CN111587254A - 包含抗cd38和抗cd138嵌合抗原受体的t-细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表达至少两种不同的嵌合抗原受体的T‑细胞，其中所述CAR中的一者特异性结合到CD138，并且另一种CAR特异性结合到CD38。具体来说，本发明提供了表达两种不同CAR的T‑细胞，其中一种CAR包含抗CD138 scFv，并且第二CAR包含抗CD138 scFv。此外，本发明提供了一种包含这些双重CAR T‑细胞的药物组合物及其在癌症、特别是多发性骨髓瘤的治疗中的用途，以及制备这些细胞的方法。

Description

包含抗CD38和抗CD138嵌合抗原受体的T-细胞及其用途
技术领域
本发明涉及表达至少两种嵌合抗原受体(CAR)的T-细胞，其中所述CAR中的一种特异性结合到CD138并且另一种CAR特异性结合到CD38。本发明还涉及包含所述细胞的药物组合物以及它们在治疗癌症中的用途，特别是治疗多发性骨髓瘤的用途。
背景技术
嵌合抗原受体T-细胞(CAR-T)疗法是一种新开发的过继性抗肿瘤治疗方法。遗传修饰的T细胞表达嵌合抗原受体，其通常由信号末端结构域(例如来自于FcR的CD3-ζ或γ链)、跨膜结构域和赋予所述受体针对靶恶性细胞上的肿瘤相关抗原的特异性的源自于单克隆抗体的细胞外单链可变片段(scFv)构成。在通过所述嵌合抗原受体结合肿瘤相关抗原后，所述在T细胞(CAR T-细胞)上表达的嵌合抗原受体增强对所述恶性细胞具有细胞毒性的免疫应答。理论上，CAR-T细胞通过与肿瘤细胞表面上表达的肿瘤相关抗原(TAA)的相互作用，可以特异性定位并消除肿瘤细胞。
尽管该领域发展迅速，但高效安全的CAR-T治疗方法的开发仍面临许多挑战。许多已知和众多尚未确定的因素可能对在不同试验中以及个体患者之间的临床反应中观察到的可变性有贡献。必须考虑的因素是例如T-细胞的体内命运、肿瘤的特性和安全性。为了提高安全性和效能，提出了产生用在结合到一种抗原后提供亚最适活化的CAR和识别第二抗原的嵌合共刺激受体转导的T-细胞(Kloss等，2013，Nature Biotechnology,13,71-75，WO2014/055668和WO 2015/142314)。在考虑癌症治疗时总是成为主要障碍之一的另外的因素是靶标的选择。真正肿瘤特异性的表面抗原很难鉴定，并且减轻危及生命且出人意料的脱靶毒性的有效机制的实施至关重要。
多发性骨髓瘤(MM)是一种不可治愈的浆细胞(PC)恶性肿瘤，其在骨髓中发生，并最终引起肾衰竭、伴有重复感染的免疫抑制、贫血和骨骼病变。当前的疗法包括蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂，已在多发性骨髓瘤患者中实质性改善了结果。不幸的是，这些患者中的大多数复发，并且在接触这些类型的药剂后治疗选项受限。尽管CAR-T疗法原则上可以克服MM的“经典”治疗的一些问题，但CAR T-细胞疗法的开发中的主要障碍是它们的显著中靶脱组织(on-target off-tissue)毒性。仅有少数蛋白质并且事实上没有任何细胞表面抗原是被恶性细胞专一地表达的，导致不想要地靶向了健康组织。因此，寻找仅在肿瘤细胞上特异性表达的抗原已变成鉴定MM中的CAR靶标的主要目的。几种与骨髓瘤相关的表面分子被确定为可通过CAR疗法靶向的潜在靶标。这些靶标包括CD38、CD40、CD44、CD47、CD54、CD56、CD138、CD200、CD307等(Atanackovic等，British Journal of Haematology,2016,172,685–698)。然而，这些靶中没有一个专一地存在于癌细胞上，因此当将这些靶用于CAR-T细胞疗法时，可以预期会发生显著的脱靶效应。
Chen等人(Leukemia 2017，doi:10.1038/leu.2017.302)表明靶向骨髓瘤细胞上的BCMA和CS1可能潜在地是增强针对骨髓瘤肿块疾病的应答的有效策略。
CD38是一种45-kD的II型跨膜糖蛋白，其与脂筏上的细胞表面受体结合，调控细胞质Ca2+流量，并在淋巴系和髓系细胞中介导信号转导。CD38在骨髓瘤细胞上高度且均匀地表达，并且在正常淋巴系和髓系细胞上以及某些非造血来源的组织中以相对低的水平表达，使其成为骨髓瘤治疗中的潜在靶标。一种人类IgG1κ单克隆抗体达雷木单抗(HuMax-CD38，GenMab)结合到独特的CD38表位。临床前研究显示，达雷木单抗利用包括补体介导的和抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性作用、抗体依赖性的细胞吞噬作用、凋亡以及在较小程度上CD38的酶活性的抑制在内的多种机制，诱导了表达CD38的肿瘤细胞的靶细胞杀死。抗CD38单克隆抗体被描述在例如US 7,829,673中。
CD138是一种表面蛋白，其作为与细胞外基质分子胶原蛋白和纤连蛋白结合的粘附分子起作用。抗CD138抗体以前已被描述在例如US9,221,914中。尽管CD138被认为是最有希望的标志物之一，但在使用免疫偶联物BT062作为单一药剂的I/II期研究中，23位患者中仅有1位显示出目标临床反应(Atanackovic等)。此外，CD138在许多成熟的上皮细胞上表达。事实上，在那些临床试验中观察到肝和皮肤毒性，表明可以预期针对CD138的CAR-T治疗的显著副作用。
上述其他靶标也有其优点和缺点，其中大多数与高水平的副作用有关，这使靶标的选择仍然是开发安全高效的CAR-T疗法的主要障碍之一。在允许长期安全地治疗多发性骨髓瘤且具有较少的脱靶副作用的其他CAR T治疗系统的合理开发中，存在着未满足的需求。
发明内容
现在，根据本发明，公开了被遗传修饰以表达能够结合到多发性骨髓瘤细胞上经仔细选择的两种不同的靶标、即CD38和CD138的两种分开的不同CAR的T-细胞，有效地治疗所述癌症并延长存活期。此外，所述CAR系统的其中一种CAR仅带有活化结构域并且第二个CAR仅带有共刺激结构域的特定设计，允许降低与所述T-细胞的“中靶脱肿瘤”结合相关的副作用的严重性。这种设计允许获得具有降低的副作用的高效治疗。根据一个方面，本发明提供了一种T-细胞，其被遗传修饰以表达至少两种不同且分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域。根据某些实施方式，所述特异性结合到CD38或CD138的抗原结合结构域分别是抗CD38和抗CD138抗体的单链可变结构域(scFv)。因此，根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其被遗传修饰以表达两种不同且分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。
根据某些实施方式，所述抗CD138 scFv包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：13或其类似物的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：14或其类似物的VH结构域，其中所述抗CD138scFv的VL和VH结构域通过肽连接物相连，并且其中所述类似物与亲本(原始)序列具有至少70％的同一性。
根据其他实施方式，所述抗CD38 scFv结构域包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：15或其类似物的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：16或其类似物的VH结构域，其中所述抗CD38 scFv的VL和VH结构域通过肽连接物相连，并且其中所述类似物与原始序列具有至少70％的同一性。
根据某些实施方式，所述CAR中的至少一者包含共刺激结构域，并且所述CAR中的另一者包含活化结构域。根据一个实施方式，所述共刺激结构域是CD28、4-1BB、OX40、iCOS、CD27、CD80、CD70的共刺激结构域。根据其他实施方式，所述活化结构域选自FcRγ和CD3-ζ。
根据某些实施方式，所述第一CAR包含共刺激结构域并且不含活化结构域，并且所述第二CAR包含活化结构域并且不含共刺激结构域。根据一个实施方式，所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23或其类似物，并且所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ IDNO：22或其类似物。
根据某些实施方式，所述第一CAR的跨膜结构域具有序列SEQ ID NO：35或其类似物。根据其他实施方式，所述第二CAR的跨膜结构域具有序列SEQ ID NO：36或其类似物。
根据某些实施方式，本发明提供了被工程化改造以表达两种分开的嵌合抗原受体(CAR)的CAR T-细胞，其中所述第一CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：24或是其类似物，并且所述第二CAR具有SEQ ID NO：25中的氨基酸序列或是其类似物。
根据一个实施方式，所述T-细胞是CD4+ T-细胞。根据另一个实施方式，所述T-细胞是CD8+ T-细胞。根据上述实施方式中的任一者，所述T-细胞表达本发明的CAR。
根据另一方面，本发明提供了一种T-细胞，其包含编码本发明的两种或更多种CAR的一种或多种DNA构建物的至少一个拷贝。根据一个实施方式，所述T-细胞包含DNA构建物的至少一个拷贝，其编码：(A)从5’至3’(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者；和(B)从5’至3’(v)前导肽，(vi)抗CD38 scFv结构域，(vii)跨膜结构域II和(viii)共刺激结构域、活化结构域或两者；其中(A)和(B)被自切割肽分隔开。
根据某些实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)活化结构域。根据其他实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv，(iii)跨膜结构域II，(iv)活化结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD138 scFv结构域，(viii)跨膜结构域I和(ix)共刺激结构域。根据某些实施方式，所述自切割肽由DNA序列SEQ ID NO：27或其变体编码。
可选地，所述T-细胞包含两种不同的编码本发明的CAR的DNA构建物，其中所述第一DNA构建物包含的序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I和(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，并且所述第二DNA构建物包含的序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv结构域，(iii)跨膜结构域II和(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者。
根据上述实施方式中的任一者，所述抗CD138 scFv由SEQ ID NO：28中示出的DNA序列或其变体编码。根据其他实施方式，所述抗CD38 scFv由DNA序列SEQ ID NO：29或其变体编码。根据其他实施方式，所述共刺激结构域由DNA序列SEQ ID NO：30或其变体编码。根据又一个实施方式，所述活化结构域由DNA序列SEQ ID NO：31或其变体编码。根据某些实施方式，所述前导肽由DNA序列SEQ ID NO：39或其变体编码。根据某些实施方式，所述跨膜结构域I由SEQ ID NO：37中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述跨膜结构域II由SEQ ID NO：38中示出的DNA序列或其变体编码。
根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其包含具有DNA序列SEQ ID NO：34或其变体的DNA构建物的至少一个拷贝。
根据其他实施方式，本发明提供了一种CAR T-细胞，其包含两种DNA构建物中的每一者的至少一个拷贝，其中所述第一DNA构建物包含DNA序列SEQ ID NO：32或其变体，并且所述第二DNA构建物包含DNA序列SEQ ID NO：33或其变体。
根据另一方面，本发明提供了一种DNA构建物，其编码至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且所述第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域。根据一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码：(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，(iv)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)共刺激结构域、活化结构域或两者。根据一个实施方式，本发明提供了一种DNA构建物，其包含DNA序列SEQ ID NO：32和DNA序列SEQ ID NO：33或其变体。根据另一个实施方式，本发明提供了一种DNA构建物，其包含DNA序列SEQ ID NO：34或其变体。
根据另一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的DNA构建物。根据一个实施方式，所述载体包含含有DNA序列SEQ ID NO：32和DNA序列SEQ ID NO：33或其变体的DNA构建物。根据另一个实施方式，所述载体包含含有DNA序列SEQ ID NO：34或其变体的DNA构建物。根据某些实施方式，所述载体是病毒载体。
根据又一方面，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的DNA构建物或载体。根据一个实施方式，所述细胞是原核细胞。根据另一个实施方式，所述细胞是真核细胞。根据某些实施方式，所述细胞是人类细胞。根据另一个实施方式，所述细胞是T-细胞例如CD4+或CD8+T-细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含多个本发明的CAR T-细胞。根据一个实施方式，所述T-细胞被遗传修饰以表达本发明的两种CAR。根据一个实施方式，所述T-细胞表达本发明的CAR。根据其他实施方式，所述T-细胞包含编码本发明的两种CAR的DNA构建物或编码本发明的所述两种不同CAR的两种或更多种不同构建物。根据某些实施方式，本发明的药物组合物用于治疗癌症。根据一个实施方式，所述癌症是多发性骨髓瘤。根据某些实施方式，所述T-细胞被遗传修饰以表达具有氨基酸序列SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：25的两种CAR。
根据另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症例如多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括给药有效量的本发明的T-细胞。根据另一方面，本发明提供了一种用于制备被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的T-细胞的方法，其中所述第一CAR包含抗CD38 scFv并且所述第二CAR包含抗CD138 scFv，所述方法包括用本发明的DNA构建物转染T-细胞。
附图说明
图1示出了双CAR DNA构建物的设计方案：VL和VH是scFv的被连接物分隔开的部分，T2A是自切割肽，CD28是指CD28的共刺激元件，并且FcRγ是活化结构域。
图2示出了通过IFN-γ测定法测试的用不同CAR构建物转导的T-细胞与表达CD38和CD138的CAG细胞系相互作用的能力。所述图代表了4次重复测定；所述图示出了IFN-γ的分泌，暗示了存在如图中所标示的不同转导T-细胞的刺激。
图3示出了表达不同水平的CD38和CD138的靶细胞对CAR T-细胞的刺激：图3A-不同细胞系的刺激；图3B-CAR T-细胞对正常原生组织的活性的比较。结果被表示为以pg/ml为单位的IFN-γ浓度(ELISA)。
图4示出了CAG-LUC细胞被双CAR T细胞杀死。将表达萤光素酶的CAG细胞与转导的CAR T细胞温育。
图5示出了来自于移植有人类CAG多发性骨髓瘤细胞系的NSG小鼠的组织与对照相比的抗人类CD138抗体免疫组织学的图像。
图6示出了用CAG多发性骨髓瘤细胞注射并用转导有不同CAR构建物的T-细胞治疗的小鼠的存活曲线。
图7示出了来自于移植有CAG细胞系并用SW1或双CAR治疗的存活小鼠的组织的苏木精和曙红(H&E)染色。
图8示出了在治疗的小鼠中表达萤光素酶的MM肿瘤(CAG-Luc)的图像。对用MMCAG-Luc注射然后注射不同CAR(第8天)的小鼠进行监测以观察治疗效果。
图9示出了CD138 CAR T-细胞对小鼠皮肤的毒性(左图小鼠–用CAR-CD38 T-细胞处理)，与此相反，当用双CAR T-细胞治疗时不存在这种副作用(右图)。
具体实施方式
根据一个方面，本发明提供了一种T-细胞，其被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中第一CAR包含特异性结合到人类CD138的抗原结合结构域，并且第二CAR包含特异性结合到人类CD38的抗原结合结构域。
当在本文中使用时，术语“T细胞”是指由胸腺产生或加工的一类淋巴细胞，其正如本领域中公知的，参与各种不同的细胞介导的免疫反应。所述术语涵盖了任选地使用载体，用核酸例如DNA或RNA、多肽转导的T-细胞。本发明的T-细胞能够表达由用于通过感染或电穿孔转导所述T-细胞的DNA或RNA所编码的CAR分子。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中可互换使用，并且是指在细胞上表达的工程化的受体，即蛋白质。一般来说，CAR包含包括抗原结合结构域的细胞外结构域(细胞外部分)、跨膜结构域和细胞内结构域。
所述细胞外结构域包含抗原结合结构域和任选地间隔物或铰链区。
CAR的抗原结合结构域靶向特定抗原。所述靶向区可以包含抗体的全长重链、Fab片段或抗体的单链可变片段(scFv)。所述抗原结合结构域可以源自于与所述CAR将在其中使用的物种相同或不同的物种。在一个实施方式中，所述抗原结合结构域是scFv。
CAR的细胞外间隔物或铰链区位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间。细胞外间隔物结构域可以包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的CH2区、抗体的CH3区、辅助蛋白、人造间隔物序列或其组合。
术语“跨膜结构域”是指CAR的横穿或桥接质膜的区域。本发明的CAR的跨膜结构域是跨膜蛋白的跨膜区、人造疏水序列或其组合。根据某些实施方式，所述术语还涵盖与细胞外间隔物或铰链区在一起的跨膜结构域。
术语“特异性结合”或“特异性”对于抗体、其片段或CAR的抗原结合结构域来说，是指识别并结合特定抗原，但不实质性识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域。所述术语暗示所述抗原结合结构域以高亲和性结合到它的抗原并以低亲和性结合其他抗原。特异性结合到来自于一个物种的抗原的抗原结合结构域可能也结合到来自于另一个物种的该抗原。这种跨物种反应性与该抗原结合结构域为特异性的定义并不抵触。
细胞内结构域可以是T细胞受体或任何其他受体(例如TNFR超家族成员)的细胞内结构域或其部分，例如细胞内活化结构域(例如含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的T细胞活化基序)、细胞内共刺激结构域或两者。
本发明的术语“遗传修饰的T细胞”和“CAR-T细胞”在本文中可互换使用。
术语“CD38”和“人类CD38”在本文中可互换使用，并且是指被称为人类分化抗原簇38(CD38)、ADP-核糖基环化酶1、cADPr水解酶1、环ADP-核糖水解酶1、T10的蛋白质，并具有扩展号EC 3.2.2.5。术语“抗CD38”或“αCD38”是指特异性结合到人类CD38的抗体的抗原结合结构域。根据一个实施方式，抗原结合结构域是CAR的抗原结合结构域。根据另一个实施方式，所述抗原结合结构域是scFv。根据其他实施方式，所述抗原结合结构域结合到人类CD38的表位，特别是人类CD38的细胞外结构域的表位。
术语“CD138”和“人类CD138”在本文中可互换使用，并且是指被称为多配体聚糖1、SDC1、CD138、SDC或SYND1并具有登记号P18827的蛋白质。术语“抗CD138”或“αCD138”是指特异性结合到人类CD138的抗体的抗原结合结构域。根据一个实施方式，抗原结合结构域是CAR的抗原结合结构域。根据另一个实施方式，所述抗原结合结构域是scFv。根据其他实施方式，所述抗原结合结构域结合到人类CD138的表位，特别是人类CD138的细胞外结构域的表位。
根据某些实施方式，本发明的CAR的抗原结合结构域是scFv。根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR包含特异性结合到人类CD138的scFv抗原结合结构域(抗CD138scFv)，并且所述第二CAR包含特异性结合到人类CD38的scFv抗原结合结构域(抗CD38scFv)。
根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其被遗传修饰以表达两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。当在本文中使用时，术语“第一CAR”是指包含抗CD138 scFv的CAR。当在本文中使用时，术语“第二CAR”是指包含抗CD38 scFv的CAR。
根据上述实施方式中的任一者，抗CD138和抗CD38 scFv结合结构域包含VL和VH结构域。
根据一个实施方式，所述抗CD138 scFv包含VL和VH结构域，其中所述VL结构域包含三个互补决定区(CDR)，它们具有序列SEQ ID NO：1、2和3或由其构成，并且所述VH结构域包含三个CDR，它们具有序列SEQ ID NO：4、5和6或由其构成。
根据一个实施方式，所述抗CD38 scFv包含VL和VH结构域，其中所述VL结构域包含三个互补决定区(CDR)，它们具有序列SEQ ID NO：7、8和9或由其构成，并且所述VH结构域包含三个CDR，它们具有序列SEQ ID NO：10、11和12或由其构成。
根据某些实施方式，所述抗CD138 scFv包含6个CDR，它们具有序列SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6或由其构成，并且所述抗CD138scFv包含6个CDR，它们具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12中示出的序列或由其构成。
根据本发明的任一方面和实施方式，术语“包含SEQ ID NO：X中示出的氨基酸序列的肽”、“包含SEQ ID NO：X的肽”和“具有SEQ ID NO：X的肽”在本文中可互换使用。术语“由SEQ ID NO：X中示出的氨基酸序列构成的肽”、“由SEQ ID NO：X构成的肽”和“SEQ ID NO：X的肽”在本文中可互换使用。
根据上述实施方式中的任一者，所述抗CD138 scFv包含具有氨基酸序列SEQ IDNO：13或其类似物的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：14或其类似物的VH结构域，其中所述抗CD138 scFv的VL和VH结构域通过肽连接物相连，并且其中所述类似物与原始序列具有至少70％的同一性。根据一个实施方式，所述抗CD138 scFv包含具有氨基酸序列SEQ IDNO：13的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：14的VH结构域。根据另一个实施方式，所述VL结构域是SEQ ID NO：13的类似物。根据其他实施方式，所述VH结构域是SEQ ID NO：14的类似物。根据某些实施方式，所述抗CD138 scFv包含作为SEQ ID NO：13的类似物的VL结构域和作为SEQ ID NO：14的类似物的VH结构域。
根据上述实施方式中的任一者，所述抗CD38 scFv结构域包含具有氨基酸序列SEQID NO：15或其类似物的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：16或其类似物的VH结构域，其中所述抗CD38 scFv的VL和VH结构域通过肽连接物相连，并且其中所述类似物与原始序列具有至少70％的同一性。根据一个实施方式，所述抗CD38 scFv包含具有氨基酸序列SEQ IDNO：15的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：16的VH结构域。根据另一个实施方式，所述VL结构域是SEQ ID NO：15的类似物。根据另一个实施方式，所述VH结构域是SEQ ID NO：16的类似物。根据某些实施方式，所述抗CD138 scFv包含作为SEQ ID NO：15的类似物的VL结构域和作为SEQ ID NO：16的类似物的VH结构域。
术语“肽连接物”是指能够连接两个可变结构域的任何肽，其长度取决于待连接的可变结构域的种类。根据某些实施方式，所述肽连接物是具有氨基酸序列SEQ ID NO：17的肽。根据另一个实施方式，所述肽连接物是具有SEQ ID NO：17的肽的类似物。
如上所述，scFv包含通过肽连接物连接到VL结构域的VH结构域。根据某些实施方式，所述VH位于VL的N-端。根据另一个实施方式，所述VL位于VH的N-端。
根据某些实施方式，本发明提供了被遗传修饰以表达两种CAR的T-细胞，其中一种CAR包含抗CD138 scFv，其包含具有SEQ ID NO：13的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ IDNO：14的VH结构域，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv，其包含具有SEQ ID NO：15的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：16的VH结构域。根据某些实施方式，抗CD138 scFv和/或抗CD38 scFv的VL和VH结构域通过具有氨基酸序列SEQ ID NO：17的肽连接物相连。
术语“肽”是指通过肽键，即在一个氨基酸的羧基与相邻氨基酸的氨基之间形成的共价键相连的氨基酸残基的短链。术语“肽”是指具有至多50个氨基酸的短序列。长于50个氨基酸的氨基酸单体的链被称为“多肽”。这些多肽当具有超过50个氨基酸残基时，也可以被分类为蛋白质，更具体来说低或中分子量的蛋白质。
术语“肽类似物”、“类似物”、“序列类似物”、“类似序列”和“SEQ ID NO：X的类似物”在本文中可互换使用，并且是指肽的与原始肽具有至少70％序列同一性的类似物，其中所述类似物保留了所述原始肽的活性；X表示所述序列的编号。因此，术语“类似物”和“活性类似物”可能被互换使用。术语“类似物”是指相应地在亲本(原始)肽或蛋白质的氨基酸序列中含有替换、重排、缺失、添加和/或化学修饰的肽或蛋白质。根据某些实施方式，所述肽类似物与原始肽具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。根据一个实施方式，所述类似物与原始肽具有约80％至约99％、约85％至约98％或约90％至约95％的序列同一性。根据某些实施方式，本发明的类似物包含其中做出了1、2、3、4或5个替换的原始肽的序列。
氨基酸的替换可能是保守或非保守性替换。非保守性替换涵盖一个氨基酸被任何其他氨基酸的替换。
根据某些实施方式，术语“类似物”还涵盖术语“保守性类似物”。
本领域技术人员所知的氨基酸的保守性替换在本发明的范围之内。保守性氨基酸替换包括将一个氨基酸用具有相同类型例如脂族、芳香族、带正电、带负电的官能团或侧链的另一个氨基酸代替。专业技术人员将会认识到，各个替换，在所述改变引起氨基酸被化学上相似的氨基酸替换的情况下，是“保守性修饰的类似物”。提供了功能上相近的氨基酸的保守性替换表在本领域中是公知的。保守性替换的一个典型实例在下文中提供。
下述6个组各自含有彼此是保守性替换的氨基酸：(1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。在其他实施方式中，保守性替换涵盖使用化学上相似的非天然氨基酸的替换。
因此，在某些实施方式中，所述类似物是抗CD38或抗CD138 scFv的保守性类似物。根据某些实施方式，本发明的保守性类似物包含其中做出了1、2、3、4或5个保守性替换的原始scFv的序列。根据另一个实施方式，所述类似物由其中做出了1、2或3个保守性替换的所述原始肽的氨基酸序列构成。因此，所述类似物由具有1、2、或3个保守性替换的原始肽的氨基酸序列构成。
根据某些实施方式，所述抗CD138 scFv具有氨基酸序列SEQ ID NO：18。根据其他实施方式，所述抗CD138 scFv由氨基酸序列SEQ ID NO：18构成。
根据其他实施方式，所述抗CD38 scFv具有氨基酸序列SEQ ID NO：19。根据其他实施方式，所述抗CD38 scFv由氨基酸序列SEQ ID NO：19构成。
根据其他实施方式，所述抗CD138 scFv具有氨基酸序列SEQ ID NO：18并且所述抗CD38 scFv具有氨基酸序列SEQ ID NO：19。根据另一个实施方式，所述抗CD138 scFv由氨基酸序列SEQ ID NO：18构成，并且所述抗CD38 scFv由氨基酸序列SEQ ID NO：19构成。
根据上述实施方式中的任一者，所述CAR的细胞外结构域包含前导肽。根据一个实施方式，所述前导肽位于scFv的N-端。术语“前导肽”和“信号肽”在本文中可互换使用，并且是指使靶蛋白向细胞膜移位或促进所述移位的肽。
根据一个实施方式，所述第一CAR包含位于抗CD138 scFv的N-端并包含SEQ IDNO：20的前导肽。根据另一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：20的前导肽位于包含SEQ IDNO：18或由其构成的抗CD138 scFv的N-端。
根据一个实施方式，所述第二CAR包含位于抗CD38 scFv的N-端并包含SEQ ID NO：20的前导肽。根据另一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：20的前导肽位于包含SEQ ID NO：19或由其构成的抗CD38 scFv的N-端。
根据上述实施方式中的任一者，所述CAR中的至少一者包含共刺激结构域，并且至少一个另外的CAR包含活化结构域。
根据某些实施方式，所述第一CAR包含共刺激结构域，并且所述第二CAR包含活化结构域。根据某些实施方式，所述第一CAR包含活化结构域，并且所述第二CAR包含共刺激结构域。
根据某些实施方式，所述共刺激结构域选自CD28、4-1BB、OX40、iCOS、CD27、CD80和CD70的共刺激结构域。根据一个实施方式，所述共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。根据另一个实施方式，所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22。根据其他实施方式，所述共刺激结构域是SEQ ID NO：22的类似物。
术语“活化结构域”和“活化元件”在本文中可互换使用，并且是指细胞内信号传导结构域。根据某些实施方式，所述活化结构域选自FcRγ和CD3-ζ。根据一个实施方式，所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23。根据其他实施方式，所述活化结构域是SEQ IDNO：23的类似物。
根据本发明的教导，为了获得较低的“中靶脱肿瘤”效应，将共刺激结构域与活化结构域之间分开将是有益的。因此，根据一个实施方式，一种CAR只包含共刺激结构域，并且另一种CAR只包含活化结构域。因此，在一个实施方式中，所述包含抗CD138 scFv的第一CAR包含共刺激结构域并且不含活化结构域，并且所述包含抗CD38 scFv的第二CAR包含活化结构域并且不含共刺激结构域。根据另一个实施方式，所述第一CAR包含活化结构域并且不含共刺激结构域，并且所述第二CAR包含共刺激结构域并且不含活化结构域。
根据其他实施方式，所述CAR中的至少一者包含活化结构域和共刺激结构域两者。
根据另一个实施方式，所述第二CAR包含活化结构域和共刺激结构域两者。根据这类实施方式，所述第一CAR包含共刺激结构域并且不含活化结构域。
根据某些实施方式，所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23，并且所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22。根据一个实施方式，所述活化结构域是SEQ IDNO：23的类似物。根据其他实施方式，所述共刺激结构域是SEQ ID NO：22的类似物。
根据一个实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22。根据另一个实施方式，所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个实施方式，本发明提供了一种工程化改造的包含两种CAR的T-细胞，其中所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22，并且所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：23。
根据上述实施方式中的任一者，所述CAR包含跨膜结构域(TM)和铰链结构域。根据本发明的教导，当对TM结构域做出指称时，它还包括铰链结构域，并且所述跨膜结构域的序列还包括铰链结构域的序列。根据一个实施方式，所述第一CAR包含具有氨基酸序列SEQ IDNO：35的TM结构域I(TM-I)。根据另一个实施方式，所述第二CAR包含具有氨基酸序列SEQ IDNO：36的TM结构域II(TM-II)。
根据某些实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其被工程化改造以表达两种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR具有SEQ ID NO：24中示出的氨基酸序列，并且所述第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25。根据一个实施方式，所述第一CAR具有作为SEQ ID NO：24的类似物的氨基酸序列。根据另一个实施方式，所述第二CAR具有作为SEQ ID NO：25的类似物的氨基酸序列。根据其他实施方式，所述第一CAR具有类似于SEQ ID NO：24的氨基酸序列，并且所述第二CAR具有类似于SEQ ID NO：25的氨基酸序列。根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其被工程化改造以表达两种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：24构成，并且所述第二CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：25构成。根据某些实施方式，所述变体与原始序列具有至少85％的序列同一性。根据其他实施方式，所述变体与原始序列具有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。
根据上述实施方式中的任一者，所述T细胞选自CD4+ T-细胞和CD8+ T-细胞。因此在一个实施方式中，本发明提供了CD4+ T-细胞，其被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据另一个实施方式，本发明提供了CD8+ T-细胞，其被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据某些这类实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22。根据另一个实施方式，所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22，并且所述第二CAR包含氨基酸序列SEQID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个这类实施方式，所述第一CAR具有氨基酸序列SEQ IDNO：24或是其类似物，并且所述第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25或是其类似物。根据其他实施方式，本发明提供了CD4+和/或CD8+ T-细胞，其被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR，其中所述第一CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：24构成，并且所述第二CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：25构成。
根据上述实施方式中的任一者，本发明的T-细胞能够表达两种不同的分开的CAR，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据某些实施方式，本发明提供了表达两种不同的分开的CAR的T-细胞，其中所述第一CAR包含抗CD138scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据某些实施方式，所述T细胞选自CD4+T-细胞和CD8+ T-细胞。因此，在一个实施方式中，本发明提供了表达两种不同的分开的CAR的CD4+ T-细胞，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据另一个实施方式，本发明提供了表达两种不同的分开的CAR的CD8+ T-细胞，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据某些这类实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22。根据另一个实施方式，所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22，并且所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：23。根据一个这类实施方式，所述第一CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：24或是其类似物，并且所述第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25或是其类似物。根据其他实施方式，本发明提供了表达两种不同的分开的CAR的CD4+和/或CD8+ T-细胞，其中所述第一CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：24构成，并且所述第二CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：25构成。
根据另一方面，本发明提供了一种T-细胞，其包含编码至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种DNA构建物的至少一个拷贝，其中所述第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且所述第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域。根据一个实施方式，本发明的CAR的抗原结合结构域是scFv。因此，所述T-细胞包含编码至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种DNA构建物的至少一个拷贝，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据一个实施方式，所述两种CAR由一种DNA构建物编码。根据另一个实施方式，所述两种CAR由两种不同的DNA构建物编码。根据一个实施方式，所述T-细胞表达或能够表达本发明的CAR。
当在本文中使用时，术语“DNA构建物”是指人工构建的核酸区段。它可以是分离物或被整合到另一个DNA分子中。因此，“重组DNA构建物”通过实验室方法来生产。术语“核酸”涵盖了单链或双链的DNA、RNA及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。
本发明的CAR可以由一种DNA构建物或由两种或更多种DNA构建物编码。
根据某些实施方式，本发明的两种CAR由一种DNA构建物编码。因此在一个实施方式中，本发明提供了一种T-细胞，其包含DNA构建物的至少一个拷贝，所述DNA构建物编码：(A)从5’至3’(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，和(B)从5’至3’(v)前导肽，(vi)抗CD38 scFv结构域，(vii)跨膜结构域II和(viii)共刺激结构域、活化结构域或两者；其中(A)和(B)由自切割肽分隔开。根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其包含DNA构建物的至少一个拷贝，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)共刺激结构域、活化结构域或两者。
根据一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)活化结构域。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv，(iii)跨膜结构域II，(iv)活化结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD138 scFv结构域，(viii)跨膜结构域I和(ix)共刺激结构域。
在前述方面中使用的所有定义和实施方式，特别是与CAR、它们的部分和结构域以及与DNA构建物和T-细胞相关的定义和实施方式，被涵盖并包括在这里。
根据一个实施方式，所述自切割肽是具有SEQ ID NO：26的肽或其活性类似物。根据另一个实施方式，所述自切割肽是IRES肽或其类似物。根据另一个实施方式，所述自切割肽由DNA序列SEQ ID NO：27或其变体编码。
术语“变体”、“DNA变体”、“序列变体”、“多核苷酸变体”和“SEQ ID NO：X的变体”在本文中可互换使用，并且是指与原始多核苷酸具有至少70％的序列同一性的DNA多核苷酸，其中X是序列的编号。所述变体可以包括突变例如缺失、添加或替换，使得所述突变不改变开放阅读框，并且所述多核苷酸编码具有与由原始多核苷酸所编码的肽或蛋白质实质上相近的结构和功能的肽或蛋白质。根据某些实施方式，所述变体是保守性变体。当在本文中使用时，术语“保守性变体”是指其中在给定密码子位置中一个或多个核苷酸的改变不引起在该位置处编码的氨基酸的改变的变体。因此，由所述保守性变体编码的肽或蛋白质与由原始多核苷酸编码的肽或蛋白质具有100％的序列同一性。根据某些实施方式，所述变体是编码作为由原始多核苷酸编码的肽或蛋白质的保守性类似物的肽或蛋白质的非保守性变体。根据某些实施方式，所述变体与原始多核苷酸具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
根据某些实施方式，本发明的CAR由两种或更多种不同的DNA构建物编码。因此在某些实施方式中，本发明提供了一种包含两种不同DNA构建物的T-细胞，其中第一DNA构建物包含的序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I(TM-I)和(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，并且第二DNA构建物包含的序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv结构域，(iii)跨膜结构域II(TM-II)和(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者。根据一个实施方式，所述第一DNA构建物包含的序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)TM-I和(iv)共刺激结构域。根据另一个实施方式，所述第二DNA构建物包含的序列编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv结构域，(iii)TM-II和(iv)活化结构域。根据一个实施方式，所述第一DNA构建物包含的序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)TM-I和(iv)共刺激结构域，并且所述第二DNA构建物包含的序列编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv结构域，(iii)TM-II和(iv)活化结构域。
根据上述实施方式中的任一者，所述两种CAR中的任一者由一种或两种分开的DNA构建物编码；所述前导肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：20或其类似物。根据另一个实施方式，所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23或其类似物。根据其他实施方式，所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22或其类似物。根据又一个实施方式，所述抗CD138scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：18或其类似物。跟你局某个实施方式，所述抗CD38scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：19或其类似物。根据某些实施方式，TM-I具有氨基酸序列SEQ ID NO：35。根据其他实施方式，所述TM-II具有氨基酸序列SEQ ID NO：36。根据某些实施方式，所述前导肽由SEQ ID NO：39中示出的DNA序列或其变体编码；和/或所述抗CD138 scFv由SEQ ID NO：28中示出的DNA序列或其变体编码；和/或所述抗CD38 scFv由SEQID NO：29中示出的DNA序列或其变体编码；和/或所述共刺激结构域由SEQ ID NO：30中示出的DNA序列或其变体编码，和/或所述活化结构域由SEQ ID NO：31中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述跨膜结构域I由SEQ ID NO：37中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述跨膜结构域II由SEQ ID NO：38中示出的DNA序列或其变体编码。根据这类实施方式，所述类似物或变体与原始序列具有至少85％的序列同一性。
根据其他实施方式，所述编码两种CAR的DNA构建物包含SEQ ID NO：28。根据其他实施方式，这类DNA构建物包含SEQ ID NO：28的变体，例如保守性变体。
根据某些实施方式，两种CAR由两种不同的DNA构建物编码，并且所述第一DNA构建物包含SEQ ID NO：28。根据其他实施方式，所述第一DNA构建物包含SEQ ID NO：28的变体，例如保守性变体。
根据某些实施方式，所述编码两种CAR的DNA构建物包含SEQ ID NO：29。根据其他实施方式，这类DNA构建物包含SEQ ID NO：29的变体，例如保守性变体。
根据某些实施方式，两种CAR由两种不同的DNA构建物编码，并且所述第二DNA构建物包含DNA序列SEQ ID NO：29。根据其他实施方式，所述第二DNA构建物包含SEQ ID NO：29的变体，例如保守性变体。
根据某些实施方式，所述共刺激结构域由SEQ ID NO：30中示出的DNA序列编码，并且所述活化结构域由SEQ ID NO：31中示出的DNA序列编码。
根据一个实施方式，两种CAR由一种DNA构建物编码，所述构建物从5’到3’包含下述DNA序列：SEQ ID NO：28、30、29和31。
根据某些实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：32或其变体。根据另一个实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：33或其变体。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：32。
根据一个实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其包含编码本发明的两种CAR的DNA构建物，其中所述DNA构建物具有SEQ ID NO：34。根据另一个实施方式，所述DNA构建物是SEQ ID NO：34的变体，例如保守性变体。根据其他实施方式，所述变体与原始序列具有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。
根据某些实施方式，本发明提供了一种T-细胞，其包含编码本发明的两种CAR的两种DNA构建物，其中第一DNA构建物包含DNA序列SEQ ID NO：32，并且第二DNA构建物包含DNA序列SEQ ID NO：33。根据一个实施方式，所述第一DNA构建物具有的DNA序列是SEQ ID NO：32的变体，例如保守性变体。根据一个实施方式，所述第二DNA构建物具有的DNA序列是SEQID NO：33的变体，例如保守性变体。根据其他实施方式，所述T-细胞包含两种DNA构建物，其中所述第一DNA构建物包含作为SEQ ID NO：32的变体的DNA，并且所述第二DNA构建物具有作为SEQ ID NO：33的变体的DNA序列。根据某些实施方式，所述变体与原始序列具有至少85％的序列同一性。根据其他实施方式，所述变体与原始序列具有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。
根据上述实施方式中的任一者，所述包含本发明的DNA构建物的T-细胞表达或能够表达由所述DNA构建物编码的CAR。
当在本文中使用时，词语“表达”在指称DNA构建物时意味着该构建物的转录和/或翻译产物。DNA分子在细胞中的表达水平可以在所述细胞内存在的相应mRNA的量或由所述细胞产生的由该DNA编码的蛋白质的量的基础上确定。根据某些实施方式，所述表达是条件性表达。
根据另一方面，本发明提供了一种编码两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的核酸构建物，其中所述第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且所述第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域。根据一个实施方式，核酸构建物编码两种不同的分开的嵌合抗原受体，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据一个实施方式，所述核酸构建物是DNA。因此在一个实施方式中，本发明提供了一种编码两种不同的分开的嵌合抗原受体的DNA构建物，其中所述第一CAR包含抗CD138scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。
根据一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)共刺激结构域、活化结构域或两者。
根据一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)活化结构域。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv，(iii)跨膜结构域II，(iv)活化结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD138 scFv结构域，(viii)跨膜结构域I和(ix)共刺激结构域。根据一个实施方式，所述前导肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：20或其类似物。根据另一个实施方式，所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23或其类似物。根据其他实施方式，所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22或其类似物。根据又一个实施方式，所述抗CD138scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：18或其类似物。根据某个实施方式，所述抗CD38scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：19或其类似物。根据某些实施方式，TM-I具有氨基酸序列SEQ ID NO：35。根据其他实施方式，所述TM-II具有氨基酸序列SEQ ID NO：36。
根据某些实施方式，所述前导肽由SEQ ID NO：39中示出的DNA序列或其变体编码。根据其他实施方式，所述抗CD138 scFv由SEQ ID NO：28中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述抗CD38 scFv由SEQ ID NO：29中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述共刺激结构域由SEQ ID NO：30中示出的DNA序列或其变体编码。根据又一个实施方式，所述活化结构域由SEQ ID NO：31中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述共刺激结构域由DNA序列SEQ ID NO：30编码，并且所述活化结构域由DNA序列SEQ ID NO：31编码。根据某些实施方式，所述自切割肽由DNA序列SEQ ID NO：27或其变体编码。根据某些实施方式，所述跨膜结构域I由SEQ ID NO：37中示出的DNA序列或其变体编码。根据某些实施方式，所述跨膜结构域II由SEQ ID NO：38中示出的DNA序列或其变体编码。
根据一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含下述DNA序列：SEQ ID NO：28、30、29和31。
根据某些实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：32或其变体。根据另一个实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：33或其变体。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：32。根据某些实施方式，所述DNA构建物在序列SEQ ID NO：32与SEQ ID NO：33之间包含具有DNA序列SEQ ID NO：27的自切割序列。
根据某些实施方式，本发明提供了一种包含SEQ ID NO：34的核酸构建物。根据某些实施方式，本发明提供了一种由SEQ ID NO：34构成的核酸构建物。根据另一个实施方式，所述DNA构建物是SEQ ID NO：34的变体，例如保守性变体。
根据某些实施方式，所述DNA构建物被可操作连接到启动子。当在本文中使用时，术语“启动子”是指启动下游核酸的转录的调控序列。术语“启动子”是指较大的DNA序列内的一个DNA序列，其定义了RNA聚合酶可以结合并启动转录的位点。启动子可以包括任选的远端增强子或阻遏元件。所述启动子可以是同源的，即天然存在以指导所需核酸的表达，或者是异源的，即天然存在以指导源自于所需核酸之外的基因的核酸的表达。启动子可以是组成型或诱导型的。组成型启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。诱导型启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。启动子可以整体源自于本源基因，可以包含本源基因的区段或片段，或者可以由源自于自然界中存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应该理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段，或对不同的环境或生理条件做出响应的表达。还应该理解，同一个启动子可能在不同组织中差异表达和/或在不同条件下差异表达。
根据另一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的核酸构建物。根据一个实施方式，所述DNA构建物编码两种不同的分开的嵌合抗原受体，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据另一个实施方式，所述载体包含的DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)共刺激结构域、活化结构域或两者。根据某些实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含下述DNA序列：SEQ ID NO：28、30、29和31。根据另一个实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。根据某些实施方式，所述DNA构建物在序列SEQ IDNO：32与SEQ ID NO：33之间包含序列SEQ ID NO：27。根据又一个实施方式，本发明提供了一种载体，其包含含有SEQ ID NO：34的DNA构建物。根据其他实施方式，本发明提供了一种载体，其包含由SEQ ID NO：34构成的DNA构建物。
术语“载体”和“表达载体”在本文中可互换使用，并且是指任何病毒或非病毒载体，例如质粒、病毒、反转录病毒、噬菌体、粘粒、人工染色体(细菌或酵母的)、噬菌体、采取双链或单链线性或环状形式的二元载体，或能够转化宿主细胞并任选地能够在宿主细胞中复制的核酸序列。所述载体可以被整合到细胞基因组中，或者可以在染色体外存在(例如具有复制原点的自主复制质粒)。所述载体可以含有适用于鉴定被转化的细胞的任选的标志物，例如四环素抗性或氨苄青霉素抗性。克隆载体可以具有也可以不具有它用作表达载体所必需的特点。
根据其他实施方式，所述载体是病毒，例如修饰或工程化改造的病毒。病毒的修饰可以包括突变例如缺失或插入突变、基因缺失或基因包含。具体来说，突变可以在病毒基因组的一个或多个区域中做出。这类突变可以被引入到与内部结构蛋白、复制或反转录功能相关的区域中。载体修饰的其他实例是构成本源感染性载体的某些基因例如与病毒的致病性和/或其复制的能力相关的基因的缺失。
根据一个实施方式，所述载体是病毒载体。通过本文中公开的方法可以使用任何病毒。所述病毒可以是dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、单链“正”义DNA病毒(例如细小病毒)、双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒)、单链正义RNA病毒(例如细小核糖核酸病毒、披膜病毒)、单链“负”义RNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、具有DNA中间体的单链正义RNA病毒(例如反转录病毒)或双链反转录病毒(例如嗜肝DNA病毒)。在本发明的某些非限制性实施方式中，所述病毒是脊髓灰质炎病毒(PV)、鼻病毒、流感病毒包括禽流感(例如甲型流感病毒H5N1亚型)、严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、传染性支气管炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、登革热病毒(黄病毒血清型)、西尼罗病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、黄热病病毒、埃博拉(埃博拉病毒)、水痘(水痘-带状疱疹病毒)、麻疹(副粘病毒)、腮腺炎(副粘病毒)、狂犬病(狂犬病毒)、人乳头瘤病毒，卡波斯肉瘤相关疱疹病毒、单纯性疱疹病毒(HSV 1型)或生殖器疱疹(HSV 2型)。根据某些实施方式，所述载体是选自慢病毒、腺病毒、修饰的腺病毒和逆转录病毒的病毒。在一个特定实施方式中，所述载体是慢病毒。根据上述实施方式中的任一者，所述病毒是非致病性病毒或缺乏病原基因的改良病毒。
根据另一方面，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的DNA构建物或载体。根据某些实施方式，所述细胞是原核或真核细胞。根据另一个实施方式，所述细胞是非人类或人类哺乳动物细胞。根据某些实施方式，所述细胞是人类细胞。根据某些特定实施方式，所述细胞是T-细胞。根据一个实施方式，所述T-细胞选自CD4+ T-细胞和CD8+ T-细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含多个本发明的T-细胞和可药用载体。
在前述方面中使用的所有定义和实施方式，特别是与CAR、它们的部分和结构域以及与DNA构建物和T-细胞相关的定义和实施方式，被涵盖并包括在这里。
当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指包含与一种或多种可药用载体配制在一起的本发明的T-细胞的组合物。
所述药物组合物的配制可以根据应用来调整。具体来说，所述药物组合物可以使用本领域中已知的方法来配制，以便在给药到哺乳动物后提供活性成分的快速、连续或延迟释放。例如，所述制剂可以是选自膏药、颗粒剂、洗剂、搽剂、柠檬水、芳香水、粉剂、糖浆、眼药膏、液体和溶液、气溶胶、提取物、酏剂、软膏、流浸膏剂、乳液、悬液、汤剂、输注剂、滴眼液、片剂、栓剂、注射剂、醑剂、胶囊、霜剂、锭剂、酊剂、糊剂、丸剂和软或硬明胶胶囊的任一者。根据一个实施方式，所述组合物被配制成液体剂型。根据另一个实施方式，所述组合物被配制成注射用溶液。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”或“可药用赋形剂”是指与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、防腐剂、抗氧化剂、包衣剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、助流剂、pH调节剂、缓冲剂、强化剂、润湿剂、增溶剂、表面活性剂、抗氧化剂等。这些介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是公知的。所述组合物可以含有提供补充、额外或增强的治疗功能的其他活性化合物。
术语“可药用”和“药理上可接受的”包括在视情况而定给药到动物或人类时不产生不利、过敏性或其他不良反应的分子实体或组合物。对于人类给药来说，制剂应该满足政府药物管理部门例如美国食品药品监督管理局(FDA)生物制品标准办公室所要求的无菌性、热原性、总体安全性和纯度标准。
本发明的组合物可以通过任何已知方法给药。术语向对象“给药”组合物或组合物的“给药”可以使用本领域技术人员已知的各种不同方法之一来进行。例如，化合物或药剂可以静脉内、动脉、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、眼、舌下、口服(通过摄入)、鼻内(通过吸入)、脊髓内、脑内和透皮(通过例如经皮肤导管吸收)给药。化合物或药剂也可以适合地通过可更换的或可生物降解的聚合物装置或其他装置例如贴片和泵或用于提供所述化合物或药剂的延长、缓慢或受控释放的剂型来引入。给药也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行。在某些实施方式中，所述给药包括直接给药(包括自我给药)和间接给药(包括开出药物的行动)两者。例如，当在本文中使用时，指示患者自我给药药物或由别人给药所述药物和/或为患者提供药物处方的医生，正向所述患者给药所述药物。根据一个实施方式，所述药物组合物被肠胃外给药，即不通过口服给药。根据一个实施方式，所述药物组合物被系统给药。根据另一个实施方式，所述药物组合物被局部给药。根据一个实施方式，所述药物组合物被静脉内给药。根据另一个实施方式，所述药物组合物被肌肉内给药。
根据另一个实施方式，所述药物组合物包含多个含有本发明的DNA构建物的T-细胞。根据一个实施方式，所述T-细胞包含一种构建物，其编码本发明的两种CAR。根据另一个实施方式，所述T-细胞包含两种构建物，其各自编码本发明的一种分开的CAR。
根据一个实施方式，所述药物组合物包含多个T-细胞，其被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据某些实施方式，所述T细胞选自CD4+ T-细胞、CD8+ T-细胞或其组合。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR的CD4+ T-细胞，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38scFv。根据另一个实施方式，本发明提供了一种药物组合物，其包含被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR的CD8+ T-细胞，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。根据某些这类实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22。根据另一个实施方式，所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：23。根据一个实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22，并且所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个这类实施方式，所述第一CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：24或者是其类似物，并且所述第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25或者是其类似物。根据其他实施方式，本发明提供了一种药物组合物，其包含被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR的CD4+和/或CD8+ T-细胞，其中所述第一CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：24构成，并且所述第二CAR由氨基酸序列SEQ IDNO：25构成。根据某些实施方式，所述T-细胞能够表达所述CAR。根据另一个实施方式，所述T-细胞表达所述CAR。
根据一个实施方式，所述药物组合物包含含有本发明的DNA构建物的T-细胞。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)共刺激结构域、活化结构域或两者。根据某些实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含下述DNA序列：SEQ ID NO：28、30、29和31。根据另一个实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。根据某些实施方式，所述DNA构建物在序列SEQ ID NO：32与SEQ ID NO：33之间包含序列SEQ ID NO：27。根据又一个实施方式，本发明提供了一种载体，其包含含有SEQ ID NO：34的DNA构建物。根据其他实施方式，本发明提供了一种载体，其包含由SEQ ID NO：34构成的DNA构建物。
根据上述实施方式中的任一者，所述药物组合物用于治疗癌症。
当在本文中使用时，术语“治疗”病症或患者是指采取步骤以获得有益或所需的结果，包括临床结果。有益或所需的临床结果包括但不限于改善或消除、实质上抑制、减缓或逆转癌症的进展，实质上改善或减轻病症的临床或美学症状，实质性防止疾病、病症的临床症状出现，和保护以免于有害或讨厌的症状。治疗还指实现下述一项或多项：(a)降低障碍的严重程度；(b)限制待治疗的障碍特征性的症状的发展；(c)限制待治疗的障碍特征性的症状的恶化；(d)限制先前已患有所述障碍的患者中所述障碍的复发；和/或(e)限制先前对所述障碍无症状的患者中症状的复发。
根据一个实施方式，所述癌症是骨髓瘤。根据另一个实施方式，所述癌症是多发性骨髓瘤。
术语“骨髓瘤”是指一种骨髓的癌症。术语“多发性骨髓瘤”是指血浆白细胞的一种癌症。
因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含多个被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR的T-细胞，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv，所述组合物用于治疗多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，这类药物组合物用于治疗多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，所述T细胞是被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR的CD4+ T-细胞或CD8+ T-细胞。根据某些这类实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：22。根据另一个实施方式，所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个实施方式，所述第一CAR包含氨基酸序列SEQID NO：18和SEQ ID NO：22，并且所述第二CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23。根据一个这类实施方式，所述第一CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：24或者是其类似物，并且所述第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25或者是其类似物。根据其他实施方式，本发明提供了被遗传修饰以表达两种不同的分开的CAR的CD4+和/或CD8+ T-细胞，其中所述第一CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：24构成，并且所述第二CAR由氨基酸序列SEQ ID NO：25构成。根据上述实施方式中的任一者，所述T-细胞表达所述两种CAR。
根据上述方面中的任一者，术语治疗涵盖了存活率提高至少1.5、2、2.5或3倍。根据另一个实施方式，治疗包括与传统治疗相比或与使用表达一种CAR的T细胞的治疗相比减轻副作用。
根据某些实施方式，使用所述药物组合物的治疗具有低得多的副作用率。
根据另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括给药有效量的本发明的T-细胞。根据另一个实施方式，所述方法包括给药包含本发明的T-细胞的药物组合物。根据一个实施方式，所述癌症是骨髓瘤。根据另一个实施方式，所述癌症是多发性骨髓瘤。
根据又一方面，本发明提供了被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的T-细胞的用途，其用于制备在需要的对象中治疗癌症的药物，其中所述第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且所述第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域。根据一个实施方式，所述T-细胞包含本发明的DNA构建物。根据另一个实施方式，所述T-细胞包含至少两种DNA构建物，其分开地编码包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域的CAR和包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域的CAR。
根据另一方面，本发明提供了一种制备本发明的T-细胞的方法。根据一个实施方式，本发明提供了一种制备被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的T-细胞的方法，其中所述第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且所述第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域，所述方法包括用本发明的DNA构建物转染T-细胞。
在前述方面中使用的所有定义和实施方式，特别是与CAR、它们的部分和结构域以及与DNA构建物和T-细胞相关的定义和实施方式，被涵盖并包括在这里。
术语“转染”或“转导”可以互换使用，并且被定义为将核酸分子引入细胞的过程。核酸使用非病毒或基于病毒的方法被引入细胞。所述核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。非病毒转染方法包括不使用病毒DNA或病毒粒子作为将核酸分子引入细胞的递送系统的任何合适的转染方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声穿孔、通过热激的转染、磁转染和电穿孔。在某些实施方式中，所述核酸分子按照本领域中公知的标准程序，使用电穿孔引入到细胞中。对于基于病毒的转染方法来说，在本文所述的方法中可以使用任何有用的病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于反转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在某些实施方式中，所述核酸分子按照本领域中公知的标准程序，使用反转录病毒载体引入到细胞中。
根据一个实施方式，所述T-细胞是CD4+ T-细胞。根据另一个实施方式，所述T-细胞是CD8+细胞。
根据一个实施方式，所述方法包括用至少一种编码两种CAR的DNA构建物转染T细胞，其中所述构建物从5’至3’包含DNA序列SEQ ID NO：28、30、29和31。根据某些实施方式，所述DNA构建物包含SEQ ID NO：32或其变体。根据另一个实施方式，所述DNA构建物包含SEQID NO：33或其变体。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。根据另一个实施方式，所述DNA构建物从5’至3’包含SEQ ID NO：33和SEQ IDNO：32。
根据一个实施方式，本发明的编码两种CAR的DNA构建物具有SEQ ID NO：34。根据另一个实施方式，所述DNA构建物是SEQ ID NO：34的变体，例如保守性变体。
根据一个实施方式，所述方法包括用各自编码本发明的一种分开的CAR的两种DNA构建物转染T细胞，其中所述第一DNA构建物包含SEQ ID NO：32中示出的DNA序列，并且所述第二DNA构建物包含SEQ ID NO：33中示出的DNA序列。根据一个实施方式，所述第一DNA构建物具有作为变体、例如SEQ ID NO：32的保守性变体的DNA序列。根据一个实施方式，所述第二DNA构建物具有作为变体、例如SEQ ID NO：33的保守性变体的DNA序列。根据其他实施方式，所述T-细胞包含两种DNA构建物，其中所述第一DNA构建物包含作为SEQ ID NO：32的变体的DNA，并且所述第二DNA构建物具有作为SEQ ID NO：33的变体的DNA序列。
根据上述实施方式中的任一者，所述转导使用选自反转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体的病毒载体来进行。
根据某些实施方式，所述载体可以含有适用于鉴定被转化的细胞的任选的标志物。
术语“包含”、“包括”、“具有”和“含有”在本文中可互换使用，并且具有“至少部分由……构成”的含义。当解释本说明书中每个包括术语“包含”的陈述时，在以所述术语作为开端的一个或多个特征之外的特征也可能存在。相关的术语例如“包括”以相同的方式来解释。术语“具有”和“包含”也可以涵盖“由……构成”和“基本上由……构成”的含义，并且可以被这些术语替代。术语“由……构成”排除了没有具体描述或列出的任何组分、步骤或程序。术语“基本上由……构成”意味着所述组合物或组分可以包括另外的成分，但仅仅在所述另外的成分不实质性改变所要求的组合物或方法的基本和新颖特征的前提下。
现在已经总体描述了本发明，其通过参考下面的实施例将更容易被理解，提供所述实施例是为了说明，并且不打算限制本发明。
实施例
材料和方法
细胞系和培养物
细胞系(表达萤光素酶的人类多发性骨髓瘤细胞系CAG/CAG和人类前列腺癌细胞系PC-3)在增补有10％胎牛血清(FCS)(Hy clone)和2mM谷氨酰胺的RPMI(Biologicalindustries,Bet-Ha'emek,Israel)中，在具有5％CO2的加湿37℃培养箱中培养。293T人类胚胎细胞(ATCC)和PG13(表达Gag-Pol并用pCL-Ampho病毒包膜蛋白感染的鼠类细胞系)在增补有10％FCS、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的DMEM中培养。将所述细胞在具有7.5％CO2的加湿37℃培养箱中温育。人类淋巴细胞在增补有10％FCS和50μM 2-巯基乙醇的RPMI-1640中培养，并在具有5％CO2的加湿37℃培养箱中中温育。所有培养基被增补有含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和新霉素(10μg/ml)(Bio-Lab,Jerusalem,Israel)的混合抗生素溶液。使用PCR检查所有细胞是否含有支原体。所述细胞以低传代次数冷冻，并在融化后记录传代次数。细胞在培养物中维持不超过4周，这对应于约12次传代。在本项目中使用的原代细胞系从Cell Biologics和Lonzo from Almog以及Eisenberg Bros.Ltd订购。每种原代细胞按照产品说明单中的指示进行繁殖。
抗体和试剂
纯化的抗人类CD3抗体从杂交瘤OKT3自产制备。纯化的抗人类CD28抗体购自Southern Biotechnology Associates,Inc(Birmingham,USA)。人类IL-2购自Novartis-Pharma(England)。重组的带有His或人类Fc标签的CD38和CD138蛋白购自SinoBiological、抗His抗体购自Abcam；抗人类Fc(γ-特异性)抗体购自eBioscience。抗人类CD3 APC从BioLegend获得。抗人类CD38 PE-cy7、抗人类CD-138APC和抗人类ErbB2 FITC购自eBioscince。
实施例1
在下面的实施例中，制备并试验了用不同嵌合抗原受体转导的人类细胞。本实施例的目的是测试用特异性结合临床相关的两种不同抗原的两种不同CAR转导的T-细胞用于多发性骨髓瘤(MM)治疗的效能。为此目的选择了两种临床上相关的抗原：CD38和CD138。产生了旨在特异性结合这些抗原的两种CAR。一种CAR包含源自于抗CD138特异性单克隆抗体的scFv，其中VL和VH分别具有序列SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。所述第二CAR包含源自于抗CD38特异性单克隆抗体的scFv，其中VL和VH分别具有序列SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。每种CAR中的VL和VH使用具有序列GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：17)的14个氨基酸的连接物相连。
本实验的测试对象是用下述两种CAR转导的T-细胞：一种具有抗CD138(αCD138)scFv，一种具有抗CD38(αCD38)scFv。为了降低“中靶脱肿瘤”毒性，将共刺激结构域和活化信号传导元件在两种CAR之间分开；具有αCD138 scFv的CAR仅带有共刺激结构域(CD28的跨膜和共刺激结构域分别具有序列SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：22)，并且具有αCD38 scFv的CAR仅具有活化信号传导元件(CD8的跨膜结构域和FcR-γ结构域分别具有序列SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：26)。将所述两种CAR放置在一种DNA构建物中，所述构建物在它们之间包含具有序列SEQ ID NO：26的自切割肽T2A。所述构建物的示意图示出在图1中，并且使用的构建物具有序列SEQ ID NO：21。所述构建物被称为双CAR。
使用了包含不同CAR的几种对照T-细胞。调换是指包含两种CAR的对照，其中所述临床相关的CAR即抗CD138 CAR或抗CD38 CAR之一被抗ErbB2 CAR(N29，ErbB2在多发性骨髓瘤中不表达)代替。下述克隆被用于产生所述修饰的T-细胞：
αCD138-CD28-γ
αCD38-CD28-γ
双CAR：αCD138-CD28-T2A-αCD38-γ
调换1(对照1)：N29-CD28-T2A-αCD38-γ
调换2(对照2)：αCD138-CD28-T2A-N29-γ
其中αCD138是抗CD138 scFv；αCD38是抗CD38 scFv；γ–FcRγ活化结构域(免疫受体酪氨酸活化基序–ITAM)；CD28–CD28的共刺激元件；T2A-自切割肽，N29–抗ErbB2 scFv。
首先，测试了T细胞使用源自于包装细胞的病毒经历用CAR转导的能力。将人类外周血淋巴细胞(PBL)活化48小时，并用来自于相关包装细胞系的上清液转导。在转导2天后，将细胞针对蛋白质表达进行染色并通过FACS进行分析。
T-细胞转导
简单来说，通过Lymphoprep梯度(Axis-shield,Oslo,Norway)，通过离心从健康人类献血者分离外周血淋巴细胞(PBL)，并以3X106个细胞/孔的密度在增补有50μM 2-巯基乙醇的4mL完全RPMI-1640中培养。将细胞在未用组织培养物处理的用1μg/ml抗CD3抗体和大鼠抗人类CD28(AbD Serotec,USA)抗体两者预包被的6孔板(Falcon)上刺激2天。然后通过用PBS剧烈冲洗来收获活化的淋巴细胞。通过离心沉积细胞，并以2-3x106个细胞/ml的密度重悬浮在病毒上清液中。然后将细胞(1.5ml)添加到未用组织培养物处理的用RetroNectinTM(12μg/ml，4ml/well，Takara Shuzu Ltd.Otsu,Japan)预包被的6孔板(Falcon)的孔中。在37℃、7.5％CO2下温育6h后，轻柔地移除病毒上清液，用增补有IL-2(100IU/ml)的淋巴细胞培养基替换，并在37℃、5％CO2下温育过夜。
在第二天重复所述转导程序。在第二次转染后当天，通过剧烈冲洗来收获细胞并用PBS洗板。将细胞重悬浮在增补有350IU/ml IL-2的淋巴细胞培养基中，并在37℃、5％CO2下温育。
用不同构建物转导的T-细胞经历由表达CD38和CD138抗原的CAG细胞系的特异性刺激的能力，使用CAG细胞系的INF-γ测定法来测试。被示出为IFN-γ的浓度的结果呈现在图2中。所述图示出了4次重复试验之一的代表性结果。其中尤其是转导的T-细胞的IFN-γ分泌，由转导的水平预先决定。正如可以从该图看出的，用不同CAR转导的T-细胞刺激IFN-γ分泌。在重复试验之间CAR T细胞的转导比率是不同的，因此所述图的本质是显示CAR受到刺激，并且所述双CAR具有令人印象深刻的刺激。
结果
首先可以看出，用针对不同抗原的不同CAR转导的T-细胞对表达相应抗原的细胞具有响应性。我们比较了用双CAR-αCD138-CD28-αCD38-γ转导的T-细胞对表达CD38和CD138两者的CAG细胞的选择性响应的能力。为此目的，将只表达CD38的Jurkat细胞用作对照。正如可以从图2看到的，在实验条件下，T-细胞中αCD38-γCAR的存在足以独立于共刺激赋予所述T-细胞以完全的活化能力。这可以从显示出表达N29-CD28-T2A-αCD38-γ(调换1)或αCD38CAR的T-细胞在与jurkat细胞温育后表现出高IFN-γ分泌的结果容易地得出结论。
对表达αCD38 CAR的T-细胞来说，在与培养基温育后看到的相对高的信号，可以通过αCD38 CAR与天然表达CD38抗原的转导T-细胞的相互作用来解释。
实施例2
在与实施例1中描述的相似的实验安排下，测量了用CAR-N29、调换1、调换2或双CAR(αCD138-CD28-T2A-αCD38)转导的T-细胞在与不同细胞系温育后的IFN-γ分泌。所述细胞系是293–对照细胞系(其不表达CD38、ErbB2或CD138)，CAG，PC-3–(具有CD38的低表达的前列腺癌细胞系)，以及淋巴细胞在没有靶细胞的情况下温育(仅仅培养基)。结果呈现在图3A中。
从结果可以看出，SW1和双CAR两者在与PC-3细胞温育后具有低的IFN-γ分泌。这暗示尽管可以预期用双CAR转导的T-细胞存在一定反应，但它显著低于使用高表达CD38的细胞时的反应。还可以看出，双CAR的效果远高于SW1的效果。考虑到SW2不显示出任何IFN-γ分泌，这是完全出人意料的。在另外的实验中，为了显示双CAR的安全性，我们研究了针对正常细胞的刺激。
为了进一步分析每种单或双CAR针对正常组织的潜在毒性并预测预期的“脱肿瘤中靶”效应，将不同CAR用正常原代人类组织进行刺激。结果呈现在图3B中。正如所指示的7种不同的原代细胞源自于健康人类献血者，具有CD38/CD138-CD28-γ或双CAR。所述CD38单CAR与双CAR相比显示出被几种正常组织更强的刺激。所述双CAR相对于CD38单CAR显示出针对被测试细胞降低的反应性。令人吃惊的是，CD138 CAR针对所分析的组织不显示出任何IFN-γ分泌，尽管已知它表达在许多组织类型上(蛋白质表达图集)。
为了证实IFN-γ分泌与靶细胞被CAR T细胞杀死之间的关系，我们使用稳定的萤光素酶感染的CAG细胞以1:2(靶标:效应CAR)的比例刺激CAR T细胞，并且在温育20小时后，我们通过生物发光成像(IVIS)分析了培养物。正如在图4中所示，与对照相比，双CAR具有特异性且高效的杀死。CD138-CD28-γCAR与双CAR T细胞相比显示出较低程度的杀死。SW1对照始终如一地显示出高效的杀死，尽管仅仅活化一个信号(因为只有CD38被表达在CAG细胞上)而没有完全的双信号活化。此外，CD38完整CAR也显示出杀死的有效性。然而，在具有双抗原识别的情况下观察到CAG细胞系的清除以及更好的IFN-γ分泌。
实施例3.双CAR的体内效能
材料和方法
我们校准了体内人类多发性骨髓瘤(MM)模型，所述模型是基于免疫缺陷小鼠株系NOD scid-γ(NSG)上的MM细胞系CAG。这些小鼠缺少成熟的淋巴细胞并且在多种细胞因子信号传导途径中存在缺陷，从而允许广范围的人类细胞和组织的植入。我们首先确定了注入的MM细胞的最适数量、给药途径和为了获得用于CAR T细胞治疗的方便窗口，对受体小鼠进行预先调制的影响(数据未示出)。确定了IV注射106个CAG MM细胞然后在第7天以200RAD辐照，允许肿瘤的高效发生并提供所需的肿瘤模型。
因此，将约106个CAG MM细胞注入小鼠(被称为第0天)。在第7天，将所述小鼠以200RAD辐照(其不影响肿瘤生长)，并且在第8天，IV注入约107个用不同CAR转导的修饰的T-细胞。
在第25天从用不同CAR T-细胞治疗的小鼠获取组织，通过使用抗CD138抗体染色的组织学并通过FACS进行分析(数据未示出)。组织学的结果呈现在图5中。
此外，我们评估了用双CAR、调换1、调换2或单CAR转导的T-细胞的抗MM活性，并根据存活曲线与未治疗的小鼠进行比较。结果呈现在图6中。
结果
从图5可以看出，在注射CAG MM细胞后，在所有测试的组织即在肝、肺、脾和骨骼中发现了肿瘤病灶。
当通过FACS搜寻CAR时，记录了在CAG注射后26天在治疗的NSG小鼠的血液中发现淋巴细胞(数据未示出)。这清楚地表明包含治疗性双CAR的转导的T-细胞在血液中已持续至少26天。正如可以从示出了用不同CAR转导的T-细胞治疗的小鼠的存活曲线的图6清楚地看到的，除了用双CAR或αCD38 CAR治疗的小鼠之外，所有组的小鼠平均在CAG MM细胞注射后40-45天后死于由移植物抗宿主病症造成的体重减轻以及死于肿瘤本身，正如可以在未治疗的对照组中看到的。用αCD38 CAR转导的T-细胞显示出显著的治疗效果，然而最终仅有20％的小鼠在85天后存活。用双CAR T-细胞治疗的小鼠与用CD38 CAR-T细胞治疗的小鼠相比显示出明显更好的存活率，在超过95天后存活率为60％。将小鼠在第95天处死以允许组织学和FACS分析，并不是因为它们的肿瘤负荷。
所有三只双CAR治疗的存活小鼠在实验结束时无肿瘤，正如可以通过使用H&E染色的组织学检查看到的。存活的SW1小鼠在肝、肺和骨骼中显示出肿瘤(图7)。
实施例4.双CAR的体内效能
在与实施例3中所述相似的条件下进行的实验中，为了便于CAG肿瘤/肿瘤体积的监测，我们使用了CAG-LUC细胞系，其在遇到在成像前注入到小鼠中的萤光素时发射出生物光。由此，我们比较了每只小鼠中的肿瘤强度，并在每个组中跟踪了治疗效能。结果呈现在图8中。
从图8可以看出，用αCD38或双CAR T-细胞治疗的所有小鼠和用调换1(对应于SW1)治疗的大多数小鼠在第13天是无肿瘤的。相反，用调换2(对应于SW2)、CD138和N29 CAR T-细胞治疗的小鼠在第13天已经发展出肿瘤。与用SW1和αCD38 CAR治疗的小鼠相反，用双CAR治疗的小鼠直至第48天仍然无癌症，并且它们中的60％直至第62天仍然无癌症。其他组中的大多数小鼠在第55天之前由于肿瘤负荷和体重减轻而被处死。显然，使用双CAR T-细胞的治疗远远比任何其他治疗更为有效。
还可以看出，使用调换2、αCD138或N29 CAR-T细胞的治疗提供了以肿瘤的快速发展为特征的相似结果。使用调换1的治疗平均来说不如使用αCD38的治疗有效，表明共刺激结构域和活化结构域的分开影响了修饰的T-细胞的活化效能，并且可以改善“脱靶”效应。
也对小鼠的病症进行了跟踪。正如可以从图9看到的，接受CAR138的小鼠显示出皮肤刺激，这是由于在它们的皮肤上表达的CD138小鼠和人类抗原之间的交叉反应性。当小鼠用双CAR T-细胞治疗时，这些副作用不存在。这为带有双CAR的T-细胞在仅仅一种抗原即CD138存在下(在皮肤细胞上不存在CD38抗原)不被完全活化，从而提供较少的副作用，提供了额外的证明。
尽管在上文中已通过优选实施方式对本发明进行了描述，但可以对它进行修改而不背离在权利要求书中所定义的本发明的精神和本质。
序列表
<110> 特拉维夫医学技术有限公司（Aviv MedTech LTD）
<120> 包含抗CD38和抗CD138嵌合抗原受体的T-细胞及其用途
<130> SMC/013 PCT
<150> US 62/594577
<151> 2017-12-05
<150> US 62/667638
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
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Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile
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Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
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Val Ser Ser
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
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115 120 125
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Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
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Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
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Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
195 200 205
Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met
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Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Ile
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Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
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Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Ser Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe
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Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Ser Gln Val
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Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
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Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
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Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser
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Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
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Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Ser Asn Ser Ile
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Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
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Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
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Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
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Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
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ggctccggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cct 63
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gatatccaga tgacacagag tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gtgcaagtca gggcattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttgaactcct gatctattac acatcaactt tacagtcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240
gaagatattg gcacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa agggtcgact tccggtagcg gcaaatcctc tgaaggcaaa 360
ggtcaggttc agctgcagca gtctggatct gagctgatga tgcctggggc ctcagtgaag 420
atatcctgca aggctactgg ctacacattc agtaactact ggatagagtg ggtaaagcag 480
aggcctggac atggccttga gtggattgga gagattttac ctggaactgg tagaactatc 540
tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ttcactgcag atatatcctc caacacagtc 600
caaatgcaac tcagcagcct gacatctgag gactctgccg tctattactg tgcaagaagg 660
gactattatg gtaactttta ctatgctatg gactactggg gtcaagggac ctcagtcacc 720
gtctcctca 729
<210> 29
<211> 729
<212> DNA
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<223> artificial sequence
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gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg cattccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa agggtcgact tccggtagcg gcaaatcctc tgaaggcaaa 360
ggtgaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 420
ctctcctgtg cagtctctgg attcaccttt aacagctttg ccatgagctg ggtccgccag 480
gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tggcacatac 540
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 600
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatatttctg tgcgaaagat 660
aagattttat ggtttgggga gccggtcttc gactactggg gccagggaac cctggtcacc 720
gtctcctca 729
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 60
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatagatct 120
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<212> DNA
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<400> 31
agatctcaag tgcgaaaggc agctataacc agctatgaga aatcagatgg tgtttacacg 60
ggcctgagca ccaggaacca ggagacttac gagactctga agcatgagaa accaccacag 120
tagactcgag 130
<210> 32
<211> 1059
<212> DNA
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<223> artificial sequence
<400> 32
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60
agaggagata tccagatgac acagagtaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagtgc aagtcagggc attaacaatt atttaaactg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttga actcctgatc tattacacat caactttaca gtcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctcaccat cagcaacctg 300
gaacctgaag atattggcac ttactattgt cagcagtata gtaagcttcc tcggacgttc 360
ggtggaggca ccaagctgga aatcaaaggg tcgacttccg gtagcggcaa atcctctgaa 420
ggcaaaggtc aggttcagct gcagcagtct ggatctgagc tgatgatgcc tggggcctca 480
gtgaagatat cctgcaaggc tactggctac acattcagta actactggat agagtgggta 540
aagcagaggc ctggacatgg ccttgagtgg attggagaga ttttacctgg aactggtaga 600
actatctaca atgagaagtt caagggcaag gccacattca ctgcagatat atcctccaac 660
acagtccaaa tgcaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgccgtcta ttactgtgca 720
agaagggact attatggtaa cttttactat gctatggact actggggtca agggacctca 780
gtcaccgtct cctcagcggc cgcaaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 840
ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 900
ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 960
cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1020
ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatagatct 1059
<210> 33
<211> 1198
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 33
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60
agaggagaaa ttgtgttgac gcagtctcca gccaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 120
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttagcagct acttagcctg gtaccaacag 180
aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc tatgatgcat ccaacagggc cactggcatt 240
ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagccta 300
gagcctgaag attttgcagt ttattactgt cagcagcgta gcaactggcc tccgacgttc 360
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaaggg tcgacttccg gtagcggcaa atcctctgaa 420
ggcaaaggtg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 480
ctgagactct cctgtgcagt ctctggattc acctttaaca gctttgccat gagctgggtc 540
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtggc 600
acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 660
acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata tttctgtgcg 720
aaagataaga ttttatggtt tggggagccg gtcttcgact actggggcca gggaaccctg 780
gtcaccgtct cctcactgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 840
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 960
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 1020
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaccacag atctcaagtg 1080
cgaaaggcag ctataaccag ctatgagaaa tcagatggtg tttacacggg cctgagcacc 1140
aggaaccagg agacttacga gactctgaag catgagaaac caccacagta gactcgag 1198
<210> 34
<211> 2319
<212> DNA
<213> artificial sequenc
<220>
<223> artificial sequence
<400> 34
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60
agaggagata tccagatgac acagagtaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagtgc aagtcagggc attaacaatt atttaaactg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttga actcctgatc tattacacat caactttaca gtcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctcaccat cagcaacctg 300
gaacctgaag atattggcac ttactattgt cagcagtata gtaagcttcc tcggacgttc 360
ggtggaggca ccaagctgga aatcaaaggg tcgacttccg gtagcggcaa atcctctgaa 420
ggcaaaggtc aggttcagct gcagcagtct ggatctgagc tgatgatgcc tggggcctca 480
gtgaagatat cctgcaaggc tactggctac acattcagta actactggat agagtgggta 540
aagcagaggc ctggacatgg ccttgagtgg attggagaga ttttacctgg aactggtaga 600
actatctaca atgagaagtt caagggcaag gccacattca ctgcagatat atcctccaac 660
acagtccaaa tgcaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgccgtcta ttactgtgca 720
agaagggact attatggtaa cttttactat gctatggact actggggtca agggacctca 780
gtcaccgtct cctcagcggc cgcaaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 840
ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 900
ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 960
cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1020
ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatagatctg gctccggaga gggcagagga 1080
agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc cttacgtaat ggattttcag 1140
gtgcagattt tcagcttcct gctaatcagt gcctcagtca taatgtccag aggagaaatt 1200
gtgttgacgc agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 1260
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccag 1320
gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcattcc agccaggttc 1380
agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat 1440
tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggcctc cgacgttcgg ccaagggacc 1500
aaggtggaaa tcaaagggtc gacttccggt agcggcaaat cctctgaagg caaaggtgag 1560
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 1620
tgtgcagtct ctggattcac ctttaacagc tttgccatga gctgggtccg ccaggctcca 1680
gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtggcac atactacgca 1740
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 1800
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt tctgtgcgaa agataagatt 1860
ttatggtttg gggagccggt cttcgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 1920
tcactgagca actccatcat gtacttcagc cacttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 1980
cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 2040
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 2100
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 2160
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaccacagat ctcaagtgcg aaaggcagct 2220
ataaccagct atgagaaatc agatggtgtt tacacgggcc tgagcaccag gaaccaggag 2280
acttacgaga ctctgaagca tgagaaacca ccacagtag 2319
<210> 35
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 35
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
1 5 10 15
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
20 25 30
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
35 40 45
<210> 36
<211> 91
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 36
Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
20 25 30
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
35 40 45
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
50 55 60
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
85 90
<210> 37
<211> 134
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 37
aaagggaaac acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg 60
ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 120
attttctggg tgag 134
<210> 38
<211> 273
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 38
ctgagcaact ccatcatgta cttcagccac ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc 60
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 120
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 180
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 240
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac cac 273
<210> 39
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 39
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60
agagga 66

Claims (43)

1.一种T-细胞，其被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)，其中第一CAR包含特异性结合到CD138的抗原结合结构域，并且第二CAR包含特异性结合到CD38的抗原结合结构域。
2.权利要求1所述的T-细胞，其中所述特异性结合到CD138的抗原结合结构域和所述特异性结合到CD38的抗原结合结构域各自独立地是单链可变片段(分别被表示为抗CD138scFv和抗CD38 scFv)。
3.权利要求2所述的T-细胞，其中所述抗CD138 scFv包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：13或其类似物的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：14或其类似物的VH结构域，其中所述抗CD138 scFv的VL和VH结构域通过肽连接物相连，并且其中所述类似物与原始序列具有至少70％的同一性。
4.权利要求2或3所述的T-细胞，其中所述抗CD38 scFv结构域包含具有氨基酸序列SEQID NO：15或其类似物的VL结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO：16或其类似物的VH结构域，其中所述抗CD38scFv的VL和VH结构域通过肽连接物相连，并且其中所述类似物与原始序列具有至少70％的同一性。
5.权利要求3或4所述的T-细胞，其中所述肽连接物是具有氨基酸序列SEQ ID NO：17或其类似物的肽。
6.权利要求1至5中任一项所述的T-细胞，其中所述CAR中的至少一者包含共刺激结构域，并且所述CAR中的另一者包含活化结构域。
7.权利要求6所述的T-细胞，其中所述第一CAR包含活化结构域并且不含共刺激结构域，并且所述第二CAR包含共刺激结构域并且不含活化结构域。
8.权利要求6所述的T-细胞，其中所述第一CAR包含共刺激结构域并且不含活化结构域，并且所述第二CAR包含活化结构域并且不含共刺激结构域。
9.权利要求6所述的T-细胞，其中所述CAR中的至少一者包含活化结构域和共刺激结构域两者。
10.权利要求6至9中任一项所述的T-细胞，其中所述共刺激结构域选自CD28、4-1BB、OX40、iCOS、CD27、CD80、CD70的共刺激结构域，并且所述活化结构域选自FcRγ和CD3-ζ活化结构域。
11.权利要求6至10中任一项所述的T-细胞，其中所述活化结构域是具有氨基酸序列SEQ ID NO：23或其类似物的FcRγ活化结构域，并且所述共刺激结构域是具有氨基酸序列SEQ ID NO：22或其类似物的CD28的共刺激结构域。
12.权利要求1所述的T细胞，其中所述第一CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：24或其类似物，并且所述第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25或其类似物，并且其中所述类似物与原始序列具有至少85％的同一性。
13.一种工程化T-细胞，其表达两种嵌合抗原受体(CAR)，其中第一CAR具有在SEQ IDNO：24中示出的氨基酸序列或其类似物，并且第二CAR具有氨基酸序列SEQ ID NO：25或其类似物，并且其中所述类似物与原始序列具有至少85％的同一性。
14.权利要求1所述的T-细胞，其包含编码所述至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种DNA构建物的至少一个拷贝，其中所述第一CAR包含抗CD138 scFv，并且所述第二CAR包含抗CD38 scFv。
15.权利要求14所述的T-细胞，其包含DNA构建物的至少一个拷贝，所述DNA构建物编码：(A)从5’至3’(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，和(B)从5’至3’(v)前导肽，(vi)抗CD38 scFv结构域，(vii)跨膜结构域II和(viii)活化结构域、共刺激结构域或两者；其中(A)和(B)被自切割肽分隔开。
16.权利要求16所述的T-细胞，其中所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)活化结构域。
17.权利要求15所述的T-细胞，其中所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv，(iii)跨膜结构域II，(iv)活化结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD138 scFv结构域，(viii)跨膜结构域I和(ix)共刺激结构域。
18.权利要求15至17中任一项所述的T-细胞，其中所述自切割肽选自具有氨基酸序列SEQ ID NO：26的肽、IRES肽或其类似物。
19.权利要求18所述的T-细胞，其中所述自切割肽由DNA序列SEQ ID NO：27或其变体编码。
20.权利要求14所述的T-细胞，其包含两种不同的DNA构建物，其中第一DNA构建物包含的DNA序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I和(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，并且第二DNA构建物包含的DNA序列从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv结构域，(iii)跨膜结构域II和(iv)活化结构域、共刺激结构域或两者。
21.权利要求14至20中任一项所述的T-细胞，其中：
(i)所述前导肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：20或其类似物；和/或
(ii)所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23或其类似物；和/或
(iii)所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22或其类似物；和/或
(iv)所述抗CD138 scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：18或其类似物；和/或
(v)所述抗CD38 scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：19或其类似物，
其中所述类似物与原始序列具有至少85％的序列同一性。
22.权利要求14至21中任一项所述的T-细胞，其中：
(i)所述前导肽由SEQ ID NO：39中示出的DNA序列或其变体编码；和/或
(ii)所述抗CD138 scFv由SEQ ID NO：28中示出的DNA序列或其变体编码；和/或
(iii)所述抗CD38 scFv由SEQ ID NO：29中示出的DNA序列或其变体编码；和/或
(iv)所述共刺激结构域由SEQ ID NO：30中示出的DNA序列或其变体编码；和/或
(v)所述活化结构域由SEQ ID NO：31中示出的DNA序列或其变体编码，
其中所述变体与原始序列具有至少85％的序列同一性。
23.权利要求14所述的T-细胞，其包含具有DNA序列SEQ ID NO：34或其变体的DNA构建物的至少一个拷贝。
24.权利要求14所述的T-细胞，其包含含有DNA序列SEQ ID NO：32或其变体的DNA构建物的至少一个拷贝和含有DNA序列SEQ ID NO：33或其变体的DNA构建物的至少一个拷贝。
25.权利要求1至24中任一项所述的T-细胞，其中所述T细胞选自CD4+T-细胞和CD8+T-细胞。
26.一种DNA构建物，其编码：
(A)从5’至3’(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38 scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)共刺激结构域、活化结构域或两者；或
(B)从5’至3’(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv结构域，(iii)跨膜结构域II，(iv)活化结构域、共刺激结构域或两者，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域、活化结构域或两者。
27.权利要求26所述的DNA构建物，其中所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD138 scFv，(iii)跨膜结构域I，(iv)共刺激结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD38scFv结构域，(viii)跨膜结构域II和(ix)活化结构域。
28.权利要求26所述的DNA构建物，其中所述DNA构建物从5’至3’编码(i)前导肽，(ii)抗CD38 scFv，(iii)跨膜结构域II，(iv)活化结构域，(v)自切割肽，(vi)前导肽，(vii)抗CD138 scFv结构域，(viii)跨膜结构域I和(ix)共刺激结构域。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的DNA构建物，其中：
(i)所述自切割肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：26或其类似物；和/或
(ii)所述前导肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：20或其类似物；和/或
(iii)所述活化结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：23或其类似物；和/或
(iv)所述共刺激结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：22或其类似物；和/或
(v)所述抗CD138 scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：18或其类似物；和/或
(vi)所述抗CD38 scFv结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：19或其类似物，
其中所述类似物与原始序列具有至少85％的序列同一性。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的DNA构建物，其中：
(i)所述自切割肽由DNA序列SEQ ID NO：27或其变体编码；和/或
(ii)所述前导肽由DNA序列SEQ ID NO：39或其变体编码；和/或
(iii)所述活化结构域由DNA序列SEQ ID NO：31或其变体编码；和/或
(iv)所述共刺激结构域由DNA序列SEQ ID NO：30或其变体编码；和/或
(v)所述抗CD138 scFv结构域由DNA序列SEQ ID NO：28或其变体编码；和/或
(vi)所述抗CD38 scFv结构域由DNA序列SEQ ID NO：29或其变体编码，
其中所述变体与原始序列具有至少85％的序列同一性。
31.权利要求26所述的DNA构建物，其包含DNA序列SEQ ID NO：32和DNA序列SEQ ID NO：33，或其变体。
32.权利要求25所述的DNA构建物，其包含DNA序列SEQ ID NO：34或其变体。
33.一种载体，其包含根据权利要求26至32中任一项所述的DNA构建物。
34.一种细胞，其包含根据权利要求26至32中任一项所述的DNA构建物或权利要求33所述的载体。
35.权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是T-细胞。
36.权利要求35所述的细胞，其中所述T-细胞选自CD4+T-细胞和CD8+T-细胞。
37.一种药物组合物，其包含多个根据权利要求1至25、35或36中任一项所述的T-细胞和可药用载体。
38.权利要求37所述的药物组合物，其包含可药用赋形剂。
39.用于治疗癌症的权利要求37或38所述的药物组合物。
40.如权利要求39所述使用的药物组合物，其中所述癌症是骨髓瘤。
41.如权利要求40所述使用的药物组合物，其中骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
42.一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括给药有效量的根据权利要求1至25、35或36中任一项所述的T-细胞。
43.一种用于制备被遗传修饰以表达至少两种不同的分开的嵌合抗原受体(CAR)的T-细胞的方法，其中第一CAR包含抗CD138 scFv并且第二CAR包含抗CD38 scFv，所述方法包括用根据权利要求26至32中任一项所述的DNA构建物或用根据权利要求33所述的载体转染T-细胞。
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