CN113444710A - ACE2-Fc融合蛋白及其用途 - Google Patents

ACE2-Fc融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及融合蛋白及其在治疗冠状病毒引起的疾病中的应用，所述融合蛋白含ACE2部分和Fc段；其中，所述ACE2部分选自：ACE2蛋白胞外域或其突变体，所述胞外域含ACE2蛋白PD结构域的片段或其突变体；所述Fc段选自IgG1、IgG2和IgG4的Fc段或其突变体，且所述IgG1的Fc段无ADCC活性。

Description

ACE2-Fc融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及Fc融合蛋白，尤其是ACE2与Fc的融合蛋白及其用途。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎重症比例为13.8％，危重病例比例为4.7％，其中危重病人的死亡率高达49％。新冠肺炎目前没有针对抗病毒感染的特效药，临床治疗以支持生命体征的对症治疗为主，所以亟待开发能够抑制病毒感染的有效治疗药物。
研究显示，新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)基因组序列与SARS病毒保持了70％的同源性，其用于发挥感染作用的S蛋白同源性达到76.47％；该病毒与SARS一样，均通过ACE2蛋白(血管紧张素转换酶2)来进行感染，其与ACE2亲和力达到15nM，是其与SARS S蛋白结合力的10到20倍。这种高亲和力造成2019-nCoV高传染性，而且提示可以用ACE2蛋白作为体内阻断SARS-CoV-2浸染的候选靶点。
传统的针对病毒的中和性抗体往往具有单一的表位，可能存在阻断效率低，且受到病毒变异影响中和效果的缺点，而ACE2蛋白作为SARS-CoV-2感染的必需受体，不受病毒变异的影响，且可以适用于SARS等其他同样采用ACE2作为感染受体的病毒的临床治疗。
Fc融合蛋白(Fc-fusion proteins)是近几年发展极快的一种生物制药研究方向。它是以免疫球蛋白的Fc段作为分子伴侣，通过分子生物学手段将功能性蛋白与之融合，从而极大地延长功能性蛋白的半衰期。Fc融合蛋白保持了功能性蛋白的活性，同时兼具免疫球蛋白的半衰期长及具有细胞毒性。
发明内容
本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含ACE2部分和Fc段；其中，所述ACE2部分选自：ACE2蛋白胞外域或其突变体，所述胞外域的含ACE2蛋白PD结构域的片段或其突变体；所述Fc段选自IgG1、IgG2和IgG4的Fc段或其突变体，且所述IgG1的Fc段无ADCC活性。
在一个或多个实施方案中，所述ACE2蛋白胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段为野生型胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段；所述胞外域或片段的突变体为无酶活的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者为糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者为无酶活、且糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者为具有酶活、但糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
在一个或多个实施方案中，突变的糖基化位点包括选自N53，N90，N103，N322，N432，N546，N690的一个或多个位点。优选地，突变的糖基化位点突变为A。
在一个或多个实施方案中，所述无酶活的胞外域或其片段为374和/或378位发生了突变的胞外域或其片段；优选为发生了H374N和/或H378N的胞外域或其片段。
在一个或多个实施方案中，所述胞外域的突变体与野生型ACE2蛋白胞外域的序列同一性为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选97％以上，更优选99％以上；所述片段的突变体与野生型ACE2蛋白PD结构域的序列同一性为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选97％以上，更优选99％以上。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白为含两个ACE2部分的二价形式，或含四个ACE2部分的四价形式。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白具有减弱的ACE2酶活。
在一个或多个实施方案中，所述二价形式的融合蛋白中，一个ACE2部分为野生型ACE2胞外域或其含PD结构域的片段，另一个ACE2部分为无酶活的突变型ACE2蛋白胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
在一个或多个实施方案中，所述二价形式的融合蛋白中，两个ACE2部分均为野生型ACE2胞外域或其含PD结构域的片段，或者两个ACE2部分均为无酶活的突变型ACE2蛋白胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
在一个或多个实施方案中，所述二价形式的融合蛋白中，至少一个ACE2部分为无酶活、且糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为具有酶活、但糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
在一个或多个实施方案中，所述四价形式的融合蛋白中，至少一个ACE2部分为野生型ACE2胞外域或其含PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为无酶活的ACE2胞外域或其含PD结构域的片段；任选地，至少一个ACE2部分的部分或全部糖基化位点发生突变。
在一个或多个实施方案中，所述四价形式的融合蛋白中，至少一个ACE2部分为野生型胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为具有酶活、但糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为无酶活、且糖基化位点未发生突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为无酶活、且糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
在一个或多个实施方案中，所述ACE2部分通过接头肽连接到Fc；优选地，所述接头肽为含有G和S的接头。
在一个或多个实施方案中，所述IgG1 Fc包含N297A糖基化位点突变，所述IgG4 Fc具有S228P突变和任选的N297A突变。
在一个或多个实施方案中，两条IgG Fc分别具有形成杵的突变和形成臼的突变，优选地，形成杵的突变是T366位点的突变，形成臼的突变是选自T366、L368和Y407中一个或多个位点的突变，更优选地，形成杵的突变是T366W，形成臼的突变选自T366S、L368A、Y407V中的一个或多个。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白由酵母表达得到。
在一个或多个实施方案中，ACE2-Fc融合蛋白是由两个ACE2部分与Fc组成的二价融合蛋白，两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，
优选地，ACE2部分具有SEQ ID NO:1-4中任一所述的序列，Fc具有SEQ ID NO:5-8中任一所述的序列；
优选地，ACE2部分具有选自以下的糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A，N690A；
优选地，两个ACE2部分是相同的；
优选地，ACE2部分具有SEQ ID NO:1或2所述的序列，Fc具有SEQ ID NO:5-7中任一所述的序列；
优选地，ACE2部分具有SEQ ID NO:3或4所述的序列，Fc具有SEQ ID NO:7所述的序列；
优选地，ACE2部分具有SEQ ID NO:1所述的序列，Fc具有SEQ ID NO:8所述的序列，任选地，各ACE2部分具有选自以下的一个多个或全部糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A。
在一个或多个实施方案中，ACE2-Fc融合蛋白是由四个ACE2部分与Fc组成的四价融合蛋白，两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端直接或通过(GGGGS)n连接，其中，n为1-8的正整数，
优选地，与Fc的N端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:1-4中任一所述的序列，与Fc的C端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:1-4中任一所述的序列，
优选地，Fc具有SEQ ID NO:5-8中任一所述的序列，
优选地，n为3、4、7或8；
优选地，与Fc的N端连接的两个ACE2部分是相同的，与Fc的C端连接的两个ACE2部分是相同的；
优选地，ACE2部分具有选自以下的糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A，N690A；
优选地，与Fc的N端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:1或2所述的序列，与Fc的C端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:1或2所述的序列，并且Fc具有SEQ ID NO:5-7中任一所述的序列；
优选地，与Fc的N端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:3或4所述的序列，与Fc的C端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:3或4所述的序列，并且Fc具有SEQ ID NO:7所述的序列；
优选地，与Fc的N端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:1所述的序列，与Fc的C端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:2所述的序列，并且Fc具有SEQ ID NO:8所述的序列，任选地，各ACE2部分具有选自以下的一个多个或全部糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A。
本发明还提供一种核酸分子，选自：(1)编码本文所述的融合蛋白的多核苷酸序列；(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
本发明还提供一种核酸构建物，其含有本文所述核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为克隆载体或表达载体。
本发明还提供一种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞：(1)表达本文所述的融合蛋白；和/或(2)含有本文所述的核酸分子，或本文所述的核酸构建物。
本文还提供一种药物组合物，含有本文所述的ACE2-Fc融合蛋白、本文所述的核酸分子或本文所述的核酸构建物，和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供融合蛋白、含有编码该融合蛋白的核酸序列或其互补序列的核酸分子、包含该核酸分子的核酸构建物在制备治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的应用，所述融合蛋白含ACE2部分和Fc；其中，所述ACE2部分选自：ACE2蛋白胞外域或其片段或所述胞外域或其片段的突变体，所述胞外域的片段含ACE2蛋白PD结构域或其突变体；所述Fc段选自IgG1、IgG2和IgG4的Fc段或其突变体，且所述IgG1的Fc段无ADCC活性。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒选自以下的一个或多个：HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV、2019-nCoV。
在一个或多个实施方案中，冠状病毒引起的疾病包括但不限于中东呼吸综合征、重症急性呼吸综合征、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性呼吸窘迫、心衰、新型冠状病毒肺炎等。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白如本文第一方面所述。
本发明还提供ACE2-Fc融合蛋白、含有编码该融合蛋白的核酸序列或其互补序列的核酸分子、包含该核酸分子的核酸构建物在制备治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)的药物中的应用，所述ACE2-Fc融合蛋白含ACE2部分和Fc；其中，所述ACE2部分选自：ACE2蛋白胞外域或其片段或所述胞外域或其片段的突变体，所述胞外域的片段含ACE2蛋白PD结构域或其突变体；所述Fc段选自IgG1、IgG2和IgG4的Fc段或其突变体，且所述IgG1的Fc段无ADCC活性。
在一个或多个实施方案中，所述ACE2-Fc融合蛋白如本文第一方面所述。
一种生产ACE2-Fc融合蛋白的方法，包含将本文所述的核酸构建物引入能表达所述ACE2-Fc融合蛋白的细胞并在能表达所述ACE2-Fc融合蛋白的条件下孵育细胞的步骤。
在一个或多个实施方案中，在一个或多个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞CHO或毕赤酵母细胞。
在一个或多个实施方案中，所述ACE2-Fc融合蛋白如本文第一方面所述，所述核酸构建物表达所述ACE2-Fc融合蛋白，
优选地，所述ACE2-Fc融合蛋白是由两个ACE2部分与Fc组成的二价融合蛋白，两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，所述ACE2部分具有SEQ ID NO:1所述的序列，Fc具有SEQID NO:8所述的序列，任选地，各ACE2部分具有选自以下的一个多个或全部糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A，
优选地，所述ACE2-Fc融合蛋白是由四个ACE2部分与Fc组成的四价融合蛋白，两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端直接或通过(GGGGS)n连接，n为1-8的正整数，其中，与Fc的N端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:1所述的序列，与Fc的C端连接的两个ACE2部分具有SEQ ID NO:2所述的序列，并且Fc具有SEQ ID NO:8所述的序列，任选地，各ACE2部分具有选自以下的一个多个或全部糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A。
附图说明
图1：本发明的融合蛋白中和病毒毒性示意图。
图2：本发明涉及的融合蛋白示意图。
图3：本发明涉及的融合蛋白治疗急性呼吸窘迫综合征的机制示意图。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明旨在合成一种与冠状病毒本身结合的抗体样分子，从而中和病毒的毒性，而不是保护细胞不被感染。具体地，本发明公开了一种ACE2-Fc融合蛋白作为抑制新冠肺炎侵染的阻断剂。Fc融合蛋白在细胞内涵体(endosome)中可以通过其Fc段与FcRn受体结合，从而被循环至细胞外，避免溶酶体途径对蛋白的降解，增长药物的半衰期，从而减少给药频次，增加药物疗效，降低治疗成本。
全长ACE2是跨膜蛋白，由N末端肽酶结构域(PD)和C末端Collectrin样结构域(CLD)组成，CLD末尾包含跨膜螺旋和细胞内节段。肽酶结构域(PD)位于胞外域，负责裂解血管紧张素II和血管紧张素I。同时，ACE2-PD的晶体结构还提供了冠状病毒S蛋白的直接结合位点。对于冠状病毒细胞的结合而言，PD在ACE2中至关重要。本发明的ACE2-Fc融合蛋白中的ACE2部分可为ACE2的胞外结构域或其包含ACE2的肽酶结构域的片段，或所述胞外结构域或所述片段的突变体。具体地，ACE2部分可为ACE2胞外结构域或其包含野生型ACE2肽酶结构域的片段，或它们的保留与配体(例如病毒的S蛋白)结合能力的突变体。所述突变体可以是经突变失去切割血管紧张素II和血管紧张素I的肽酶活性的ACE2胞外结构域或其包含肽酶结构域的片段，例如将ACE2的活性中心位点组氨酸突变成其它氨基酸残基，具体可以是将第374和/或378位组氨酸(His)突变成为天冬酰氨(Asn)后的突变体。所述突变体也可以是保留肽酶活性的突变体。在2019-nCoV或SARS病毒感染的病人中，由于其ACE2伴随病毒内化，其表达水平下调，导致其正常调节肾素-血管紧张素的功能受损，从而引发肺动脉高压，急性呼吸窘迫，心衰等多个症状。所以，临床使用中，ACE2-Fc融合蛋白的ACE2肽酶活性可以保留，从而补充ACE2缺失造成的上述症状。所述突变体还包含部分或全部糖基化位点发生突变的具有或不具有肽酶活性的ACE2胞外结构域或其包含ACE2肽酶结构域的片段，这些糖基化位点包含选自第53、90、103、322、432、546、690位的天冬酰氨残基的一个或多个位点，如本文他处所述。示例性地，活性ACE2-PD结构域序列如SEQ ID NO:1所示，失活ACE2-PD结构域序列如SEQ ID NO:2所示，活性ACE2-胞外域序列如SEQ ID NO:3所示，失活ACE2-胞外域序列如SEQ ID NO:4所示。在一些实施方案中，所述ACE2胞外域的突变体中的突变发生在PD结构域以外。
ACE2-Fc融合蛋白是指将免疫球蛋白的Fc段与ACE2部分融合而产生的蛋白。Fc融合蛋白不仅可发挥所ACE2部分的生物学活性，还具有抗体的性质，如可引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)与抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)等。本发明涉及的Fc可以采用来自人类IgG1，IgG2，IgG4等不同亚型的免疫球蛋白Fc段。其中IgG1往往具有较强的效应功能，其通过与Fcγ受体招募NK细胞或巨噬细胞对靶细胞或病原体进行杀伤(ADCC)或吞噬(ADCP)从而发挥清除效应，而IgG2、IgG4等分子与Fcγ受体结合的亲和力则较弱，发生ADCC或ADCP的效应较弱。研究表明，Fc段与Fcγ受体的结合是依赖于297位天冬氨酸的糖基化，糖基化位点突变将造成其与Fcγ受体结合能力丧失，从而失去ADCC，ADCP等活性。对于抗病毒治疗来说，ADCC/ADCP有可能促进机体免疫系统对病毒的清除，从而促进病人痊愈。但是另外一方面，研究表明中和性抗体或融合蛋白可能介导了病毒与巨噬细胞的结合从而促进病毒感染巨噬细胞，进而在巨噬细胞内病毒发生扩增，复制，从而造成病毒载量的增加，对病人病程造成负面影响，这种作用称为抗体依赖的增强作用(Antibody dependentenhancement,ADE)。通过选用IgG2亚型或IgG4亚型，或者通过Fc工程化改造策略，包括N297糖基化位点的突变改造，可以降低病人发生ADE的风险，提高了药物的安全性。因此，本发明融合蛋白的Fc段可以是IgG1、IgG2和IgG4的Fc段或其突变体。这些Fc段可通过引入N297位点的突变(例如突变为A)从而消除ADCC、ADCP活性。此外，IgG4 Fc段可通过引入S228位点的突变(例如突变为P)以消除链交换的产生。因此，本发明融合蛋白的Fc段选自：具有或不具有N297位点突变的IgG1的Fc段，具有或不具有N297位点突变的IgG2的Fc段，具有或不具有S228和/或N297位点突变的IgG4的Fc段。在具体实施方案中，本发明融合蛋白的Fc段选自：具有N297位点突变的IgG1的Fc段，野生型IgG2的Fc段，具有S228和任选的N297位点突变的IgG4的Fc段。示例性地，含有N297A突变的IgG1如SEQ ID NO:5所示，野生型IgG2如SEQ IDNO:6所示，含有S228P突变的IgG4如SEQ ID NO:7所示，含有N297A和S228P突变的IgG4如SEQID NO:8所示。
本发明的ACE2-Fc融合蛋白可以具有不同价位，通过多个ACE2对于2019-nCoV病毒刺突蛋白的多价结合，可以同时结合一个刺突上多个S蛋白，或者结合一个病毒的多个刺突，甚至结合多个病毒的多个刺突，增强其中和活性。多价结合可以通过亲和力加合效应(Avidity effect)极显著地增加分子间作用力，从而提高阻断病毒感染的中和效应。本文中，二价ACE2-Fc融合蛋白包括位于Fc段N末端的两个ACE2部分。在二价形式的融合蛋白中，两个ACE2部分可以都具有或都不具有肽酶活性，也可以其中一个具有肽酶活性而另一个不具有肽酶活性。例如一个ACE2部分为野生型ACE2的全长胞外结构域或含肽酶结构域的片段或它们的保留酶活的突变体，另一个ACE2部分为无酶活的胞外结构域或含肽酶结构域的片段或它们的无酶活突变体。本文中，四价ACE2-Fc融合蛋白包括位于Fc段N末端的两个ACE2部分和位于Fc段C末端的两个ACE2部分。在四价形式的ACE2-Fc融合蛋白中，可以全部或部分保留各ACE2部分的酶活。即，四价形式的ACE2-Fc融合蛋白中，可以仅一个、两个、三个或四个ACE2部分具有肽酶活性。所以，四价形式的ACE2-Fc融合蛋白中可以至少一个ACE2部分为野生型ACE2胞外域或其含PD结构域的片段或它们的保留酶活的突变体，或至少一个ACE2部分为无酶活的ACE2胞外域或其含PD结构域的片段或它们的无酶活突变体。这既保证了四价形式的ACE2-Fc融合蛋白可以高效阻断病毒感染，同时又防止过度的ACE2肽酶活性造成血压下降等风险。例如，ACE2-Fc融合蛋白N端的两个ACE2部分是野生型ACE2胞外域或其PD结构域，具有肽酶活性，而C端的两个ACE2部分是通过H374N和/或H378N突变丧失肽酶活性的ACE2胞外域或其PD结构域。当然，本发明的ACE2-Fc融合蛋白也可以是N端的两个ACE2部分不具有肽酶活性，而C端的两个ACE2部分具有肽酶活性。
本发明融合蛋白中的ACE2部分可以直接连接Fc，或通过常用接头肽连接。示例性的，本发明的接头肽为含有G和S的接头，包括但不局限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，其中G指甘氨酸，S指丝氨酸，n为1-15、优选1-10，更优选1-8的正整数。在具体实施方式中，接头是(GGGGS)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8。其他常用接头肽本领域周知。
本发明的融合蛋白还可以包含信号肽，适合各种细胞或亚细胞结构表达的信号肽序列本领域周知。示例性地，ACE2-Fc融合蛋白在N端包含ACE2的天然信号肽：MSSSSWLLLSLVAVTAA(SEQ ID NO:9)。本文中提及ACE2的氨基酸编号时将该天然信号肽包括在内，但这仅是为了表述方便起见，并非旨在限制融合蛋白是否包含信号肽以及包含的信号肽的种类和序列。
本发明ACE2部分、Fc段和融合蛋白也包括与其具有至少70％序列相同性并保留各自所需活性的突变体。对于ACE2，所述活性是与病毒蛋白例如S蛋白结合的能力；对于Fc段，所述活性是与FcRn受体结合的能力，从而避免溶酶体途径对蛋白的降解；对于融合蛋白，所述活性是与病毒蛋白例如S蛋白结合的能力以及与FcRn受体结合的能力。所述突变体包括：与参照序列具有至少70％，至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％，优选至少99％的序列相同性并保留参照序列的所需活性(例如与病毒蛋白例如S蛋白结合的能力和/或与FcRn受体结合的能力)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在所述氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该参照序列的所需活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－50个以内，例如1-20、1-10、1-8、1-5或1-3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽或蛋白中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明的示例性ACE2-Fc融合蛋白如下所示：
M01：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:5所示的IgG1 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M02：由两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:5所示的IgG1 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M03：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:6所示的IgG2 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M04：由两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:6所示的IgG2 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M05：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M06：由两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M05F：由两个SEQ ID NO:3所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M06F：由两个SEQ ID NO:4所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
M07：由四个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:5所示的IgG1 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M08：由四个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:5所示的IgG1 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M09：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:5所示的IgG1 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M10：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:5所示的IgG1 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个失活ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个活性ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M11：由四个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:6所示的IgG2 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M12：由四个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:6所示的IgG2 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M13：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:6所示的IgG2 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M14：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:6所示的IgG2 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个失活ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个活性ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M15：由四个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过(GGGGS)3连接；
M16：由四个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M17：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M18：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M15F：由四个SEQ ID NO:3所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M16F：由四个SEQ ID NO:4所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，另两个ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M17F：由两个SEQ ID NO:3所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:4所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M18F：由两个SEQ ID NO:3所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:4所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个失活ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个活性ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)3连接；
M19：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc直接连接；
M20：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头GS连接；
M21：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头GGS连接；
M22：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头GGGS连接；
M23：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头GGGGS连接；
M24：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头(GGGGS)2连接；
M25：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头(GGGGS)4连接；
M26：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头(GGGGS)5连接；
M27：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头(GGGGS)6连接；
M28：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头(GGGGS)7连接；
M29：与M17的结构相同，但位于Fc的C端的ACE2部分与Fc通过接头(GGGGS)8连接；
Y01：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:8所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
Y03：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:8所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)4连接。
为了更好地在蛋白表达系统(例如毕赤酵母系统)中表达，本发明的融合蛋白中的ACE2部分也可以是部分或全部糖基化位点发生突变的ACE2部分。这些糖基化位点包含第53，90，103，322，432，546，690位的天冬酰氨残基，第55、92、105、324、434、548，692位的苏氨酸或丝氨酸。将其突变成无糖基化形式(例如丙氨酸)可以显著提高由毕赤酵母系统生产本发明融合蛋白的产量、纯度和酶活。本发明中，部分或全部糖基化位点发生突变的ACE2部分可以具有肽酶活性或不具有肽酶活性，例如通过本文他处所述的突变减弱或丧失肽酶活性。
在多价融合蛋白中，至少一个、两个、三个或四个ACE2部分的部分或全部糖基化位点发生突变。因此，本发明还包括如下所述的ACE2-Fc融合蛋白：
Y02：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分与SEQ ID NO:8所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中各ACE2部分均具有糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A，并且两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接；
Y04：由两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分、两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:8所示的IgG4 Fc组成的四价融合蛋白，其中两个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，两个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分分别与Fc的C端通过接头(GGGGS)4连接，其中各ACE2部分均具有糖基化突变：N53A，N90A，N103A，N322A，N432A，N546A。
如上所述，本发明的融合蛋白还可以是在Fc的N端(或C端)具有活性不同的ACE2部分的异源二聚体ACE2-Fc融合蛋白。进一步地，所述异源二聚体ACE2-Fc融合蛋白还可以在Fc中具有杵臼突变。例如，通过在一条IgG Fc中引入“杵”突变(例如T366位点的突变)，在另一条IgG Fc中引入“臼”突变(例如T366和/或L368和/或Y407位点的突变)，可产生稳定的基于杵臼互补的异源二聚体结构。因此，本发明还包括如下所述的ACE2-Fc融合蛋白：
KIH01：由一个SEQ ID NO:1所示的活性ACE2部分和一个SEQ ID NO:2所示的失活ACE2部分与SEQ ID NO:7所示的IgG4 Fc组成的二价融合蛋白，其中两个ACE2部分分别与Fc的N端直接连接，并且IgG4 Fc的一条链具有T366W突变，IgG4 Fc的另外一条链具有选自T366S、L368A和Y407V的一个或多个突变。
在某些实施方案中，本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的ACE2-Fc融合蛋白或其编码核酸作为活性物和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。本文中，药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对所述蛋白或核酸的接受者是无毒的，可包括本领域周知的治疗中常用于递送蛋白或核酸的各种类型的载体或赋形剂。药物组合物中的蛋白或核酸以治疗有效量存在。可根据不同的活性物种类、接受该蛋白或核酸的患者的年龄、性别、所患疾病的严重程度等确定本文所述蛋白或核酸的治疗有效量和剂型。可通过常规的给药方式给予本文所述的蛋白或核酸，例如口服或注射。本领域知晓针对不同剂型的给药方式。
本发明的融合蛋白或药物组合物可以治疗冠状病毒引起的疾病。如上所述，本发明的融合蛋白可以与冠状病毒本身结合从而中和病毒的毒性，并且具有延长的半衰期。本文所述的冠状病毒是有包膜的含单股正链RNA的冠状病毒属(Coronavirus)病毒，包括但不限于HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV、2019-nCoV(COVID-19)。冠状病毒的S蛋白(spike，纤突蛋白S)是冠状病毒感染细胞的关键蛋白，在病毒的组织或宿主嗜性和毒力等方面发挥重要作用。如图1所示，本发明的融合蛋白通过ACE部分与冠状病毒的S蛋白结合，阻止或降低冠状病毒蛋白与宿主细胞的结合从而中和毒性。因此，本发明的融合蛋白可以治疗冠状病毒引起的疾病。这些疾病包括但不限于中东呼吸综合征、重症急性呼吸综合征、急性呼吸窘迫综合症、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性呼吸窘迫、心衰、新型冠状病毒肺炎等。基于此，本文还提供一种治疗冠状病毒引起的疾病的方法，包括给予有需要的对象治疗有效量的本发明的融合蛋白或药物组合物。本文中，“个体”、“对象”或“患者”指哺乳动物，尤其指人。
本发明还包括本文所述的各种氨基酸序列、多肽、蛋白或其突变体的编码序列及其互补序列，以及含有所述编码序列或互补序列的核酸构建体。本文所述的编码序列包括经密码子优化而发生变化的序列，只要所编码的氨基酸序列不变即可。经密码子优化的序列可对具体物种表现出更适合的表达性。本领域周知对编码序列进行密码子优化的方法。本文中，核酸构建体是可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。该核酸构建体含有本文所述的编码序列或其互补序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建体是载体。具体而言，可将本文所述的编码序列克隆入许多类型的载体，这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒和粘粒。载体可以是表达载体，或者是克隆载体。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。当本文所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含本文所述的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的融合蛋白可通过化学合成或生物合成方法制备。本领域周知常规蛋白化学合成的过程和条件。本文所述生物合成方法是通过细胞表达方法，包含将表达本文所述ACE2-Fc融合蛋白的载体引入能表达所述融合蛋白的细胞并在能表达所述融合蛋白的条件下孵育细胞的步骤。所述细胞包括但不仅限于哺乳动物细胞CHO或毕赤酵母细胞。在毕赤酵母中表达所需的载体、启动子等组件本领域已知。为了更好地在毕赤酵母系统中表达，本发明的融合蛋白中的ACE2部分也可以是部分或全部糖基化位点发生突变的ACE2部分。本发明示例性的糖基化位点发生的突变的ACE2-Fc融合蛋白如上Y02和Y04所述。
本文还包括表达本文所述蛋白、包含本文所述多核苷酸序列或其核酸构建体的宿主细胞或工程细胞。宿主细胞或工程细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。
进一步地，本文还包括本文涉及的各种产品的应用，包括制药应用。具体而言，本文包括本文所述融合蛋白、本文所述核酸分子、本文所述核酸构建物在制备治疗冠状病毒引起的疾病或急性呼吸窘迫综合症的药物中的应用。冠状病毒引起的疾病包括但不限于中东呼吸综合征、重症急性呼吸综合征、冠状病毒引起的肺炎、肺动脉高压、急性呼吸窘迫、心衰、新型冠状病毒肺炎等。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的病因包括但不限于肺炎、误吸、肺挫伤、淹溺、有毒物质吸入；全身严重感染(细菌、病毒、真菌、非典型病原体)、恶性肿瘤、严重多发伤(多发骨折、连枷胸、严重脑外伤和烧伤)、休克、高危手术(心脏手术、大动脉手术等)、大量输血、药物中毒、胰腺炎和心肺转流术后等。基于此，本文还提供一种治疗冠状病毒引起的疾病的方法，包括给予有需要的对象治疗有效量的本发明的融合蛋白或药物组合物。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明。实施例中所用到的材料和方法，除非另有说明，否则为本领域常规的材料和方法。
本发明涉及的各序列如下：
活性ACE2-PD序列，SEQ ID NO:1
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYAD；
失活ACE2-PD序列，SEQ ID NO:2
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHNEMGNIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYAD；
活性ACE2-胞外域序列，SEQ ID NO:3
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSR)SRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS；
失活ACE2-胞外域序列，SEQ ID NO:4
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含有N297A突变的IgG1，SEQ ID NO:5
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
野生型IgG2，SEQ ID NO:6
RKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
含有S228P突变的IgG4，SEQ ID NO:7
SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
含有N297A和S228P突变的IgG4，SEQ ID NO:8
SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。
实施例1：在HEK293细胞中表达不同形式的ACE2-Fc系列融合蛋白
设计一系列不同形式的ACE2-Fc融合蛋白，其变化在于：
1)ACE2选取自肽酶结构域(PD结构域，其编号为M+数字，M指哺乳动物细胞表达)或全长胞外结构域(其中编号为M+数字+F，F代表全长)。
2)ACE2是否保留活性，即活性型与失活型，其中失活型将374和378位组氨酸(His)突变成为天冬酰氨(Asn)。
3)Fc段选取自人IgG1 Fc，IgG2 Fc，以及IgG4 Fc，其中IgG1 Fc包含了N297A糖基化位点突变以消除与Fcγ受体结合从而消除效应功能，IgG4 Fc引入S228P突变以消除链交换的产生。
4)不同价位：当通过在Fc N端和C端同时连接ACE2分子，其中C端加入(GGGGS)3连接肽与ACE2连接，形成四聚体形式的ACE2-Fc分子。总共设计分子如下表所示。
Figure BDA0002425260150000181
Figure BDA0002425260150000191
将上述24个分子的氨基酸序列交由苏州金唯智公司进行针对哺乳动物细胞的密码子优化，并合成、构建至pTT5载体中，其中信号肽序列选取自ACE2天然信号肽(MSSSSWLLLSLVAVTAA)。将上述24个分子进行质粒中抽提取，并通过聚乙烯亚胺(PEI)试剂转染200μg质粒至对数生长期，密度为1E6/ml的200ml HEK293细胞中，转染24小时后添加千分之五的Peptone以促进细胞生长。转染7天后，收获细胞，4000rpm离心30min，上清经0.22μm过滤膜后用ProteinA填料(博格隆)进行纯化并透析换液至PBS中，再次以0.22μm过滤膜无菌过滤保存。
利用BCA蛋白浓度定量试剂盒(翊圣生物)，按其说明书提供的操作规程对得到的24个ACE2系列融合蛋白进行定量，利用SEC-HPLC(G3000SWXL，TOSOH)对其进行聚体和纯度分析。结果如下：
Figure BDA0002425260150000192
Figure BDA0002425260150000201
实施例2：ACE2-Fc系列融合蛋白与2019-nCoV S蛋白RBD结构域的结合ELISA实验
对上述24个分子进行酶联免疫吸咐实验以表征不同分子对2019-nCoV S蛋白的结合能力。96孔ELISA板(Maxisorp,NUNC)用100μL的1μg/mL 2019-nCoV RBD(COV-VM4BD，恺佧生物)于4℃孵育过夜，然后用1％的BSA(牛血清白蛋白)溶液室温封闭2小时，用PBST洗三次。将不同浓度的人ACE2-Fc系列融合蛋白各100μL加入96孔板中，与包被的2019-nCoV RBD室温结合1小时，然后用PBST洗三次。接着加入与抗人IgG偶联的HRP酶(Goat anti-HumanIgG Fc Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,HRP,A18829，1:5000，赛默飞世尔科技中国有限公司)，并在室温结合0.5小时，然后用PBST洗三次。最后每孔加入100μL TMB底物(Solarbio，PR1200)显色，50μL ELISA终止液(Solarbio,C1058)终止反应。使用酶标仪(型号BioTek Elx800)在450nm处检测吸光度。利用GraphPad Prism软件进行数据处理，利用四参数回归模型计算半数效应浓度(EC50)。结果汇总如下：
Figure BDA0002425260150000202
Figure BDA0002425260150000211
上述实验结果表明，四聚体形式的ACE2-Fc融合蛋白相对于二聚体形式结合力提高了10倍左右，这可能是由于四聚体与2019-nCoV S蛋白之间形成的亲和力加合效应(Avidity)所致，提示其具有更强的抗2019-nCoV病毒感染活性。
实施例3：ACE2-Fc系列融合蛋白竞争阻断2019-nCoV S蛋白RBD与ACE2蛋白的结合
对上述24个分子进行竞争酶联免疫吸咐实验以表征不同分子对2019-nCoV S蛋白的阻断能力。96孔ELISA板(Maxisorp,NUNC)用100μL的1μg/mL2019-nCoV RBD(COV-VM4BD，恺佧生物)于4℃孵育过夜，然后用1％的BSA(牛血清白蛋白)溶液室温封闭2小时，用PBST洗三次。将不同浓度的人ACE2-Fc系列融合蛋白各50μL加入96孔板中，同时于各孔中加入50μL终浓度为的0.3nM ACE2 His-Biotin(ACE-HM401B，恺佧生物)，使其混合物与包被的2019-nCoV RBD室温结合1.5小时，然后用PBST洗三次。接着加入
Figure BDA0002425260150000212
High SensitivityStreptavidin-HRP(21130，1:15000，赛默飞世尔科技中国有限公司)，并在室温结合1小时，然后用PBST洗三次。最后每孔加入100μL TMB底物(Solarbio，PR1200)显色，50μL ELISA终止液(Solarbio,C1058)终止反应。使用酶标仪(型号BioTek Elx800)在450nm处检测吸光度。利用GraphPad Prism软件进行数据处理，利用四参数回归模型计算半数抑制浓度(IC50)。结果汇总如下：
分子编号 ELISA IC<sub>50</sub>(nM)
M01 8.9
M02 7.2
M03 9.6
M04 7.8
M05 8.3
M06 6.5
M05F 9.6
M06F 7.3
M07 0.39
M08 0.62
M09 0.43
M10 0.38
M11 0.36
M12 0.42
M13 0.69
M14 0.81
M15 0.26
M16 0.36
M17 0.23
M18 0.34
M15F 0.27
M16F 0.39
M17F 0.33
M18F 0.42
实施例4：ACE2-Fc系列融合蛋白的肽酶活性测定
对上述24个分子进行肽酶活性测定实验以表征不同分子的酶切活性。用75mMTris,1M NaCl,10μM ZnCl2,pH 7.5的Assay Buffer将人ACE2-Fc系列融合蛋白配制成0.2ng/μL的溶液，同时以相同的Assay Buffer稀释酶反应底物Mca-Y-V-A-D-A-P-K(Dnp)-OH Fluorogenic Peptide Substrate VI(ES007,R&D)到40μΜ。于比色皿中加入250μL的0.2ng/μL人ACE2-Fc系列融合蛋白溶液，接着加入250μL的40μΜ反应底物溶液，开始反应，同时设置不加蛋白而加Assay Buffer的对照孔。使用F-180荧光分光光度计(天津港东科技发展股份有限公司)在激发波长和发射波长分别为320nm和405nm的条件下，分别于动态模式下读数5分钟。利用比活度计算公式计算人ACE2-Fc系列融合蛋白的比活度：
比活度(pmol/min/μg)＝校正的Vmax(RFU/min)x换算因子(pmol/RFU)/每孔中酶(μg)，其换算因子利用不同浓度的MCA-Pro-Leu-OH(Bachem,Catalog#M-1975)制作标准曲线求得，其中酶量指人ACE2-Fc系列融合蛋白。
结果汇总如下：
Figure BDA0002425260150000231
Figure BDA0002425260150000241
实施例5：四聚体ACE2-Fc融合蛋白连接肽的筛选
在M17分子的基础上，对ACE2与Fc C端的连接肽进行筛选，设计一系列不同长短的连接肽如下：
分子编号 ACE2 Fc段 价位 连接肽
M17 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)3
M19 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 无
M20 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 GS
M21 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 GGS
M22 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 GGGS
M23 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 GGGGS
M24 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)2
M25 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)4
M26 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)5
M27 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)6
M28 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)7
M29 N端活性型，C端失活型 IgG4,S228P 四价 (GGGGS)8
将上述不同的分子序列进行密码子优化，基因合成并克隆至pTT5载体中，利用上述实施例1-4的方法进行表达纯化，SEC纯度分析，结合活性测试，阻断活性测试，酶学活性测试。结果汇总如下：
Figure BDA0002425260150000242
Figure BDA0002425260150000251
实施例6：利用毕赤酵母系统对ACE2-Fc系列融合蛋白进行表达
根据上述筛选实验结果，选定四个分子进行毕赤酵母系统表达。为避免酵母系统高甘露糖型的糖基化修饰对药物半衰期和免疫原性造成影响，将所有基于酵母的分子中其Fc段糖基化位点进行突变，ACE2分子的糖基化位点保留或突变，总共设计如下四个分子：
Figure BDA0002425260150000252
其中ACE2糖基化突变位点为53，90，103，322，432，546的天冬酰氨残基，突变成丙氨酸以形成无糖基化形式。上述四个分子进行基于毕赤酵母的密码子优化，合成基因并克隆至Invitrogen pPICZα载体中。按Invitrogen提供的EasySelect Pichia ExpressionKit说明书，将线性化的质粒通过电穿孔法转化至GS115感受态细胞中，通过Zeocin抗性对阳性克隆进行筛选。在3000μg/ml Zeocin抗性平板中选择10个克隆，在200mL BMMY培养基中以0.5％甲醇进行小量诱导表达三天，取上清进行Protein A纯化，并对每个分子产量最高的克隆进行上述SEC纯度分析，结合活性分析，抑制活性分析和酶学活性分析。
结果汇总如下：
Figure BDA0002425260150000261
实施例7：利用假病毒感染实验考察ACE2-Fc系列融合蛋白对2019-nCoV感染的中和作用
对实施例1-7中选定的13个ACE2-Fc融合蛋白分子进行2019-nCoV S假病毒中和实验以表征不同分子对2019-nCoV S蛋白感染的中和阻断能力。将pCMVR8.2慢病毒包装质粒、pHRCMV-Luc报告基因质粒和CMVR-2019-nCoV-S病毒真核表达质粒瞬时共转染293T细胞，于转染后48小时收集上清，离心并用0.45μm的滤器进行除菌过滤，获得包装过的2019-nCoV S假病毒，分装后部分假病毒-4℃保存，部分假病毒冻存于-80℃备用。使用HIV-1p24检测试剂盒检测并计算p24的含量，以确定用于中和试验的假病毒所需剂量。利用pcDNA3-ACE2真核表达质粒瞬时转染293T细胞，获得短暂表达ACE2的293T-ACE2细胞，以每孔1x104个293T-ACE2细胞铺板于96孔细胞培养板，每孔100μL，过夜培养。将不同浓度的人ACE2-Fc系列融合蛋白与利用p24的含量标准化过的2019-nCoV S假病毒溶液以1:1的体积比混合，于室温环境下作用10分钟。于上述96细胞培养板中加入融合蛋白和病毒的混合液100μL，共同作用16小时。更换新的培养液(不含病毒新鲜培养基)，每孔200μL，继续培养48h。使用萤火虫荧光素酶检测试剂盒及酶标仪(TACAN,
Figure BDA0002425260150000262
M1000全波长多功能酶标仪)检测萤火虫荧光素酶表达量。利用GraphPad Prism软件进行数据处理，利用四参数回归模型计算半数抑制浓度(IC50)。结果汇总如下：
Figure BDA0002425260150000263
Figure BDA0002425260150000271
实施例8：利用杵臼突变产生异源二聚体ACE2-Fc
在IgG4 Fc(含S228P突变)的一条链中通过引入T366W突变(“杵”突变)，IgG4Fc另外一条链中引入T366S/L368A/Y407V突变(“臼”突变)，可产生稳定的基于杵臼互补的异源二聚体结构。将活性型和失活型的ACE2 PD结构域分别融合至上述含杵和臼突变的IgG4 Fc(含S228P)片段，所述异源二聚化分子命名为KIH01。按实施例1所述的方法进行质粒共转染并表达纯化，并测试其结合活性，竞争抑制活性，肽酶活性，病毒中和活性，结果汇总如下：
产量(mg/200ml) 4.2
SEC纯度(单体百分比) 92％
结合ELISA EC50(nM) 0.194
竞争ELISA IC50(nM) 7.7
肽酶活性(pmol/min/μg) 589
病毒中和实验抑制活性IC50(nM) 4.7
序列表
<110> 上海英脉德医疗科技有限公司
<120> ACE2-Fc融合蛋白及其用途
<130> 201760
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 598
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp
595
<210> 2
<211> 598
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp
595
<210> 3
<211> 723
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
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Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
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Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
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Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
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Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
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355 360 365
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Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
625 630 635 640
Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser
690 695 700
Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
Pro Val Ser
<210> 4
<211> 723
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
625 630 635 640
Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser
690 695 700
Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
Pro Val Ser
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 6
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 7
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 8
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala

Claims (17)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含ACE2部分和Fc段；其中，所述ACE2部分选自：ACE2蛋白胞外域或其突变体，和所述胞外域的含ACE2蛋白PD结构域的片段或其突变体；所述Fc段选自IgG1、IgG2和IgG4的Fc段或其突变体，且所述IgG1的Fc段无ADCC活性。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述ACE2蛋白胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段为野生型胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段；所述胞外域或片段的突变体为无酶活的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者为糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者为无酶活、且糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者为具有酶活、但糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述无酶活的胞外域或其片段为374位和/或378位发生了突变的胞外域或其片段；优选为发生了H374N和/或H378N的胞外域或其片段。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述胞外域的突变体与野生型ACE2蛋白胞外域的序列同一性为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选97％以上，更优选99％以上；所述片段的突变体与野生型ACE2蛋白PD结构域的序列同一性为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选97％以上，更优选99％以上。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为含两个ACE2部分的二价形式，或含四个ACE2部分的四价形式。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有减弱的ACE2酶活。
7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述二价形式的融合蛋白中，一个ACE2部分为野生型ACE2胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，另一个ACE2部分为无酶活的突变型ACE2蛋白胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或
所述二价形式的融合蛋白中，两个ACE2部分均为野生型ACE2胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或者两个ACE2部分均为无酶活的突变型ACE2蛋白胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或
所述二价形式的融合蛋白中，至少一个ACE2部分为无酶活、且糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为具有酶活、但糖基化位点发生部分或全部突变的胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段。
8.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述四价形式的融合蛋白中，至少一个ACE2部分为野生型ACE2胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段，或至少一个ACE2部分为无酶活的ACE2胞外域或其含ACE2蛋白PD结构域的片段；任选地，至少一个ACE2部分的部分或全部糖基化位点发生突变。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述ACE2部分通过接头肽连接到Fc段；优选地，所述接头为含有G和S的接头。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IgG1 Fc包含N297A糖基化位点突变，所述IgG4 Fc具有S228P突变和任选的N297A突变，或
IgG Fc的两条链分别具有形成杵的突变和形成臼的突变，优选地，形成杵的突变是T366位点的突变，形成臼的突变是选自T366、L368和Y407中一个或多个位点的突变。
11.权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由酵母表达得到。
12.一种核酸分子，选自：
(1)编码权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列；
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
13.核酸构建物，其含有权利要求12所述核酸分子。
14.如权利要求13所述的核酸构建物，其为克隆载体或表达载体。
15.工程细胞，其特征在于，所述工程细胞：
(1)表达权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白；和/或
(2)含有权利要求12所述的核酸分子，或权利要求13或14所述的核酸构建物。
16.权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13或14所述的核酸构建物在制备治疗冠状病毒引起的疾病的药物中的应用。
17.权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13或14所述的核酸构建物在制备治疗急性呼吸窘迫综合症的药物中的应用。
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