KR20220147121A - 가용성 ace2 및 융합 단백질, 및 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가용성 ACE2 및 이의 말단절단된 형태, 이의 융합 단백질 및 이들의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 ACE2 관련 질환에 대한 약물의 제조에서 가용성 ACE2 및 이의 말단절단된 형태, 및 융합 단백질의 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 가용성 ACE2 및 이의 융합 단백질 및 이의 응용에 관한 것이다.
2019년 12월, 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)로 인한 코로나바이러스 질환 2019(SARS-CoV-2)의 전염병 발생 상황이 발생하여 전 세계적으로 빠르게 확산되었고, 2021년 2월 기준 전 세계 감염자 수는 1억 명을 넘어섰고 사망률은 약 2.2%로 세계 보건 위기를 촉발했을 뿐만 아니라 사회 및 경제 등 각 측면에 광범위하고 심각한 영향을 미친다.
코로나바이러스는 니도바이러스목, 코로나바이러스과, 코로나바이러스속에 속하며 외피가 있고 게놈이 선형 양성 단일 가닥 RNA인 바이러스로, 자연계에 널리 존재하는 한 종류의 바이러스이며, 이들이 일으키는 질환에 걸린 환자는 감기부터 중증 폐감염까지 다양한 임상 증상을 보인다. 지난 20년 동안 코로나바이러스는 각각 2002/2003년 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)과 2012년 중동 호흡기 증후군(MERS)이라는 두 가지 대규모 전염병 발생 상황을 일으켰다. 2019년 말부터 SARS-CoV-2로 인한 코로나바이러스 질환 2019의 전염병 발생 상황은 전염병 범위, 누적 감염 수 및 사망자 수 측면에서 SARS 및 MERS의 전염병 발생 상황을 훨씬 초과했다.
SARS-CoV2의 바이러스 게놈 서열은 2013년 중국 윈난성에서 발견된 박쥐(중국적갈색관박쥐)에서 분리된 RaTG13 바이러스 균주와 매우 유사하며 서열 상동성이 96.2%로 높다(Zhou et al., 2020). 이번 발병에서 바이러스의 근원은 SARS 및 MERS를 일으킨 코로나바이러스의 근원과 일치한 바, 모두 박쥐에서 유래한 것으로 유추할 수 있다. 인간에게 발병을 일으킨 경로는 위에서 언급한 두 바이러스와 같을 가능성이 높은데, 바이러스는 박쥐로부터 중간 숙주(인간의 활동과 더 밀접한 관계가 있는 동물)의 체내에서 진화 및 증폭되어 최종적으로 인간을 감염시키고 계속해서 진화하고 빠르게 전파하여 발병을 일으킬 수 있다. 자연 조건에서 SARS와 유사한 코로나바이러스는 세계 여러 지역의 박쥐에서 오랫동안 존재하며 대부분은 인간을 감염시킬 수 없음에도 불구하고, 이러한 "자연 병소” 질환은 우발적인 조건에서 다른 중간 숙주를 통해 인간을 감염시킬 수 있다. 2002/03년의 "SARS" 전염병 발생 상황과 17년의 경과 후 신종 코로나바이러스 감염의 발생으로부터 자연 숙주가 존재하는 한 향후 다른 병원성 코로나바이러스 감염이 재차 발생할 가능성이 있음을 다시 한 번 보여준다.
2020년 11월, FDA는 신종 코로나바이러스에 대한 두 가지 특이적 단클론 항체 치료법에 사용되는 일라이릴리앤드컴퍼니(Eli Lilly and Company)의 밤라니비맙(bamlanivimab) 및 리제네론(Regeneron) 회사의 카시리비맙(casirivimab)과 임데비맙(imdevimab) 두 항체 조합에 대한 긴급 사용 승인을 부여하였다. 이러한 두 가지 치료법 모두 입원하지 않은 성인과 경증에서 중등도의 SARS-CoV2 증상이 있는 사람, 추가 질환 악화의 위험이 있는 12세 이상의 어린이에게 사용하는 것으로 승인되었다. 단클론 항체는 일반적으로 고효율과 넓은 스펙트럼의 두 가지 측면을 고려하기 어렵다. 신종 코로나바이러스의 세계적 유행으로 변이 균주가 생산되었으며 인간 숙주에 대한 추가 적응 및 집단 면역과 같은 선택 압력 하에서 계속 생산될 것이다. 변이 균주는 이전에 개발된 중화 항체를 효과가 없게 만드는 항원 부위 변화가 발생한다.
신종 코로나바이러스, SARS-CoV, 및 신종 코로나바이러스와 관련된 동물 바이러스는 모두 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 수용체로 사용하여 표적 세포에 침입하여 감염시킨다. 신종 코로나바이러스의 표면에는 삼량체 형태의 S 단백질이 여러 개 있고 ACE2와 친화력이 높으므로, 바이러스를 효과적으로 중화하려면 S 단백질과 ACE2의 다가 고친화력 결합을 동시에 차단해야 한다. ACE2의 세포외 도메인을 항체의 불변 영역에 융합시켜 형성된 가용성 수용체는 중화 항체와 유사한 작용 기전을 가지며, 변이되었지만 여전히 ACE2를 수용체로 사용하는 돌연변이 바이러스 균주에 의한 감염을 차단할 수 있다. 가용형 ACE2 수용체 융합 단백질을 천연의 넓은 스펙트럼 중화 능력을 가지고 있고 바이러스 변이의 제한을 받지 않는 치료제로서 연구 개발함으로써, 신종 코로나바이러스 감염의 치료제에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 미래에 발생할 수 있는 유사한 전염병 발생 상황에 대처할 수도 있다.
본 발명의 가용성 ACE2 및 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2(NN), 및 상기 가용성 ACE2 및 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2(NN)와 인간 IgG1의 Fc 세그먼트의 ACE2-Fc 융합 단백질은 SARS-CoV2 및 SARS-CoV를 효율적으로 중화할 수 있고, 특히 SARS-CoV2의 스파이크 단백질 S(Furin 프로테아제 절단 부위를 포함)와 SARS-CoV2의 수용체 인간 ACE2가 결합되어 유도된 다핵 합포체 형성을 차단할 수 있다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태를 제공한다. 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 세포외 도메인, 또는 ACE2의 세포외 도메인의 아미노산 서열로 구성되거나 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 이의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인(19-615aa)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인(1-740aa)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 Q24, T27, F28, D30, K31, H34, E37, D38, Y41, Q42, L45, M82, Y83, Q325, E329, N330, K353, G354, D355, R357 및 R393을 포함한다. 특히, K31 및 K353을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2 또는 이의 임의의 상동 이종상동체 또는 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 이들의 단편을 포함한다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2를 숙주 결합 수용체로 사용하는 바이러스를 효율적으로 중화할 수 있다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태일 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 374번째 및/또는 378번째 부위에서 H374N 및/또는 H378N 돌연변이가 발생된 인간 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태(ACE2-NN)이다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 효소 활성을 유지하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태일 수 있다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이다. 바람직하게는, 인간 ACE2의 N-말단 53번째, 90번째, 103번째, 322번째, 432번째, 546번째 및/또는 690번째 부위가 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
제2 양태에 따르면, 본 발명은 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태를 항체 Fc 도메인과 융합시켜 구축된 ACE2-Fc 융합 단백질을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 세포외 도메인, 또는 ACE2의 세포외 도메인의 아미노산 서열로 구성되거나 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 이의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인(19-615aa)을 포함한다. 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인(1-740aa)을 포함한다. 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 Q24, T27, F28, D30, K31, H34, E37, D38, Y41, Q42, L45, M82, Y83, Q325, E329, N330, K353, G354, D355, R357 및 R393을 포함한다. 특히, K31 및 K353을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2 또는 이의 임의의 상동 이종상동체 또는 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 이들의 단편을 포함한다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2를 숙주 결합 수용체로 사용하는 바이러스를 효율적으로 중화할 수 있다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태일 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 374번째 및/또는 378번째 부위에서 H374N 및/또는 H378N 돌연변이가 발생된 인간 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태(ACE2-NN)이다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 효소 활성을 유지하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태일 수 있다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이다. 바람직하게는, 인간 ACE2의 N-말단 53번째, 90번째, 103번째, 322번째, 432번째, 546번째 및/또는 690번째 부위가 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2를 숙주 결합 수용체로 사용하는 바이러스를 효율적으로 중화할 수 있다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 항체는 IgG 항체이고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 인간 IgG일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1이다. 상기 항체 Fc 도메인은 항체의 2개의 중쇄 Fc 영역을 포함하는 항체 Fc-도메인이다. 바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 N-말단에 힌지 영역을 갖는다. 바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래되는 CH3 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 상기 Fc 영역은 2개의 ACE2 도메인의 이량체화를 촉진할 수 있다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결되거나 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 2n(n은 1, 2 또는 3임)개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단 및/또는 N-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 항체 Fc-도메인의 N-말단에 연결되어 이량체를 형성한다. 또는, 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결되어 이량체를 형성한다.
일부 실시형태에서, 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 항체 Fc-도메인의 N-말단에 연결되고, 다른 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결됨으로써, 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다. 또한, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 N-말단의 2개의 상기 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태의 N-말단에 추가로 하나의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 각각 직렬로 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다. 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결된다. 상기 링커는 시스테인 AAA 링커일 수 있다. 또는, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 C-말단의 2개의 상기 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태의 C-말단에 추가로 하나의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 각각 직렬로 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다. 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결된다. 상기 링커는 시스테인 AAA 링커일 수 있다.
일부 실시형태에서, 4개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개씩 직렬로 연결된 후 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결됨으로써, 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다. 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결된다. 상기 링커는 시스테인 AAA 링커일 수 있다. 또한, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 N-말단의 2개의 상기 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태의 N-말단에 추가로 하나의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 각각 직렬로 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다. 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결된다. 상기 링커는 시스테인 AAA 링커일 수 있다. 또는, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 상기 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 2개의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다.
또는, 4개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개씩 직렬로 연결된 후 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결됨으로써, 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다. 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결된다. 상기 링커는 시스테인 AAA 링커일 수 있다. 또한, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 2개의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성한다.
바람직하게는, 상기 ACE2-Fc 융합 단백질은 실제로 이량체 ACE2-Fc 융합 단백질이고, 여기서 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 ACE2-Fc 융합 단백질 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 ACE2-Fc 융합 단백질은 신호 펩티드, 바람직하게는 CD33 신호 펩티드를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 ACE2-Fc 융합 단백질 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 ACE2-Fc 융합 단백질 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태는 단일 중쇄 Fc 영역에 연결된 다음 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단일 ACE2(ACE2-Fc-ACE2)에 연결된다.
바람직하게는, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질 중 직렬로 연결된 2개의 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단일 중쇄 Fc 영역(ACE2-ACE2-Fc)에 연결된다.
상기 ACE2-Fc 융합 단백질은 ACE2를 숙주 결합 수용체로 사용하는 바이러스를 효율적으로 중화할 수 있다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
본 발명의 ACE2-Fc 융합 단백질은 가용성 ACE2의 반감기 및 생산량을 향상시킬 수 있고, 신속한 공정 개발 및 응급 약물의 요구를 최대한 충족시킬 수 있다.
제3 양태에 따르면, 본 발명은 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)을 제공하며, 이는 n개의 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하고, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태가 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결되어 형성된 이량체이며, 상기 n개의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 Fc-도메인의 C-말단에 위치한 테일을 통해 다량체로 조립된다.
일부 실시형태에서, 각 폴리펩티드 단량체 단위 중 각 중쇄 Fc 영역의 C-말단에는 하나의 테일이 연결되므로, 각 폴리펩티드 단량체 단위의 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에는 2개의 테일이 연결되고, n개의 폴리펩티드 단량체 단위는 총 2n개의 테일을 가지며, 서로 연결되어 폐쇄 고리 다량체를 구성한다.
상기 테일은 임의의 적합한 아미노산 서열일 수 있고, 자연 발생 항체에서 발견되는 테일일 수 있거나, 선택적으로 길이 및/또는 조성이 천연 테일과 상이한 변형된 테일일 수 있다. 또는, 상기 테일은 적절한 길이의 유연한 시스테인으로 구성된 테일과 같은 다량체화에 적합한 인공 합성 테일이다. 또는, 상기 테일은 IgM 테일 PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO: 15) 또는 IgA 테일 PTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO: 16)와 같은 천연 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있거나, 또는, IgM 또는 IgA 테일의 변이체는 일반적으로 IgM 테일 PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO: 15) 또는 IgA 테일 PTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO: 16) 중 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개 위치 중의 아미노산 서열을 가지며, 테일은 하이브리드 IgM/IgA 테일일 수도 있고, 바람직하게는, 테일은 TGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO: 17)이다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 세포외 도메인, 또는 ACE2의 세포외 도메인의 아미노산 서열로 구성되거나 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 이의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인(19-615aa)을 포함한다. 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인(1-740aa)을 포함한다. 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 Q24, T27, F28, D30, K31, H34, E37, D38, Y41, Q42, L45, M82, Y83, Q325, E329, N330, K353, G354, D355, R357 및 R393을 포함한다. 특히, K31 및 K353을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2 또는 이의 임의의 상동 이종상동체 또는 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 이들의 단편을 포함한다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2를 숙주 결합 수용체로 사용하는 바이러스를 효율적으로 중화할 수 있다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태일 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 374번째 및/또는 378번째 부위에서 H374N 및/또는 H378N 돌연변이가 발생된 인간 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태(ACE2-NN)이다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 효소 활성을 유지하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태일 수 있다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이다. 바람직하게는, 인간 ACE2의 N-말단 53번째, 90번째, 103번째, 322번째, 432번째, 546번째 및/또는 690번째 부위가 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 가용성 ACE2 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2를 숙주 결합 수용체로 사용하는 바이러스를 효율적으로 중화할 수 있다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 항체는 IgG 항체이고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 인간 IgG일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1이다. 상기 항체 Fc 도메인은 항체의 2개의 중쇄 Fc 영역을 포함하는 항체 Fc-도메인이다. 바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 N-말단에 힌지 영역을 갖는다. 바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래되는 CH3 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 상기 Fc 영역은 2개의 ACE2 도메인의 이량체화를 촉진할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 중쇄 Fc 영역은 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한 중쇄 Fc 영역일 수 있다.
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결되거나 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결된다.
바람직하게는, 상기 각 폴리펩티드 단량체 단위 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 각 폴리펩티드 단량체 단위 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 각 폴리펩티드 단량체 단위 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)은 ACE2-hFc5, ACE2-NN-hFc5, 또는 ACE2-NN-hFc5 L309C이고, 여기서,
ACE2-hFc5는 5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 5개의 Fc-도메인의 C-말단의 10개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체를 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
ACE2-NN-hFc5는 5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 5개의 Fc-도메인의 C-말단의 10개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체를 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
ACE2-NN-hFc5-L309C는 5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 5개의 Fc-도메인의 C-말단의 10개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체를 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 중쇄 Fc 영역은 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한다.
일부 실시형태에서, 상기 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)은 ACE2-hFc6, ACE2-NN-hFc6, 또는 ACE2-NN-hFc6 L309C이고, 여기서,
ACE2-hFc6은 6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 6개의 Fc-도메인의 C-말단의 12개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체을 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 단일 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
ACE2-NN-hFc6은 6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 6개의 Fc-도메인의 C-말단의 12개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체을 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 단일 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
ACE2-NN-hFc6 L309C는 6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 6개의 Fc-도메인의 C-말단의 12개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체을 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 다량체 융합 단백질은,
4개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 사량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-hFc4;
4개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc4;
4개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 사량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 중쇄 Fc 영역이 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한 ACE2-NN-hFc4-L309C;
5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-hFc5;
5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc5;
5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 중쇄 Fc 영역이 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한 ACE2-NN-hFc5-L309C;
6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACESARS-CoV22 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 단일 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-hFc6;
6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 단일 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc6; 및
6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc6-L309C로부터 선택되는 하나 이상의 다량체 융합 단백질이다.
상기 다량체 융합 단백질은 바이러스 S 단백질과의 친화력을 크게 강화시킬 수 있고, 동시에 Fc 분자의 작용 기능을 강화시킬 수도 있다.
제4 양태에 따르면, 본 발명은 제1 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n) 유전자를 발현하는 발현 벡터를 제공한다.
제5 양태에 따르면, 본 발명은 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n) 유전자를 발현할 수 있는 포유 동물 세포주를 제공한다. 상기 세포주는 CHO 세포주, 293 세포주 및 Vero 세포주 및 이들에서 유래되는 세포주를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, Vero E6 세포 또는 HEK293T 세포이다.
제6 양태에 따르면, 본 발명은 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은,
제4 양태에 따른 발현 벡터로 포유 동물 세포주를 형질감염시켜 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)을 발현하는 포유 동물 세포 발현주를 구축하는 단계 (1);
배양 조건에서 단계 (1)의 포유 동물 세포 발현주를 배양하여 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)을 생성함으로써 재조합 단백질을 생성하는 단계 (2); 및
단계 (2)에서 발현된 재조합 단백질을 정제하는 단계 (3)을 포함한다.
제7 양태에 따르면, 본 발명은 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n); 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다.
제8 양태에 따르면, 본 발명은 ACE2 관련 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)의 응용을 제공한다.
상기 질환은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환으로부터 선택된다. 상기 바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-COV2와 같은 코로나바이러스일 수 있다. 상기 질환은 폐렴, 중증 급성 호흡기 감염, 신부전, 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 간 손상, 장 질환, 또는 중증 급성 호흡기 증후군일 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)은 응급 상황에서의 투여에 사용될 수 있음으로써, ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염의 발생으로 인한 높은 발병률과 치사율을 방지한다.
본 발명의 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 또는 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)은 또한 의료 종사자 및 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스에 노출될 수 있는 다른 사람들의 수동 면역에 사용될 수 있다.
합포체(syncytia)는 숙주 세포가 바이러스에 감염된 후 세포 간의 융합이 발생하여 최종적으로 형성된 다핵 거대 세포이다. SARS-CoV2 바이러스에 감염된 중증 환자에서는 확산성 폐포 상피 손상이 발생하여 융합된 다핵 세포(합포체)가 형성되는데, 이는 바이러스 S 단백질이 ACE2에 결합함으로써 야기되고 세포 변성 효과의 중요한 원인이다. 동시에 사이토카인 폭풍은 또한 폐포 손상을 일으킬 수 있다. 가용성 ACE2의 다량체 Fc 융합 단백질(ACE2-NN-hFcn)은 바이러스 S 단백질과 ACE2의 결합으로 인한 다핵 세포(합포체)의 융합 및 후속 세포 변성 효과를 효과적으로 방지할 수 있다.
바람직하게는, 상기 약물은 흡입, 비강내 또는 기도 점적, 약물은 흡입, 비강내 또는 기도 점적, 눈, 중이 주사, 귀점액, 국소, 경피, 비경구, 피하, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 흉강내 점적, 복강내 주사, 병변내에 의해 투여되거나, 점막에 적용하거나 서방성 담체를 이식하여 투여되고, 바람직하게는, 상기 약물은 분무화 흡입에 의해 투여될 수 있다. 제9 양태에 따르면, 본 발명은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염 저항성 약물의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은, 제1 양태에 따른 가용성 ACE2, 제2 양태에 따른 ACE2-Fc 융합 단백질, 제3 양태에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n), 제4 양태에 따른 벡터 또는 제5 양태에 따른 포유 동물 세포주를 사용하여 상기 약물을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
제10 양태에 따르면, 본 발명은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염 저항성 약물의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은 Furin 프로테아제를 이용하거나 코로나바이러스의 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위를 약물 스크리닝 표적으로 사용하는 단계를 포함한다.
상기 약물은 Furin 프로테아제 억제제일 수 있다.
상기 약물은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에서 Furin 제한 효소 절단 부위를 갖는 S 단백질을 통한 합포체 형성을 차단한다.
제11 양태에 따르면, 본 발명은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에 사용되는 약물의 제조에서 Furin 프로테아제 또는 코로나바이러스의 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위를 표적으로 하는 시약의 응용을 제공한다.
특히, 본 발명은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에 사용되는 약물의 제조에서 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에서 Furin 제한 효소 절단 부위를 갖는 S 단백질을 통한 합포체 형성을 차단하는 시약의 응용에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 시약은 Furin 프로테아제 억제제이다.
상기 코로나바이러스는 SARS-COV2이다.
제12 양태에 따르면, 본 발명은 돌연변이된 S 단백질을 제공하며, 상기 S 단백질은 말단절단된 형태, 및/또는 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 형태이다.
상기 말단절단된 형태는 S 단백질이 세포외 도메인(S1+S2)만 포함하는 것, 즉 막횡단 및 세포내 영역이 결실된 것이다.
상기 Furin 제한 효소 절단 부위의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 추가에 의해 Furin 제한 효소 절단 부위가 더 이상 Furin 제한 효소 절단 부위로서의 활성을 갖지 않도록 하는 것이다.
바람직하게는, 상기 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 형태는 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위가 RRAR에서 SRAS로 돌연변이된 것이다.
바람직하게는, Furin 제한 효소 절단 부위의 돌연변이를 제외하고, 상기 돌연변이된 S 단백질은 세포외 도메인(S1+S2)만 포함하는데, 즉 막횡단 및 세포내 영역이 결실된다.
상기 돌연변이된 S 단백질은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 SEQ ID NO: 10은 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위가 RRAR에서 SRAS로 돌연변이된 아미노산 서열이다. 상기 SEQ ID NO: 11은 막횡단 및 세포내 영역이 결실된 말단절단된 형태의 S 단백질의 아미노산 서열이다. 상기 SEQ ID NO: 11은 Furin 제한 효소 절단 부위가 RRAR에서 SRAS로 돌연변이되고 막횡단 및 세포내 영역이 결실된 말단절단된 형태의 S 단백질의 아미노산 서열이다.
제13 양태에 따르면, 본 발명은 또한 ACE2 관련 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 제12 양태에 따른 돌연변이된 S 단백질의 응용에 관한 것이다.
상기 질환은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환이고, 바람직하게는, 상기 바이러스는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV, HCoV-NL63, 또는 SARS-CoV2일 수 있다.
상기 질환은 폐렴, 중증 급성 호흡기 감염, 신부전, 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 간 손상, 장 질환, 또는 중증 급성 호흡기 증후군으로부터 선택된다.
상기 약물은 의료 종사자 및 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스에 노출될 수 있는 다른 사람들의 수동 면역에 사용될 수 있다.
제14 양태에 따르면, 본 발명은 SARS-CoV2 감염을 예방하기 위한 재조합 백신을 제공하며, 상기 재조합 백신은 제12 양태에 따른 S 단백질을 포함한다.
SARS-CoV2 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위 및 Furin 프로테아제는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 사용되는 용도로서, 상기 약물은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 신종 코로나바이러스 SARS-CoV2 스파이크 단백질 중의 Furin 프로테아제 절단 부위가 합포체 형성에 필요함을 증명하였고, 구체적으로, SARS-CoV2 스파이크 (S) 단백질은 681-685번째 잔기 부근(S1과 S2 분할 영역에 근접)에 RRAR 모티프를 갖고 있으며, 해당 모티프는 Furin 등 프로테아제에 의해 절단된다. 서열 정렬은 해당 모티프가 알려진 모든 SARS-CoV2 균주의 서열에 존재하지만 SARS-CoV2에 가장 가까운 RaTG13 박쥐 바이러스 균주에는 존재하지 않는다는 것을 보여준다. 데이터베이스에서 박쥐 바이러스 서열을 정렬한 결과 batSARS-HKU5 바이러스에만 근사 서열(RRAT)이 있었다. 야생형 SARS-CoV2의 S 단백질과 Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2의 S 단백질 발현 플라스미드로 형질감염된 293T 세포가 모두 ACE2-IgG1 Fc에 결합할 수 있는 반면, 빈 벡터로 형질감염된 대조군 세포는 ACE2-IgG1 Fc에 결합하지 않음을 발견하였다. 야생형 SARS-CoV2의 S 단백질과 Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2의 S 단백질은 293T 세포 표면에서 정상적으로 발현될 수 있으며, Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 후(즉, RRAR이 SRAS로 돌연변이됨), 돌연변이된 S 단백질은 여전히 ACE2-IgG1 Fc에 더 강력하게 결합할 수 있다.
합포체 형성 실험에서, 빈 벡터 대조군 세포와 인간 전장 ACE2(인간 천연 ACE2) 발현 세포 사이에 세포 융합이 일어나지 않았으며, 다핵 합포체 형성이 관찰되지 않았지만, 야생형 SARS-CoV2 S 단백질 발현 세포군에서, 인간 전장 ACE2 발현 세포와 3시간 동안 공동 배양한 후, 대량의 다핵 합포체 형성이 관찰되었고, 24시간 동안 지속적으로 배양한 후, 형성된 합포체가 사멸되었다. 그러나, SARS-CoV2 S 단백질 중의 Furin 부위 RRAR이 SRAS로 돌연변이된 후, 세포 융합의 발생을 완전히 억제하였고, 다핵 합포체 생성이 관찰되지 않았으므로, S 단백질이 세포 융합을 매개하는 능력을 상실했음을 나타내며, S 단백질 중의 Furin 부위가 신종 코로나바이러스 SARS-CoV2가 세포를 감염시키는데 매우 중요하다는 것을 설명한다.
따라서, S 단백질의 Furin 부위(PRRAR) 및 Furin 프로테아제를 표적으로 하는 약물은 신종 코로나바이러스 감염을 억제하는 능력이 있으며; 또한, 신종 코로나바이러스가 세포에 들어가는 과정에서의 융합 단계를 억제함으로써 SARS-CoV2 치료용 항바이러스제를 개발할 수 있다.
또한, SARS-CoV2 S 단백질 중의 Furin 부위 RRAR이 SRAS로 돌연변이된 후, 세포 융합의 발생을 완전히 억제하였고, 다핵 합포체 생성이 관찰되지 않았으므로, S 단백질이 세포 융합을 매개하는 능력을 상실했음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2의 S 단백질, 특히 막횡단 및 세포내 영역이 결실된 Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2의 S 단백질은 재조합 단백질 약물로 사용되어 바이러스의 야생형 S가 세포 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단할 수 있음으로써, 감염을 차단한다. 또한, 상기 Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2의 S 단백질은 야생형 S 단백질보다 더 안정적인 재조합 백신의 후보 분자로 사용될 수 있다.
신종 코로나바이러스 SARS-CoV2는 β속 신종 코로나바이러스에 속하는 것으로, 외피가 있고, 입자는 원형 또는 타원형이며 다형성이고, 직경은 60-140nm이며, 표면의 외피 스파이크 당단백질(Spike glycoprotein) (S 단백질)은 코로나바이러스의 주요 항원 단백질로 바이러스의 감염과 전파에 매우 중요한 역할을 하고, S 단백질에는 두 개의 소단위가 있는데, S1 소단위는 세포 표면 수용체에 결합하고 S2 소단위는 막융합 과정에 필요한 기본 요소를 포함한다.
신종 코로나바이러스 SARS-CoV2의 외피 스파이크 (S) 단백질의 아미노산 서열은 SARS-CoV의 S 단백질과 약 76%의 상동성을 가지며 상동성이 높지 않아 대부분의 SARS-CoV 바이러스의 중화 항체는 SARS-CoV2 바이러스 감염을 중화할 수 없다. 그러나, SARS-CoV2와 SARS-CoV는 동일한 숙주 세포 수용체 단백질인 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 공유하므로, SARS-CoV와 마찬가지로 SARS-CoV2 바이러스 감염도 ACE2를 표적 세포 침입 수용체로 사용해야 한다. 즉, SARS-CoV2의 S 단백질의 아미노산 서열과 SARS-CoV의 S 단백질의 아미노산 서열은 몇 가지 아미노산 차이가 있지만, 이들은 여전히 동일한 ACE2 수용체 단백질을 이용하여 숙주 세포에 들어갈 수 있는데, 이는 ACE2 단백질 표면이 이러한 형태의 코로나바이러스의 S 단백질과 구조적으로 높은 상용성을 갖고 있어, 서열 차이가 큰 바이러스 스파이크 단백질이 쉽게 이용하는 숙주 단백질 분자이기 때문에 ACE2가 여전히 그러한 바이러스가 미래에 인간을 감염시키는 진입점이 될 수 있음을 설명한다. 본 발명에서 가용성 ACE2 및 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2(NN)는 ACE2를 숙주 수용체로 사용하여 바이러스와 ACE2 수용체의 결합 및 바이러스 침입을 차단할 수 있으므로, 이번 전염병 발생 상황의 예방과 통제, 그리고 미래에 재차 발생할 수 있는 발병에 대해 매우 중요한 의미가 있다.
또한, 신종 코로나바이러스 SARS-CoV2 바이러스가 사람들에서 유행함에 따라 인간 숙주 및 인간 면역 등에 대한 추가 적응의 선택 압력 하에서 변이 균주가 생성되는 것이 매우 중요하다. 이러한 변이 균주는 바이러스의 독성 및 항원 부위에 변화를 일으킬 수 있다. 유사한 변경이 SARS-CoV에서 여러 번 관찰 및 기록되었다. 최신 신종 코로나바이러스 SARS-CoV2 바이러스 시퀀싱 데이터는 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)의 서열이 여전히 변이 과정에 있음을 보여준다. 본 발명에서 얻은 가용성 ACE2 및 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2(NN)의 장점은 바이러스가 ACE2를 침입 수용체로 사용하기만 하면 바이러스의 단백질, 특히 S 단백질이 어떻게 돌연변이되더라도 SARS-CoV2 바이러스를 강력하게 중화할 수 있다는 것이다. 아직 진화하고 있는 바이러스의 예방 및 치료를 위해 S 단백질의 단클론 중화 항체와 달리 치료제로서 본 발명의 가용성 ACE2 수용체는 천연의 넓은 스펙트럼 중화 능력을 가지고 있어 바이러스 변이에 의해 제한되지 않으며 항체 스크리닝 작업을 수행할 필요가 없으므로 현재와 미래의 전염병 예방의 긴급한 요구에 매우 적합하다. 실험 결과, 본 발명의 오량체 ACE2-NN-hFc5는 현재 나타난 주요 돌연변이 균주의 슈도바이러스 감염에 대해 모두 강력한 중화 활성을 가짐을 보여준다.
또한, 수용체가 인체 자체의 단백질이기 때문에 항체 약물과 달리 조직 교차 반응 연구를 할 필요가 없고; 급성 전염성 질환에 대한 응급 약물이며 수용체 융합 단백질의 반감기가 길기 때문에, 일반적으로 1-2회 투여하여 치료하므로 항약물 항체 연구, 장기 독성 연구도 면제될 수 있으며, 개발 주기를 가속화할 수 있다.
본 발명의 ACE2-Fc 융합 단백질, 및 가용성 ACE2의 다량체 Fc 융합 단백질(ACE2-NN-hFcn)은 새로운 전염병 발생 상황 발생 시 선택될 수 있는 가장 빠르고 가장 특이적인 치료 약물이며, 그 장점은 다음과 같은 몇 가지 측면에서 나타난다.
(1) 중화 항체로 사용되어 바이러스 탈출을 방지한다.
(2) SARS-CoV2 및 SARS-CoV 바이러스 합포체의 형성을 억제할 수 있다.
(3) Fc 도메인의 이펙터 기능이 보존되기 때문에 관련 수용체를 통해 바이러스 입자 또는 감염된 세포에 대항하는 보체, 수지상 세포, 대식세포 및 자연 살해 세포를 모집할 수 있다.
(4) 가용성 ACE2 분자의 순환 반감기를 연장한다.
(5) 이전에 재조합 인간 ACE2(rhACE2)에 대한 임상 2상 시험이 있어 우수한 내약성과 안전성을 보였으나 대상자의 임상 증상이 크게 개선되지 않아 본 발명의 ACE2-Fc, ACE2(NN)-Fc 또는 ACE2-NN-hFcn은 현재 응급 상황에서 동정적 투여 후 정식 임상 시험에 적합할 수 있음을 보여준다.
(6) 본 발명의 ACE2-Fc를 이용하여 ACE2(NN)-Fc 또는 ACE2-NN-hFcn은 감염된 환자를 돕기 위해 백신이 출시되기 몇 달 또는 몇 년 전에 널리 사용될 수 있다.
(7) 본 발명에서 얻은 가용성 ACE2를 이용하여 바이러스 감염을 차단하는 것은 ACE2의 천연 효소 활성에 의존하지 않고 환자 체내의 천연 ACE2 활성에 영향을 미치지 않으므로, 활성 중심 돌연변이된 가용성 ACE2(NN)는 ACE2 효소 활성으로 인한 생체 내 잠재적인 부작용을 방지하여 인체 사용에서 안전성을 극대화한다.
(8) 항-S 단백질 항체와 비교하여 가용성 ACE2의 또 다른 이점은 바이러스가 ACE2를 침입 항체로 사용하는 한 바이러스 돌연변이는 바이러스 돌연변이로 인한 수용체에 대한 향상된 친화력을 포함하여 가용성 ACE2의 효과에 영향을 미치지 않는다는 것이다.
ACE2는 메탈로프로테이나제로, 안지오텐신 I에서 안지오텐신 노나펩티드(1-9)로, 또는 안지오텐신 II에서 안지오텐신 헵타펩티드(1-7)로 분해하는 것을 촉매화하는 역할을 하며, 심혈관 기능의 조절에 관여하고 급성 폐 손상에 보호 작용이 있을 수 있는 것으로 인정되는데, 예를 들어 혈관 확장, 항증식 및 항산화 스트레스 등 역할을 하는 것으로 인정된다. ACE2는 혈관계와 대부분의 기관에서 발현되지만 주로 폐, 심장, 간, 신장 및 고환에서 발현된다. 따라서, ACE2의 효소 활성을 억제하는 후보 약물은 이상적인 약물이 아니다.
인간 천연 ACE2(막형 ACE2라고 함)는 805개의 아미노산의 전체 길이를 가지며, 그 중 1-740번째 아미노산은 세포외 영역이고 나머지 65개의 아미노산은 짧은 막횡단 영역 및 세포내 영역이다. ACE2의 효소 활성은 모두 세포외 영역에 의해 수행된다. 본 발명의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 막횡단 도메인을 갖지 않는다.
도 1은 정제 후 얻은 ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질, ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질 및 ACE2-hFc5 융합 단백질 및 ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질의 SEC-HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질이 합포체 형성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
도 3은 ACE2-hFc5 융합 단백질이 시험관 내에서 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 매개 세포간 막융합을 유의하게 억제함을 나타낸다.
도 4는 신종 코로나바이러스 SARS-CoV2의 스파이크 단백질(S 단백질)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9) 및 Furin 부위를 나타낸다.
도 5는 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질아미노산 서열(SEQ ID NO: 10)을 나타낸다.
도 6은 SARS-CoV2 S 단백질의 세포 표면 발현과 Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질의 세포 표면 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 빈 벡터 대조군 세포(빨간색 표시)와 인간 ACE2 발현 세포(녹색 표시) 사이에 세포 융합이 일어나지 않았으며, 다핵 합포체 형성이 관찰되지 않았지만, 야생형 신종 코로나바이러스 S 단백질 발현 세포(빨간색 표시)군에서, ACE2 발현 세포(녹색 표시)와 3시간 동안 공동 배양한 후, 대량의 다핵 합포체 형성이 관찰되었고, 계속 24시간 동안 배양한 후, 형성된 합포체가 사멸되었으며; furin 부위가 돌연변이된 S 단백질과 ACE2 발현 세포가 혼합된 후 합포체를 생성하지 않았음을 나타낸다.
도 8은 SARS-CoV2 S 단백질 야생형 Ectdomain(1-1208 aa)(SEQ ID NO: 11), 및 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질의 Ectdomain(1-1208 aa)(SEQ ID NO: 12)을 나타낸다.
도 9는 ACE2-hFc 및 ACE2-hFc5 융합 단백질과 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 RBD의 친화력 및 결합력을 나타낸다.
도 10은 상이한 형태의 ACE2 융합 단백질 다량체가 신종 코로나바이러스 슈도바이러스(D614)의 감염을 억제함을 나타낸다.
도 11은 ACE2-hFc5 융합 단백질이 신종 코로나바이러스 D614, G614, SARS 바이러스, 천산갑 코로나바이러스 슈도바이러스의 감염을 억제함을 나타낸다.
도 12는 ACE2-hFc5 융합 단백질이 신종 코로나바이러스 라이브 바이러스의 감염을 억제함을 나타낸다.
도 13은 SEC-HPLC 분석에 따른 ACE2-hFc5 분무화 전후의 물리화학적 성질을 나타낸다.
도 14는 신종 코로나바이러스 슈도바이러스 감염에 대한 분무화 전후의 ACE2-hFc5 분자의 시험관 내 중화 활성의 평가 결과를 나타낸다.
도 15는 햄스터 폐에서 신종 코로나바이러스 gRNA 및 sgRNA 함량에 대한 RT-qPCR 정량 분석을 나타낸다.
도 16은 상이한 형태의 ACE2-IgG1 융합 단백질 분자 구조 모식도를 나타낸다.
도 2는 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질이 합포체 형성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
도 3은 ACE2-hFc5 융합 단백질이 시험관 내에서 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 매개 세포간 막융합을 유의하게 억제함을 나타낸다.
도 4는 신종 코로나바이러스 SARS-CoV2의 스파이크 단백질(S 단백질)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9) 및 Furin 부위를 나타낸다.
도 5는 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질아미노산 서열(SEQ ID NO: 10)을 나타낸다.
도 6은 SARS-CoV2 S 단백질의 세포 표면 발현과 Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질의 세포 표면 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 빈 벡터 대조군 세포(빨간색 표시)와 인간 ACE2 발현 세포(녹색 표시) 사이에 세포 융합이 일어나지 않았으며, 다핵 합포체 형성이 관찰되지 않았지만, 야생형 신종 코로나바이러스 S 단백질 발현 세포(빨간색 표시)군에서, ACE2 발현 세포(녹색 표시)와 3시간 동안 공동 배양한 후, 대량의 다핵 합포체 형성이 관찰되었고, 계속 24시간 동안 배양한 후, 형성된 합포체가 사멸되었으며; furin 부위가 돌연변이된 S 단백질과 ACE2 발현 세포가 혼합된 후 합포체를 생성하지 않았음을 나타낸다.
도 8은 SARS-CoV2 S 단백질 야생형 Ectdomain(1-1208 aa)(SEQ ID NO: 11), 및 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질의 Ectdomain(1-1208 aa)(SEQ ID NO: 12)을 나타낸다.
도 9는 ACE2-hFc 및 ACE2-hFc5 융합 단백질과 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 RBD의 친화력 및 결합력을 나타낸다.
도 10은 상이한 형태의 ACE2 융합 단백질 다량체가 신종 코로나바이러스 슈도바이러스(D614)의 감염을 억제함을 나타낸다.
도 11은 ACE2-hFc5 융합 단백질이 신종 코로나바이러스 D614, G614, SARS 바이러스, 천산갑 코로나바이러스 슈도바이러스의 감염을 억제함을 나타낸다.
도 12는 ACE2-hFc5 융합 단백질이 신종 코로나바이러스 라이브 바이러스의 감염을 억제함을 나타낸다.
도 13은 SEC-HPLC 분석에 따른 ACE2-hFc5 분무화 전후의 물리화학적 성질을 나타낸다.
도 14는 신종 코로나바이러스 슈도바이러스 감염에 대한 분무화 전후의 ACE2-hFc5 분자의 시험관 내 중화 활성의 평가 결과를 나타낸다.
도 15는 햄스터 폐에서 신종 코로나바이러스 gRNA 및 sgRNA 함량에 대한 RT-qPCR 정량 분석을 나타낸다.
도 16은 상이한 형태의 ACE2-IgG1 융합 단백질 분자 구조 모식도를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 사상 및 본질을 벗어나지 않고 본 발명의 방법, 단계 또는 조건에 대한 수정 또는 대체는 모두 본 발명의 범위에 속한다.
달리 명시되지 않는 한, 실시예에서 사용된 화학 시약은 모두 통상적으로 시판되는 시약이며, 실시예에서 사용된 기술적 수단은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 수단이다. 실시예 및 도면의 모든 Fc는 IgG1에서 유래된다. 실시예 및 도면의 모든 ACE2-hFc는 모두 ACE2-NN-hFc(여기서, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 가짐)이고, 달리 명시되지 않는 한, 상이한 형태의 ACE2-hFc는 모든 ACE2-hFc 및 ACE2-hFc 다량체 및 돌연변이체를 의미하며; 실시예 및 도면의 모든 ACE2-hFc-ACE2는 모두 사량체 ACE2(NN)-hFc-ACE2(NN)(여기서, 단일 ACE2 말단절단된 형태는 단일 중쇄 Fc 영역에 연결된 다음 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단일 ACE2(ACE2-Fc-ACE2)에 연결됨)이고; 실시예 및 도면의 모든 ACE2-ACE2-hFc는 모두 사량체 ACE2(NN)-ACE2(NN)-hFc(여기서, 직렬로 연결된 2개의 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단일 중쇄 Fc 영역(ACE2-ACE2-Fc)에 연결됨)이며; 모든 ACE2-hFc5는 모두 ACE2(NN)-hFc(5)이고, 이는 5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 5개의 Fc-도메인의 C-말단의 10개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체를 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 실시예 및 도면의 모든 ACE2-hFc5-L309C는 모두 ACE2(NN)-hFc(5)-L309C이고, 이는 5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 5개의 Fc-도메인의 C-말단의 10개의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체를 의미하며, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 중쇄 Fc 영역이 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한다. 도 16을 참조한다.
실시예 1: ACE2-hFc 융합 단백질 발현 플라스미드, SARS-CoV2 S 단백질 발현 플라스미드 및 Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2의 S 단백질 발현 플라스미드의 구축
표 1에 나타낸 프라이머를 이용하여 Overlap PCR을 통해, CD33 신호 펩티드, ACE2 메탈로프로테이나제 도메인 세포외 도메인(H374N 및 H378N 효소 불활성화 부위를 포함) 및 hIgG1 Fc를 코딩하는 DNA 서열을 얻었다. 구체적인 클로닝 단계는 다음과 같은 바, ACE2-hFc 발현 플라스미드를 구축할 경우, pcDNA3.0-ACE2-NEMGE를 주형으로 사용하고, 프라이머 2-FrontIn 및 4-MidR을 이용하여 PCR을 통해, ACE2 세포외 도메인(19-615aa)을 코딩하고 효소 불활성화 부위 H374N 및 H378N을 포함하는 DNA 단편을 얻으며; pCHOGS-HH009를 주형으로 사용하고, 프라이머 3-MidF 및 5-IgG1Cterm을 이용하여 PCR을 통해, hIgG1 Fc를 코딩하는 영역을 얻으며; 다음, 상기 PCR을 통해 얻은 생성물을 주형으로 사용하고, 프라이머 6-FrontOutXhoI 및 5-IgG1Cterm을 이용하여 Overlap PCR을 통해, CD33 신호 펩티드-ACE2 세포외 도메인-hFc를 코딩하는 전장 DNA를 얻으며; 그 다음, XhoI 및 PacI 제한 효소 절단 부위를 통해 pCHOGS 발현 벡터를 클로닝하여 pCHOGS-ACE2-NN-hIgG1 발현 플라스미드를 얻었다.
프라이머 ID | 서열(5'-3') |
6-FrontOutXhoI | aagCTCGAGgccaccATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGC |
2-FrontIn | CTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTCGCTaccattgaggaacaggccaag |
3-MidF | gactggagtccatatgcagacgagcccaaatcttCtgacaaaactcacacatgcc |
4-MidR | ggcatgtgtgagttttgtcaGaagatttgggctcgtctgcatatggactccagtc |
5-IgG1Cterm | cccTTAATTAAtcatttacccg |
7-Oligomer (pentamer)In | CATCACCAGAGACACGTTGTAGAGGGTGGGCTTGCCGGTagacagggagaggctcttc |
8-Oligomer (pentamer)Out | cccTTAATTAAtcaGTAGCATGTGCCGGCGGTGTCGCTCATCACCAGAGACACGTTGTA |
신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 발현 플라스미드 pCAGGS-SARS-CoV2 S-C9를 구축할 경우, pCMV3-2019-nCoV-Spike(S1+S2)-long(Sino Biological, Cat#: VG40589-UT)를 주형으로 사용하고, SB-S-NheI: CGTGCTAGCcGTGAACCT GACCACCAGGACCCAA 및 SB-S-C9-XhoI: CGCCTCGAGCTAG GCGGGCGCCACCTGGCTGGTCTCGGTGGTGTAGTGCAGTTTCACTCC를 프라이머로 사용하여 PCR을 통해, SARS-CoV2 스파이크 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 얻은 다음, NheI 및 XhoI 제한 효소 절단 부위로 pCAGGS 벡터를 클로닝하여 SARS-CoV2 S 단백질 발현 플라스미드를 얻되, 여기서 N-말단 신호 펩티드는 CD4 신호 펩티드이고, C-말단은 C9 태그였다.
이 플라스미드를 기반으로 SB-S-NheI, SB-S-C9-XhoI 및 SB-Drs-f: CAGCCCAagcAGGGCAagcTCTGTGGCAAGCCAG 및 SB-Drs-r: CTGGCTTGCCACAGAgctTGCCCTgctTGGGCTG 프라이머를 사용하여, Overlap PCR을 통해 S 단백질 중의 Furin 프로테아제 절단 부위 PRRAR을 PSRAS로 돌연변이시킴으로써, Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질 발현 플라스미드를 얻었다.
실시예 2: ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질, ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질 및 ACE2-hFc5 융합 단백질 및 ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질 발현 플라스미드의 구축
ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질, ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질, ACE2-hFc5 융합 단백질, 및 ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질 발현 플라스미드의 구축은 ACE2-hFc 융합 단백질 발현 플라스미드의 구축과 유사하므로, 실시예 1의 방법을 이용하여 구축하였다.
실시예 3: ACE2-hFc 융합 단백질 및 ACE2-hFc5 융합 단백질의 발현, 정제 및 SEC-HPLC 분석
실시예 1에서 구축된 ACE2-hFc 융합 단백질을 발현하는 발현 플라스미드, 및 실시예 2에서 구축된 ACE2-hFc5 융합 단백질을 발현하는 발현 플라스미드를 각각 PEI를 통해 293F 세포에 형질감염시키고, 형질감염 5일 후 배양 상층액을 수집하며, 각각 Protein A 칼럼에 의한 단일 단계 정제를 수행하여 정제된 ACE2-hFc 융합 단백질 및 ACE2-hFc5 융합 단백질을 각각 얻었다. Nano drop2000 단백질 정량을 거친 후, SEC-HPLC 순도 분석을 수행하였다(도 1A 및 도 1C를 참조). 도 1A로부터 알 수 있는 바, 얻은 ACE2-hFc 융합 단백질의 순도 분석에서는 하나의 피크만 나타났고, 메인 피크는 99.34%였다. 도 1C로부터 알 수 있는 바, 얻은 ACE2-hFc5 융합 단백질의 순도 분석에서는 하나의 피크만 나타났고, 메인 피크는 66.94%였다.
실시예 4: ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질, ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질 및 ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질의 발현, 정제 및 SEC-HPLC 분석
실시예 2에서 구축된 ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질, ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질 및 ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질을 발현하는 발현 플라스미드를 각각 PEI를 통해 293F 세포에 형질감염시키고, 형질감염 5일 후 배양 상층액을 수집하며, Protein A 및 분자체에 의한 두 단계 정제를 수행하여 정제된 ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질, ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질 및 ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질을 각각 얻었다. Nano drop2000 단백질 정량을 거친 후, 각각 SEC-HPLC 순도 분석을 수행하였다(도 1B, 도 1D 및 도 1E를 참조). 도 1B로부터 알 수 있는 바, ACE2-ACE2-hFc 융합 단백질의 메인 피크는 98.96%였고, 도 1D로부터 알 수 있는 바, ACE2-hFc-ACE2 융합 단백질의 메인 피크는 97.99%였으며, 도 1E로부터 알 수 있는 바, ACE2-hFc5-L309C 융합 단백질의 메인 피크는 97.99%였다.
실시예 5: ACE2-hFc5 융합 단백질의 발현, 정제 및 SEC-HPLC 분석
실시예 2에서 구축된 ACE2-hFc5 융합 단백질을 발현하는 발현 플라스미드를 PEI를 통해 293F 세포에 형질감염시키고, 형질감염 5일 후 배양 상층액을 수집하며, 다단계 정제를 수행하여 정제된 ACE2-hFc5 융합 단백질을 얻었다. Nano drop2000 단백질 정량을 거친 후, SEC-HPLC 순도 분석을 수행하였다(도 1F를 참조). 도 1F로부터 알 수 있는 바, ACE2-hFc5 융합 단백질의 메인 피크는 99.2%였다.
실시예 6: 시험관 내 세포간 막융합 억제 실험
6.1 방법
ACE2 융합 단백질이 신종 코로나바이러스(SARS-CoV2) 합포체 형성을 억제하는 실험에서, pCAGGS 빈 벡터, 및 SARS-CoV2 스파이크 단백질 및 SARS 스파이크 단백질을 발현하는 플라스미드를 각각 PEI를 사용하여 pEGFP-N1과 함께 293T 세포에 공동 형질감염시키고; hACE2-C9(실험실에 보관됨)를 발현하는 플라스미드 및 pmCherry-C1을 PEI를 사용하여 293T 세포에 공동 형질감염시키며, 형질감염 24시간 후 세포를 소화시키고, DMEM 완전 배지(10% FBS, 1×PS)로 세포를 1회 세척하고 계수하며, 다음, 각각 10μg/ml의 대조군 단백질 및 ACE2-hFc5 융합 단백질과 2.5E5/웰 빈 벡터 대조군 세포, SARS-CoV2-S 및 SARS-S 형질감염된 세포를 37℃에서 30분 동안 공동 배양하고, 그 다음, hACE2-C9형질감염된 세포를 2.5E5/웰로 첨가하며, 37℃, 5% CO2에서 세포를 3시간 동안 공동 배양한 후, 형광현미경으로 ACE2-hFc5 융합 단백질이 신종 코로나바이러스(SARS-CoV2) 합포체 형성을 억제하는 상황을 관찰하고, 실험 결과를 촬영하여 기록하였다.
6.2 도 2로부터 알 수 있는 바, SARS-CoV2 바이러스군 및 SARS 바이러스군 모두에서 대량의 합포체 형성을 보였고, SARS-CoV2 바이러스군에서 합포체의 수가 가장 많았지만, 빈 벡터 대조군에서는 세포 융합 현상이 보이지 않았는데, 이러한 결과는 SARS-CoV2 바이러스 스파이크 단백질이 SARS 바이러스 스파이크 단백질과 유사하게 세포 융합을 유도하여 합포체를 형성하는 능력이 있으며, 유도 능력이 SARS 바이러스 스파이크 단백질보다 더 강함을 보여준다(도 3의 상단 도면). 이는 또한 SARS-CoV2 바이러스 스파이크 단백질이 수용체 hACE2와의 친화력이 SARS 바이러스 스파이크 단백질보다 더 강함을 간접적으로 증명하였다. 실험에서 ACE2-hFc5 융합 단백질을 첨가한 후, 대조군 단백질에 비해 ACE2-hFc5 융합 단백질이 SARS-CoV2 바이러스 스파이크 단백질에 의해 유도되는 합포체 생성을 유의하게 억제할 수 있고, 억제율이 90% 이상에 도달하며, 또한 SARS 바이러스에 의한 합포체 생성을 완전히 억제할 수 있음을 관찰하였다.
또한, 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 발현 세포 및 수용체 ACE2 발현 세포를 공동 배양할 경우, 대량의 합포체 형성을 관찰하였는 바(도 3의 하단 도면), 이는 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질이 수용체 ACE2에 결합한 후 막융합을 유도할 수 있는 과정에서 20시간 때 다핵 합포체가 더 뚜렷하게 나타났음을 설명한다. 실험계에 10μg/ml의 ACE2-hFc5를 첨가하여 처리한 후, 합포체의 수를 유의하게 감소시킬 수 있고, 억제율은 90% 이상에 도달하였다. 그러나 동일한 조건에서, ACE2-hFc 억제 효과는 명확하지 않았다. 또한, ACE2-hFc5 분자는 용량 의존적으로 합포체 형성을 억제하고, 0.3μg/ml의 낮은 농도에서도 ACE2-hFc5는 합포체 형성을 억제하는 활성이 여전히 유의한 것을 관찰하였다.
코로나바이러스를 비롯한 외피 바이러스의 바이러스 막과 세포(내)막의 융합은 감염의 핵심 단계이고, 합포체 형성은 SARS-CoV2 바이러스가 인체를 감염시킨 후 폐에서 발생하는 뚜렷한 병리학적 변화이다. 실험 결과는 ACE2-hFc5 융합 단백질이 매우 강한 합포체 형성 억제 활성을 갖고, 코로나바이러스, 특히 SARS-CoV2의 감염을 차단할 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 야생형 SARS-CoV2 S 단백질 및 Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질 세포 표면 발현 분석 및 합포체 형성 실험
pCAGGS 빈 벡터, 및 SARS-CoV2 S 단백질 및 Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질(PRRAR에서 PSRAS로 돌연변이됨)을 발현하는 플라스미드와 pmCherry-C1을 PEI를 사용하여 293T 세포에 각각 공동 형질감염시키고; 전장 ACE2(세포외 영역, 막횡단 영역 및 세포내 영역을 포함)를 발현하는 플라스미드와 pEGFP-N1을 PEI를 사용하여 293T 세포에 공동 형질감염시키며; 형질감염 24시간 후 세포를 소화시키고, DMEM 완전 배지(10% FBS, 1ХPS)로 세포를 1회 세척하고 계수하며, 다음, 일부분의 빈 벡터 대조군 세포, 및 SARS-CoV2 S 단백질(SEQ ID NO: 9)(도 4를 참조) 및 Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질(SEQ ID NO: 10)(도 5를 참조)을 발현하는 세포를 취하여 SARS-CoV2의 S 단백질 세포 표면 발현 검출에 사용하고, 나머지 부분의 세포를 합포체 형성 실험에 사용하였다.
SARS-CoV2의 S 단백질 세포 표면 발현 검출을 진행할 경우, 20μg/ml의 ACE2-NN-Fc 융합 단백질을 취하여 각각 상기 세포와 함께 얼음 위에서 45분 동안 배양하고, 다음, FACS buffer(PBS, 0.5% BSA)를 사용하여 세포를 3회 세척하며, 그 다음, 1:300으로 희석한 FITC-항-인간-Fc-2차 항체(F9512, Sigma)를 첨가하여 얼음 위에서 30분 동안 배양하고, FACS buffer(PBS, 0.5% BSA)를 사용하여 세포를 3회 세척한 후, 유세포 분석기로 SARS-CoV2 S 단백질의 표면 발현을 분석하고, Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질의 발현 결과를 FlowJo V10 소프트웨어로 분석하였으며, 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
합포체 형성 실험에서, 빈 벡터 대조군 세포, SARS-CoV2 S 플라스미드 및 Furin 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 플라스미드 형질감염된 세포를 각각 2.5E5/웰로 48웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 30분 후, 세포가 함유된 상기 웰에 ACE2 형질감염된 세포를 2.5E5/웰로 첨가하며, 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 계속하여 3시간 동안 공동 배양한 후, 형광현미경으로 바이러스 합포체 형성 상황을 관찰하고, 실험 결과를 촬영하여 기록하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 빈 벡터 대조군 세포(빨간색 표시)와 인간 전장 ACE2 발현 세포(녹색 표시) 사이에 세포 융합이 일어나지 않았으며, 다핵 합포체 형성이 관찰되지 않았지만, 야생형 신종 코로나바이러스 S 단백질 발현 세포(빨간색 표시)군에서, 인간 전장 ACE2 발현 세포(녹색 표시)와 3시간 동안 공동 배양한 후, 대량의 다핵 합포체 형성이 관찰되었다. SARS-CoV2 S 단백질 중의 Furin 제한 효소 절단 부위 RRAR이 SRAS로 돌연변이된 후, 세포 융합의 발생을 완전히 억제하였고, 다핵 합포체 생성이 관찰되지 않았으므로, S 단백질이 세포 융합을 매개하는 능력을 상실했음을 나타낸다. 따라서, SARS-CoV2 S 단백질 중의 Furin 부위는 신종 코로나바이러스 S 단백질이 매개하는 세포 융합에 필요함을 알 수 있다.
또한, Furin 프로테아제 절단 부위가 돌연변이된 SARS-CoV2 S 단백질은 바이러스 세포 융합 및 다핵 합포체 형성을 억제하는 현저한 효과가 있다(도 7의 가장 우측 도면).
실시예 8: 상이한 형태의 ACE2-hFc 융합 단백질의 친화력, 결합력 분석
8.1 방법
표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR) 기술 및 생물층 간섭계(Bio-Layer Interferometry, BLI) 기술을 적용하여 각각 ACE2-NN-hFc 및 ACE2-NN-hFc5 융합 단백질과 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질(SARS-CoV-2 S) 수용체 결합 영역 RBD(aa331-527)의 친화력(Affinity, BIAcore T200 기기) 및 결합력(Avidity, Fortebio Octet RED384 기기)을 검출하였다.
친화력 측정 시, 먼저 ACE2-hFc 및 ACE2-hFc5 융합 단백질을 항-인간 Fc 항체가 코팅된 CM5 바이오센서 칩 표면에 포획한 다음, SARS-CoV-2 RBD 단백질(C-말단에 His6-Avi 태그가 있음)(200nM에서 6.25nM 사이의 2배 연속 희석 샘플)을 30μl/min의 속도로 칩을 통과시켜 단백질의 분자간 결합 및 해리 동역학을 검출하였다. 1:1 Langmuir 결합 모델(BIA Evaluation 소프트웨어)을 사용하여 결합 상수(Ka), 해리 상수(Kd) 및 해리 평형 상수(KD)를 계산하였다. 결합력(avidity) 측정의 경우, 먼저 C-말단 His6-Avi 태그를 갖는 20μg/ml의 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 스트렙타비딘 바이오센서 표면에 포획한 다음, 상이한 농도의 ACE2-hFc(0nM, 1.65-105.3nM 사이에서 2배 연속 희석) 및 ACE2-hFc5 융합 단백질(0nM, 8.22-526.3nM 사이에서 2배 연속 희석)을 분석물로 사용하고, RBD가 결합된 센서 표면에 180초 동안 결합한 후, 300초 동안 해리를 수행하였다. 1:1 결합 모델(Fortebio data Analysis 11.1-knetics 소프트웨어)을 사용하여 결합 상수 Ka, Kd 및 KD를 계산하였다.
8.2 결과
1가 결합의 친화력을 측정하는 방법(BIAcore T200)(도 9를 참조)을 사용하여 ACE2-hFc 및 ACE2-hFc5 융합 단백질이 SARS-CoV-2 RBD에 대해 동일한 결합 친화력을 가지며, 각각 26.4nM 및 29.1nM인 것을 발견하였다. Fortebio를 이용하여 ACE2-NN-hFc 및 ACE2-NN-hFc5 융합 단백질과 스파이크 단백질 RBD의 결합력을 분석하였다. 실험에서 20μg/ml RBD-His-avi 단백질을 스트렙타비딘 바이오센서 표면에 포획하고, 상이한 농도의 ACE2-NN-hFc 및 ACE2-NN-hFc5 융합 단백질을 이동상으로 사용하며, 실험 결과의 데이터는 Octet DataAnalysis11.0 소프트웨어를 이용하여 분석하였고, 여기서 0nM은 배경값으로서 차감되었다. 결과(도 9)는 다량체화에 의해 변형된 ACE2-hFc5 융합 단백질은 ACE2-hFc 융합 단백질에 비해 스파이크 단백질 RBD-His-avi와의 결합력을 유의하게 증가시켰고, KD값(<1.0E-12M)은 기기의 검출 범위를 초과하였음을 보여준다.
실시예 9: 시험관 내 신종 코로나바이러스 슈도바이러스 중화 실험
9.1 방법
9.1.1 신종 코로나바이러스 슈도바이러스의 패키징
신종 코로나바이러스 바이러스 균주(D614) 슈도바이러스를 패키징할 경우, HEK293T 세포를 10cm 세포 배양 접시에 접종하고, 세포 밀도가 80%에 도달했을 때 Lipofactamine 3000을 사용하여 신종 코로나바이러스 전장 스파이크 단백질 발현 플라스미드 pSARS-CoV2 S-C9(D614), 패키징 플라스미드 psPAX2 및 플루오레세인 발현 플라스미드 pHIV-Luc를 공동 형질감염시키고, 1:3:4의 비율에 따라 세포에 형질감염시키며, 세포 형질감염 6시간 후, 배지를 버리고, 2% FBS 및 페니실린을 포함하는 새로운 DMEM 배지를 첨가하여 계속하여 48시간 동안 배양하며, 슈도바이러스 입자를 포함하는 배양 상층액을 수집하고, 원심분리하며, 여과하여 세포 조각을 제거한 다음 -80℃의 냉장고에 냉동 저장하여 비축하였다. 다른 신종 코로나바이러스 돌연변이 균주 및 SARS, 천산갑 코로나바이러스를 패키징할 경우, 돌연변이 균주의 스파이크 단백질을 발현하는 플라스미드로 pSARS-CoV2 S-C9(D614)를 대체하는 것을 제외하고 다른 제조 조건은 동일하다. 본 발명에서 사용된 신종 코로나바이러스 슈도바이러스는 신종 코로나바이러스 초기 바이러스 균주(D614); Furin 부위 돌연변이 신종 코로나바이러스 초기 바이러스 균주(D614); 신종 코로나바이러스 주요 유행 균주 G614; 신종 코로나바이러스 돌연변이 균주 D614(L18F; A22V; V367F; N439K; Y453F; N501Y; T478I; P1263L); SARS 코로나바이러스; 천산갑 코로나바이러스를 포함한다.
9.1.2 신종 코로나바이러스 슈도바이러스 중화 실험
신종 코로나바이러스 슈도바이러스 중화 실험을 수행할 경우, 먼저 인간 ACE2를 안정적으로 발현하는 293T-ACE2 세포를 1E5/well로 불투명한 96웰 세포 배양 플레이트에 도말하고, 37℃, CO2 배양기에서 20시간 동안 배양한 후 중화 실험을 수행하였다. 실험 당일, 75μl의 신종 코로나바이러스 슈도바이러스와 25μl의 연속 희석된 상이한 형태의 가용성 ACE2 융합 단백질을 균일하게 혼합하고, 실온에서 30분 동안 배양하며, 96웰 세포 배양 플레이트 중의 세포 배양 상층액을 버린 다음, 미리 혼합한 슈도바이러스와 ACE2 융합 단백질의 혼합물을 293T-ACE2 세포에 첨가하고, 37℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 배지를 교환하고 새로운 2% FBS를 첨가하고, DMEM 배지를 계속 배양하며, 24시간 동안 배양한 후, Bright-Glo 루시페라제 측정 시스템을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하고, 마이크로플레이트 발광 측정기를 사용하여 측정하였다. 실험에서는 적어도 2개의 중복 웰을 설정하고 PBS 대조군 웰을 설정하였다.
9.2 결과
9.2.1 상이한 형태의 ACE2-hFc 융합 단백질 다량체에 의한 신종 코로나바이러스 슈도바이러스의 감염의 중화
신종 코로나바이러스 슈도바이러스 감염에 대한 상이한 형태의 ACE2-hFc 융합 단백질의 중화 활성을 비교할 경우, 인간 ACE2를 안정적으로 발현하는 293T 세포를 숙주 세포로 사용하고, ACE2-NN-hFc 융합 단백질을 연속 희석하여 SARS-CoV-2 슈도바이러스와 혼합한 후 293T-ACE2 세포를 감염시키며, 감염 2일째 세포내 루시페라제의 활성(RLU)을 검출하고, 바이러스에 감염된 PBS 대조군의 세포내 루시페라제의 활성(RLU)을 기준수로 하여 상이한 ACE2-NN-hFc 융합 단백질 농도에서 억제 백분율을 계산하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 상이한 형태의 ACE2-hFc 융합 단백질은 모두 SARS-CoV-2 슈도바이러스(D614) 감염에 대해 중화 활성을 갖고, 그 중 ACE2-hFc5 및 ACE2-hFc5 L309C의 시험관 내 중화 활성이 가장 강하며, IC50이 각각 9.86ng/ml 및 12.4ng/ml이고; ACE2-hFc-ACE2 Tetramer(사량체) 및 ACE2-ACE2-hFc Tetramer(사량체)가 그 다음으로 IC50이 각각 39.31ng/ml 및 260.8ng/ml이며; ACE2-NN-hFc의 중화 활성이 가장 낮았다. 이러한 결과는 신종 코로나바이러스 감염에 대한 ACE2 융합 단백질의 중화 활성이 신종 코로나바이러스 스파이크 단백질 RBD와의 결합력에 정비례하고, 다량체화 정도가 높을수록 중화 효과가 더 좋으며, 다량체화에 의한 변형은 ACE2-hFc 융합 단백질의 중화 활성을 유의하게 향상시킴을 설명한다.
9.2.2 ACE2-NN-hFc5는 넓은 스펙트럼의 항-신종 코로나바이러스 감염 중화 활성을 가짐
신종 코로나바이러스 돌연변이 균주 및 관련 코로나바이러스에 대한 ACE2-NN-hFc5의 넓은 스펙트럼의 항감염 활성을 평가하기 위해, 사람들에서 나타나는 주요 유행 돌연변이 균주에 따라, 다양한 단일점 돌연변이 신종 코로나바이러스 슈도바이러스를 패키징하고, 293T-ACE2 안정 세포주 감염 모델에서 ACE2-NN-hFc5의 중화 활성을 평가하였다. 결과는 ACE2-NN-hFc5 분자가 신종 코로나바이러스 초기 바이러스 균주 D614, 주요 유행 균주 G614 및 다른 돌연변이 균주, 및 SARS 및 천산갑 코로나바이러스 슈도바이러스에 대해 모두 강력한 중화 활성을 있음을 보여주고, 넓은 스펙트럼의 항바이러스 능력을 보여주며, 신종 코로나바이러스 주요 유행 균주 G614 슈도바이러스에 대한 중화 활성 IC50은 9.56ng/ml에 도달하였다(도 11, 하기 표 2). 신종 코로나바이러스 주요 돌연변이 균주 슈도바이러스 감염에 대한 중화 활성 측면에서, 결과는 ACE2-NN-hFc5 다량체가 여전히 강한 시험관 내 중화 능력을 갖고, 특히 N501Y 돌연변이 균주, ACE2-NN-hFc5에 대한 중화 활성이 더 강하며, IC50이 0.036ng/ml인 것을 보여준다. 이상의 결과는 ACE2-NN-hFc5가 시험관 내에서 고효율, 넓은 스펙트럼의 항-신종 코로나바이러스 활성을 가짐을 설명한다.
신종 코로나바이러스 초기 바이러스 균주 D614 | 신종 코로나바이러스 주요 유행 균주 G614 | SARS 코로나바이러스 | 천산갑 코로나바이러스 | |
IC50(ng/ml) | 17.09±7.08 | 9.56±0.25 | 84.54±33.4 | 108.2 |
SARS-CoV-2 변종 슈도바이러스(SARS-CoV-2 variants pseudovirus) | L18F | A222V | V367F | N439K | Y453F | N501Y | T478I | P1263L |
IC50(ng/ml) | 0.669 | 1.151 | 1.975 | 0.2668 | 0.8352 | 0.036 | 0.86 | 2.168 |
실시예 10: 시험관 내 신종 코로나바이러스 라이브 바이러스 중화 실험
10.1 방법
Vero 세포를 96웰 플레이트에 약 2×104/웰의 세포 밀도로 접종하였다. 다음날, 세포 배양액을 2% FBS-DMEM 배지로 교체하였다. 2% FBS-DMEM 배양액을 사용하여 ACE2-hFc 융합 단백질을 20μg/ml, 2μg/ml, 0.2μg/ml의 작업 농도로 희석하고, 각 샘플에 대해 3개의 중복 웰을 만들었다. 2% FBS-DMEM 배양액을 사용하여 2019-nCoV(바이러스 균주: C-Tan-nCoV Wuhan strain 01)를 200 TCID50/100μl로 희석하였다. 50μl의 희석된 샘플을 동일한 부피의 200 TCID50 바이러스에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 100μl 항체-바이러스 복합체를 세포에 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 CPE를 관찰하고, 48시간 후 100μl의 배양 상층액을 흡인하여 핵산 추출을 수행하며, 마지막으로 80μl의 용리액으로 용리하였다. 5μl의 핵산을 취하여 시스템을 조제하고, ABI Q5 형광 정량 PCR 기기에서 실시간 형광 RT-PCR 반응을 수행하였다. 측정된 샘플의 CT값을 표준 곡선에 대입한 후 샘플 중의 바이러스 TCID50를 계산하였다. 바이러스 복제 억제율(%)=(대조군 TCID50-융합 단백질군 TCID50)/대조군TCID50Х100%의 공식에 따라 계산하였다. 이상의 실험은 생물 안전 3등급 실험실에서 완료되었다.
10.2 결과
Vero 세포를 숙주 세포로 사용하여 생물 안전 실험실에서 신종 코로나바이러스 2019-nCoV 라이브 바이러스(C-Tan-nCoV Wuhan strain 01)에 대한 ACE2-hFc5의 중화 효과를 평가하였다. 실험 결과(도 12를 참조)는 ACE2-hFc5 및 ACE2-hFc가 신종 코로나바이러스의 감염에 대해 모두 현저한 중화 활성을 갖지며, IC50이 각각 0.02-0.06μg/ml 및 5.3-6.8μg/m임을 보여준다. 중화 능력 측면에서, ACE2-NN-hFc5의 시험관 내 중화 효과는 ACE2-NN-hFc보다 수백 배 더 높아 더욱 우수하고, 0.2μg/ml의 농도에서 여전히 80%의 바이러스 억제 작용을 관찰할 수 있으며, 이상의 결과는 ACE2-NN-hFc5 분자가 시험관 내에서 효율적인 항-신종 코로나바이러스 활성을 가짐을 충분히 보여준다.
실시예 11: 햄스터에서 ACE2-hFc5 융합 단백질의 분무화 흡입 평가
11.1 방법
11.1.1 분무화 흡입 후 호흡기 및 폐에서 ACE2-NN-hFc5의 침착 및 분포 분석
소형 동물 전신 노출 분무화 약물 전달 시스템(공기 펌프, 질량 유량계, 노출 상자를 포함)을 선택하고 이와 매칭되는 Aerogen solo 분무기, 어댑터 및 분무화 수집 장치를 사용하여 ACE2-hFc5의 분무화 약물 전달 실험을 수행하였다. 호흡기 침착 및 분포 분석 실험에서, 분무화 후 각각 0h, 6h 및 24h에 생리식염수로 헹구는 방법으로 햄스터의 비강 세척액(Nasal Lavage Fluid, NLF)을 수집하였다. 주기관(trachea), 기관지(bronchus) 및 폐포(alveoli)를 각각 수집한 후 일정한 비율로 취하여 조직 용해액으로 용해시키고, 용해 후 원심분리하여 상층액을 취하여 ACE2-hFc5 다량체의 함량을 검출하였다. 폐 침착 용량 탐색 분석 실험에서, 분무화 흡입 15분, 30분, 60분 후, 각 햄스터를 4mL의 생리식염수로 세척하여 폐포 세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)을 수집하고, 나머지 폐를 채취하여 균질화하며, 일정한 비율의 폐 균질액을 취하여 조직 용해액으로 용해시키고, 용해 후 원심분리하여 상층액을 취하여 ACE2-hFc5 다량체의 함량을 검출하였다.
11.1.2 ACE2-hFc5 함량의 ELISA 분석
ACE2-hFc5 다량체의 함량은 신종 코로나바이러스 RBD 결합 ELISA 방법을 사용하여 분석하였다. 2μg/mL의 스트렙타비딘으로 코팅하고, 2μg/mL의 비오틴(Biotin) 표지된 신종 코로나바이러스 RBD를 포획하며, 정제된 ACE2-NN-hFc5를 사용하여 표준품을 제조하고, 동시에 검출할 희석된 세척액 또는 조직 용해액 상층액을 첨가하며, HRP 표지된 항-hFc 2차 항체를 사용하여 검출하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD450-OD630값을 읽었다.
11.1.3 분무화 전후 ACE2-hFc5의 응집체 형태의 SEC-HPLC 분석
HPLC 방법을 사용하여 분무화 전후의 ACE2-hFc5에 대한 응집체 및 분해 분석을 수행하였다. Agilent 1260 고성능 액체 크로마토그래피 분석 시스템을 사용하고, G4000 TSK G4000SWxl 분석 칼럼 및 TSK gel guard column SWxl 보호 칼럼을 사용하였다. 완충액은 50 mM PB, 300 mM NaCl pH6.7±0.1이고, 분석 시간은 20분 또는 25분이며, 유속은 0.8mL/분이다.
11.2 결과
분무화 투여 방식을 통해 ACE2-NN-hFc5가 햄스터 폐포에 효과적으로 침착될 수 있다.
신종 코로나바이러스 감염 경로는 주로 호흡기 전파이고 주요 병소는 폐임을 고려하여 분무화 흡입의 호흡기 투여 방식을 탐구하였다. Aerogen의 분무기를 사용하여 ACE2-hFc5를 분무화하고, 매칭되는 유리 시험관을 사용하여 아이스 배스 조건에서 분무화된 액체 방울을 수집하였는데, 이 수집 방법의 회수율은 90% 이상에 도달할 수 있다. SEC-HPLC로 ACE2-hFc5 분무화 전후의 물리화학적 성질 및 항-신종 코로나바이러스 슈도바이러스 감염 중화 활성을 분석하였고, 결과는 분무화가 ACE2-NN-hFc5의 응집 및 분해를 일으키지 않으며(도 13을 참조), 신종 코로나바이러스 슈도바이러스 감염에 대해 현저한 억제 활성을 갖고, 분무화 전후의 항바이러스 능력이 현저한 변화가 없음(도 14를 참조)을 보여준다.
추가적으로 소형 동물 분무화 노출 약물 전달 방식으로 햄스터에서 분무화 흡입 투여(5mg/mL ACE2-NN-hFc5)를 50분 동안 수행하고, 분무화 후 각각 0h, 6h 및 24h에 햄스터의 비강 세척액(Nasal Lavage Fluid, NLF), 주기관(trachea), 기관지(bronchus) 및 폐포(alveoli)를 취하여 호흡기의 각 구성 요소에서 ACE2-NN-hFc5의 침착 및 분포 상황을 분석하였다. 투여 종료 후 0h, 6h 및 24h에 흡입된 ACE2-hFc5가 주로 폐포(약 75%를 차지함)에 분포되고; 비강 세척액에서의 분포가 흡입 후 0h의 17.33%에서 흡입 후 F24h의 0.7%로 급격히 감소하며; 주기관에서의 분포가 0.35%-3.4% 사이로 비교적 작음을 발견하였다. 기관지에서의 분포는 5%에서 19%로 점차적으로 증가하였다. 이러한 결과는 분무화 흡입을 통한 ACE2-NN-hFc5가 폐포 부위에 효과적으로 도달할 수 있고 흡입 후 24시간 내에 주로 폐포에 분포됨을 설명한다.
햄스터의 ACE2-hFc5 흡입 용량과 폐 침착 사이의 관계를 추가적으로 연구하였고, 슈도바이러스에 대한 폐포 세척액의 중화 활성을 분석하였다. 농도가 5mg/mL인 ACE2-hFc5를 사용하여 분무화 흡입 15분, 30분, 60분 후, 햄스터의 폐포 세척액, 및 폐 균질액을 수집하고, ELISA 방법을 사용하여 ACE2-hFc5의 함량을 검출하며, 폐포 세척액 및 폐 균질액 중 ACE2-NN-hFc의 합을 총 폐 침착량으로 계산하였다. 결과는 ACE2-hFc5 분무화 흡입 후 햄스터의 폐 침착량이 용량의 증가에 따라 증가함을 보여준다. 흡입 직후, 흡입 지속 시간은 15분, 30분, 60분으로 각각 6.48μg, 18.69μg, 33.35μg의 침착량에 대응된다. 흡입 종료 후, 햄스터 폐에서 ACE2-hFc5의 침착은 급격히 감소하였고, 흡입 종료 12시간 후, 햄스터 폐의 침착량은 흡입 직후의 14.73%-46%로 감소하였다. 그럼에도 불구하고 분무화 흡입 지속 시간 15분 및 30분의 조건에서, 흡입 종료 12시간 후, 4mL의 생리식염수로 각 햄스터를 세척하여 얻은 폐포 세척액은 4배 희석 후 여전히 90% 이상의 신종 코로나바이러스 슈도바이러스 중화 활성을 유지하였다.
실시예 12: 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 햄스터 감염 모델에서 ACE2-NN-hFc5의 약효 평가
12.1 방법
12.1.1 실험 설계
모든 동물 실험은 중국 의과 아카데미 쿤밍 의생명 과학 연구소 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 중국 윈난 국립 쿤밍 고등급 생물 안전 실험실 조작 규범 및 지침에 부합된다.
성체 SPF급 햄스터는 고등급 생물 안전 실험실로 옮겨져 단일 케이지에서 사육하였다. 햄스터는 체중에 따라 미처리 대조군, 1일 2회 15분 분무화 처리군 및 1일 2회 30분 분무화 처리군인 3개 군으로 평균적으로 나누되, 각 군에 7마리씩 나누었다. 실험에서, 햄스터에 104 PFU의 SARS-CoV-2 바이러스(GD108#)를 비강을 통해 접종하였고, 2시간 후 1차 분무화 흡입 치료를 수행하였으며, 분무화 시간은 각각 15분(25mg ACE2-hFc5) 및 30분(50mg ACE2-hFc5)이고, 이후 분무화 치료는 12시간마다 1회 총 6회 수행하였으며, 각 분무화 전에 중량을 칭량하였다. 실험 종료 시점은 챌린지 후 62시간이었고, 폐 조직을 채취하여 SARS-CoV-2 바이러스의 게놈(gRNA) 및 서브바이러스 게놈(sgRNA) 부하 분석을 수행하였다. 폐 조직(왼쪽 폐) 100mg 당 1ml의 PBS를 첨가하고, 신속한 균질화한 후 200μl를 취하여 RNA 추출을 수행하며, 그 후 RT-qPCR을 통해 SARS-CoV-2 바이러스 gRNA 및 sgRNA 부하 분석을 수행하였다. GraphPad Prism 8 소프트웨어를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 양측 Mann-Whitney U를 통해 두 군 간의 차이를 분석하였다.
12.2 결과
ACE2-hFc5의 분무화 투여는 햄스터 신종 코로나바이러스 감염 모델에서 바이러스 부하를 효과적으로 감소시킬 수 있다.
확립된 분무화 흡입 투여 방법을 기반으로 햄스터 SARS-CoV-2 감염 모델을 이용하여 ACE2-NN-hFC5의 생체 내 항바이러스 능력을 평가하였다. 실험은 각각 15분 분무화 흡입 및 30분 분무화 흡입의 2가지 용량군을 설정하여 ACE2-hFC5의 약효를 평가하였다. 햄스터가 SARS-CoV-2에 감염된 후, 3일째에 바이러스 역가가 가장 높았고 시간이 지남에 따라 바이러스 혈증이 점차적으로 개선되었으므로, 챌린지 후 3일째를 실험 종료 시점으로 선택하였다. ACE2-NN-hFc5 치료 후 햄스터 체중 감소는 약간 개선되는 경향을 보였다. 폐 조직의 gRNA와 sgRNA의 정량적 결과로부터 알 수 있는 바, ACE2-hFc5의 분무화 흡입은 폐 조직에서 SARS-CoV-2 바이러스의 복제를 유의하게 억제할 수 있는 효과가 있다(그림 15). 도 15의 실험 종료 시점(챌린지 후 62시간)에서, 햄스터 폐에서 SARS-CoV-2 게놈(gRNA) 및 서브게놈(sgRNA) 변화에 대해 qPCR 분석을 수행하였는 바, ●는 미처리 대조군을 나타내고, ■는 ACE2-hFc5-15min-BID군을 나타내며, ▲는 ACE2-hFc5-30min-BID군을 나타낸다. 가로줄은 중앙값을 나타내며 Mann-Whitney U를 통해 두 군 간의 차이의 통계적 분석을 수행하였다. 따라서, ACE2-hFc5의 분무화 흡입은 햄스터 SARS-CoV-2 감염 모델의 바이러스 부하를 효과적으로 감소시킬 수 있으며 새로운 신종 코로나바이러스 폐렴을 예방 및 치료할 수 있는 잠재력이 있다.
위에서 일반적인 설명, 구체적인 실시형태 및 시험을 통해 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 본 발명에 기초하여 일부 수정 또는 개선을 진행할 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 진행된 이러한 수정 또는 개선은 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING
<110> HUAHUI HEALTH LTD.
<120> SOLUBLE ACE2 AND FUSION PROTEINS, AND APPLICATIONS THEREOF
<130> RYP2010572.6
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 596
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu
1 5 10 15
Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn
20 25 30
Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr
50 55 60
Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala
65 70 75 80
Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg
85 90 95
Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys
100 105 110
Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly
115 120 125
Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp
130 135 140
Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu
145 150 155 160
Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn His
165 170 175
Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly
180 185 190
Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu
195 200 205
His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr
210 215 220
Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile
225 230 235 240
Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp
245 250 255
Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile
260 265 270
Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile
275 280 285
Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met
290 295 300
Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn Val
305 310 315 320
Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Asp
325 330 335
Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr
340 345 350
Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala
355 360 365
Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala
370 375 380
Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys
385 390 395 400
Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu
405 410 415
Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro
420 425 430
Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu
435 440 445
Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu
450 455 460
Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp
465 470 475 480
Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr
485 490 495
Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln
500 505 510
Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser
515 520 525
Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser
530 535 540
Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met
545 550 555 560
Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp Leu
565 570 575
Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp Ser
580 585 590
Pro Tyr Ala Asp
595
<210> 2
<211> 596
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu
1 5 10 15
Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn
20 25 30
Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp
35 40 45
Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr
50 55 60
Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala
65 70 75 80
Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg
85 90 95
Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys
100 105 110
Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly
115 120 125
Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp
130 135 140
Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu
145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro
420 425 430
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435 440 445
Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu
450 455 460
Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp
465 470 475 480
Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr
485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp Ser
580 585 590
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595
<210> 3
<211> 828
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg
100 105 110
Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys
115 120 125
Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly
130 135 140
Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp
145 150 155 160
Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu
165 170 175
Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn His
180 185 190
Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly
195 200 205
Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu
210 215 220
His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr
225 230 235 240
Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile
245 250 255
Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp
260 265 270
Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile
275 280 285
Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile
290 295 300
Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met
305 310 315 320
Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn Val
325 330 335
Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Asp
340 345 350
Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr
355 360 365
Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala
370 375 380
Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala
385 390 395 400
Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys
405 410 415
Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu
420 425 430
Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro
435 440 445
Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu
450 455 460
Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu
465 470 475 480
Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp
485 490 495
Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr
500 505 510
Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln
515 520 525
Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser
530 535 540
Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser
545 550 555 560
Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met
565 570 575
Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp Leu
580 585 590
Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp Ser
595 600 605
Pro Tyr Ala Asp Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys
610 615 620
Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser
625 630 635 640
Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn
645 650 655
Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu
660 665 670
Ala Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu
675 680 685
Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp
690 695 700
Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr
705 710 715 720
Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu
725 730 735
Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn
740 745 750
Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln
755 760 765
Leu Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala
770 775 780
Arg Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr
785 790 795 800
Glu Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile
805 810 815
Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His
820 825 830
Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr
835 840 845
Ile Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp
850 855 860
Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln
865 870 875 880
Lys Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp
885 890 895
Ala Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly
900 905 910
Leu Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp
915 920 925
Pro Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu
930 935 940
Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp
945 950 955 960
Asp Phe Leu Thr Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met
965 970 975
Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly
980 985 990
Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro
995 1000 1005
Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu
1010 1015 1020
Asp Asn Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr
1025 1030 1035
Ile Val Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg
1040 1045 1050
Trp Met Val Phe Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys
1055 1060 1065
Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro
1070 1075 1080
Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His
1085 1090 1095
Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu
1100 1105 1110
Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Lys His
1115 1120 1125
Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser Thr Glu Ala
1130 1135 1140
Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser Glu Pro
1145 1150 1155
Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met Asn
1160 1165 1170
Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp Leu
1175 1180 1185
Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp
1190 1195 1200
Ser Pro Tyr Ala Asp Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
1205 1210 1215
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1220 1225 1230
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
1235 1240 1245
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
1250 1255 1260
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
1265 1270 1275
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1280 1285 1290
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
1295 1300 1305
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1310 1315 1320
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
1325 1330 1335
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
1340 1345 1350
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
1355 1360 1365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
1370 1375 1380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
1385 1390 1395
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
1400 1405 1410
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
1415 1420 1425
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1430 1435 1440
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 15
Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr
1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 16
Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr
1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 17
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Tyr
20
<210> 18
<211> 862
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 18
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu
20 25 30
Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn
35 40 45
Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp
50 55 60
Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr
65 70 75 80
Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg
100 105 110
Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys
115 120 125
Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly
130 135 140
Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp
145 150 155 160
Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu
165 170 175
Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn His
180 185 190
Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly
195 200 205
Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu
210 215 220
His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr
225 230 235 240
Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile
245 250 255
Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp
260 265 270
Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile
275 280 285
Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile
290 295 300
Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met
305 310 315 320
Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn Val
325 330 335
Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Asp
340 345 350
Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr
355 360 365
Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala
370 375 380
Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala
385 390 395 400
Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys
405 410 415
Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu
420 425 430
Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro
435 440 445
Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu
450 455 460
Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu
465 470 475 480
Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp
485 490 495
Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr
500 505 510
Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln
515 520 525
Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
625 630 635 640
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
645 650 655
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660 665 670
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
675 680 685
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
690 695 700
Val Cys His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
705 710 715 720
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
725 730 735
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
740 745 750
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
755 760 765
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
770 775 780
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
785 790 795 800
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
805 810 815
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
820 825 830
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr
835 840 845
Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
850 855 860
Claims (42)
- 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태로서,
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 세포외 도메인, 또는 ACE2의 세포외 도메인의 아미노산 서열로 구성되거나 코로나바이러스와의 결합 능력을 유지하는 ACE2의 세포외 도메인의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 제1항에 있어서,
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 세포외 도메인 메탈로프로테이나제 도메인을 포함하고, 바람직하게는 인간 ACE2의 19번째 내지 615번째 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 제1항에 있어서,
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 아미노산 Q24, T27, F28, D30, K31, H34, E37, D38, Y41, Q42, L45, M82, Y83, Q325, E329, N330, K353, G354, D355, R357 및 R393을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 제1항에 있어서,
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 활성 중심 돌연변이된 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이고, 바람직하게는, 상기 활성 중심 돌연변이된 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 인간 ACE2의 374번째 및/또는 378번째 부위에 대응되는 부위에서 H374N 및/또는 H378N 돌연변이가 발생된 가용성 ACE2인 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 제1항에 있어서,
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 ACE2의 효소 활성을 유지하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태인 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태이고, 바람직하게는, 인간 ACE2의 53번째, 90번째, 103번째, 322번째, 432번째, 546번째 및/또는 690번째 부위가 글리코실화된 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태인 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 제1항에 있어서,
상기 가용성 ACE2의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태. - 가용성 ACE2의 융합 단백질로서,
상기 융합 단백질은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태와 항체 Fc 도메인의 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질. - 제8항에 있어서,
상기 항체는 IgG 항체이고, 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 인간 IgG이며, 바람직하게는 IgG1이고,
바람직하게는, 상기 항체 Fc 도메인은 항체의 2개의 중쇄 Fc 영역을 포함하는 항체 Fc-도메인이며,
바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 N-말단에 힌지 영역을 갖고,
바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래되는 CH3 도메인을 포함하며,
바람직하게는, 각 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고,
바람직하게는, 상기 Fc 영역은 힌지 영역, 및 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질. - 제8항에 있어서,
2n개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단 및/또는 N-말단에 연결되되, n은 1, 2 또는 3이고,
바람직하게는, 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결되어 이량체를 형성하거나; 또는, 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결되어 이량체를 형성하거나,
또는, 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결되고, 다른 2개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결됨으로써, 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하고; 또한, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 N-말단의 2개의 상기 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태의 N-말단에 추가로 하나의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 각각 직렬로 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하며; 바람직하게는, 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결되고, 바람직하게는, 상기 링커는 시스테인 AAA 링커이거나; 또는, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 C-말단의 2개의 상기 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태의 C-말단에 추가로 하나의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 각각 직렬로 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하며, 바람직하게는, 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결되고, 바람직하게는, 상기 링커는 시스테인 AAA 링커이거나;
또는, 4개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개씩 직렬로 연결된 후 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 연결됨으로써, 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하고, 바람직하게는, 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결되며, 바람직하게는, 상기 링커는 시스테인 AAA 링커이고; 또한, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 N-말단의 2개의 상기 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태의 N-말단에 추가로 하나의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 각각 직렬로 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하며, 바람직하게는, 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결되고, 바람직하게는, 상기 링커는 시스테인 AAA 링커이거나; 또는, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 상기 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 2개의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하거나;
또는, 4개의 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 2개씩 직렬로 연결된 후 2개의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 연결됨으로써, 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하고, 바람직하게는, 상기 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 링커를 통해 직렬로 연결되며, 바람직하게는, 상기 링커는 시스테인 AAA 링커이고; 또한, 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질의 2개의 중쇄 Fc 영역의 N-말단에 2개의 가용성 ACE 또는 이의 말단절단된 형태를 연결함으로써, 육량체 ACE2-Fc 융합 단백질을 형성하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 융합 단백질은 이량체 ACE2-Fc 융합 단백질이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 융합 단백질은 신호 펩티드, 바람직하게는 CD33 신호 펩티드를 더 포함하고, 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 이량체 ACE2-Fc 융합 단백질며, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질. - 제10항에 있어서,
상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질 중의 단일 ACE2 말단절단된 형태는 단일 중쇄 Fc 영역에 연결된 다음 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단일 ACE2에 연결되거나; 또는 상기 사량체 ACE2-Fc 융합 단백질 중 직렬로 연결된 2개의 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단일 중쇄 Fc 영역에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질. - 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태의 Fc 다량체 융합 단백질 ACE2-hFc(n)로서,
n개의 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하고, 각 폴리펩티드 단량체 단위는 2개의 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태가 2개의 중쇄 Fc 영역의 항체 Fc-도메인의 N-말단에 연결되어 형성된 이량체이며, 상기 n개의 폴리펩티드 단량체 단위는 항체 Fc-도메인의 C-말단에 위치한 테일을 통해 다량체로 조립되고, 상기 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태인 것을 특징으로 하는 다량체 융합 단백질. - 제14항에 있어서,
각 폴리펩티드 단량체 단위 중 각 중쇄 Fc 영역의 C-말단에는 하나의 테일이 연결되고, n개의 폴리펩티드 단량체 단위는 총 2n개의 테일을 가지며, 서로 연결되어 다량체를 구성하고, 바람직하게는, 상기 테일은 IgM 및/또는 IgA에서 유래되는 테일이며, 바람직하게는, 상기 테일은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 다량체 융합 단백질. - 제14항에 있어서,
상기 다량체 융합 단백질은,
4개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 사량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-hFc4;
4개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc4;
4개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 사량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 중쇄 Fc 영역이 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한 ACE2-NN-hFc4-L309C;
5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-hFc5;
5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc5;
5개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 오량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 중쇄 Fc 영역이 309번째 부위에서 L309C 돌연변이가 발생한 ACE2-NN-hFc5-L309C;
6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 단일 테일과 함께 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-hFc6;
6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 단일 테일과 함께 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc6; 및
6개의 폴리펩티드 단량체 단위가 Fc-도메인의 C-말단의 테일을 통해 서로 연결되어 조립된 육량체로서, 각 폴리펩티드 단량체 단위가 2개의 ACE2 말단절단된 형태와 2개의 중쇄 Fc 영역으로 구성된 이량체이고, 단일 ACE2 말단절단된 형태 및 단일 중쇄 Fc 영역이 테일과 함께 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ACE2-NN-hFc6-L309C로부터 선택되는 하나 이상의 다량체 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 다량체 융합 단백질. - 발현 벡터로서,
상기 발현 벡터는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터. - 포유 동물 세포주로서,
상기 세포주는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질, 또는 제16항에 따른 발현 벡터를 발현하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 세포주. - 제18항에 있어서,
상기 세포주는 CHO 세포주, 293 세포주 및 Vero 세포주 및 이들에서 유래되는 세포주를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는, Vero E6 세포 또는 HEK293T 세포인 것을 특징으로 하는 포유 동물 세포주. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질의 제조 방법으로서,
상기 방법은,
제17항에 따른 발현 벡터로 제18항에 따른 포유 동물 세포주를 형질감염시켜 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질을 발현하는 포유 동물 세포 발현주를 구축하는 단계 (1);
배양 조건에서 단계 (1)의 포유 동물 세포 발현주를 배양하여 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질을 생성함으로써 재조합 단백질을 생성하는 단계 (2); 및
단계 (2)에서 발현된 재조합 단백질을 정제하는 단계 (3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 약학적 조성물로서,
상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - ACE2 관련 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질의 응용.
- 제22항에 있어서,
상기 질환은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환이고, 바람직하게는, 상기 바이러스는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV, HCoV-NL63, 또는 SARS-CoV2일 수 있는 것을 특징으로 하는 응용. - 제22항에 있어서,
상기 질환은 폐렴, 중증 급성 호흡기 감염, 신부전, 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 간 손상, 장 질환, 또는 중증 급성 호흡기 증후군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 응용. - 제22항에 있어서,
상기 약물은 의료 종사자 및 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스에 노출될 수 있는 다른 사람들의 수동 면역에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 응용. - 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항, 및 제21항에 있어서,
상기 약물은 흡입, 비강내 또는 기도 점적, 약물은 흡입, 비강내 또는 기도 점적, 눈, 중이 주사, 귀점액, 국소, 경피, 비경구, 피하, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 흉강내 점적, 복강내 주사, 병변내에 의해 투여되거나, 점막에 적용하거나 서방성 담체를 이식하여 투여되고, 바람직하게는, 상기 약물은 분무화 흡입에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 응용 및 약학적 조성물. - ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염 저항성 약물의 스크리닝 방법으로서,
상기 방법은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 ACE2 또는 이의 말단절단된 형태, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 다량체 융합 단백질, 제17항에 따른 발현 벡터 또는 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 포유 동물 세포주를 이용하여 상기 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염 저항성 약물의 스크리닝 방법으로서,
상기 방법은 Furin 프로테아제를 이용하거나 코로나바이러스의 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위를 약물 스크리닝 표적으로 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제28항에 있어서,
상기 약물은 Furin 프로테아제 억제제인 것을 특징으로 하는 방법. - 제28항 또는 제29항에 있어서,
상기 약물은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에서 Furin 제한 효소 절단 부위를 통한 합포체 형성을 차단하는 것을 특징으로 하는 방법. - ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에 사용되는 약물의 제조에서 Furin 프로테아제 또는 코로나바이러스의 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위를 표적으로 하는 시약의 응용.
- ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에 사용되는 약물의 제조에서 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스 감염에서 Furin 제한 효소 절단 부위를 통한 합포체 형성을 차단하는 시약의 응용.
- 제31항 또는 제32항에 있어서,
상기 시약은 Furin 프로테아제 억제제인 것을 특징으로 하는 응용. - 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항, 및 제31항 또는 32항에 있어서,
상기 코로나바이러스는 SARS-CoV, HCoV-NL63 또는 SARS-CoV2인 것을 특징으로 하는 방법 및 응용. - 돌연변이된 S 단백질로서,
상기 S 단백질은 말단절단된 형태, 및/또는 Furin 제한 효소 절단 부위가 돌연변이된 형태이고, 상기 말단절단된 형태는 S 단백질의 막횡단 영역 및 세포내 영역의 결실이며, 상기 Furin 제한 효소 절단 부위의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 추가에 의해 Furin 제한 효소 절단 부위가 더 이상 Furin 제한 효소 절단 부위로서의 활성을 갖지 않도록 하는 것을 특징으로 하는 S 단백질. - 제35항에 있어서,
상기 S 단백질의 Furin 제한 효소 절단 부위는 RRAR에서 SRAS로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 S 단백질. - 제35항 또는 제36항에 있어서,
상기 S 단백질은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 S 단백질. - ACE2 관련 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 S 단백질의 응용.
- 제38항에 있어서,
상기 질환은 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환이고, 바람직하게는, 상기 바이러스는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV, HCoV-NL63, 또는 SARS-CoV2일 수 있는 것을 특징으로 하는 응용. - 제38항에 있어서,
상기 질환은 폐렴, 중증 급성 호흡기 감염, 신부전, 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 간 손상, 장 질환, 또는 중증 급성 호흡기 증후군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 응용. - 제38항에 있어서,
상기 약물은 의료 종사자 및 ACE2를 수용체로 사용하는 바이러스, 특히 코로나바이러스에 노출될 수 있는 다른 사람들의 수동 면역에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 응용. - SARS-CoV2 감염을 예방하기 위한 재조합 백신으로서,
상기 재조합 백신은 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 S 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 백신.
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