JP2023515603A - 可溶性ａｃｅ２及び融合タンパク質、並びにその適用 - Google Patents

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Abstract

可溶性ＡＣＥ２及びその欠失型、その融合タンパク質、並びにそれらの製造方法。可溶性ＡＣＥ２及びその欠失型、並びに融合タンパク質のＡＣＥ２に関連する疾患の薬物の製造における用途。

Description

本発明は可溶性ＡＣＥ２及びその融合タンパク質、並びにその適用に関する。
２０１９年１２月に、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）により引き起こされた新型コロナウイルス感染症肺炎（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）疫病が爆発し、世界中で急速に広がり、２０２１年２月まで、世界中で感染人数が１億人以上に達し、死亡率が約２．２％であり、世界的な健康危機を引き起こすだけでなく、社会、経済などの様々な面に広く深刻な影響を与えている。
コロナウイルスはニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス属に属し、エンベロープを有し、ゲノムが線状の一本鎖プラス鎖ＲＮＡのウイルスであり、自然界に広く存在するウイルスの一種であり、引き起こされた疾患の患者は一般的な風邪から重篤な肺感染などの異なる臨床症状が示されている。過去の２０年間、コロナウイルスは既に２回の大規模な疫病を引き起こし、それぞれ２００２／２００３年の重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び２０１２年に現れた中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）である。２０１９年末以来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされた新型コロナウイルス感染症の状況は、流行範囲、累計感染人数であっても、死亡人数であっても、ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳ感染症の状況を遥かに超えている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のウイルスゲノム配列は、２０１３年に中国雲南省で発見された１種のコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）から分離されたＲａＴＧ１３ウイルス株と非常に類似し、配列相同性が９６．２％に達する（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。これにより、今回爆発したウイルスの由来は、ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳを引き起こすコロナウイルスの由来と一致しており、いずれもコウモリに由来すると推定される。ヒトでの流行、爆発を引き起こす経路も前述した２種類のウイルスと一致する可能性があり、ウイルスはコウモリから、中間宿主（ヒトの活動により密接な動物）の体内で進化し、増幅し、最終的にヒトに感染し、かつ進化し続け、迅速に伝播し、爆発流行を引き起こしてしまう。自然条件下で、ＳＡＲＳと類似するコロナウイルスは世界の多くの地域のコウモリに長期に存在しており、ほとんどが人体に感染することができない。ところが、これらの「Ｎａｔｕｒａｌ－ｆｏｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ」は、偶然の条件下で、別の中間宿主によりヒトに感染することができる。２００２／０３年の「サーズ」及びその１７年後の今回の新型コロナウイルス感染の爆発流行により、自然宿主が存在すれば、将来、他の可能な病原性コロナウイルス感染が再び爆発する可能性があることがもう一度明らかとなった。
２０２０年１１月に、ＦＤＡは２種類の新型コロナウイルスに対する特異性モノクローナル抗体による治療の緊急使用許可を承認した。それぞれイーライ・リリー社のｂａｍｌａｎｉｖｉｍａｂ及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ社のｃａｓｉｒｉｖｉｍａｂとｉｍｄｅｖｉｍａｂの２つの抗体の組み合わせである。この２種類の治療方法がいずれも非入院の成人及び軽度から中度までのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２症状を有し、かつ疾患がさらに悪化するリスクがある１２歳以上の子供に用いることが承認された。モノクローナル抗体は一般的に高効率性と広域スペクトル性の両方を両立することが困難である。新型コロナウイルスの世界範囲での流行に伴い、ヒト宿主への更なる適応及び集団免疫などの選択圧で、変異株が既に生まれ、かつ生まれつつある。変異株は抗原部位の変化が発生することにより、以前に開発された中和抗体が効力を失ってしまう。
新型コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び新型コロナに関連する動物ウイルスはいずれもアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を受容体として使用して標的細胞に感染、侵入する。新型コロナウイルスの表面は三量体の形式で存在する複数のＳタンパク質を有し、かつＡＣＥ２と高いアフィニティを有し、ウイルスを効果的に中和することはＳタンパク質とＡＣＥ２の多価高アフィニティの結合を同時に遮断する必要がある。ＡＣＥ２細胞外領域と抗体固定領域を融合して形成された可溶性受容体は中和抗体と類似する作用メカニズムを有し、変異したが依然としてＡＣＥ２を受容体とする突然変異したウイルス株の感染を遮断することができる。可溶性ＡＣＥ２受容体融合タンパク質を治療薬物として開発し、天然広域スペクトル中和能力を有し、ウイルス変異に制限されず、新型コロナウイルス感染の治療薬物として用いられるだけでなく、将来発生する可能性のある類似疫病にも対応することができる。
本発明の可溶性ＡＣＥ２及び活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２（ＮＮ）、並びに前記可溶性ＡＣＥ２及び活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２（ＮＮ）とヒトＩｇＧ１のＦｃセグメントとのＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶを効率的に中和することができ、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質Ｓ（Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位を含む）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の受容体であるヒトＡＣＥ２に結合することによって誘発される多核合胞体の形成を遮断することができる。
第１の態様において、本発明は可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）を提供する。前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２の細胞外ドメインを含み、又はＡＣＥ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列で構成され、又はコロナウイルスとの結合能力を保持するフラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメイン（１９－６１５ａａ）を含む。いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメイン（１－７４０ａａ）を含む。いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２のＱ２４、Ｔ２７、Ｆ２８、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｈ３４、Ｅ３７、Ｄ３８、Ｙ４１、Ｑ４２、Ｌ４５、Ｍ８２、Ｙ８３、Ｑ３２５、Ｅ３２９、Ｎ３３０、Ｋ３５３、Ｇ３５４、Ｄ３５５、Ｒ３５７及びＲ３９３を含む。特に、Ｋ３１及びＫ３５３を含む。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２又はその任意のオーソロガス・ホモログを含み、又はそれらのコロナウイルスとの結合能力を保持するフラグメントである。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２を宿主結合受容体とするウイルスを効率的に中和することができる。前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であってもよい。好ましくは、前記活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は３７４番目及び／又は３７８番目にＨ３７４Ｎ及び／又はＨ３７８Ｎ突然変異したヒト可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型（ＡＣＥ２－ＮＮ）である。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２酵素活性を保持する可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であってもよい。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。好ましくは、ヒトＡＣＥ２のＮ－末端の５３番目、９０番目、１０３番目、３２２番目、４３２番目、５４６番目及び／又は６９０番目がグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する。
第２の態様において、本発明は可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型を抗体Ｆｃドメインと融合することにより構築されたＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２の細胞外ドメインを含み、又はＡＣＥ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列で構成され、又はコロナウイルスとの結合能力を保持するフラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメイン（１９－６１５ａａ）を含む。前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメイン（１－７４０ａａ）を含む。前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２のＱ２４、Ｔ２７、Ｆ２８、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｈ３４、Ｅ３７、Ｄ３８、Ｙ４１、Ｑ４２、Ｌ４５、Ｍ８２、Ｙ８３、Ｑ３２５、Ｅ３２９、Ｎ３３０、Ｋ３５３、Ｇ３５４、Ｄ３５５、Ｒ３５７及びＲ３９３を含む。特に、Ｋ３１及びＫ３５３を含む。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２又はその任意のオーソロガス・ホモログを含み、又はそれらのコロナウイルスとの結合能力を保持するフラグメントである。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２を宿主結合受容体とするウイルスを効率的に中和することができる。前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であってもよい。好ましくは、前記活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は３７４番目及び／又は３７８番目にＨ３７４Ｎ及び／又はＨ３７８Ｎ突然変異したヒト可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型（ＡＣＥ２－ＮＮ）である。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２酵素活性を保持する可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であってもよい。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。好ましくは、ヒトＡＣＥ２のＮ－末端の５３番目、９０番目、１０３番目、３２２番目、４３２番目、５４６番目及び／又は６９０番目がグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２を宿主結合受容体とするウイルスを効率的に中和することができる。前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記抗体はＩｇＧ抗体であり、ヒトＩｇＧであってもよく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくはＩｇＧ１である。前記抗体Ｆｃドメインは抗体を含有する２つの重鎖Ｆｃ領域の抗体Ｆｃ－ドメインである。好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はそのＮ末端にヒンジ領域を有する。好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む。好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。前記Ｆｃ領域は２つのＡＣＥ２ドメインの二量化を促進することができる。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続され、又は重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に接続される。
いくつかの実施形態において、２ｎ（ｎは１、２又は３である）個の前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続され及び／又はＮ末端に接続される。
いくつかの実施形態において、２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域の抗体Ｆｃ－ドメインのＮ末端に接続され二量体を形成する。又は、２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続され二量体を形成する。
いくつかの実施形態において、２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域の抗体Ｆｃ－ドメインのＮ末端に接続されると共に、他の２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続されることにより、四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。さらに、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端の２つの前記可溶性ＡＣＥ又はその欠失型のＮ末端にさらにそれぞれ１つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が直列接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続される。前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであってもよい。又は、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端の２つの前記可溶性ＡＣＥ又はその欠失型のＣ末端にさらにそれぞれ１つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が直列接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続される。前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであってもよい。
いくつかの実施形態において、４つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つずつ直列接続された後に２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に接続されることにより、四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続される。前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであってもよい。さらに、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端の２つの前記可溶性ＡＣＥ又はその欠失型のＮ末端にさらにそれぞれ１つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が直列接されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続される。前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであってもよい。又は、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の前記２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に２つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。
又は、４つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つずつ直列接続された後に２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続されることにより、四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続される。前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであってもよい。さらに、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に２つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成する。
好ましくは、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は、実際に、二量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質であり、ここで、単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質はさらにシグナルペプチドを含み、好ましくはＣＤ３３シグナルペプチドである。
好ましくは、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における単一のＡＣＥ２欠失型には単一の重鎖Ｆｃ領域が接続されてから、さらに単一のＡＣＥ２が接続され（ＡＣＥ２－Ｆｃ－ＡＣＥ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における２つの直列接続されたＡＣＥ２又はその欠失型には単一の重鎖Ｆｃ領域が接続され（ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－Ｆｃ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有する。
前記ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質はＡＣＥ２を宿主結合受容体とするウイルスを効率的に中和することができる。前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であってもよい。
本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質は可溶性ＡＣＥ２の半減期及び収量を向上させ、迅速なプロセス開発及び緊急使用の需要を最大限に満たすことができる。
第３の態様において、本発明は、ｎ個のポリペプチド単量体単位を含み、各ポリペプチド単量体単位は２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端との接続により形成された二量体であり、前記ｎ個のポリペプチド単量体単位は抗体Ｆｃ－ドメインＣ末端に位置する尾部により多量体に組み立てられる、可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）を提供する。
いくつかの実施形態において、各ポリペプチド単量体単位における各重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に１つの尾部が接続されるため、各ポリペプチド単量体単位の２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に２つの尾部が接続され、ｎ個のポリペプチド単量体単位は合計２ｎ個の尾部を有し、互いに接続されて閉鎖環状多量体を構成する。
前記尾部は任意の適切なアミノ酸配列であってもよく、天然に存在する抗体に発見された尾部であってもよく、又は選択的に、それは長さ及び／又は組成上で天然尾部と異なる修飾された尾部であってもよい。又は、前記尾部は人工的に合成された多量化に適する尾部であり、例えば、適切な長さの可撓性システインで構成された尾部である。又は、前記尾部は天然配列の変異体又はフラグメントを含むことができ、例えば、ＩｇＭ尾部ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）又はＩｇＡ尾部ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）であり、又は、ＩｇＭ又はＩｇＡ尾部の変異体は、通常、ＩｇＭ尾部ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）又はＩｇＡ尾部ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）のうちの８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個又は１８個の位置におけるアミノ酸配列を有し、尾部はハイブリダイズしたＩｇＭ／ＩｇＡ尾部であってもよい。好ましくは、尾部はＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）である。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２の細胞外ドメインを含み、又はＡＣＥ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列で構成され、又はコロナウイルスとの結合能力を保持するフラグメントである。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメイン（１９－６１５ａａ）を含む。前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメイン（１－７４０ａａ）を含む。前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２のＱ２４、Ｔ２７、Ｆ２８、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｈ３４、Ｅ３７、Ｄ３８、Ｙ４１、Ｑ４２、Ｌ４５、Ｍ８２、Ｙ８３、Ｑ３２５、Ｅ３２９、Ｎ３３０、Ｋ３５３、Ｇ３５４、Ｄ３５５、Ｒ３５７及びＲ３９３を含む。特に、Ｋ３１及びＫ３５３を含む。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２又はその任意のオーソロガス・ホモログを含み、又はそれらのコロナウイルスとの結合能力を保持するフラグメントである。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２を宿主結合受容体とするウイルスを効率的に中和することができる。前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であってもよい。好ましくは、前記活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は３７４番目及び／又は３７８番目にＨ３７４Ｎ及び／又はＨ３７８Ｎ突然変異したヒト可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型（ＡＣＥ２－ＮＮ）である。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２酵素活性を保持する可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であってもよい。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。好ましくは、ヒトＡＣＥ２のＮ－末端の５３番目、９０番目、１０３番目、３２２番目、４３２番目、５４６番目及び／又は６９０番目がグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記可溶性ＡＣＥ２欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２を宿主結合受容体とするウイルスを効率的に中和することができる。前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記抗体はＩｇＧ抗体であり、ヒトＩｇＧであってもよく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくはＩｇＧ１である。前記抗体Ｆｃドメインは抗体を含有する２つの重鎖Ｆｃ領域の抗体Ｆｃ－ドメインである。好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はそのＮ末端にヒンジ領域を有する。好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含む。好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。前記Ｆｃ領域は２つのＡＣＥ２ドメインの二量化を促進することができる。
いくつかの実施形態において、前記重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した重鎖Ｆｃ領域であってもよい。
前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続され、又は重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に接続される。
好ましくは、前記各ポリペプチド単量体単位における単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記各ポリペプチド単量体単位における単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記各ポリペプチド単量体単位における単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）はＡＣＥ２－ｈＦｃ５、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５、又はＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５Ｌ３０９Ｃであり、ここで、
ＡＣＥ２－ｈＦｃ５とは、５つのポリペプチド単量体単位が５つのＦｃ－ドメインＣ末端の１０個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有し、
ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５とは、５つのポリペプチド単量体単位が５つのＦｃ－ドメインＣ末端の１０個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有し、
ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃとは、５つのポリペプチド単量体単位が５つのＦｃ－ドメインＣ末端の１０個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した。
いくつかの実施形態において、前記多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）はＡＣＥ２－ｈＦｃ６、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６、又はＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６Ｌ３０９Ｃであり、ここで、
ＡＣＥ２－ｈＦｃ６とは、６つのポリペプチド単量体単位が６つのＦｃ－ドメインＣ末端の１２個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、単一の尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有し、
ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６とは、６つのポリペプチド単量体単位が６つのＦｃ－ドメインＣ末端の１２個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、単一の尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有し、
ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６ Ｌ３０９Ｃとは、６つのポリペプチド単量体単位が６つのＦｃ－ドメインＣ末端の１２個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記多量体融合タンパク質は、
４つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた四量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ｈＦｃ４、
４つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ４、
４つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた四量体であり、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ４－Ｌ３０９Ｃ、
５つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５、
５つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５、
５つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ、
６つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥＳＡＲＳ－ＣｏＶ２２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、単一の尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ｈＦｃ６、
６つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、単一の尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６、
６つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６－Ｌ３０９Ｃ、といった多量体融合タンパク質から選択される１種又は複数種である。
前記多量体融合タンパク質はウイルスＳタンパク質とのアフィニティを大幅に強化しつつ、Ｆｃ分子の効果機能を強化することができる。
第４の態様において、本発明は、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）を発現する遺伝子を含有する発現ベクターを提供する。
第５の態様において、本発明は、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）を発現できる遺伝子の哺乳動物細胞株を提供する。前記細胞株はＣＨＯ細胞株、２９３細胞株及びＶｅｒｏ細胞株及びその派生する細胞株を含むがそれらに限定されない。例えば、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
第６の態様において、本発明は、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）の製造方法であって、
（１）第４の態様の発現ベクターで哺乳動物細胞株をトランスフェクトし、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）を発現する哺乳動物細胞発現株を構築するステップと、
（２）培養条件下でステップ（１）の哺乳動物細胞発現株を培養して第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）を生成して組換えタンパク質を生成するステップと、及び
（３）ステップ（２）で発現された組換えタンパク質を精製するステップとを含む、方法を提供する。
第７の態様において、本発明は、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）、及び薬学的に許容される担体を含む、薬物組成物をさらに提供する。
第８態様において、本発明は、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）の、ＡＣＥ２に関連する疾患を治療するか又は予防するための薬物の製造における適用を提供する。
前記疾患はＡＣＥ２を受容体とするウイルスの感染に起因する疾患から選択される。前記ウイルスはコロナウイルスであってもよく、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ２である。前記疾患は肺炎、重症急性呼吸器感染、腎不全、心不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝臓損傷、腸疾患、又は重症急性呼吸器症候群であってもよい。
本発明の第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）は緊急事態時での投与に用いることができ、それによりＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染爆発による高い発病率及び致死率を回避する。
本発明の第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、又は第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）は、医療従事者及びＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスに曝される可能性がある他の者の受動免疫にさらに用いることができる。
合胞体（ｓｙｎｃｙｔｉａ）は、ウイルスが宿主細胞に感染した後、細胞間の融合が発生し、最終的に形成された多核巨細胞である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスに感染した重症患者は肺胞上皮にびまん性損傷が発生し、融合多核細胞（合胞体）が形成され、これはウイルスＳタンパク質とＡＣＥ２の結合によるものであり、細胞変性効果の重要な原因である。同時に、サイトカインストームも肺胞の損傷を引き起こすことができる。可溶性ＡＣＥ２の多量体Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃｎ）はウイルスＳタンパク質とＡＣＥ２との結合による融合多核細胞（合細胞）、及びその後に発生する細胞変性効果を効果的に阻止することができる。
好ましくは、前記薬物は吸入、鼻内又は気道滴下注入薬物は吸入、鼻内又は気道滴下注入、点眼、中耳注射、点耳薬、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、胸腔内滴下注入、腹膜内注射、病巣内、粘膜への適用又は徐放性担体の移植によって投与され、好ましくは、前記薬物は霧化吸入により投与される。第９の態様において、本発明は、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に抵抗する薬物をスクリーニングする方法であって、第１の態様の可溶性ＡＣＥ２、第２の態様のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、第３の態様の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）、第４の態様のベクター又は第５の態様の哺乳動物細胞株を用いて前記薬物をスクリーニングすることを含む方法を提供する。
第１０の態様において、本発明は、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に抵抗する薬物をスクリーニングする方法であって、Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ、又はコロナウイルスのＳタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位を薬物スクリーニングの標的として利用することを含む方法を提供する。
前記薬物はＦｕｒｉｎプロテアーゼ阻害剤であってもよい。
前記薬物はＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染において、Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位を含むＳタンパク質により合胞体が形成されることを遮断する。
第１１の態様において、本発明は、Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ又はコロナウイルスのＳタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位を標的とする試薬の、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に対する薬物の製造における適用を提供する。
特に、本発明は、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染においてＦｕｒｉｎ酵素切断部位を有するＳタンパク質により合胞体が形成されることを遮断する試薬の、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に対する薬物の製造における適用に関する。
好ましくは、前記試薬はＦｕｒｉｎプロテアーゼ阻害剤である。
前記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣＯＶ２である。
第１２の態様において、本発明は、突然変異したＳタンパク質を提供し、前記Ｓタンパク質は欠失型、及び／又はＦｕｒｉｎ酵素切断部位に突然変異が発生した形態である。
前記欠失型とは、Ｓタンパク質は細胞外ドメイン（Ｓ１＋Ｓ２）のみを含み、つまり、膜貫通領域及び細胞内領域が欠失していることである。
前記Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位に突然変異が発生したことは、１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は添加することにより、Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位がＦｕｒｉｎ酵素切断部位としての活性を有さなくなることである。
好ましくは、前記Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位に突然変異が発生した形式とは、Ｓタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位がＲＲＡＲからＳＲＡＳに突然変異したことである。
好ましくは、Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位が突然変異したことに加えて、前記突然変異したＳタンパク質は細胞外ドメイン（Ｓ１＋Ｓ２）のみを含み、つまり、さらに膜貫通領域及び細胞内領域が欠失していることである。
前記突然変異したＳタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有する。
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はＳタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位がＲＲＡＲからＳＲＡＳに突然変異したアミノ酸配列である。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は欠失型のＳタンパク質のアミノ酸配列であり、膜貫通領域及び細胞内領域が欠失している。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位がＲＲＡＲからＳＲＡＳに突然変異し、かつ膜貫通領域及び細胞内領域が欠失している欠失型のＳタンパク質のアミノ酸配列である。
第１３の態様において、本発明は、さらに、第１２の態様の突然変異したＳタンパク質の、ＡＣＥ２に関連する疾患を治療するか又は予防するための薬物の製造における適用に関する。
前記疾患はＡＣＥ２を受容体とするウイルスの感染に起因する疾患であり、好ましくは、前記ウイルスはコロナウイルスであってもよく、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ２である。
前記疾患は肺炎、重症急性呼吸器感染、腎不全、心不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝臓損傷、腸疾患、又は重症急性呼吸器症候群から選択される。
前記薬物は医療従事者及びＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスに曝される可能性がある他の者の受動免疫に用いることができる。
第１４の態様において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染を予防するための組換えワクチンであって、第１２の態様のＳタンパク質を含む組換えワクチンを提供する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質におけるＦｕｒｉｎ酵素切断部位及びＦｕｒｉｎプロテアーゼは、薬物をスクリーニングするための標的である用途として用いられ、前記薬物はＡＣＥ２を受容体とするウイルスの感染による疾患の治療に用いることができる。
本発明は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質におけるＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が合胞体の形成に必須であることを判明し、具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイク（Ｓ）タンパク質は、６８１～６８５番目の残基の近傍（Ｓ１とＳ２の分離領域に隣接）にＲＲＡＲモチーフを有し、該モチーフはＦｕｒｉｎ等のプロテアーゼによって切断される。配列比較により、該モチーフはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の全ての既知のウイルス株の配列に存在するが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に最も近いＲａＴＧ１３コウモリウイルス株に存在しない。データベース中のコウモリウイルス配列を比較すると、ｂａｔＳＡＲＳ－ＨＫＵ５ウイルスのみに近似配列（ＲＲＡＴ）がある。本発明者らは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質及びＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質発現プラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞はいずれもＡＣＥ２－ＩｇＧ１ Ｆｃと結合することができ、空ベクターでトランスフェクトされたコントロール細胞はＡＣＥ２－ＩｇＧ１ Ｆｃと結合しないことを発見した。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質及びＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質は２９３Ｔ細胞の表面で正常に発現することができ、また、Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異した後（すなわち、ＲＲＡＲからＳＲＡＳに突然変異）、突然変異したＳタンパク質は依然としてＡＣＥ２－ＩｇＧ１ Ｆｃに結合することが可能であり、かつより強く結合する。
合胞体の形成実験において、空ベクターのコントロール細胞と全長ヒトＡＣＥ２（ヒト天然ＡＣＥ２）を発現する細胞との間に細胞融合が発生せず、多核の合胞体の形成が観察されていないのに対して、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の発現細胞グループにおいて、全長ヒトＡＣＥ２を発現する細胞と３ｈ共培養した後、大量の多核合胞体の形成が観察され、２４ｈ培養し続けた後、形成された合胞体が死亡する。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質におけるＦｕｒｉｎ部位がＲＲＡＲからＳＲＡＳに突然変異した後、細胞融合の発生が完全に抑制され、多核合胞体の生成が観察されず、Ｓタンパク質が細胞融合を媒介誘導する能力を失ったことが示され、Ｓタンパク質におけるＦｕｒｉｎ部位が新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の細胞への感染に関して非常に重要であることが明らかである。
したがって、Ｓタンパク質のＦｕｒｉｎ部位（ＰＲＲＡＲ）及びＦｕｒｉｎプロテアーゼを標的とする薬物は新型コロナウイルスの感染確立を抑制する能力を有する。また、新型コロナウイルスが細胞に入る過程における融合ステップを抑制することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を治療する抗ウイルス薬物を開発することができる。
そして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓタンパク質におけるＦｕｒｉｎ部位ＲＲＡＲがＳＲＡＳに突然変異した後、細胞融合の発生が完全に抑制され、多核合胞体の生成が観察されず、Ｓタンパク質が細胞融合を媒介誘導する能力を失ったことが示される。したがって、本発明のＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質、特に、膜貫通領域及び細胞内領域が欠失しているＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質は組換えタンパク質薬物としてウイルスの野生型Ｓと細胞受容体との結合を競争的に遮断することにより感染を遮断することができる。また、前記Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質も組換えワクチンの候補分子とすることができ、野生Ｓタンパク質よりも安定である。
新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２はβ属の新型コロナウイルスに属し、エンベロープを有し、粒子は円形又は楕円形であり、多形性を有し、直径は６０～１４０ｎｍであり、その表面のエンベロープスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｓタンパク質）はコロナウイルスの主な抗原タンパク質であり、ウイルスの感染及び伝播において非常に重要な役割を果たし、Ｓタンパク質は２つのサブユニットを有し、Ｓ１サブユニットは細胞表面受容体と結合し、Ｓ２サブユニットは膜融合過程に必要な基本的な要素を含む。
新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のエンベロープスパイクＳｐｉｋｅ（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質と約７６％の相同性を有し、相同性が高くないため、多くのＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの中和抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの感染を中和することができない。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶは同一の宿主細胞受容体タンパク質であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を共用しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染もＡＣＥ２を標的細胞に侵入する受容体として利用しなければならない。つまり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のアミノ酸配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質のアミノ酸配列に対して複数のアミノ酸の差異が存在するが、それらは依然として同一のＡＣＥ２受容体タンパク質を利用して宿主細胞に入ることができ、ＡＣＥ２タンパク質の表面がこの種のコロナウイルスのＳタンパク質と構造上の高い相溶性を有し、配列に大きな差異があるウイルススパイクタンパク質に利用されやすい宿主タンパク質分子であることが示され、このため、ＡＣＥ２は依然としてこの種のウイルスが将来ヒトに感染する導入点となる可能性がある。本発明により得られた可溶性ＡＣＥ２及び活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２（ＮＮ）は、ＡＣＥ２を宿主受容体とするウイルスとＡＣＥ２受容体との結合及びウイルス侵入を遮断することができ、今回の感染予防対策ひいては将来の可能な再爆発に対して、いずれも重要な意味を有する。
そして、非常に重要なことは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの人々における流行に伴い、ヒト宿主への更なる適応及び人体免疫などの選択圧で、変異株が生まれることである。これらの変異株はウイルスの毒性及び抗原部位の変化を引き起こす可能性がある。類似する変更はＳＡＲＳ－ＣｏＶにおいて多くの観察及び記録がある。最新の新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス配列決定データにより、そのＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の配列が依然として変異過程にあることが示されている。本発明により得られた可溶性ＡＣＥ２及び活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２（ＮＮ）の利点は、ウイルスがＡＣＥ２を侵入受容体とすれば、ウイルスのタンパク質、特にＳタンパク質がどのように突然変異しても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスをより強く中和できることにもある。継続的に進化するウイルスの防除に関しては、Ｓタンパク質のモノクローナル中和抗体と異なり、本発明の可溶性ＡＣＥ２受容体は治療薬物として、天然の広域スペクトル中和能力を有し、ウイルスの変異に制限されず、かつ抗体スクリーニング作業を進める必要がないため、現在及び将来のしばらくの間での防疫の緊急需要に非常に適する。実験結果によると、本発明の五量体ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５は現在出現した主な変異株のシュードウイルスの感染に対していずれも強い中和活性が示されている。
また、抗体薬物と異なり、受容体が人体自身のタンパク質であるため、組織交差反応性アッセイを行う必要がない。急性伝染病の緊急使用及び受容体融合タンパク質の長半減期のために、通常１～２回投与して治療するため、抗薬物抗体の研究、長期毒性の研究が免除され、開発サイクルをスピードアップすることができる。
本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質、及び可溶性ＡＣＥ２の多量体Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃｎ）は新たな感染事態が爆発する時に選択可能な最も迅速で特異的な治療薬であり、その利点は主に以下のいくつかの側面で現れる。
（１）中和抗体としてウイルスの逃走を回避すること。
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスによる合胞体の形成に抵抗することができること。
（３）Ｆｃドメインのエフェクター機能が保留されたため、関連する受容体により補体、樹状細胞、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を募集してウイルス粒子又は感染された細胞に抵抗することができること。
（４）可溶性ＡＣＥ２分子のサイクル半減期を延長すること。
（５）この前に、組換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）に対する第二相臨床試験があり、被験者の臨床症状が顕著に改善されていないが、耐性及び安全性が良好であることが示され、したがって、本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ、ＡＣＥ２（ＮＮ）－Ｆｃ又はＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃｎは現在の緊急事態でのコンパッショネート・ユースに適し、その後に正式な臨床試験を行うことが可能であることが示されること。
（６）本発明のＡＣＥ２－Ｆｃ、ＡＣＥ２（ＮＮ）－Ｆｃ又はＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃｎを利用して、ワクチンの前に、感染している患者に対して、将来の数ヶ月乃至数年間内に広く適用されることを助けることができること。
（７）本発明により得られた可溶性ＡＣＥ２を利用してウイルスの感染を遮断することはＡＣＥ２の天然酵素活性に依存せず、患者の体内の天然ＡＣＥ２の活性にも影響を与えず、さらに、活性中心が突然変異した可溶性ＡＣＥ２（ＮＮ）はＡＣＥ２酵素活性が体内にもたらす潜在的な副作用を回避したため、人体での使用の安全性を最大限に向上させること。
（８）抗Ｓタンパク質抗体に比べて、可溶性ＡＣＥ２の別の利点としては、ウイルスがＡＣＥ２を侵入抗体とすれば、ウイルスの突然変異は、ウイルスの突然変異による受容体とのアフィニティの増強を含み、可溶性ＡＣＥ２の有効性に影響を与えないこと。
ＡＣＥ２はメタロプロテアーゼの一種であり、その作用としては、アンジオテンシンＩからアンギオテンシンノナペプチド（１－９）への分解、又はアンジオテンシンＩＩから
アンギオテンシンヘプタペプチド（１－７）への分解を触媒するものであり、心血管機能の調整に関与するとともに急性肺損傷において保護作用を有する可能性があると考えられ、例えば、血管拡張、抗増殖、抗酸化ストレス等で機能する。ＡＣＥ２は血管系及びほとんどの臓器で発現されるが、主に肺、心臓、肝臓、腎臓及び精巣で発現される。したがって、ＡＣＥ２酵素活性を阻害する候補薬物は理想的な薬物ではない。
ヒト天然ＡＣＥ２（膜型ＡＣＥ２と呼ばれる）の全長は８０５個のアミノ酸があり、なかでも、１～７４０番目のアミノ酸は細胞外セグメントであり、残りの６５個のアミノ酸は短い膜貫通領域と細胞内領域とする。ＡＣＥ２の酵素活性はいずれも細胞外セグメントに担われる。本発明の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は膜貫通ドメインを有しない。
精製して得られたＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質とＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質のＳＥＣ－ＨＰＬＣピーク図を示す。 新型コロナウイルスのスパイクタンパク質が合胞体の形成を誘導することができることを示す。 ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質がインビトロで新型コロナウイルスのスパイクタンパク質によって媒介誘導される細胞間膜融合を顕著に抑制することを示す。 新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳｐｉｋｅタンパク質（Ｓタンパク質）のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）及びＦｕｒｉｎ部位を示す。 Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の細胞表面発現及びＦｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の細胞表面分析結果を示す。 空ベクターのコントロール細胞（赤色標識）とヒトＡＣＥ２が発現した細胞（緑色標識）との間に細胞融合が発生せず、多核の合細胞の形成が観察されていないが、野生型新型コロナウイルスのＳタンパク質発現細胞（赤色標識）グループにおいて、ＡＣＥ２が発現した細胞（緑色標識）と３ｈ共培養した後、大量の多核合胞体の形成が観察され、２４ｈ持続培養した後、形成された合胞体が死亡したこと、ｆｕｒｉｎ部位が突然変異したＳタンパク質とＡＣＥが発現した細胞とを混合した後に合胞体が発生しないことを示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質野生型Ｅｃｔｄｏｍａｉｎ（１－１２０８ａａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、及びＦｕｒｉｎ酵素切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のＥｃｔｄｏｍａｉｎ（１－１２０８ａａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を示す。 ＡＣＥ２－ｈＦｃ及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質と新型コロナウイルススパイクタンパク質ＲＢＤとのアフィニティ及びアビディティを示す。 異なる形式のＡＣＥ２融合タンパク質多量体が新型コロナウイルスのシュードウイルス（Ｄ６１４）の感染を抑制することを示す。 ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質が新型コロナウイルスのＤ６１４、Ｇ６１４、サーズウイルス、パンゴリンコロナウイルスのシュードウイルスの感染を抑制することを示す。 ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質が新型コロナウイルスの生ウイルスの感染を抑制することを示す。 ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によるＡＣＥ２－ｈＦｃ５の霧化前後の物理化学的性質を示す。 霧化前後のＡＣＥ２－ｈＦｃ５分子のインビトロでの新型コロナウイルスのシュードウイルスの感染中和活性の評価結果を示す。 ＲＴ－ｑＰＣＲ定量分析によるハムスターの肺中の新型コロナウイルスｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの含有量を示す。 異なる形式のＡＣＥ２－ＩｇＧ１融合タンパク質の分子構造概略図を示す。
以下の実施例は本発明を説明するために用いられるが、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神及び実質から逸脱することなく、本発明の方法、ステップ又は条件に対する修正又は置換は、いずれも本発明の範囲に属する。
特に示さない限り、実施例に使用された化学試薬はいずれも一般的な市販試薬であり、実施例に使用された技術手段は当業者によく知られた一般的な手段である。実施例及び図面における全てのＦｃはＩｇＧ１に由来する。実施例及び図面において全てのＡＣＥ２－ｈＦｃは、異なる形態のＡＣＥ２－ｈＦｃとは全てのＡＣＥ２－ｈＦｃ及びＡＣＥ２－ｈＦｃ多量体及び突然変異体を意味することが特に示さない限り、いずれもＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ（ここで、単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有する）である。実施例及び図面において全てのＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２はいずれも四量体ＡＣＥ２（ＮＮ）－ｈＦｃ－ＡＣＥ２（ＮＮ）（ここで、単一のＡＣＥ２欠失型に単一の重鎖Ｆｃ領域が接続されてさらに単一のＡＣＥ２が接続されて（ＡＣＥ２－Ｆｃ－ＡＣＥ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有する）である。実施例及び図面において全てのＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃはいずれも四量体ＡＣＥ２（ＮＮ）－ＡＣＥ２（ＮＮ）－ｈＦｃ（ここで、２つの直列接続されたＡＣＥ２又はその欠失型に単一の重鎖Ｆｃ領域が接続されて（ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－Ｆｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有する）である。全てのＡＣＥ２－ｈＦｃ５はいずれもＡＣＥ２（ＮＮ）－ｈＦｃ（５）であることは、５つのポリペプチド単量体単位が５つのＦｃ－ドメインＣ末端の１０個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であることを意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する。実施例及び図面における全てのＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃは、いずれもＡＣＥ２（ＮＮ）－ｈＦｃ（５）－Ｌ３０９Ｃであり、５つのポリペプチド単量体単位が５つのＦｃ－ドメインＣ末端の１０個の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体を意味し、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有し、そのうち重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した。図１６を参照する。
実施例１ ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質発現プラスミド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓタンパク質発現プラスミド及びＦｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質発現プラスミドの構築
表１に示されるプライマーを利用し、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲにより、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＡＣＥ２メタロプロテアーゼドメイン細胞外領域（Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ酵素不活性化部位を含む）及びｈＩｇＧ１ ＦｃをコードするＤＮＡ配列を取得する。具体的なクローニング手順は以下のとおりである。ＡＣＥ２－ｈＦｃ発現プラスミドを構築する場合、ｐｃＤＮＡ３．０－ＡＣＥ２－ＮＥＭＧＥをテンプレートとし、２－ＦｒｏｎｔＩｎ及び４－ＭｉｄＲを利用してＰＣＲによりＡＣＥ２細胞外領域（１９－６１５ａａ）をコードする、酵素活性不活性化部位Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎを含むＤＮＡフラグメントを取得する。ｐＣＨＯＧＳ－ＨＨ００９をテンプレートとし、プライマー３－ＭｉｄＦ及び５－ＩｇＧ１Ｃｔｅｒｍを利用してＰＣＲによりｈＩｇＧ１Ｆｃをコードする領域を取得する。次に上記ＰＣＲにより取得された生成物をテンプレートとし、プライマー６－ＦｒｏｎｔＯｕｔＸｈｏＩ及び５－ＩｇＧ１Ｃｔｅｒｍを利用してＯｖｅｒｌａｐ ＰＣＲによりＣＤ３３シグナルペプチド－ＡＣＥ２細胞外領域－ｈＦｃをコードする全長ＤＮＡを合成する。次にＸｈｏＩ及びＰａｃＩ酵素切断部位によりｐＣＨＯＧＳ発現ベクターにクローニングし、ｐＣＨＯＧＳ－ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＩｇＧ１発現プラスミドを取得する。
表１ ＡＣＥ２ ＩｇＧ１融合タンパク質発現プラスミド構築プライマー
Figure 2023515603000001
新型コロナウイルススパイクタンパク質発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ－Ｃ９を構築する場合、ｐＣＭＶ３－２０１９－ｎＣｏＶ－Ｓｐｉｋｅ（Ｓ１＋Ｓ２）－ｌｏｎｇ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ＃：ＶＧ４０５８９－ＵＴ）をテンプレートとし、ＳＢ－Ｓ－ＮｈｅＩ：ＣＧＴＧＣＴＡＧＣｃＧＴＧＡＡＣＣＴ ＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＡ及びＳＢ－Ｓ－Ｃ９－ＸｈｏＩ：ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＣＣをプライマーとし、ＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質をコードするＤＮＡ配列を取得する。次に、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ酵素切断部位を用いてｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングする。ここで、Ｎ末端シグナルペプチドはＣＤ４シグナルペプチドであり、Ｃ末端はＣ９タグであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質発現プラスミドを取得する。
このプラスミドに基づいて、ＳＢ－Ｓ－ＮｈｅＩ、ＳＢ－Ｓ－Ｃ９－ＸｈｏＩ及びＳＢ－Ｄｒｓ－ｆ：ＣＡＧＣＣＣＡａｇｃＡＧＧＧＣＡａｇｃＴＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＧとＳＢ－Ｄｒｓ－ｒ：ＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡｇｃｔＴＧＣＣＣＴｇｃｔＴＧＧＧＣＴＧプライマーを用いて、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲによりＳタンパク質中のＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位ＰＲＲＡＲをＰＲＡＳに突然変異させることにより、Ｆｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質発現プラスミドを取得する。
実施例２ ＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質とＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質発現プラスミドの構築
ＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質、及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質発現プラスミドの構築はＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質発現プラスミドの構築と類似し、実施例１の方法で構築される。
実施例３ ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質の発現、精製及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
実施例１で構築されたＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質を発現する発現プラスミド、及び実施例２で構築されたＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を発現する発現プラスミドを、それぞれＰＥＩにより２９３Ｆ細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトしてから５日後に培養上清を収集し、それぞれＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムにより一段階で精製し、それぞれ精製されたＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を取得する。Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ２０００タンパク質で定量した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度分析を行う（図１Ａ及び図１Ｃを参照する）。図１Ａから分かるように、得られたＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質の純度分析には１つのピークのみを有し、主ピークは９９．３４％である。図１Ｃから分かるように、得られたＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質の純度分析には１つのピークのみを有し、主ピークは６６．９４％である。
実施例４ ＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質の発現、精製及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
実施例２で構築されたＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質を発現する発現プラスミドをそれぞれＰＥＩにより２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトしてから５日後に培養上清を収集し、それぞれＰｒｏｔｅｉｎ Ａ及び分子篩の二段階で精製した後にそれぞれ精製されたＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質、ＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質を取得する。Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ２０００タンパク質で定量した後、それぞれＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度分析を行う（図１Ｂ、図１Ｄ及び図１Ｅを参照する）。図１Ｂから分かるように、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質の主ピークは９８．９６％であり、図１Ｄから分かるように、ＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２融合タンパク質の主ピークは９７．９９％であり、図１Ｅから分かるように、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ融合タンパク質の主ピークは９７．９９％である。
実施例５ ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質の発現、精製及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
実施例２で構築されたＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を発現する発現プラスミドをＰＥＩにより２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトしてから５日後に培養上清を収集し、複数の段階で精製した後に精製されたＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を取得する。Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ２０００タンパク質で定量した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度分析を行う（図１Ｆを参照する）。図１Ｆから分かるように、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質の主ピークは９９．２％である。
実施例６ インビトロの細胞間膜融合抑制実験
６．１ 方法 ＡＣＥ２融合タンパク質の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）による合胞体形成に対する抵抗実験 それぞれｐＣＡＧＧＳ空ベクター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質及びＳＡＲＳスパイクタンパク質を発現するプラスミドを、それぞれｐＥＧＦＰ－Ｎ１と共にＰＥＩにより２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトする。ｈＡＣＥ２－Ｃ９（実験室に保存される）を発現するプラスミドをｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１と共にＰＥＩにより２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクトしてから２４ｈ後、細胞を消化し、ＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、１×ＰＳ）で細胞を一回洗浄してカウントし、その後にそれぞれ１０μｇ／ｍｌのコントロールタンパク質及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を２．５Ｅ５／ウェルの空ベクターコントロール細胞、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－Ｓ及びＳＡＲＳ－Ｓトランスフェクトされた細胞と３７℃で３０ｍｉｎ共インキュベートし、その後に２．５Ｅ５／ウェルでｈＡＣＥ２－Ｃ９トランスフェクトされた細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベータで３ｈ共培養した後、蛍光顕微鏡でＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）による合胞体形成に対する抵抗状況を観察し、実験結果を撮影記録する。
６．２ 図２から分かるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスグループ及びＳＡＲＳウイルスグループにいずれも大量の合胞体の形成が見られ、そしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスグループに、合胞体の数が最も多く、空ベクターのコントロールグループに、細胞融合の現象が見られず、この結果はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルススパイクタンパク質とＳＡＲＳウイルススパイクタンパク質が類似し、細胞が融合して合胞体を形成するように誘導する能力を有し、かつその誘導能力がＳＡＲＳウイルススパイクタンパク質よりも強いことが示されている（図３の上図）。これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルススパイクタンパク質と受容体ｈＡＣＥ２とのアフィニティがＳＡＲＳウイルススパイクタンパク質よりも強いことも間接的に証明されている。実験においてＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を添加した後、本発明者らはコントロールタンパク質と比較して、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのスパイクタンパク質の誘導による合胞体の生成を明らかに抑制することができ、抑制率が９０％以上に達し、さらに、ＳＡＲＳウイルスによる合胞体の生成を完全に抑制することができることを観察した。
また、本発明者らは、新型コロナウイルスのスパイクタンパク質が発現した細胞と受容体ＡＣＥ２発現細胞を共インキュベートする時、大量の合胞体が形成されることを観察した（図３の下図）。それは新型コロナのスパイクタンパク質が受容体ＡＣＥ２と結合した後に膜融合過程を誘導することができ、２０ｈ時に多核合胞体がより明らかになることが説明される。実験系に１０μｇ／ｍｌのＡＣＥ２－ｈＦｃ５を添加して処理した後、合胞体の数を明らかに低減することができ、抑制率が９０％以上に達する。同じ条件で、ＡＣＥ２－ｈＦｃ抑制効果は明らかではない。さらに、本発明者らは、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５分子が用量依存の方式で合胞体の形成を抑制し、０．３μｇ／ｍｌの低濃度の条件で、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５が依然として合胞体の形成を抑制する顕著な活性を有することを観察した。
コロナウイルスを含むエンベロープウイルスのプウイルス膜と細胞（内）膜の融合は感染の重要な一歩であり、合胞体の形成はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスが人体に感染した後に肺で発生した突出した病理変化である。本発明者らの実験結果によると、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質は強い合胞体形成抵抗活性を有し、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染を遮断することができる。
実施例７ 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質及びＦｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の細胞表面発現分析及び合胞体形成実験
それぞれｐＣＡＧＧＳ空ベクター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質及びＦｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質（ＰＲＲＡＲからＰＳＲＡＳに突然変異した）を発現するプラスミド及びｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１をＰＥＩにより２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトする。全長ＡＣＥ２（細胞外部分、膜貫通領域及び細胞内領域を有する）を発現するプラスミド及びｐＥＧＦＰ－Ｎ１をＰＥＩにより２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクトしてから２４ｈ後に、細胞を消化し、ＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、１×ＰＳ）で細胞を一回洗浄してカウントし、その後に一部の空ベクターコントロール細胞を取り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）（図４参照）及びＦｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）（図５参照）が発現した細胞はＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２のＳタンパク質の細胞表面発現の検出に用いられ、残りの一部の細胞は合胞体形成実験に用いられる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質細胞の表面発現の検出を行う場合、２０μｇ／ｍｌのＡＣＥ２－ＮＮ－Ｆｃ融合タンパク質を取り、それぞれ上記細胞と氷上で４５ｍｉｎｓインキュベートし、その後にＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ）で細胞を三回洗浄し、その後に１：３００で希釈されたＦＩＴＣ－抗－ヒト－Ｆｃ－二次抗体（Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ）を添加して氷上で３０ｍｉｎｓインキュベートし、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ）で細胞を三回洗浄した後、フローサイトメーターでＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質の表面発現を分析し、及びＦｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質の発現結果をＦｌｏｗＪｏＶ１０ソフトウェアで分析し、その結果は図６を参照する。
合胞体の形成実験において、それぞれ２．５Ｅ５／ウェルで空ベクターコントロール細胞、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓプラスミド及びＦｕｒｉｎ部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓプラスミドでトランスフェクトされた細胞をそれぞれ４８ウェル細胞培養プレートに接種し、３０ｍｉｎ後、上記細胞を含有するウェルに２．５Ｅ５／ウェルでＡＣＥ２トランスフェクトされた細胞を添加し、３７℃で、５％ＣＯ２細胞インキュベータで３ｈ共培養し続けた後、蛍光顕微鏡でウイルス合胞体の形成状況を観察し、実験結果を撮影記録する。図７に示されるように、空ベクターコントロール細胞（赤色標識）とヒト全長ＡＣＥ２を発現する細胞（緑色標識）との間に細胞融合が発生せず、多核の合胞体の形成が観察されていないのに対して、野生型新型コロナウイルスＳタンパク質発現細胞（赤色標識）グループにおいて、ヒト全長ＡＣＥ２を発現する細胞（緑色標識）と３ｈ共培養した後、大量の多核合胞体の形成が観察される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質中のＦｕｒｉｎ酵素切断部位ＲＲＡＲがＳＲＡＳに突然変異した後、細胞融合の発生が完全に抑制され、多核合胞体の生成が観察されず、Ｓタンパク質が細胞融合を媒介誘導する能力を失ったことが示されている。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質中のＦｕｒｉｎ部位が新型コロナウイルスＳタンパク質によって媒介誘導される細胞融合に必要であることが分かる。
そして、Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ切断部位が突然変異したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質はウイルス細胞融合及び多核合胞体の形成を抑制する顕著な効果を有する（図７の最も右側の画像を参照する）。
実施例８ 異なる形式のＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質のアフィニティ、アビディティ分析
８．１ 方法
表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）技術及びバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）技術を適用し、それぞれＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ及びＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５融合タンパク質と新型コロナウイルのスパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ）受容体結合領域ＲＢＤ（ａａ３３１－５２７）とのアフィニティ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器）及びアビディティ（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４機器）を測定する。
アフィニティを測定する場合、まずＡＣＥ２－ｈＦｃとＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質を抗ヒトＦｃ抗体で被覆されたＣＭ５バイオセンサチップの表面に捕捉し、次にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤタンパク質（Ｃ末端にＨｉｓ６－Ａｖｉタグを有する）（２００ｎＭ～６．２５ｎＭの間の２倍段階希釈サンプル）を３０μｌ／ｍｉｎの速度でチップを流れ、タンパク質分子間の結合及び解離速度を測定する。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア）を使用して結合定数（Ｋａ）及び解離定数（Ｋｄ）を算出し、解離定数（ＫＤ）を平衡化する。アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）の測定について、まず２０μｇ／ｍｌのＣ末端Ｈｉｓ６－Ａｖｉタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤタンパク質をストレプトアビジンバイオセンサの表面に捕捉し、次に異なる濃度のＡＣＥ２－ｈＦｃ（０ｎＭ、１．６５～１０５．３ｎＭの間の２倍段階希釈）及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質（０ｎＭ、８．２２～５２６．３ｎＭの間の２倍段階希釈）を分析物とし、ＲＢＤが結合されたセンサの表面に１８０秒結合し、その後に３００秒の解離を行う。１：１の結合モデル（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ １１．１－ｋｎｅｔｉｃｓソフトウェア）を用いて結合定数Ｋａ、Ｋｄ及びＫＤを算出する。
８．２ 結果
単価結合のアフィニティを測定する方法（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００）（図９参照）を採用し、本発明者らはＡＣＥ２－ｈＦｃとＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質が同様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤと結合するアフィニティを有し、それぞれ２６．４ｎＭ及び２９．１ｎＭであることを発見した。本発明者らはＦｏｒｔｅｂｉｏを利用してＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ及びＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５融合タンパク質とスパイクタンパク質ＲＢＤとのアビディティを分析した。実験において２０μｇ／ｍｌのＲＢＤ－Ｈｉｓ－ａｖｉタンパク質をストレプトアビジンバイオセンサの表面に捕捉し、異なる濃度のＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ及びＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５融合タンパク質を移動相とし、実験結果はＯｃｔｅｔ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ１１．０ソフトウェアを利用してデータを分析し、ここで０ｎＭを背景値として減算する。結果に示されるように（図９）、ＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質に対して、多量化改造後のＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質はスパイクタンパク質ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ａｖｉとのアビディティが顕著に強化され、そのＫＤ値（＜１．０Ｅ－１２Ｍ）は機器の測定範囲を超えた。
実施例９ インビトロ新型コロナウイルスのシュードウイルスの中和実験
９．１ 方法
９．１．１ 新型コロナウイルスのシュードウイルスの包装
新型コロナウイルス株（Ｄ６１４）のシュードウイルスを包装する時、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、細胞密度が８０％に達した時、Ｌｉｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ ３０００で新型コロナウイルスの全長スパイクタンパク質の発現プラスミドｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ－Ｃ９（Ｄ６１４）、包装プラスミドｐｓＰＡＸ２及びフルオレセイン発現プラスミドｐＨＩＶ－Ｌｕｃを共トランスフェクトし、１：３：４の比率で細胞にトランスフェクトし、細胞にトランスフェクトしてから６ｈ後、培地を捨て、新鮮な２％ＦＢＳ、ペニシリンを含有するＤＭＥＭ培地を添加して４８ｈ培養し続け、シュードウイルスの粒子を含有する培養上清を収集し、遠心分離し、濾過して細胞のフラグメントを除去し、その後に－８０℃の冷蔵庫に凍結保存して使用に備える。他の新型コロナ変異株及びサーズ、パンゴリンコロナウイルスを包装する場合、変異株のスパイクタンパク質を発現するプラスミドでｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ－Ｃ９（Ｄ６１４）を取り替える以外、他の製造条件は同じである。本発明に使用された新型コロナウイルスのシュードウイルスは、新型コロナ初期ウイルス株（Ｄ６１４）、Ｆｕｒｉｎ部位が突然変異した新型コロナ初期ウイルス株（Ｄ６１４）、新型コロナ主流行株Ｇ６１４、新型コロナ突変株Ｄ６１４（Ｌ１８Ｆ、Ａ２２Ｖ、Ｖ３６７Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｙ４５３Ｆ、Ｎ５０１Ｙ、Ｔ４７８Ｉ、Ｐ１２６３Ｌ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、パンゴリンコロナウイルスを包含する。
９．１．２ 新型コロナウイルスのシュードウイルスの中和実験
新型コロナウイルスのシュードウイルスの中和実験を行う場合、まずヒトＡＣＥ２を安定的に発現する２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を１Ｅ５／ｗｅｌｌで不透明な９６ウェル細胞培養プレートに敷き、ＣＯ２インキュベータに置いて３７℃で２０ｈ培養した後に中和実験を行う。実験当日、７５μｌの新型コロナウイルスのシュードウイルスと２５μｌの段階希釈された異なる形式の可溶性ＡＣＥ２融合タンパク質とを均一に混合し、室温で３０分間インキュベートし、９６ウェル細胞培養プレート中の細胞培養上清を捨て、その後、予め混合されたシュードウイルスとＡＣＥ２融合タンパク質との混合物を２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞に添加し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２４ｈ培養した後、液体を交換して新鮮な２％ＦＢＳを添加し、ＤＭＥＭ培地で培養し続け、２４ｈ培養した後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定システムを用いてルシフェラーゼ活性を測定し、マイクロプレート発光装置を用いて測定する。実験において少なくとも２つのデュプリケートウェルが設置され、ＰＢＳコントロールウェルが設置されている。
９．２ 結果
９．２．１ 異なる形式のＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質多量体による新型コロナウイルスのシュードウイルスの感染に対する中和
異なる形式のＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質による新型コロナウイルスのシュードウイルスの感染に対する中和活性を比較する場合、ヒトＡＣＥ２が安定して発現した２９３Ｔ細胞を宿主細胞とし、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ融合タンパク質を段階希釈してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のシュードウイルスと均一に混合した後に２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞に感染させ、感染させた後の２日目に細胞内のルシフェラーゼの活性（ＲＬＵ）を測定し、ウイルス感染されたＰＢＳコントロールグループの細胞内のルシフェラーゼの活性（ＲＬＵ）を基数として異なるＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ融合タンパク質濃度での抑制百分率を算出する。図１０に示されるように、異なる形式のＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質はいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のシュードウイルス（Ｄ６１４）感染に対して中和活性を有し、なかでも、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５及びＡＣＥ２－ｈＦｃ５ Ｌ３０９Ｃのインビトロ中和活性が最も高く、ＩＣ５０はそれぞれ９．８６ｎｇ／ｍｌ及び１２．４ｎｇ／ｍｌである。ＡＣＥ２－ｈＦｃ－ＡＣＥ２ Ｔｅｔｒａｍｅｒ（四量体）及びＡＣＥ２－ＡＣＥ２－ｈＦｃ Ｔｅｔｒａｍｅｒ（四量体）がそれに次いで、ＩＣ５０はそれぞれ３９．３１ｎｇ／ｍｌ及び２６０．８ｎｇ／ｍｌである。ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃの中和活性が最も低い。この結果により、ＡＣＥ２融合タンパク質の新型コロナウイルス感染を中和する活性がそれと新型コロナスパイクタンパク質ＲＢＤとのアビディティに正比例し、多量化程度が高いほど、中和効果が高く、多量化の改造がＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質の中和活性を顕著に強化することが示されている。
９．２．２ ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５は広域スペクトルの新型コロナウイルス感染に抵抗する中和活性を有する
ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の新型コロナ変異株及び関連するコロナウイルスに対する広域スペクトルの抗感染活性を評価するために、人々に現れた主な流行変異株に基づいて、本発明者らは様々な一点突然変異の新型コロナシュードウイルスを包装し、２９３Ｔ－ＡＣＥ２安定型細胞株感染モデルでＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の中和活性を評価した。その結果によると、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５分子は新型コロナウイルスの初期ウイルス株Ｄ６１４、主な流行株Ｇ６１４及び他の変異株、並びにＳＡＲＳ及びパンゴリンコロナウイルスのシュードウイルスに対していずれも強い中和活性を有し、その広域スペクトルの抗ウイルス能力が示され、新型コロナウイルスの主な流行株Ｇ６１４のシュードウイルスに対する中和活性ＩＣ５０は９．５６ｎｇ／ｍｌに達した（図１１、下記の表２）。新型コロナウイルスの主な変異株のシュードウイルス感染に対する中和活性の側面（表３）において、その結果はＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５多量体が依然として強いインビトロ中和能力を有することが示され、特にＮ５０１Ｙ変異株に対して、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の中和活性がより強く、ＩＣ５０が０．０３６ｎｇ／ｍｌであった。以上の結果により、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５がインビトロで効率的で、広域スペクトルの抗新型コロナウイルス活性を有することが説明される。
表２．ＡＣＥ２－ｈＦｃ５多量体の新型コロナウイルスＤ６１４、Ｇ６１４、サーズウイルス、パンゴリンコロナウイルスのシュードウイルスの感染に抵抗する中和活性
Figure 2023515603000002
表３．ＡＣＥ２－ｈＦｃ５多量体の新型コロナウイルスの主な変異株のシュードウイルスの感染に抵抗する中和活性
Figure 2023515603000003
実施例１０ インビトロ新型コロナウイルス生ウイルス中和実験
１０．１ 方法
Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに接種し、細胞密度は約２×１０４／ウェルである。翌日、細胞培養液を２％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に変更する。２％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培養液を用いて作業濃度が２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌになるまでＡＣＥ２－ｈＦｃ融合タンパク質を希釈し、各サンプルに３つのデュプリケートウェルを設置する。２０１９－ｎＣｏＶ（ウイルス株：Ｃ－Ｔａｎ－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ ｓｔｒａｉｎ ０１）を２％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培養液で２００ＴＣＩＤ５０／１００μｌに希釈する。希釈されたサンプル５０μｌを等量の２００ＴＣＩＤ５０ウイルスに添加し、３７℃で１ｈインキュベートする。次に１００μｌの抗体－ウイルス複合体を細胞に添加し、３７℃でインキュベートする。３７℃で４８ｈインキュベートした後にＣＰＥを観察し、４８ｈ後に培養上清を１００μｌ吸い取って核酸抽出を行い、最後に８０μｌの溶出液で溶出させる。核酸５μｌを取って体系を調製し、ＡＢＩＱ５蛍光定量ＰＣＲ装置でリアルタイム蛍光ＲＴ－ＰＣＲ反応を行う。測定されたサンプルＣＴ値を検量線に代入してサンプル中のウイルスＴＣＩＤ５０を算出する。以下の式に基づいて算出する。
ウイルス複製抑制率（％）＝（コントロールグループのＴＣＩＤ５０－融合タンパク質グループのＴＣＩＤ５０）／コントロールグループのＴＣＩＤ５０×１００％
以上の実験はバイオセーフティーレベル３の実験室で完了した。
１０．２ 結果
Ｖｅｒｏ細胞を宿主細胞としてバイオセーフティー実験室でＡＣＥ２－ｈＦｃ５の新型コロナウイルス２０１９－ｎＣｏＶの生ウイルス（Ｃ－Ｔａｎ－ｎＣｏＶ Ｗｕｈａｎ ｓｔｒａｉｎ ０１）に対する中和効果を評価した。実験結果によると（図１２を参照）、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５及びＡＣＥ２－ｈＦｃは新型コロナウイルスの感染に対していずれも明らかな中和活性を有し、ＩＣ５０はそれぞれ０．０２～０．０６μｇ／ｍｌ及び５．３～６．８μｇ／ｍｌである。中和能力において、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５のインビトロ中和効果がより優れ、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃよりも数百倍高く、０．２μｇ／ｍｌの濃度で依然としてウイルスに対する８０％の抑制作用が観察される。以上の結果により、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５分子がインビトロで効率的な抗新型コロナウイルス活性を有することが十分に示されている。
実施例１１ ＡＣＥ２－ｈＦｃ５融合タンパク質のハムスターにおける霧化吸入評価
１１．１ 方法
１１．１．１ ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５霧化吸入後の気道及び肺部での堆積分布分析
本発明者らは、小動物を選定してその全身を霧化投与システム（エアポンプ、質量流量計、曝露ボックスを含む）に曝露させ、Ａｅｒｏｇｅｎ ｓｏｌｏ霧化器、アダプタ及び霧化収集装置を配置してＡＣＥ２－ｈＦｃ５の霧化投与実験を行った。気道堆積分布分析実験において、それぞれ霧化後の０ｈ、６ｈ及び２４ｈに生理食塩水で灌流する方法でハムスターの鼻腔灌流液（Ｎａｓａｌ Ｌａｖａｇｅ Ｆｌｕｉｄ、ＮＬＦ）を収集する。主気管（ｔｒａｃｈｅａ）、気管支（ｂｒｏｎｃｈｕｓ）及び肺胞（ａｌｖｅｏｌｉ）についてそれぞれ収集した後に一定の割合を取って組織溶解液で溶解し、溶解した後に遠心分離して上清を取ってＡＣＥ２－ｈＦｃ５多量体の含有量を測定する。肺部堆積用量探索分析実験において、１５分間、３０分間、６０分間で霧化吸入後に、各ハムスターについて４ｍＬの生理食塩水を用いて灌流して肺胞灌流液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ Ｌａｖａｇｅ Ｆｌｕｉｄ、ＢＡＬＦ）を収集し、残りの肺臓を取り出した後にホモジネートにし、一定の割合の肺ホモジネートを取って組織溶解液で溶解し、溶解した後に遠心分離して上清を取ってＡＣＥ２－ｈＦｃ５多量体の含有量を測定する。
１１．１．２ ＥＬＩＳＡによるＡＣＥ２－ｈＦｃ５の含有量の分析
ＡＣＥ２－ｈＦｃ５多量体の含有量は、新型コロナウイルスＲＢＤを用いてＥＬＩＳＡの方法と組み合わせて分析した。２μｇ／ｍＬストレプトアビジンをコーティングし、２μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎで標識された新型コロナウイルスＲＢＤを捕捉し、精製されたＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５を標準品として使用し、同時に、測定対象としての希釈された灌流液又は組織溶解液の上清を添加し、ＨＲＰで標識された抗ｈＦｃの二次抗体を使用して測定し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０－ＯＤ６３０の値を読み取る。
１１．１．３ ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる霧化前後のＡＣＥ２－ｈＦｃ５の量体形態の分析
霧化前後のＡＣＥ２－ｈＦｃ５については、ＨＰＬＣの方法で量体及び分解分析を行った。Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０高速液体クロマトグラフィー分析システムを使用し、Ｇ４０００ ＴＳＫ Ｇ４０００ＳＷｘｌ分析カラム及びＴＳＫ ｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ ＳＷｘｌ保護カラムを使用した。緩衝液は５０ｍＭ ＰＢ、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．７±０．１であり、分析時間は２０分間又は２５分間であり、流速は０．８ｍＬ／分間である。
１１．２ 結果 霧化投与方式により、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５はハムスターの肺胞に効果的に堆積することができる。
新型コロナの感染経路が主に気道伝播であり、かつ主な病巣が肺部であることを考慮し、本発明者らは霧化吸入による気道投与方式を検討した。本発明者らは、Ａｅｒｏｇｅｎの霧化器を用いてＡＣＥ２－ｈＦｃ５を霧化させ、対応するガラス試験管を用いて氷浴の条件下で霧化液滴を収集した。この収集方法の回収率は９０％以上に達することができる。本発明者らはＳＥＣ－ＨＰＬＣによりＡＣＥ２－ｈＦｃ５の霧化前後の物理化学的性質及び新型コロナウイルスのシュードウイルスの感染に抵抗する中和活性を分析した結果、霧化がＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の凝集及び分解を引き起こさず（図１３を参照）、かつ、新型コロナウイルスのシュードウイルスの感染に対して顕著な抑制活性を有し、その抗ウイルス能力は霧化前後に明らかな変化が発生しない（図１４を参照）ことが示されている。
さらに小動物への霧化曝露投与を用いてハムスターに５０ｍｉｎの霧化吸入投与（５ｍｇ／ｍＬ ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５）を行い、それぞれ霧化後の０ｈ、６ｈ及び２４ｈにハムスターの鼻腔灌流液（Ｎａｓａｌ Ｌａｖａｇｅ Ｆｌｕｉｄ、ＮＬＦ）、主気管（ｔｒａｃｈｅａ）、気管支（ｂｒｏｎｃｈｕｓ）及び肺胞（ａｌｖｅｏｌｉ）を取ることにより、気道の各成分におけるＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の堆積分布状況を分析した。本発明者らは、投与終了後の０ｈ、６ｈ及び２４ｈに、吸入後のＡＣＥ２－ｈＦｃ５が主に肺胞に分布している（約７５％を占める）こと、鼻腔灌流液における分布が迅速に低下し、吸入後０ｈの１７．３３％から吸入後Ｆ２４ｈの０．７％まで低下すること、主気管における分布が少なく、０．３５％～３．４％の間にあることを発見した。気管支内の分布は徐々に上昇し、５％から１９％まで上昇する。この結果により、霧化吸入されたＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５は肺胞部位に効果的に到達することができ、かつ吸入後の２４ｈ以内にいずれも主に肺胞に分布することがわかる。
本発明者らは、さらに、ハムスターにおけるＡＣＥ２－ｈＦｃ５の吸入用量と肺堆積との間の関係を研究するとともに、肺胞灌流液でのシュードウイルスの中和活性を分析した。濃度が５ｍｇ／ｍＬのＡＣＥ２－ｈＦｃ５を使用し、霧化吸入させて１５分間、３０分間、６０分間後、ハムスターの肺胞灌流液、及び肺ホモジネートを収集し、ＥＬＩＳＡ方式を使用してＡＣＥ２－ｈＦｃ５の含有量を測定し、肺胞灌流液及び肺ホモジネートにおけるＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の合計を肺堆積総量として算出する。その結果によると、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５霧化吸入後、ハムスターでの肺堆積量は投与量の増加に伴って増加することがわかる。吸入直後に、吸入時間が１５分間、３０分間、６０分間にそれぞれ堆積量６．４８μｇ、１８．６９μｇ、３３．３５μｇに対応する。吸入が終了した後、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５のハムスター肺部での堆積は迅速に低下し、吸入終了後１２時間後、ハムスター肺部での堆積量は吸入直後の１４．７３％～４６％に低下する。それにもかかわらず、霧化吸入時間が１５分間及び３０分間である条件下で、吸入終了後１２時間後、４ｍＬの生理食塩水で各ハムスターを灌流して得られた肺胞灌流液を４倍希釈した後に依然として９０％以上の新型コロナウイルスのシュードウイルスの中和活性を保持することができる。
実施例１２ ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ハムスター感染モデルにおける薬効評価
１２．１ 方法
１２．１．１ 実験設計
全ての動物実験は、中国医学科学院昆明生物医学研究所の動物倫理委員会により承認され、中国雲南国家昆明高レベルバイオセーフティー実験室の操作仕様及びガイドに合致する。
成年ＳＰＦレベルのハムスターを高レベルのバイオセーフティー実験室に移動した後、単独のケージで飼育する。ハムスターは、体重に応じて、未治療のコントロールグループ、毎日２回の１５分間の霧化治療グループ及び毎日２回の３０分間の霧化治療グループという３つのグループに平均に分けられ、グループ毎に７匹である。実験において、ハムスターに鼻腔を介して１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＧＤ１０８＃）を接種し、２時間後、一回目の霧化吸入治療を行い、霧化時間はそれぞれ１５分間（２５ｍｇＡＣＥ２－ｈＦｃ５）及び３０分間（５０ｍｇＡＣＥ２－ｈＦｃ５）であり、その後に１２時間ごとに一回霧化治療し、合計６回であり、毎回の霧化前に秤量する。チャレンジした後に６２ｈ後は実験終点となり、肺臓組織を取ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのゲノム（ｇＲＮＡ）及びサブウイルスゲノム（ｓｇＲＮＡ）量の分析を行う。１００ｍｇの肺組織（左肺）ごとに１ｍｌのＰＢＳを添加し、迅速にホモジネートにした後に２００μｌを取ってＲＮＡ抽出を行い、その後にＲＴ－ｑＰＣＲでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ量の分析を行う。統計学的分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを採用する。Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵを用いて２つのグループの間の差異分析を行う。
１２．２ 結果 ハムスター新型コロナウイルス感染モデルにおいて、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５の霧化投与により、ウイルス量を効果的に低減することができる。
本発明者らが確立した霧化吸入投与方式に基づいて、本発明者らはハムスターＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデルを利用して、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦＣ５のインビボの抗ウイルス能力を評価した。実験は２つの用量グループを設定しており、それぞれ１５分間の霧化吸入及び３０分間の霧化吸入によりＡＣＥ２－ｈＦＣ５の薬効を評価した。ハムスターがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後、ウイルスの力価が３日目に最高に達し、時間の増加に伴ってウイルス血症が徐々に改善され、したがって、本発明者らはチャレンジした後の３日目を実験終点として選択する。ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５で治療した後、ハムスターの体重の低下はわずかに改善される傾向がある。肺組織のｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの定量結果から見ると、霧化吸入したＡＣＥ２－ｈＦｃ５は顕著な肺組織ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製に対する抑制作用を有する（図１５）。図１５における実験終点のとき（チャレンジ後６２時間後）、ハムスター肺臓におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（ｇＲＮＡ）及びサブゲノム（ｓｇＲＮＡ）の変化状況に対してｑＰＣＲ分析を行った。
●未治療のコントロールグループ
■ＡＣＥ２－ｈＦｃ５－１５ｍｉｎ－ＢＩＤグループ
▲ＡＣＥ２－ｈＦｃ５－３０ｍｉｎ－ＢＩＤグループ
横線は中央値を示し、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕを用いて２つのグループの間の差異の統計学的分析を行った。したがって、霧化吸入したＡＣＥ２－ｈＦｃ５はハムスターＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデルのウイルス量を効果的に低減することができ、新型コロナ肺炎を予防治療する潜在的な能力を有する。
以上において、一般的な説明、具体的な実施形態及び試験を用いて本発明を詳細に説明したが、本発明に基づいて、いくつかの修正又は改良を行うことができ、これは当業者にとって自明である。したがって、本発明の精神から逸脱することなく行われたこれらの修正又は改良は、いずれも本発明の保護範囲に属する。

Claims (42)

  1. ＡＣＥ２の細胞外ドメインを含み、又はＡＣＥ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列で構成され、又はコロナウイルスとの結合能力を保持するＡＣＥ２の細胞外ドメインのフラグメントであることを特徴とする可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  2. 前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の細胞外領域メタロプロテアーゼドメインを含み、好ましくはヒトＡＣＥ２の１９番目～６１５番目のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  3. 前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２のＱ２４、Ｔ２７、Ｆ２８、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｈ３４、Ｅ３７、Ｄ３８、Ｙ４１、Ｑ４２、Ｌ４５、Ｍ８２、Ｙ８３、Ｑ３２５、Ｅ３２９、Ｎ３３０、Ｋ３５３、Ｇ３５４、Ｄ３５５、Ｒ３５７及びＲ３９３のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  4. 前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は活性中心が突然変異したＡＣＥ２又はその欠失型であり、好ましくは、前記活性中心が突然変異したＡＣＥ２又はその欠失型はヒトＡＣＥ２の３７４番目及び／又は３７８番目に対応してＨ３７４Ｎ及び／又はＨ３７８Ｎ突然変異した可溶性ＡＣＥ２であることを特徴とする請求項１に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  5. 前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＡＣＥ２酵素活性を保持する可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であることを特徴とする請求項１に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  6. 前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であり、好ましくは、ヒトＡＣＥ２の５３番目、９０番目、１０３番目、３２２番目、４３２番目、５４６番目及び／又は６９０番目がグリコシル化された可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型であることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  7. 前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型。
  8. 請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型と抗体Ｆｃドメインとの融合タンパク質であることを特徴とする可溶性ＡＣＥ２の融合タンパク質。
  9. 前記抗体はＩｇＧ抗体であり、好ましくはヒトＩｇＧであり、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくはＩｇＧ１であり、
    好ましくは、前記抗体Ｆｃドメインは抗体を含有する２つの重鎖Ｆｃ領域の抗体Ｆｃ－ドメインであり、
    好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はそのＮ末端にヒンジ領域を有し、
    好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ３ドメインを含み、
    好ましくは、各重鎖Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、
    好ましくは、前記Ｆｃ領域はヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むことを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. ２ｎ個の前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続され及び／又はＮ末端に接続され、ここで、ｎは１、２又は３であり、
    好ましくは、２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に接続され二量体を形成し、又は、２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続され二量体を形成し、
    又は、２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に接続されると共に、他の２つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続されることにより、四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、さらに、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端の２つの前記可溶性ＡＣＥ又はその欠失型のＮ末端にさらにそれぞれ１つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が直列接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、好ましくは、前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続され、好ましくは、前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであり、又は、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端の２つの前記可溶性ＡＣＥ又はその欠失型のＣ末端にさらにそれぞれ１つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が直列接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、好ましくは、前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続され、好ましくは、前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであり、
    又は、４つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つずつ直列接続された後に２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に接続されることにより、四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、好ましくは、前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続され、好ましくは、前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであり、さらに、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端の２つの前記可溶性ＡＣＥ又はその欠失型のＮ末端にさらにそれぞれ１つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が直列接されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、好ましくは、前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続され、好ましくは、前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであり、又は、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の前記２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に２つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、
    又は、４つの前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は２つずつ直列接続された後に２つの重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に接続されることにより、四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成し、好ましくは、前記２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型はリンカーを介して直列接続され、好ましくは、前記リンカーはシステインＡＡＡリンカーであり、さらに、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の２つの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に２つの可溶性ＡＣＥ又はその欠失型が接続されることにより、六量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を形成することを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
  11. 前記融合タンパク質は、二量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質であり、ここで、単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項８又は９に記載の融合タンパク質。
  12. 前記融合タンパク質はさらにシグナルペプチドを含み、好ましくはＣＤ３３シグナルペプチドであり、好ましくは、前記融合タンパク質は二量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質であり、ここで、単一のＡＣＥ２欠失型及び単一の重鎖Ｆｃ領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項８又は９に記載の融合タンパク質。
  13. 前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における単一のＡＣＥ２欠失型には単一の重鎖Ｆｃ領域が接続されてから、さらに単一のＡＣＥ２が接続されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有し、又は、前記四量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質における２つの直列接続されたＡＣＥ２又はその欠失型には単一の重鎖Ｆｃ領域が接続されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の融合タンパク質。
  14. 可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型のＦｃ多量体融合タンパク質ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ｎ）であって、ｎ個のポリペプチド単量体単位を含み、各ポリペプチド単量体単位は２つの可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域の抗体Ｆｃ－ドメインのＮ末端との接続により形成された二量体であり、前記ｎ個のポリペプチド単量体単位は抗体Ｆｃ－ドメインＣ末端に位置する尾部により多量体に組み立てられ、前記可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型は請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型である。
  15. 各ポリペプチド単量体単位における各重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に１つの尾部が接続され、ｎ個のポリペプチド単量体単位は合計２ｎ個の尾部を有し、互いに接続されて多量体を構成し、好ましくは、前記尾部はＩｇＭ及び／又はＩｇＡに由来する尾部であり、好ましくは、前記尾部はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される配列を有することを特徴とする請求項１４に記載の多量体融合タンパク質。
  16. 前記多量体融合タンパク質は、
    ４つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた四量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ｈＦｃ４、
    ４つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ４、
    ４つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた四量体であり、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ４－Ｌ３０９Ｃ、
    ５つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ｈＦｃ５、
    ５つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５、
    ５つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた五量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、重鎖Ｆｃ領域は３０９番目にＬ３０９Ｃ突然変異が発生した、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ５－Ｌ３０９Ｃ、
    ６つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、単一の尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ｈＦｃ６、
    ６つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体であって、各ポリペプチド単量体単位が２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、単一の尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６、
    ６つのポリペプチド単量体単位がＦｃ－ドメインＣ末端の尾部を介して互いに接続されて組み立てられた六量体であって、各ポリペプチド単量体単位は２つのＡＣＥ２欠失型と２つの重鎖Ｆｃ領域で構成された二量体であり、単一のＡＣＥ２欠失型と単一の重鎖Ｆｃ領域は、尾部と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有する、ＡＣＥ２－ＮＮ－ｈＦｃ６－Ｌ３０９Ｃ、といった多量体融合タンパク質から選択される１種又は複数種であることを特徴とする請求項１４に記載の多量体融合タンパク質。
  17. 請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、又は請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質を発現することを特徴とする発現ベクター。
  18. 請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質、又は請求項１６の発現ベクターを発現することを特徴とする哺乳動物細胞株。
  19. 前記細胞株はＣＨＯ細胞株、２９３細胞株及びＶｅｒｏ細胞株及びその派生する細胞株、好ましくは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含むがそれらに限定されないことを特徴とする請求項１８に記載の哺乳動物細胞株。
  20. 請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、又は請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質の製造方法であって、
    （１）請求項１７の発現ベクターで請求項１８の哺乳動物細胞株をトランスフェクトし、請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、又は請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞発現株を構築するステップと、
    （２）培養条件下でステップ（１）の哺乳動物細胞発現株を培養して請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、又は請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質を生成して組換えタンパク質を生成するステップと、及び
    （３）ステップ（２）で発現された組換えタンパク質を精製するステップとを含むことを特徴とする方法。
  21. 請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、又は請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
  22. 請求項１～７のいずれか一項に記載の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１４～１６のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質の、ＡＣＥ２に関連する疾患を治療するか又は予防するための薬物の製造における適用。
  23. 前記疾患はＡＣＥ２を受容体とするウイルスの感染に起因する疾患であり、好ましくは、前記ウイルスはコロナウイルスであってもよく、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であることを特徴とする請求項２２に記載の適用。
  24. 前記疾患は肺炎、重症急性呼吸器感染、腎不全、心不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝臓損傷、腸疾患、又は重症急性呼吸器症候群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の適用。
  25. 前記薬物は医療従事者及びＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスに曝される可能性のある他の者の受動免疫に用いることができることを特徴とする請求項２２に記載の適用。
  26. 前記薬物は吸入、鼻内又は気道滴下注入薬物は吸入、鼻内又は気道滴下注入、点眼、中耳注射、点耳薬、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、胸腔内滴下注入、腹膜内注射、病巣内、粘膜への適用又は徐放性担体の移植によって投与され、好ましくは、前記薬物は霧化吸入により投与されることを特徴とする請求項２２～２５のいずれか一項に記載の適用、及び請求項２１に記載の薬物組成物。
  27. ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に抵抗する薬物をスクリーニングする方法であって、請求項１～７のいずれか一項の可溶性ＡＣＥ２又はその欠失型、請求項８～１３のいずれか一項の融合タンパク質、請求項１４～１６のいずれか一項の多量体融合タンパク質、請求項１７の発現ベクター又は請求項１８～１９のいずれか一項の哺乳動物細胞株を用いて前記薬物をスクリーニングすることを含むことを特徴とする方法。
  28. ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に抵抗する薬物をスクリーニングする方法であって、Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ、又はコロナウイルスのＳタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位を薬物スクリーニングの標的として利用することを含むことを特徴とする方法。
  29. 前記薬物がＦｕｒｉｎプロテアーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 前記薬物はＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染において、Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位により合胞体が形成されることを遮断することを特徴とする請求項２８又は２９に記載の方法。
  31. Ｆｕｒｉｎプロテアーゼ又はコロナウイルスのＳタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位を標的とする試薬の、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に対する薬物の製造における適用。
  32. ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染においてＦｕｒｉｎ酵素切断部位により合胞体が形成されることを遮断する試薬の、ＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスの感染に対する薬物の製造における適用。
  33. 前記試薬はＦｕｒｉｎプロテアーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項３１又は３２に記載の適用。
  34. 前記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であることを特徴とする請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法、請求項３１又は３２に記載の適用。
  35. 突然変異したＳタンパク質であって、前記Ｓタンパク質は欠失型、及び／又はＦｕｒｉｎ酵素切断部位に突然変異が発生した形態であり、前記欠失型とは、Ｓタンパク質の膜貫通領域及び細胞内領域が欠失していることであり、前記Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位に突然変異が発生したことは、１つ又は複数のアミノ酸を欠失、置換又は添加することにより、Ｆｕｒｉｎ酵素切断部位がＦｕｒｉｎ酵素切断部位としての活性を有さなくなることである、ことを特徴とする突然変異したＳタンパク質。
  36. 前記Ｓタンパク質のＦｕｒｉｎ酵素切断部位がＲＲＡＲからＳＲＡＳに突然変異したことを特徴とする請求項３５に記載のＳタンパク質。
  37. 前記Ｓタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３５又は３６に記載のＳタンパク質。
  38. 請求項３５～３７のいずれか一項に記載のＳタンパク質の、ＡＣＥ２に関連する疾患を治療するか又は予防するための薬物の製造における適用。
  39. 前記疾患はＡＣＥ２を受容体とするウイルスの感染に起因する疾患であり、好ましくは、前記ウイルスはコロナウイルスであってもよく、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ２であることを特徴とする請求項３８に記載の適用。
  40. 前記疾患は肺炎、重症急性呼吸器感染、腎不全、心不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝臓損傷、腸疾患、又は重症急性呼吸器症候群から選択されることを特徴とする請求項３８に記載の適用。
  41. 前記薬物は医療従事者及びＡＣＥ２を受容体とするウイルス、特にコロナウイルスに曝される可能性がある他の者の受動免疫に用いることができることを特徴とする請求項３８に記載の適用。
  42. 請求項３５～３７のいずれか一項に記載のＳタンパク質を含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染を予防するための組換えワクチン。
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