KR102254246B1 - 항-cd163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 아데노바이러스 벡터, 및 이의 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 아데노바이러스 벡터, 및 이의 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다. 본 발명의 항-CD163 항체 또는 항원 결합 단편과, 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터는 돼지 폐포 마크로파지에서 아프리카 돼지열병 바이러스의 감염을 억제하는 능력을 나타내므로, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 아데노바이러스 벡터, 및 이의 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
유전자 치료는 유전자 재조합 기술을 이용하여 치료 유전자를 환자의 세포 안에 전달하여 대상세포의 유전적 변형을 일으키거나 특정 단백질을 발현시켜 유전적 질환 및 난치병 등을 치료하는 방법이다. 이 때 유전자를 생체 내로 전달하는 물질을 운반체 또는 벡터라고 하는데, 벡터는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분된다. 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스가 대표적이며, 비바이러스성 벡터로는 naked DNA, 리포좀(liposome) 등이 있다.
아프리카 돼지열병은 바이러스성 출혈 돼지 전염병으로, 주로 감염된 돼지의 분비물 등에 의해 직접 전파된다. 돼지과(Suidae)에 속하는 동물에만 감염되며, 고병원성 바이러스에 감염될 경우 치사율이 거의 100%에 이르기 때문에 한번 발생하면 양돈 산업에 엄청난 피해를 끼친다. 우리나라에서도 지난 2019년 9월 17일 파주에서 첫 발생 보고가 있은 이후, 지금까지 발생 및 예방적 살처분으로 11만여두의 돼지를 살처분하였으며, 2020년 2월 13일까지 야생 멧돼지에서 199건의 아프리카 돼지열병 바이러스가 검출되어 왔다. 아프리카 돼지열병 바이러스는 유전체의 크기가 약 180kb (염기쌍 18만 개) 로 다른 바이러스보다 수십 배 큰 유전체를 가지고 있으며, 이에 따라 바이러스가 만드는 단백질의 종류도 대단히 많다. 백신은 해당 바이러스의 특징적인 단백질을 찾아 이를 타깃으로 만드는데, 아프리카 돼지열병 바이러스는 단백질의 수가 많아 아직까지도 감염 메커니즘과 감염에 직접 관여하는 단백질을 발견하지 못하여 백신이 개발되지 못하고 있는 실정이다.
한편, Sαnchez-Torres 등(Archives of Virology volume 148, pages 2307-2323, 2003)은 단핵구가 성숙화되면 CD163의 발현이 증가하고, CD163+ 단핵구/마크로파지가 CD163- 단핵구/마크로파지와 비교하여 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 감수성이 높음을 확인하였으며, 항-CD163 항체가 아프리카 돼지열병 바이러스가 단핵구/마크로파지에 감염되는 것을 저해함을 확인한 바 있다.
Sαnchez-Torres et al., (Archives of Virology volume 148, pages 2307-2323, (2003)
본 발명자들은 아프리카 돼지열병을 치료하기 위하여 항-CD163 항체 또는 이들의 항원 결합 단편과, 이를 세포질 내에서 발현시켜 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들이 발굴한 항-CD163의 항원 결합 단편을 변형하여 아데노바이러스 벡터를 이용하여 도입하는 경우 돼지의 폐포 마크로파지(PAM)에서 아프리카 돼지열병 바이러스의 감염을 억제할 수 있음을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 N-말단과 C-말단에 폴리펩타이드 태그가 융합된, 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDRL1(complementarity determining region 1 of light chain), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDRL2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역(LV, light chain variable region); 및
(b) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDRH1(complementarity determining region 1 of heavy chain), 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDRH2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역(HV, heavy chain variable region).
본 명세서에서, CD163 (M130 antigen, Ber-Mac3, Ki-M8, SM4)은 130 kDa의 막 당단백질로, scavenger receptor cysteine-rich superfamily의 멤버이고, 헤모글로린-헵타글로빈 복합체의 수용체이다. CD163은 protects tissues from free 유리 헤모글로빈-매개 산화적 손상((free hemoglobin-mediated oxidative damage)로부터 조직을 보호한다. CD163 은 또한 헤모글로린/헵타글로빈의 세포내재화(endocytosis)와 이로 인한 헴(heme)의 분해를 통하여 철의 흡수와 재활용하는데 있어 역할을 수행한다. CD163은 단핵구와 마크로파지의 세포 표면에 특징적으로 발현되고, 염증의 후기 단계에서 발현된다. 구체적으로 CD163은 림프 폴리클의 맨틀존과 저미널 센터, interdigitating reticulum cell 및 랑게르한스 세포를 제외한 순환하는 단핵구와 대부분의 조직 마크로파지에 존재한다. CD163은 모든 CD14 양성 단핵구와, 대부분의 CD64 양성 단핵구에 존재하고, CD16 양성 단핵구에서 보다 높은 발현을 나타낸다. CD163은 단핵성 포식세포에서 IL-10, IL-6 및 덱사메타손에 의해 상향조절된다. LPS(Lipopolysaccharide)와 PMA(phorbol myristate acetate)는 모두 CD163을 세포 표면으로부터 혈장 또는 세포의 상등액으로 분비되도록 유도한다. CD163은 칼슘과 pH에 의존적으로 헤모글로빈/헵타글로빈 복합체에 결합하고, 헤모글로빈과 HP1S 표현형을 가진 다이머 헵토글로빈의 복합체보다, 헤모글로빈과 HP1F 표현형을 가진 멀티머 헵타글로빈의 복합체와 더 높은 친화성을 나타낸다. 또한, CD163은 타이로신 키나아제-의존적 칼슘의 이동과, 이노시톨 트리포스페이트의 생산, 및 IL-6 및 CSF1의 분비를 수반하는 세포내 신호전달의 연쇄적 과정을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14 내지 19 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CD163에 대하여 특이적 결합능을 가지며, 상기 CD163은 구체적으로 돼지의 CD163이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 항체는 2JB1으로 명명된 바 있다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 CD163에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab(fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain variable fragment, single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 항체는 구체적으로 Fab, scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 구체적으로는 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 구체적으로는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab, scFv 형태 또는 IgG1 형태이다.
본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항-CD163 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, CD163을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 N-말단에 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 음전하성 폴리펩타이드가 융합되고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 C-말단에 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 헤마글루티닌 태그가 융합된, 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드는 음전하를 띄고 낮은 등전점을 갖는 것으로 알려진 펩타이드 태그로서, 본 발명의 항원 결합 단편이 세포질 내에서 발현될 때 응집되는 것을 막고 항체로서의 기능을 발휘할 수 있게 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 헤마글루티닌 태그 또한 음전하를 띄고 낮은 등전점을 갖는 것으로 알려진 펩타이드 태그이다.
본 발명에서 융합 단백질이란, 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 공유결합에 의해 재조합 융합 단백질로 발현되는 것을 통해 연결된 2 이상의 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 2 이상의 폴리펩타이드가 화학적 컨쥬게이션에 의해 연결된, 2 이상의 폴리펩타이드를 지칭하기도 한다.
본 발명에서 통상의 기술자라면, 융합 단백질의 제작시 보통 융합하고자하는 기능적 일부분(moiety) 사이에 링커를 포함할 수 있으며, 서로 다른 특성을 가진 다른 종류의 링커, 예를 들어 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커 및 절단 가능한 아미노산 링커가 있다는 것을 알고 있을 것이다. 링커는 융합단백질의 발현량 증가, 생물학적 활성 향상, 타겟팅을 가능하게 하거나, 약동학을 변경시키기 위한 목적으로, 또는 융합단백질의 안정성을 증가시키고 폴딩을 향상시키기 위해 사용되어 왔다.
따라서 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 융합단백질은 적어도 하나의 링커, 예컨대 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커 및 절단 가능한 아미노산 링커로부터 선택되는 적어도 하나의 링커를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 융합 단백질은 적어도 하나의 링커로 연결된다.
이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:
여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다.
보다 더 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 (GGGGS)3 이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%, 또는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 ii) 상기 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 융합 단백질을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오티드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오티드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 i) 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 ii) 상기 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반하는데 이용될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD163 항원에 대하여 특이적으로 결합한다. 또한, 상술한 i) 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 ii) 상기 융합 단백질을 아데노바이러스에 클로닝하여 돼지의 폐포 마크로파지(PAM) 세포에 투여하는 경우, 아프리카 돼지열병 바이러스 Spain 70 분리주에 대하여 우수한 감염 억제능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 아프리카 돼지열병을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 (a) 아프리카 돼지열병의 진행/발전의 지연 또는 억제; (b) 아프리카 돼지열병의 경감; 및 (c) 아프리카 돼지열병의 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 척수강내 투여, 뇌실 내 투여(intracerebroventricular injection), 뇌 투여(intracerebral injection) 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 주사로 제제화되어 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 1×108 내지 1×1012 TCID50의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 아데노바이러스 벡터, 및 이의 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
본 발명의 항-CD163 항체 또는 항원 결합 단편과, 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터는 돼지 폐포 마크로파지에서 아프리카 돼지열병 바이러스의 감염을 억제하는 능력을 나타내므로, 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명자들이 스크리닝 한 항-CD163 항체의 아미노산 서열을 분석하기 위하여 LC-MS/MS 데이터로부터 얻은 펩타이드 단편의 서열을 어셈블리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 Ad5-s3Flag-scFv-HA의 돼지 폐포 마크로파지에서 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 감염 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 Ad5-s3Flag-scFv-HA의 돼지 폐포 마크로파지에서 아프리카 돼지열병 바이러스에 대한 감염 억제 효과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 돼지 CD163에 대한 폴리클로날 항체 제작
항체의 개발을 위해 돼지의 마크로파지 또는 모노사이트에서 발현되는 CD163 단백질을 구입(ab117700, abcam, MA, USA)하여 사용하였다. 돼지의 CD163 항원(130 kDa) 5 ug을 마우스에 대하여 동량의 프로인트 완전 어주번트와 혼합하고, 그 용액을 마우스의 여러 부위에 피내 주사하였다. 한 달 후, 상기 마우스에 최초 주사량의 1/10의 양으로 여러 위치에 피하 주사하여 추가 접종하였다. 추가 접종하고 7 내지 14일 후에 마우스로부터 혈액을 채취하여 항체 역가에 대해 혈청을 분석하였다. 역가가 높은 수치로 일정하게 될 때까지 마우스에 추가 접종을 하였고, 마우스로부터 심장 채혈을 하여 항체가 포함된 혈청을 분리하였다.
상기 돼지 CD163에 대한 항체가 포함된 혈청중에서 IgG만을 분리하기 위하여 protein A affinity chromatography를 실시하였다. 이 칼럼을 20 mM의 Tris 완충용액(pH 7.4)으로 충분히 activation 한 후, 혈청을 로딩하였다. 로딩 후, 20 mM의 Tris 완충용액으로 충분히 세척한 다음, 0.2 M의 Glycine-HCl (pH 3.0)으로 용출하여 PBS 버퍼로 투석하고, 항체를 정제하였으며, 수득된 항-CD163 폴리클로날 항체의 특이성은 ELISA로 확인하였다.
실시예 2: 항체 서열 분석(de novo sequencing)
상기 실시예 1에서 수득한 항-CD163 폴리클로날 항체의 서열을 분석하기 위해서 RAPID NOVOR사에 상기에서 선발된 항체를 송부하여 LC-MS/MS 데이터로부터 아미노산 서열을 분석하였다. 먼저 펩신, 트립신, 키모트립신, Asp N, Lys C, 및 비특이적 단백질 절단효소, 총 6종의 효소를 사용하여 7개의 효소처리 결과물을 준비하였다. 다음으로 각각의 효소처리 결과물에 대하여 이황화 결합의 환원, 알킬화, 효소 소화를 진행하였다. 효소소화가 완료된 펩타이드 단편들로부터 Thermo-Fisher Orbitrap FusionTM mass spectrometer를 사용하여 LC-MS/MS 데이터를 얻었고, de novo 펩타이드 시퀀싱 및 어셈블리 처리를 거쳐 항체의 서열을 분석하였다. 분석과정에서 생성된 경쇄와 중쇄의 어셈블리 과정을 도 1 및 도 2에 나타내었다. 분석 결과, 폴리클로날 항체의 서열을 수득하였으며, 이중 돼지 CD163에 대한 특이성이 가장 높은 항체를 2JB1로 명명하였다. 2JB1 항체의 경쇄 아미노산 서열과 중쇄 아미노산 서열을 각각 서열번호 1 및 2로 표시하였다. 상기 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열 중 CDR(complementarity determining region) 서열은 다음 표 1 및 표 2에 정리하였다.
구분 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
CDRL1 | RASESVYAYGNTFMH | 3 |
CDRL2 | RTSNLES | 4 |
CDRL3 | QQTNEDPFT | 5 |
구분 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
CDRH1 | GYTFTNY | 6 |
CDRH2 | YPGGGN | 7 |
CDRH3 | ERNDYSSLDY | 8 |
실시예 3: 돼지 CD163으로 면역화된 마우스로부터 수득한 B cell의 단일세포 시퀀싱 및 HCDR3 서열의 특성 비교
항체의 CDR 서열의 길이와 조성은 매우 가변적이며, 특히 CDR3의 서열이 가변적인 것으로 알려져 있다. 이러한 다양성의 원천은 상대적으로 적은 수의 항체 유전자로부터 고도로 가변적인 항체의 풀을 생성할 수 있는 복잡한 유전적 메커니즘에 있는 것으로 알려져 있다. 가변영역은 두개의 유전자(V, J 유전자; kappa 및 lambda chain의 경우) 또는 세 개의 유전자(V, D, J 유전자; heavy chain의 경우)의 다양한 조합에 의해 형성된다. 마우스의 경우 Vκ가 85종, Jκ 4종이고, Vλ가 2종, Jλ가 3종이며, VH가 134종, DH가 13종, JH가 4조으로 매우 다양한 조합이 가능하다. 항체의 CDR 서열에 있어서 CDR3의 서열이 항체의 항원에 대한 결합에 가장 많은 기여를 하는 것으로 알려져 있으며, CDR3의 서열의 길이가 길고 소수성이 높을수록 항체의 결합력이 우수한 것으로 알려져 있다.
항체의 VDJ 유전자 중 D 유전자에서 유래한 아미노산의 소수성이 강한 것으로 알려져 있으므로, 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 채취한 비장으로부터 B cell을 분리하고, 이를 96웰 플레이트에 single cell로 분주하고, 각 세포의 VDJ 유전자를 시퀀싱하였다. 상기 VDJ 유전자의 시퀀스 데이터를 바탕으로 HCDR3의 아미노산 숫자와 VH, DH, JH 유전자로부터 유래한 HCDR3의 아미노산 서열을 분석하였으며, 각 HCDR3의 서열의 hydropathicity index (H.I.)를 계산하였다. 상기 실시예 2에서 선발한 항체 2JB1의 CDR 서열과 일치하는 아미노산 서열을 가진 B cell을 11개 선발하고, 이를 A1 내지 A11로 코드명을 붙였다. 상기 11개의 B cell 중 HCDR3의 아미노산 길이 및 H.I. 값이 높은 5개의 PMBC 및 이들의 HCDR3의 아미노산 서열을 표 3에 나열하였다.
코드명 | DH 유래 아미노산의 H.I. | 아미노산 서열 | SEQ ID NO | ||
VH | DH | JH | |||
A5 | 2.9 | ERNDYS | IMVLSL | DY | 9 |
A6 | 2.24 | ERNDYS | AIMSL | DY | 10 |
A2 | 2.18 | ERNDYS | AMVSL | DY | 11 |
A4 | 2.175 | ERNDYS | MLSL | DY | 12 |
A9 | 1.63 | ERNDYS | MSL | DY | 13 |
2JB1.00 | 1.5 | ERNDYS | SL | DY | 8 |
본 발명자들은 상기 표 3에서 확인한 DH 유전자 유래의 아미노산의 H.I.값이 높은 순으로 다음과 같은 서열의 scFv를 제작하였다. 각 scFv의 아미노산 서열은 표 4에 나타내었다.
항체명 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
2JB1.A5 | QVQLQQSGPDLVKPGTSVRISCKAS GYTFTNY NIHWAKQRPGQGLEWIGWI YPGGGN TKYSEKFRGKATLTADKSSNTVYMQLNSLTSEDSAVYFCAR ERNDYSIMVLSLDY WGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVYAYGNTFMH WYQQKPGQPPKLLIY RTSNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYC QQTNEDPFT FGSGTKLEIN | 14 |
2JB1.A6 | QVQLQQSGPDLVKPGTSVRISCKAS GYTFTNY NIHWAKQRPGQGLEWIGWI YPGGGN TKYSEKFRGKATLTADKSSNTVYMQLNSLTSEDSAVYFCAR ERNDYSAIMSLDY WGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVYAYGNTFMH WYQQKPGQPPKLLIY RTSNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYC QQTNEDPFT FGSGTKLEIN | 15 |
2JB1.A2 | QVQLQQSGPDLVKPGTSVRISCKAS GYTFTNY NIHWAKQRPGQGLEWIGWI YPGGGN TKYSEKFRGKATLTADKSSNTVYMQLNSLTSEDSAVYFCAR ERNDYSAMVSLDY WGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVYAYGNTFMH WYQQKPGQPPKLLIY RTSNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYC QQTNEDPFT FGSGTKLEIN | 16 |
2JB1.A4 | QVQLQQSGPDLVKPGTSVRISCKAS GYTFTNY NIHWAKQRPGQGLEWIGWI YPGGGN TKYSEKFRGKATLTADKSSNTVYMQLNSLTSEDSAVYFCAR ERNDYSMLSLDY WGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVYAYGNTFMH WYQQKPGQPPKLLIY RTSNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYC QQTNEDPFT FGSGTKLEIN | 17 |
2JB1.A9 | QVQLQQSGPDLVKPGTSVRISCKAS GYTFTNY NIHWAKQRPGQGLEWIGWI YPGGGN TKYSEKFRGKATLTADKSSNTVYMQLNSLTSEDSAVYFCAR ERNDYSMSLDY WGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVYAYGNTFMH WYQQKPGQPPKLLIY RTSNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYC QQTNEDPFT FGSGTKLEIN | 18 |
2JB1.00 | QVQLQQSGPDLVKPGTSVRISCKAS GYTFTNY NIHWAKQRPGQGLEWIGWI YPGGGN TKYSEKFRGKATLTADKSSNTVYMQLNSLTSEDSAVYFCAR ERNDYSSLDY WGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVYAYGNTFMH WYQQKPGQPPKLLIY RTSNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYC QQTNEDPFT FGSGTKLEIN | 19 |
실시예 4: 세포질 내 항체 컨스트럭트의 제작
본 발명자들은 상기에서 제작한 두 가지의 항-CD163 scFv를 세포 내에서 발현시켜 세포질 내에서 세포질 내 항체(cytoplasmic antibody)intrabody를 제조하고자 하였다. 세포질 내에서 발현된 항체는 쉽게 응집체를 형성하여 항체로서의 기능을 수행할 수 없는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 이러한 항체의 세포질 내 응집을 저해하기 위하여 서열번호 20으로 표시되는 음전하 및 낮은 등전점을 갖는 펩타이드 태그(s3Flag)를 상기 항-CD163 scFv의 N-말단에 부착하고, 서열번호 22로 표시되는 낮은 등전점(3.53)을 가진 것으로 알려진 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) 태그를 항-CD163 scFv의 C-말단에 부착하여, s3Flag-scFv-HA와 같은 구조의 펩타이드 단편을 제작하였다.
실시예 5: Ad5-s3Flag-scFv-HA의 제작
상기 실시예 3으로부터 얻은 s3Flag-scFv-HA 컨스트럭트를 이용하여 아데노바이러스 벡터를 제조하였다. Adenoviral shuttle plasmid 벡터인 pAvCvSv를 Microbix사(Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada)로부터 구입한 pXCJL-1에 promoter와 polyadenylation signal을 추가하여 제조하였다. human cytomegalovirus promoter와 translation enhancer 서열은 multiple cloning site의 상부에 삽입되었고 SV40 polyadenylation signal은 하부에 추가되었다. pXCJL-1은 pBR322를 기본구조로 human adenovirus type 5(Ad5) 5'-inverted terminal repeat (ITR), Ad5의 origin of replication, Ad5 encapsidation signal, E1-alpha enhancer 및 multiple cloning site를 포함하고 Ad5의 3328부터 6246 nucleotide까지가 상동재조합 fragment로 작용한다.
재조합 아데노바이러스(Ad5-s3Flag-scFv-HA)는 실시예 4에서 제작한 여섯 가지 cDNA 컨스트럭트(s3Flag-2JB1.A5-HA, )를 클로닝한 pAvCvSv와 Ad5 DNA를 포함하는 pJM17를 HEK293 세포에 cotransfection하여 제작하였다. pJM17만 transfection시키면 복제는 가능하나 infectious virions으로 packaging이 일어나지 않으므로 s3Flag-scFv-HA를 인코딩하는 실시예 4의 cDNA를 pAvCvSv의 blunt-ended Bgl II site에 서브클로닝하여 만든 shuttle plasmid (10 μg)를 10 μg의 supercoiled pJM17과 함께 HEK293 세포에 calcium phosphate를 사용하여 co-transfection하였다. Transfection 2주 후 infectious recombinant adenoviral vector plaques을 골라서 HEK293 세포에 propagation하고 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 스크리닝하여 s3Flag-scFv-HA를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 CsCl density ultracentrifugation에 의해 대량 정제하여 사용하였다.
실시예 6: Ad5-s3Flag-scFv-HA의 아프리카 돼지열병에 대한 방어능 확인
실시예 5에서 제조된 Ad5-s3Flag-scFv-HA가 발현하는 세포질 내 scFv의 아프리카 돼지열병에 대한 방어능을 확인하고자, 돼지의 폐포 마크로파지(porcine alveolar macrophage, PAM)에 Ad5-s3Flag-scFv-HA를 접종하고, 아프리카 돼지열병 바이러스를 공격 접종한 후 아프리카 돼지열병 바이러스에 감염된 세포를 계수하였다. 음성 대조군으로는 s3Flag-scFv-HA가 포함되지 않은 Ad5 벡터를 사용하였다.
돼지의 폐포 마크로파지(PAM)은 아프리카 돼지열병이 감염되지 않은 돼지에서 BAL(bronchalveolar lavage)를 실시하여 수득하였다. 실시예 5에서 제조된 Ad5-s3Flag-scFv-HA 컨스트럭트들 및 s3Flag-scFv-HA가 포함되지 않은 Ad5 벡터를 각각 5 μl (titer: 1 Х 1011 TCID)로 PAM에 접종하고, 37℃에서 1.5-2.0시간 동안 인큐베이션 한 후, 무혈청 배지로 4회 워싱하였다. Ad5-s3Flag-HA 로 각각 트랜스펙션된 PAM 세포를 다시 7일 동안 인큐베이션 한 후, 100 TCID50의 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 Recombinant virus 1207VR △TKβ-gal를 상기 각 아데노바이러스 벡터로 트랜스펙션된 PAM 세포에 각 실험군 별로 접종하고 2시간 동안 인큐베이션 한 후 워싱하였다. 14시간 동안 인큐베이션을 수행하면 상기 재조합 아프리카 돼지열병 바이러스 1207VR △TKβ-gal에 감염된 PAM에서는 X-Gal로 염색된다(G´omez-Puertas P et al., J Virol Methods 55: 271-279, 1995).
결과는 표 5 및 도 3에 나타내었다.
실험군 | Ad5-s3Flag-2JB1.A5-HA | Ad5-s3Flag-2JB1.A6-HA | Ad5-s3Flag-2JB1.A2-HA | Ad5-s3Flag-2JB1.A9-HA | Ad5-s3Flag-2JB1.00-HA | Ad5 (음성대조군) |
감염 억제율 | 71% | 65% | 59% | 61 | 49 | 2% |
표 5 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Ad5-s3Flag-scFv-HA는 아프리카 돼지열병에 대한 감염 억제효과를 나타내었고, 특히 최초의 폴리클로날 항체 2JB1에서 유래한 Ad5-s3Flag-2JB1.00-HA보다 CDR3의 아미노산 서열이 길고 DH에서 유래한 소수성 아미노산을 더 포함하는 Ad5-s3Flag-2JB1.A5-HA, Ad5-s3Flag-2JB1.A6-HA, Ad5-s3Flag-2JB1.A2-HA, 및 Ad5-s3Flag-2JB1.A9-HA의 감염 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
<110> KuVet
<120> Nucleic acid encoding anti-CD163 antibody or antigen binding
fragment thereof, Adenovirus vector comprising the same, and use
thereof in the prevention or treatment of African swine fever
<130> PN200026
<160> 23
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Light chain variable region of 2JB1.00
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Heavy chain variable region of 2JB1.00
<400> 2
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Tyr Gly Asn
20 25 30
Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val
65 70 75 80
Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp
85 90 95
Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp
100 105 110
Ala Ala
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of LCDR1 of 2JB1.00
<400> 3
Arg Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of LCDR2 of 2JB1.00
<400> 4
Arg Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of LCDR3 of 2JB1.00
<400> 5
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR1 of 2JB1.00
<400> 6
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR2 of 2JB1.00
<400> 7
Tyr Pro Gly Gly Gly Asn
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR3 of 2JB1.00
<400> 8
Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR3 of 2JB1.A5
<400> 9
Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ile Met Val Leu Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR3 of 2JB1.A6
<400> 10
Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ala Ile Met Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR3 of 2JB1.A2
<400> 11
Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ala Met Val Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR3 of 2JB1.A4
<400> 12
Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Met Leu Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of HCDR3 of 2JB1.A9
<400> 13
Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Met Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 2JB1.A5
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ile Met Val Leu Ser Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser
180 185 190
Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
245
<210> 15
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 2JB1.A6
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ala Ile Met Ser Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Ser Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Asn
245
<210> 16
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 2JB1.A2
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ala Met Val Ser Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Ser Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Asn
245
<210> 17
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 2JB1.A4
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Met Leu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Glu Ser Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu
180 185 190
Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Asn
245
<210> 18
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 2JB1.A9
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Met Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
130 135 140
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu
145 150 155 160
Ser Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Glu
180 185 190
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Asn
<210> 19
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 2JB1.00
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Asp Tyr Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
130 135 140
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Tyr Ala Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Glu Ser
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Asn
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of s3Flag
<400> 20
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 21
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence of s3Flag
<400> 21
gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca tcgattacaa ggatgacgat 60
gacaag 66
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of hemagglutinin
<400> 22
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence of hemagglutinin
<400> 23
tacccatacg atgttccaga ttacgct 27
Claims (8)
- 다음을 포함하는 항-CD163 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDRL1(complementarity determining region 1 of light chain), 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDRL2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDRL3를 포함하는 경쇄가변영역(LV, light chain variable region); 및
(b) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDRH1(complementarity determining region 1 of heavy chain), 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDRH2, 및 서열번호 8 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 CDRH3를 포함하는 중쇄가변영역(HV, heavy chain variable region).
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14 내지 19 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 scFv인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 N-말단에 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 음전하성 폴리펩타이드가 융합되고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 C-말단에 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 헤마글루티닌 태그가 융합된, 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제3항의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제5항의 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터.
- 제6항의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제7항의 약제학적 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 아프리카 돼지열병의 예방 또는 치료방법.
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2020
- 2020-03-23 KR KR1020200035235A patent/KR102254246B1/ko active IP Right Grant
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