源亚型血球凝集素的胞外域的效价(图22C)指示对微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO:51)的明显反应。在用编码微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)的DNA免疫之后，在4只小鼠中的2只中；及针对微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)、微型2-聚簇1+5+6-nl2(SEQ ID NO:153)、微型2-聚簇1+5+6-nl2s-GCN4(SEQID NO:154)，在4只小鼠中的1只中，亦获得可观察的效价。令人惊讶的是，我们亦在用编码微型3-聚簇11(SEQ ID NO11)及微型2-聚簇11+5(SEQ IDNO:14)的DNA免疫之后发现可检测效价。前一个构建体并不诱导针对同源及异源H1HA的任何可检测的抗体效价，而后者仅诱导中度反应(图22A及图22B)。此实验中所有构建体与H5HA的序列的比较预示推定线性抗原决定基定位于较长CD螺旋的膜远程处(参见图1)。SEQ ID NO:11中位置175处及SEQ ID NO:14中位置156处的蛋氨酸突变成异亮氨酸产生线性序列ERRIENLNKK(SEQ ID NO:11中的位置172至181；SEQ ID NO:14中的位置153至162)。此序列亦存在于来自H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的HA中，但不存在于来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007及H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009的HA中(其中相应序列分别为ERRMENLNKK及EKRIENLNKK)。
总之，针对以下产生的抗体能够识别全长血球凝集素：本发明的多肽微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)、微型2-聚簇1+5+6(SEQ ID NO:46)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)、微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ IDNO:152)、微型2-聚簇1+5+6-nl2(SEQ ID NO:153)、微型2-聚簇1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO:154)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO:52)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO:51)、微型2-聚簇1+5+6+12(SEQ IDNO:156)及微型2-聚簇1+5+6+12+13(SEQ ID NO:157)。此等抗体的抗原决定基必定位于血球凝集素主干域且在来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007与H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009的全长血球凝集素之间保守。经由用编码以下的DNA免疫而诱生的抗体亦能够识别来自H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的HA的胞外域：微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2(SEQ IDNO:51)、及在较低程度上微型2-聚簇11+5(SEQ ID NO:14)、微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:45)、微型2-聚簇1+5+6-nl(SEQ ID NO:152)、微型2-聚簇1+5+6-nl2(SEQ ID NO:153)、微型2-聚簇1+5+6-nl2s-GCN4(SEQID NO:154)及微型2-聚簇1+5+6+12(SEQ ID NO:156)。本发明的多肽微型3-聚簇11(SEQ ID NO:11)能够诱生识别来自H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的HA的胞外域的抗体。
实例20：设计包含CR6261及CR9114的保守主干域抗原决定基的主干域多肽的一般方法
基于上述结果，定义一般方法以自流感病毒HA0序列、尤其自血清型H1的流感HA0序列建立本发明的多肽。该方法包含以下步骤：
1.移除HA1与HA2之间的裂解位点。此举可藉由在P1位置处使R(在少数情况下为K)突变成Q来达成(参见例如Sun等人，2010对于裂解位点(SEQID NO:1中的位置343)的命名的解释)。优选地突变成Q，但S、T、N、D或E为替代方案。
2.藉由使来自SEQ ID NO:1的氨基酸53至320、或来自其他流感病毒的HA中的等效位置处的氨基酸缺失来移除头部域。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。序列的剩余部分可直接连接或者藉由引入柔性连接子来连接。连接子序列长度可为1至50个氨基酸。优选地为有限长度的柔性连接子(小于或等于10个氨基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或类似物。缺失长度亦可变化，例如藉由在位置54、55、56、57或58(等效位置)处开始缺失，或藉由在位置47、48、49、50、51或52处切割以增加缺失长度。类似地，最后一个欲缺失的氨基酸可在位置315、316、317、318或319(等效位置)处，或在位置321、322、323、324或325(等效位置)处以增加缺失长度。重要的是认识到，缺失长度的变化可藉由匹配连接子序列的长度来部分补偿，亦即较大缺失可与较长连接子匹配且反之亦然。本发明亦涵盖此等多肽。
3.增强由H1A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(SEQ ID NO:1)中的残基402至418(等效位置)形成的环(在A螺旋与CD螺旋之间)的溶解度，以使经修饰的HA的融合前构象的稳定性增强且使融合后构象不稳定。此环在H1序列中高度保守，如可在以下表6中看出。此举可例如藉由用亲水性对应物置换该环中的I、L、F或V残基来达成。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal或Muscle)比对序列来轻易地测定。突变成甘氨酸使融合后构象不稳定，因为此氨基酸的高度柔性引起欲利用HA序列的此部分形成的融合后螺旋的稳定性降低。描述血清型H1的流感HA的残基402至418之间的环的共同序列为(SEQ ID NO:17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本发明的多肽中，位置406、409、413和/或416(或其等效位置，如由序列比对测定)处的氨基酸为极性(S、T、N、Q)、带电荷的(R、H、K、D、E)或柔性(G)氨基酸。应注意到L416突变成S或T亦引入共同N-糖基化位点(共同序列为NX(S/T))。此位置天冬酰胺的糖基化将进一步增强此区域的溶解度。亦可能为此等位点处的突变的组合，例如SEQ ID NO:10及SEQ IDNO:14中的F406S、V409T、L416S。在一些情况下，优选地为恢复共同氨基酸的突变，例如其中V或M在位置404处(突变成T)，V在408(突变成A)或410(突变成G)处，或I在414处(突变成N)；具有此等特定氨基酸的序列的发生率极低。表征本发明的多肽的上述突变的概述在表6中给出。
4.在本发明的多肽中引入二硫桥键，优选地在H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007中的位置324与436(等效位置)的氨基酸之间；SEQ IDNO:13至SEQ ID NO:16。等效位置可由普通技术人员藉由使用适合的算法(诸如Clustal、Muscle等)比对序列来轻易地测定。藉由以下方式产生经工程化的二硫桥键：使空间上接近的至少一个(若另一者已为半胱氨酸)、但通常两个残基突变成半胱氨酸，其将自发地或藉由活性氧化在此等残基的硫原子之间形成共价键。
使用上述本发明的一般方法，建立基于以下的HA0序列的本发明的多肽：H1N1 A/加利福尼亚(California)/04/2009(SEQ ID NO:159)、H1N1 A/加利福尼亚(California)/07/2009(SEQ ID NO:56)、H1N1 A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934(SEQ ID NO:78)及H1N1 A/德克萨斯州(Texas)/36/1991(SEQ ID NO:64)。此外，使用来自H5N1 A/越南(Vietnam)/1203/2004的HA(SEQ ID NO:158)，将该方法应用于来自另一亚型(其为第1类群的一部分，亦即H5)的HA。
H1微型HA A/加利福尼亚(California)/07/2009(SEQ ID NO:160)藉由以下方式自H1 FL HA A/加利福尼亚(California)/07/2009(SEQ ID NO:56)建立：
1.移除裂解位点：突变R344Q(编号参考SEQ ID NO:56)。
2.使残基K53至P321缺失，且在D52与K322(编号参考SEQ ID NO:56)之间引入GGGG连接子
3.在A螺旋与CD螺旋之间的环(SEQ ID:NO:56中的残基403至419)中，在位置407、417处引入丝氨酸残基(F407S、L417S；编号参考SEQ IDNO:2)，在位置410处引入苏氨酸(V410T；编号参考SEQ ID NO:56)，及在位置414处引入甘氨酸残基(F414G；编号参考SEQ ID NO:2)
4.藉由使残基赖氨酸325及苏氨酸437突变成半胱氨酸(K325C、T437C；编号参考SEQ ID NO:56)来引入二硫桥键
5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQ置换419KRIENLNKKVDDGFLD434(编号参考SEQ ID NO:56)来引入另一稳定化元素。
基于来自A/加利福尼亚(California)/04/2009(SEQ ID NO:159)的全长HA的微型HA序列可以相同方式建立，且与H1微型HA A/加利福尼亚(California)/07/2009(SEQ ID NO:160)的序列一致。
类似地，H1微型HA A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934(SEQ ID:NO:161)藉由以下方式自H1 FL HA A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934(SEQID NO:78)建立
1.移除裂解位点：突变R343Q(编号参考SEQ ID NO:78)
2.使残基S53至P320缺失，且在D52与K321(编号参考SEQ ID NO:78)之间引入GGGG连接子
3.在A螺旋与CD螺旋之间的环(SEQ ID NO:78中的残基402至418)中，在位置406、416处引入丝氨酸残基(F406S、L416S；编号参考SEQ IDNO:78)，在位置409处引入苏氨酸(V409T；编号参考SEQ ID NO:78)，及在位置413处引入甘氨酸残基(F413G；编号参考SEQ ID NO:78)
4.藉由使残基精氨酸324及苏氨酸436突变成半胱氨酸(R324C、T436C；编号参考SEQ ID NO:78)来引入二硫桥键
5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQ置换418KRMENLNNKVDDGFLD433(编号参考SEQ ID NO:78)来引入另一稳定化元素。
H1微型HA A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934(SEQ ID:NO:161)与H1FL HA A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934(SEQ ID NO:78)之间的另一差异在位置397处，该位置397在全长蛋白(SEQ ID:NO:78)中为丝氨酸，但在SEQ ID:NO:161的本发明多肽中为苏氨酸(S397T突变)。此突变为A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934序列中天然产生的变化，且因此含有此突变的序列亦包括于本发明中。
H1微型HA A/德克萨斯州(Texas)/36/1991(SEQ ID NO:162)藉由以下方式自H1FL HA A/德克萨斯州(Texas)/36/1991(SEQ ID NO:64)建立
1.移除裂解位点：突变R344Q(编号参考SEQ ID NO:64)
2.使残基S53至P321缺失，且在D52与K322(编号参考SEQ ID NO:64)之间引入GGGG连接子
3.在A螺旋与CD螺旋之间的环(SEQ ID:NO:64中的残基403至419)中，在位置407、417处引入丝氨酸残基(F407S、L417S；编号参考SEQ IDNO:64)，在位置410处引入苏氨酸(V410T；编号参考SEQ ID NO:64)，及在位置414处引入甘氨酸残基(F414G；编号参考SEQ ID NO:64)
4.藉由使残基精氨酸325及苏氨酸437突变成半胱氨酸(R325C、T437C；编号参考SEQ ID NO:64)来引入二硫桥键
5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQ置换419 RRMENLNKKVDDGFLD434(编号参考SEQ ID NO:64)来引入另一稳定化元素。
H5微型HA A/越南(Vietnam)/1203/2004(SEQ ID NO:163)藉由以下方式自H5 FL HA A/越南(Vietnam)/1203/2004(SEQ ID NO:158)建立
1.移除裂解位点。由于H5 FL HA A/越南(Vietnam)/1203/2004(SEQID NO:158)含有多元裂解位点(341 RRRKKR 346)，故单一位点突变不足以防止蛋白质裂解。代之以，使341 RRRKK 345缺失且引入R346Q突变。
2.使残基K52至P319缺失，且在K51与K320(编号参考SEQ ID NO:158)之间引入GGGG连接子
3.在A螺旋与CD螺旋之间的环(SEQ ID:NO:158中的残基405至421)中，在位置409、419处引入丝氨酸残基(F409S、L419S；编号参考SEQ IDNO:158)，在位置412处引入苏氨酸(V412T；编号参考SEQ ID NO:158)，及在位置416处引入甘氨酸残基(F416G；编号参考SEQ ID NO:158)
4.藉由使残基赖氨酸323及苏氨酸439突变成半胱氨酸(K323C、T439C；编号参考SEQ ID NO:158)来引入二硫桥键
5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQI置换421RRIENLNKKMEDGFLDV437(编号参考SEQ ID NO:158)来引入另一稳定化元素。
合成编码以下的蛋白质序列的基因：SEQ ID:NO:56、SEQ ID:NO:160、SEQ ID:NO:78、SEQ ID:NO:161、SEQ ID:NO:162、SEQ ID:NO:158及SEQID:NO:163，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。出于比较原因，将H3 A/香港(Hong Kong)/1/1968(SEQ ID NO:121)的全长HA序列以及具有另一裂解位点突变R343Q的H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA序列(SEQ ID NO:1)包括于实验中。
使用40μl 293 transfectin作为转染试剂用表达载体(1μg/ml)转染HEK293F(Invitrogen)悬浮细胞(106个细胞/毫升，30ml)，且允许再增殖2天。收集细胞，等分试样(0.3ml，约3×105个细胞)，且将等分试样以针对H1 HA产生的多克隆血清(Sino Biological Inc.北京(Beijing)，China)处理以探查表达或以HA特异性单克隆抗体(5微克/毫升)及用于染色的二级抗体处理。随后，针对细胞表面上膜连接的本发明的HA主干域多肽的表达，藉由荧光结合细胞分选(FACS)分析细胞。将具有结合全长蛋白质中的主干域的已知特异性的单克隆抗体小组(CR6261、CR9114)用于探查保守抗原决定基的存在，且根据推理探查全长HA及本发明的微型HA多肽的正确折叠。单克隆抗体CR8020(已知不结合至H1及H5 HA)及CR9020(结合至来自H1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的HA的头部域)亦包括于实验中。结果表示为阳性细胞百分比及平均荧光强度(MFI)，且展示于图23中。
用多克隆抗H1血清处理经转染的细胞产生针对全长HA(实心条)的20％至80％阳性细胞及针对微型HA的40％至50％阳性细胞。阴性对照FL H3 A/香港(Hong Kong)/1/1968及cM2仅展示极低数目的阳性细胞。平均荧光强度(下图)对映此结果，该平均荧光强度对于所有H1全长HA蛋白均展示明显可检测信号。对于全长H5 HA的信号仍然较低；然而，此现象可由经转染的细胞数目较低以及多克隆H1血清的识别较低来解释。阴性对照FL A/香港(HongKong)/1/1968及cM2展示在背景水平下的强度。
如由较高数目的阳性细胞(约50％至约95％)及较高MFI所指示，已知为较强第1类群干结合物的CR6261及CR9114识别所有第1类群全长HA及微型HA蛋白。由此较有力地表明此等抗体的中和抗原决定基存在于微型HA蛋白中，指示强烈类似全长HA中HA主干域的天然结构的三维结构。正如所料，阴性对照CR8020(对第2类群HA具有特异性)并不结合至H1及H5全长HA或H1及H5微型HA，指示所观测的CR6261/CR9114中和抗体对微型HA蛋白的结合并不因特异性蛋白间相互作用而产生。自阳性细胞百分比及MFI明显观察到来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长H3HA与CR9114或CR8020之间的结合，与先前观察一致，且证实此等单克隆抗体的功能性。类似地，阴性对照抗体CR9020(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的HA头部结合物)并不识别微型HA或全长HA蛋白(其中例外为来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的HA)，进一步强调所观察的CR6261与CR9114之间的结合特异性。
总之，已建立四种新颖HA来源的本发明的多肽，这些多肽已展示含有在HA头部域不存在的情况下由中和CR6261及CR9114抗体识别的抗原决定基。
实例21：本发明的多肽对抗小鼠中致命流感攻击的保护
为了测定本发明的多肽是否能够诱导保护小鼠在暴露于将致命的流感病毒后免于死亡的免疫反应，进行流感攻击实验。用编码以下的表达载体肌肉内对小鼠进行免疫：SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:45及SEQID NO:6以及含有另一R343Q突变以移除裂解位点的来自A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA(SEQ ID NO:1)。包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。根据以下研究方案，使用50μg表达构建体+50μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)进行免疫
研究方案
临床分数≥3的动物每日监测两次。
临床分数≥4或体温为32℃的动物，无论何者在先，均立即自研究中移除。
第70天 处死所有小鼠。
第1组至第6组：用PR8(A/波多黎各(Puerto Rico)8/34，H1N1)攻击
第1组：SEQ ID NO:78
第2组：SEQ ID NO:161
第3组：SEQ ID NO:1 R343Q
第4组：SEQ ID NO:45
第5组：SEQ ID NO:6
第6组：空载体
每组10只小鼠。总共60只小鼠。BALB/c。
材料及方法：
病毒株及来源：
流感病毒株PR8(A/波多黎各(Puerto Rico)8/34,H1N1)是源自Virapur(San Diego)。储备溶液1×108空斑形成单位/毫升(pfu/ml)批号E2004B。
储存条件：-75℃±10℃。冷冻器：-86℃ UCT冷冻器。Thermo Form.Fisher Scientific(飞世尔科技)。
动物：
小鼠，BALB/c(无特定病原体；SPF)，雌性。在研究第0天6至8周大，约17公克至19公克。来源于查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)，且利用‘耳朵识别法’来识别。使所有动物适应新环境，且在实验开始之前维持11天。
DNA投与
接种物复原的方法
制备如上列的适当DNA调配物，等分试样，且储存在-20℃下。在注射即将开始之前，每构建体解冻一份等分试样至室温，抽取至注射器中且注射。在完成各轮免疫的所有注射之后，丢弃各等分试样的剩余部分。
剂量水平及投与方法
小鼠藉由腹膜内注射以每公斤体重9.75mg Xylasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目录号：763.02)及48.75mg Ketasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目录号：668.51)麻醉。使用0.5ml注射器以G29针在各后腿的四头肌中肌肉内(i.m.)注射50μl DNA溶液，得到每小鼠注射100μl总体积。在完成各轮免疫的所有注射之后，丢弃各等分试样的剩余部分。
病毒投与：
接种物复原的方法
将病毒材料储存在-75℃±10℃下，且在投与之前除霜。一旦除霜，即针对A/PR/8/34攻击，对应于5LD50/50μl在冷PBS(4℃)中稀释材料。将经稀释的病毒保存在冰上，直至投与小鼠。
剂量水平及投与方法
动物藉由腹膜内注射以每公斤体重9.75mg Xylasol及48.75mg Ketasol麻醉，且使各动物藉由鼻内接受50μl病毒溶液。将未使用的材料送回实验室以用于反滴定。
抽血及血清制备
在以上研究方案中指定的天数下，采集血液样本(经由眼球后套管插入法中间取血：100μl至150μl，经由心脏穿刺末端取血：约300μl至500μl)。藉由在14000g下离心5分钟自此血液中分离血清，且储存在-20℃下直至在干冰上装运为止
临床评分
用评分系统在病毒攻击之后对临床体征评分(1分为健康小鼠；2分为小鼠展示不适的体征，包括轻微竖毛、步态略有改变及走动增多；3分为小鼠展示强烈竖毛、腹部收缩、步态改变、不活动阶段、呼吸速率增加及时有啰音()(吱吱(clicking)/沙沙(crackling)声)的体征；4分为小鼠的前一组特征增强，但展示几乎不活动且变得垂死；5分为死亡小鼠)。只要动物得到3分，即对其每日观察两次。由单个研究者进行评分，且具有部分由两个分数表示的症状的小鼠+/-0.5分。
称重
每日称重所有动物，在第48天开始(授权号2216)。在研究结束之前在死亡的情况下(亦即自研究移除时)亦称重动物。体重以公克(g)形式记录
病毒反滴定
所投与的病毒剂量藉由滴定来自完成动物接种之后剩余的接种物的8份复制样品来测定。在病毒反滴定中，根据‘Current Protocols in Immunology,Animal Models of Infectious Disease19.11.7’中概述的方案使用TCID50量度。
结果：
研究在无技术难度的情况下进行且与所定义的研究方案一致。流感病毒株PR8(A/波多黎各(Puerto Rico)8/34，H1N1)的接种物的反滴定产生以下TCID50：PR8(A/波多黎各(Puerto Rico)8/34，H1N1)：3.2×104TCID50/ml。
图24A展示此实验的卡本-麦尔(Kaplan-Meier)存活曲线。用编码本发明的多肽SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:161的DNA免疫分别引起经流感致死剂量感染的小鼠50％、40％及40％的存活率，指示用本发明的多肽免疫可实际上诱导保护性免疫反应。相比之下，用空载体对照免疫的动物均在病毒攻击8天后死于感染。用编码与攻击病毒株同源的全长HA(SEQ IDNO:78)的DNA免疫充分保护所有动物(亦即100％存活率)免于致命攻击，而用编码自含有另一裂解位点突变(R343Q；编号参考SEQ ID NO:1)的异源病毒株A/布里斯班(Brisbane)/59/2007获得的全长HA(SEQ ID NO:1)的DNA免疫引起经感染的动物90％的存活率。
自存活曲线获得的结果亦反映于展示于图24B及图24C中的各组的平均体重变化及临床分数中值中。用本发明的多肽SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:161免疫的动物展示至多25％至30％的体重损失，但在感染后第9天后存活的动物展示体重增加。对于用SEQ ID NO:45免疫的动物，亦观察到临床分数自4下降至3。用编码与攻击病毒株同源的全长HA(SEQ ID NO:78)的DNA免疫的动物并不展示体重损失，而用编码自含有另一裂解位点突变(R343Q；编号参考SEQ ID NO:1)的异源病毒株A/布里斯班(Brisbane)/59/2007获得的全长HA(SEQ ID NO:1)的DNA免疫的动物经历体重损失及临床症状，但幸存者完全恢复。对于用空载体免疫的对照组，观察到最高体重损失及临床症状，与此等动物无存活一致。
总之，本发明的多肽SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:78能够在小鼠中诱导对抗用H1N1 A/波多黎各(Puerto Rico)/8/1934致命攻击的保护性反应。应注意本发明的多肽SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:45是自与攻击病毒株异源的HA分子获得，而SEQ ID NO:78是自同源流感病毒株获得。因此，本发明的多肽可对抗同源及异源流感感染诱导保护。
实例22：选择代表性H1N1 HA序列小组并基于此等序列设计本发明的多肽。
为了展示实例20中所述设计方法的广泛可适用性，将该方法应用至选定HA0序列小组，这些HA0序列涵盖H1N1病毒中可见的多数百分比天然序列变异。此实例中自已知人类H1N1 HA序列池选择代表性HA序列小组的目的为选择具有最大代表性的最小数目病毒株。为了达成此目的，已定量流感病毒序列数据库中存在的人类H1N1流感病毒的HA序列之间的所有差异，此等差异中的结构已经研究且已鉴别同源子群。已自其中每一组选择最有代表性的序列来构成该小组。
程序中的第一步骤为定量所考虑的序列数据库中每一对序列之间的差异。采用反向PAM250(rPAM250)矩阵(Xu，2004)定量各氨基酸位置处的差异。采用欧几里德加成法(Euclidian addition)定量该成对序列的总差异。采用所有成对差异形成差异的对称的n×n矩阵，其中n等于所考虑的病毒株数目。
采用主坐标分析(PCA)建构该差异的矩阵(Higgins，1992)。PCA是依据维度降低。输入矩阵视为n维空间中的分布(其中n等于所考虑的病毒株数目)。随后分析并建构变异性，以便利用最小维度来涵盖最多(或所有)变异性。结果为m维坐标是(其中m为涵盖最多或所有变异性的维度数目)，其中最大变异在第一轴上且随后递减。所有考虑的序列均位于坐标之内。在仅需要2维或3维的情况下，结果可分别完整绘制成2D或3D图式，其中可观测到病毒株之间的差异。在需要较多维度的情况下，3D图亦可由前3个轴建构，但该图式并不涵盖所有变异性，因为一部分变异在第四维及较高维度中。
随后，使用分级及k均值聚簇法，使m维空间中的序列聚簇。组内平均联系用于获得具有类似内部变异性的组，且避免较大比例的单个病毒株形成聚簇。在所有层面下进行聚簇，起始于1(所有病毒株在一个聚簇中)直至n(各病毒株自身即形成聚簇)。自各聚簇选择最中心的病毒株作为最具代表性的病毒株。最中心病毒株组随后形成该层面聚簇的代表性病毒株小组。对于各聚簇层面，藉由与各病毒株至坐标是中心的平方距离的总和相比，计算各病毒株至其中心病毒株的平方距离的总和，来估算覆盖率(或所解释的变异的百分比)。随后将达成的最低层面覆盖率设置为代表小组的最小所需尺寸。
除Xu rPAM250矩阵以外，在两个序列之一在特定位置上具有空隙(归因于插入或缺失)时，针对差异分配较小值。权重因子亦包括于程序中，以顾及经过多年的分离株的数目上的较大差异。此变异视为部分发生真正的变异，部分受不同监督/知晓程度驱动。因此，权重因子设置为1除以特定年份中观察数目的平方根。在构建m维空间时、在聚簇分析及选择中心点期间及在估算所涵盖的变异程度时顾及此权重因子。
在此实例中，使用经构建的序列，其由针对本发明的多肽编码的HA的一部分组成。建立两组不同的经构建的序列。在第一组中，顾及除以下以外的天然序列：信号序列(例如氨基酸1至18)、氨基酸53至320(HA头部域)、跨膜序列(氨基酸530至C端氨基酸)(编号参考SEQ ID NO:1)或其他序列中此等位置的等效位置。在第二组中，亦不考虑位置406、409、416、324、436、413(或等效位置)处的氨基酸，因为此等氨基酸根据实例20中所述的一般方法经修饰。此外，亦不在第二组中考虑位置419至433(等效位置)，反映基于GCN4的稳定化序列在如实例9中所述的本发明的多肽中的添加。
使用上述方法，自涵盖75％序列变异的所选经构建的序列第1组选择7个HA序列，且自涵盖74％序列变异的经构建的序列第2组选择8个HA序列。病毒株列于表10中。三种所选序列出现于两个组中，因此剩余13种唯一的HA序列。此等序列用于根据实例20中所述方法设计本发明的多肽。此外，如实例9中所述，在位置419至433(编号参考SEQ ID NO:1)的等效位置处引入稳定化GCN4序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO:84)。基于H1N1 A/孟斐斯(Memphis)/20/1978及H1N1 A/USSR/92/1977的HA序列设计的本发明多肽与基于A/威斯康辛州(Wisconsin)/629-D01415/2009及H1N1 A/悉尼(Sydney)/DD3-55/2010的HA序列设计的本发明多肽一致。因此，设计总共10个唯一的本发明的多肽，且此等序列的比对展示于图25中。
将含有编码以下的DNA的表达载体用于转染HEK293F细胞：本发明的多肽SEQ ID NO:164至SEQ ID NO:173、以及基于A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的HA序列的本发明多肽SEQ ID NO:45、及在表达载体pcDNA2004中具有另一裂解位点突变R343Q的相应全长HA SEQ ID NO:1，且如前所述藉由FACS分析细胞。除人类单克隆抗体CR6261、CR9114及CR8020以外，实验中亦包括已知中和A型流感H1及H2病毒株的小鼠单克隆抗体C179(Okuna等人，1993)。结果展示于图26中。
本发明的所有多肽以及A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长序列均表达于细胞表面上，且由广泛中和抗体CR6261、CR9114及C179而非CR8020识别。后者已知仅结合来自A型流感第2类群的HA。抗体CR6261、CR9114及C179的结合指示广泛中和抗原决定基在本发明的多肽中较好地保留。考虑到涵盖于此等序列中的序列变异，此结果明显表明我们设计方法的一般可适用性，该设计方法用于产生含有广泛中和抗原决定基的本发明多肽。
实例23：本发明的多肽s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)的表征
如实例13中所述获得本发明的经纯化的多肽s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)。为了证实CR6261及CR9114的构象抗原决定基的存在，藉由生物层干涉术(Octet Red384,Forte Bio)研究此等抗体与经纯化的蛋白的结合。为此，在经抗生蛋白链菌素涂布的传感器上固定经生物素标记的CR6261、CR9114及CR8020，首先使传感器暴露于本发明的经纯化的多肽的溶液(250nM)以量测结合速率，且随后暴露于洗液以量测解离速率。出于比较原因，用呈三聚体及单体形式的全长蛋白(SEQ ID NO149)重复实验。结果展示于图27中。
在暴露于呈溶解状态的此等蛋白之后，如由明确反应表明，经固定的CR6261识别来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA的胞外域的单体及三聚体形式(图27A)。由较小尺寸单体引起(至少部分)的作用与三聚体相比，针对三聚体蛋白观察到的反应大于以相同序列针对单体观察到的反应(约1.3nm相对于0.9nm)。CR6261对s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)的结合引起约0.25nm的最大反应。在暴露于洗液后，观察到所有三种分析物的复合物的解离，其中对本发明的多肽s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)观察到的释放最快，且对于来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA(SEQ ID NO 149)的胞外域的三聚体形式最慢。
与CR6261相似，经固定的CR9114亦识别来自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的全长HA的胞外域的三聚体及单体形式以及本发明的多肽s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)。与CR6261相比，所有三种分析物的反应均较强(对于三聚体、单体全长HA(SEQ ID NO:149)及主干域多肽s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)分别为1.5nm、1.4nm及0.8nm)，且在使复合物暴露于洗涤缓冲液后，在所有三种情况下抗原释放极少或不可检测。对于CR8020，对任何分析物均未观察到反应，与此抗体的流感第2类群主干域特异性一致。
为了进一步表征CR6261及CR9114对经纯化的主干域多肽的结合，进行滴定。为此，使含有经固定的CR6261的传感器暴露于浓度分别为500nM、250nM、125nM、63nM、31nM、16nM及8nM的s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)溶液，且14000秒后记录最终反应。绘制随主干域多肽浓度而变的反应，且进行对稳态1:1结合模型的拟合，得到对于CR6261/主干域多肽复合物约190nM的解离常数Kd(图28A)。类似地，使经固定的CR9114修饰的传感器暴露于浓度分别为80nM、40nM、20nM、10nM、5nM、2.5nM及1.3nM的s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)，且在10800秒之后记录最终反应。拟合随主干域多肽浓度而变的最终反应，得到对于CR9114/主干域多肽复合物5.4nM的Kd值(图28B)。
总之，本发明的多肽s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(SEQ ID NO:145)能够结合广泛中和单克隆抗体CR6261及CR9114，证实此主干域多肽中存在相应中和抗原决定基。
实例24：本发明的多肽对抗小鼠中致命流感攻击的保护
为了测定本发明的多肽是否能够诱导保护小鼠在暴露于将致命的流感病毒后免于死亡的免疫反应，进行流感攻击实验。用编码以下的表达载体肌肉内对小鼠进行免疫：H3全长A/香港(Hong Kong)/1/1968(SEQ IDNO:121)、HK68 H3m2-cl9+10+11(SEQ ID NO:124)及HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4 SEQ ID NO:130。根据以下研究方案，使用50μg表达构建体+50μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)进行免疫
研究方案
临床分数≥3的动物每日监测两次。
临床分数≥4或体温为32℃的动物，无论何者在先，均立即自研究中移除。
第70天 处死所有小鼠。
第7组至第10组：用HK68(A/香港(Hong Kong)/1/68，H3N2)攻击
第7组：SEQ ID NO:121
第8组：SEQ ID NO:130
第9组：SEQ ID NO:124
第10组：空载体
每组10只小鼠。总共40只小鼠。BALB/c。
材料及方法：
病毒株及来源：
流感病毒株HK68(A/香港(Hong Kong)/1/68)由J.Katz教授(疾病控制与预防中心(Center for Disease Control and Prevention)，Atlanta(亚特兰大)，GA,USA)提供，继而由Virapur(San Diego)增殖。病毒已在小鼠肺中继代多次以增强在小鼠中的毒性。适用于此病毒的参考文献为：Frace等人，Vaccine1999；17:2237。储备溶液3×108pfu/ml。批号F1109A。
储存条件：-75℃±10℃。冷冻器：-86℃UCT冷冻器。Thermo Form.Fisher Scientific。
动物：
小鼠，BALB/c(无特定病原体；SPF)，雌性。在研究第0天6至8周大，约17公克至19公克。来源于查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)，且利用‘耳朵识别法’来识别。使所有动物适应新环境，且在实验开始之前维持11天。
DNA投与
接种物复原的方法
制备如上列的适当DNA调配物，等分试样，且储存在-20℃下。在注射即将开始之前，每构建体解冻一份等分试样至室温，抽取至注射器中且注射。在完成各轮免疫的所有注射之后，丢弃各等分试样的剩余部分。
剂量水平及投与方法
小鼠藉由腹膜内注射以每公斤体重9.75mg Xylasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目录号：763.02)及48.75mg Ketasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目录号：668.51)麻醉。使用0.5ml注射器以G29针在各后腿的四头肌中肌肉内(i.m.)注射50μl DNA溶液，得到每小鼠注射100μl总体积。在完成各轮免疫的所有注射之后，丢弃各等分试样的剩余部分。
病毒投与：
接种物复原的方法
将病毒材料储存在-75℃±10℃下，且在投与之前除霜。一旦除霜，即针对A/HK/1/68攻击，对应于10LD50/50μl在冷PBS(4℃)中稀释材料。将经稀释的病毒保存在冰上，直至投与小鼠。
剂量水平及投与方法
动物藉由腹膜内注射以每公斤体重9.75mg Xylasol及48.75mg Ketasol麻醉，且使各动物藉由鼻内接受50μl病毒溶液。将未使用的材料送回实验室以用于反滴定。
抽血及血清制备
在以上研究方案中指定的天数下，采集血液样本(经由眼球后套管插入法中间取血：100μl至150μl，经由心脏穿刺末端取血：约300μl至500μl)。藉由在14000g下离心5分钟自此血液中分离血清，且储存在-20℃下直至在干冰上装运为止。
临床评分
用评分系统在病毒攻击之后对临床体征评分(1分为健康小鼠；2分为小鼠展示不适的体征，包括轻微竖毛、步态略有改变及走动增多；3分为小鼠展示强烈竖毛、腹部收缩、步态改变、不活动阶段、呼吸速率增加及时有啰音(吱吱/沙沙声)的体征；4分为小鼠的前一组特征增强，但展示几乎不活动且变得垂死；5分为死亡小鼠)。只要动物得到3分，即对其每日观察两次。由单个研究者进行评分，且具有部分由两个分数表示的症状的小鼠+/-0.5分。
称重
每日称重所有动物，在第48天开始(授权号2216)。在研究结束之前在死亡的情况下(亦即自研究移除时)亦称重动物。体重以公克(g)形式记录。
病毒反滴定
所投与的病毒剂量藉由滴定来自完成动物接种之后剩余的接种物的8份复制样品来测定。在病毒反滴定中，根据‘Current Protocols in Immunology,Animal Models of Infectious Disease19.11.7’中概述的方案使用TCID50量度。
结果：
研究在无技术难度的情况下进行且与所定义的研究方案一致。流感病毒株HK68(A/香港(Hong Kong)/1/68，H3N2)的接种物的反滴定产生以下TCID50：HK68(A/香港(Hong Kong)/1/68)：1×103TCID50/ml。
图29展示如由ELISA测定的在第49天时针对来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA的胞外域的IgG反应。用编码本发明的多肽SEQ ID NO:124及SEQID NO:130的DNA免疫诱导针对H3 HA HK68胞外域的明显可检测反应，而对于空载体阴性对照未检测到反应。正如所料，对用H3全长A/香港(HongKong)/1/1968(SEQ ID NO:121)免疫观察到最高反应。
图30A展示此实验的卡本-麦尔存活曲线。用编码本发明的多肽SEQ IDNO:124及SEQ ID NO:130的DNA免疫分别引起经流感致死剂量感染的小鼠40％及20％的存活率，指示用本发明的多肽免疫可实际上诱导保护性免疫反应。相比之下，用空载体对照免疫的动物均在病毒攻击10天后死于感染。用编码全长HA(SEQ ID NO:121)的DNA免疫充分保护所有动物(亦即100％存活率)免于致命攻击。
自存活曲线获得的结果亦反映于展示于图30B及图30C中的各组的平均体重变化及临床分数中值中。用编码本发明的多肽SEQ ID NO:124及SEQ IDNO:130的DNA免疫的动物展示至多20％的体重损失，但在感染后第9天后存活的动物展示体重增加。用编码全长HA(SEQ ID NO:121)的DNA免疫的动物并不展示体重损失。对于用空载体免疫的对照组，观察到最高体重损失及临床症状，与此等动物无存活一致。
总之，本发明的多肽SEQ ID NO:124及SEQ ID NO:130为免疫原性的且能够在小鼠中诱导对抗用H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968致命攻击的保护性反应。
实例25：基于H3 HA的主干域多肽的设计及表征
为了进一步改良实例12中所述的主干域多肽，设计另一组构建体。设计将允许在位置53及334(T53C、G334C；聚簇16)及位置39及51(G39C、E51C；聚簇17)(编号参考SEQ ID NO:121)处形成稳定化二硫桥键的另外两组半胱氨酸突变。此外，将两个序列插入于位置420至421之间(亦即在较长CD螺旋的N端侧处)(参见图1)。插入序列已经设计使得其将促进三聚体分子中个别单体之间的单体间二硫桥键的形成。已设计两种不同序列，亦即NATGGCCGG(聚簇18)及GSGKCCGG(聚簇19)。聚簇18的序列亦包含在主干域多肽中引入糖基化位点的序列(亦即NAT)。在一些情况下，糖基化位点亦藉由突变成NAT在位置417至419处引入。
使用来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长HA的序列作为起点，使上述修饰与S62至P322缺失组合以得到以下主干域多肽：
SEQ ID NO:174：H3 HK微型2a-连接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-1
SEQ ID NO:175：HK68 H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+18+GCN4T
SEQ ID NO:176：HK68 H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+16+CG7-GCN4T
SEQ ID NO:177：HK68 H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+19+GCN4T
SEQ ID NO:178：HK68 H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T
SEQ ID NO:179：H3 HK68微型2a-连接子2+cl9_+10+12+GCN4T
合成编码上述蛋白质序列的基因，且使用普通技术人员一般已知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。藉由如上所述的荧光结合细胞分选分析细胞表面上的表达及单克隆抗体的结合。出于比较原因，实验中亦包括另外在裂解位点中含有R345Q突变的H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长HA(SEQ ID NO:121)、及SEQ ID NO:130(HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4)以及阴性对照cM2。
图31展示此实验的结果。如由对多克隆抗H3血清观察到的反应(MFI，图A；阳性细胞百分比，图B)表明，所有构建体均表达于细胞表面上。观察到CR8043及CR8020对SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:121及SEQID NO:130的结合，指示聚簇16的突变并不有助于使此等抗体的构象抗原决定基稳定。针对单抗CR9114，仅可观察到对SEQ ID NO:174：H3HK微型2a-连接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-1及在较小程度上SEQ ID NO:177：HK68H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T的在背景以上的结合。两种序列均在B环中含有另一糖基化位点，指示此修饰对CR9114的构象中和抗原决定基的稳定作用。
总之，我们已展示根据上述方法，可针对第2类群的血清型、尤其H3亚型获得本发明的主干域多肽。藉由在B环中引入糖基化位点，可达成此等主干域多肽的进一步稳定。本发明亦涵盖此等序列。
实例26：基于H3 HA的HA主干域多肽的免疫原性
为了评估主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的全长H3(SEQ ID NO:89)；SEQ ID NO:105：H3-微型2；SEQ ID NO:108：H3-微型2-cl9+10+11；SEQ IDNO:112：H3-微型2-cl9+10+12；SEQ ID NO:111：H3-微型2-cl9+10+11+12；SEQ ID NO:114：H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚体；SEQ ID NO:113：H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4；SEQ ID NO:119：H3-微型3-cl9+10+11+12+14；SEQID NO:120：H3-微型4-cl9+10+11+12+14。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天、第21天及第42天用50μg构建体+50μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。使用约10μg构建体+约2μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)及相同免疫流程，藉由基因枪投与阴性对照质体cM2。使用来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005及A/香港(Hong Kong)/1/1968的重组全长HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA获得)作为抗原，藉由ELISA分析血清。简言之，在4℃下用50ng HA涂布96孔盘隔夜，随后在室温下与阻断缓冲液(100μl PBS(pH7.4)+2％脱脂牛奶)一起培育1小时。用PBS+0.05％Tween-20洗涤盘，且自血清的50倍稀释液开始添加100μl在阻断缓冲液中的2倍稀释系列。使用HRP结合的山羊抗小鼠IgG，使用此项技术中公认的标准方案检测结合的抗体。将效价与由结合至HA抗原的小鼠单克隆抗体的连续稀释液组成的标准曲线比较，且表示为ELISA单位/毫升(EU/ml)。49天后使用来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005、A/香港(Hong Kong)/1/1968及A/Perth/16/2009的HA的ELISA结果分别展示于图32A、图32B及图32C中。自用包括于此实验中的编码主干域多肽的DNA免疫的小鼠获得的血清能够识别来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的同源全长HA，且其程度与来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的异源全长HA程度类似。相比之下，与来自A/香港(Hong Kong)/1/1968及A/Perth/16/2009的异源HA相比，自用来自A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005的全长HA(SEQ ID NO:89)免疫的小鼠获得的血清展示对同源HA的较高反应。
总之，数据展示自H3 HA获得的本发明的多肽能够诱导针对全长HA的免疫反应。
实例27：基于A/香港(Hong Kong)/1/1968的H3 HA的HA主干域多肽的免疫原性
为了评估主干域多肽的免疫原性，用编码以下的表达载体对小鼠进行免疫：来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长H3(SEQ ID NO:121)；SEQ IDNO:124：HK68 H3m2-cl9+10+11；SEQ ID NO:125：HK68 H3m2-cl9+10+12；SEQ ID NO:126：HK68 H3m2-cl9+10+11+12；SEQ ID NO:128：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚体；SEQ ID NO:130：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4。亦包括编码cM2的表达载体作为阴性对照。
在第1天、第21天及第42天用100μg构建体+100μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)对4只小鼠(BALB\c)的组进行肌肉内免疫。在第49天，进行最终取血且收集血清。使用约10μg构建体+约2μg佐剂(pUMCV1-GM-CSF)及相同免疫流程，藉由基因枪投与阴性对照质体cM2。使用来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的重组全长HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA获得)作为抗原，藉由ELISA分析血清。简言之，在4℃下用50ng HA涂布96孔盘隔夜，随后在室温下与阻断缓冲液(100μl PBS(pH7.4)+2％脱脂牛奶)一起培育1小时。用PBS+0.05％Tween-20洗涤盘，且自血清的50倍稀释液开始添加100μl在阻断缓冲液中的2倍稀释系列。使用HRP结合的山羊抗小鼠IgG，使用此项技术中公认的标准方案检测结合的抗体。将效价与由结合至HA抗原的小鼠单克隆抗体的连续稀释液组成的标准曲线比较，且表示为ELISA单位/毫升(EU/ml)。
49天后使用来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA的ELISA的结果展示于图33中。用包括于此实验中的编码主干域多肽的DNA免疫的小鼠获得的血清能够识别来自A/香港(Hong Kong)/1/1968的同源全长HA。正如所料，用编码全长HA的DNA免疫对同源HA蛋白引起较高抗体效价，而用编码cM2的阴性对照表达载体免疫并不诱导识别A/香港(Hong Kong)/1/1968的全长HA的抗体。
总之，数据展示自H3 HA获得的本发明的多肽能够诱导针对全长H3 HA的免疫反应。
实例28：基于能够诱生中和第1类群及第2类群流感病毒的抗体的H1 HA设计另一主干域多肽
实例4及6揭示基于H1序列的多肽，其稳定暴露广泛中和CR6261抗体的抗原决定基。鉴于CR6261专门中和来自系统发生第1类群的流感病毒，针对此抗原决定基设计的多肽可能不诱生对系统发生第2类群流感病毒的强烈反应。设计诱生这些广泛交叉中和抗体的本发明多肽的另一方式为：使用在抗原决定基中重要氨基酸的结构及生物化学特征方面较紧密类似于H3 HA序列的H1 HA序列变异体。基于类群特异性抗体及分子(CR6261、F10及HB36)与结晶的泛流感抗体FI6的结构之间的比较(Corti等人，2011)，我们发现第1类群-第2类群T49N(HA2)突变仅可在不引入空间碰撞的情况下由FI6提供。HA2的位置49处的天冬酰胺存在于NCBI流感数据库中的两种第1类群病毒中：A/猪/湖北(Hubei)/S1/2009(ACY06623)及A/猪/Haseluenne/IDT2617/2003(ABV60697)。因此，在一个实施例中，构成如实例4、6及9中揭示的本发明的基础的H1序列为此等含有N49的HA序列之一。或者，如实例4、6及9中所述的本发明的序列在HA2中的位置49处具有另一突变以使T变成N氨基酸。表7展示可用作本发明的多肽的起始序列的例示性H1HA序列的序列比对。
SEQ ID NO:180藉由突变T392N(编号参考SEQ ID NO:1)自SEQ IDNO:45获得，SEQ ID NO:1中的T392对应于如上所述HA2中位置49处的苏氨酸。合成编码本发明的此多肽的基因，且使用普通技术人员所熟知的方法克隆至表达载体pcDNA2004中。CR9114及CR6261的中和抗原决定基的存在由如上所述的荧光结合细胞分选证实。结果展示于图34中。SEQ ID NO:180的MFI与针对CR6261及CR9114结合对SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:1观察到的MFI相当，而CR9020(已知结合至全长HA分子的头部区)仅识别SEQ ID NO:1，且CR8020(对A型流感第2类群HA具有特异性)并不识别SEQ ID NO:180、SEQID NO:1或SEQ ID NO:45。阴性对照cM2不由此实验中所用的任何单克隆抗体识别。
总之，含有突变T392N的SEQ ID NO:180包含CR6261及CR9114的中和抗原决定基。
实例29：设计缺乏跨膜序列的本发明的另一多肽
呈天然形式的流感HA以三聚体形式存在于细胞或病毒膜上。在某些实施例中，移除细胞内及跨膜序列以便在表达于细胞中之后制造分泌型(可溶性)多肽。表达及纯化HA的分泌型胞外域的方法已经描述(参见例如Dopheide等人2009；Ekiert等人2009；Ekiert等人2011；Stevens等人2004；Stevens等人2006；Wilson等人1981)。普通技术人员将理解此等方法亦可直接应用于本发明的主干域多肽以便达成分泌型(可溶性)多肽的表达。因此，此等多肽亦涵盖于本发明中。
举例而言，在自第1类群流感病毒的HA序列获得的本发明多肽的情况下，本发明的可溶性多肽可藉由使残基514至C端(等效位置)(编号根据SEQID NO:1)的多肽序列缺失来建立。或者，可使其他残基包括于本发明的多肽中，例如藉由使自残基515、516、517、518、519、520、521或522的序列缺失。出于纯化目的，任选地可添加his标记序列(HHHHHH或HHHHHHH)，任选地经由连接子连接。连接子任选地可含有蛋白水解裂解位点以在纯化后移除his标记。可藉由引入已知形成三聚体结构的序列(诸如折叠子序列)来使可溶性多肽进一步稳定。如上所述获得的多肽亦涵盖于本发明中。
SEQ ID NO:181至SEQ ID NO:185展示自H1N1 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的HA序列获得的本发明的可溶性多肽的序列。类似地，SEQ IDNO:186至SEQ ID NO:187展示H3N2 A/香港(Hong Kong)/1/1968的HA序列的本发明可溶性多肽的序列。普通技术人员将理解可设计自例如H1、H3、H5亚型的其他A型流感疫苗病毒株的其他HA序列获得的本发明多肽的等效序列。普通技术人员亦将清楚C端6个组氨酸出于纯化目的连接。由于存在不使用此标记的其他纯化方法，故任选地选用6组氨酸序列，本发明中亦涵盖缺乏此纯化标记的序列。
表1.抗体的CDR区。SEQ ID NO在括号之间给出。
表2.如由ELISA及FACS量测，CR9114的交叉结合反应性。H1＝可溶性重组A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/1999 H1 HA；H3＝可溶性重组A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005 H3 HA；H5＝可溶性重组A/越南(Vietnam)/1203/04 H5 HA；H7＝可溶性重组A/荷兰(Netherlands)/219/2003 H7 HA；H9＝可溶性重组A/香港(Hong Kong)/1073/99 H9 HA；B＝可溶性重组B/Ohio/01/05 B型流感HA；Rabies＝狂犬病糖蛋白；PER.C6＝未经转染的PER.C6细胞(对照)；mH1＝PER.C6表达的A/新喀里多尼亚(NewCaledonia)/20/1999 H1 HA；mH3＝PER.C6表达的A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005 H3 HA；mH7＝PER.C6表达的A/荷兰(Netherlands)/219/2003H7HA；ND＝未完成。+＝结合(>10×背景)；+/-＝较低结合(2×至10×背景)；-＝无可检测的结合。
表3.CR9114的交叉中和活性；效价(以μg/ml指示)为如根据至少双重复实验的斯皮尔曼-卡伯法(Spearman-Karber method)测定的几何平均IC50值；>100＝并非在最高测试的浓度下(100μg/ml)中和。
表4.如由FACS分析的由经全长HA或微型HA构建体免疫的小鼠获得的血清的结合。数据依序为染色后阳性的细胞百分比的平均值(n＝4)及平均荧光强度(在括号中)。H1-FL(SEQ ID NO:1)、CL1(SEQ ID NO:3)、CL1+2(SEQ ID NO:4)及CL1+4(SEQ ID NO:6)。cM2为阴性对照。
| PE阳性％(几何MFI，n＝4) |
表5.标准氨基酸，缩写及性质
表6.使本发明的多肽稳定的H1共同序列402至418(SEQ ID NO:17)、其他天然变异及突变。亲本序列中的一或多个突变存在于本发明的多肽中。
表7.本发明的特定实施例的H1序列的序列比对
表9.使本发明的多肽稳定的H3共同序列401至421(SEQ ID NO:104)、其他天然变异及突变。亲本序列中的一或多个突变存在于本发明的多肽中。
表10.如由SEC-MALS测定的计算及实验分子量。计算分子量是基于本发明的经处理的多肽(亦即在前导肽已经裂解之后)的氨基酸组成。并未考虑由糖基化产生的附加质量。
| SEQ ID NO | 计算分子量(Da) | 实验分子量(kDa) |
| 144 | 29137 | 75 |
| 145 | 29257 | 50 |
| 146 | 29203 | 56 |
| 147 | 29119 | 60 |
| 148 | 29293 | 66 |
| 150 | 29411 | 64 |
| 151 | 29283 | 79 |
表11.
参考文献
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Xu & Miranker(2004)Bioinformatics8:1214-1221。
序列
SEQ ID NO 1：H1全长(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 2：微型HA(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 3：微型HA聚簇1(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 4：微型HA聚簇1+2(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 5：微型HA聚簇1+3(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 6：微型HA聚簇1+4(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 7：微型HA聚簇1+2+3(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 8：微型HA聚簇1+2+3+4(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 9：微型1聚簇11(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 10：微型2聚簇11(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 11：微型3聚簇11(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 12：微型4聚簇11(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 13：微型1聚簇11+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 14：微型2聚簇11+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 15：微型3聚簇11+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 16：微型4聚簇11+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 17：H1共同序列残基402至418(编号根据SEQ ID NO:1)
402 MNTQFTAVG KEFN(H/K)LE(K/R)418
>SC09-114 VH蛋白(SEQ ID NO:18)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
>SC09-114VL蛋白(SEQ ID NO:19)
SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL
>CR6261 VH蛋白(SEQ ID NO:20)
>CR6261 VL蛋白(SEQ ID NO:21)
>SC08-057 VH蛋白(SEQ ID NO:22)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYYADSVKGRFTISRHNSMGTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV
>SC08-057 VL蛋白(SEQ ID NO:23)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSGVSDRFSASRSGDTASLTVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI
SEQ ID NO:24(STEEL)
SEQ ID NO:31：H7全长(A/绿头鸭/荷兰(Netherlands)/12/2000)
SEQ ID NO:32：H7共同序列残基394至414(编号根据SEQ ID NO:31)
394 LI(E/D/G)KTNQQFELIDNEF(N/T/S)E(I/V)E(Q/K)414
SEQ ID NO:33：H7-微型2(A/绿头鸭/荷兰(Netherlands)/12/2000)
SEQ ID NO:34：H7-微型2-聚簇15
SEQ ID NO:35：H7-微型2-聚簇15+16
SEQ ID NO:36：H7-微型2-聚簇17
SEQ ID NO:37：H7-微型2-聚簇15+16+17
SEQ ID NO:38：H7-微型2-聚簇15+16+17+18
SEQ ID NO:39：H7-微型2-聚簇15+16+17+三聚体
SEQ ID NO:40：H7-微型5
SEQ ID NO:41：H7-微型5-聚簇15+16
SEQ ID NO:42：H7-微型5-聚簇17
SEQ ID NO:43：H7-微型5-聚簇15+16+17+18
SEQ ID NO:44：H1-微型2-聚簇1+5+6-三聚体
SEQ ID NO:45：H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4
SEQ ID NO:46：微型2-聚簇1+5+6(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:47：微型2-聚簇11+5+6(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:48：微型2-聚簇1+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:49：H1-微型2-聚簇1+5+6-三聚体2
SEQ ID NO:50：H1-微型2-聚簇1+5+6-三聚体3
SEQ ID NO:51：H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4t2
SEQ ID NO:52：H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4t3
SEQ ID NO:53：H1-微型2-聚簇1+5+6-Ile三聚体
SEQ ID NO:89：H3全长A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005
SEQ ID NO:90：微型H3
SEQ ID NO:91：微型H3聚簇1
SEQ ID NO:92：微型H3聚簇1+2
SEQ ID NO:93：微型H3聚簇1+3
SEQ ID NO:94：微型H3聚簇1+4
SEQ ID NO:95：微型H3聚簇1+5N60A
SEQ ID NO:96：微型H3聚簇1+5N60D
SEQ ID NO:97：微型H3聚簇1+5N60E
SEQ ID NO:98：微型H3聚簇1+6
SEQ ID NO:99：微型H3聚簇1+7
SEQ ID NO:100：微型H3聚簇1+2+3+4+5+6+7-N405E
SEQ ID NO:101：微型H3聚簇1+2+3+4+5+6+7-N405A
SEQ ID NO:102：微型H3聚簇1+2+3+4+5+6+7-N405D
SEQ ID NO:103：微型H3聚簇1+8
SEQ ID NO:104：H3共同序列残基401至421(编号根据SEQ ID No:1)
401 I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421
SEQ ID NO:105：H3-微型2
SEQ ID NO:106：H3-微型2-cl9+10
SEQ ID NO:107：H3-微型2-cl9+11
SEQ ID NO:108：H3-微型2-cl9+10+11
SEQ ID NO:109：H3-微型2-cl9+10+11-三聚体
SEQ ID NO:110：H3-微型2-cl9+10+11-GCN4
SEQ ID NO:111：H3-微型2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO:112：H3-微型2-cl9+10+12
SEQ ID NO:113：H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4
SEQ ID NO:114：H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚体
SEQ ID NO:115：H3-微型2-cl9+13
SEQ ID NO:116：H3-微型2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO:117：H3-微型2-cl9+10+11+13-GCN4
SEQ ID NO:118：H3-微型2-cl9+10+11+13-三聚体
SEQ ID NO:119：H3-微型3-cl9+10+11+12+14
SEQ ID NO:120：H3-微型4-cl9+10+11+12+14
SEQ ID NO:121：H3全长A/香港(Hong Kong)/1/1968
SEQ ID NO:122：HK68 H3m2-cl9
SEQ ID NO:123：HK68H3m2-cl9+10
SEQ ID NO:124：HK68 H3m2-cl9+10+11
SEQ ID NO:125：HK68 H3m2-cl9+10+12
SEQ ID NO:126：HK68 H3m2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO:127：HK68 H3m2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO:128：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚体
SEQ ID NO:129：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-三聚体
SEQ ID NO:130：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4
SEQ ID NO:131：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-GCN4
SEQ ID NO:132：B/Florida/4/2006全长HA
SEQ ID NO:133：FL4-06 B-m2
SEQ ID NO:134：FL4-06 B-m2-CL1+5
SEQ ID NO:135：FL4-06 B-m2-CL1+5-GCN4a
SEQ ID NO:136：FL4-06 B-m2-CL1+5-GCN4b
SEQ ID NO:137：B/Malaysia/2506/2004全长HA
SEQ ID NO:138：Mal2506-04B-m2
SEQ ID NO:139：Mal2506-04B-m2-CL1+5
SEQ ID NO:140：Mal2506-04 B-m2-CL1+5-GCN4a
SEQ ID NO:141：Mal2506-04 B-m2-CL1+5-GCN4b
SEQ ID NO:142：B型流感HA共同序列残基416至436
416 LSELEVKNLQRLSGAMDELHN436
SEQ ID NO:144：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-三聚体(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:145：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-GCN4(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:146：s-H1-微型2-聚簇1+5+6(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:147：s-H1-微型2-聚簇11+5+6(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:148：s-H1-微型2-聚簇1+5(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO 149：s-H1全长R343Q(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:150：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-nl(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007
SEQ ID NO:151：s-H1-微型2-聚簇1+5+6-nl2(A/布里斯班(Brisbane)/59/2007)
SEQ ID NO:152 H1微型2a-cl1+5+6_无_连接子(HNGK)
SEQ ID NO:153H1微型2a-cl1+5+6_无_连接子2s
SEQ ID NO:154 H1-微型2-cl1+5+6-无_连接子2s-GCN4
SEQ ID NO:155 H1微型2a-cl1+5+6_无_连接子2s-三聚体3
SEQ ID NO:156 H1微型2a-cl1+5+6-12
SEQ ID NO:157 H1微型2a-cl1+5+6-12+13
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNNPSNQSQGLFGAIAGYNEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQSTATGKEGNKSERRMENLNKKVDDGFIDIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO：158：H5 FL HAA/越南(Vietnam)/1203/2004
(使341RRRKK345缺失且引入R346Q突变)
SEQ ID NO：159：H1 FL HAA/加利福尼亚(California)/04/2009R343Q
SEQ ID NO：160：H1微型HAA/加利福尼亚(California)/07/2009
SEQ ID NO：161：H1微型HAA/波多黎各(PuertoRico)/8/1934
SEQ ID NO:162：H1微型HAA/德克萨斯州(Texas)/36/1991
SEQ ID NO:163：H5微型HAA/越南(Vietnam)/1203/2004
SEQ ID NO:164：mHA_H1N1_A_马里兰(Maryland)_12_1991
MKAILLVLLYTFTAANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSTKLRMATGLRNIPSIQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQSTATGKEGNHSERMKQIEDKIEEIESKQVWCYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDTCMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI＊
SEQ ID NO:165：mHA_H1N1_A_亨利(Henry)_1936
MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNIPSIQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQSTATGKEGNNSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI＊
SEQ ID NO:166：mHA_H1N1A/AA/马顿(Marton)/1943
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SEQ_ID_NO:_167：_mHA_H1N1_A_New_York_607_1995
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SEQ_ID_NO:_168：mHA_H1N1_A_New_Jersey_11_2007
SEQ_ID_NO:_169：mHA_H1N1_A_USSR_92_1977
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SEQ_ID_NO:_171：mHA_H1N1_A_弗吉尼亚州(Virginia)_UR06-0549_2007
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SEQ_ID_NO:_172：_mHA_H1N1_A_德克萨斯州(Texas)_UR0-0526_2007
SEQ_ID_NO:_173：_mHA_H1N1_A_悉尼(Sydney)_DD3-55_2010
SEQ_ID_NO:_174H3微型2a-连接子+cl9_+10+11+12+GCN4T_CG7-1
(A/HongKong/1/1968(H3N2)
SEQ_ID_NO:_175H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+18+GCN4T
(A/HongKong/1/1968(H3N2))
SEQ_ID_NO:_176H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+16+CG7-GCN4T
(A/HongKong/1/1968(H3N2))]
SEQ_ID_NO:_177H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+19+GCN4T
(A/HongKong/1/1968(H3N2))]
SEQ_ID_NO:_178H3微型2a-连接子+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T
(A/HongKong/1/1968(H3N2))]
SEQ_ID_NO：_179 H3_HK68_微型2a-连接子2+cl9_+10+12+GCN4T
SEQ_ID_NO：_180 H1-微型2-聚簇1+5+6+GCN4-T49N
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SEQ ID NO：181 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4-菠萝酵素
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SEQ ID NO：182 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4-菠萝酵素-折叠子
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SEQ ID NO：183 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4t2
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SEQ ID NO：184 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4t2-菠萝酵素
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SEQ ID NO：185 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4t2-菠萝酵素-折叠子
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SEQ ID NO：186 sH3HK微型2a-连接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-His
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SEQ ID NO：187 sH3 HK微型2a-连接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-折叠子-His
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Claims (21)
1.一种流感血球凝集素主干域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，该流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段的HA1N端主干区段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中该血球凝集素主干域多肽在HA1与HA2之间的接合点处可抵抗蛋白酶裂解，且其中连接HA2的A螺旋与螺旋CD的氨基酸序列中的一或多个氨基酸与野生型流感HA2域相比已突变，且其中该HA1域及该HA2域来源于选自由以下组成的组的A型流感病毒亚型：H1、H5及H3。
2.如权利要求1所述的多肽，其中该多肽不包含全长HA1域。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中该多肽经糖基化。
4.如权利要求1、2或3所述的多肽，其包含(a)HA1N端区段，该HA1N端区段包含HA1的氨基酸1至x，利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段，该HA1C端主干区段包含HA1的氨基酸y至末端，及(b)流感血球凝集素HA2域。
5.如权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中该多肽包含流感血球凝集素HA1和/或HA2域，该流感血球凝集素HA1和/或HA2域是基于来自包含H1亚型的HA的A型流感病毒的流感血球凝集素，且其中x＝46与60之间的任何氨基酸且y＝290与325之间的任何氨基酸。
6.如权利要求5所述的多肽，其中该多肽包含流感血球凝集素HA1和/或HA2域，该流感血球凝集素HA1和/或HA2域是基于来自包含H1亚型的HA的A型流感病毒的流感血球凝集素，该H1亚型选自由表7的A型流感病毒组成的组。
7.如权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中该多肽包含流感血球凝集素HA1和/或HA2域，该流感血球凝集素HA1和/或HA2域是基于来自包含H3亚型的HA的A型流感病毒的流感血球凝集素，且其中x＝56与69之间的任何氨基酸，且其中y＝292与325之间的任何氨基酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该HA1C端主干区段的C端氨基酸残基为除精氨酸(R)或赖氨酸(K)以外的任何氨基酸，优选地为谷氨酰胺(Q)。
9.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽在该HA1域和/或该HA2域中包含一或多个其他突变。
10.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽包含一或多个二硫桥键。
11.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽不包含信号序列。
12.如权利要求11所述的多肽，其包含HA1N端区段，该HA1N端区段包含HA1的氨基酸p至x，利用具有0至50个氨基酸残基的连接序列共价键联至HA1C端主干区段，该HA1C端主干区段包含HA1的氨基酸y至末端，及(b)流感血球凝集素HA2域，其中p＝成熟HA的第一个氨基酸。
13.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽不包含HA的细胞内及跨膜序列。
14.如权利要求13所述的多肽，其中该多肽不包含流感H1HA2域的C端部分，该C端部分跨越H1HA2的氨基酸残基520、521、522、523、524、525、526、527、528、529或530至C端氨基酸。
15.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽选择性结合至抗体CR6261和/或CR9114，且不结合至抗体CR8057。
16.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽选择性结合至抗体CR8020、CR843和/或CR9114，且不结合至抗体CR8057。
17.一种提供流感血球凝集素主干域多肽的方法，该方法包含以下步骤：
(a)提供流感HA0氨基酸序列；
(b)移除HA1与HA2之间的裂解位点；
(c)自该HA0序列中移除球状头部域的氨基酸序列；
(d)在使螺旋A的C端残基连接至螺旋CD的N端残基的氨基酸序列中引入一或多个突变；及
(e)在该HA主干域多肽中引入一或多个二硫桥键。
18.一种流感血球凝集素主干域多肽，其可利用如权利要求17所述的方法获得。
19.一种核酸，其编码如权利要求1至16中任一项所述的多肽。
20.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求1至16中任一项所述的多肽和/或如权利要求19所述的核酸分子。
21.如权利要求1至16中任一项的多肽、如权利要求19所述的核酸和/或如权利要求20所述的免疫原性组合物，其用作药物，尤其用作疫苗。
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