CN116370335A - 用于擦拭的病毒防护溶液以及病毒防护擦拭产品 - Google Patents

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伍志
董海涛
刘章
于雪
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Abstract

本发明提供一种安全有效温和地的能防护病毒的用于擦拭的病毒防护溶液以及病毒防护擦拭产品，其中的病毒防护溶液，其特征在于，包括：病毒阻断蛋白和水溶剂，其中，病毒阻断蛋白具有能与病毒的S蛋白特异性结合而使得病毒失活的阻断结合分子单元，优选地，病毒为冠状病毒。

Description

用于擦拭的病毒防护溶液以及病毒防护擦拭产品
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于擦拭的病毒防护溶液、及其应用以及相应的病毒防护擦拭产品。
背景技术
近年来，随着人们生活质量的提高，卫生习惯的养成，类似湿巾等具有病菌和病毒防护的擦拭物或用于擦拭的擦拭液，由生活非必需品逐渐走入人们的生活，被大众认可，并开始应用到日常生活及各类公共场所中。
但是，目前市面上对病毒防护的擦拭产品，一般是通过药物组合或植物提取物，或者对通过对病毒蛋白的具有抑制性的化学物质等实现，而没有通过阻断蛋白实现对例如新冠病毒(SARS-CoV-2)等病毒的防护效果。
发明内容
本发明提供一种安全有效温和地的能防护病毒的用于擦拭的病毒防护溶液、及其应用以及相应的病毒防护擦拭产品，以能解决上述存在的问题。
为此，本发明提供了以下的技术方案。
本发明提供一种用于擦拭的病毒防护溶液，其特征在于，包括：病毒阻断蛋白和水溶剂，其中，病毒阻断蛋白具有能与病毒的S蛋白特异性结合而使得病毒失活的阻断结合分子单元，优选地，病毒为冠状病毒。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：其中，病毒阻断蛋白的质量占比大于等于0.0001％，优选为0.0001％-0.0007％，更优选为0.0001-0.00035％。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征，还包括：稳定剂、保湿剂、防腐剂、香味物质以及抗菌剂中的一种或多种的组合。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征，稳定剂用于保持病毒防护溶液的稳定性，稳定剂具有以下特征中的一个或多个：
(1)稳定剂含有pH调节剂、金属离子螯合剂以及表面活性剂中的一种或多种；
(2)稳定剂的质量占比为0.3％±1％，更优选地，为0.3％±0.5％。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：
pH调节剂具有以下特征中的一种或多种：(1)保持病毒防护溶液的pH在6-7.5，优选地，在6.5-7.2，(2)pH调节剂选自十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钠或其组合；
金属离子螯合剂选自二水合乙二胺四乙酸二钠；
表面活性剂选自非离子型表面活性剂。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：保湿剂的质量占比为小于等于0.3％，优选地，小于等于0.2％；和/或，保湿剂选自甘油。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：香味物质的质量占比小于等于0.2％，优选地，0.04％-0.1％，进一步优选地为0.05％-0.1％；和/或，香味物质选自挥发性香味物质，更优选地，选自薄荷醇、香精、桉油精、麝香草酚、琥珀酸薄荷酯中的任意一种或多种。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：防腐剂的质量占比小于等于0.05％，优选地，小于等于0.02％；和/或防腐剂选自苯扎氯氨和醋酸氯已定或其组合。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：其中，水溶剂的质量占比范围为大于等于90％，优选地，大于等于95％，更优选地，大于等于99％；优选地，水溶剂为饮用水、蒸馏水、无菌水、超纯水以及去离子水中的一种或多种的组合。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：病毒阻断蛋白还具有以下特征中的一个或多个的组合：
(1)所示病毒阻断蛋白还具有让其形成为多聚体的聚合分子，优选地，多聚体为数量为2-10中任意一种的单体聚合形成；
(2)病毒阻断蛋白还具有酸性结构；
(3)病毒阻断蛋白还具有将阻断结合分子单元与聚合分子连接以增强三维结构的连接分子；
(4)病毒阻断蛋白还具有先导肽；
(5)病毒阻断蛋白还具有标签蛋白；
(6)病毒阻断蛋白中具有的各个组成部分之间按N-C端的顺序连接。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：
聚合分子选自表1中的任何一项，优选地，聚合分子包含链霉亲和素，进一步优选地，含有与SEQ ID NO:1具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
连接分子包含有荧光类蛋白、人免疫球蛋白G4、Fc以及HSA中的任意一种或多种，例如，连接分子是eGFP荧光蛋白或经其改造得到，优选地，通过对eGFP删除部分氨基酸得到；或：连接分子包含与SEQ ID NO:2具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
酸性结构为带有负电的氨基酸短链聚合物，进一步地，酸性结构具有以下特征中的一个或多个的组合：
(1)酸性结构设置在C末端；
(2)短链聚合物的氨基酸的个数为0-50、2-40、3-30、2-20或2-10；
(3)带有负电的氨基酸为天冬氨酸和/或谷氨酸；
先导肽包含与SEQ ID NO:10具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
标签蛋白包含与SEQ ID NO:15具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
本发明提供的病毒防护溶液，还具有这样的特征：阻断结合分子单元含有至少一个与病毒的位于S蛋白的受体结合区域进行结合的阻断分子，优选地，所述受体结合区域以
ACE2作为结合受体，进一步优选地，所述阻断分子含有与SEQ ID NO:7-9以及16-19中任意一个具有一致性或与与SEQ ID NO:7-9以及16-19中任意一个具有至少50％、60％、70、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
本发明还提供一种前述的病毒防护溶液在擦拭或在制备用于擦拭的擦拭产品中的应用，优选地，擦拭产品为擦拭液或预润湿擦拭物。
本发明提供的应用，还具有这样的特征，前述的擦拭包括对人体皮肤和/或物体表面的擦拭。
本发明还提供一种用于病毒防护的擦拭液，其特征在于，包括：前述的病毒防护溶液。
本发明还提供一种用于病毒防护的预湿润擦拭物，其特征在于：擦拭物由病毒防护溶液浸渍的基体材料构成，其中，病毒防护溶液为前述的病毒防护溶液。
本发明提供的预湿润擦拭物，还具有这样的特征：其中，用于浸渍的病毒防护溶液与基体材料的重量比为1：1.7-1：5。
发明作用与效果
本发明提供的病毒防护溶液，采用病毒阻断蛋白特异性结合病毒S蛋白而使得病毒失活，特别是，阻断结合分子单元含有至少一个与病毒的受体结合区域进行结合的阻断分子，经实验证实，只需要极低浓度就能实现对病毒的有效防护，无毒无刺激无腐蚀性，可以广泛用于物体表面以及人体皮肤的擦拭中，或制备相应的擦拭产品用于擦拭，起到病毒防护的作用，例如对包装箱、快递等的擦拭，只需要少量使用，而且不会造成对各种包装和物品的腐蚀破坏，安全有效，又例如，还可以用于日常手部、面部等皮肤的清洁，甚至用于蔬菜水果的表面擦拭等；
可以制备成的擦拭产品，例如采用前述的病毒防护溶液制成的擦拭液，又例如通过前述的病毒防护溶液预湿润的得到的擦拭物。
又由于，本发明中涉及的病毒阻断蛋白，具有以下的优势，所以当本发明所采用的病毒阻断蛋白作为有效物质制备的病毒防护液，能对病毒起到抑制作用，使得病毒失活，起到对病毒的防护和/或治疗作用，并且安全无害，成分简单：
A、本发明中涉及的病毒阻断蛋白，通过聚合分子，能有效将对病毒与细胞受体之间的结合进行阻断的阻断结合分子单元聚合为多聚体，这样实现阻断病毒与细胞受体之间结合的阻断作用的方式，由于聚合分子的聚合作用，提高了病毒阻断蛋白的阻断结合分子单元的个数，能从多点阻断病毒与细胞受体之间的结合，同时由于多个阻断结合分子单元，能同时结合多个病毒，多个聚合结构配合，会产生交联作用，更有效阻断病毒与细胞受体之间的结合，通过实验可以看出，聚合后相比聚合前，对病毒的阻断效果有了明显提高；
B、同时，本发明提供的阻断分子，与新冠病毒的RBD具有较好的特异性结合，经实验证实，能有效抑制病毒；
C、进一步地，阻断分子为多个，可以增加多点阻断病毒与细胞受体之间的结合的机会；
D、进一步地，当病毒阻断蛋白还含有用于促进聚合结构通过细胞表达、细胞分泌或体外无细胞表达的先导肽时，更有利于通过细胞表达、细胞分泌或体外无细胞表达的方式生产前述病毒阻断蛋白；
E、进一步地，当所阻断结合分子单元与聚合分子之间通过增强三维结构的连接分子连接时，能提高病毒阻断效果；
F、进一步地，病毒阻断蛋白含有的酸性结构，能提高对病毒的阻断效果，并且能提高病毒阻断蛋白的热稳定性；
G、本发明涉及的病毒阻断蛋白，经动物实验证实，无毒无刺激，热稳定性好，所以在有效用量内足够保证无毒无害使用，且能在高温环境仍发挥有效作用。
附图说明
图1-图22为实施例2涉及的病毒阻断蛋白对假病毒的抑制实验结果图；
图23为实施例2中，病毒阻断蛋白对假病毒作用前后的电镜图。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中的“冠状病毒”是指冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)且以ACE2作为结合受体的冠状病毒，包括但不限于SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2等。
本发明的ACE2也称为ACEH，称为血管紧张素转化酶2。ACE2由805个氨基酸组成，是具有单一胞外催化结构域的I型跨膜糖蛋白。ACE2为SARS-Cov-2等冠状病毒侵染人体细胞的受体蛋白。
刺突蛋白，也即S蛋白，为病毒表面的一类标志性跨膜蛋白，有两个亚基：S1和S2，ACE2受体结合位点(RBD)位于S1亚基上。它以三聚体的形式组成病毒粒子外膜表面的刺突，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合。
在本发明中，体外无细胞表达，也即无细胞蛋白质合成系统，是一种基于原核或真核细胞的转录-翻译偶联的体系，是指在包含生物提取物和/或确定的试剂的反应混合物中多肽或其他大分子的合成。
本发明中“D2P”体系包括但不限于IVTT反应(体外转录翻译反应)。本发明中，优选IVTT反应。IVTT反应，对应IVTT体系，是在体外将DNA转录翻译为蛋白质(Protein)的过程，因此，我们还将这类的体外蛋白合成体系称为、D-to-P体系、D_to_P体系、DNAto-Protein体系；相应的体外蛋白合成方法，还称为D2P方法、D-to-P方法、D_to_P方法、DNA-to-Protein方法，其与“体外无细胞蛋白合成体系”、“体外表达系统”、“体外蛋白合成体系”、“体外蛋白质合成反应体系”、“无细胞蛋白合成体系”等表述具有相同的含义。蛋白质体外合成系统、体外蛋白合成体系、无细胞系统、无细胞蛋白合成体系、无细胞体外蛋白合成体系、体外无细胞蛋白合成体系、体外无细胞合成体系、CFS体系(cell-free system)、CFPS体系(cell-free protein synthesis system)等描述方式。包括体外翻译体系、体外转录翻译体系(IVTT体系)等。我们还将体外蛋白合成系统称为“蛋白质合成工厂”(Protein Factory)。体外蛋白合成反应，是指在体外无细胞合成体系中合成蛋白的反应，至少包括翻译过程。
本发明体外无细胞蛋白合成体系中需要的蛋白组分(举例如RNA聚合酶)，可以通过内源方式提供，也可以通过外源方式添加。通过内源方式提供时，可以参考包括但不限于文献CN108690139A、CN109423496A、CN106978439A、CN110408635A、CN110551700A、CN110093284A、CN110845622A、CN110938649A、CN111378708A、CN111484998 A、“MolecularandCellular Biology,1990,10(1):353-360”等现有文献及其引用文献提供的基因改造方法，具体地，包括但不限于：将编码序列插入到细胞内游离型质粒，将编码基因整合入细胞基因组，及其组合方式。通过外源方式提供时，用量可以根据体系所需进行控制和调节。
宿主细胞是本领域中众所周知的，包括但不限于大肠杆菌、CHO细胞、中国仓鼠卵巢、NS0、SP2细胞、海拉细胞(HeLa cell)、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusiani))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包含酵母和丝状真菌细胞，丝状真菌细胞包含例如，毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichiaminuta)(甲醇诱导型酵母(Ogataeaminuta)、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichiasalictaria)、松栎毕赤酵母(Pichia g uercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母菌(Pichiasp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)以及粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。
进一步地，体外无细胞蛋白合成体系，包括但不限于大肠杆菌体外蛋白合成体系、细菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞(如HF9、Hela、CHO、HEK293)体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、酵母细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系。酵母细胞选自下组：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母中的任意一个或多个的组合。克鲁维酵母例如式为乳酸克鲁维酵母。
本发明的体外蛋白合成体系、模板、质粒、目标蛋白、体外蛋白合成反应(孵育反应)、各种制备方法、各种检测方法等技术要素，还可以各自独立地从下述文献中选择合适的实施方式或实施方法，包括但不限于CN111484998A、CN106978349A、CN108535489A、CN108690139A、CN108949801A、CN108642076A、CN109022478A、CN109423496A、CN109423497A、CN109423509A、CN109837293A、CN109971783A、CN109988801A、CN109971775A、CN110093284A、CN110408635A、CN110408636A、CN110551745A、CN110551700A、CN110551785A、CN110819647A、CN110845622A、CN110938649A、CN110964736A等文献。除非和本发明目的相冲突，否则，这些文献及其引用文献以全部内容、全部目的被引用。
本发明，提及对病毒的抑制、中和以及阻断等，都属于让病毒失活的含义。
本文的“聚合分子”，指聚合分子之间能够进行结合，例如通过分子间作用力，或者特定结构域等自缔合。
本文的“单体”指通过聚合分子聚合之前的单个结构。
本文的“多聚体”指通过聚合分子之间的结合，将多个单体聚合到一起形成的结构。
本文的“防护”，指作为日常保护和预防用，可以是经人体吸收起到作用，也可以是对人体周围的环境进行作用，例如对人周围呼吸的空气作用，达到防护的目的，也可以是对可能会附着病毒的人体皮肤或物品表面进行擦拭。
本文的“香味物质”，指具有空气清新作用的物质，例如精油等挥发性香味物质，又例如薄荷醇物质等挥发性香味物质，可以为液体、固体或半固体等形式，固体例如粉末，半固体例如凝胶。
本发明提供的用于擦拭的病毒防护病毒防护溶液，其特征在于，包括：病毒阻断蛋白和水溶剂，其中，病毒阻断蛋白具有能与病毒的S蛋白特异性结合而使得病毒失活的阻断结合分子单元，优选地，病毒为冠状病毒。
这样，由于病毒防护溶液中具有的前述病毒阻断蛋白，采用这种溶液进行擦拭就能通过阻断结合分子与病毒的S蛋白特异性结合而使得病毒失活，从而达到防护的作用。
采用这种病毒防护溶液进行擦拭的方式，包括但不限于以下方式或以下方式的不同结合：
(1)例如，直接喷洒这种病毒防护溶液到人体皮肤表面或物体表面，再用无纺布、棉球、海绵或擦拭巾等擦拭物对喷洒了病毒防护溶液的这些表面进行擦拭；
(2)例如，用这种病毒防护溶液浸润类似前述的擦拭物制备成类似湿巾等的产品，再用这些擦拭物对上述这些表面进行擦拭；
(3)用这种病毒防护溶液预润湿前述的擦拭物，制备成成品的预润湿擦拭物产品，直接使用这种预润湿擦拭物对前述这些表面进行擦拭。
另外，本发明的物体表面，包括但不限于各种实物表面以及蔬菜水果等。
水溶剂的质量占比范围为大于等于90％，优选地，大于等于95％，更优选地，大于等于99％。这里的质量占比，指病毒防护溶液中，水溶剂的质量占有整个病毒防护溶液质量的百分比，本文没有特殊说明，均类似解释。
优选地，水溶剂为蒸馏水、饮用水、无菌水、超纯水以及去离子水中的一种或多种的组合。
理论上，病毒阻断蛋白在病毒防护溶液中的浓度，在有效作用以及毒性以下，都可以，在一示例中，病毒阻断蛋白的质量占比大于等于0.0001％，优选为0.0001-0.0007％，更优选为0.0001％-0.00035％，。
在一示例中，病毒防护溶液还包括：稳定剂、保湿剂、防腐剂、香味物质以及抗菌剂中的一种或多种的组合。
稳定剂主要的目的是用于保持病毒防护溶液的稳定性，稳定剂具有以下特征中的一个或多个：
(1)稳定剂含有pH调节剂、金属离子螯合剂以及表面活性剂中的一种或多种；
(2)稳定剂的质量占比为0.3％±1％，更优选地，为0.3％±0.5％。
通过稳定剂的作用，能保持病毒阻断蛋白至少2年保持稳定发挥作用。
在一示例中，pH调节剂具有以下特征中的一种或多种：
(1)保持病毒防护溶液的pH在6-7.5，优选地，在6.5-7.2，这样有利于保持病毒阻断蛋白的稳定性；
(2)优选地，pH调节剂选自十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钠或其组合。
在一示例中，金属离子螯合剂优选地，选自二水合乙二胺四乙酸二钠；
在一示例中，表面活性剂优选地选自非离子型表面活性剂，例如，选择吐温80(聚山梨酯-80)。
保湿剂主要目的是为了保持病毒阻断溶液在前述擦拭使用中的湿润持续时间，保湿剂的质量占比为小于等于0.3％，优选地，小于等于0.2％。
在一示例中，保湿剂选自甘油。
香味物质主要目的是起到清新的作用。
在一示例中香味物质的质量占比小于等于0.2％，优选地，0.04％-0.1％，在该范围下，使用挥发性的香味物质时，还能具有一定的杀菌作用，进一步优选地为0.05％-0.1％。
在一示例中，香味物质优选地，选自挥发性香味物质，更优选地，选自薄荷醇、香精、桉油精、麝香草酚、琥珀酸薄荷酯中的任意一种或多种，如上，除了起到清新作用，还能具有一定的杀菌功能。
在一示例中，防腐剂的质量占比小于等于0.05％，优选地，小于等于0.02％。
在一示例中，防腐剂选自苯扎氯氨和醋酸氯已定中的任意一种或两种的组合。
抗菌剂选择无刺激无毒的为主。
病毒阻断蛋白中包括的各个组成部分之间的氨基酸连接顺序没有特别的限制，优选地，按前一个的C端与后一个的N端的顺序连接。
在一示例中，病毒阻断蛋白还具有让其形成为多聚体的聚合分子，也即通过聚合分子之间的聚合作用，病毒阻断蛋白呈现多聚体的形式，病毒阻断蛋白未被聚合前，病毒阻断蛋白为单体，而聚合而，则可能形成不同单体数量聚合的多聚体，优选地，多聚体为数量为2-10中任意一种的单体聚合形成，例如，聚合后的病毒阻断蛋白为2倍多聚体、4倍多聚体、6倍多聚体、8多聚体。
聚合，指例如通过分子间作用力等，发生例如自缔合的结合，将单体聚合为多聚体。为了便于说明，本文的聚合分子，用A表示，本文的阻断结合分子单元用B表示。一示例中，病毒阻断蛋白的基本结构如下式一：
B-A(式一)：优选地，阻断结合分子单元的C端与聚合分子的N端连接。式中“-”，表示B和A之间的连接部分，该连接部分的氨基酸是有或无，下同。
通过聚合分子的聚合作用，提高了病毒阻断蛋白的阻断结合分子单元的个数，也即增加了竞争阻断的点，能从多点阻断病毒与细胞受体之间的结合，同时由于多个阻断结合分子单元，能同时结合多个病毒，产生交联作用，更有效阻断病毒与细胞受体之间的结合。
在一示例中，聚合分子选择表1中的任何一项，优选地，聚合分子包含链霉亲和素，进一步优选地，含有与SEQ ID NO:1具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。通过这样的聚合分子，使得聚合产生的四聚体达到80％以上，甚至是90％以上。
Figure SMS_1
Figure SMS_2
在一示例中，病毒阻断蛋白还包含将阻断结合分子单元与聚合结构连接以增强三维结构的连接分子，为便于说明，连接分子用D表示。
在一示例中，连接分子包含有荧光类蛋白、人免疫球蛋白G4、Fc以及HSA中的任意一种或多种，例如，连接分子是eGFP荧光蛋白或经其改造得到，优选地，改造是通过对eGFP删除部分氨基酸得到。
一优选地，连接分子包含与SEQ ID NO:2具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
在一示例中，连接分子的N端与阻断结合分子单元连接，连接分子的C端与聚合分子的设置在N端的单一结合部位连接，此时病毒阻断蛋白的基本氨基酸结构如式二所示：
B-D-A(式二)：优选地，B的C端与D的N端连接，D的N端与A的C端连接。
在一示例中，阻断结合分子单元含有至少一个与病毒的受体结合区域进行结合的阻断分子。也即可能包括一个阻断分子，也可能是多个阻断分子，当包括多个时，这些阻断分子的氨基酸序列可能是相同的，也可能是不同的。优选地，所述受体结合区域位于所述S蛋白上，更进一步地，以ACE2为结合受体。
当阻断分子为多个时，则可以增加多点阻断病毒与细胞受体之间的结合的机会，提高前述的阻断作用。
在一示例中，当阻断分子为多个时，阻断分子之间从C端到N端顺序连接，也即前一个的C端和后一个的N端连接，具体为B1-B2-B3…Bn(n为大于1的正整数)；更优选地，当阻断结合分子单元和聚合分子之间通过连接分子连接时，连接分子的N端与最末一个阻断分子的C端连接，连接分子D的C端与聚合分子连接，具体为B1-B2-B3…Bn-D-A。
在一示例中，阻断分子含有与SEQ ID NO:7-9以及16-19中任意一个具有一致性或与SEQ ID NO:7-9以及16-19中任意一个具有至少50％、60％、70、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。具体解释就是：
阻断结合分子单元中含有的每个阻断分子，可能含有SEQ ID NO:7-9以及16-19所示几种氨基酸序列中的任意一种，或是含有与SEQ ID NO:7-9以及16-19中的任意一种具有至少50％、60％、70、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
例如，阻断分子含有与SEQ ID NO:7具有一致性的氨基酸序列，又例如，阻断分子是与SEQ ID NO:7具有至少50％、60％、70、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16-19，具体显示如下：
SEQ ID NO:16(Pep170)：
STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLGGGGSGGGGSTSGGVTGGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRN；
SEQ ID NO:17(Pep180)：
STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALGGGGSGGGGSTSGGVTGFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRN；
SEQ ID NO:18(Pep190)：
STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQGGGGSGGGGSTSGGVTGRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRN；
SEQ ID NO:19(Pep200)：
STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQGGGGSGGGGSTSGGVTGGHAGGTVDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRN。
在一示例中，病毒阻断蛋白还含有用于促进病毒阻断蛋白通过细胞进行表达得到、细胞分泌得到或体外无细胞进行合成表达得到的先导肽(为便于说明，用C表示)，先导肽包含与SEQ ID NO:10具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，此时，病毒阻断蛋白的基本氨基酸结构例举如式五-式七所示：
C-B-A(式五)：优选地，C的C端与B的N端连接，B的C端和A的N端连接；
有两个阻断肽时，优选地，先导肽与任意一个阻断分子的N端连接，此时，病毒阻断蛋白的结构例如式六所示：
D-B1-B2-A(式六)：该结构式的连接，优选地，C的C端与B1的N端连接，B1的C端与B2的N端连接，B2的C端与A的N端连接；
当有连接分子且多个阻断分子时，病毒阻断蛋白的结构
例如式七所示：
C-B1-B2-D-A(式七)：该结构式的连接，优选地，也是前一个的C端与后一个的N
端连接，也即，C的C端与B1的N端连接，B1的C端与B2的N短链连接，B2的C端与D的N端连接，D的C端与A的N端连接。
在一示例中，病毒阻断蛋白还具有酸性结构(为便于说明，用E表示)，通过酸性结构，能提高病毒阻断蛋白的稳定性和活性。
在一示例中，酸性结构为带有负电的氨基酸短链聚合物，进一步地，具有以下特征中的一个或多个的组合：
(1)酸性结构设置在病毒阻断蛋白氨基酸序列的C末端；
(2)优选地，的短链聚合物的氨基酸的个数为0-50、2-40、3-30、2-20或2-10；
(3)的带有负电的氨基酸为天冬氨酸和/或谷氨酸。
在一示例中，酸性结构含有至少两个连续的D天冬氨酸氨基酸(为便于说明，用d表示)，和/或至少两个连续的E谷氨酸氨基酸(为便于说明，用e表示)，和/或至少一组D天冬氨酸氨基酸和E氨基酸的组合。例如，酸性结构含有10个连续的天冬氨酸(用10d表示)、10个连续的E谷氨酸(用10e表示)，8个连续的D天冬氨酸和8个连续的E谷氨酸(用8d8e表示)，5个D-E(5de，一个d和一个e是一组，总共5组)。
在一示例中，病毒阻断蛋白还含有标签蛋白(为便于说明，用F表示)，标签蛋白为了纯化得到病毒阻断蛋白用，在一示例中，标签蛋白包含与SEQ ID NO:15具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
优选地，标签蛋白通过C端与阻断结合分子单元的N端之间连接，也即标签蛋白的C端在阻断结合分子单元N端一侧。
另外，本文的病毒阻断蛋白具有的热稳定温度接近70℃，优选地，大于等于80℃。
在一示例中，本文的病毒阻断蛋白通过蛋白质工程技术进行生产，编码病毒阻断蛋白的核酸或含有其的载体，用于细胞内表达、细胞分泌性或体外无细胞合成表达获得。
在一示例中，本文的病毒阻断蛋白优选通过康码(上海)生物科技有限公司D2P技术进行生产，如D2P系统，D2P技术进行生产，如包括如下步骤：该基因经过编码优化并克隆到pD2P载体中。质粒是使用Ampi系统扩增，然后添加到蛋白质工厂快速反应中系统(康码(上海)生物科技有限公司)，体积比为1:30。这将反应混合物在30℃下孵育4小时，然后通过离心收集纯化。将无细胞混合物的上清液与磁性His Monster Beads(Kangma Healthcode(Shanghai)Biotech)在4℃下旋转1小时。用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0,500mMNaCl，10mM咪唑)并用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl、250mM咪唑)。
Ampi系统为：终浓度为20-30μM的随机引物，0.05-0.15μg/mL的质粒模板，0.5-1mM的dNTP，2×BSA，0.05-0.1mg/mL的phi29DNA聚合酶，1×phi29反应缓冲液(成分为50mMTris-HCl,10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mM DTT,pH 7.5)。
本发明提供的病毒防护溶液，采用病毒阻断蛋白特异性结合病毒D蛋白而使得病毒失活，特别是，阻断结合分子单元含有至少一个与病毒的受体结合区域进行结合的阻断分子，经实验证实，只需要极低浓度就能实现对病毒的有效防护，无毒无刺激无腐蚀性，可以广泛用于物体表面以及人体皮肤的擦拭中，或制备相应的擦拭产品用于擦拭，起到病毒防护的作用，例如对包装箱、快递等的擦拭，只需要少量使用，而且不会造成对各种包装和物品的腐蚀破坏，安全有效，又例如，还可以用于日常手部、面部等皮肤的清洁，甚至用于蔬菜水果的表面擦拭等。
可以制备成的擦拭产品，例如采用前述的病毒防护溶液制成的擦拭液，又例如通过前述的病毒防护溶液预湿润的擦拭物。
本发明还提供一种用于病毒防护的预湿润擦拭物，其特征在于：
擦拭物由前述的病毒防护溶液浸渍的基体材料构成，基体材料可以是各种纺织物、无纺布、棉花以及海绵等能被浸润并用于擦拭的材料。
在一示例中，其中，用于浸渍的病毒防护溶液与基体材料的重量比为1：1.7-1：5。
实施例1
本实施例以病毒为新冠病毒、细胞受体为ACE2为例的具体实验，说明各种结构的阻断优势。
1.实验例涉及的病毒阻断蛋白的制备
IVTT反应：将优化后的目标蛋白的基因序列(包括编码前述各种病毒阻断蛋白结构的基因序列)插入到质粒中，然后加入到自制的乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系中，以乳酸克鲁维酵母(KluyveromyceslactisNRRL Y-1140)制备体外。本实施例所用体外无细胞蛋白合成体系(总体积30μL)：包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物50％(v/v)，22mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，90mM醋酸钾，4.0mM醋酸镁，3.0mM核苷三19磷酸混合物，0.16mM氨基酸混合物，22mM磷酸钾，0.003mg/mL淀粉酶，3％(w/v)聚乙二醇(PEG-8000)，340mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量，对应约55mg/mL)，0.04mg/mL外源添加的RNA聚合酶，以及15ng/μL目标蛋白DNA等。当荧光蛋白DNA的种类大于1时，这里的15ng/μL为各荧光蛋白DNA的总浓度。将上述反应体系置于22-30℃的环境中，静置孵育约20h。
IVTT反应后，纯化使用His磁珠纯化，蛋白洗脱后，超滤离心置换至PBS缓冲液中。用0.22μm的针筒滤器过滤后，4度保存待用。
2.以下对本实施例各种实验涉及的制备的病毒阻断蛋白结构式进行说明：
Figure SMS_3
/>
Figure SMS_4
/>
Figure SMS_5
表2中涉及的序列说明(表3)：
Figure SMS_6
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Figure SMS_7
3.预实验测试假病毒与细胞
我们所使用的新冠假病毒表面表达了S蛋白，内部包装了荧光素酶基因。在感染细胞后，可在细胞内表达荧光素酶蛋白，通过加入其底物，检测荧光素酶底物的发光值，可以得到假病毒感染细胞的效率。
首先对假病毒的细胞感染进行预实验测试，确定假病毒的稀释度。将假病毒以30倍的梯度，逐级稀释(具体见表4)，并分别感染HEK293T或HEK293T-ACE2(过表达ACE2的HEK293T细胞)，每种感染做两个平行实验，最后发现病毒感染细胞时，荧光素酶检测的线性窗口在S3-S7范围内(稀释270-21870倍)。假病毒供应商建议的以540倍的稀释度感染细胞，所以后续我们在实验中采用的假病毒稀释度为540倍。
通过使用野生型新冠毒株对野生型和过表达ACE2的HEK293T细胞的感染实验发现，在过表达ACE2的细胞中，病毒感染的效率明显高于野生型的细胞株，因此，后续实验中，选用了过表达ACE2的HEK293T作为测试细胞株。
Figure SMS_8
/>
Figure SMS_9
4.Kd评估
表面等离子共振(SPR)实验SPR研究使用Biacore T200生物传感器(GEHealthcare，美国)进行。将病毒阻断蛋白通过胺偶联固定在S系列传感器芯片CM5(GEHealthcare，美国)上。His-tagged RBD的参考菌株和Omicron变体(Sino Biological Inc，北京，中国)被稀释至六种浓度(0.25、0.5、1、2、4和8nM)，Delta变体的RBD(SinoBiological Inc，北京,中国)稀释至(0.5,1,2,4,8和16nM)。在25℃下进行单循环动力学分析。在10mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％Tween下，结合相设置为120s和30μL/min，解离相分别设置为300s和30μL/min-20作为运行缓冲区。重复9次分析循环，分析物浓度按升序排列。使用Biacore T200评估软件(2.0版，GE Healthcare，美国)计算解离常数(Kd)值。
结果显示，测试本发明表2中提供的结构，与所有三种病毒株的RBD结构域有强烈的相互作用，即原始、Delta和Omicron变体具有牢固的结合亲和力。对原始、Delta和Omicron变体的解离常数(Kd)值分别能达到1.25nM、0.837nM和0.656nM。
总而言之，尽管Omicron变体具有更高的健康风险和惊人的免疫逃避，但本发明的病毒阻断蛋白仍然有资格与这些变体的RBD结构域结合。
5.对表2提供的不同结构进行的针对假病毒的病毒阻断实验，实验步骤如下：
(1)将待感染HEK293T-ACE2细胞细胞接种于48孔细胞培养板中。接种量为1.5×104个细胞每孔；次日进行假病毒感染实验时，细胞密度约在30％左右。
(2)次日，从-80℃取出SARS-CoV-2(2019-nCoV)S蛋白假病毒，置于冰上融化或4℃条件下自然融化。待完全融化后，用完全培养基(DMEM，10％胎牛血清，1％双抗，0.75μg/mL嘌呤霉素)进行270倍稀释成假病毒稀释液。
(3)病毒阻断蛋白的原始浓度为1μM，将其按10倍梯度用完全培养基连续稀释。将梯度稀释的病毒阻断蛋白与假病毒稀释液1：1体积混合成假病毒感染液，并将假病毒感染液在室温孵育1小时。
(4)1小时后，从培养箱取出提前铺好HEK293T-ACE2细胞的48孔板，确认细胞密度及状态后，吸去上层培养基。沿孔壁将200μL假病毒感染液加入每个孔中，避免冲起细胞。将48孔板放入培养箱中培养6小时。
(5)6小时后，小心吸出假病毒感染液，并更换300μL新鲜的完全培养基。继续在培养箱中培养48小时。
(6)48小时后，吸出培养基，并在每孔中小心加入200μL 1×PBS润洗细胞，避免冲起细胞。小心吸出PBS，并于每孔中加入65μL 1×细胞裂解液并在室温孵育15-20分钟。15-20分钟后，立即检测荧光素酶的活性，或置于-20℃保存。
(7)将5μL细胞溶解液与5μL荧光素酶底物(Promega E1501萤光素酶检测系统)混合，将混合液加入384孔板中，立即用Perkin Elmer EnVision 2102多功能酶标仪上检测荧光素酶的活性，并判定病毒阻断蛋白的抑制效率。
实验结果如图1-图23显示：
其中，图中的横坐标表示用的病毒阻断蛋白的浓度；图中的纵坐标则表示阻断实验后抑制效果(抑制率)，抑制率计算如下：
Figure SMS_10
其中，V0为仅加了病毒的作为对照的RLU读数；V1为加有病毒阻断蛋白和病毒的样品RLU读数。
纵坐标数值越高，表示效果越好。
Delta表示针对Delta株假病毒进行抑制测试，Original表示针对新冠野生型假病毒进行抑制测试，Omicron针对奥密克戎株假病毒进行抑制测试)；
图中每组柱形图分别按从左到右的顺序对应图例或标题中显示的结构名称的结果图：例如图4中，图例从左到右分别是Kmds008、Kmds007、Kmds001以及Kmds009-2，则每组柱形图的顺序也分别按这个顺序对应相应结构的结果。
结果显示：
I.聚合前后效果：
如图1-3显示，聚合前(Kmds009)比聚合后(Kmds009-2)效果差；聚合前Kmds042比聚合后(Kmds003)效果差；聚合前Kmds043比聚合后(Kmds012)效果差；
II.不同阻断分子的阻断效果，实验表面，本发明的阻断分子与新冠病毒的S蛋白具有特异性结合能力：
(1)如图4所示，不同阻断分子均能在较低浓度抑制新冠和德塔；
(2)如图5所示，0052去除聚合分子和连接分子，仍能在较低浓度有抑制效果。
III.加酸性结构：
(1)加酸性结构效果比不加好：如图6，Kmds003、Kmds002和Kmds006分别加了酸性结构的，效果比未加酸性结构的Kmds001好；酸性结构酸性结构；
(2)加8d8e、10e效果好：如图6显示，Kmds006比Kmds003和Kmds002对病毒的阻断效果好；如图7显示，Kmds012和Kmds014比Kmds011和Kmds013效果好；
IV.连接分子：
(1)如图8用不同的连接分子，效果接近：KMds104,KMds105，KMds121，KMds112；
(2)对eGFP进行部分改造，与未改造前对比：KMds003、KMds012以及KMds104分别改造后分别得到KMds045、KMds046以及KMds109，结果分别如图9-11所示，改造前后效果接近；(3)对连接分子进行删除，删除后，依然能对病毒起到抑制作用，结果如图12-14：KMds003，KMds012，KMds104的Tram被删除后，分别得到KMds036，KMds038，KMds108。
V.先导肽：
将KMds003，KMds006，KMds012，KMds014，KMds044基础上删去leading peptide序列，分别得到KMds030，KMds031，KMds032，KMds033，KMds104，结果分别如图15-22所示，根据结果，先导肽对病毒阻断蛋白对病毒的抑制性没有影响；
V.交联作用：
对病毒阻断实验中的具有聚合分子的结构处理病毒前后做了电镜观察，如图23中，图23中A是未经病毒阻断蛋白处理的，其他是经病毒阻断蛋白处理后不同放大倍数的图，从图中可见，电镜下，经具有聚合分子处理病毒后，图片中显示出现大的斑块，也就是，我们的结构能实现对病毒的交联集聚，从而能提高对病毒的交联阻断抑制作用。
VI.假病毒IC50结果：
测试结果显示，在所有测试中，针对同样的阻断分子：
具有酸性结构、聚合分子以及连接分子的，IC50值最低的能达到为42.4pM，达到极低的级别；不存在酸性结构，IC50值能达到为0.222nM左右；
没有连接分子、没有聚合分子、连接分子和聚合分子都没有的，对假病毒的抑制作用相比来说，有降低，其中IC50值分别能达到1.054、2.404和1.032nM。
6.活病毒测试
我们研究了表2中的病毒阻断蛋白对不同SARS-CoV-2毒株的抑制能力，包括原始毒株、Alpha、Beta、Delta和Omicron变体。结果显示：
原始菌株被病毒阻断蛋白强烈抑制(IC50为108.6pM)；
并且另一方面，病毒阻断蛋白可以在极低浓度(IC50分别为92.8、121.9、61.0和121.9pM)下显示出对Alpha、Beta、Delta和Omicron变体的有效抑制能力；
与中和原始SARS-CoV-2的能力相比，病毒阻断蛋白抑制Delta变体的能力增加了约1.8倍，抑制其他菌株的能力几乎相同。
对活病毒的测试表明，尽管刺突蛋白存在大量突变，但本发明的病毒阻断蛋白在不同的SARS-CoV-2变体中仍保持极低水平的强大抑制能力。
7.动物实验
SARS-CoV-2野生型(WT)毒株(IVCAS 6.7512)由中国科学院武汉病毒研究所国家病毒资源中心提供。杂合B6/JGpt-H11em1Cin(K18-ACE2)/Gpt小鼠(K18-hACE2 KI小鼠)购自南京GemPharmatech。
在特定的无病原体(SPF)环境中，在单独通风的笼子(IVC)中饲养和繁殖小鼠。动物实验由武汉大学动物实验中心的认证人员执行，经机构动物护理和使用委员会(AUP#WP2021-0602)批准。动物生物安全三级实验室设施下传染性SARS-CoV-2病毒的方案和程序已获得机构生物安全委员会(IBC，协议#S01322010A)的批准。
所有样品的灭活均按照IBC批准的标准程序进行，用于将样品从高密封中取出。每只小鼠都感染了2.5×102PFU SARS-CoV-2。对于阴性对照组，将SARS-CoV-2与对照缓冲液预混合30分钟。
对于0.25nM病毒阻断蛋白预混治疗组，将SARS-CoV-2与0.25nM病毒阻断蛋白预混30分钟；
对于25nM病毒阻断蛋白预混治疗组，将SARS-CoV-2与25nM病毒阻断蛋白预混30分钟；
然后用预混物通过鼻内途径接种K18-hACE2小鼠。
将组织称重并在Tissue Cell-destroyer 1000仪器(NZK LTD)中在1000μL PBS中匀浆。通过在5,000rpm下离心40秒来澄清组织匀浆，将100μL上清液与400μLTrizol LS混合以提取病毒RNA。
使用pCMV-N质粒和SARS-CoV-2N基因引物(F引物：ATGCTGCAATCGTGCTACAA；R引物：GACTGCCGCCTCTGCTC)构建SARS-CoV-2N基因标准曲线，计算病毒拷贝数。使用Prism版本7(GraphPad软件)通过学生测试分析数据。P值<0.05被认为具有统计学意义。
为了测试病毒阻断蛋白在小鼠模型中的作用，我们用SARS-CoV-2和病毒阻断的预混物感染了K18-hACE2小鼠。在感染后第2天和第5天(dpi)处死小鼠。在5天的时间过程中，每天326监测小鼠的体重变化和死亡率。
鼻内接种SARS-CoV-2的K18-hACE2小鼠在感染后3至4天开始体重减轻，并在4dpi时死亡；
与对照小鼠相比，接种病毒阻断蛋白和SARS-CoV-2预混物的小鼠显着减轻体重减轻并显着提高存活率，尤其是使用高剂量病毒阻断蛋白时。
在感染SARS-CoV-2的K18-hACE2的肺组织中检测到高水平的SARS-CoV-2RNA，而在感染SARS-CoV-2和低剂量病毒阻断蛋白混物病毒RNA的小鼠中病毒RNA水平较低，在感染高剂量病毒阻断蛋白和SARS-CoV-2预混物的小鼠的肺组织中甚至检测不到水平。总之，这些数据表明高剂量病毒阻断蛋白可以显着减轻体重减轻，提高小鼠存活率，并抑制小鼠的病毒拷贝数。
8.毒性实验
毒理学试验按《消毒技术标准》进行(2002年版)第二部分《消毒产品检验技术标准》2.3.1急性经口毒性试验。异常毒性试验按《中华人民共和国药典2020年版(第四部分)》《通则》《生物制品原则、检验方法》，异常毒性试验。
ICR小鼠由南京医科大学动物中心提供。
Sprague Dawley(SD)大鼠购自邳州东方繁育有限公司。
新西兰大白兔由益正安里茂生物科技有限公司提供。动物饲养于20℃-26℃，局部屏障系统内相对湿度为40％-70％。
针对表2中涉及的结构，进行以下毒性实验：
(1)急性经口毒性
20只SPF ICR小鼠(18.0～22.0g)和20只SPF SD大鼠(180～220g)用于急性经口毒性试验。雄性和雌性的数量是相等的。对过夜禁食的小鼠和大鼠施用表3中的结构式对应制备的病毒阻断蛋白，剂量5000mg/kg·bw，使用胃插管以单次。接下来每周监测动物的毒性和死亡率的临床症状14天(第0天、第7天和第14天)。行为、死亡人数和体重分别为评估，并在观察期结束时对它们进行解剖。
根据试验结果，给予5000mg/kg·bw剂量的病毒阻断蛋白不会导致过夜禁食的小鼠和大鼠发病，并且体重正常。病毒阻断蛋白对小鼠和大鼠的LD50值均在5000mg/kg·bw以上。观察期间未发现中毒和死亡迹象。
(2)急性吸入毒性试验
20只SPF ICR小鼠(18.0～22.0g)用于急性吸入毒性试验。雄性和雌性的数量是相等的。将2.2g表3中对应制备的病毒阻断蛋白置于220L毒物暴露柜，浓度假定为10,000mg/m3。这吸入的暴露时间设定为2小时。老鼠的症状和死亡是在14天观察期间(0天、7天和14天)记录。
根据试验记过，在雌性和雄性小鼠中，在2h暴露下的病毒阻断蛋白LC50值均高于10,000mg/m3。小鼠没有表现出异常迹象，现体重稳定增加是正常的。因此，在目前的实验条件下，病毒阻断蛋白符合法规，被认为是无毒的。
(3)急性眼刺激试验
三只雄性新西兰兔(2.5～3.5kg)用于急性眼刺激试验。将0.1mL表3中对应制备的病毒阻断蛋白原液滴入兔右眼结膜囊，左眼滴入生理盐水作为对照。闭眼4s，30s后用生理盐水冲洗。观察家兔结膜、虹膜和角膜的损伤和恢复情况，为期21天(1小时、24小时、48小时、72小时、7天、14天和28天)。对角膜损伤、虹膜损伤、结膜充血和结膜水肿的严重程度进行评分。
根据试验结果，测试的病毒阻断蛋白在兔子身上没有表现出眼刺激的迹象。三只兔子在24h、48h和72h的评分均小于1，如表1所示。因此，本发明病毒阻断蛋白的刺激性归类为无刺激性。
(4)小鼠骨髓多染红细胞(PCE)微核试验
将50只ICR小鼠用于小鼠骨髓多染红细胞微核试验。男性的数量等于女性的数量。将动物分成五组，每组五只雌性小鼠和五只雄性小鼠。试验组分别以5000、2500和1250mg/kg·bw的剂量分别给予一次表3中对应制备的病毒阻断蛋白。一组作为阴性对照并用溶剂纯化水处理。另一组作为阳性对照，腹腔注射40mg/kg·bw的环磷酰胺(CP)。测试组在0小时和24小时通过口服给药暴露于病阻断蛋白毒。第二次暴露于病毒阻断蛋白后6小时处死小鼠，制备骨髓涂片。计算每只动物1000个多染红细胞(PCE)中微核的出现。一旦计数了200个PCE，就确定了PCE与正色素红细胞(NCE)的比率。通过U检验进行统计分析。当与阴性对照相比，实验组微核形成的发生率显着增加时，判断试验剂对体内染色体有害，这应以剂量-反应相关性发生。
对于微核试验，雌性和雄性小鼠的微核形成率在三个实验组中与阴性组相比无显着差异(P<0.05)，与阳性对照组相比差异显着(P<0.05)，如如表2所示。此外，任何实验组与阴性对照之间的PCE/NCE比率差异均在20％以内。
(5)异常毒性实验
10只雌性SPF ICR小鼠(18.0～22.0g)和4只标准级雌性豚鼠(250～350g)进行异常毒性试验。
10只小鼠随机分为试验组和对照组，每组5只。试验组腹腔注射0.5mL样品，对照组腹腔注射0.5mL氯化钠。观察两组体质情况7d。将4只雌性豚鼠随机分为试验组和对照组，每组2只豚鼠。试验组腹腔注射0.5mL样品，对照组腹腔注射0.5mL氯化钠。观察两组体质情况7d。
在所有测试中，本发明提供的病毒阻断蛋白均没有引起可观察到的毒性作用。
9.测试病毒阻断毒蛋白的热稳定性
使用Unchained公司的Uncle设备，测试了几种蛋白的热稳定性。Tmagg表征蛋白在加热过程中发生高聚的温度，结果见表5。
Figure SMS_11
同时含有B1+B2的Kmds001 Tmagg值低于50度，但上加8D8E(Kmds006)酸性结构后，Tmagg值比不加尾(Kmds001)高很多，增加了近1倍。也就是说这个酸性结构能够增加蛋白的稳定性。
另外，经测试，表2中各个结构的病毒阻断蛋白的平均Tm接近80℃，表明本发明提供的病毒阻断蛋白可免受极端温度的影响。
10.加速稳定性试验
稳定性研究在两个不同的温度下同时进行，4℃和37℃(三个重复，100uL的10nM病毒阻断蛋白)。
另一组没有加病毒阻断蛋白作为阴性对照(NC)。在90天内(0天、15天、30天、45天、60天、75天和90天)，每15天对它们进行3次取样。通过假病毒中和试验评估抑制百分比，并通过以下公式计算：抑制百分比＝(NC-样品)/NC(RFU)。
试验结果显示：在4℃或37℃下储存超过90天后，病毒阻断蛋白的抑制效率几乎没有受损(>99.9％)，表明本发明的病毒阻断蛋白是一种超稳定的SARS-CoV-2阻断剂。
实施例2-实施例4
实施例2-4，为采用不同配方的病毒防护溶液对基体材料进行完全浸润得到预湿润擦拭物，采用的基体材料为无纺布，各个实施例的病毒防护溶液组成如下表，其中，实施例3和实施例4的防腐剂分别采用苯扎氯氨和醋酸氯已定。
Figure SMS_12
不同配方中，分别采用实施例1提供的不同结构的病毒阻断蛋白制备得到不同的配方。
实施例5
本实施例对实施例2-4得到的预湿润擦拭物，将其中的病毒防护溶液挤出进行病毒阻断效果测试。
1.实验材料
T-25flask:surface area 25cm2；DMEM培养基；Fetal Bovine Serum(FBS胎牛血清)；Penicillin streptomycin(Pen-Strep双抗)；0.25％ Trypsin-EDTA胰酶；Puromycin；1x PBS；DMSO(Tissue Culture Grade)二甲亚砜；75％ Ethanol乙醇(清洁用)。
2.仪器
电子天平；电动移液器；生物安全柜。
3.实验步骤
3.1.样品信息
实施例2-4制备得到的预湿润擦拭物。
3.2.细胞铺板
将待感染HEK293T-ACE2细胞接种于48孔细胞培养板中。接种量为1.5×104个细胞每孔；次日进行假病毒感染实验时，细胞密度约在30％左右。
血细胞计数板计算方法：
1)在细胞60-70％汇合度时传代，不让细胞长到多于80％；
2)在生物安全柜内，倒掉培养基，并加入1-2mL预热的1x PBS。在生物安全柜内静置1-2min之后倒掉PBS；
3)在T-25内加入1mL预热的trypsin-EDTA胰酶，放入37°培养箱消化1-2min，不多于2min；
4)在T-25内加入2-3mL完全培养基中和胰酶，用移液器吹打细胞，使细胞分散。转移至15mL离心管；1,000×rpm,4℃离心5分钟；
5)用5mL完全培养基重悬细胞，轻轻吹打使细胞分散。取出100-200微升细胞悬液至1个1.5毫升离心管；
6)在血细胞计数板上盖上玻璃片(注意小心不要打碎玻璃片)。从细胞悬液里取出10微升并加入血细胞计数板和玻璃片之间的缝隙中；
7)数网格1-5内细胞个数，并取平均值；
8)混合完全培养基及细胞悬液，并进行铺板。
3.3.感染(样品检测)
从-80℃取出SARS-CoV-2(Omicron)S蛋白假病毒，置于冰上自然融化。
待完全融化后，将假病毒用完全培养基进行270倍稀释。取40ul假病毒，加入到10.8ml完全培养基中，混合均匀。没用完的假病毒稀释液存放于-80℃冰箱。
将检测样品与假病毒稀释液1:1混合，室温孵育1h。
取样品330ul于灭过菌的1.5mL离心管中，加入假病毒稀释液330ul，混合均匀。放置于室温，孵育1h。
同时，设置阴性对照品。
样品信息如下：
Figure SMS_13
从培养箱取出提前铺好HEK293T-ACE2细胞的48孔板，确认细胞密度及状态后，吸去上层培养基。沿孔壁将200μL假病毒感染液加入每个孔中，避免冲起细胞，每个样品加3个复孔。将48孔板放入培养箱中培养6小时。
6小时后，小心吸出假病毒感染液，并更换300μL新鲜的完全培养基。继续在培养箱中培养48小时。
3.4.细胞裂解
用水稀释5x细胞裂解液至1x，细胞裂解液总体积＝65μL/孔x孔总数x 1.1。多余的1x裂解液可放在4°冰箱；
感染的细胞在孔板中培养48小时后，吸出培养基，并在每孔中小心加入200μL 1×PBS润洗细胞，避免冲起细胞。
小心吸出PBS，并于每孔中加入65μL 1×细胞裂解液并在室温孵育15-20分钟，15-20分钟后，立即检测荧光素酶的活性，或置于-20℃保存。
3.5.检测荧光
将5μL细胞溶解液与5μL荧光素酶底物(Promega E1501萤光素酶检测系统)混合，将混合液加入白色384孔板中；
立即用Perkin Elmer EnVision 2102多功能酶标仪上检测荧光素酶的活性，并判定病毒阻断蛋白的中和效率。
4.实验结果
对实施例2-4各个配方，进行细胞学活性检测，不同的样品，分别设置三个平行，每个平行重复测试三次，每个平行之间保留误差50％内的结果，荧光信号检测数据如下：
样品名称 average
实施例2的预湿润擦拭物挤出的病毒防护溶液 53
实施例2的预湿润擦拭物挤出的病毒防护溶液 76
实施例2的预湿润擦拭物挤出的病毒防护溶液 71
PBS x1 127111
结果分析：相比较于PBS溶液，各个实施例得到的预湿润擦拭物产品挤出的病毒防护溶液，能有效阻断新冠假病毒(Omicron株)对HEK293T-ACE2细胞的感染作用，并且基质材料不会对病毒防护溶液中的病毒蛋白的活性产生影响。
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Claims (17)

1.一种用于擦拭的病毒防护溶液，其特征在于，包括：
病毒阻断蛋白和水溶剂，
其中，所述病毒阻断蛋白具有能与病毒的S蛋白特异性结合而使得所述病毒失活的阻断结合分子单元，优选地，所述病毒为冠状病毒。
2.根据权利要求1所述的病毒防护溶液，其特征在于：
其中，所述病毒阻断蛋白的质量占比大于等于0.0001％，优选为0.0001％-0.0007％，更优选为0.0001％-0.00035％。
3.根据权利要求1或2所述的病毒防护溶液，其特征在于，还包括：
稳定剂、保湿剂、防腐剂、香味物质以及抗菌剂中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述稳定剂用于保持所述病毒防护溶液的稳定性，所述稳定剂具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述稳定剂含有pH调节剂、金属离子螯合剂以及表面活性剂中的一种或多种；
(2)所述稳定剂的质量占比为0.3％±1％，更优选地，为0.3％±0.5％。
5.根据权利要求4所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述pH调节剂具有以下特征中的一种或两种：
(1)保持所述病毒防护溶液的pH在6-7.5，优选地，在6.5-7.2，
(2)所述pH调节剂选自十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钠或其组合；
所述金属离子螯合剂选自二水合乙二胺四乙酸二钠；
所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述保湿剂的质量占比为小于等于0.3％，优选地，小于等于0.2％；和/或，
所述保湿剂选自甘油。
7.根据权利要求3-6任意一项所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述香味物质的质量占比小于等于0.2％，优选地，0.04％-0.1％，进一步优选地为0.05％-0.1％；和/或，
所述香味物质选自挥发性香味物质，更优选地，选自薄荷醇、香精、桉油精、麝香草酚、琥珀酸薄荷酯中的任意一种或多种。
8.根据权利要求3-7任意一项所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述防腐剂的质量占比小于等于0.05％，优选地，小于等于0.02％；和/或
所述防腐剂选自苯扎氯氨和醋酸氯已定或其组合。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的病毒防护溶液，其特征在于：其中，所述水溶剂的质量占比范围为大于等于90％，优选地，大于等于95％，更优选地，大于等于99％；
优选地，所述水溶剂为饮用水、蒸馏水、无菌水、超纯水以及去离子水中的一种或多种的组合。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述病毒阻断蛋白还具有以下特征中的一个或多个的组合：
(1)所示病毒阻断蛋白还具有让其形成为多聚体的聚合分子，优选地，所述多聚体为数量为2-10中任意一种的单体聚合形成；
(2)所述病毒阻断蛋白还具有酸性结构；
(3)所述病毒阻断蛋白还具有将所述阻断结合分子单元与所述聚合分子连接以增强三维结构的连接分子；
(4)所述病毒阻断蛋白还具有先导肽；
(5)所述病毒阻断蛋白还具有标签蛋白；
(6)所述病毒阻断蛋白中具有的各个组成部分之间按N端-C端的顺序连接。
11.根据权利要求10所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述聚合分子选自表1中的任何一项，优选地，所述聚合分子包含链霉亲和素，进一步优选地，含有与SEQ ID NO:1具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
所述连接分子包含有荧光类蛋白、人免疫球蛋白G4、Fc以及HSA中的任意一种或多种，例如，所述连接分子是eGFP荧光蛋白或经其改造得到，优选地，通过对eGFP删除部分氨基酸得到；或，
所述连接分子包含与SEQ ID NO:2具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
所述酸性结构为带有负电的氨基酸短链聚合物，进一步地，所述酸性结构具有以下特征中的一个或多个的组合：
(1)所述酸性结构设置在C末端；
(2)所述短链聚合物的氨基酸残基的个数为0-50、2-40、3-30、2-20或2-10；
(3)所述带有负电的氨基酸为天冬氨酸和/或谷氨酸；
所述先导肽包含与SEQ ID NO:10具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；
所述标签蛋白包含与SEQ ID NO:15具有一致性或与其具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11任意一项所述的病毒防护溶液，其特征在于：
所述阻断结合分子单元含有至少一个与病毒的位于S蛋白的受体结合区域进行结合的阻断分子，
优选地，所述阻断分子含有与SEQ ID NO:7-9以及16-19中任意一个具有一致性或与与SEQ ID NO:7-9以及16-19中任意一个具有至少50％、60％、70、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。
13.权利要求1-12任意一项所述的病毒防护溶液在擦拭或在制备擦拭产品中的应用，优选地，所述擦拭产品为擦拭液或预润湿擦拭物。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：
所述擦拭包括对人体皮肤和/或物体表面的擦拭。
15.一种用于病毒防护的擦拭液，其特征在于，包括：权利要求1-12任意一项所述的病毒防护溶液。
16.一种用于病毒防护的预湿润擦拭物，其特征在于：
所述擦拭物由病毒防护溶液浸渍的基体材料构成，
其中，所述病毒防护溶液为权利要求1-12任意一项所述的病毒防护溶液。
17.根据权利要求16所述的预湿润擦拭物，其特征在于：
其中，用于所述浸渍的所述病毒防护溶液与所述基体材料的重量比为1：1.7-1：5。
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