TW202140571A - 重組ace2-fc融合分子以及製造及使用彼等之方法 - Google Patents

Abstract

一種融合蛋白，包含共價融合至Fc結構域的變體血管收縮素轉化酶2(ACE2)結構域。變體ACE2結構域相對於具有SEQ ID NO： 1之全長野生型ACE2具有N端缺失、C端缺失或兩者皆缺失。變體ACE2結構域具有ACE2活性。

Description

重組ACE2-FC融合分子以及製造及使用彼等之方法

相關申請案的交叉引用 本申請案根據專利法主張2020年2月13日申請的美國臨時申請案序列號第62/976,344號之申請日權益以及2020年10月1日申請的美國臨時申請案序列號第63/086,593號之申請日權益，該案之整體內容以引用方式併入本文。

本申請案是關於涉及血管收縮素轉化酶2(ACE2)的疾病、症狀或病況(例如新冠肺炎2019(COVID-19)與相關病況)之預防或治療。

除本文另有指明，此節所述之材料對於此申請案之申請專利範圍並非先前技術，且亦不因內含於此節而認作先前技術。

COVID-19為嚴重急性呼吸道症候群(SARS)冠狀病毒2(SARS-CoV-2)所引起的感染性疾病。COVID-19的併發症可包括長期肺損傷、肺炎、急性呼吸道窘迫症候群(ARDS)、周邊及嗅覺神經損傷、多重器官衰竭、敗血性休克及死亡。發表於2020年一月號《刺胳針》中的頭41起COVID-19確診病例之研究報導了2019年12月1日為最早的症狀發端日。2020年3月11日之時，世界衛生組織(WHO)宣告COVID-19爆發大流行。截至2020年9月26日為止，遍及188個國家及地區已報導超過3260萬(32.6 million)起病例且超過99萬(990,000)人死亡，其中美國就報導了超過750萬(7.5 million)起病例且超過20.5萬(205,000) 人死亡。

除瑞德西韋(Remdesivir)之外，並無其他治療COVID-19之特定適應症的藥物或疫苗被批准。美國國家衛生研究院指引並無建議在暴露至SARS-CoV-2病毒前後，任何於臨床試驗範圍外用於預防COVID-19的藥物。已有至少一國家監管機構授權九種疫苗供公眾使用：來自輝瑞-德國BNT (Phizer-BioNTech)以及莫德納(Moderna)的兩種RNA疫苗；來自國藥集團(Sinopharm)、巴拉特生物科技公司 (Bharat Biotech)以及莫德納的三種習知不活化疫苗；來自衛星V (Sputnik V)、牛津-阿斯特捷利康(Oxford-AstraZeneca)以及楊森(Janssen)的三種病毒載體疫苗；以及一種肽疫苗(EpiVacCorona)。

血管收縮素轉化酶2(ACE2)是一種位於下列細胞的細胞膜上的含鋅金屬酶：主要為肺的肺泡細胞、小腸的腸上皮細胞、動脈與靜脈的內皮細胞、動脈的平滑肌細胞以及肺、動脈、心臟、腎、小腸與其他組織裡的其他細胞族系。ACE2藉由抗衡心血管、腎及呼吸系統中血管收縮素轉化酶的活性來調節腎素血管收縮素系統(renin angiotensin system)，這指出其在血壓控制中的重要角色。ACE2在高血壓、心臟相關功能(cardiac function)、心臟功能(heart function)及糖尿病的生理學中扮演保護性角色。在急性呼吸道窘迫症候群(ARDS)中，ACE、AngII與AT1R促進致病機轉，然而ACE2與AT2R卻保護免於ARDS。另外，ACE2已被鑑別為嚴重急性呼吸道症候群(SARS)冠狀病毒的受體，且扮演嚴重急性呼吸道症候群(SARS)致病機轉中的重要角色。冠狀病毒家族中的至少三種病毒SARS-CoV、MERS CoV以及SARS-CoV-2，使用其病毒蛋白中的一種，又稱為棘蛋白(Spike)，結合至人類宿主細胞表面上的ACE2蛋白，以使病毒入侵人體中。

SARS-CoV-2為七種已知之感染人類的冠狀病毒中的一種，已知之感染人類的冠狀病毒包括2003年在亞洲引起大爆發的SARS-CoV-1病毒以及2012年在中東引起大爆發的MERS CoV病毒。對SARS-CoV-2病毒的免疫反應涉及細胞促成性免疫(cell-mediated immunity)以及抗體生成。雖然超過了1億(100 million)人自COVID-19中恢復，但在個體中對SARS-CoV-2病毒的天然免疫是否持久仍屬未知。顧慮之一是關於病毒持續累積的突變，這會改變病毒抗原性範圍且引起病毒突變株的再感染。截至2021年一月，在歐洲與南非鑑別出的SARS-CoV-2病毒變異株(variant strain)似乎正迅速擴散。這些變異株可能窩藏終將增進病毒識別並感染至宿主細胞的突變。是否這些或其他可預見的變異體可能會削弱疫苗效力或克服天然免疫並導致一連串的再感染實屬未知。

其他顧慮與抗體依賴性增強反應(ADE)的現象有關。ADE在次佳抗體的結合增進病毒入侵宿主細胞中時發生。在冠狀病毒中，靶向病毒棘蛋白(S) (spike (S))醣蛋白的抗體促進ADE。在SARS-CoV-1病毒的案例中，發現了中和多數變體的抗體能增進變體病毒入侵免疫細胞，反過來說，設計來防範變體病毒的疫苗惡化了疾病。因此，ADE會牽制疫苗發展，因為疫苗可能導致次佳抗體生成。在此情況下，應考慮疫苗外的任何預防性策略做為在暴露至SARS-CoV-2病毒前後防止ADE發生的可行選項。

因此，仍迫切需要涉及血管收縮素轉化酶2(ACE2)之疾病或病況的有效治療方式或預防措施。

下列發明內容僅供說明，並不意指任何方式的限定。除上述說明性態樣、實施例及特徵外，藉由參考附圖和下列的詳細說明，進一步的態樣、實施例及特徵將變得顯而易見。

申請案提供融合蛋白、融合蛋白複合體、蛋白複合體、含融合蛋白複合體的免疫接合物以及含融合蛋白複合體的醫藥組成物等等。申請案還提供製造融合蛋白以及融合蛋白複合體的方法，以及使用融合蛋白或融合蛋白複合體來治療或預防疾病的方法。

在一個態樣中，申請案提供具有ACE2活性的融合蛋白。在一個實施例中，融合蛋白包括共價融合至Fc結構域的變體血管收縮素轉化酶2(ACE2)結構域。在一個實施例中，變體ACE2結構域包含相對於全長野生型ACE2的N端缺失、C端缺失或兩者皆缺失。在一個實施例中，全長野生型ACE2結構域具有與SEQ ID NO： 1至少95%、97%或98%序列一致性的胺基酸序列。在一個實施例中，變體ACE2結構域具有ACE2活性。

在一個實施例中，變體ACE2結構域包含一胺基酸序列，該胺基酸序列具有與來自全長野生型ACE2之胺基酸序列區段至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列一致性。在一個實施例中，區段可由選自全長野生型ACE2之殘基1～17的胺基酸殘基開始。在一個實施例中，區段可以選自全長野生型ACE2之殘基615～740的胺基酸殘基結束。例如，變體ACE2結構域與來自全長野生型ACE2之殘基1至殘基615、殘基2至殘基618、殘基2至殘基740、殘基4至殘基615、殘基17至殘基615、殘基17至殘基740或任何其他起始殘基至結束殘基之組合的胺基酸序列區段可具有至少98%或99%的序列一致性。

在一個實施例中，變體ACE2結構域包含與SEQ ID NO：3具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。

在一個實施例中，變體ACE2結構域相較於對全長野生型ACE2，對SARS-CoV或SARS棘蛋白可具有較高結合親和力(binding affinity)。例如，變體ACE2結構域與SARS-CoV或SARS棘蛋白可具有KD為0.1 nM至100 nM的結合親和力。

在一個實施例中，變體ACE2結構域相較於對全長野生型ACE2，對SARS-CoV或SARS棘蛋白可具有較高結合總親合力(binding avidity)。例如，變體ACE2結構域與SARS-CoV或SARS棘蛋白可具有KD為0.01 nM至10 nM的結合總親合力。

在一個實施例中，Fc結構域衍生自免疫球蛋白的Fc結構域。免疫球蛋白可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 (d-IgA1、S-IgA1)、IgA2、IgD、IgE或IgM。在一個實施例中，Fc結構域可具有Fc鉸鏈區。在一個實施例中，Fc鉸鏈區可生物工程化為C220S。在一個實施例中，Fc結構域當與野生型Fc結構域比較時，可包括選自K322A、L234A以及L235A的無效突變。在一個實施例中，野生型Fc結構域擁有與SEQ ID NO：5具有至少98%或99%序列一致性的胺基酸序列。

在一個實施例中，Fc結構域可缺乏效應子功能。在一個實施例中，Fc結構域可缺乏抗體依賴之細胞性細胞毒殺作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity；ADCC)、抗體依賴之細胞性吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis；ADCP)以及補體依賴性細胞毒殺作用(complement-dependent cytotoxicity；CDC)。在一個實施例中，Fc結構域包含IgG1 Fc結構域。

在一個實施例中，Fc結構域包含與SEQ ID NO：6具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。

在一個實施例中，融合蛋白可擁有與SEQ ID NO：7、9、11、13、15、16、17、18、19及21具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。

在一個實施例中，融合蛋白可具有約50 kDa至250 kDa的分子量。在一個實施例中，融合蛋白可具有50kDa、60kDa、70 kDa、80 kDa、90 kDa、100kDa、120 kDa、150 kDa、180 kDa、200 kDa、250 kDa或之間任何數字的分子量。

在第二態樣中，申請案提供融合蛋白複合體。在一個實施例中，融合蛋白複合體為本文所揭示的融合蛋白的同質二聚體。在一個實施例中，融合蛋白複合體包括兩個變體ACE2結構域。

在一個實施例中，融合蛋白複合體包含至少兩個融合蛋白。在一個實施例中，兩個融合蛋白藉由一個或兩個雙硫鍵成對。在一個實施例中，雙硫鍵位在Fc結構域的鉸鏈上。

在一個實施例中，融合蛋白或融合蛋白複合體具有對SARS-CoV-2、SARS-CoV或SARS棘蛋白或其片段的結合親和力。在一個實施例中，結合親和力具有不大於0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、3nM、5nM、10nM、20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、60nM、80nM或於之間任何數字的平衡解離常數。

在一個實施例中，融合蛋白或融合蛋白複合體具有對SARS-CoV-2、SARS-CoV或SARS棘蛋白或其片段的結合總親合力。在一個實施例中，結合總親合力具有不大於0.01nM、0.05nM、1nM、2nM、3nM、5nM、10nM或於之間任何數字的平衡解離常數。

在一個實施例中，融合蛋白或融合蛋白複合體具有約50 pmol/min/μg至約5000 pmol/min/μg的酵素比活性(specific enzymatic activity)。在一個實施例中，融合蛋白具有約568 pmol/min/μg的酵素比活性。

在第三態樣中，申請案提供蛋白複合體。在一個實施例中，蛋白複合體包括與病毒蛋白結合的如其所揭示的融合蛋白或融合蛋白複合體。在一個實施例中，病毒蛋白包含SARS-CoV-2、SARS-CoV、SARS棘蛋白、冠狀病毒、SARS病毒或前述物質的片段或組合。

在進一步的態樣中，申請案提供編碼如其所揭示之融合蛋白的經分離核酸。

在進一步的態樣中，申請案提供包含經分離核酸的表現載體，該經分離核酸編碼如其所揭示之融合蛋白。

在進一步的態樣中，申請案提供包含核酸的宿主細胞，該核酸編碼如其所揭示之融合蛋白。在一個實施例中，宿主細胞為原核細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞。

在進一步的態樣中，申請案提供製造如其所揭示之融合蛋白及融合蛋白複合體的方法。在一個實施例中，方法包含培養具有編碼融合蛋白或融合蛋白複合體之核酸的宿主細胞，以便製造融合蛋白或融合複合體。

在進一步的態樣中，申請案提供蛋白接合物。在一個實施例中，蛋白接合物包括如其所揭示之融合蛋白或融合蛋白複合體以及藥物部分。藥物部分可藉由連接子連接至融合蛋白或融合蛋白複合體。在一個實施例中，連接子可為選自酯鍵、醚鍵、胺鍵、醯胺鍵、雙硫鍵、醯亞胺鍵、碸鍵、磷酸鍵、磷酯鍵、肽鍵、腙鍵或前述之組合的共價鍵。

在一個實施例中，藥物部分可為抗病毒劑、免疫調節劑、顯影劑或前述之組合。 在一個實施例中，抗病毒劑可為法維拉韋(favipiravir)、雷巴威林(ribavirin)、戈利德西韋(galidesivir)、瑞德西韋(remdesvir)或前述之組合。在一個實施例中，顯影劑可為放射性核種、螢光劑、量子點或前述之組合。

在進一步的態樣中，申請案提供用於治療涉及血管收縮素轉化酶2(ACE2)之疾病或病況的醫藥組成物。在一個實施例中，醫藥組成物包括如本文所揭示之融合蛋白或融合複合體以及醫藥學可接受之載劑。在一個實施例中，醫藥組成物進一步包括抗病毒劑。在一個實施例中，醫藥組成物包括如其所揭示之蛋白接合物以及醫藥學可接受之載劑。

在進一步的態樣中，申請案提供治療或預防患者中病毒感染、急性呼吸道窘迫症候群、肺動脈高壓或急性肺傷害的方法。在一個實施例中，方法包括投與患者有效量的如本文所揭示的融合蛋白或融合複合體的步驟。在一個實施例中，方法進一步包括共同投與有效量的治療劑。在一個實施例中，治療劑包括抗病毒劑。在一個實施例中，患者為哺乳類。

在一個實施例中，病毒感染可為SARS-CoV-2、SARS-CoV、SARS棘蛋白、冠狀病毒、SARS病毒或前述的片段或組合的感染。

在一個實施例中，方法可包括靜脈、皮下、經鼻道(例如鼻噴劑)或經肺通道投與融合蛋白或融合蛋白複合體。

在進一步的態樣中，申請案提供溶液。在一個實施例中，溶液包括如本文所揭示之有效濃度的融合蛋白或融合蛋白複合體。在一個實施例中，溶液為患者的血漿。在一個實施例中，溶液包括如本文所揭示之融合蛋白、融合蛋白複合體或蛋白複合體，且溶液為患者的血漿。

以下的詳細說明中，參考構成其一部分的附圖。在圖式中，除非上下文另有指明，相似的符號通常標識相似的元件。在詳細說明、圖式和申請專利範圍中所描述的說明性實施例並不被視為限制。在不背離本文所呈現之標的之精神或範圍的情形下，可利用其他實施例，且可進行其他改變。將容易理解，能夠以本文中明確考量之所有各式各樣不同的配置，來佈置、取代、組合、分離及設計在本文中概述且在圖式中闡明之本案揭示內容的態樣。

本申請案是關於融合蛋白(例如重組人類ACE2-Fc融合蛋白)的生產和特性分析等。在一些實施例中，這些融合蛋白能保護人類宿主細胞的膜ACE2免於病毒顆粒或病毒的侵害。在一個實施例中，病毒顆粒或病毒可運用病毒棘蛋白，在感染後使病毒入侵宿主細胞。在一個實施例中，病毒顆粒包括但不限定於SARS-CoV-2病毒、COVID-19病毒、SARS-CoV-2變體及其他冠狀病毒。在一個實施例中，病毒可引起嚴重急性呼吸道症候群(SARS)。在一個實施例中，SARS可包括冠狀病毒疾病2019或COVID-19。

在一個實施例中，重組人類ACE2-Fc融合蛋白可為ACE2鋅金屬肽酶結構域(又稱ACE2胞外結構域，ACE2-ECD)及IgG1 Fc片段的融合蛋白。在一個實施例中，融合蛋白為SI-F019，為ACE2-ECD及IgG1 Fc片段之融合蛋白且具有依據EU編號系統的C220S、L234A、L235A及K322A突變 (表1及圖1)。活性ACE2-ECD保留宿主受體-病毒交互作用的結構性構形。IgG1 Fc片段中的每個突變可耗損某些免疫反應。突變C220S可移除配對輕鏈與重鏈用的不成對半胱胺酸，因此提供避免蛋白質形成聚集、改善蛋白質穩定度及促進製造效率與擴充性等等的技術優勢。導入L234A及L235A兩者可減少Fc的效應子功能，例如抗體依賴之細胞性細胞毒殺作用(ADCC)、抗體依賴之細胞性吞噬作用(ADCP)。K322A突變可減少C1q結合所觸發的補體依賴性細胞毒殺作用(CDC)。SI-F019經設計以中和SARS-CoV-病毒，同時觸發較少的效應子反應。

除非上下文不適用，本文中使用的用語「一(a/an)」及「該」經定義為「一或更多」且包括複數。

用語「重組融合蛋白」是指透過編碼二或更多基因之融合基因的基因生物工程所產生的蛋白質，該二或更多基因原本編碼不同的蛋白質。

用語「ACE2-Fc」是指人類ACE2蛋白片段及人類免疫球蛋白之片段可結晶區(Fc區)的生物工程化片段的重組融合蛋白，其中人類免疫球蛋白包括但不限定於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 (d-IgA1、S-IgA1)、IgA2、IgD、IgE或IgM。

用語「棘蛋白(spike/Spike)」、「S蛋白」或變體是指負責讓病毒能附接至宿主細胞之膜(「S1次單元」或「S1蛋白」)並與宿主細胞之膜融合(「S2次單元」或「S2蛋白」)的蛋白質。在COVID-19的案例中，SARS-CoV-2 對人類細胞上的ACE2受體具有充分親和力，以使用其做為進入細胞的機制，且比起原始SARS病毒，SARS-CoV-2對人類ACE2具有較高親和力。

用語「Fc結構域」、「Fc片段」及「Fc區」是指IgG、IgA及IgD抗體同型中Fc區的相同結構域或片段(各自為「Fc結構域」或「Fc片段」)，其衍生自鉸鏈以及抗體兩個重鏈的第二與第三恆定結構域(CH2-CH3)。

用語「親和力」是指兩種多肽之間吸引力的度量單位(measure)，兩種多肽例如受體/配體、ACE2/棘蛋白或例如其變體。兩種多肽之間的內在吸引力(intrinsic attractiveness)能被表現為特定交互作用的結合親和力平衡常數(KD)。可藉由例如生物層干涉技術(Bio-Layer Interferometry)來量測KD結合親和力常數。

用語「總親合力」是指例如蛋白質受體與其配體之間的個別非共價結合交互作用的多重親合力累加強度，且一般稱功能性親和力。因而總親合力與親和力不同，親和力是描述單一交互作用的強度。

用語「抗原性飄移(antigenic drift)」是指感染性病毒隨機基因突變而產生在抗原性上具微小改變的新病毒株，防止先前株感染的抗體對新病毒株可能並不有效。

用語「細胞激素釋放症候群(CRS)」是指SARS-CoV-2感染後血液中與發炎介質增加程度相關聯的COVID-19重度案例中的CRS，發炎介質包括細胞激素與趨化激素，例如介白素(IL)-2、IL-6、IL-7、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、單核球趨化蛋白-1(MCP1；又稱CCL2)、巨噬細胞發炎蛋白1α(MIP1α；又稱CCL3)、CXC-趨化激素配體10 (CXCL10)、C-反應蛋白、鐵蛋白及D-二元體。 範例 範例1：重組ACE2-Fc融合蛋白的選殖、表現及純化

人類膜ACE2是介導SARS-CoV病毒入侵類宿主細胞中的關鍵性受體。人類ACE2蛋白具有至少三個功能性結構域：信號肽(殘基1-17)；鋅金屬肽酶結構域(殘基18-615)；以及TMPRSS2蛋白酶切位(殘基697-716) (SEQ ID NO：1為來自Genbank登錄號NP_001358344.1的全長人類ACE2蛋白序列)，SARS-CoV 病毒蛋白(也就是棘蛋白)與全長人類ACE2蛋白的鋅金屬肽酶結構域(SEQ ID NO：3為殘基1至615的經截斷ACE2蛋白序列)交互作用。換句話說，人類抗體Fc區(SEQ ID NO：5)能與許多免疫細胞上的Fc受體(FcRs)以及補體系統的一些蛋白質交互作用。每個IgG1 Fc區的Fc片段在C220處(依據EU編號系統)含有半胱胺酸，其本身可與κ或λ輕鏈形成雙硫鍵。為減少具有可將蛋白質去穩定化及/或去活化的游離半胱胺酸的風險，C220可被絲胺酸取代(C220S)或被其他胺基酸取代。為減少Fc結合至FcγR以及C1q，可將其他點突變(例如K322A、L234A以及L235A)生物工程化至野生型IgG1 Fc片段中。共同地具有該四個突變的IgG1 Fc片段稱之為IgG1 Fc無效段(Fc null) (SEQ ID NO：6)。

將重組人類ACE2-Fc融合蛋白(如表1中列舉)生物工程化以製造可溶性融合蛋白，其中的SI-69R2 (SEQ ID NO：7)為不含TMPRSS2蛋白酶切位的經截斷ACE2片段及IgG1 Fc無效片段之重組融合蛋白。製作其他重組融合蛋白以提供Ig同型的Fc片段，例如SI-69R2-G4 (IgG4 Fc，SEQ ID NO：9)、SI-69R2-A1 (IgA1 Fc，SEQ ID NO：11)、SI-69R2-A2(IgA2 Fc，SEQ ID NO：13)或野生型IgG1 Fc片段(IgG1 Fc，SEQ ID NO：19)。亦製作具有所有三種結構域的經截斷ACE2及野生型IgG1 Fc片段之重組融合蛋白(SI-69R4，1～740，SEQ ID NO：21)。所有重組ACE2-Fc融合蛋白中，可以不同長度的其他信號肽取代信號肽(ACE2殘基1～17)而不影響人類ACE蛋白或ACE2-Fc融合蛋白中其他結構域的功能。

將表1中編碼融合蛋白的重組融合基因選殖入pCGS3.0 (例如SI-69R2)或pTT5表現載體(例如SI-69R4及SI-69R10)並表現在ExpiCHO細胞中。在標準蛋白質表現步驟準則之後純化所有的融合蛋白，使用0.22 um過濾器滅菌，並在4℃儲存於冷凍保存緩衝液中。在表現及純化期間，每個重組融合蛋白可經歷轉譯後修飾，包括N-醣基化及N端信號肽(17個胺基酸)切割。在SI-69R2的案例中，將經純化之融合蛋白新命名為SI-F019。

如圖1A及1B中所示，SI-F019保留包含人類ACE2的鋅金屬肽酶結構域(殘基19～611)的經截斷之ACE2片段(殘基18～615)，但不含TMPRSS2蛋白酶切位。此外，SI-F019保留IgG1 Fc無效片段，該IgG1 Fc無效片段並不結合至Fcγ受體。如此一來，並不預期在其可溶形態下的SI-F019結合周邊血液中的任何標靶細胞。

SI-F019融合蛋白很可能經歷轉譯後修飾，例如N-醣基化及藉由Fc區的兩個雙硫鍵連接的同質二聚體化。為估定SI-F019二聚體的實際分子量，如圖1C所示，使用分析式尺寸排阻層析法(SEC)與多角度光散射(MALS)、吸光度(UV)及/或折射率(RI)濃度偵測器技術的組合。方法組合藉由分子尺寸的層析分離及藉由光散射(LS)的絕對莫耳質量測定，而不受分子量標準校正限制。SI-F019呈現209.6 kDa(主峰)的平均總分子量，其中SI-F019二聚體及其修飾物(也就是多醣)的分子量經量測分別為189.3 kDa及20.3 kDa。在其胺基酸的理論計算中，SI-F019單體的分子量為95.1 kDa。因此，經純化的SI-F019融合蛋白複合體為同質二聚體，而SI-F019蛋白複合體卻是指如單體或二聚體的SI-F019與例如棘蛋白與效應子蛋白的其他蛋白質之間的蛋白質-蛋白質交互作用。SI-F019-棘蛋白複合體(如圖1D之圖示說明)的形成構成一機制的基礎，藉由該機制，SI-F019為用於預防SARS-CoV-2病毒停駐在供病毒入侵人類宿主細胞中之膜ACE2上的候選抑制劑。 範例2：SI-F019對棘蛋白、Fc受體及Clq的結合親和力

SI-F019經設計以藉由防止棘蛋白結合至人類宿主細胞上的膜ACE2蛋白來阻斷SARS-CoV病毒入侵人體。棘蛋白為冠狀病毒最具識別性的特徵，其為造就冠狀或光環狀表面的旋鈕結構。棘蛋白大致上由醣蛋白構成，且每個棘蛋白由S蛋白的三聚體構成，且S蛋白依次由S1及S2次單元構成。同質三聚體S蛋白介導病毒與宿主細胞之間的受體結合與膜融合。S1次單元形成棘蛋白的頭部並具有受體結合結構域(RBD)。S2次單元形成將棘蛋白固定在病毒套膜中的桿，並打開蛋白酶活化作用以賦予融合能力。在功能活性狀態中，在宿主細胞的蛋白酶(例如組織蛋白酶家族以及跨膜絲胺酸蛋白酶2(TMPRSS2))作用下，當病毒與宿主細胞結合並融合時，S1及S2次單元複合體分裂成個別的次單元。棘蛋白在冠狀病毒感染過程中的病毒入侵扮演重要腳色。在COVID-19的案例中，SARS-CoV-2病毒停駐至宿主細胞表面上之膜結合ACE2受體上，且棘蛋白與ACE2功能性結構域之間的交互作用係藉由觸發病毒套膜與宿主細胞膜之間的融合，致使病毒的核殼蛋白釋放至宿主細胞的細胞質中。

針對ACE-Fc融合蛋白與病毒棘蛋白的結合親和力及總親合力來評估SI-F019。在生物層干涉技術分析中，棘蛋白樣品包括SARS-CoV-2棘蛋白三聚體、SARS-CoV-2 S1蛋白、SARS-CoV-2 S1蛋白RBD結構域及SARS-CoV-1 RBD 結構域(表2)。結合親和力測定量測固定在抗人類IgG Fc捕獲生物感測器(anti-human IgG Fc Capture Biosensor)尖端表面上的SI-F019與溶液中棘蛋白的結合。總親合力測定量測固定在卵白素生物感測器尖端表面上的生物素化棘蛋白與溶液中SI-F019的結合。數據分析運用1：1擬合模型來計算結合親和力及總親合力兩者。結果指出SI-F019與這些棘蛋白、片段或結構域的結合親和力及總親合力似乎在其各自為奈莫耳(nM)的KD尺度內(表2)。此特徵性及情報性數據對量測具有病毒棘蛋白變體的SI-F019蛋白複合體而言可為有用的參考，該等病毒棘蛋白變體表明為SARS-CoV-2變體中的潛在抗原性飄移。該現象接近與某些SARS-CoV-2病毒株中病毒突變(例如棘蛋白中的D614G (Zhang等人，2020))關聯的現實，該些病毒突變很可能已更改病毒對膜ACE2的親和力然後病毒入侵宿主細胞。

在SI-F019結合至棘蛋白的同時，藉由使用生物層干涉技術來評估SI-F019其與人類FcγRs、C1q及FcRn的結合。如表3所示，並沒有偵測到與包括FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa之FcγRs的結合，也沒有偵測到與C1q的結合。然而，SI-F019確實與FcRn結合，且判定結合親和力的KD在37.6 nM，其堪比人類IgG1 Fc區的結合親和力。 範例3：SI-F019抗TMPRSS2蛋白酶活性

人類ACE2受到TMPRSS2的膜蛋白酶水解，單體胞外ACE2便從細胞脫落，其可馬上在血清中測得。在重組ACE2-Fc融合蛋白中，將經截斷ACE2結構域與Fc片段融合，但仍保留與病毒棘蛋白的結合親和力。

將SI-F019生物工程化使之在經截斷ACE2結構域中不具TMPRSS2切位。如圖1中所示，SI-F019含有18到615的殘基，而SI-69R4卻編碼包含TMPRSS2切位的所有三個ACE2結構域(殘基：1～740，SEQ ID NO：21)。為證實SI-F019免遭TMPRSS2特異性蛋白水解作用，使用SI-69R4作為對照。為進行TMPRSS2特異性水解的測定，依據Genbank：NP_001358344.1來選殖、表現及純化TMPRSS2 (106～492)催化結構域。如圖2A所示，不存在TMPRSS2時，SI-F019及SI-69R4兩者皆穩定遷移至其各自的分子量(變性情況下為單體)。當添加TMPRSS2時，SI-F019顯露出其TMPRSS2抗性，而SI-69R4卻經歷如預測指出其對TMPRSS2敏感性的蛋白水解作用。因此，SI-F019係為穩定且抗TMPRSS2介導蛋白酶活性。 範例4：SI-F019發揮ACE2酵素活性

SI-F019為經截斷ACE2 (殘基18～625)及IgG1 Fc無效片段的融合蛋白。經截斷ACE2編碼鋅金屬肽酶，其酵素活性可藉由使用已確立的測定法再評估。使用具有MCA (7-甲氧基香豆素-4-乙酸)螢光標記物[MCA-YVADAPK Dnp)-OH螢光肽基質(MCA-YVADAPK (Dnp)-OH Fluorogenic Peptide Substrate)]的ACE2肽基質來量測SI-F019的ACE2酵素活性。製備MCA分子做為游離螢光團定量的標準曲線校正，以及將基質稀釋於DMSO中至0.97 mg/ml。將SI-F019稀釋成100、200及300 ng/ml，並用於試管內使螢光肽斷裂以釋出游離MCA。測定法在室溫下培養20分鐘，並以每間隔2分鐘的時間點收集螢光信號數據。

使用MCA標準曲線定量斷裂的MCA之莫耳。如圖2B (MCA量對時間)所示，依據線性曲線的斜率判定酵素活性。SI-F019在三個濃度中皆呈現出良好線性度(R² ＞ 0.99)，這表明了肽的穩定斷裂具濃度依賴性。為計算酵素活性，斜率除以SI-F019的質量數(μg)。最終酵素比活性為568  pmol/min/μg。SI-F019保留膜ACE2酵素活性的事實表明了此ACE2的獨立結構域也保留了供宿主受體與病毒交互作用的結構構形。 範例5：SI-F019抑制活SARS-CoV-2感染VeroE6細胞

在試管內測試SI-F019抑制活SARS-CoV-2感染及溶解VeroE6 (ATCC：CRL-1586)細胞的能力。將範圍自1.5 nM至1200 nM測試濃度的SI-F019與三種濃度的活SARS-CoV-2病毒(病毒株USA-WA1/2020，相當於100倍範圍的感染劑量，MOI)預培養1小時，接著添加至90%匯合(90% confluent)的單層VeroE6細胞。1小時後，移除含病毒培養基並以匹配測試濃度之含SI-F019培養基取代，執行三重複的測試。藉由中性紅染劑攝入72小時之後量測細胞存活率，並藉由與其中不含SI-F019但添加各MOI之病毒的盤孔(well)比較來判定溶菌病毒感染的抑制百分比。使用GraphPad Prism軟體來計算各病毒濃度(1 MOI = 40,000病毒顆粒)的50%抑制濃度(IC50)，並將其顯示餘各圖表中。SI-F019與活SARS-CoV-2的預培養在所有三個經測試之病毒MOI下皆達到100%的劑量依賴性感染阻斷。如圖3所示，SI-F019在MOI為1.0時中和40,000個之多的病毒顆粒，且IC50為97.62 nM。在MOI為0.1及0.01時，SI-F019能各自在79.95 nM及36.5 nM的IC50阻斷感染。 範例6：SI-F019減少病毒複製及再感染

針對SI-F019抑制複製及再感染的能力測試之，也就是從先前以低MOI之SARS-CoV-2或SARS-CoV-1病毒感染之細胞進一步將感染轉移至VeroE6細胞。將90%匯合單層的VeroE6細胞(～20,000個細胞)在0.01的MOI下(經計算為400個病毒感染性顆粒)暴露至SARS-CoV-2 (病毒株USA-WA1/2020)或SARS-CoV-1 (病毒株Urbani 2003000592) 1小時。在清洗掉游離病毒顆粒後，以三重複將範圍在10 fM至100 nM的SI-F019添加至細胞，並將細胞培養物保持72小時。藉由中性紅染劑攝入判定細胞存活率並計算病毒細胞毒性抑制%。使用表示100%細胞存活率之無病毒或無藥物(NVND)條件的最大吸光以及使用方程式： %細胞生存 = [(Well OD₅₄₀ -VND OD₅₄₀ )/ (NVND OD₅₄₀ -VND OD₅₄₀ )]*100 確立最大細胞死亡數的病毒/無藥物(VND)之平均吸光值，在各培養盤上常態化吸光值。

如圖4所示，添加濃度為10 fM的SI-F019保護Vero E6細胞免於二次感染。以0.01之MOI感染SARS-CoV-2或SARS-CoV-1病毒1小時的培養物減少了至少20%的細胞溶解。然而，當SI-F019濃度增加10倍的增加量而高至100 nM時，在此測定中並無觀察到保護性顯著增加。該發現表明了對以低病毒效價感染的細胞而言，即便以低濃度添加SI-F019也可減少病毒傳播還有細胞毒殺作用的程度。 範例7：SI-F019抑制假病毒感染HEK293T-ACE2細胞

藉由人類ACE2蛋白的慢病毒轉導生產HEK293T (ATCC：CRL-3216)-3D4殖株細胞株。藉由酵素基質轉化測定及藉由FACS以特異性抗體結合來確認表現人類ACE2的功能。自中國藥品生物製品檢定所(National Institute for the Control of Pharmaceutical & Biological Products)獲得含有螢光酶報導基因的SARS-CoV-2 S蛋白包裝假病毒。依據製造商說明書執行測試。將S-假病毒原液稀釋於MRD為20的培養物培養基中以產出300 TCID50/盤孔的病毒載量。將濃度範圍在0.07 nM至1500 nM的SI-F019與稀釋的病毒溶液預培養1小時。將HEK293T-3D4細胞分散至96孔盤中。1小時後，將混合物添加至細胞盤中。藉由測試培養24小時後的螢光酶活性來量測感染細胞。使用GraphPad Prism軟體來計算定義之病毒載量的50%抑制濃度(IC50)。圖5顯示出在以假病毒預培養後，SI-F019以劑量依賴方式抑制病毒感染並在較高濃度達到完全抑制(IC50= 32.56 nM)。 範例8：SI-F019減少ADE發生率

抗體依賴性增強反應(ADE)為一種現象，在該現象中病毒結合至次佳抗體而增進其入侵宿主細胞。在COVID-19案例中，SARS-CoV-2病毒對具有由初次感染而發展出抗SARS-CoV-2抗體的患者或已接種疫苗的個體的二次感染可能導致藉由單核球與B細胞的病毒攝入增強。與病毒接觸的抗病毒抗體可結合至表現在特定免疫細胞上的Fc受體或結合至一些補體蛋白。後者的結合依賴抗體的Fc區。典型地，病毒經歷稱之為吞噬作用之過程的降解，宿主細胞藉由吞噬作用通過細胞膜(plasma membrane)將病毒顆粒吞噬。然而，若由於低親和力之結合或靶向非中和之抗原決定基而使病毒未被抗體中和，抗體結合可能會產生病毒逃逸。於是，後果就是抗體增進感染。

透過天然免疫或接種疫苗過程，抗體發展出野生型Fc區。儘管SI-F019能與抗棘蛋白抗體競爭結合至SARS-CoV2病毒，但IgG1 Fc無效片段無法結合至Fc受體或C1q (請參閱表3)。為證實其在減少ADE效果上的比較性優勢，針對SI-F019評估其在內化、複製及再感染中的角色。

在量測Fc媒介內化的測定中，將SARS-CoV-2 S 蛋白包裝至GFP表現假病毒(PsV)中，以及使用表現Fc受體及補體受體2 (CR2)的THP1 (單核球)及Daudi (B細胞)兩種細胞株來測定FcRγ及CR2媒介的ADE機制。使用SI-69R3做為SI-F019的對照，與具有IgG1 Fc無效修飾的SI-F019相比SI-69R3具有野生型的Fc (請參閱表1)。在暴露至PsV 48小時之後，定量來自細胞的綠螢光信號做為PsV感染的指標。在以PsV與SI-69C1 (抗S1抗體)處理或PsV與SI-69R3處理的條件中，於THP1 (pH 7.2) (6A)、THP1 (pH 6.0)(6B)及Daudi (6C)細胞中在48小時之時量測到低程度綠螢光。此結果表明一些PsV轉移可經由Fc受體發生。相反地，在指示濃度之SI-F019條件下，THP1或Daudi細胞不產生PsV攝入，其與包括測定培養基、配方緩衝液及SI-69C1的陰性對照條件下量測到的綠螢光信號不相上下(圖6)。當使用1 pM至高達100 nM範圍的劑量執行細胞處理時，Fc介導ADE的效果呈劑量依賴性。這表明了某些PsV攝入可透過FcγR或CR2機制發生。 範例9：SI-F019減少PsV病毒載量

由於缺乏功能性Fc片段，SI-F019可不介導包裝S蛋白之GFP表現假病毒(PsV)的內化。為判定是否SI-F019能抑制假病毒攝入，在競爭模式中使用SI-F019做為與SI-69R3或天然抗SARS-CoV-2抗體的共處理。在感染同系列標靶細胞之前，將PsV與劑量範圍1 pM至100 nM的SI-F019共同與10 pM的抗SARS-CoV-2 (S1)抗體或10 pM的SI-69R3培養1小時。偵測PsV衍生之GFP信號做為感染的病毒載量。SI-F019能抑制在標靶細胞中始於10 fM的PsV病毒載量(圖7)。

雖然顯示出抗體(例如抗SARS-CoV-2 (S1)抗體)以及SI-69R3中經截斷ACE2野生型Fc片段之融合蛋白皆能介導SARS-CoV-2棘蛋白假性慢病毒的內化，但由於SI-F019缺乏功能性Fc片段，因此不能介導內化。本文中，在10 pM的抗SARS-CoV-2 (S1)抗體或10 pM的SI-69R3存在的情況下，即便是在10 fM的低濃度時，SI-F019幫助減少PsV病毒載量。整體來說，這些結果表明SI-F019可減少各自在THP1單核球及Daudi B細胞中藉由FcRγ及CR2依賴性機制所誘發的ADE發生率。 範例10：表現SARS-CoV-2棘蛋白的HEK293-T細胞

藉由轉導包裝有編碼SARS-CoV-2棘蛋白之cDNA (登錄號：YP_009724390.1)的慢病毒以及IRES表現與基於嘌呤黴素抗性的選擇來確立穩定表現SARS-CoV-2棘蛋白的HEK293-T細胞(ATCC：CRL-3216)，該嘌呤黴素抗性藉由相同的表現建構體(LPP-CoV219-Lv105-050，GeneCopoeia)驅動。藉由人類IgG殖株AM001414的結合來確認SARS-CoV-2棘蛋白表現，AM001414對SARS-CoV-2棘蛋白的「抗棘蛋白(Anti-Spike)」(SKU938701，Biolegend)具特異性，以及使用人類同型匹配殖株QA16A12做為對照「同型」(SKU403502, Biolegend)。如圖8所示，藉由與多株抗人類Fc AF647 Fab (SKU109-607-008，Jackson ImmunoResearch)二次培養以及FACS評估來定量結合的蛋白質。

以指示材料將表現SARS-CoV-2棘蛋白的HEK293-T細胞及親代HEK293細胞在37^o C且存在內化抑制劑疊氮化鈉的情形下進行30分鐘的染色。在移除游離SI-F019之後，藉由使用抗人類Fc AF647 fab (SKU109-607-008，Jackson ImmunoResearch)以及流式細胞儀分析來偵測與定量SI-F109。如圖9所示，使用幾何平均信號強度來定量SI-F019與標靶細胞株的結合。表現SARS-CoV-2棘蛋白的HEK293-T細胞可當作COVID-19感染細胞的模型。 範例11：SI-F019對抗體依賴之細胞性細胞毒殺作用(ADCC)之效果

抗體依賴之細胞性細胞毒殺作用(ADCC)是針對病毒感染的重要免疫反應中的一種，該病毒感染例如在COVID-19案例中SARS-CoV-2病毒感染。在初始病毒感染後，抗病毒抗體直接結合至病毒顆粒以中和並凝集。病毒-抗體複合體與吞噬細胞上Fc受體的結合能觸發吞噬作用而摧毀病毒；結合至例如單核球、嗜中性球、嗜酸性白血球及NK細胞的免疫效應子細胞上的Fc受體能觸發細胞毒性因子(例如：抗病毒干擾素)釋出，而產生對病毒複製不友善的微環境。

為區別SI-F019及抗棘蛋白抗體的效果，以鈣黃綠素裝載表現SARS-CoV-2棘蛋白的HEK293-T細胞，並與純化的人類NK細胞以效應子比標靶為5：1的比例共培養。測試的處理包括SI-F019及S1特異性人類IgG殖株SI-69C3。SI-69C3為人類抗體殖株CC12.3，其分離自住院的COVID-19患者(10.1126/science.abc7520)。在共培養12小時之後，以碘化丙啶將細胞染色並評估存活率。如圖10所示，評估基於鈣黃綠素及碘化丙啶染色之表現的存活標靶細胞頻率(族群3)的減少做為胞解度量單位(a measure of cytolysis)。

NK細胞介導的ADCC可與暴露至S1特異性人類IgG殖株SI-69C3 (殖株CC12.3)時的表現SARS-CoV-2蛋白的HEK293-T細胞有關。SI-F019在100 nM至100 fM的處理範圍內相較於SI-69C3並不介導ADCC。如圖11及圖12所示，在這些測定條件下，具wt Fc的SI-F019藥物變體(SI-69R3)能以劑量依賴方式介導ADCC，但相較於S1特異性人類IgG殖株CC12.3的活性程度較低。這些數據表明了與SARS-CoV-2 S1特異性人類IgG抗體不同的是，SI-F019不會介導NK細胞所介導的ADCC。 範例12：SI-F019對補體依賴性細胞毒殺作用(CDC)的效果

COVID-19患者中基於抗體的細胞及組織傷害介導的補體級聯(complement cascade)角色可見於天然免疫反應及基於中和性抗體的治療(Perico等人，2021)兩者中。由病毒及特異性IgG形成的免疫複合物介導補體誘發的血液凝固、血栓性栓塞及全身性微血管病變。這些在COVID-19患者中的普遍併發症能危及性命且取決於補體蛋白結合至IgG。透過C1q橋接紅血球細胞與具有FcγRIIA之血小板的病毒免疫複合物是COVID-19患者中血栓性栓塞的媒介物(Nazy等人，2020)。免疫複合物固著至內皮血管壁以及補體介導的凝血是患有COVID-19之患者主要擔心的事，其中內皮細胞的活化是血栓性栓塞級聯的一部分。

如表3所示，不同於天然IgG抗體，SI-F019無法結合C1q。此特徵消除可瞬間在其表面上表現SARS-CoV-2棘蛋白的經感染之上皮與內皮誘發之細胞死亡的風險。與抗棘蛋白人類IgG抗體相較證實了此SI-F019的保護性效果。

為證實SI-F019的保護性效果，將表現SARS-CoV-2棘蛋白的HEK293-T細胞培養於不含血清的培養基(Optimem)處理30分鐘，接著以1：10的血清比培養基之比例添加人類補體。測試的處理包括SI-F019及S1特異性人類IgG殖株AM001414。在每個盤孔中添加碘化丙啶染色以及計數正染色細胞之前，將細胞於37^o C培養3小時。如圖12及圖13所示，將在第3小時之時以Incucyte Zoom Software計數的紅色細胞評估為CDC的度量單位(a measure of CDC)。如圖13展示的，在96小時之後評估總細胞匯合度作為CDC影響力的度量單位。

在人類血清補體挑戰後，藉由這些細胞進一步增殖的能力來進一步確認保護組織細胞免於補體損傷。以1：10之體積對體積比例的人類血清補體與不含血清培養基所介導的CDC可評估暴露至S1特異性人類IgG殖株(殖株AM4141)時表現SARS-CoV-2 S蛋白的HEK293-T細胞。結果表明人類可溶性單體ACE2及SI-F019兩者皆不介導CDC，反之與人類IgG抗體相較，SI-69R3具有經限制的劑量依賴性增加CDC活性。CDC細胞溶解反映於基於處理後96小時之時的盤孔匯合度之減少的細胞生長。 範例13：PBMC培養物中由可溶或盤結合SI-F019所引起的細胞激素釋出

SARS-CoV-2具有對呼吸道及小腸的ACE2-表現上皮細胞具有向性。表明為細胞激素釋放症候群(CRS)之升高的IL-2、IL-6、IL-7、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ誘導蛋白10 (IP-10)、單核球趨化蛋白1(MCP-1)、巨噬細胞發炎蛋白1α(MIP-1α)以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的臨床實驗室發現暗示隱含的免疫病理學。CRS為能限制生物製劑治療運用的主要的不良副作用，以及使用試管內細胞激素釋出測定來測試CRS。

SI-F019是由人類ACE2及無法結合至Fc受體的突變形式人類IgG1 Fc所組成的融合蛋白。因此，並不期望SI-F019結合至周邊血液中任何的標靶細胞或引起細胞激素釋出。將分離自5名健康捐贈者，包括嗜中性球的白血球細胞(WBC)放置在含有濃度為2000 nM及200 nM之盤結合或可溶SI-F019的培養盤孔中。

由於在此測定的盤結合形式中，其證據充分之誘發細胞激素釋出的能力，以相同濃度及相同形式使用TGN1412抗體做為陽性對照。藉由與具有能結合Fcγ受體的野生型Fc片段的SI-69R3相較來評估IgG1 Fc無效片段減少細胞激素釋出的潛在貢獻，該些Fcγ受體由周邊血液中的數種細胞類型表現。使用相似稀釋度之SI-F019用的僅含配方緩衝液WBC培養物做為陰性對照。收集在第24及48小時之時點的培養物上清液，並使用Meso Scale Discovery (MSD)平台來偵測9種存在的細胞激素。

如圖14A～14E所示，細胞激素小組包括T細胞相關細胞激素IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL-2以及IL-10。如圖14F～14I所示，亦測試下列物質的促炎性程度，非T細胞相關細胞激素IL-1β、IL-12p70及IL-6，還有單核球趨化蛋白MCP-1。平均來自每位血液捐贈者重複盤孔的結果，並使用JMP14軟體繪製來自每位血液捐贈者重複盤孔的箱型圖，該箱型圖顯示出95%可信區間及離群值。

結果表明在200 nM及2000 nM濃度下，不論在盤結合形式或可溶形式中，SI-F019不會自暴露之WBC誘發任何所測試的細胞激素。SI-F019處理樣品中細胞激素的程度呈現類似於所有條件下緩衝液對照的濃度。在盤結合形式而不在可溶形式中，陽性對照TGN1412激烈誘發大部分細胞激素，這與先前發表的結果吻合。當使用盤結合ACE2-Fc野生型刺激WBC時，可偵測到一些中間產生的IFNγ、GM-CSF及TNFα，這表明了SI-F019的Fc無效片段增強的安全性。

近來已提出在接受介入性IgG療法的患者中，抗SARS-CoV-2病毒體液反應的致病性角色(Weinreich 等人，2021；Chen等人，2021)。小血管過度發炎反應為包括血小板增多、搔癢、發熱及高血壓之不良事件的基礎。本案證實SI-F019可提供與IgG療法之益處相當的病毒中和的益處，同時保護組織與器官免於多重途徑的功能異常。因此，可將SI-F019用於治療、預防或緩和病毒感染，具體來說用於預防及管理COVID-19病程並減少臨床併發症，以及另外用於急性呼吸道窘迫症候群、肺動脈高壓或急性肺傷害。 表

表1  重組ACE2-Fc融合蛋白的選殖、表現及純化

重組融合蛋白	樣品 ID	純化的融合蛋白
huACE2 (1-615) - 6His-標記	SI-69R1 SI-69R3 SI-69R4	huACE2 (18-615) - 6His-標記
huACE2 (1-615) - IgG1 Fc (w2)	huACE2 (18-615) - IgG1 Fc (w2)
huACE2 (1-740) - IgG1 Fc (w2)	huACE2 (18-740) - IgG1 Fc (w2)
huACE2 (1-615) - IgG1 Fc 無效段	SI-69R2	SI-F019	huACE2 (18-615) - IgG1 Fc 無效段
huACE2 (1-615) - IgG4 Fc	SI-69R2-G4 SI-69R2-A1 SI-69R2-A2	huACE2 (18-615) - IgG4 Fc
huACE2 (1-615) - IgA1 Fc	huACE2 (18-615) - IgA1 Fc
huACE2 (1-615) - IgA2 Fc	huACE2 (18-615) - IgA2 Fc

表2  SI-F019結合至病毒蛋白的親和力及總親合力

	親和力 (nM)	Kon (1/ms)	Kdis (1/s)	總親合力 (nM)	Kon (1/ms)	Kdis (1/s)
CoV2 S1	14.7	3.37E+05	4.93E-03	0.29	1.49E+05	4.72E-05
CoV2 RBD	13.8	3.45E+05	4.79E-03	0.89	3.09E+05	2.70E-04
CoV RBD	14.0	4.26E+05	5.97E-03	0.33	5.18E+05	1.71E-04
CoV2 棘蛋白三聚體	NA	NA	NA	0.18	4.20E+04	1.12E-05

表3 Fc無效突變在其結合至Fc受體上的效果

Fc受體	KD (nM)	Kon (1/ms)	Kdis (1/s)
FcγRI/CD64	無法偵測
FcγRIIa/CD32a	無法偵測
FcγRIIb/CD32b	無法偵測
FcγRIIIa/CD16a	無法偵測
C1q	無法偵測
FcRn	37.6	4.51E+05	3.52E-0.2

無

本案揭示內容之前述及其他的特徵經由以下的詳細說明及附加的申請專利範圍並結合附圖，將變得更加顯而易見。應理解這些附圖僅描繪出依據本揭示內容所配置的數種實施例，因此不應視作其範圍之限制，將透過使用附圖，並以附帶的具體內容與細節來說明本揭示內容，其中： 圖1顯示出(1A)由ACE2功能結構域至生物工程化的Fc(無效段)片段的重組融合蛋白(SI-69R2以及SI-69R4)之圖解，(1B) SI-F019融合蛋白之序列，為缺乏N端17個胺基酸信號肽的轉譯後修飾SI-69R2，(1C) 粒徑篩析層析指出SI-F019融合蛋白複合體為同質二聚體，以及(1D) SI-F019-棘蛋白複合體之圖解； 圖2顯示出SI-F019，而不是SI-69R4，為抗TMPRSS2依賴型水解(2A)，以及可以試管內(in vitro )的螢光測定法定量SI-F019的酵素活性(2B)； 圖3證實活SARS-CoV-2感染VeroE6細胞的SI-F019劑量依賴型阻斷在測試中的三個病毒MOI皆已達到100%； 圖4顯示出以0.01之MOI的SARS-CoV-2或SARS-CoV-1病毒進行病毒感染的一小時後，添加10 fM或超過的SI-F019保護了一部分Vero E6細胞免遭細胞溶解； 圖5顯示出在與假病毒預培養之後，SI-F019以劑量依賴方式抑制病毒感染並在較高濃度達到完全抑制(IC50 = 32.56 nM)； 圖6顯示出在THP1 (pH 7.2)(6A)、THP1 (pH 6.0)(6B)以及Daudi (6C)中48小時之時的內化/感染介導測定結果，當以測試濃度的SI-F019連同培養基、緩衝液及ACE2-his (SI-69C1)預處理時，未見表明為假病毒(PsV)之GFP信號的攝入，儘管SI-69C1 (抗S1抗體)及SI-69R3 (SARS-CoV-2 ACE-2 Fc WT) 與低GFP信號相關聯； 圖7顯示出SI-F019能與天然抗SARS-CoV-2抗體或ACE2-Fc(野生型)融合蛋白競爭，以阻斷如GFP信號所量測到的Fc介導式抗體依賴性增強反應(ADE)，該GFP信號表明為PsV感染； 圖8顯示出藉由使用抗棘蛋白抗體及抗人類Fc抗體所偵測到的表現SARS-CoV-2棘蛋白之HEK293-T細胞的流式細胞儀分析； 圖9顯示出藉由幾何平均螢光強度(gMFI)所量測到的SI-F019對表現SARS-CoV-2棘蛋白之HEK293-T細胞的劑量依賴型結合； 圖10展示抗體依賴之細胞性細胞毒殺作用(ADCC)測定之FACS分析，其顯示出如藉由鈣黃綠素(Calcein-AM)及碘化丙啶(Propidium Iodide)染色所量測到的，人類抗S1抗體(SI-69C3)將人類NK細胞導向表現SARS-CoV-2棘蛋白之標靶HEK293-T細胞； 圖11顯示出當與人類抗S1抗體(SI-69C3)相較時，在100fM至100 nM間之治療劑量的SI-F019並不會介導ADCC，然而其具有野生型Fc的變體(SI-69R3)卻為抗體依賴方方式，即使活性程度較低； 圖12顯示出在試管內藉由表現SARS-CoV-2 S蛋白之HEK293-T細胞存活率所量測到的，Fc無效突變能使SI-F019減少血清介導的補體依賴性細胞毒殺作用(CDC)； 圖13顯示出在試管內藉由量測在各種處理之後表現SARS-CoV-2 S蛋白之HEK293-T細胞的存活率，SI-F019並不會誘發血清補體依賴性細胞毒殺作用(CDC)(13A)；及在試管內處理後的第96小時，SI-F019的Fc無效突變不影響後續細胞生長(13B)；以及 圖14顯示出在PBMC培養中無論是可溶或盤結合形式，SI-F019並不引起細胞激素釋出：(14A) IFNγ；(14B) TNFα；(14C) GM-CSF；(14D) IL-2；(14E) IL-10；(14F) IL-6；(14G) IL-1β；(14H) IL-12p70；以及(14I) MCP-1。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (37)

1. 一種融合蛋白，包含共價融合至一Fc結構域的一變體血管收縮素轉化酶2 (ACE2)結構域，其中該變體ACE2結構域包含一N端缺失、一C端缺失或兩者皆缺失，該變體ACE2結構域相對於全長野生型ACE2具有SEQ ID NO：1，其中該變體ACE2結構域具有ACE2活性。
2. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該變體ACE2結構域包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與來自該全長野生型ACE2的胺基酸序列的一區段具有至少98%的序列一致性，其中該區段由選自該全長野生型ACE2的殘基1～17的胺基酸殘基開始並至選自該全長野生型ACE2的殘基615～740的胺基酸殘基結束。
3. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該變體ACE2結構域包含與SEQ ID NO：3具有至少98%序列一致性的一胺基酸序列。
4. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該變體ACE2結構域相較於對該全長野生型ACE2，對SARS-CoV或SARS棘蛋白具有較高結合親和力(binding affinity)。
5. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域衍生自一免疫球蛋白的一Fc結構域，其中該免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 (d-IgA1、S-IgA1)、IgA2、IgD、IgE或IgM
6. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域包含一Fc鉸鏈區，以及其中該Fc鉸鏈區生物工程化為C220S。
7. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域與具有SEQ ID NO：5的一野生型Fc結構域比較時，包含選自K322A、L234A以及L235A的一無效突變。
8. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域包含與SEQ ID NO：6具有至少98%序列一致性的一胺基酸序列。
9. 如請求項1所述之融合蛋白，包含與SEQ ID NO：7、9、11、13、15、16、17、18、19或21具有至少98%序列一致性的一胺基酸序列。
10. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域缺乏效應子功能。
11. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域缺乏ADCC、ADCP及CDC。
12. 如請求項1所述之融合蛋白，其具有一約50 kDa至250 kDa的分子量。
13. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該Fc結構域包含一IgG1 Fc結構域。
14. 一種融合蛋白複合體，包含如請求項1所述的兩個融合蛋白，其中該兩個融合蛋白藉由一雙硫鍵成對。
15. 如請求項14所述的融合蛋白複合體，其中該兩個融合蛋白藉由該Fc結構域上的兩個雙硫鍵成對。
16. 如請求項14所述的融合蛋白複合體，其中該蛋白複合體具有一約190 kDa至300 kDa的分子量。
17. 如請求項1所述的融合蛋白，其中該融合蛋白具有對SARS-CoV-2、SARS-CoV或SARS棘蛋白的一結合親和力，該結合親和力具有不大於50 nM的一平衡解離常數。
18. 一種蛋白複合體，其與病毒蛋白結合，且包含如請求項1所述的融合蛋白或如請求項14所述的融合蛋白複合體。
19. 如請求項18所述的蛋白複合體，其中該病毒蛋白包含SARS-CoV-2、SARS-CoV、SARS棘蛋白、冠狀病毒、SARS病毒或前述物質的片段或組合。
20. 一種經分離核酸，編碼如請求項1所述的融合蛋白。
21. 一種表現載體，包含如請求項20所述的經分離核酸。
22. 一種宿主細胞，包含如請求項20所述的核酸，其中該宿主細胞為一原核細胞或一真核細胞。
23. 一種製造一融合蛋白的方法，包含以下步驟:培養如請求項22所述的宿主細胞，以便製造融合蛋白。
24. 一種蛋白接合物，包含如請求項14所述的融合蛋白複合體及一藥物部分，其中該藥物部分藉由一連接子連接至該融合蛋白，以及其中該連接子包含選自一酯鍵、一醚鍵、一胺鍵、一醯胺鍵、一雙硫鍵、一醯亞胺鍵、一碸鍵、一磷酸鍵、一磷酯鍵、一肽鍵、一腙鍵或前述之組合的一共價鍵。
25. 如請求項24所述之蛋白接合物，其中該藥物部分包含一抗病毒劑、一免疫調節劑、一顯影劑或前述物質的組合。
26. 如請求項25所述之蛋白接合物，其中該抗病毒劑選自法維拉韋(favipiravir)、雷巴威林(ribavirin)、戈利德西韋(galidesivir)、瑞德西韋(remdesvir)或前述物質的組合。
27. 如請求項25所述之蛋白接合物，其中該顯影劑可為射性核種、一螢光劑、一量子點或前述物質的組合。
28. 一種醫藥組成物，包含如請求項14所述的融合蛋白複合體及一醫藥學可接受的載劑。
29. 如請求項28所述之醫藥組成物，進一步包含一抗病毒劑。
30. 一種醫藥組成物，包含如請求項24所述的蛋白接合物及醫藥學可接受之載劑。
31. 一種如請求項14所述的融合蛋白複合體在製造用於治療或預防一患者中病毒感染、急性呼吸道窘迫症候群、肺動脈高壓或急性肺傷害的一醫藥品之用途，其中將有效量的該醫藥品投與該患者。
32. 如請求項31所述之用途，進一步包含共同投與有效量的一治療劑的步驟，其中該治療劑包括一抗病毒劑。
33. 如請求項31所述之用途，其中該患者為一哺乳類。
34. 如請求項31所述之用途，其中該病毒感染包含SARS-CoV-2、SARS-CoV、SARS棘蛋白、冠狀病毒、SARS病毒或前述之片段或組合的感染。
35. 如請求項31所述之用途，其中投與該醫藥品係藉由靜脈、皮下、經鼻道或經肺通道投與。
36. 一種溶液，包含一有效濃度的如請求項14所述的融合蛋白複合體，其中該溶液為一患者的血漿。
37. 一種溶液，包含如請求項18所述的蛋白複合體，其中該溶液為一患者的血漿。

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