CN112375149A

CN112375149A - Ace2免疫融合蛋白及其应用

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Publication number: CN112375149A
Application number: CN202011192863.5A
Authority: CN
Inventors: 胡适; 傅文燕
Original assignee: Fengchao Medical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Fengchao Medical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2040-10-30
Also published as: CN112375149B

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了ACE2免疫融合蛋白及其应用。该ACE2免疫融合蛋白结构通式为Z1‑Z2，其中Z1为ACE2或其功能变体或片段，Z2为IgA重链恒定区或其功能变体或片段。通过实验证实，ACE2‑IgA免疫融合蛋白增强了ACE2酶活，有效增强抗免疫细胞IgA受体活化、增强ACE2依赖的免疫细胞吞噬和清除作用、降低的免疫细胞分泌作用，而ACE2‑IgG型融合蛋白无类似作用。通过动物模型实验，免疫融合蛋白能够减少脏器炎症介质过度表达释放、减轻脏器炎症损伤、增强脏器抗应激能力、抵抗脏器损伤。通过单独应用或与其他相关病症药物联用，能有效治疗ACE2下调和或功能紊乱导致的炎性介质相关性疾病，具备广阔的临床应用前景。

Description

ACE2免疫融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及ACE2免疫融合蛋白、其制备方法及其应用。

背景技术

当动物细胞或组织受到细菌、外伤、毒素、物理或化学因素(其可以统称为“炎性物质，inflammatory agent”)损伤时，会发生炎性应答。炎症应答的病理生理特征受到由细胞合成并释放的多种促炎或抗炎剌激物或介质的复杂相互作用的调节。一些己知种类的促炎、抗炎剌激物或介质包括细胞因子、氧化亚氮、血栓皖(thromboxane)、自兰烯、磷脂样血小板活化因子、前列腺素、激肤、补体因子、凝血因子、超抗原、单核因子、趋化因子、干扰素、自由基、蛋白酶、花生四烯酸代谢物、环前列腺素、β内啡肽、心肌抑制因子(myocardialdepressant factor)、anadamide，2-花生酷甘油(2-arachidonoylglycerol)、四氢生物蝶岭、细胞碎片以及化学物质(包括组胺、缓激肽和血清素)等。

根据被侵袭的位置、炎性物质的性质以及所涉及的促炎或抗炎剌激物或介质的相互作用，炎性应答的性质和强度不同。当受到调节并且为局限性时，炎性应答是有益的。但是如果不受调节并且广泛化时，炎性应答可造成显著的组织损伤甚至死亡。

近年来，高度耐药的微生物感染成为临床常见的棘手问题。由于患者救治时间延长，微生物在体内进一步进化，产生如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resist-antStaphylococcus aureus，MRSA)等“超级耐药菌”，耐药微生物在体内持续存在，使得参与炎症的细胞因子网络调控紊乱，因此开发能抑制整个微生物-免疫系统作用的药物成为前沿热点。尽管利用超剂量的抗生素可以杀灭微生物，但死亡微生物可以进一步介导炎症因子风暴，且大剂量抗生素造成患者肝肾损害，依然无法对抗疾病。

血管紧张素转化酶2(ACE2)是组织肾素-血管紧张素系统的关键酶，也是部分病原微生物如冠状病毒等的关键受体。ACE2基因编码的蛋白属于二肽基羧基二肽酶的血管紧张素转换酶家族，其分泌的蛋白质催化血管紧张素I分裂成血管紧张素1-9，同时将血管紧张素II分裂成血管紧张素1-7。血管紧张素1-7通过作用于Mas受体，起到舒张血管、抗增生、抗氧化应激的心血管保护作用。

近年来的一些报道认为在多种病理过程中，ACE2的下调可以导致组织内部炎症介质的进一步紊乱。但目前尚未有如何针对ACE2下调或功能障碍介导的病理状况系统性的治疗研究。一些基于ACE2的重组蛋白类候选药物在动物模型的急性炎症损伤研究中显示了一些治疗效果，但这些候选药物在相关疾病治疗的确切地位尚未明确。

发明内容

本发明的目的在于，依托上述研究背景，对ACE2蛋白的工程化应用进行探索，并对其生物学活性进行探究。在研究的过程中，申请人意外的发现，利用免疫球蛋白A(ImmunoglobulinA，IgA)的功能结构与ACE2蛋白融合，可显著提高的ACE2的生物学活性。即本发明公开了融合有免疫球蛋白A的ACE2免疫融合蛋白ACE2-IgA、其制备方法和用途。

本发明的第一方面，对ACE2-IgA免疫融合蛋白的多肽链结构进行描述，其结构通式为Z1-Z2，其中Z1为ACE2或其功能变体或片段，Z2为IgA重链恒定区或其功能变体或片段。

所述ACE2在国际数据库编码为Entrez Gene:59272；UniProtKB:Q9BYF1。

所述IgA重链恒定区在国际数据库编码为Entrez Gene:3493；UniProtKB:P01876或Entrez Gene:3494；UniProtKB:P01877。其中IgA还包括其亚型和同种异型，可参考非专利文献[Lombana TN,Rajan S,Zorn JA,et al.MAbs.Taylor&Francis,2019,11(6):1122-1138.]

此外，二聚化结构域Z2还可以包含有肽接头，该肽接头由15-32个氨基酸残基组成，其中这些残基中的1-8个(例如，2个)是半胱氨酸残基。在具体变化中，Z2包含免疫球蛋白铰链区或其变体。

在某些实施方案中，由于免疫融合蛋白是IgA型，可以进一步采用抗体工程方法形成二聚体或者多聚体，这是领域内的技术人员所熟知的，可以参考非专利文献[KumarN,Arthur C P,Ciferri C,et al.Science,2020,367(6481):1008-1014.]

在某些方面，所述免疫融合蛋白还包括连接肽链(joining chain)或聚合免疫球蛋白受体的分泌部分(secretory component ofthe polymeric immunoglobulinreceptor，SC)中的任一种或两种的组合。包含上述两种多肽使得免疫融合蛋白形成寡聚体或多聚体的分泌形势。

优选的，Z1是ACE2胞外结构域或其功能变体或片段，Z2是人免疫球蛋白IgA的Fc结构域或其功能变体或片段，如采用IgA1或IgA2的Fc结构域。

在本发明的一些优选实施例中，Z1-Z2的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。

在本发明的一些优选实施例中，Z1-Z2的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。

在本发明的一些优选实施例中，Z1-Z2的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。本发明的第二方面，提供了编码上述多肽链的多核苷酸、运载该核苷酸的载体以及包含这种载体的细胞。

本发明提供的表达载体包含下述可操作地连接的元件：转录启动子、编码上述多肽的DNA区和转录终止子。

通过培养包含载体的细胞，用于生产如上公开的多肽，包括：(i)培养包含如上公开的表达载体的细胞，其中细胞表达由所述DNA区段编码的多肽，并生产编码的多肽；(ii)回收可溶性多肽。

本发明的第三方面，提供了所述多肽链的的制备方法，包括以下步骤：

(A)全基因合成编码多肽链的多核苷酸；

(B)采用PCR技术对步骤(A)中获得的多核苷酸进行克隆，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到表达载体中，测序验证后确认获得正确的克隆；

(C)将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。

本发明中，任何合适的载体都适用，优选为pGEM-T、Pet32a，pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4、pDHFR或pDR1，所述表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，哺乳动物或昆虫宿主细胞或原核细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达。可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a、Top10、BL21(DE3)、TG1之一。

本发明的融合蛋白可在以下细胞中容易地产生：哺乳动物细胞，诸如CHO、NSO、HEK293、BHK或者COS细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽自杆菌或荧光假单胞菌；昆虫细胞，或真菌或酵母细胞，所述细胞使用本领域中己知的技术培养。

本发明中公开的融合蛋白的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达、分离、纯化所述融合蛋白。利用上述方法，可以将抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

可采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中己知的并且描述于例如(Wilchek and Bayer,1990,Methods in enzymology)(Scopes,2013,Proteinpurification:principles andpractice)。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，包括活性成分以及药学上可接受的药物载体，所述活性成分包括上述的ACE2免疫融合蛋白、编码该ACE2免疫融合蛋白的核苷酸或运载有ACE2免疫融合蛋白或核苷酸的载体。

该药物组合物以上述多肽为主要或唯一活性成分，辅料可以保证本发明公开的多肽氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)，从而更稳定地发挥疗效。

在药物形式上，可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。

对于本发明公开的上述ACE2免疫融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中，表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能双特异性抗体蛋白的颗粒化趋势最小；溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态；等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

本发明中所述免疫融合蛋白及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天，吸入给药的剂量是1～1800mg/天。

由此，本发明的第五方面，提供了上述融合蛋白及药物组合物的用途，即ACE2免疫融合蛋白在制备治疗ACE2表达水平下调或功能异常介导的炎症介质紊乱相关疾病药物中的用途。

所述ACE2免疫融合蛋白的用途包括：(1)直接结合病原体表面抗原或炎症介质、中和病原体；如实施例2；(2)介导免疫细胞吞噬清除病原体或炎症介质，如实施例3；(3)调节免疫系统紊乱，减少免疫细胞过度释放促炎因子，如实施例4-7；(4)减少脏器炎症介质过度表达释放、减轻脏器炎症损伤、增强脏器抗应激能力、抵抗脏器损伤，如实施例5-10；(5)介导免疫耐受，如实施例11；(6)预防病原体入侵，如实施例13。

所述ACE2表达水平下调或功能异常介导的炎症介质紊乱相关疾病指在特定病理情况下由ACE2表达水平下调或功能异常介导的疾病病理，包括：全身性炎性应答综合征(SIRS)或脓毒症(例如源自病毒、细菌、真菌或寄生虫感染，尤其是以ACE2为受体的微生物或病原体感染，如新型冠状病毒SARS-COV-1和SAR-COV-2)、自身免疫病(如狼疮)、外科手术、细胞毒性化疗、骨髓操作、大的组织损伤或外伤、肠系膜灌注不足、肠粘膜损伤、疟疾、胃肠道炎性疾病、肠道感染、宫腔感染、流行性感冒、急性肺炎如急性呼吸窘迫综合症或急性肺损伤、肺栓塞、胰腺炎、自身免疫和胶原血管病、输血相关疾病、烧伤、烟或吸入肺损伤、移植物抗宿主病、缺血或梗死、再灌注损伤、出血、过敏反应、药物过量、辐射损伤或化学损伤。

在一些实施方案中，所述ACE2表达水平或功能异常介导的炎症介质紊乱相关疾病还包括由生物战的病原体、毒素或制剂导致的ACE2下调或功能紊乱。例如病毒性出血热、水母毒素、汉坦病毒心肺综合征(汉坦病毒)、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、草麻毒素、Q热[博纳特氏立克次氏体(Coxiellaburnetii)]、斑痊伤寒症(Rickettsiaprowaszekii)或鹦鹉热[鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)]。病毒感染相关疾病药物、试剂、试剂盒用途中的任意一种或至少两种的组合。

本发明的有益保障及效果：

本发明独创性的制备了ACE2-IgA免疫融合蛋白，并在实验中意外的发现ACE2-IgA免疫融合蛋白增强了ACE2酶活，有效增强抗免疫细胞IgA受体活化、增强ACE2依赖的免疫细胞吞噬和清除作用、降低的免疫细胞分泌作用，而ACE2-IgG型融合蛋白无类似作用。

通过动物模型实验，免疫融合蛋白能够减少脏器炎症介质过度表达释放、减轻脏器炎症损伤、增强脏器抗应激能力、抵抗脏器损伤。通过单独应用或与其他相关病症药物联用，能有效治疗ACE2下调和或功能紊乱导致的炎性介质相关性疾病，具备广阔的临床应用前景。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如常用的抗体工程方法、那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法、合成细胞、装置、基因回路的构建方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括董志伟，王琰主编《抗体工程》第二版，北京医科大学出版社，2002；Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring HarborLaboratory Press；PhageDisplay:A laboratory Manual,Cold spring HarborLaboratory Press等。

实施例1.重组多肽制备

(1)委托基因合成商(苏州金维智公司)针对本实施例需要的免疫融合蛋白氨基酸序列进行编码核苷酸密码子优化和全基因合成，优化后的核苷酸序列直接装载到PCDNA3.4载体上，所有载体编码后的氨基酸序列描述见表1。

(2)委托蛋白质制备商(义翘神州公司)针对本实施例需要对免疫融合蛋白进行表达纯化。采用文献Finck B K.Science,265.；Mihara M et al..Journal ofClinicalInvestigation.2000；106:91-101；Yu X,et al.Nature Immunology.2009；10:48-57.LiuS,et al.Clin Immunol.2019Jun；203:72-80.)方法，利用293F系统进行瞬时转染表达技术进行蛋白表达，然后利用多肽M、SSL7和离子交换的方法获取大量的重组多肽，SDS-PAGE、western blot、质谱证实目的蛋白。ACE2重组蛋白(rhACE2)和ACE2-IgG融合蛋白的制备参考文献[Monteil V,KwonH,Prado P,et al.Cell,2020.Lei C,Qian K,Li T,etal..Nature communications,2020,11(1):1-5.]。IgA型对照抗体S309的制备参考文献[Pinto,Dora,et al.Nature(2020):1-6.；Ejemel M,Li Q,Hou S,et al.Naturecommunications,2020,11(1):1-9.]

(3)测定免疫融合蛋白对配体结合能力

利用ELISA方法检测免疫融合蛋白对特定配体的结合能力，如表2所示。

(4)测定免疫融合蛋白ACE2酶活

利用文献方法[Xiao F,Burns K D.Hypertension.Humana Press,New York,NY,2017:101-115.]检测融合蛋白ACE2酶活性，各组蛋白浓度为50ng/ml，结果如表3。

表1多肽信息

序号	命名	描述	氨基酸序列
				1	ACE2-IgA1	FUSION-[ACE2]2-FC-ALPHA-1	SEQIDNO.1
2	ACE2-IgA2	FUSION-[ACE2]2-FC-ALPHA-2	SEQIDNO.2
				3	ACE2(short)-IgA1	FUSION-[ACE2-short]2-FC-ALPHA-1	SEQIDNO.3

表2多肽结合能力检测

序号	命名	配体	结合力*
				1	对照IgG	SARS-CoV-2Spike蛋白	无结合力
2	对照IgA	SARS-CoV-2Spike蛋白	无结合力
				3	ACE2-IgG	SARS-CoV-2Spike蛋白	+++
4	rhACE2	SARS-CoV-2Spike蛋白	++
				5	ACE2-IgA1	SARS-CoV-2Spike蛋白	+++
6	ACE2-IgA2	SARS-CoV-2Spike蛋白	+++
				7	S309-IgA	SARS-CoV-2Spike蛋白	+++

*+++：结合力达PM级别；++结合力达NM级别

表3 ACE2酶活检测

组别(药物浓度，50ng/ml)	相对ACE2活性(％)	SD	P值(对比rhACE2组)
				rhACE2	100	0
对照IgG	未检测到	-	-
				对照IgA	未检测到	-	-
ACE2-IgG	70.105	3.738	P＜0.05(恶化)
				ACE2-IgA1	157.925	33.392	P＜0.05
ACE2-IgA2	180.613	22.795	P＜0.05
				S309-IgA	未检测到

结果显示，相比IgG型免疫融合蛋白，本发明所述的IgA型免疫融合蛋白具有ACE2酶活性的促进作用，而IgG型免疫融合蛋白酶活性相比重组蛋白反而降低。

实施例2.免疫融合蛋白对病毒入侵中和作用

首先利用重组病毒系统检测免疫融合蛋白重组SARS-CoV-2S蛋白介导的病毒入侵Vero E6细胞作用，该方法为本领域的常规检测手段，参考非专利文献[Lei C,etal..Naturecommunications,2020,11(1):1-5.].结果如表4：

表4病毒感染情况

组别(药物浓度，5μg/ml)	重组病毒入侵(对比背景荧光强度倍数)	SD	P值(对比阳性对照组)
				空白对照(无病毒)	1.204	0.213
阳性对照(仅病毒)	3622.65	201.66
				rhACE2	1208.37	28.68
对照IgG	3854.327	350.180
				对照IgA	4143.753	203.011
ACE2-IgG	0.927	0.497	P＜0.05
				ACE2-IgA1	1.113	0.932	P＜0.05
ACE2-IgA2	1.115	0.755	P＜0.05
				S309-IgA	1.076	0.563	P＜0.05

这些结果显示免疫融合蛋白具有很强的阻断病毒入侵能力。在中和活性方面本发明所公开的免疫融合蛋白与IgG型ACE2具有类似的中和活性。

实施例3.免疫融合蛋白介导免疫细胞对病毒颗粒的吞噬作用

进一步对外周单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)评估其吞噬病毒颗粒的实验研究，利用流式细胞术检测细胞吞噬病毒颗粒的方法、吞噬分数的计算可以参考非专利文献[Gach J S,et al..PLoS pathogens,2017,13(12):e1006793.]，检测重组病毒用携带FITC的抗S蛋白抗体作为检测手段。利用重组病毒系统制备和利用流式细胞术检测细胞内蛋白是本领域的常规技术，可以参考非专利文献[Fu W,etal.Naturecommunications,2019,10(1):1-12.]。结果如表5：

表5对SARS-CoV-2重组病毒颗粒的吞噬作用

结果显示，相比IgG型融合蛋白，本发明所述的免疫融合蛋白融合多肽显著增加免疫细胞对病毒颗粒的吞噬作用。值得注意的是，IgA型的单克隆抗体介导免疫细胞吞噬病毒颗粒的能力较弱，而比ACE2-IgG更弱。因此，这些结果创造性的提示IgA型的免疫融合蛋白对巨噬细胞的提高作用是ACE2酶活和IgA结构域协同作用的共同效果。

因此，进一步对ACE2的酶活性进行抑制，抑制剂为DX600(购自selleck公司，浓度为1mg/ml)，然后进行病毒颗粒吞噬作用检测，结果如表6。

表6对SARS-CoV-2重组病毒颗粒的吞噬作用

这些结果显示，IgA型免疫融合蛋白介导细胞吞噬病毒能力的增强与ACE2酶活性具有明显的相关性。而IgG型免疫融合蛋白介导的细胞吞噬病毒作用于ACE2酶活性无关。这一研究结果部分解释了IgA型免疫融合蛋白的优势作用。

实施例4.免疫融合蛋白介导免疫细胞吞噬后细胞因子的释放

对实施例3中的各组细胞吞噬病毒颗粒后进行细胞因子的检测，检测方法参考非专利文献[Roybal K T,et al..Cell,2016,164(4):770-779.]，结果如表7-10：

表7免疫融合蛋白介导吞噬病毒颗粒后的GM-CSF的分泌表达情况

表8免疫融合蛋白介导吞噬病毒颗粒后的IL-6的分泌表达情况

表9免疫融合蛋白介导吞噬病毒颗粒后的IL-8的分泌表达情况

表10免疫融合蛋白介导吞噬病毒颗粒后的IL-1β的分泌表达情况

表11免疫融合蛋白介导吞噬病毒颗粒后的IL-10的分泌表达情况

这些结果显示，在吞噬病毒颗粒后，相比IgG型的ACE2融合蛋白，本发明所述的免疫融合蛋白在介导免疫细胞吞噬病毒颗粒后并不明显的释放促炎细胞因子。

这些不寻常的发现让我们进一步对其背后的机理进行了探索。检测免疫细胞经过重组病毒处理后IgA受体激活的水平，利用细胞内IgA受体沉淀物中Syk磷酸化水平评估，方法参考非专利文献[Lang M L,ChenYW,Shen L,et al.Biochemical Journal,2002,364(2):517-525.]结果如表12：

表12免疫融合蛋白介导吞噬病毒颗粒后的IgA受体沉淀物中Syk磷酸化水平

进一步利用小干扰RNA(购自赛默飞世尔)降低细胞的ACE2表达水平，然后检测各处理组免疫细胞Syk磷酸化水平，结果如表13。

表13 ACE2干扰下调后IgA受体沉淀物中Syk磷酸化水平

组别(药物浓度，5μg/ml)	Syk磷酸化(％相对于PBMC)	SD	P值(对比ACE2-IgG组)
				仅PBMC(阴性对照)	100	11.39
空白对照(仅干扰RNA)	10.564	0.812
				rhACE2	31.159	9.749
对照IgG	10.261	0.882
				对照IgA	12.052	2.182
ACE2-IgG	44.565	37.079
				ACE2-IgA1	78.884	14.351	P＜0.05
ACE2-IgA2	87.300	6.826	P＜0.05
				S309-IgA	9.736	1.147	P＜0.05

这些结果显示，在免疫细胞吞噬病毒颗粒，或ACE2下调时，免疫细胞IgA受体的激活水平明显降低，而本发明所述的免疫融合蛋白可以明显的提高受体的激活水平，这些结果部分解释了IgA型ACE2免疫融合蛋白具有非常强的介导免疫细胞吞噬病毒的能力背后的科学机理。

实施例5.免疫融合蛋白对病毒造成急性肺损伤治疗作用

按照非专利文献[Bao L,et al.Nature,2020.]的方法建立人ACE2转基因小鼠SARS-CoV-2疾病模型，正常对照组不感染，空白对照组感染但不采用任何干预，治疗组自感染开始即每2天给与尾静脉治疗性药物10mg/kg每只每次，给与三次，感染6天后进行各组评价，评价方法和指标同专利文献(CN 111018999 A)。结果如表14-19。

表14各组支气管肺泡灌洗液蛋白含量

组别	蛋白含量(g/L)	SD	P值(对比ACE2-IgG组)
				正常对照	0.886	0.105
模型组(空白对照)	10.438	1.442
				rhACE2	9.183	2.145
对照IgG	10.709	1.749
				对照IgA	10.567	1.308
ACE2-IgG	6.109	2.522
				ACE2-IgA1	2.177	0.434	P＜0.05
ACE2-IgA2	1.800	0.231	P＜0.05
				S309-IgA	4.884	2.556	P＞0.05

表15各组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数量

组别	细胞数(10<sup>8</sup>/L)	SD	P值(对比ACE2-IgG组)
				正常对照	1.067	0.145
模型组(空白对照)	10.596	1.361
				rhACE2	10.288	2.981
对照IgG	11.881	1.962
				对照IgA	9.838	1.142
ACE2-IgG	5.863	2.278
				ACE2-IgA1	2.516	1.861	P＜0.05
ACE2-IgA2	1.964	0.408	P＜0.05
				S309-IgA	5.243	2.323	P＞0.05

表16各组肺组织湿干质量比

表17各组肺损伤评分

组别	肺组织评分	SD	P值(对比ACE2-IgG组)
				正常对照	0.188	0.259
模型组(空白对照)	2.688	0.259
				rhACE2	2.750	0.267
对照IgG	2.563	0.320
				对照IgA	2.750	0.378
ACE2-IgG	1.875	0.641
				ACE2-IgA1	0.875	0.443	P＜0.05
ACE2-IgA2	0.813	0.372	P＜0.05
				S309-IgA	1.750	0.655	P＞0.05

表18各组血清SOD活性

组别	SOD活性(U/ml)	SD	P值(对比ACE2-IgG组)
				正常对照	140.705	34.782
模型组(空白对照)	36.288	12.180
				rhACE2	43.191	12.923
对照IgG	37.720	11.455
				对照IgA	43.887	3.557
ACE2-IgG	69.464	31.685
				ACE2-IgA1	112.709	18.598	P＜0.05
ACE2-IgA2	130.203	33.546	P＜0.05
				S309-IgA	39.482	10.190	P＜0.05

表19各组血清MDA含量(μmol/L)

这些实验证实，本发明所描述的免疫融合蛋白相比IgG型的ACE2融合蛋白具有更强的降低急性炎症渗出、抑制白细胞渗出、减少组织水肿、减轻组织损伤、增强SOD活性、降低血清MDA含量等生物学活性，可以用于病毒急性组织损伤。

实施例6免疫融合蛋白对巨噬细胞抗炎活性

Raw264.7巨噬细胞(中科院细胞库)在含有10％的胎牛血清(FBS；GibcoLaboratories)的DMEM培养基培养，培养条件为在37℃和5％CO₂。以1×10⁶个细胞/mL的密度将Raw264.7细胞接种至96孔板中并贴壁培养过夜；次日，用新鲜的DMEM培养基替换上述培养基，并将5μg/mL的多种药物加至细胞中，对照组加入对照人IgG或IgA(Sigma)。将细胞与蛋白孵育30分钟后，培养基添加LPS(终浓度1μg/mL)，并将细胞再温育24小时后进行检测实验。

1)NO水平测试

使用Griess试剂系统(Promega，USA)测量上述Raw264.7细胞培养基中的中的一氧化氮(NO)水平。将50μL培养基加入96孔板，接着加入相同量的Griess试剂I(NED)溶液和Griess试剂II(对氨基苯磺酰胺溶液)，孵育10分钟，之后，使用微孔板读取仪(MolecularDevices，USA)在30分钟内测量540nm下的光密度。使用亚硝酸钠标准曲线(0～100μM)来计算NO的浓度。

如下表20所示，以LPS刺激细胞增加了NO的表达，ACE2重组蛋白不能降低LPS诱导的NO表达，ACE2-IgG可以少量降低NO的表达；LPS与本发明所述的免疫融合蛋白共同处理时，上述NO表达水平显著的降低了。支持了发明所述的免疫融合蛋白减少巨噬细胞自身炎性渗出的效果。

表20相对NO含量

2)细胞因子检测

收集含有细胞培养基的上清液样品，并使用HMGB1、IFN-γ和IL-1βELISA试剂盒(eBioscience，San Diego)分析细胞因子的水平。在4℃下用100μL捕获抗体(在涂布缓冲液中稀释至制造商的操作规程所建议的浓度)涂布96孔板过夜。接着，在洗涤该板5次之后，每孔中加入200μL测定稀释液，并于室温下温育1小时以进行封闭。在用洗涤缓冲液洗涤各孔5次之后，将细胞培养物样品或每个细胞因子标准蛋白样品稀释，并在每孔中加入100μL各样品。在4℃下过夜温育含有样品的板。接着，在用洗涤缓冲液洗涤该板5次之后，加入100μL与抗生物素蛋白偶联的二抗，并在室温下温育1小时。在与二抗温育之后，洗涤该板5次，并在室温下与100μL抗生物素蛋白-HRP(BDBioscience)温育30分钟。在洗涤该板7次之后，加入100μLTMB溶液(Pierce)并在室温下温育15分钟。在各孔中加入50μl硫酸来终止反应。使用微孔板读取仪测量450nm下的光密度。使用SPSS程序的ANOVA操作进行方差分析，从而进行统计学分析，并使用邓肯氏多变域检验法来验证分析之间的显著性。检测结果如表21～23所示：

表21各处理组HMGB1水平

组别(药物浓度，μg/ml)	HMGB1(pg/ml)	SD	P值(vs.对照IgG)
				空白对照(仅培养基)	33.674	3.601
rhACE2	41.364	5.390
				对照IgG	42.046	15.100
对照IgA	40.287	5.915
				rhACE2+LPS	573.541	123.248
对照IgG+LPS	516.204	30.191
				对照IgA+LPS	537.729	70.042	P＞0.05
ACE2-IgG+LPS	298.785	42.630	P＜0.05
				ACE2-IgA1+LPS	91.780	21.064	P＜0.01
ACE2-IgA2+LPS	98.290	10.184	P＜0.01
				S309-IgA+LPS	536.744	32.979	P＞0.05

表22各处理组IFN-γ水平

表23各处理组IL-1β水平

组别(药物浓度，μg/ml)	IL-1β(pg/ml)	SD	P值(vs.对照IgG+LPS)
				空白对照(仅培养基)	3.499	2.587
rhACE2	2.097	0.253
				对照IgG	3.803	2.755
对照IgA	3.270	1.583
				rhACE2+LPS	104.628	16.210
对照IgG+LPS	112.684	9.705
				对照IgA+LPS	102.813	19.147	P＞0.05
ACE2-IgG+LPS	55.515	5.457	P＜0.05
				ACE2-IgA1+LPS	10.803	2.755	P＜0.01
ACE2-IgA2+LPS	15.270	1.583	P＜0.01
				S309-IgA+LPS	112.684	9.705	P＞0.05

结果显示，ACE2重组蛋白、IgA型抗体并不能降低HMGB1、IFN-γ和IL-1β的分泌水平。而本发明所描述的免疫融合蛋白有效降低细胞因子的水平，且这种效果远强于IgG型免疫融合蛋白，证实本发明所述的免疫融合蛋白具有显著的抗炎性渗出作用。

实施例7用于动物模型的免疫融合蛋白制备

为了在小鼠模型中评估免疫融合蛋白的治疗价值，必须制备鼠源对应的免疫融合蛋白，制备的方法同实施例1，鼠源蛋白采用标签纯化的方法[Kumar N,Arthur C P,Ciferri C,et al..Science,2020,367(6481):1008-1014.]。具体信息如表24～25.

表24用于动物模型的免疫融合蛋白制备

表25多肽结合能力检测

*+++：结合力达PM级别；++结合力达NM级别

实施例8免疫融合蛋白对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用

BALB/c小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～20g，细菌国际标准株MRSA-252，购自美国组织培养库(American Tissue Culture Collection，ATCC)。建立小鼠模型，经尾静脉注射0.1mL洗涤后的菌液(菌液浓度为1×10⁹CFU/mL)，空白组小鼠经尾静脉注射等量无菌生理盐水。然后将小鼠分为对照组和处理组，每组10只，对照组给与对照IgG或IgA，处理组给与本发明所述的免疫融合蛋白的代表物，剂量为10mg/kg，静脉注射一天一次，连续观察10d。如有小鼠死亡或最后一天实验结束处死全部老鼠，立即无菌条件下取血液铺板计数细菌，同时无菌取肾脏、脾脏、肝脏全器官，取部分组织用玻璃匀浆器磨碎后铺板计数细菌，同时进行病理检查。同时利用Western Blot检测空白组和模型组血液、肝脏、脾脏、肾脏、肺组织内的ACE2表达水平，结果如表26～31所示。

表26模型组小鼠各组织ACE2表达水平

组织	ACE2表达水平(％相对正常小鼠组)	SD	P值(相对于空白组)
				全血细胞	35.759	12.998	P＜0.05
肝脏	37.077	10.873	P＜0.05
				脾脏	42.341	8.097	P＜0.05
肾脏	41.575	3.195	P＜0.05
				肺	35.515	5.457	P＜0.05

结果显示，严重感染导致多脏器ACE2表达下降，符合本发明所述免疫融合蛋白的应用范围。

表27小鼠生存率％

组别	0d	2d	4d	6d	8d	10d
							正常小鼠	100	100	100	100	100	100
模型组	100	10	0	0	0	0
							对照IgG	100	10	0	0	0	0
对照IgA	100	20	0	0	0	0
							rmACE2	100	30	10	0	0	0
mACE2-IgG	100	30	10	30	0	0
							mACE2-IgA	100	80	80	70	70	70

表28各组小鼠死亡前血液相对菌落数

表29各组小鼠死亡前肝脏相对菌落数

组别	相对菌落数％	SD	P值(相比对照IgG)
				正常小鼠	0	0
模型组	100	7.110
				对照IgG	102.947	11.949
对照IgA	98.867	15.632	P＞0.05
				rmACE2	97.105	25.222	P＞0.05
mACE2-IgG	74.912	16.014	P＜0.05
				mACE2-IgA	10.432	1.215	P＜0.01

表30各组小鼠死亡前脾脏相对菌落数

组别	相对菌落数％	SD	P值(相比对照IgG)
				正常小鼠	0	0
模型组	100	17.556
				对照IgG	99.710	21.616
对照IgA	97.156	10.250	P＞0.05
				rmACE2	89.723	4.567	P＞0.05
mACE2-IgG	35.738	13.266	P＜0.05
				mACE2-IgA	6.211	3.221	P＜0.01

表31各组小鼠死亡前肾脏相对菌落数

组别	相对菌落数％	SD	P值(相比对照IgG)
				正常小鼠	0	0
模型组	100	12.439
				对照IgG	96.797	19.502
对照IgA	103.386	17.655	P＞0.05
				rmACE2	102.233	19.073	P＞0.05
mACE2-IgG	53.662	18.802	P＜0.05
				mACE2-IgA	5.210	2.261	P＜0.01

这些结果表明，相比IgG型的免疫融合蛋白，本发明所述的免疫融合蛋白具有较强的微生物抵抗作用、抗感染作用、减少脏器菌落数量，有效对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球。

实施例9免疫融合蛋白治疗的动物系统性真菌感染实验

选用雌性C57BL/6小鼠作为实验动物(20g左右)，经尾静脉注射给予5×10⁶CFU/ml浓度的新生隐球菌0.1ml(5×10⁵CFU/ml)，造成系统性真菌感染模型。然后进行分组，每组10只小鼠，处理组分别经脉施用总剂量为10mg/kg的本发明所述的免疫融合蛋白，每日一次，对照组给予对照IgG或IgA，给药共5天，在第5天将小鼠处死、取脑、将脑组织匀浆均匀，将匀浆液稀释一定倍数后加入到蛋白胨琼脂基涂板，将培养基上的菌落计数，计算小鼠脑部真菌荷菌量，同时检测模型组和正常小鼠全血ACE2表达水平。结果如表31～32所示。

表32模型组小鼠各组织ACE2表达水平

组织	ACE2表达水平(％相对正常小鼠组)	SD	P值(相对于空白组)
				全血细胞	23.853	5.606	P＜0.05

结果显示，严重感染导致全血ACE2表达下降，符合本发明所述免疫融合蛋白的应用范围。

表33脑组织来源菌落计数

组别	相对菌落数％	SD	P值(相比对照IgG)
				正常小鼠	0	0
模型组	100	11.880
				对照IgG	99.146	11.429
对照IgA	101.459	27.416	P＞0.05
				rmACE2	104.091	22.854	P＞0.05
mACE2-IgG	44.878	11.751	P＜0.05
				mACE2-IgA	8.395	1.845	P＜0.01

这些结果显示，相较IgG型免疫融合蛋白，本发明所述的免疫融合蛋白系统性给药可以更有效的抑制脑组织内的真菌生长，达到真菌杀灭效果疗效明显。

实施例10.免疫融合蛋白治疗急性肺损伤

BALB/c小鼠进行分组(n＝8)，空白组和假手术组均给与PBS，对照组给与对照IgG或IgA，各处理组给与本发明所述的免疫融合蛋白代表物，以按照5mg/kg的给药剂量尾静脉注射小鼠，同时给与雾化吸入5mg/kg，每天一次连续给药3天，末次给药1h后开始造模，2％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定于37℃恒温手术台。参照专利文献(111018999A)方法造模，造模主要步骤如下：小心剃去颈部正中毛发，酒精消毒，正中切开颈部皮肤约2cm，暴露及分离气管，利用胰岛素注射器于气管内慢慢滴注LPS 5mg/kg(0.5mL/kg)，假手术组气管内滴注等量生理盐水，碘伏消毒伤口并缝合皮肤，建立小鼠急性肺损伤模型。

造模24h后摘眼球取血，4℃冰箱静置3h后，3500r/min离心15min,分离血清，液氮保存，待测。各组小鼠小心剪开颈部皮肤并分离气管，行气管插管。剖开胸部，结扎右支气管，用磷酸缓冲液灌洗左肺，共3次，2mL/次，收集支气管肺泡灌洗液并离心(4℃，1300r/min,5min)。

首先检测模型组和假手术组肺组织内ACE2表达水平，然后检测如下指标：1)BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)检测支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,实验操作均按照试剂盒说明书进行。2)支气管肺泡灌洗液白细胞水平，用800μL 0.01mol/L(pH 7.4)的PBS缓冲液重悬支气管肺泡灌洗液沉淀物,吹打均匀后,取400μL于血液分析仪中检测白细胞数目。3)肺湿干质量比(W/D)：称取左肺上叶为湿质量,将左肺上叶放入恒温干燥箱(105℃)烤72h，干燥至恒质量，并称取记录为干质量，按下列公式计算:肺湿干质量比＝湿质量/干质量。4)肺组织病理形态评分：取右肺下叶,10％

中性甲醛浸泡固定24h，流水冲洗12h，常规石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，封片，显微镜下进行病理观察。选择不同视野按照标准肺炎症评分进行病理评分，评分方法参考文献[朱珊,潘灵辉,林飞,等.临床麻醉学杂志,2013,29(6).]。5)血生化指标检测血清中SOD活性和MDA的含量测定严格按照相应检测试剂盒说明书步骤进行检测。结果如表34～40所示：

表34模型组小鼠各组织ACE2表达水平

组织	ACE2表达水平(％相对于假手术组小鼠)	SD	P值(相对于假手术组)
				肺组织	10.484	0.830	P＜0.05

结果显示，严重感染导致肺组织内ACE2表达显著下降，符合本发明所述免疫融合蛋白的应用范围。

表35各组支气管肺泡灌洗液蛋白含量

组别	蛋白含量(g/L)	SD	P值(vs.对照IgG)
				假手术组	1.079	0.113
模型组(空白对照)	11.456	2.893
				对照IgG	8.561	1.537
对照IgA	9.390	2.555	P＞0.05
				rmACE2	11.280	2.504	P＞0.05
mACE2-IgG	5.745	2.276	P＜0.05
				mACE2-IgA	1.834	0.491	P＜0.01

表36各组支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数量

组别	细胞数(10<sup>8</sup>/L)	SD	P值(vs.对照IgG)
				假手术组	1.072	0.122
模型组(空白对照)	10.660	0.374
				对照IgG	11.876	3.026
对照IgA	8.766	3.183	P＞0.05
				rmACE2	10.372	1.897	P＞0.05
mACE2-IgG	7.039	2.106	P＞0.05
				mACE2-IgA	2.842	0.243	P＜0.01

表37各组肺组织湿干质量比

表38各组肺损伤评分

组别	肺组织评分	SD	P值(vs.对照IgG)
				假手术组	0.250	0.267
模型组(空白对照)	2.750	0.267
				对照IgG	2.625	0.443
对照IgA	2.813	0.372	P＞0.05
				rmACE2	2.938	0.496	P＞0.05
mACE2-IgG	2.250	0.655	P＞0.05
				mACE2-IgA	0.688	0.259	P＜0.01

表39各组血清SOD活性

组别	SOD活性(U/ml)	SD	P值(vs.对照IgG)
				假手术组	181.079	36.578
模型组(空白对照)	39.535	16.748
				对照IgG	40.903	5.807
对照IgA	38.713	12.563	P＞0.05
				rmACE2	34.222	6.330	P＞0.05
mACE2-IgG	76.639	25.383	P＜0.05
				mACE2-IgA	159.138	62.118	P＜0.01

表40各组血清MDA含量(μmol/L)活性

组别	MDA活性(μmol/L)	SD	P值(vs.对照IgG)
				假手术组	10.098	0.712
模型组(空白对照)	38.362	7.719
				对照IgG	45.149	10.644
对照IgA	40.655	6.049	P＞0.05
				rmACE2	41.132	13.629	P＞0.05
mACE2-IgG	31.976	3.528	P＜0.05
				mACE2-IgA	16.182	8.219	P＜0.01

这些实验证实，相比IgG型免疫融合蛋白，本发明所描述的免疫融合蛋白具有更强的生物学活性，包括降低急性炎症渗出、抑制白细胞渗出、减少组织水肿、减轻组织损伤、增强SOD活性、降低血清MDA含量的作用，有效增加组织对炎症损伤的抵抗。

实施例11:免疫融合蛋白对狼疮小鼠模型的治疗作用

狼疮性肾炎作为一种代表性免疫系统疾病，发病率约为50/10万，在我国约占人口的0.7‰。90％以上狼疮性肾炎见于女性，主要为青、中年女性，一般认为30岁以下者肾脏受累率高，约有70％病人有不同程度的肾损害临床表现，以程度不等的蛋白尿、镜下血尿为多见，常伴有管型尿及肾功能损害，严重影响患者的正常生活。

狼疮小鼠模型多采用NZB雌鼠与NZW雄鼠杂交产生，杂交第一代(NZB×NZW)F1，能产生包括狼疮性肾炎在内的典型狼疮症状，是目前公认的研究狼疮性肾炎动物模型之一。模型的建立参考非专利文献Brinks et al.Circ Res(2010)107:1140-1149。然后将小鼠分组进行分组，每组n＝8。免疫融合蛋白的施用剂量为:10mg/kg，一周两次尾静脉注射，连续注射十周。对照组注射对照IgG或IgA，剂量同处理组。

于第30周，首先检测模型组和正常组全血细胞的ACE2表达水平，结果见表41。然后分别检测各处理组自身抗体水平，本发明所述免疫融合对白较对照组抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体显著减少，而总IgG水平不变，证实处理对自身免疫性抗体有抑制生成的作用，且比IgG型免疫融蛋白效果更佳。如表42～44所示。

于40周统计蛋白尿发生率，50周统计存活率，小鼠死亡立即进行组织学研究做病理评分，存活小鼠在50周同一处死，肾脏组织学研究进行病理评分，评分方法参考文献[LiuS,et al.Clinical Immunology,2019,203:72-80.]。如表45～47所示，本发明所述免疫融合蛋白处理组相比IgG型免疫融合蛋白更有效减少蛋白尿水平、减轻肾脏炎症和病理破坏、提高狼疮小鼠存活力。

表41模型组小鼠各组织ACE2表达水平

组织	ACE2表达水平(％相对正常小鼠组小鼠)	SD	P值(相对正常小鼠组小鼠)
				全血细胞	23.344	3.094	P＜0.05

表42 30周各组小鼠血清抗dsDNA抗体

组别	抗dsDNA抗体水平(相对单位)	SD	P值(vs.对照IgG)
				模型组(空白对照)	192.800	43.949
对照IgG	217.913	25.553
				对照IgA	218.760	43.706	P＞0.05
rmACE2	273.749	33.126	P＞0.05
				mACE2-IgG	146.873	16.645	P＜0.05
mACE2-IgA	44.204	8.092	P＜0.01

表43 30周各组小鼠血清抗组蛋白抗体

表44 30周各组小鼠血清总IgG水平

组别	总IgG水平(ng/ml)	SD	P值(vs.对照IgG)
				模型组(空白对照)	16.948	5.132
对照IgG	13.207	6.375
				对照IgA	14.263	4.517	P＞0.05
rmACE2	14.564	2.956	P＞0.05
				mACE2-IgG	15.653	2.831	P＞0.05
mACE2-IgA	15.805	3.784	P＞0.05

表45 40周各组小鼠蛋白尿发生率

组别	蛋白尿发生率％	P值
			模型组(空白对照)	100
对照IgG	100
			对照IgA	100	P＞0.05
rmACE2	100	P＞0.05
			mACE2-IgG	80	P＞0.05
mACE2-IgA	10	P＜0.01

表46 50周各组小鼠存活率

组别	存活率％	P值
			模型组(空白对照)	0
对照IgG	0
			对照IgA	0	P＞0.05
rmACE2	12.5	P＞0.05
			mACE2-IgG	37.5	P＞0.05
mACE2-IgA	87.5	P＜0.01

表47各组肾脏病理评分

综上，在狼疮小鼠模型中，相比IgG型ACE2，本发明所述的免疫融合蛋白可以更有效的减少自身免疫抗体、减少脏器病理性炎症渗出、对于自身免疫系统疾病均具有良好的治疗效果，有利于后续的临床试验的开展。

实施例12向暴露于未知病原体的患者施用二聚体融合蛋白举例

在突发公共安全事件或生物恐怖主义袭击中，人们暴露于未知的病原体或毒素。暴露模式为很多不同方式中的一种，例如食物或水摄取、气雾剂吸入或皮肤接触。病原体为众多中的一种，例如新型冠状病毒，炭疽杆菌(炭疽热)、流感病毒、天花病毒、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、埃博拉病毒或马尔堡病毒、土拉弗朗西斯菌(野兔病)、汉坦病毒、登革病毒、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、蓖麻毒素、沙门氏菌、大肠杆菌如E.coli 0157:H7、志贺氏杆菌、李斯特菌等。

当威胁性的微生物尚未确定时，一些病人已经迅速开始患有相似症状的严重疾病，包括高烧、寒颤、咳嗽、严重疲劳和腹泻。患者可接受标准治疗，例如抗病毒药、抗生素、抗毒素、免疫球蛋白。

可以通过组织或血液检测评估患者组织内的ACE2表达和功能情况，一旦发现ACE2下调或功能紊乱，即可以利用本发明所述的免疫融合蛋白，如作为发生感染症状和炎症体征的患者的预防措施或治疗手段，向患者静脉施用本发明所述免疫融合蛋白，例如包含活性成分为50mg/kgACE2-IgA等。一旦药物分布到体液中，免疫融合蛋白可以增强巨噬细胞对病理因素的清除作用，减少异常调控的炎性介质，从而防止或限制细胞因子或其他炎性介质诱导的细胞死亡、器官损伤、多器官衰竭和潜在死亡的发生。

实施例13分泌型融合蛋白制备和应用

利用实施例1所述的ACE2-IgA1融合蛋白进一步制备多聚免疫融合蛋白。编码ACE2-IgA1的多核苷酸和编码JC多肽链的多核苷酸共转染并进一步进行纯化，获得的多聚体ACE2-IgA1和SC多肽链孵育制备。制备的方法可以参考非专利文献[KumarN,Arthur C P,Ciferri C,et al.Science,2020,367(6481):1008-1014.]，获得的分泌型融合蛋白命名为sACE2-IgA1。

按照实施例5的方法建立人ACE2转基因小鼠SARS-CoV-2疾病模型，采用预防模型进行研究，即转基因动物在造模前即吸入10mg/kg不同融合蛋白，同时在鼻腔内涂抹10mg/kg不同融合蛋白处理。仅处理一次，三天后进行感染造模(n＝10)，统计发病率，结果如表48。

表48各组感染情况

结果显示，分泌型的多聚免疫融合蛋白在粘膜施用方面具有独到的优势，效果优于单个ACE2免疫融合蛋白，可以用于病毒感染的粘膜应用。

本发明中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实现。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 沣潮医药科技（上海）有限公司

<120> ACE2免疫融合蛋白及其应用

<130> 权利要求书说明书

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 975

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn

1 5 10 15

His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn

20 25 30

Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala

35 40 45

Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln

50 55 60

Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu

65 70 75 80

Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser

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Cys Tyr

850

Claims

1.一种ACE2免疫融合蛋白，其特征在于，结构通式为Z1-Z2，其中Z1为ACE2或其功能变体或片段，Z2为IgA重链恒定区或其功能变体或片段。

2.根据权利要求1所述的ACE2免疫融合蛋白，其特征在于：

其中，Z1是ACE2胞外结构域或其功能变体或片段，Z2是人免疫球蛋白IgA的Fc结构域或其功能变体或片段。

3.根据权利要求2所述的ACE2免疫融合蛋白，其特征在于：

其中，Z2为二聚化结构域，还包含有肽接头，该肽接头由15-32个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基包括1-8个半胱氨酸。

4.根据权利要求2所述的ACE2免疫融合蛋白，其特征在于：

其中，Z1-Z2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3任一项中的序列所示。

5.一种多聚ACE2免疫融合蛋白，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的ACE2免疫融合蛋白、以及连接肽链或聚合免疫球蛋白受体的分泌部分中的任一种或两种的组合。

6.编码权利要求1～4任一项所述的ACE2免疫融合蛋白或权利要求5所述的多聚ACE2免疫融合蛋白的多核苷酸、运载该多核苷酸的基因载体以及包含该基因载体的重组细胞。

7.权利要求1～4任一项所述ACE2免疫融合蛋白、权利要求5所述的多聚ACE2免疫融合蛋白、编码该ACE2免疫融合蛋白或多聚融合蛋白的多核苷酸、运载该核苷酸的载体或重组细胞在制备治疗ACE2表达水平下调或功能异常介导的炎症介质紊乱相关疾病试剂、试剂盒或药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物为增强ACE2酶活、增强抗免疫细胞IgA受体活化、增强ACE2依赖的免疫细胞吞噬和清除功能、中和以ACE2为受体的入侵病原体、降低免疫细胞分泌炎性因子、减少脏器炎症介质过度表达释放、减轻脏器炎症损伤、增强脏器抗应激能力或介导免疫耐受的试剂或药物。

9.一种治疗ACE2表达水平下调或功能异常介导的炎症介质紊乱相关疾病药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的稀释剂或赋形剂，该活性组分为权利要求1～4任一项所述的ACE2免疫融合蛋白、权利要求5所述的多聚ACE2免疫融合蛋白或权利要求6所述的多核苷酸、运载该多核苷酸的基因载体或包含该基因载体的重组细胞。