CN107592865B

CN107592865B - 中和流感病毒的拟肽化合物

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Publication number: CN107592865B
Application number: CN201680027488.4A
Authority: CN
Inventors: M·万东根; C·F·R·N·布伊克; W·B·G·舍彭斯; J·尤拉斯泽科; B·R·R·凯斯泰莱伊恩; P·J-M·B·拉布瓦松; B·勃兰登堡
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2016-05-10
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2036-05-10
Also published as: AU2016261299A1; MX2017014343A; US10738083B2; JP6921002B2; JP2018522819A; WO2016180826A1; BR112017024206A2; EA201792482A1; IL255542A; AU2016261299B2; CN107592865A; PH12017501943B1; US20180118788A1; AU2016261299A9; CA2985402A1; WO2016180826A8; PH12017501943A1; IL255542B; KR20180002713A; EP3294753A1

Abstract

本发明涉及能够结合和/或中和流感病毒，特别是系统发育组1的A型流感病毒的新颖拟肽化合物，并且涉及包含此类化合物的药物组合物。本发明还涉及拟肽化合物在流感病毒感染的诊断、预防和/或治疗中的用途。

Description

中和流感病毒的拟肽化合物

技术领域

本发明涉及医学领域。本发明涉及能够结合和/或中和流感病毒，特别是系统发育组1的A型流感病毒的新颖拟肽化合物，并且涉及包含此类化合物的药物组合物。本发明还涉及拟肽化合物在流感病毒感染的诊断、预防和/或治疗中的用途。

背景技术

季节性A型流感是一个重要的公共健康问题，每年在全球范围内危害超过250,000人，同时产生数百万的经济负担。大流行性流感在新的病毒出现时发生，并感染全球具有很少免疫力或没有免疫力的人群，甚至对人类健康构成更大的威胁；例如，1918年“西班牙流感”大流行造成了估计5千万人死亡。持续关注的是高致病性禽流感(HPAI)，其在感染的人群中已经显示了高于50％的死亡率。H5以及H7流感病毒在世界某些部分的家禽中流行。目前，这些病毒看起来不能在人与人之间轻易传播，但针对禽类H5的最新数据表明仅几个氨基酸的变化就足以使这种病毒能够在哺乳动物体内模型系统中通过气溶胶传播来扩散。

近来已经描述了能够广泛中和A型流感和/或B型病毒的抗体，例如CR9114(如披露于WO2013/007770中)、CR6261(披露于WO2008/028946中)、FI6(描述于以下文献中：Corti等人，Science[科学]333，850-856(2011))。已经显示了这些抗体与大量血凝素蛋白相互作用并中和广谱的流感株。由于其效力和广度，目前正在研发此类抗体用于治疗重症患者和对属于高风险群体的人的预防应用。然而，这类产品及其肠胃外给药的相对较高的成本预计将限制单克隆抗体在更大群体中的使用。

预防和/或治疗流感感染的其他目前可用的药剂也与严重的限制有关。抗病毒药物如神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)以及M2抑制剂金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)如果在感染晚期给药，效力有限，并且广泛使用可能导致抗性病毒株的出现。此外，奥司他韦在成人中的使用与恶心、呕吐、精神病学影响和肾脏事件等不良反应有关。

此外，流感疫苗的效力已经示出对于高危患者(老年人)来说不太理想，并且循环流感病毒的永久性抗原变化需要每年对流感疫苗配制品进行改变以确保流感疫苗株与循环流感株之间实现最相近的可能的匹配。

由于该蛋白质具有大的序列变异性，作为用于预防和/或治疗流感感染的替代性策略，作用于血凝素(HA)的新颖流感抗病毒药物的发现也受到了阻碍。因此，迄今为止所描述的血凝素配体仅显示对有限数量的密切相关的流感株有活性。

鉴于由A型流感病毒引起的呼吸系统疾病的严重程度、和季节性流行病的高的经济影响、以及针对大流行病的持续风险，存在对抗A型流感病毒具有广泛活性并且可以作为用于预防或治疗流感感染的药物使用的新型有效的抑制剂的持续需要。

发明内容

本发明提供了新颖拟肽化合物，这些拟肽化合物能够特异性结合至少两种A型流感病毒株的血凝素(HA)，所述A型流感病毒株包含来自系统发育组1的不同亚型的HA。在某些实施例中，这些化合物能够特异性结合包含H1亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H1N1流感病毒株，和包含H5亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H5N1流感病毒株。这些化合物中的至少一些能够中和包含来自系统发育组1的不同亚型的HA的至少两种A型流感病毒株。在某些实施例中，这些化合物能够特异性中和包含H1亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H1N1流感病毒株，和包含H5亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H5N1流感病毒株。

在某些实施例中，这些化合物具有以下序列：

Cap1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-X9-X10-Cap2

其中Cap1是包含具有N-末端阻断基的从0-10个残基的任何氨基酸序列；

X1是任何L或D-氨基酸；

X2是任何L-氨基酸；

X3是分子量低于200Da的脂肪族L-氨基酸；

X4是任何L-氨基酸；

X5是Tyr或L-酪氨酸类似物；

X6是Phe或L-苯丙氨酸类似物；

X7是任何带电的或中性的亲水性L-氨基酸；

X8是Trp或L-色氨酸类似物；

X9不存在或者是任何亲水性L-氨基酸；

X10是任何L-氨基酸；并且

Cap2是包含具有C-末端阻断基的从0-10个残基的任何氨基酸序列。

本发明进一步提供了环化拟肽化合物。在某些实施例中，这些化合物因此具有选自以下的序列：

并且

X1是任何L或D-氨基酸；

X2是任何L-氨基酸；

X3是分子量低于200Da的脂肪族L-氨基酸；

X4是任何L-氨基酸；

X5是Tyr或L-酪氨酸类似物；

X6是Phe或L-苯丙氨酸类似物；

X7是任何带电的或中性的亲水性L-氨基酸；

X8是Trp或L-色氨酸类似物；

X9不存在或者是任何亲水性L-氨基酸；

X10是任何L-氨基酸；并且

在又另一个方面，本发明提供了多聚、特别是二聚拟肽化合物。在某些实施例中，这些化合物因此具有以下序列：

X1是任何L或D-氨基酸；

X2是任何L-氨基酸；

X3是分子量低于200Da的脂肪族L-氨基酸；

X4是任何L-氨基酸；

X5是Tyr或L-酪氨酸类似物；

X6是Phe或L-苯丙氨酸类似物；

X7是任何带电的或中性的亲水性L-氨基酸；

X8是Trp或L-色氨酸类似物；

X9不存在或者是任何亲水性L-氨基酸；

X10是任何L-氨基酸；并且

本发明还提供了包含如本文所述的至少一种化合物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

本发明还涉及如本文所述的用于诊断、预防和/或治疗流感的化合物。

附图说明

图1：展示了针对衍生自三种流感株(A/加利福尼亚州/07/09(左)、A/新喀里多尼亚/20/99(中)、A/越南/1194/04(右))的HA的CP141037、CP141019和CP141099的结合曲线。一经注射增加量的化合物，将应答单位(RU)绘制为时间的函数。曲线是从SPR实验获得的迹线，并且覆盖的细黑线是1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型对数据的最佳拟合。

发明详述

在促成了本发明的研究中，新颖拟肽化合物是在具有特别是单克隆抗体CR6261、CR9114和FI6的HA复合物的结构数据指导下研发的。拟肽化合物(也称为“肽模拟物”)通常是设计用于模拟天然肽或蛋白质的小蛋白样分子。这些肽模拟物优选地具有以与天然肽相同的方式与其天然靶标结合的能力，并且因此应具有相同的生物学效应。进一步可能以这样的方式设计这些分子，使得这些分子显示与所述天然肽具有相同的生物学效应，但具有增强的性质，如更高的蛋白水解稳定性、生物利用度、选择性和/或效力。

已显示本发明的拟肽化合物至少对H1亚型的HA(例如H1N1流感病毒株A/加利福尼亚州/07/2009和A/新喀里多尼亚/20/1999)和H5亚型的HA(例如H5N1流感株A/越南/1203/2004)具有竞争性结合活性。本发明的化合物中的至少一些也已被示出对至少两种不同的A型流感病毒株具有中和活性，每种不同的A型流感病毒株包含来自系统发育组1的不同HA亚型的HA，例如对包含H1亚型的HA的流感病毒(例如H1N1流感病毒株A/加利福尼亚州/07/2009和A/新喀里多尼亚/20/1999)和包含H5亚型的HA的流感病毒(例如H5N1流感株A/越南/1203/2004)具有中和活性。相对于抗流感抗体，本发明的化合物提供了若干优点，包括尺寸小(1.5kDa)、化学生产成本低、工程化为多聚形式的操作简单、以及潜在支持非注射给药途径的高稳定性。

在第一方面，本发明因此提供了具有以下序列的新颖拟肽化合物：

Cap1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-X9-X10-Cap2

其中Cap1是包含具有N-末端阻断基的从0-10个残基的氨基酸序列；

X1是任何L或D-氨基酸；

X2是任何L-氨基酸；

X3是分子量低于200Da的脂肪族L-氨基酸；

X4是任何L-氨基酸；

X5是Tyr或L-酪氨酸类似物；

X6是Phe或L-苯丙氨酸类似物；

X7是任何带电的或中性的亲水性L-氨基酸；

X8是Trp或L-色氨酸类似物；

X9不存在或者是任何亲水性L-氨基酸；

X10是任何L-氨基酸；并且

Cap2是包含具有C-末端阻断基的从0-10个残基的氨基酸序列。

如上所述，本发明的化合物能够特异性结合至少两种A型流感病毒株的血凝素(HA)，所述A型流感病毒株包含来自系统发育组1的不同亚型的HA。在某些实施例中，这些化合物能够特异性结合包含H1亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H1N1流感病毒株，和包含H5亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H5N1流感病毒株。在某些实施例中，这些化合物能够特异性结合包含H1亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H1N1流感病毒株，和包含H5亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H5N1流感病毒株。

在某些实施例中，这些化合物能够特异性结合包含H1亚型的HA的至少两种、优选地至少三种、更优选地至少四种不同的流感病毒株。在某些实施例中，这些化合物能够特异性结合包含H5亚型的HA的至少两种、优选地至少三种、更优选地至少四种不同的流感病毒株。在某些实施例中，这些化合物能够中和包含H1亚型的HA的至少两种、优选地至少三种、更优选地至少四种不同的流感病毒株。

在某些实施例中，这些化合物能够结合至少一种流感病毒，该流感病毒包含来自系统发育组1的另一亚型(例如H2和/或H9亚型)的HA。

本文所用的术语“特异性结合”是指结合感兴趣的蛋白质的表位(即HA)的化合物，但不实质性地识别和结合在包含抗原生物分子的混合物的样品中的其他分子。通常，本发明的化合物结合组1的A型流感病毒的HA，其亲和常数(Kd值)低于10μM、优选地低于1μM、更优选地低于0.1μM、甚至更优选地低于10nM、甚至更优选地低于1nM。

如本说明书中通篇使用的，与A型流感病毒相关的术语“流感病毒亚型”是指由血凝素(H)和神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的不同组合表征的A型流感病毒株。A型流感病毒亚型可以由其H号表示，例如像“包括所述H1或H5亚型的HA的流感病毒”、或“H1流感病毒”、“H5流感病毒”，或由H号和N号的组合表示，例如像“流感病毒亚型“H1N1”或“H5N1”。术语流感病毒“亚型”具体包括这样的亚型中的所有个体流感病毒“株”，这些“株”通常由于血凝素和/或神经氨酸酶的突变而不同，并且显示出不同的致病性谱，并且包括天然分离物以及人造突变体或重配体等。这些株还可以被称为病毒亚型的各种“分离物”。因此，如在此使用的，术语“株”和“分离物”可以互换使用。这些A型流感病毒亚型可以通过参考其系统发育组进一步分类。因此系统发育分析表明了将流感血凝素细分为两个主要的组：尤其是在系统发育组1(“组1”流感病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育组2(“组2”流感病毒)中的H3、H4、H7和H10亚型。

根据本发明的氨基酸可以是二十个天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一个，例如，像D-氨基酸(具有手性中心的氨基酸的D-对映异构体)或在蛋白质中不天然存在的任何变体。表5显示了标准氨基酸的缩写和性质。

在本发明的某些实施例中，X3是具有线性或C-γ分支的侧链、分子量低于200Da的脂肪族L-氨基酸；X5是Tyr或具有取代酪氨酸的羟基基团的氢键供体和/或受体的L-酪氨酸类似物；X6是Phe或具有选自下组的一个或多个取代基的L-苯丙氨酸类似物，该组由以下各项组成：苯环的邻位和/或间位上的氢、卤素、C1-C4烷基、苯环对位上的卤素、L-3-萘-1-基-丙氨酸和L-3-萘-2-基-丙氨酸；并且X8是Trp或在C5、C6和/或C7处具有卤素取代基和/或在吲哚环的C2上具有小脂肪族取代基的L-色氨酸类似物。

在另一个方面，本发明提供了环状化合物。环化降低了化合物的灵活性，并且产生了更高的亲和力和效力，连同增强的性质，如更高的蛋白水解稳定性、生物利用度和/或选择性。因此，在某些实施例中，本文所述的化合物被环化。在某些实施例中，这些化合物经由残基X2和X10之间的化学桥和/或残基X4和X10之间的化学桥环化。在某些实施例中，这些化合物经由形成包含残基X2和X10的酰胺键进行环化。在某些实施例中，这些化合物经由形成包含残基X4和X10的酰胺键进行环化。

因此，在某些实施例中，这些化合物具有选自下组的序列，该组由以下各项组成：

并且

X1是任何L或D-氨基酸；

X2是任何L-氨基酸；

X3是分子量低于200Da的脂肪族L-氨基酸；

X4是任何L-氨基酸；

X5是Tyr或L-酪氨酸类似物；

X6是Phe或L-苯丙氨酸类似物；

X7是任何带电的或中性的亲水性L-氨基酸；

X8是Trp或L-色氨酸类似物；

X9不存在或者是任何亲水性L-氨基酸；

X10是任何L-氨基酸；并且

Cap2是包含具有C-末端阻断基的从0-10个残基的氨基酸序列。

在某些实施例中，X2和/或X4是具有可用于环化的官能团的任何L-氨基酸，其中所述官能团是远离L-氨基酸的C-α原子的2-5个原子；并且X10是具有可用于环化的官能团的任何L-氨基酸，其中所述官能团是远离L-氨基酸的C-α原子的2-5个原子。

在某些实施例中，X2为Lys或L-鸟氨酸，并且X10为β-丙氨酸、3-氨基丙酸、3-氨基-2,2-二甲基-丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、或Pro。

在某些实施例中，X2为Asp或Glu，并且X10为Lys或L-鸟氨酸。

在某些实施例中，X4为Lys或L-鸟氨酸，并且X10为β-丙氨酸、3-氨基丙酸、3-氨基-2,2-二甲基-丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、或Pro。

在某些实施例中，X4为Asp或Glu，并且X10为Lys或L-鸟氨酸。

在某些实施例中，这些化合物经由残基X2和X10之间的化学桥以及残基X4和X10之间的化学桥环化。

在某些实施例中，这些化合物借助在残基X2和X4以及X10上引入的游离胺基团与三琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯(TSAT)的分子内交联进行环化。

在又另外的方面，本发明提供了多聚拟肽化合物，其中所述多聚化合物包含如本文所述的两种或更多种化合物。在某些实施例中，这些化合物是二聚体。在某些实施例中，参与连接这些单体的残基在X4位置上。因此，在某些实施例中，这些化合物通过在残基X4处引入的反应基团的分子间交联进行多聚化。本发明的化合物可以是同型二聚体(即包含两个类似的单体化合物)或可以是异二聚体。

在某些实施例中，本发明的化合物具有以下序列：

其中Cap1、X1至X10和Cap2如上所定义。

在某些实施例中，通过在残基X4处引入的反应基团与由2-20个重复乙二醇单元组成的接头的分子间交联对这些化合物进行二聚化。

如上所述，在本发明的线性、环化和/或多聚化合物中，Cap1和/或Cap2可以是包含从0至10个附加残基的氨基酸序列。因此，根据本发明，可能不存在Cap 1和/或Cap 2，或者可能在N-末端位点存在具有高达10个附加残基(天然或非天然氨基酸)的氨基酸序列，和/或如在本文给出的核心序列的C-末端位点可能存在多达10个附加残基(天然或非天然氨基酸)。所述C-和/或N-末端阻断基可以是本领域已知的任何任意的阻断基。N-末端阻断基是例如乙酰基或琥珀酰基。C-末端阻断基是例如甲酰胺。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基或琥珀酰基。

如上所定义，根据本发明，X1可以是任何L或D-氨基酸。在某些实施例中，X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸、(2S)-3,3-二甲基-2-氨基-5-苯基戊酸或Arg。

在某些实施例中，X2为Lys、L-鸟氨酸、Cys、L-高半胱氨酸或Ser。

在某些实施例中，X3是Leu、L-正亮氨酸、L-环戊基丙氨酸、L-环丁基丙氨酸、L-环丙基丙氨酸、(2S,4S)-2-氨基-4-甲基己酸、(2S,4R)-2-氨基-4-甲基己酸、(2S,4S)-2-氨基-4-甲基庚酸、(2S,4R)-2-氨基-4-甲基庚酸、(S)-2-氨基-4-乙基己酸或其N-甲基化衍生物。

在某些实施例中，X4是Asp、Glu、Arg、Lys、鸟氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、

N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸或N5-(4-羧基丁酰)鸟氨酸。

在某些实施例中，X5是Tyr。

在某些实施例中，X6是Phe、L-2-氯苯丙氨酸、L-3-氯苯丙氨酸、L-4-氯苯丙氨酸、或L-3,4-二氯苯丙氨酸。

如上所定义，X7可以是任何带电的或中性的亲水性L-氨基酸。在某些实施例中，X7是Glu、Gln、Asp、Asn、Arg或Lys。

在某些实施例中，X8是Trp或L-2-甲基-色氨酸。

如上所定义，根据本发明，X9可以不存在或可以是任何亲水性L-氨基酸。在某些实施例中，X9是Ser或Gln。

如上所定义，根据本发明，X10可以是任何L-氨基酸。在某些实施例中，X10是4-氨基丁酸、β-丙氨酸、((2R)-3-氨基-2-(3-氨基丙酰基氨基)β-丙氨酸、Lys、L-鸟氨酸、Cys或高半胱氨酸。

在某些实施例中，Cap2不存在。

在至少某些实施例中，这些化合物能够中和包含来自系统发育组1的不同亚型的HA的至少两种A型流感病毒株。在某些实施例中，这些化合物能够特异性中和包含H1亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H1N1流感病毒株，和包含H5亚型的HA的至少一种流感病毒株，例如H5N1流感病毒株。

在某些实施例中，这些化合物能够中和包含H1亚型的HA的至少两种、优选地至少三种、更优选地至少四种不同的流感病毒株。在某些实施例中，这些化合物能够中和包含H5亚型的HA的至少两种、优选地至少三种、更优选地至少四种不同的流感病毒株。

在某些实施例中，这些化合物能够中和至少一种流感病毒，该流感病毒包含来自系统发育组1的另一亚型(例如H2和/或H9亚型)的HA。在本发明的某些实施例中，因此提供了交叉中和化合物。

如本文所使用的，与本发明的化合物相关的术语“中和(neutralizing或neutralization)”指化合物抑制流感病毒在受试者体外和/或体内复制的能力，而不论通过何种机制实现中和。在一些实施例中，本发明的化合物通过在病毒附着于靶细胞后抑制病毒膜和细胞膜的融合来中和流感病毒。如本文所使用的，与本发明的化合物相关的术语“交叉中和(cross-neutralizing或cross-neutralization)”是指中和A型流感的不同亚型的流感病毒株的能力。可以例如如本文所述的测量中和活性。测量中和活性的替代性试验描述于例如WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva:World Health Organisation,2005,version 2002.5[关于动物流感诊断和监视的WHO手册，日内瓦：世界卫生组织，2005，2002.5版本]中。典型地，如在体外病毒中和测定(VNA)中确定的，例如在实例中所述，本发明的化合物具有1μM或更少，优选地100nM或更少，更优选地10nM或更少的中和活性。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是精氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由残基X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是谷氨酸；X5是酪氨酸；X6是L-3,4-二氯苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是L-环戊基丙氨酸；X4是谷氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是L-N-甲基-亮氨酸；X4是谷氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是谷氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是谷氨酰胺；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸；X10是β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2的分子内侧链环化成尾部形成，并经由包含13个乙烯单元(PEG13)的X4酰胺连接的聚乙二醇间隔基进行二聚化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是谷氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸，X10是((2R)-3-氨基-2-(3-氨基丙酰基氨基)β-丙氨酸；并且Cap2不存在，其中所述化合物经由X2和X10(侧链X2至尾部内酰胺形成)之间的酰胺键进行环化。

在本发明的某些实施例中，Cap1是乙酰基；X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；X2是L-鸟氨酸；X3是亮氨酸；X4是L-鸟氨酸；X5是酪氨酸；X6是苯丙氨酸；X7是谷氨酸；X8是色氨酸；X9是丝氨酸，X10是L-鸟氨酸，并且Cap2是甲酰胺，其中所述化合物通过X2、X4和X10的TSAT(三琥珀酰亚胺基)氨基三乙酸酯)介导的连接进行环化。

在某些实施例中，所述化合物具有选自下组的序列，该组由以下各项组成：

本发明的拟肽化合物可以通过本领域任何熟知的程序制备，特别是通过利用自动化固相肽合成仪的公认的化学合成程序，然后进行色谱纯化，例如，如以下实例中所述。

本发明进一步提供了包含如本文所述的一种或多种化合物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。“药学上可接受的赋形剂”可以是与活性分子(例如根据本发明的化合物)组合用于制备适合的组合物的任何惰性物质。药学上可接受的赋形剂是一种在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与配制品的其他成分相容的赋形剂。药学上可接受的赋形剂广泛适用并且在本领域中是已知的。根据本发明的药物组合物可以进一步包括至少一种其他的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。所述另外的治疗剂和/或预防剂可以是例如还能够预防和/或治疗流感病毒感染的试剂，例如像M2抑制剂(例如，金刚胺、金刚烷乙胺)和/或神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、奥司他韦)。这些可以与本发明的化合物组合使用。本文中的“组合”意指作为单独的配制品或作为单一组合的配制品同时地进行，或作为单独配制品以任何顺序按照顺序给予方案进行。

在另外的方面，本发明提供了如本文所述的用于诊断、预防和/或治疗流感的化合物。本发明还提供了如本文所述的化合物在制造用于诊断、预防和/或治疗流感的药物中的用途。如在此使用的，术语“流感”或“流感病毒疾病”是指由流感病毒感染细胞或受试者而产生的病理状况。在具体的实施例中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸系统疾病。如在此使用的，术语“流感病毒感染”意指通过流感病毒在细胞或受试者中繁殖和/或存在的侵染。流感病毒感染可以发生在小群体中，但还可以在季节性流行病中，或更严重地在数百万个体处于风险中的全球大流行病中传播到世界各地。本发明提供可以中和引起此类季节性流行病以及潜在的大流行病的流感株感染的结合分子。

本发明进一步提供了用于在受试者中预防和/或治疗流感的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如本文所述的化合物。术语“治疗有效量”是指如本文定义的化合物用于预防、改善和/或治疗由流感病毒感染引起的病症有效的量。预防和/或治疗可以靶向易受流感感染影响的患者群组。这样的患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的已被感染的患者。

本发明的化合物可以例如静脉内、鼻内、经口吸入、肺、皮下、皮内、玻璃体内、口服、肌内等给予至受试者。最佳的给予途径将受多种因素的影响，这些因素包括活性分子的物理化学性质、临床表现的紧急性、以及活性分子的血浆浓度与所希望的治疗效果之间的关系。

本发明进一步提供了检测样品中A型流感病毒的方法，其中该方法包括以下步骤：a)使所述样品与诊断有效量的根据本发明的化合物接触，以及b)确定所述化合物是否特异性结合样品中的分子。该样品可以是生物样品，该生物样品包括但不限于来自(潜在地)被感染的受试者的血液、血清、组织或其他生物材料。(潜在地)被感染的受试者可以是人类受试者，但是也可以使用本发明的化合物对被怀疑是流感病毒携带者的动物测试流感病毒的存在。

在以下非限制性实例中进一步阐明了本发明。

实例

实例1：CP132070的合成

通过使用β-丙氨酸预加载的2-氯三苯甲基氯树脂(0.685mmol/g)，通过手动固相Fmoc肽合成来制备线性肽前体，其规模为0.5mmol。氨基酸侧链官能团被保护为N-Boc(W)、O-t-Bu(E,S,Y)和N-Pbf(R)基团。N-Dde基团用于鸟氨酸侧链胺官能团的正交保护(Boc：叔丁氧基羰基，t-Bu：叔丁基，Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己基)乙基，Fmoc：9-芴甲氧羰酰基，Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基)。在第一氨基酸附着之前，将所述树脂在DMF(二甲基甲酰胺)中溶胀1h。采用偶联方案：使用DMF(4mL)中的Fmoc-氨基酸各3当量，和包含DMF(4mL)中的HBTU((2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐，2.85当量)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，6当量)的活化混合物。将该反应混合物震荡1.5-2小时。用在DMF中的20％哌啶溶液进行Fmoc基团去除(2×15min)。通过在室温下用乙酸酐和4-甲基吗啉在DMF中的混合物(2:1:17，v/v/v，20mL)处理肽树脂1小时，在肽组装结束时进行N-末端乙酰化。最后，用在DMF中的3％肼水合物溶液处理肽树脂(3×10min)，选择性地除去N-Dde保护基团。

通过在65％(v)DCM(二氯甲烷)、20％(v)六氟异丙醇、10％(v)三氟乙醇和5％(v)三乙基硅烷(10mL/g肽-树脂)的混合物中旋转所述肽树脂60分钟，从所述树脂中切下鸟氨酸侧链去保护肽。将所述树脂滤出并且用DCM洗涤。通过添加冷的异丙醚从滤液中沉淀出肽，并在真空下干燥。在随后的内酰胺环化步骤中将粗肽原样使用。

通过将鸟氨酸侧链去保护的C末端羧酸肽溶解在150mL DMF中，以高稀释度进行内酰胺环化，向其中滴加在DMF(90mL)中的PyBOP(苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐，2当量)和N-甲基吗啉(6当量)的溶液。将反应混合物在室温下搅拌直到观察到其完全转化。减压下除去溶剂，得到环化肽，所述环化肽通过在室温下用90％(v)TFA(三氟乙酸)、5％(v)茴香硫醚、2.5％(v)H2O和2.5％(v)EDT(乙二硫醇)的混合物处理完全去保护，持续三小时。沉淀，然后用冰冷的乙醚洗涤，得到粗肽，将所述粗肽以20mL/min的流动相流速，在LunaC18制备型HPLC柱(25×200mm，10μm，

)和串联的Gemini C18制备型HPLC柱(30×150mm，50μm，

)上通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化(流动相A：在水中0.05％TFA，流动相B：CH3CN，应用线性梯度)。冻干纯的级分得到328mg(产率：53％，纯度：97％)的作为三氟乙酸盐的内酰胺环化肽。

以类似于CP132070的方式制备以下化合物：

CP141019

CP141036

CP141037

CP141077

实例2：CP141032的合成

通过使用Sieber树脂(0.69mmol/g)，通过手动固相Fmoc肽合成来制备线性肽前体，其规模为0.25mmol。氨基酸侧链官能团被保护为N-Boc(W)、O-t-Bu(E,S,Y)和N-Pbf(R)基团。N-Dde基团用于鸟氨酸侧链胺官能团的正交保护(Boc：叔丁氧基羰基，t-Bu：叔丁基，Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己基)乙基，Fmoc：9-芴甲氧羰酰基，Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基)。在第一氨基酸附着之前，将所述树脂在DMF中溶胀1h。采用偶联方案：使用3当量的DMF(4mL)中的Fmoc-氨基酸，和包含在DMF(4mL)中的2.85当量的HBTU和6当量的DIPEA的活化混合物；在每一偶联步骤期间将该反应混合物震荡1.5-2小时。用在DMF中的20％哌啶溶液进行Fmoc基团去除(2×15min)。通过在室温下用乙酸酐和4-甲基吗啉在DMF中的混合物(2:1:17，v/v/v，20mL)处理肽树脂1小时，在肽组装结束时进行N-末端乙酰化。最后，用在DMF中的3％肼水合物溶液处理肽树脂(3×10分钟)，选择性地除去N-Dde保护基团，然后用DMF和DCM洗涤肽树脂。

随后通过在包含1％TFA的DCM溶液中将所述肽树脂旋转60分钟来将肽从树脂上切割下来。将所述树脂滤出并且用DCM洗涤。将滤液倒入冷的异丙醚中，使肽沉淀。通过离心分离，用冷的异丙醚洗涤并真空干燥，得到粗制线性肽348mg(产率：55％，纯度：80％)，将所述粗制线性肽原样用于TSAT(三-(琥珀酰亚胺基)氨基三乙酸酯)介导的环化步骤。

将鸟氨酸侧链去保护肽(150mg，纯度80％，0.0595mmol)溶于DMF(300mL)中，然后添加DIPEA直到pH＝8-9。向该混合物中滴加TSAT交联剂(1.0当量)在DMF(50mL)中的溶液，将所得反应混合物在室温下搅拌直到观察到完全转化。减压下除去溶剂，得到二环肽，所述二环肽通过在室温下用90％(v)TFA、5％(v)茴香硫醚、2.5％(v)H₂O和2.5％(v)EDT的混合物处理完全去保护，持续三小时。沉淀并用冰冷的叔丁基甲基醚进行洗涤，得到粗制的环状肽，将所述环状肽通过如实例1中所述的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化。冻干纯的级分，给出40mg(产率：34％，纯度：94％)的作为三氟乙酸盐的二环肽CP141032。

实例3：同型二聚肽CP141100的合成.

通过在β-丙氨酸预加载的2-氯三苯甲基氯树脂(0.29mmol/g)上，通过自动化固相Fmoc肽合成来制备线性单体肽前体，其规模为0.5mmol。氨基酸侧链官能团被保护为N-Boc(W)和O-t-Bu(E,S,Y)基团。N-Mtt基团用于鸟氨酸侧链胺官能团的正交保护(Boc：叔丁氧基羰基，t-Bu：叔丁基，Fmoc：9-芴甲氧羰酰基，Mtt：甲基三苯甲基)。在第一氨基酸附着之前，将所述树脂在NMP中进行溶胀(2×15min)。对于正好是氨基酸偶联步骤采用偶联方案：使用10当量的Fmoc-氨基酸、9当量的HATU(N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐，0.45M在DMF中)和10当量的DIPEA(2M在NMP中)(偶联持续时间：30分钟)。在两个N-末端氨基酸的情况下应用双偶联策略。用NMP中的20％哌啶溶液进行Fmoc去除，并通过UV检测进行监测。在DIPEA(NMP中10当量的的2M溶液)存在下用过量的乙酸酐处理30分钟，在肽组装结束时进行N-末端乙酰化。

通过在65％(v)DCM(二氯甲烷)、20％(v)六氟异丙醇、10％(v)三氟乙醇和5％(v)三乙基硅烷(10mL/g肽-树脂)的混合物中旋转所述肽树脂60分钟，来实现从树脂上切割肽和选择性Mtt侧链去保护。将所述树脂滤出并且用DCM洗涤。通过添加冷的乙醚从滤液中沉淀肽，将粗产物在真空下干燥并原样用于下一步骤中。

通过将粗制鸟氨酸侧链去保护肽溶解在200mL的DMF中，然后滴加PyBOP(2当量)和N-甲基吗啉(6当量)在DMF(60mL)中的溶液，以高稀释度进行内酰胺环化。将反应混合物在室温下搅拌直到观察到其完全转化(2小时)。在减压下除去溶剂并将残余物再次溶解于乙酸乙酯中。将有机相用5％NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，并在减压下浓缩。将环化肽通过在室温下用87.5％(v)TFA、5％(v)茴香硫醚、5％(v)H₂O和2.5％(v)EDT的混合物处理完全去保护，持续两小时。沉淀，然后用冰冷的乙醚洗涤，得到粗肽，将所述粗肽以30mL/min的流动相流速，在XBridge C18 OBD制备型HPLC柱(30×250mm，5μm，

)上通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化(溶剂A：在水中0.1％TFA+CH₃CN，溶剂B：CH₃CN，应用线性梯度)。冻干纯的级分提供了250mg(产率：31％，纯度：83％)的作为三氟乙酸盐的完全侧链去保护的内酰胺环化肽。

使用可商购的双-PEG13-NHS酯(双-琥珀酰亚胺基活化的双-PEG13-酸)作为连接试剂进行二聚化。这通过将连接试剂(0.4当量)添加到内酰胺环化肽(75mg，0.048mmol)和Et₃N(5当量)在干DMF中的溶液中来完成，将反应混合物在室温下搅拌直至不再观察到转化。在减压下除去溶剂，并将所得残余物通过如上所述的反相高效液相色谱(RP-HPLC)直接纯化。冻干纯的级分给出19mg(产率：11％，纯度：96％)的二聚肽CP141100。

实例4：CP141066的合成

将来自实例3的完全侧链去保护的内酰胺环化肽中间体(50mg，0.032mmol)溶于DMF(2mL)中。添加Et₃N(5当量)和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(1.0当量)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并将所得残余物通过实例3中所述的反相高效液相色谱进行纯化。冻干纯的级分给出28mg(产率：56％，纯度：99％)的肽CP141066。

实例5：内酰胺环化肽CP141099的合成

通过在L-Dap(Fmoc)(Dap：2,3-二氨基丙酸)预负载的2-氯三苯甲基氯树脂(0.15mmol/g)上的自动化Fmoc固相肽合成，以0.3mmol规模合成线性肽。通过在DIPEA(2.6当量)的存在下，用Dde-L-Dap(Fmoc)-OH的DMF溶液(0.66当量)处理2-氯三苯甲基氯树脂(5g，1.4mmol/g，7mmol)来手动制备L-Dap(Fmoc)预加载的2-氯三苯甲基氯树脂。将所得反应混合物震荡90分钟，添加甲醇(2.5ml)，并继续再震荡5分钟。通过过滤除去溶剂，并用DMF(5x)洗涤树脂。最后，通过与DMF中的2％肼水合物溶液反应(5×2min)除去N-Dde保护基团，得到替换率为0.15mmol/g的L-Dap(Fmoc)负载的2-氯三苯甲基氯树脂(从用DMF中的哌啶溶液处理树脂时释放的Fmoc发色团的量来光度确定取代率)。随后通过如实例3中所述的自动化合成进行氨基酸偶联和N-末端乙酰化。重要的是要注意，在L-Dap(Fmoc)预加载的2-氯三苯甲基氯树脂的Fmoc去保护之前，将Boc-β-丙氨酸偶联。

通过在65％(v)DCM、20％(v)六氟异丙醇、10％(v)三氟乙醇和5％(v)三乙基硅烷(10mL/g肽-树脂)的混合物中旋转所述肽树脂60分钟，来实现从树脂上切割肽和选择性Mtt侧链去保护。将所述树脂滤出并且用DCM洗涤。通过添加冷的乙醚从滤液中沉淀肽，将粗产物在真空下干燥并原样用于下一步骤中。

通过将粗制鸟氨酸侧链去保护肽溶解在120mL的DMF中，然后滴加PyBOP(2当量)和N-甲基吗啉(6当量)在DMF(36mL)中的溶液，以高稀释度进行内酰胺环化。将反应混合物在室温下搅拌直到完全转化(2小时)。在减压下除去溶剂并将残余物再次溶解于乙酸乙酯中。将有机相用5％NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，并在减压下浓缩。通过在室温下用87.5％(v)TFA、5％(v)茴香硫醚、5％(v)H₂O和2.5％(v)EDT的混合物处理来进行完全侧链去保护，持续二小时。沉淀，然后用冰冷的乙醚洗涤，得到粗肽，将所述粗肽以30mL/min的流动相流速，在XBridge C18 OBD制备型HPLC柱(30×250mm，5μm，

)上通过反相高效液相色谱纯化(溶剂A：在水中0.1％TFA+CH₃CN，溶剂B：MeOH，应用线性梯度)。冻干纯的级分提供了36mg(产率：7％，纯度：95％)的作为三氟乙酸盐的内酰胺环化肽CP141099。

实例6：肽分析

如相应方法中所指明使用LC泵、二极管阵列(DAD)或UV检测器和柱进行UPLC(超高效液相色谱)和HPLC(高效液相色谱)(HPLC)测量。如果必要的话，包括其他检测器(参见下文的方法表格)。将来自柱的流带至配置有大气压离子源的质谱仪(MS)。设置调谐参数(例如扫描范围、驻留时间…)以便获得允许鉴定化合物的分子量(MW)的离子在本领域的普通技术人员的知识内。利用适宜软件进行数据采集。

通过其实验停留时间(R_t)及其分子量(MW)对肽进行描述。所获得的所有结果均具有实验不确定性，这通常与所使用方法相关。如本文所用：“MSD”：质谱选择性检测器，“DAD”：二极管阵列检测器，“SQD”：单四极检测器。

表1：LCM方法代码(以mL/min来表示流量；以℃表示柱温度(T)；以分钟表示运行时间)。

表2.肽分析

化合物ID	R<sub>t</sub>(min)<sup>#</sup>	计算的MW	纯度(％)<sup>$</sup>
				CP141099	7.80(C)	1556.77	95
CP141019	15.34(A)	1539.57	100
				CP141037	14.10(A)	1484.71	99
CP141066	7.12(C)	1583.84	99
				CP132070	14.07(A)	1497.75	97
CP141036	14.01(A)	1496.72	98
				CP141077	12.63(C)	1511.73	99
CP141100	8.64(C)	3594.22	96
				CP141032	16.04(B)	1633.86	94

^#括号中所示的分析方法(A、B、C)如上所述。^$肽纯度按照色谱图主峰下洗脱的UV-正(220nm)材料的面积百分比进行计算。

实例7：化合物与流感HA的结合以及化合物与其他HA结合剂的竞争

设计了结合竞争研究，以测试化合物与具有HA上已知表位的其他良好表征的HA结合蛋白(包括例如CR9114)的竞争。这些表位位于HA的主干部位(HA的病毒膜近端部分)或HA的头部(HA的病毒膜远端部分)(出于对照目的)。如果观察到竞争，则假定两个分子在HA的表面上结合相似的或至少重叠的表位。与HA头部和主干部位结合剂的竞争被解释为非特异性结合。

对此，建立了依赖于由HA特异性结合剂结合的生物素化全长和三聚HA蛋白(Protein Sciences[蛋白质科学]，10μL，在50μL中最终浓度为0.5nM)的AlphaLISA竞争测定(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))。在室温下孵育1h后，使用两种珠(使用了识别HA的链霉亲和素供体珠(10μL，10μg/mL)和识别IgG的抗Fc珠(10μg/mL))检测HA和结合剂之间的相互作用。如果在室温下孵育另外一个小时后，激发的供体珠(680nm)和受体珠紧密相邻，则可以测量作为受体珠发光信号的能量转移(单线态氧)(珀金埃尔默公司Envision板读取器)。处于这种均质测定形式的信号强度直接与两种结合配偶体之间的结合强度(亲和力/亲合力)成比例。取决于其亲和力和浓度(通常在从100nM至0.5pM的范围内测试)，竞争者(化合物)可以破坏AlphaLISA信号，导致在SPSS中用标准的四参数逻辑非线性回归模型拟合的Sigmoidal抑制剂曲线。将计算的pIC50值的平均值显示于表3中。

表3：竞争结合A型流感病毒HA的化合物(值表示pIC₅₀(半最大抑制浓度的负对数)的平均值，更高值表示在指数上具有更大的效力，空白格意味着“未测试”)

总之，根据本发明，已经显示本发明的化合物广泛地与组1A型流感病毒结合，并且特异性地与HA主干部位结合分子竞争，但不与对照HA头部结合分子竞争。

实例8：化合物的流感病毒中和活性和细胞毒性

在病毒中和测定(VNA)中分析化合物预防流感病毒感染哺乳动物细胞的能力。为此目的，将人类肺上皮衍生的Calu-3细胞(ATCC，目录号HTB-55)接种在96孔板(4E+04细胞/孔)中，并在37℃和10％CO₂下在完全DMEM(包含1x MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺和10％FBSHI，来源：澳大利亚；博科公司(Gibco))中孵育至少7天。为VNA准备好约90％汇融度的极化的Calu-3细胞和已建立的紧密连接。在测定当天，从在不完全DMEM(包含2mM L-谷氨酰胺，1×pen/strep)中稀释2倍的化合物原料(溶于PBS 0.1％BSA，0.1％吐温5％DMSO，500nM起始浓度)制备样品稀释板。将样品稀释板离心(1000g，持续15min)以除去潜在的聚集物。然后将在不完全DMEM中的5TCID₅₀/50μL流感病毒(在Calu-3细胞上预滴定)添加到样品稀释板中，并在37℃和10％CO₂下孵育1小时。移除细胞中的培养基，并用补充有3％FBS的50μL不完全DMEM替代。然后将100μL的病毒/化合物混合物添加到所述细胞中，得到150μL的总测定体积，终浓度为1％FBS。在37℃和10％CO₂下孵育4天后，将细胞用PBS洗涤，并在室温(RT)下用200μL/孔80％丙酮固定15min。流感感染的水平通过流感核蛋白(NP)ELISA来确定。使用以1:1000稀释于PBS中的1％BSA中的一抗抗-Flu-A-NP(Abbiotec公司，克隆5D8)，并在RT下以300rpm振荡孵育1小时。用洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温)洗涤细胞三次后，添加二抗(抗-小鼠HRP，1:2000)，并在RT下以300rpm振荡孵育1小时。洗涤细胞三次后，添加50μL/孔POD化学发光底物，并在Biotek Synergy Neo板读取器上读取发光前孵育2-5min。化合物的pIC₅₀用SPSS软件计算。以多个重复测试多种流感株以评估中和作用的广度(见表4)。

为了确定细胞毒性的水平，VNA也在没有病毒的情况下进行。经由ATP Lite试剂并根据制造商的方案(珀金埃尔默公司)测量细胞病变效应(CPE)，并以相同的方式分析数据(参见表4)。

表4：中和流感病毒的化合物(值表示pIC₅₀(半最大抑制浓度的负对数)的平均值，更高值表示在指数上具有更大的效力，空白格意味着“未测试”)

总之，在不存在可检测的细胞毒性的情况下，本发明的化合物广泛中和组1流感病毒株。

表5.标准氨基酸，缩写和性质

氨基酸	3字母	1字母	侧链极性	侧链电荷(pH 7.4)
					丙氨酸	Ala	A	非极性	中性
精氨酸	Arg	R	极性	正
					天冬酰胺	Asn	N	极性	中性
天冬氨酸	Asp	D	极性	负
					半胱氨酸	Cys	C	非极性	中性
谷氨酸	Glu	E	极性	负
					谷氨酰胺	Gln	Q	极性	中性
甘氨酸	Gly	G	非极性	中性
					组氨酸	His	H	极性	正(10％)中性(90％)
异亮氨酸	Ile	I	非极性	中性
					亮氨酸	Leu	L	非极性	中性
赖氨酸	Lys	K	极性	正
					甲硫氨酸	Met	M	非极性	中性
苯丙氨酸	Phe	F	非极性	中性
					脯氨酸	Pro	P	非极性	中性
丝氨酸	Ser	S	极性	中性
					苏氨酸	Thr	T	极性	中性
色氨酸	Trp	W	非极性	中性
					酪氨酸	Tyr	Y	极性	中性
缬氨酸	Val	V	非极性	中性

实例9：使用表面等离子体共振(SPR)的直接HA结合实验

所有SPR实验使用在25℃下操作的Biacore T200仪器(GE医疗集团)进行。将三聚HA蛋白(Protein Sciences[蛋白质科学])随机生物素化并共价固定在包被链霉亲和素的羧甲基化葡聚糖传感器表面(SA芯片，GE医疗集团)上。将测试化合物重悬于运行缓冲液(20mM PBS，137mM NaCl，0.05％P-20表面活性剂，pH 7.4(GE医疗集团)，补充2％DMSO)中，并且以流速为30μl/min，从浓度范围为0.1nM至10μM的化合物的一系列注射获得结合常数。使用BIAevaluation软件分析来自单循环动力学的数据。将所有曲线的基线调整为零，并对齐注射开始时间。从实验传感图中减去参考传感图，以产生表示特异性结合的曲线，然后进行背景扣除(即双参考)。使用1:1结合模型(朗缪尔(Langmuir))评估结合动力学以获得结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。从观察到的稳态反应的浓度依赖性估计结合亲和力(KD)。进行三次实验以确保重复性。

图1展示了三种化合物与来自三种流感株(A/加利福尼亚州/07/09(H1)、A/新喀里多尼亚/20/99(H1)和A/越南/1194/04(H5))的HA结合的代表性实验的结合曲线。如表6所示，检测到所有三种化合物的结合亲和力在10和100nM之间，解离速率在5s^-1和20s^-1之间，这取决于HA株。

表6.对于CP141037、CP141019和CP141099，具有标准偏差SD_pKD和相应解离速率kd[s-1]的pKD值。已经测试了每种化合物与衍生自三种流感株(A/加利福尼亚州/07/09(H1)和A/新喀里多尼亚/20/99(H1)以及A/越南/1194/04(H5))的HA的结合。

化合物	HA	pK<sub>D</sub>	SD_pK<sub>D</sub>	k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)
					CP141037	A/加利福尼亚州/07/09(H1)	7.21	0.14	1.84E-01
CP141037	A/新喀里多尼亚/20/99(H1)	7.35	0.16	7.53E-02
					CP141037	A/越南/1194/04(H5)	7.19	0.33	8.45E-02
CP141019	A/加利福尼亚州/07/09(H1)	7.77	0.11	1.82E-01
					CP141019	A/新喀里多尼亚/20/99(H1)	7.75	0.13	5.89E-02
CP141019	A/越南/1194/04(H5)	7.50	0.29	5.33E-02
					CP141099	A/加利福尼亚州/07/09(H1)	7.58	0.16	2.52E-01
CP141099	A/新喀里多尼亚/20/99(H1)	7.60	0.18	1.01E-01
					CP141099	A/越南/1194/04(H5)	7.56	0.35	6.52E-02

序列表

<110> 扬森疫苗与预防公司

<120> 中和流感病毒的拟肽化合物

<130> 0256 WO 00 ORD

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP132070

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的 L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的β-丙氨酸

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Leu Arg Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141019

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是 L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> X6是L-3,4-二氯苯丙氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 2

Xaa Xaa Xaa Leu Glu Tyr Xaa Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141036

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> X3是L-环戊基丙氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的β-丙氨酸

<400> 3

Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141037

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1 是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> X3是L-N-甲基-亮氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的β-丙氨酸

<400> 4

Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141066

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1 是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> X4是N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的β-丙氨酸

<400> 5

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141077

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1 是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的β-丙氨酸

<400> 6

Xaa Xaa Xaa Leu Glu Tyr Phe Glu Trp Leu Gln Xaa

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141100

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1 =乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> X4是N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> X4是N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的β-丙氨酸

<400> 7

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141099

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1 是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2是经由酰胺键结合X10的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由酰胺键结合X2的((2R)-3-氨基-2-(3-氨基丙酰基氨基)β-丙氨酸

<400> 8

Xaa Xaa Xaa Leu Glu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141032

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Cap1 是乙酰基

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> X1是 (S)-2-氨基-5-苯基戊酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> X2 is L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> X4是L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> X10是经由TSAT键连接至X2和X4的L-鸟氨酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (13)..(13)

<223> Cap2是甲酰胺

<400> 9

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Xaa Xaa

1 5 10

Claims

1.具有如下序列的拟肽化合物：

Cap1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-X9-X10-Cap2

其中：

Cap1是乙酰基；

X1是(S)-2-氨基-5-苯基戊酸；

X2是L-鸟氨酸；

X3是Leu或其N-甲基化衍生物；

X4是Glu、Arg、L-鸟氨酸或N6-(4-羧基丁酰)赖氨酸；

X5是Tyr；

X6是Phe或L-3,4-二氯苯丙氨酸；

X7是Glu；

X8是Trp；

X9是Ser或Gln；

X10是β-丙氨酸、((2R)-3-氨基-2-(3-氨基丙酰基氨基)β-丙氨酸或L-鸟氨酸；并且

Cap2不存在，

并且其中所述化合物能够特异性结合至少两种A型流感病毒株的血凝素(HA)，所述A型流感病毒株包含来自系统发育组1的两种不同亚型的HA，并且其中所述化合物经由形成包含残基X2和/或X4和X10的酰胺键进行环化。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中X2为L-鸟氨酸，并且X10为β-丙氨酸。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中X4为L-鸟氨酸，并且X10为β-丙氨酸。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物通过在残基X2和X4以及X10处引入的游离胺基团与三琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯(TSAT)的分子内交联进行环化。

5.包含两个或更多个根据权利要求1-4中任一项所述的化合物的一种多聚拟肽化合物，其中通过在残基X4处引入的反应基团与由2-20个重复乙二醇单元组成的接头的分子间交联对所述化合物进行二聚化。

6.根据权利要求5所述的多聚拟肽化合物，其中所述化合物是二聚体。

7.根据权利要求1所述的拟肽化合物或根据权利要求5或6所述的多聚拟肽化合物，其中所述化合物已经通过在残基X4处引入的反应基团的分子间交联进行二聚化。

8.用于诊断、预防和/或治疗流感的药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物在制造用于诊断、预防和/或治疗流感的药物中的用途。