ES2949855T3 - Linfocitos T que comprenden receptores antigénicos quiméricos anti-CD38 y ant-CD138 y los usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona células T que expresan al menos dos receptores de antígenos quiméricos diferentes, en los que uno de los CAR se une específicamente a CD138 y otro CAR se une específicamente a CD38. En particular, la presente invención proporciona células T que expresan dos CAR diferentes, cuando un CAR comprende Fv sc anti-CD138 y el segundo CAR Fv sc anti-CD138. Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende estas células T con CAR duales y su uso en el tratamiento del cáncer, en particular mieloma múltiple, y métodos para la preparación de estas células. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Linfocitos T que comprenden receptores antigénicos quiméricos anti-CD38 y ant-CD138 y los usos de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a células T que expresan al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR), donde uno de los CAR se une específicamente a CD138 y otro CAR se une específicamente a CD38. La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas células, su uso en el tratamiento del cáncer, en particular el uso en el tratamiento del mieloma múltiple.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) es un tratamiento antitumoral adoptivo recientemente desarrollado. Las células T modificadas genéticamente expresan receptores de antígenos quiméricos, que generalmente consisten en un dominio final de señalización (como CD3-zeta o cadena gamma del FcR), un dominio transmembrana y un fragmento variable de cadena única extracelular (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal que da la especificidad del receptor para un antígeno asociado a un tumor en una célula maligna diana. Al unirse al antígeno asociado al tumor a través del receptor de antígeno quimérico, el receptor de antígeno quimérico expresado en la célula T (célula T CAR) genera una respuesta inmunitaria que es citotóxica para la célula maligna. En teoría, las células CAR-T pueden localizar y eliminar específicamente las células tumorales al interactuar con los antígenos asociados a tumores (TAA) expresados en la superficie de las células tumorales.
[0003] A pesar del rápido crecimiento en el campo, el desarrollo de tratamientos CAR-T eficientes y seguros se enfrenta a muchos desafíos. Es probable que muchos factores conocidos y numerosos aún no identificados contribuyan a la variabilidad observada en las respuestas clínicas en los ensayos y también entre pacientes individuales. Los factores que deben tenerse en cuenta son, por ejemplo, el destino in vivo de las células T, las propiedades de un tumor y la seguridad. Para mejorar la seguridad y la eficacia, se sugirió generar células T transducidas con un CAR que proporciona una activación subóptima al unirse a un antígeno y un receptor coestimulador quimérico que reconoce un segundo antígeno (Kloss et al., 2013, Nature Biotechnology, 13, 71-75, WO 2014/055668 y WO 2015/142314). Un factor adicional, que siempre es uno de los principales obstáculos cuando se trata del tratamiento del cáncer, es la elección de la(s) diana(s). Los antígenos de superficie verdaderamente específicos del tumor apenas se identifican, y la implementación de mecanismos efectivos para mitigar las toxicidades inesperadas y que amenazan la vida es crucial.
[0004] El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia incurable de células plasmáticas (CP), que se desarrolla en la médula ósea y eventualmente causa insuficiencia renal, inmunosupresión con infecciones repetidas, anemia y lesiones óseas. Las terapias actuales, incluidos los inhibidores del proteasoma y los agentes inmunomoduladores, han mejorado sustancialmente los resultados en pacientes con mieloma múltiple. Desafortunadamente, la mayoría de estos pacientes tienen una recaída y tienen opciones de tratamiento limitadas después de la exposición a esta clase de agentes. Aunque la terapia CAR-T podría, en principio, superar algunos de los problemas del tratamiento "clásico" del MM, el principal obstáculo en el desarrollo de la terapia de células CAR T es su toxicidad sustancial en el tejido. Solo unas pocas proteínas, y prácticamente ningún antígeno de la superficie celular, se expresan exclusivamente en células malignas, lo que da como resultado la selección no deseada de tejidos sanos. Por tanto, la búsqueda de antígenos expresados específicamente en células tumorales se ha convertido en un objetivo central en la identificación de dianas CAR en MM. Se determinaron varias moléculas de superficie relacionadas con el mieloma como objetivos potenciales a los que se pueden dirigir las terapias CAR. Estos objetivos incluyen CD38, CD40, CD44, CD47, CD54, CD56 CD138, CD200 CD307, etc. (Atanackovic, et al., British Journal of Haematology, 2016, 172, 685-698). Sin embargo, ninguno de estos objetivos está presente exclusivamente en las células cancerosas, por lo que se puede esperar un efecto fuera del objetivo sustancial cuando se usan estos objetivos para la terapia con células CAR-T.
[0005] Chen et al., (Leukemia 2017, doi: 10.1038/leu.2017.302) indicaron que dirigirse a BCMA y CS1 en las células de mieloma puede ser una estrategia potencialmente eficaz para aumentar la respuesta contra la enfermedad masiva del mieloma. Drent et al., (Haematologica 2016, 101, 616-625) informan el efecto antitumoral de las células T transducidas para expresar un CAR anti-CD38 en un modelo de MM de ratón. Guo et al., (Journal of Cellular Immunotherapy, 2016, 2, 28-35) informan sobre el tratamiento de pacientes con MM con células T que expresan un CAR anti-CD138.
[0006] CD38 es una glicoproteína transmembrana tipo II de 45 kD que se asocia con receptores de superficie celular en balsas lipídicas, regula el flujo de Ca2+ citoplásmico y media la transducción de señales en células linfoides y mieloides. CD38 se expresa alta y uniformemente en células de mieloma y se expresa en niveles relativamente bajos en células linfoides y mieloides normales y en algunos tejidos de origen no hematopoyético, lo que lo convierte en un objetivo potencial en el tratamiento del mieloma. Daratumumab (HuMax-CD38, GenMab), un anticuerpo monoclonal IgG1K humano, se une a un epítopo CD38 único. Los estudios preclínicos demostraron que daratumumab inducía la destrucción de células diana de células tumorales que expresan CD38 por medio de múltiples mecanismos, incluidos efectos citotóxicos mediados por complemento y dependientes de anticuerpos mediados por células, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, apoptosis y, en menor medida, inhibición de la actividad enzimática de CD38. Los anticuerpos monoclonales anti-CD38 se describen como ejemplos en el documento US 7.829.673.
[0007] CD138 es una proteína de superficie, que funciona como una molécula de adhesión que se une a las moléculas de colágeno y fibronectina de la matriz extracelular. Los anticuerpos anti-CD138 se describieron previamente, por ejemplo, en el documento US 9.221.914. A pesar de que CD138 se considera uno de los marcadores más prometedores, en un estudio de fase I/II con inmunoconjugado BT062 utilizado como agente único, solo 1 de 23 pacientes mostró una respuesta clínica objetiva (Atanackovic et al.). Además, CD138 se expresa en muchas células epiteliales maduras. De hecho, se observó toxicidad en el hígado y la piel en esos ensayos clínicos, lo que indica que se pueden esperar efectos secundarios significativos del tratamiento con CAR-T dirigido a CD138.
[0008] Otros objetivos descritos anteriormente también tienen sus ventajas y desventajas, la mayoría de las cuales están relacionadas con un alto nivel de efectos secundarios, lo que mantiene la elección del objetivo como uno de los principales obstáculos en el desarrollo de terapias CAR-T seguras y eficientes. Existe una necesidad insatisfecha en el desarrollo racional de sistemas terapéuticos CAR T adicionales que permitan un tratamiento seguro y duradero del mieloma múltiple con menos efectos secundarios fuera del objetivo.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0009] Ahora se describe de acuerdo con la presente invención que las células T modificadas genéticamente para expresar dos CAR distintas separadas capaces de unirse a dos dianas cuidadosamente elegidas en células de mieloma múltiple, es decir, CD38 y CD138, trataron eficazmente el cáncer y prolongaron la supervivencia. Además, el diseño específico del sistema CAR, en el que un CAR portaba solo un dominio de activación y el segundo CAR portaba solo un dominio de coestimulación, permitió reducir la gravedad del efecto secundario relacionado con el enlace "en el objetivo fuera del tumor" de la T -células. Tal diseño permitió obtener un tratamiento eficiente con efectos secundarios reducidos. De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una célula T genéticamente modificada para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, donde el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38. Según algunas formas de realización, los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a CD38 o CD138 son dominios variables de cadena sencilla (scFv) de anticuerpos anti-CD38 y anti-CD138, respectivamente. Así, según una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en los que el primer CAR comprende un scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende un scFv anti-CD38.
[0010] De acuerdo con algunas formas de realización, el scFv anti-CD138 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o un análogo del mismo y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 o un análogo del mismo, en donde el Vl y Los dominios Vh del scFv anti-CD138 están unidos por un conector peptídico y en el que el análogo tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia parental (original).
[0011] De acuerdo con otras formas de realización, el dominio anti-CD38 scFv comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 o un análogo del mismo y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 o un análogo del mismo, en donde Los dominios Vl y Vh del scFv anti-CD38 están unidos por un conector peptídico y el análogo tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia original.
[0012] De acuerdo con algunas formas de realización, al menos uno de los CAR comprende un dominio coestimulador y el otro de los CAR comprende un dominio de activación. Según una forma de realización, el dominio coestimulador es un dominio coestimulador de CD28, 4-1BB, OX40, iCOS, CD27, CD80, CD70. De acuerdo con otras formas de realización, el dominio de activación se selecciona de FcRy y CD3-Z.
[0013] De acuerdo con algunas formas de realización, el primer CAR comprende un dominio coestimulador y carece de un dominio de activación y el segundo CAR comprende un dominio de activación y carece de un dominio coestimulador. Según una forma de realización, el dominio de activación tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 o un análogo de la misma y el dominio coestimulador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 o un análogo de la misma.
[0014] Según algunas formas de realización, el dominio transmembrana del primer CAR tiene una secuencia SEQ ID NO: 35 o un análogo de la misma. Según otras formas de realización, el dominio transmembrana del segundo CAR tiene una secuencia SEQ ID NO: 36 o un análogo de la misma.
[0015] De acuerdo con algunas formas de realización, la presente invención proporciona células CAR T diseñadas para expresar dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) separados, donde el primer CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o es un análogo de la misma, y el segundo CAR tiene una secuencia de aminoácidos secuencia de ácido en SEQ ID NO: 25 o siendo un análogo de la misma.
[0016] De acuerdo con una forma de realización, la célula T es una célula T CD4+. De acuerdo con otra forma de realización, la célula T es una célula T CD8+. De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, la célula T expresa las CAR de la presente invención.
[0017] Según otro aspecto, la presente invención proporciona una célula T que comprende al menos una copia de una o
más construcciones de ADN que codifican las dos o más CAR de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización, la célula T comprende al menos una copia de una construcción de ADN que codifica: (A) de 5' a 3': (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos; y (B) de 5' a 3' (v) un péptido líder, (vi) dominio anti-CD38 scFv, (vii) un dominio transmembrana II y (viii) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos; donde (A) y (B) están separados por un péptido de autoescisión.
[0018] Según algunas formas de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio de activación. De acuerdo con otras formas de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD38, (iii) un dominio transmembrana II (iv) un dominio de activación, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD138 scFv, (viii) un dominio transmembrana I y (ix) un dominio coestimulador. Según 34 5 algunas formas de realización, el péptido autoescindible está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 27 o una variante de la misma.
[0019] Alternativamente, la célula T comprende dos construcciones de ADN diferentes que codifican los CAR de la presente invención, donde la primera construcción de ADN comprende una secuencia que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I y (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, y la segunda construcción de ADN comprende una secuencia que codifica, de 5' a 3' (i) un péptido líder, (ii) anti-CD38 dominio scFv, (iii) un dominio transmembrana II y (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos.
[0020] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, el scFv anti-CD138 está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 28 o una variante de la misma. Según otras formas de realización, el scFv anti-CD38 está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 o una variante de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, el dominio coestimulador está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 o una variante de la misma. Según otra forma de realización más, el dominio de activación está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 31 o una variante de la misma. De acuerdo con algunas formas de realización, el péptido líder está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 39 o una variante de la misma. De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio transmembrana I está codificado por la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 37 o una variante de la misma. De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio transmembrana II está codificado por la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 38 o una variante de la misma.
[0021] De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T que comprende al menos una copia de una construcción de ADN que tiene la secuencia de ADN SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma.
[0022] De acuerdo con otras formas de realización, la presente invención proporciona una célula T con CAR que comprende al menos una copia de cada una de las dos construcciones de ADN, donde la primera construcción de a Dn comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 32 o una variante de la misma y la segunda construcción de ADN comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 33 o una variante de la misma.
[0023] Según otro aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ADN de al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en el que el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo c Ar comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138. a CD38. Según una forma de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3': (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, (iv) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos. De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 32 y la secuencia de ADN SEQ ID NO: 33, o una variante de las mismas. De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención proporciona una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma.
[0024] Según otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende la construcción de ADN de la presente invención. Según una forma de realización, el vector comprende una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 32 y la secuencia de ADN SEQ ID NO: 33, o una variante de las mismas. De acuerdo con otra forma de realización, el vector comprende una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma. Según algunas formas de realización, el vector es un vector viral.
[0025] Según otro aspecto más, la presente invención proporciona una célula que comprende la construcción de ADN del vector de la presente invención. Según una forma de realización, la célula es una célula procariótica. Según otra forma de realización, la célula es una célula eucariota. Según algunas formas de realización, la célula es una célula humana. De acuerdo con otra forma de realización, la célula es una célula T, tal como una célula T CD4+ o CD8+.
[0026] De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células T con CAR de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización, las células T se
modifican genéticamente para expresar dos CAR de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización, las células T expresan las CAR de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización adicional, la célula T comprende una construcción de a Dn que codifica las dos CAR de la presente invención o dos o más construcciones diferentes que codifican las dos CAR diferentes de la presente invención. Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica de la presente invención es para uso en el tratamiento del cáncer. Según una forma de realización, el cáncer es mieloma múltiple. De acuerdo con algunas formas de realización, las células T se modifican genéticamente para expresar dos CAR que tienen la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25.
[0027] De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar el cáncer tal como el mieloma múltiple en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad eficaz de células T de la presente invención. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de células T modificadas genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en el que el primer CAR comprende un scFv anti-CD38 y el segundo CAR comprende un antígeno anti-CD138 scFv, dicho método comprende transfectar células T con la construcción de ADN de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0028]
Fig. 1 muestra un esquema de una construcción de ADN de doble CAR: Vl y Vh son partes de scFv separadas por un conector, T2A es un péptido autoescindible, CD28 se refiere a un elemento coestimulador de CD28 y FcRy es un dominio de activación.
Fig. 2 muestra la capacidad de las células T transducidas con diferentes construcciones CAR para interactuar con la línea celular CAG que expresa CD38 y CD138, según lo probado por el ensayo IFNy. La figura es representativa de 4 repeticiones; la figura muestra la secreción de IFN-y, lo que implica que hay una estimulación de diferentes células T transducidas como se indica en la figura.
Fig. 3 muestra la estimulación de células T con CAR por células diana que expresan diferentes niveles de CD38 y CD138:
Fig. 3A - estimulación por diferentes líneas celulares; Fig. 3B - comparación de la actividad de las células T con CAR frente a tejidos primarios normales. Los resultados se expresan como concentración de IFN-y en μg/ml (ELISA).
Fig. 4 muestra la destrucción de células CAG-LUC por células CAR T duales. Las células CAG que expresan luciferasa se incubaron con células CAR T transducidas.
Fig. 5 muestra imágenes de inmunohistología anti-CD138 humano de tejidos de ratones NSG trasplantados con línea celular de mieloma múltiple CAG humana frente al control.
Fig. 6 muestra la curva de supervivencia de ratones inyectados con células de mieloma múltiple CAG y tratados con células T transducidas con diferentes construcciones de CAR.
Fig. 7 Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de tejidos de ratones supervivientes trasplantados con línea celular CAG y tratados con SW1 o CAR dual.
Fig. 8 muestra las imágenes del tumor MM que expresa luciferasa (CAG-Luc) en ratones tratados. Los ratones a los que se les inyectó MM CAG-Luc después de la inyección de diferentes CAR (día 8) se controlaron para determinar el efecto terapéutico.
Fig. 9 muestra la toxicidad de las células CAR T CD138 en la piel de los ratones (ratones del panel izquierdo -tratados con células CAR T-CD38), en contraste con la ausencia de este efecto secundario cuando se tratan con células CAR T duales (panel derecho).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0029] Según un aspecto, la presente invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos (Ca R) distintos y separados, en los que el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente al CD138 humano y el segundo CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38 humano.
[0030] El término "célula T", como se usa en el presente documento, se refiere a un linfocito de un tipo producido o procesado por la glándula timo que participa en una variedad de reacciones inmunitarias mediadas por células, como se conoce bien en la técnica. El término abarca células T transducidas con un ácido nucleico tal como un polipéptido de ADN o ARN, opcionalmente usando un vector. Las células T de la presente invención son capaces de expresar las moléculas CAR codificadas por el ADN o el ARN mediante el cual las células T son transducidas, infectadas o electroporadas.
[0031] Los términos "receptor de antígeno quimérico" o "CAR" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a receptores manipulados, es decir, proteínas, que se expresan en las células. En general, un CAR comprende un dominio extracelular (parte extracelular) que comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular.
[0032] El dominio extracelular comprende un dominio de unión a antígeno y, opcionalmente, una región espaciadora o bisagra.
[0033] El dominio de unión a antígeno del CAR se dirige a un antígeno específico. Las regiones de direccionamiento pueden comprender una cadena pesada de longitud completa de un anticuerpo, fragmentos Fab o un fragmento variable de cadena única (scFv) de un anticuerpo. El dominio de unión a antígeno puede derivar de la misma especie o de una especie diferente para o en la que se usará el CAR. En una forma de realización, el dominio de unión a antígeno es un scFv.
[0034] El espaciador extracelular o región bisagra de un CAR está ubicado entre el dominio de unión al antígeno y un dominio transmembrana. Los dominios espaciadores extracelulares pueden incluir, entre otros, fragmentos Fc de anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, regiones bisagra de anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos, regiones CH2 de anticuerpos, regiones CH3 de anticuerpos, proteínas accesorias, secuencias espaciadoras artificiales o combinaciones de los mismos.
[0035] El término "dominio transmembrana" se refiere a la región del CAR, que cruza o une la membrana plasmática. El dominio transmembrana del CAR de la invención es la región transmembrana de una proteína transmembrana, una secuencia hidrófoba artificial o una combinación de las mismas. De acuerdo con algunas formas de realización, el término comprende también el dominio transmembrana junto con el espaciador extracelular o la región bisagra.
[0036] Los términos "se une específicamente" o "específico para" con respecto a un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, de un fragmento del mismo o de un CAR se refiere a un dominio de unión a antígeno que reconoce y se une a un antígeno específico, pero no reconoce sustancialmente o unir otras moléculas en una muestra. El término implica que el dominio de unión a antígeno se une a su antígeno con alta afinidad y se une a otros antígenos con baja afinidad. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno de una especie también puede unirse a ese antígeno de otra especie. Esta reactividad entre especies no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico.
[0037] Un dominio intracelular puede ser un dominio intracelular del receptor de células T o de cualquier otro receptor (p. ej., miembro de la superfamilia TNFR) o parte del mismo, como un dominio de activación intracelular (p. ej., un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) que contiene T motivo de activación celular), un dominio coestimulador intracelular, o ambos.
[0038] Los términos "células T genéticamente modificadas" de la presente invención y "células CAR-T" se usan aquí de manera intercambiable.
[0039] Los términos "CD38" y "CD38 humano" se usan aquí indistintamente y se refieren a la proteína conocida como grupo humano de diferenciación 38 (CD38), ADP-ribosil ciclasa 1, cADPr hidrolasa 1, ADP-ribosa hidrolasa cíclica 1, T10 y tiene un número de extensión EC 3.2.2.5. Los términos "anti CD38" o "aCD38" se refieren a un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a CD38 humano. De acuerdo con una forma de realización, el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno de un CAR. De acuerdo con otras formas de realización, el dominio de unión a antígeno es un scFv. De acuerdo con una forma de realización adicional, el dominio de unión a antígeno se une a un epítopo del CD38 humano y, en particular, a un epítopo del dominio extracelular del CD38 humano.
[0040] El término "CD138" y "CD138 humano" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a la proteína conocida como Syndecan 1, SDC1, CD138, SDC o SYND1, y que tiene el número de acceso P18827. Los términos "anti CD138" o "aCD138" se refieren a un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a CD138 humano. De acuerdo con una forma de realización, el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno de un CAR. De acuerdo con otras formas de realización, el dominio de unión a antígeno es un scFv. De acuerdo con una forma de realización adicional, el dominio de unión a antígeno se une a un epítopo del CD138 humano, y en particular a un epítopo del dominio extracelular del CD138 humano.
[0041] Según algunas formas de realización, los dominios de unión a antígeno de las CAR de la presente invención son scFv. De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos separados (CAR) distintos, en donde el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno scFv que se une específicamente a CD138 humano (anti-CD138 scFv) y el segundo CAR comprende un dominio de unión al antígeno scFv que se une específicamente al CD38 humano (anti-CD38 scFv).
[0042] Según una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar dos receptores de antígenos quiméricos separados distintos (CAR), en el que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. El término "primer CAR", como se usa en el presente documento, se refiere a un CAR que comprende scFv anti-CD138. El término "segundo CAR", como se usa en el presente documento, se refiere a un CAR que comprende scFv anti-CD38.
[0043] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, los dominios de unión de scFv anti-CD138 y anti-CD38 comprenden dominios Vl y Vh.
[0044] De acuerdo con una forma de realización, el scFv anti-CD138 comprende dominios Vl y Vh, donde el dominio Vl comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen o consisten en las secuencias SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y el dominio Vh comprende tres CDR. que tiene o consiste en las secuencias SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
[0045] De acuerdo con una forma de realización, el scFv anti-CD38 comprende dominios Vl y Vh, donde el dominio Vl comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen o consisten en las secuencias SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y el dominio Vh comprende tres CDR que tiene o consiste en las secuencias SEQ ID NO: 10, 11 y 12.
[0046] De acuerdo con algunas formas de realización, el anti-CD138 scFv comprende 6 CDR que tienen o consisten en las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y el anti-CD138 scFv comprende 6 CDR que tienen o consisten en las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
[0047] De acuerdo con cualquiera de los aspectos y formas de realización de la invención, los términos "péptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: X", "péptido que comprende SEQ ID NO: X" y "péptido que tiene SEQ ID NO: X " se utilizan aquí indistintamente. Los términos "péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: X", "péptido que consiste en SEQ ID NO: X" y "péptido de SEQ ID NO: X" se usan aquí de manera intercambiable.
[0048] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, el scFv anti-CD138 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o un análogo del mismo y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 o un análogo del mismo, en el que los dominios Vl y Vh del scFv anti-CD138 están unidos por un conector peptídico y en el que el análogo tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia original. Según una forma de realización, el scFv anti-CD138 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14. Según otra forma de realización, el dominio Vl es un análogo de SEQ ID NO: 13. Según otra forma de realización, el dominio Vh es un análogo de SEQ ID NO: 14. Según algunas formas de realización, el scFv anti-CD138 comprende un dominio Vl que es un análogo de SEQ ID NO: 13 y siendo un dominio Vh un análogo de SEQ ID NO: 14.
[0049] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, el dominio scFv anti-CD38 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 o un análogo del mismo y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 o un análogo del mismo, en el que los dominios Vl y Vh del scFv anti-CD38 están unidos por un conector peptídico y en el que el análogo tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia original. Según una forma de realización, el scFv anti-CD38 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16. Según otra forma de realización, el dominio Vl es un análogo de SEQ ID NO: 15. Según otra forma de realización, el dominio Vh es un análogo de SEQ ID NO: 16. Según algunas formas de realización, el scFv anti-CD138 comprende un dominio Vl que es un análogo de SEQ ID NO: 15 y un siendo el dominio Vh un análogo de SEQ ID NO: 16.
[0050] El término "enlazador de péptidos" se refiere a cualquier péptido capaz de conectar dos dominios variables con su longitud dependiendo de los tipos de dominios variables a conectar. Según algunas formas de realización, el conector peptídico es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17. Según otra forma de realización, el conector peptídico es un análogo de un péptido que tiene la SEQ ID NO: 17.
[0051] Como se describió anteriormente, el scFv comprende un dominio Vh unido por un conector peptídico a un dominio Vl. De acuerdo con algunas formas de realización, el Vh está ubicado N-terminalmente con respecto a Vl. De acuerdo con otra forma de realización, el Vl está ubicado en el extremo N de Vh.
[0052] De acuerdo con algunas formas de realización, la presente invención proporciona células T genéticamente modificadas para expresar dos CAR, en las que una CAR comprende un scFv anti-CD138 que comprende un dominio Vl que tiene la SEQ ID NO: 13 y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y el segundo CAR comprende un scFv anti-CD38 que comprende un dominio Vl que tiene SEQ ID NO: 15 y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16. Según algunas formas de realización, los dominios Vl y Vh de anti-CD138 scFv y/o anti-CD38 scFv están unidos por un conector peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17.
[0053] El término "péptido" se refiere a una cadena corta de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, es decir, un enlace covalente formado entre el grupo carboxilo de un aminoácido y un grupo amino de un aminoácido adyacente. El término "péptido" se refiere a secuencias cortas que tienen hasta 50 aminoácidos. Una cadena de monómeros de aminoácidos de más de 50 aminoácidos se denomina "polipéptido". Dichos polipéptidos, cuando tienen más de 50 residuos de aminoácidos, también pueden clasificarse como proteínas, más particularmente, proteínas de bajo o medio peso molecular.
[0054] Los términos "análogo de péptido", "análogo", "análogo de secuencia", "secuencia análoga" y "análogo de SEQ ID NO: X" se usan aquí indistintamente y se refieren a un análogo de un péptido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con el péptido original, en el que el análogo retiene la actividad del péptido original; X representa un número de la secuencia. Por lo tanto, los términos "análogo" y "análogo activo" pueden usarse indistintamente. El término "análogo" se refiere a un péptido o una proteína que contiene sustituciones, reordenamientos, deleciones, adiciones y/o
modificaciones químicas en la secuencia de aminoácidos del péptido padre (original) o una proteína, respectivamente. De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo peptídico tiene al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con el péptido original. De acuerdo con una forma de realización, el análogo tiene una identidad de secuencia de alrededor del 80% a alrededor del 99%, alrededor del 85% a alrededor del 98% o alrededor del 90% a alrededor del 95% con el péptido original. Según algunas formas de realización, el análogo de la presente invención comprende la secuencia del péptido original en el que se realizaron 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones.
[0055] Las sustituciones de los aminoácidos pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas. La sustitución no conservativa abarca la sustitución de un aminoácido por cualquier otro aminoácido.
[0056] De acuerdo con algunas formas de realización, el término "análogo" abarca también el término "análogo conservador".
[0057] Las sustituciones conservadoras de aminoácidos, como conocen los expertos en la técnica, están dentro del alcance de la presente invención. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen la sustitución de un aminoácido por otro que tenga el mismo tipo de grupo funcional o cadena lateral, por ejemplo, alifático, aromático, cargado positivamente, cargado negativamente. Un experto reconocerá que las sustituciones individuales son un "análogo modificado de forma conservadora" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. A continuación, se proporciona un ejemplo típico de sustitución conservadora.
[0058] Cada uno de los seis grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: (1) alanina (A), serina (S), treonina (T); (2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); (3) asparagina (N), glutamina (Q); (4) arginina (R), lisina (K); (5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y (6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). En otras formas de realización, la sustitución conservativa abarca la sustitución con un aminoácido no natural químicamente similar.
[0059] Por lo tanto, en algunas formas de realización, el análogo es un análogo conservador del scFv, ya sea anti-CD38 o anti-CD 138. Según algunas formas de realización, el análogo conservador de la presente invención comprende la secuencia del scFv original en la que 1,2, 3 Se hicieron, 4 o 5 sustituciones conservativas. Según otra forma de realización, el análogo consiste en la secuencia de aminoácidos del péptido original en el que se realizaron 1, 2 o 3 sustituciones conservadoras. Así, el análogo consta de la secuencia de aminoácidos del péptido original con 1, 2 o 3 sustituciones conservadoras.
[0060] Según algunas formas de realización, el scFv anti-CD138 tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18. Según otras formas de realización, el scFv anti CD138 consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.
[0061] Según otras formas de realización, el scFv anti-CD38 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19. Según otras formas de realización, el scFv anti-CD38 consta de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19.
[0062] Según formas de realización adicionales, el anti-CD138 scFv tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y el anti-CD38 scFv tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19. Según otra forma de realización, el anti-CD138 scFv consta de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y el scFv anti-CD38 consta de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19.
[0063] Según cualquiera de las formas de realización anteriores, el dominio extracelular de las CAR comprende un péptido líder. De acuerdo con una forma de realización, el péptido líder está ubicado en el extremo N de scFv. Los términos "péptido líder", "péptido líder" y "péptido señal" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a un péptido que transloca o provoca la translocación de la proteína diana a la membrana celular.
[0064] De acuerdo con una forma de realización, el primer CAR comprende un péptido líder que comprende SEQ ID NO: 20 ubicado en el extremo N de scFv anti-CD138. De acuerdo con otra forma de realización, el péptido líder que comprende SEQ ID NO: 20 está ubicado en el extremo N de scFv anti-CD138 que comprende o consiste en SEQ ID NO: 18.
[0065] De acuerdo con una forma de realización, el segundo CAR comprende un péptido líder que comprende SEQ ID NO: 20 11 1259 ubicado en el extremo N del scFv anti-CD38. De acuerdo con otra forma de realización, el péptido líder que comprende SEQ ID NO: 20 está ubicado en el extremo N de scFv anti-CD38 que comprende o consiste en SEQ ID NO: 19.
[0066] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, al menos uno de los CAR comprende un dominio coestimulador y al menos otro CAR comprende un dominio de activación.
[0067] Según algunas formas de realización, el primer CAR comprende un dominio coestimulador y el segundo CAR comprende un dominio de activación. Según algunas formas de realización, el primer CAR comprende un dominio de activación y el segundo CAR comprende un dominio coestimulador.
[0068] Según algunas formas de realización, el dominio coestimulador se selecciona de un dominio coestimulador de CD28, 4-1BB, OX40, iCOS, CD27, CD80 y CD70. Según una forma de realización, el dominio coestimulador es un dominio coestimulador de CD28. Según otra forma de realización, el dominio coestimulador tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22. Según otra forma de realización, el dominio coestimulador es un análogo de SEQ ID NO: 22.
[0069] Los términos "dominio de activación" y "elemento de activación" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a un dominio de señalización intracelular. Según algunas formas de realización, el dominio de activación se selecciona de FcRy y CD3-Z. Según una forma de realización, el dominio de activación tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23. Según otra forma de realización, el dominio de activación es un análogo de SEQ ID NO: 23.
[0070] De acuerdo con la enseñanza de la presente invención, es beneficioso separar entre un dominio coestimulador y un dominio de activación con el fin de lograr un menor efecto "en el objetivo fuera del tumor". Así, según una forma de realización, un CAR comprende solo un dominio coestimulador y el otro CAR comprende solo un dominio de activación. Así, en una forma de realización, el primer CAR, que comprende scFv anti-CD138, comprende un dominio coestimulador y carece de un dominio de activación, y el segundo CAR que comprende scFv anti-CD38 comprende un dominio de activación y carece de un dominio coestimulador. Según otra forma de realización, el primer CAR comprende un dominio de activación y carece de dominio coestimulador y el segundo CAR comprende un dominio coestimulador y carece de dominio de activación.
[0071] De acuerdo con una forma de realización adicional, al menos uno de los CAR comprende tanto un dominio de activación como un dominio coestimulador.
[0072] De acuerdo con otra forma de realización, el segundo CAR comprende tanto un dominio de activación como un dominio coestimulador. De acuerdo con tales formas de realización, el primer CAR comprende un dominio coestimulador y carece de un dominio de activación.
[0073] Según algunas formas de realización, el dominio de activación tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 y el dominio coestimulador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22. Según una forma de realización, el dominio de activación es un análogo de SEQ ID NO: 23. Según una forma de realización adicional, el dominio coestimulador en un análogo de SEQ ID NO: 22.
[0074] Según una forma de realización, el primer CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22. Según otra forma de realización, el segundo CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T diseñada que comprende dos CAR, en la que la primera CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22 y la segunda CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23.
[0075] Según cualquiera de las formas de realización anteriores, las CAR comprenden un dominio transmembrana (TM) y un dominio bisagra. Según las enseñanzas de la presente invención, cuando la referencia se hace a un dominio TM incluye también un dominio bisagra y las secuencias del dominio transmembrana incluyen también las secuencias de los dominios bisagra. Según una forma de realización, el primer CAR comprende un dominio I de TM (TM-I) que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35. Según otra forma de realización, el segundo CAR comprende un dominio II de TM (TM-II) que tiene el amino secuencia de ácido SEQ ID NO: 36.
[0076] De acuerdo con algunas formas de realización, la presente invención proporciona una célula T diseñada para expresar dos receptores de antígenos quiméricos (CAR), donde el primer CAR tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 24 y el segundo CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25. Según una forma de realización, el primer CAR tiene una secuencia de aminoácidos que es un análogo de SEQ ID NO: 24. Según otra forma de realización, el segundo CAR tiene una secuencia de aminoácidos que es un análogo de SEQ ID NO: 25. De acuerdo con una forma de realización adicional, el primer CAR tiene una secuencia de aminoácidos análoga a la SEQ ID NO: 24 y la segunda CAR tiene una secuencia de aminoácidos análoga a la SEQ ID NO: 25. Según una forma de realización, la presente invención proporciona un Células T diseñadas para expresar dos receptores de antígenos quiméricos (CAR), en los que el primer CAR consta de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 y el segundo CAR consta de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25. Según algunas formas de realización, la variante tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia original. Según otras formas de realización, la variante tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia original.
[0077] Según cualquiera de las formas de realización anteriores, las células T se seleccionan entre células T CD4+ y células T CD8+. Por tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona células T CD4+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separadas distintas, en las que la primera CAR comprende scFv anti-CD138 y la segunda CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención proporciona células T CD8+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separados distintos, en donde el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con algunas de tales formas de realización, el primer CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22. Según otra forma de realización, el segundo CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO:
22. NO: 23. Según una forma de realización, el primer CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22 y el segundo CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según una de tales formas de realización, el primer CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o es un análogo de la misma y el segundo CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 o es un análogo de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, la presente invención proporciona células T CD4+ y/o CD8+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separados distintos, donde el primer CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 y el segundo CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25.
[0078] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, las células T de la presente invención son capaces de expresar dos CAR separados distintos, donde el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con algunas formas de realización, la presente intención proporciona células T que expresan dos CAR separados distintos, en los que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con algunas formas de realización, la célula T se selecciona de una célula T CD4+ y una célula T CD8+. Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona células T CD4+ que expresan dos CAR separados distintos, en los que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. Según otra forma de realización, la presente invención proporciona células T CD8+ que expresan dos CAR separados distintos, en los que el primer c A r comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con algunas de tales formas de realización, el primer CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22. Según otra forma de realización, el segundo CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según una forma de realización, el primer CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22 y el segundo CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según una de tales formas de realización, la primera CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o es un análogo de la misma y el segundo CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 o es un análogo de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, la presente invención proporciona células T CD4+ y/o CD8+ que expresan dos CAR separados distintos, en donde el primer CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 y el segundo CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25.
[0079] De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona una célula T que comprende al menos una copia de una o más construcciones de ADN que codifican al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, donde el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo CAR comprenden un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38. Según una forma de realización, los dominios de unión a antígeno de las CAR de la presente invención son scFv. Por lo tanto, la célula T comprende al menos una copia de una o más construcciones de ADN que codifican al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en los que el primer CAR comprende un scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende un scFv anti-CD38. De acuerdo con una forma de realización, los dos CAR están codificados por una construcción de ADN. De acuerdo con otra forma de realización, los dos CAR están codificados por dos construcciones de ADN diferentes. De acuerdo con una forma de realización, la célula T expresa o es capaz de expresar los CAR de la presente invención.
[0080] El término "construcción de ADN", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de un ácido nucleico construido artificialmente. Puede ser aislado o integrado en otra molécula de ADN. En consecuencia, se produce una "construcción de ADN recombinante" mediante métodos de laboratorio. El término "ácido nucleico" abarca ADN, ARN, monocatenario o bicatenario y modificaciones químicas de los mismos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en este documento.
[0081] Los CAR de la presente invención pueden estar codificados por una construcción de ADN o por 2 o más construcciones de ADN.
[0082] De acuerdo con algunas formas de realización, los dos CAR de la presente invención están codificados por una construcción de ADN. Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T que comprende al menos una copia de una construcción de ADN que codifica: (A) de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, y (B) forman 5' a 3' (v) un péptido líder, (vi) dominio anti-CD38 scFv, (vii) un dominio transmembrana II y (viii) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos; donde (A) y (B) están separados por un péptido de autoescisión. De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T que comprende al menos una copia de una construcción de ADN que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II, y (ix) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos.
[0083] Según una forma de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio de activación. Según otra forma de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD38, (iii) un dominio transmembrana II, (iv) un dominio de activación, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) un dominio scFv
anti-CD138, (viii) un dominio transmembrana I y (ix) un dominio coestimulador.
[0084] Todas las definiciones y formas de realización utilizadas en aspectos anteriores, y en particular aquellas relacionadas con CAR, sus partes y dominios, así como con construcciones de ADN y células T, se incluyen e incorporan aquí.
[0085] De acuerdo con una forma de realización, el péptido autoescindible es un péptido que tiene la SEQ ID NO: 26 o un análogo activo del mismo. De acuerdo con otra forma de realización, el péptido autoescindible es el péptido IRES o un análogo del mismo. Según otra forma de realización, el péptido autoescindible está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 27 o una variante de la misma.
[0086] Los términos "variante", "variante de ADN", "variante de secuencia", "variante de polinucleótido" y "variante de SEQ ID NO: X" se usan aquí indistintamente y se refieren a un polinucleótido de ADN que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con el original. polinucleótido, en el que X es un número de una secuencia. La variante puede incluir mutaciones tales como deleción, adición o sustitución de modo que las mutaciones no cambien el marco de lectura abierto y el polinucleótido codifique un péptido o una proteína que tenga una estructura y una función sustancialmente similares a las del péptido o proteína codificada por el polinucleótido original. Según algunas formas de realización, las variantes son variantes conservadoras. El término "variantes conservativas", como se usa en el presente documento, se refiere a variantes en las que un cambio de uno o más nucleótidos en una posición de codón dada da como resultado que no se altere el aminoácido codificado en esa posición. Por lo tanto, el péptido o la proteína codificada por las variantes conservativas tiene una identidad de secuencia del 100 % con el péptido o la proteína codificada por el polinucleótido original. Según algunas formas de realización, la variante es una variante no conservativa que codifica para un péptido o una proteína que es un análogo conservativo del péptido de la proteína codificada por el polinucleótido original. Según algunas formas de realización, la variante tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con el polinucleótido original.
[0087] De acuerdo con algunas formas de realización, los CAR de la presente invención están codificados por dos o más construcciones de ADN diferentes. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la presente invención proporciona una célula T que comprende dos construcciones de ADN diferentes, donde la primera construcción de ADN comprende una secuencia que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I (TM-I) y (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, y la segunda construcción de ADN comprende una secuencia que codifica de 5' a 3' (i) un péptido líder, (ii) un dominio scFv anti-CD38, (iii) un dominio transmembrana II (TM-II) y (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos. Según una forma de realización, la primera construcción de ADN comprende una secuencia que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un TM-I y (iv) un dominio coestimulador. Según otra forma de realización, la segunda construcción de ADN comprende una secuencia que codifica (i) un péptido líder, (ii) un dominio scFv anti-CD38, (iii) un TM-II y (iv) un dominio de activación. Según una forma de realización, la primera construcción de ADN comprende una secuencia que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un TM-I y (iv) un dominio coestimulador y la segunda construcción de ADN comprende una secuencia que codifica (i) un péptido líder, (ii) un dominio scFv anti-CD38, (iii) un TM-II y (iv) un dominio de activación.
[0088] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, los dos CAR están codificados por una o dos construcciones de ADN separadas; el péptido líder tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 o un análogo de la misma. Según otra forma de realización, el dominio de activación tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 o un análogo de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, el dominio coestimulador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 o un análogo de la misma. De acuerdo con otra forma de realización más, el dominio scFv anti-CD138 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 o un análogo de la misma. Según una forma de realización determinada, el dominio anti-CD38 scFv tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 o un análogo de la misma. Según algunas formas de realización, TM-I tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35. Según otra forma de realización, TM-II tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36. Según algunas formas de realización, el péptido líder está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 39 o una variante de la misma; y/o el scFv anti-CD138 está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 28 o una variante de la misma; y/o el scFv anti-CD38 está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 29 o una variante de la misma; y/o el dominio coestimulador está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 30, o una variante de la misma, y/o el dominio de activación está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 31, o una variante del mismo. De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio transmembrana I está codificado por la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 37 o una variante de la misma. De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio transmembrana II está codificado por la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 38 o una variante de la misma. De acuerdo con dichas formas de realización, el análogo o la variante tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia original.
[0089] Según otras formas de realización, la construcción de ADN que codifica ambas CAR comprende la SEQ ID NO: 28. Según otras formas de realización, dicha construcción de ADN comprende una variante, como una variante conservativa, de la SEQ ID NO: 28.
[0090] De acuerdo con algunas formas de realización, dos CAR están codificados por dos construcciones de ADN
diferentes y la primera construcción de ADN comprende la SEQ ID NO: 28. Según otras formas de realización, la primera construcción de ADN comprende una variante, por ejemplo, una variante conservadora de la SEQ ID NO: 28.
[0091] De acuerdo con algunas formas de realización, la construcción de ADN que codifica ambas CAR comprende la SEQ ID NO: 29. Según otras formas de realización, dicha construcción de ADN comprende una variante, tal como una variante conservadora, de la SEQ ID NO: 29.
[0092] Según algunas formas de realización, dos CAR están codificados por dos construcciones de ADN diferentes y la segunda construcción de ADN comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 29. Según otras formas de realización, la segunda construcción de ADN comprende una variante, por ejemplo, una variante conservativa de SEQ ID NO: 29.
[0093] De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio coestimulador está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 30 y el dominio de activación está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 31
[0094] De acuerdo con una forma de realización, dos CAR están codificados por una construcción de ADN que comprende, de 5' a 3, secuencias de ADN SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28, 30, 29 y 31
[0095] De acuerdo con algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende SEQ ID NO: 32 o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende SEQ ID NO: 33 o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende de 5' a 3' SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende de 5' a 3' SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 32.
[0096] De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona una célula T que comprende una construcción de ADN que codifica dos CAR de la presente invención, donde la construcción de ADN tiene SEQ ID NO: 34. Según otra forma de realización, la construcción de ADN es una variante, por ejemplo, una variante conservativa de SEQ ID NO: 34. Según otras formas de realización, la variante tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia original.
[0097] De acuerdo con algunas formas de realización, la presente invención proporciona una célula T que comprende dos construcciones de ADN que codifican dos CAR de la presente invención, donde la primera construcción de ADN comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 32 y la segunda construcción de ADN comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 33. Según una forma de realización, la primera construcción de ADN tiene una secuencia de ADN que es una variante, tal como una variante conservadora de SEQ ID NO: 32. Según una forma de realización, la segunda construcción de ADN tiene una secuencia de ADN que es una variante, tal como como variante conservadora de SEQ ID NO: 33. De acuerdo con una forma de realización adicional, la célula T que comprende dos construcciones de ADN, en donde la primera construcción de ADN comprende el ADN que es una variante de SEQ ID NO: 32 y la segunda construcción de ADN tiene un ADN siendo la secuencia una variante de SEQ ID NO: 33. De acuerdo con algunas formas de realización, la variante tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia original. Según otras formas de realización, la variante tiene al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia original.
[0098] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, las células T que comprenden las construcciones de ADN de la presente invención expresan o son capaces de expresar las CAR codificadas por las construcciones de ADN.
[0099] La palabra "expresión" o "expresar", tal como se usa en el presente documento en referencia a una construcción de ADN, significa el producto transcripcional y/o traduccional de esa construcción. El nivel de expresión de una molécula de ADN en una célula puede determinarse sobre la base de la cantidad de ARNm correspondiente que está presente dentro de la célula o de la cantidad de proteína codificada por ese ADN producido por la célula. Según algunas formas de realización, la expresión es una expresión condicional.
[0100] Según otro aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en el que el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une a específicamente a CD38. De acuerdo con una forma de realización, la construcción de ácido nucleico codifica dos receptores de antígenos quiméricos separados distintos en los que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con una forma de realización, la construcción de ácido nucleico es ADN. Así, en una forma de realización, la presente invención proporciona una construcción de ADN que codifica dos receptores de antígenos quiméricos separados distintos en los que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38.
[0101] De acuerdo con una forma de realización, la construcción de ADN codifica de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) un dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un
dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos.
[0102] Según una forma de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio de activación. Según otra forma de realización, la construcción de ADN codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD38, (iii) un dominio transmembrana II, (iv) un dominio de activación, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) un dominio scFv anti-CD138, (viii) un dominio transmembrana I y (ix) un dominio coestimulador. De acuerdo con una forma de realización, el péptido líder tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 o un análogo de la misma. Según otra forma de realización, el dominio de activación tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 o un análogo de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, el dominio coestimulador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 o un análogo de la misma. De acuerdo con otra forma de realización más, el dominio scFv anti-CD138 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 o un análogo de la misma. Según una determinada realización, el dominio anti-CD38 scFv tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 o un análogo de la misma. Según algunas formas de realización, TM-I tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35. Según otra forma de realización, TM-II tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36.
[0103] De acuerdo con algunas formas de realización, el péptido líder está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 39 o una variante de la misma. De acuerdo con otras formas de realización, el scFv anti-CD138 está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 28 o una variante de la misma. Según algunas formas de realización, el scFv anti-CD38 está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 29 o una variante de la misma. Según algunas formas de realización, el dominio coestimulador está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 30, o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización más, el dominio de activación está codificado por una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 31 o una variante de la misma. Según algunas formas de realización, el dominio coestimulador está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 y el dominio de activación está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 31. Según algunas formas de realización, el péptido autoescindible está codificado por una secuencia de ADN SEQ ID NO: 27 o una variante de la misma. De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio transmembrana I está codificado por la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 37 o una variante de la misma. De acuerdo con algunas formas de realización, el dominio transmembrana II está codificado por la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 38 o una variante de la misma.
[0104] Según una forma de realización, la construcción de ADN comprende, desde 5' hasta 3, secuencias de ADN SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28, 30, 29 y 31.
[0105] De acuerdo con algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende SEQ ID NO: 32 o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende SEQ ID NO: 33 o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende de 5' a 3' SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende de 5' a 3' SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 33. NO: 32. Según algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende una secuencia autoescindible que tiene la secuencia de ADN SEQ ID NO: 27 entre las secuencias SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
[0106] Según algunas formas de realización, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 34. Según algunas formas de realización, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que consta de la SEQ ID NO: 34. Según otra forma de realización, la construcción de ADN es una variante, por ejemplo, una variante conservadora de SEQ ID NO: 34.
[0107] De acuerdo con algunas formas de realización, la construcción de ADN se une operativamente a un promotor. El término "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia reguladora que inicia la transcripción de un ácido nucleico cadena abajo. El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN dentro de una secuencia de ADN más grande que define un sitio al que la ARN polimerasa puede unirse e iniciar la transcripción. Un promotor puede incluir elementos potenciadores o represores distales opcionales. El promotor puede ser homólogo, es decir, de forma natural para dirigir la expresión del ácido nucleico deseado, o heterólogo, es decir, de forma natural para dirigir la expresión de un ácido nucleico derivado de un gen distinto del ácido nucleico deseado. Un promotor puede ser constitutivo o inducible. Un promotor constitutivo es un promotor activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor inducible es un promotor que está activo bajo la regulación ambiental o de desarrollo. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, pueden comprender un segmento o fragmento de un gen nativo, o pueden estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Se entiende además que el mismo promotor puede expresarse diferencialmente en diferentes tejidos y/o expresarse diferencialmente en diferentes condiciones.
[0108] Según otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende la construcción de ácido nucleico de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización, la construcción de ADN codifica dos receptores de antígenos quiméricos separados distintos en los que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con otra forma de realización, el vector comprende una construcción de ADN
que codifica de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos. Según algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende, desde 5' hasta 3, secuencias de ADN SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28, 30, 29 y 31. Según otra forma de realización, la construcción de ADN comprende desde SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. Según algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende la secuencia SEQ ID NO: 27 entre las secuencias SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. Según otra forma de realización más, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ADN que comprende SEQ ID NO: 34. De acuerdo con una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ADN que consiste en SEQ ID NO: 34.
[0109] Los términos "vector" y "vector de expresión" se usan aquí indistintamente y se refieren a cualquier vector viral o no viral como plásmido, virus, retrovirus, bacteriófago, cósmido, cromosoma artificial (bacteriano o de levadura), fago, vector binario en doble o simple forma lineal o circular de cadena, o secuencia de ácido nucleico, que es capaz de transformar células huésped y, opcionalmente, capaz de replicarse en una célula huésped. El vector puede integrarse en el genoma celular o puede existir extracromosómicamente (p. ej., un plásmido de replicación autónomo con un origen de replicación). El vector puede contener un marcador opcional adecuado para su uso en la identificación de células transformadas, por ejemplo, resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina. Un vector de clonación puede poseer o no las características necesarias para que funcione como un vector de expresión.
[0110] De acuerdo con otras formas de realización, el vector es un virus, por ejemplo, un virus modificado o manipulado. La modificación de un vector puede incluir mutaciones, tales como mutación por deleción o inserción, deleción de genes o inclusión de genes. En particular, se puede realizar una mutación en una o más regiones 21 22 14 del genoma viral. Tales mutaciones pueden introducirse en una región relacionada con las proteínas estructurales internas, la replicación o la función de transcripción inversa. Otros ejemplos de modificación del vector son la eliminación de ciertos genes que constituyen el vector infeccioso nativo, como los genes relacionados con la patogenicidad del virus y/o con su capacidad de replicación.
[0111] Según una forma de realización, el vector es un vector viral. Cualquier virus puede ser utilizado por los métodos descritos en este documento. El virus puede ser un virus ADN bicatenario (p. ej., adenovirus, herpesvirus, poxvirus), un virus de ADN monocatenario con sentido "plus" (p. ej., parvovirus), un virus de ARN bicatenario (p. ej., reovirus), un virus de ARN monocatenario con sentido (p. ej., picornavirus, Togavirus), un virus de ARN de sentido "menos" de cadena sencilla (p. ej., ortomixovirus, rabdovirus), un virus de ARN de cadena sencilla con sentido con un ADN intermedio (p. ej., retrovirus) o un virus de transcripción inversa de doble cadena (p. ej., hepadnavirus). En ciertas formas de realización no limitantes de la presente invención, el virus es el poliovirus (PV), el rinovirus, el virus de la influenza que incluye la gripe aviar (p. ej., el subtipo H5N1 del virus de la influenza A), el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la bronquitis infecciosa, virus del ébola, virus de Marburg, virus de la fiebre del dengue (serotipos de flavivirus), virus de la enfermedad del Nilo Occidental, virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la fiebre amarilla, Ébola (ébolavirus), varicela (virus varicelazoster), sarampión (un paramixovirus), paperas (un paramixovirus), rabia (Lyssavirus), virus del papiloma humano, herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, virus del herpes simple (VHS tipo 1) o herpes genital (VHS tipo 2). Según algunas formas de realización, el vector es un virus seleccionado entre lentivirus, adenovirus, adenovirus modificado y retrovirus. En una forma de realización particular, el vector es un lentivirus. Según cualquiera de las formas de realización anteriores, el virus es un virus no patógeno o un virus modificado que carece de genes patógenos.
[0112] Según otro aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende la construcción de ADN o el vector de la presente invención. Según algunas formas de realización, la célula es una célula procariota o eucariota. De acuerdo con otra forma de realización, la célula es una célula de mamífero humano o no humano. Según algunas formas de realización, la célula es una célula humana. Según alguna forma de realización particular, la célula es una célula T. De acuerdo con una forma de realización, la célula T se selecciona de una célula T c D4+ y una célula T CD8+.
[0113] Según otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células T de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0114] Todas las definiciones y formas de realización utilizadas en aspectos anteriores, y en particular aquellas relacionadas con CAR, sus partes y dominios, así como con construcciones de ADN y células T, se incluyen e integran en el presente documento.
[0115] El término "composición farmacéutica", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que comprende las células T de la presente invención formuladas junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
[0116] La formulación de la composición farmacéutica puede ajustarse según las aplicaciones. En particular, la composición farmacéutica se puede formular usando un método conocido en la técnica para proporcionar una liberación rápida, continua o retardada del ingrediente activo después de la administración a los mamíferos. Por ejemplo, la formulación puede ser cualquiera seleccionada entre emplastos, gránulos, lociones, linimentos, limonadas, aguas
aromáticas, polvos, jarabes, ungüentos oftálmicos, líquidos y soluciones, aerosoles, extractos, elixires, ungüentos, extractos fluidos, emulsiones, suspensiones, decocciones, infusiones, soluciones oftálmicas, tabletas, supositorios, inyecciones, licores, cápsulas, cremas, trociscos, tinturas, pastas, píldoras y cápsulas de gelatina blanda o dura. Según una forma de realización, la composición se formula como una formulación líquida. Según otra forma de realización, la composición se formula como solución inyectable.
[0117] El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, conservantes, antioxidantes, recubrimientos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tensioactivos, rellenos, desintegrantes, aglutinantes, diluyentes, lubricantes, deslizantes, agentes de ajuste del pH, agentes tamponantes, potenciadores, agentes humectantes, agentes solubilizantes, tensioactivos, antioxidantes similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Las composiciones pueden contener otros compuestos activos que proporcionen funciones terapéuticas suplementarias, adicionales o mejoradas.
[0118] Los términos "farmacéuticamente aceptable" y "farmacológicamente aceptable" incluyen entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal oa un ser humano, según corresponda. Para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por una agencia reguladora de medicamentos del gobierno, por ejemplo, los estándares de la Oficina de Productos Biológicos de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA).
[0119] La composición de la presente invención puede administrarse por cualquier método conocido. Los términos "administrar" o "administración de" una composición a un sujeto pueden llevarse a cabo usando uno de una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un compuesto o un agente puede administrarse por vía intravenosa, arterial, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, ocular, sublingual, oral (por ingestión), intranasal (por inhalación), intraespinal, intracerebral y transdérmica (por absorción, por ejemplo, a través de un conducto cutáneo). Un compuesto o agente también puede introducirse apropiadamente mediante dispositivos poliméricos recargables o biodegradables u otros dispositivos, por ejemplo, parches y bombas, o formulaciones, que proporcionan la liberación prolongada, lenta o controlada del compuesto o agente. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados. En algunas formas de realización, la administración incluye tanto la administración directa, incluida la autoadministración, como la administración indirecta, incluido el acto de recetar un fármaco. Por ejemplo, como se usa aquí, un médico que instruye a un paciente para que se autoadministre un fármaco, o para que otro administre el fármaco y/o que proporciona al paciente una receta para un fármaco, le está administrando el fármaco al paciente. Según una forma de realización, la composición farmacéutica se administra por vía parenteral, es decir, no por vía oral. Según una forma de realización, la composición farmacéutica se administra sistémicamente. Según otra forma de realización, la composición farmacéutica se administra localmente. Según una forma de realización, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Según otra forma de realización, la composición farmacéutica se administra por vía intramuscular.
[0120] De acuerdo con otra forma de realización, la composición farmacéutica comprende una pluralidad de células T que comprenden la construcción de ADN de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización, la célula T comprende una construcción que codifica las dos CAR de la presente invención. De acuerdo con otra forma de realización, la célula T comprende dos construcciones, cada una de las cuales codifica un CAR separado de la presente invención.
[0121] De acuerdo con una forma de realización, la comparación farmacéutica comprende una pluralidad de células T modificadas genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos separados distintos (CAR), en el que el primer CAR comprende un scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende un scFv anti-CD38. De acuerdo con algunas formas de realización, las células T se seleccionan de células T CD4+, células T CD8+ o una combinación de las mismas. Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende células T CD4+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separados distintos, en donde el primer c Ar comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende células T CD8+ modificadas genéticamente para expresar dos c Ar separados distintos, en donde el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38. De acuerdo con algunas de tales formas de realización, el primer CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22. Según otra forma de realización, el segundo CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según en una forma de realización, el primer CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22 y el segundo CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según una de tales formas de realización, la primera CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o es un análogo de la misma y el segundo CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 o es un análogo de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende células T CD4+ y/o CD8+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separados distintos, donde el primer CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 y el segundo CAR consiste en de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25. Según algunas formas de realización, las células T son capaces de expresar las CAR. De acuerdo con otra forma de realización, las células T expresan los CAR.
[0122] De acuerdo con una forma de realización, la composición farmacéutica comprende células T que comprenden la construcción de ADN de la presente invención. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN que codifica de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) un dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos. Según algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende, desde 5' hasta 3, secuencias de ADN SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28, 30, 29 y 31. Según otra forma de realización, la construcción de ADN comprende desde SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. Según algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende la secuencia SEQ ID NO: 27 entre las secuencias SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. Según otra forma de realización más, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ADN que comprende SEQ ID NO: 34. De acuerdo con una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ADN que consiste en SEQ ID NO: 34.
[0123] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, la composición farmacéutica para uso en el tratamiento del cáncer.
[0124] El término "tratar" una afección o un paciente como se usa en el presente documento se refiere a tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, o mejorar anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de un cáncer mejorar o aliviar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección, prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad, acondicionar y proteger de síntomas nocivos o molestos. El tratamiento adicional se refiere a lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar el desarrollo de los síntomas característicos de los trastornos que se están tratando; (c) limitar el empeoramiento de los síntomas característicos de los trastornos que se están tratando; (d) limitar la recurrencia del (de los) trastorno(s) en pacientes que han tenido previamente el (los) trastorno(s); y/o (e) limitar la recurrencia de los síntomas en pacientes que previamente eran asintomáticos para el (los) trastorno(s).
[0125] Según una forma de realización, el cáncer es mieloma. De acuerdo con otra forma de realización, el cáncer es mieloma múltiple.
[0126] El término "mieloma" se refiere a un cáncer de médula ósea. El término "mieloma múltiple" se refiere a un cáncer de los glóbulos blancos del plasma.
[0127] Por lo tanto, en algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células T modificadas genéticamente para expresar dos CAR separados distintos, donde el primer CAR anti-CD138 scFv y el segundo CAR comprende anti-CD38 scFv, para uso en el tratamiento del mieloma múltiple. En ciertas formas de realización, tal composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de mieloma múltiple. En una forma de realización, las células T son células T CD4+ o células T CD8+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separadas distintas. De acuerdo con algunas de tales formas de realización, el primer CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22. Según otra forma de realización, el segundo CAR comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según en una forma de realización, el primer CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22 y el segundo CAR comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. Según una de tales formas de realización, la primera CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o es un análogo de la misma y el segundo CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 o es un análogo de la misma. De acuerdo con una forma de realización adicional, la presente invención proporciona células T CD4+ y/o CD8+ modificadas genéticamente para expresar dos CAR separados distintos, donde el primer CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 y el segundo CAR consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25. De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, la célula T expresó los dos CAR.
[0128] De acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, el término tratamiento abarca el aumento de la tasa de supervivencia en al menos 1,5, 2, 2,5 o 3 veces. De acuerdo con otra forma de realización, tratar comprende reducir los efectos secundarios en comparación con el tratamiento tradicional o en comparación con el tratamiento con células T que expresan un CAR.
[0129] De acuerdo con algunas formas de realización, el tratamiento que usa la composición farmacéutica tiene una tasa mucho menor de efectos adversos.
[0130] Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad eficaz de células T de la presente invención. Según otra forma de realización, el método comprende administrar la composición farmacéutica que comprende las células T de la presente invención. Según una forma de realización, el cáncer es mieloma. De acuerdo con otra forma de realización, el cáncer es mieloma múltiple.
[0131] De acuerdo con otro aspecto más, la presente invención proporciona un uso de células T modificadas
genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, en el que el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38. De acuerdo con una forma de realización, las células T comprenden la construcción de ADN de la presente invención. De acuerdo con otra forma de realización, la célula T comprende al menos dos construcciones de ADN, que codifican por separado un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38.
[0132] Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de células T de la presente invención. De acuerdo con una forma de realización, la presente invención proporciona un método de preparación de células T modificadas genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en el que el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38, dicho método comprende la transfección de células T con la construcción de ADN de la presente invención.
[0133] Todas las definiciones y formas de realización utilizadas en aspectos anteriores, y en particular aquellas relacionadas con CAR, sus partes y dominios, así como con construcciones de ADN y células T, se incluyen e integran en el presente documento.
[0134] Los términos "transfección", "transducción", "transfección" o "transducción" se pueden usar indistintamente y se definen como un proceso de introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula. Los ácidos nucleicos se introducen en una célula usando métodos no virales o basados en virus. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser secuencias génicas que codifican proteínas completas o porciones funcionales de las mismas. Los métodos de transfección no virales incluyen cualquier método de transfección apropiado que no use ADN viral o partículas virales como sistema de administración para introducir la molécula de ácido nucleico en la célula. Los métodos de transfección no viral ejemplares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección liposomal, nucleofección, sonoporación, transfección mediante choque térmico, magnetifección y electroporación. En algunas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico se introducen en una célula mediante electroporación siguiendo procedimientos estándar bien conocidos en la técnica. Para los métodos de transfección basados en virus, se puede usar cualquier vector viral útil en los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores virales retrovirales, adenovirales, lentivirales y adenoasociados. En algunas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico se introducen en una célula usando un vector retroviral siguiendo procedimientos estándar bien conocidos en la técnica.
[0135] De acuerdo con una forma de realización, las células T son células T CD4+. Según otra forma de realización, las células T son células CD8+.
[0136] De acuerdo con una forma de realización, el método comprende la transducción de células T con al menos una construcción de ADN que codifica dos CAR, donde la construcción comprende, de 5' a 3, secuencias de ADN SEQ ID NO: 28, 30, 29 y 31. De acuerdo con algunas formas de realización, la construcción de ADN comprende SEQ ID NO: 32 o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende SEQ ID NO: 33 o una variante de la misma. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende de 5' a 3' SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. De acuerdo con otra forma de realización, la construcción de ADN comprende de 5' a 3' SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 32.
[0137] Según una forma de realización, una construcción de ADN que codifica dos CAR de la presente invención tiene SEQ ID NO: 34. Según otra forma de realización, la construcción de ADN es una variante, por ejemplo, una variante conservativa, de SEQ ID NO: 34.
[0138] De acuerdo con una forma de realización, el método comprende la transducción de células T con dos construcciones de ADN, cada una de las cuales codifica un CAR separado de la presente invención, en el que la primera construcción de ADN comprende la secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 32 y la segunda construcción de ADN comprende la secuencia de ADN. secuencia establecida en SEQ ID NO: 33. Según una forma de realización, la primera construcción de ADN tiene una secuencia de ADN que es una variante, tal como una variante conservadora de SEQ ID NO: 32. Según una forma de realización, la segunda construcción de ADN tiene una secuencia de ADN siendo la secuencia una variante, tal como una variante conservadora de SEQ ID NO: 33. De acuerdo con una forma de realización adicional, la célula T que comprende dos construcciones de ADN, en donde la primera construcción de ADN comprende el ADN que es una variante de SEQ ID NO: 32 y el la segunda construcción de ADN tiene una secuencia de ADN que es una variante de SEQ ID NO: 33.
[0139] De acuerdo con cualquiera de las formas de realización anteriores, la transducción se realiza utilizando un vector viral seleccionado entre vectores virales retrovirales, adenovirales, lentivirales y adenoasociados.
[0140] De acuerdo con algunas formas de realización, el vector puede contener un marcador opcional adecuado para su uso en la identificación de células transformadas.
[0141] Los términos "que comprende", "comprende", "induye(n)", "que tiene", "tiene" y "contiene(n)", se utilizan aquí de manera intercambiable y tienen el significado de "consistir al menos en parte de". Al interpretar cada declaración en esta especificación que incluye el término "que comprende", también pueden estar presentes otras características distintas a las precedidas por el término. Los términos relacionados como "comprende" y "comprenden" deben interpretarse de la misma manera. Los términos "tiene", "tienen", “que tiene" y "que comprende" también pueden abarcar el significado de "que consiste en" y "que consiste esencialmente en", y pueden sustituirse por estos términos. El término "que consta de" excluye cualquier componente, paso o procedimiento que no esté específicamente delineado o enumerado. El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición o componente puede incluir ingredientes adicionales, pero solo si los ingredientes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de las composiciones o métodos reivindicados.
[0142] Habiendo descrito ahora en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS
Materiales y métodos
Líneas celulares y cultivo
[0143] Las líneas celulares (línea celular de mieloma múltiple humano que expresa CAG/CAG-Luciferasa y PC-3, una línea celular de cáncer de próstata humano) se cultivaron en RPMI (Industrias biológicas, Bet-Ha'emek, Israel), suplementadas con 10% de feto de ternera. suero (FCS) (clon Hy) y glutamina 2 mM, en una incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2. Se cultivaron células embrionarias humanas 293T (ATCC) y PG13 (una línea celular murina que expresa Gag-Pol e infectada con proteína de envoltura viral pCL-Ampho) en DMEM suplementado con FCS al 10%, glutamina 2 mM y piruvato de sodio 1 mM. Las células se incubaron en una incubadora a 37° humidificada con 7,5% de CO2. Los linfocitos humanos se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 % y 2-mercaptoetanol 50 μM, y se incubaron en una incubadora a 37° humidificada con CO2 al 5 %. Todos los medios se complementaron con una solución antibiótica mixta que contenía penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y neomicina (10 μg/ml) (Bio-Lab, Jerusalén, Israel). Todas las células se comprobaron en busca de micoplasma mediante PCR. Las células se congelaron en pases bajos y se registró el número de pases después de la descongelación. Las células se mantuvieron en cultivo durante no más de 4 semanas, lo que corresponde a aproximadamente 12 pases. Las líneas celulares primarias que se usaron en este proyecto se ordenaron a Cell Biologics y Lonzo a Almog and Eisenberg Bros. Ltd. Cada célula primaria se propagó como se indica en su hoja de datos.
Anticuerpos y reactivos
[0144] Se preparó internamente CD3 antihumano purificado a partir del hibridoma OKT3. El CD28 antihumano purificado se adquirió de Southern Biotechnology Associates, Inc (Birmingham, EE. UU.). La IL-2 humana se adquirió de Novartis-Pharma (Inglaterra). Las proteínas c D38 y CD138 recombinantes, etiquetadas con His o Fc humana se adquirieron de Sino Biological. Los anticuerpos anti-His se adquirieron de Abcam; Los anticuerpos anti-Fc humanos (Y-específicos) se adquirieron de eBioscience. El APC anti-CD3 humano se obtuvo de BioLegend. El CD38 PE-cy7 antihumano, el APC CD-138 antihumano y el ErbB2 FITC antihumano se adquirieron de eBioscince.
Ejemplo 1
[0145] En el siguiente ejemplo, se prepararon y analizaron células T humanas, transducidas con diferentes receptores de antígenos quiméricos. El objetivo del presente ejemplo fue probar la eficacia de los transductores de células T con dos CAR diferentes que se unen específicamente a dos antígenos distintos que son clínicamente relevantes para tratamientos de mieloma múltiple (MM). Para ello se eligieron dos antígenos clínicamente relevantes: CD38 y CD138. Se generaron dos CAR dirigidos a unir específicamente estos antígenos. Un CAR comprendía scFv derivado del anticuerpo monoclonal específico anti-CD138 con Vl y Vh que tenían las secuencias SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente. El segundo CAR comprende scFv derivado del anticuerpo monoclonal específico anti-CD38 con Vl y Vh que tienen las secuencias SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. La Vl y Vh en cada una de las CAR se conectó con un conector de 14 aminoácidos que tenía la secuencia GSTSGSGKSSEg Kg (SEQ ID NO: 17).
[0146] El elemento de prueba de los presentes experimentos fueron células T transducidas con dos CAR siguientes: uno con anti-CD138 (aCD138) scFv y otro con anti-CD38 (aCD38) scFv. Con el fin de reducir la toxicidad "en el objetivo fuera del tumor", el dominio coestimulador y los elementos de señalización de activación se separaron entre los dos CAR; un CAR que tenía aCD138 scFv albergaba solo un dominio coestimulador (un dominio transmembrana y coestimulador de CD28 tienen la secuencia SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 22, respectivamente) y el CAR que tenía aCD38 scFv tenía el elemento de señalización de activación solamente (el dominio transmembrana de CD8 y un dominio FcR-gamma tienen la secuencia SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 26, respectivamente). Los dos CAR se colocaron en una construcción de ADN que comprende un péptido autoescindible T2A, que tiene la secuencia SEQ ID NO: 26, entre ellos. La presentación esquemática de la construcción se muestra en la Fig. 1, y la construcción utilizada tenía la secuencia SEQ ID NO: 21. La
construcción se denomina Dual-CAR.
[0147] Se usaron varias células T de control que comprendían diferentes CAR. Switch se refiere a un control que comprende dos CAR en el que uno de los CAR clínicamente relevantes, es decir, CAR anti-CD138 o CAR anti-CD38 se reemplazó con CAR anti-ErbB2 (N29, ErbB2 no se expresa en mieloma múltiple) Se usaron los siguientes clones para generar las células T modificadas:
aCD138-CD28-Y
aCD38-CD28-Y
Dual-CAR: aCD138-CD28-T2A-aCD38-Y
Switch 1 (control 1): N29-CD28-T2A-aCD38-Y
Switch 2 (control 2): aCD138-CD28-T2A-N29-Y
en el que aCD138 es un scFv anti CD138; aCD38 es un scFv anti CD38; y - dominio de activación de FcRy (motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor - ITAM); CD28 - elemento coestimulador de CD28; t 2a - péptido autoescindible y N29 - anti-ErbB2 scFv.
[0148] En primer lugar, se probó la capacidad de las células T para someterse a la transducción con los CAR utilizando virus derivados de las células de empaquetamiento. Se activaron linfocitos de sangre periférica humana (PBL) durante 48 horas y se transdujeron con sobrenadante de la línea celular de empaquetamiento relevante. Después de dos días desde la transducción, las células se tiñeron para determinar la expresión de proteínas y se analizaron mediante FACS.
Transducción de células T
[0149] Brevemente, los linfocitos de sangre periférica (LSP) de donantes humanos sanos se aislaron mediante centrifugación a través de un gradiente de Lymphoprep (Axis-shield, Oslo, Noruega) y se cultivaron a 3x106 células/pocillo en 4 ml de RPMI-1640 completo complementado con 50 μM de 2-mercaptoetanol. Las células se estimularon durante 2 días en placas de 6 pocillos no tratadas con cultivo de tejido (Falcon) recubiertas previamente con 1 μg/ml de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 humano de rata (AbD Serotec, Ee . UU.). A continuación, los linfocitos activados se recogieron mediante enjuague vigoroso con PBS. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en sobrenadante viral a una densidad de 2-3x106 células/ml. A continuación, se añadieron células (1,5 ml) a pocillos de placas de 6 pocillos no tratadas con cultivo de tejidos (Falcon) recubiertas previamente con RetroNectin™ (12 μg/ml, 4 ml/pocillo, Takara Shuzu Ltd. Otsu, Japón). Después de 6 h de incubación a 37 °C, 7,5 % CO2, el sobrenadante viral se eliminó cuidadosamente y se reemplazó con medio de linfocitos suplementado con IL-2 (100 Ul/ml) y se incubó durante la noche a 37 °C, 5 % CO2.
[0150] El procedimiento de transducción se repitió al día siguiente. Al día siguiente de la segunda infección, se recogieron los linfocitos mediante lavado vigoroso y lavado de las placas con PBS. Las células se resuspendieron en medio de linfocitos suplementado con 350 Ul/ml de IL-2 y se incubaron a 37°C, CO2 al 5%.
[0151] La capacidad de las células T transducidas con diferentes construcciones para someterse a una estimulación específica por la línea celular CAG que expresa los antígenos CD38 y CD138 se probó utilizando el ensayo INF-y en la línea celular CAG. Los resultados, que se muestran como una concentración de IFN-y, se presentan en la Fig. 2. La figura muestra resultados representativos de una de cada 4 repeticiones. La secreción de IFN-y por las células T transducidas está predefinida, entre otras cosas, por el nivel de transducción. Como puede verse en esta figura, las células T transducidas con diferentes CAR estimularon la secreción de IFN-y. La proporción de transducción de células T con CAR es diferente entre repeticiones, por lo que la esencia de la figura es mostrar que las CAR están estimuladas y la CAR dual tiene una estimulación impresionante.
Resultados
[0152] En primer lugar, puede verse que las células T transducidas con diferentes CAR que apuntan a diferentes antígenos responden a las células que expresan los antígenos correspondientes. Comparamos la capacidad de las células T transducidas con un dual-CAR-aCD138-CD28-aCD38-Y para responder selectivamente a las células CAG que expresan tanto CD38 como CD138. Las células Jurkat, que expresan solo CD38, sirvieron como control para ese propósito. Como puede verse en la Fig. 2, en las condiciones experimentales, la presencia de aCD38-Y CAR en las células T fue suficiente para dotar a las células T de una capacidad de activación completa independientemente de la coestimulación. Esto se concluye fácilmente a partir de los resultados que muestran que las células T que expresan N29-CD28-T2A-aCD38-Y (interruptor 1) o aCD38 CAR demostraron una alta secreción de IFN-y tras la incubación con células Jurkat.
[0153] La señal relativamente alta observada para las células T que expresan aCD38 CAR tras la incubación con medio puede explicarse por las interacciones de aCD38 CAR con las células T transducidas que expresan naturalmente el antígeno Cd 38.
Ejemplo 2.
[0154] En un arreglo experimental similar al descrito en el Ejemplo 1, la secreción de IFN-y por las células T transducidas con CAR-N29, switch 1 switch 2, o Dual-CAR (aCD138-CD28-T2A-aCD38) tras la incubación con diferentes se midieron las líneas celulares. Las líneas celulares fueron 293 - línea celular de control (que no expresan CD38, ErbB2 ni CD138), CAG, PC-3 -(línea celular de cáncer de próstata con baja expresión de CD38) e incubación de linfocitos sin células diana (solo medios). Los resultados se presentan en la Fig. 3A.
[0155] Puede verse a partir de los resultados que tanto SW1 como Dual-CAR tienen una baja secreción de IFN-y tras la incubación con células PC-3. Esto implica que aunque puede esperarse alguna reacción de las células T transducidas con Dual-CAR, es sustancialmente menor que la reacción con células que expresan profundamente CD38. También se puede ver que el efecto de Dual-CAR es mucho mayor que el de SW1. Esto fue completamente inesperado considerando que SW2 no mostró ninguna secreción de IFN-y. En un experimento adicional, para demostrar la seguridad del doble CAR, hemos analizado la estimulación contra células normales.
[0156] Para analizar más a fondo la toxicidad potencial de cada CAR simple o doble frente a los tejidos normales y predecir el efecto "fuera del tumor en el objetivo" esperado, se estimularon diferentes CAR utilizando tejidos humanos primarios normales. Los resultados se presentan en la Fig. 3B. Siete células primarias diferentes, como se indica, procedentes de donantes humanos sanos, con CD38/CD138-CD28-y o doble CAR. El CAR simple CD38 mostró una estimulación más fuerte por varios tejidos normales en comparación con el CAR dual. El CAR dual mostró una reactividad reducida contra las células probadas en relación con el CAR único CD38. Sorprendentemente, el CD138 CAR no mostró ninguna secreción de IFN-y contra los tejidos analizados, aunque se sabe que se expresa en muchos tipos de tejidos (atlas de proteínas).
[0157] Con el fin de demostrar la relación entre la secreción de IFN-y y la destrucción de células diana por parte de las células CAR T, estimulamos las células CAR T utilizando células CAG estables infectadas con luciferasa en una proporción de 1:2 (objetivo: CAR efectora), y después A las 20 horas de incubación, analizamos los cultivos mediante imágenes de bioluminiscencia (IVIS). Como se muestra en la Fig. 4 , la destrucción específica y eficiente del CAR dual en comparación con los controles. CD138-CD28-y CAR muestra un menor grado de muerte en comparación con la célula T CAR dual. El control de SW1 muestra consistentemente una destrucción eficiente a pesar de activar solo una señal (ya que solo se expresa CD38 en las células CAG), sin la activación completa de dos señales. Además, el CAR completo CD38 también muestra efectividad para matar. Sin embargo, con el reconocimiento de antígeno dual, se observó la eliminación de la línea celular CAG, así como una mejor secreción de IFN-y.
Ejemplo 3. Eficacia in vivo de CAR dual
Materiales y métodos
[0158] Hemos calibrado el modelo de mieloma múltiple (MM) humano in vivo, que se basa en la línea celular CAG de MM en la cepa de ratón inmunodeficiente NOD scidgamma (NSG). Estos ratones carecen de linfocitos maduros y son deficientes en múltiples vías de señalización de citoquinas, lo que permite el injerto de una amplia gama de células y tejidos humanos. Primero determinamos el número óptimo de células MM inyectadas, la vía de administración y el efecto del preacondicionamiento de los ratones receptores para obtener una ventana conveniente para el tratamiento con células CAR T (datos no mostrados). Se determinó que la inyección IV de 106 células CAG MM seguida de irradiación en 200 RAD el día 7 permitía el desarrollo eficaz del tumor y proporcionaba el modelo de tumor deseado.
[0159] Por lo tanto, se inyectaron aproximadamente 106 células CAG MM a ratones (indicado como Día 0). En el día 7, los ratones se irradiaron con 200 RAD (que no afectaron al crecimiento del tumor) y en el día 8, se inyectaron por vía intravenosa aproximadamente 107 células T modificadas transducidas con diferentes CAR.
[0160] Se tomaron tejidos de ratones tratados con diferentes células CAR T el día 25 y se analizaron por histología con tinción anti CD138 y por FACS (datos no mostrados). Los resultados de la histológica se presentan en la Fig. 5.
[0161] Además, evaluamos la actividad anti-MM de las células T transducidas con Dual-CAR, interruptor 1, interruptor 2 o CAR individuales en comparación con los ratones no tratados seguidos de las curvas de supervivencia. Los resultados se presentan en la Fig. 6.
Resultados
[0162] Puede verse en la Fig. 5 que después de la inyección de células CAG MM, se encontraron lesiones tumorales en todos los tejidos analizados, es decir, en hígado, pulmón, bazo y hueso.
[0163] Al buscar los CAR por FACS, registra los linfocitos encontrados en la sangre de los ratones NSG tratados 26 días después de la inyección de CAG (datos no mostrados). Esto indica claramente que las células T transducidas que comprenden el c Ar dual terapéutico han durado al menos 26 días en la sangre. Como se puede ver claramente en la Fig. 6 que muestra las curvas de supervivencia de ratones tratados con células T transducidas con diferentes CAR, los ratones de todos los grupos, excepto los tratados con Dual-CAR o aCD38 CAR, murieron en promedio después de 40-45 días después de la inyección de células CAG MM por pérdida de peso debido a la condición de injerto contra huésped,
así como por el propio tumor, como se puede observar en el grupo de control no tratado. Las células T transducidas con aCD38 CAR mostraron un efecto terapéutico significativo, sin embargo, eventualmente solo el 20% de los ratones sobrevivieron después de 85 días. Los ratones tratados con células T Dual-CAR mostraron una tasa de supervivencia significativamente mejor en comparación con los tratados con células CART CD38 con una supervivencia del 60 % después de más de 95 días. Los ratones se sacrificaron el día 95 para permitir el análisis histológico y FACS y no por su carga tumoral.
[0164] Los tres ratones supervivientes tratados con doble CAR estaban libres de tumores al final del experimento, como puede verse mediante el examen histológico usando tinción H&E. El ratón SW1 que sobrevivió exhibió tumores en el hígado, pulmón y hueso (Fig. 7).
Ejemplo 4. Eficacia in vivo de doble CAR
[0165] En el experimento realizado en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 3, para facilitar el seguimiento del volumen del tumor/tumor CAG, utilizamos una línea celular CAG-LUC, que emite bioluminiscencia cuando se encuentra con luciferina que se inyecta a ratones antes de la formación de imágenes. Por eso, comparamos la intensidad del tumor en cada ratón y seguimos la eficacia del tratamiento en cada grupo. Los resultados se presentan en la Fig. 8.
[0166] Puede verse en la Fig. 8 que todos los ratones tratados con aCD38 o células T Dual-CAR y la mayoría de los ratones tratados con el interruptor 1 (correspondiente a SW1) estaban libres de tumores el día 13. Por el contrario, los ratones tratados con células CAR T switch 2 (correspondiente a SW2), CD138 y N29 desarrollaron tumor ya en el día 13. A diferencia de los ratones tratados con SW1 y aCD38 CAR, los ratones tratados con Dual CAR permanecieron libres de cáncer hasta el día 48, y el 60% de los permanecieron libres de cáncer hasta el día 62. La mayoría de los ratones de otros grupos se sacrificaron antes del día 55 en cuanto a carga tumoral y pérdida de peso. Está claro que el tratamiento con células T-CAR duales fue mucho más eficaz que cualquier otro tratamiento.
[0167] También se puede observar que el tratamiento con células CAR-T switch 2, aCD138 o N29 proporcionó resultados similares caracterizados por un rápido desarrollo del tumor. El tratamiento con el switch 1 fue, en promedio, menos eficiente que el tratamiento con aCD38, lo que indica que la separación de un dominio coestimulador y un dominio de activación afecta la eficacia de la activación de la célula T modificada y puede mejorar el efecto "fuera del objetivo".
[0168] Los ratones también fueron seguidos por su condición. Como puede verse en la Fig. 9 , los ratones que recibieron el CAR 138 mostraron irritación de la piel en cuanto a reactividad cruzada entre el antígeno CD138 de ratón y humano que se expresa en su piel. Estos efectos secundarios no estaban presentes cuando los ratones fueron tratados con células T de Dual CAR. Esto proporciona una prueba adicional de que las células T portadoras de Dual CAR no se activaron por completo en presencia de un solo antígeno, es decir, CD138 (no hay antígeno CD38 en las células de la piel), por lo que proporciona menos efectos secundarios.
[0169] Aunque la presente invención se ha descrito anteriormente en el presente documento a modo de formas de realización preferidas de la misma, puede modificarse, sin apartarse del espíritu y la naturaleza de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (15)
1. Una célula T modificada genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos (CAR) distintos y separados, en el que el primer CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y el segundo CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD38.
2. La célula T de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD138 y los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a CD38 son cada uno independientemente un fragmento variable de cadena única (indicado como anti-CD138 scFv y anti-CD38 scFv, respectivamente), preferentemente.
3. La célula T de la reivindicación 2, en la que el scFv anti-CD138 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o un análogo del mismo y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 o un análogo del mismo; y/o en el que el dominio scFv anti-CD38 comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 o un análogo de la misma y un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 o un análogo de la misma, en donde Vl y el Los dominios Vh están unidos por un conector peptídico y el análogo tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia original.
4. La célula T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que al menos uno de los CAR comprende un dominio coestimulador y el otro de los CAR comprende un dominio de activación, preferiblemente en el que (i) el dominio coestimulador se selecciona de un dominio coestimulador de CD28, 4-1BB, OX40, iCOS, CD27, CD80, CD70 y el dominio de activación se selecciona de los dominios de activación FcRy y CD3-Z y/o (ii) el conector peptídico es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 o un análogo del mismo, más preferiblemente donde el dominio de activación es un dominio de activación FcRy que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 o un análogo del mismo y el dominio coestimulador es un dominio coestimulador de CD28 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 o un análogo del mismo.
5. La célula T de la reivindicación 4, en la que (i) el primer CAR comprende un dominio de activación y carece de un dominio coestimulador y el segundo CAR comprende un dominio coestimulador y carece de un dominio de activación o (ii) el primer CAR comprende un dominio dominio coestimulador y desprovisto de un dominio de activación y el segundo CAR comprende un dominio de activación y desprovisto de un dominio coestimulador.
6. La célula T de la reivindicación 1, donde el primer CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o un análogo de la misma, y el segundo CAR tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 o un análogo de la misma, y donde el análogo tiene al menos 85% de identidad con la secuencia original.
7. La célula T de la reivindicación 1, que comprende al menos una copia de una o más construcciones de ADN que codifican al menos dos receptores de antígenos quiméricos separados (CAR) distintos, donde el primer CAR comprende un scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende un scFv anti-CD38.
8. La célula T de la reivindicación 1, que comprende (i) al menos una copia de una construcción de ADN que tiene la secuencia de ADN SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma; o (ii) que comprende al menos una copia de una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 32 o una variante de la misma y al menos una copia de una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 33 o una variante de la misma.
9. La célula T de la reivindicación 8, que comprende al menos una copia de una construcción de ADN seleccionada de:
(I) una construcción de ADN que codifica: (A) de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, y (B) de 5' a 3' (v) un péptido líder, (vi) dominio anti-CD38 scFv, (vii) un dominio transmembrana II y (viii) un dominio de activación, un dominio coestimulador o ambos; donde (A) y (B) están separados por un péptido de autoescisión;
(II) una construcción de ADN que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD138, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio de activación; y
(III) una construcción de ADN que codifica de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) scFv anti-CD38, (iii) un dominio transmembrana II, (iv) un dominio de activación, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD138 scFv, (viii) un dominio transmembrana I y (ix) un dominio coestimulador, o
dos construcciones de ADN diferentes, donde la primera construcción de ADN comprende la secuencia de ADN que codifica, de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I y (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos, y la segunda construcción de ADN comprende una secuencia de ADN que codifica de 5' a 3' (i) un péptido líder, (ii) un dominio anti-CD38 scFv, (iii) un dominio transmembrana II y (iv) un dominio de activación, un dominio coestimulador o ambos.
10. Una construcción de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia que comprende:
(A) de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio
coestimulador, un dominio de activación o ambos, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) dominio anti-CD38 scFv, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos;
(B) de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) dominio anti-CD38 scFv, (iii) un dominio transmembrana II, (iv) un dominio de activación, un dominio coestimulador o ambos, (v) un péptido de autoescisión, (vi) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, un dominio de activación o ambos; (C) de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD138 scFv, (iii) un dominio transmembrana I, (iv) un dominio coestimulador, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) un dominio scFv anti-CD38, (viii) un dominio transmembrana II y (ix) un dominio de activación; y
(D) de 5' a 3', (i) un péptido líder, (ii) anti-CD38 scFv, (iii) un dominio transmembrana II (iv) un dominio de activación, (v) un péptido autoescindible, (vi) un péptido líder, (vii) un dominio scFv anti-CD138, (viii) un dominio transmembrana I y (ix) un dominio coestimulador.
11. La célula T de acuerdo con la reivindicación 9 o la construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 10, donde la construcción de ADN se caracteriza por al menos uno de:
(i) el péptido autoescindible tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 o un análogo del mismo;
(ii) el péptido líder tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 o un análogo de la misma;
(iii) el dominio de activación tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 o un análogo de la misma; (iv) el dominio coestimulador tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 o un análogo de la misma; (v) el dominio anti-CD138 scFv tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 o un análogo de la misma; (vi) el dominio anti-CD38 scFv tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 o un análogo de la misma; (vii) el péptido autoescindible está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 27 o una variante de la misma;
(viii) el péptido líder está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 39 o una variante de la misma; (ix) el dominio de activación está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 31 o una variante de la misma; (x) el dominio coestimulador está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 o una variante de la misma; (xi) el dominio anti-CD138 scFv está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 o una variante de la misma;
(xii) el dominio scFv anti-CD38 está codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 o una variante de la misma;
(xiii) la construcción de ADN comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 32 y la secuencia de ADN SEQ ID NO: 33; y
(xiv) la construcción de ADN comprende la secuencia de ADN SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma,
donde la variante o el análogo tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia original.
12. Una célula que comprende la construcción de ADN según la reivindicación 10 u 11, preferiblemente en la que la célula es una célula T.
13. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células T según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11-12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 13, para uso en el tratamiento del cáncer, preferiblemente en la que el cáncer es mieloma múltiple.
15. Un método para la preparación de células T modificadas genéticamente para expresar al menos dos receptores de antígenos quiméricos separados distintos (CAR), en el que el primer CAR comprende scFv anti-CD138 y el segundo CAR comprende scFv anti-CD38, dicho método comprende transfectar T -células con una construcción de ADN según la reivindicación 9 o 10.
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