JPH06237772A - 免疫抑制剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合
を阻害するペプチド、該ペプチドを含有するヒトＩＬ−
６の作用抑制剤、抗炎症薬、免疫抑制剤または自己免疫
疾患治療薬、該ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子
を有するプラスミド、該プラスミドを有する形質転換
体、並びに該形質転換体を培養することによる該ペプチ
ドの製造方法。 【効果】 本発明のペプチドは、ＩＬ−６が発症あるい
は悪化の原因と考えられている疾病の治療薬として有用
である。
を阻害するペプチド、該ペプチドを含有するヒトＩＬ−
６の作用抑制剤、抗炎症薬、免疫抑制剤または自己免疫
疾患治療薬、該ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子
を有するプラスミド、該プラスミドを有する形質転換
体、並びに該形質転換体を培養することによる該ペプチ
ドの製造方法。 【効果】 本発明のペプチドは、ＩＬ−６が発症あるい
は悪化の原因と考えられている疾病の治療薬として有用
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩＬ−６（インタ
ーロイキン−６）のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害
するペプチド、該ペプチドを含有するヒトＩＬ−６の作
用抑制剤、抗炎症薬、免疫抑制剤または自己免疫疾患治
療薬、該ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を有す
るプラスミド、該プラスミドを有する形質転換体、並び
に該形質転換体を培養することによる該ペプチドの製造
方法に関する。
ーロイキン−６）のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害
するペプチド、該ペプチドを含有するヒトＩＬ−６の作
用抑制剤、抗炎症薬、免疫抑制剤または自己免疫疾患治
療薬、該ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を有す
るプラスミド、該プラスミドを有する形質転換体、並び
に該形質転換体を培養することによる該ペプチドの製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトＩＬ−６は、１９８６年にその遺伝
子が単離された物質であり（Nature、３２４巻、７３
頁、１９８６年）、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血管内皮細
胞、繊維芽細胞などの種々の細胞から産生され、Ｂ細胞
の抗体産生細胞への分化誘導、肝細胞からの急性期蛋白
質合成誘導、脳神経系細胞の分化誘導、造血系細胞の増
殖分化誘導などの多様な生理作用を有する物質であるこ
とが知られている（実験医学、７巻、１号、１９８９
年）。
子が単離された物質であり（Nature、３２４巻、７３
頁、１９８６年）、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血管内皮細
胞、繊維芽細胞などの種々の細胞から産生され、Ｂ細胞
の抗体産生細胞への分化誘導、肝細胞からの急性期蛋白
質合成誘導、脳神経系細胞の分化誘導、造血系細胞の増
殖分化誘導などの多様な生理作用を有する物質であるこ
とが知られている（実験医学、７巻、１号、１９８９
年）。
【０００３】さて、本ヒトＩＬ−６の各種疾患との関連
性が注目されており、多数報告されている。まず、自己
免疫疾患との関連については、慢性関節リウマチ患者の
関節液中のヒトＩＬ−６濃度が、変形性関節症患者のそ
れに比較して著しく高値であるという報告をはじめ（Eu
ropean Journal of Immunology、１８巻、１７９７
頁）、心房内粘液腫患者のＩＬ−６を構成的に産生して
いる原発腫瘍を切除することにより自己免疫疾患症状が
改善すること（Proceedings of National Academy of S
cience U.S.A.、８４巻、２２８頁、１９８７年）、高
γグロブリン血症を呈するキャッスルマン症候群におい
て、病巣リンパ節組織培養上清中に高濃度のヒトＩＬ−
６が検出されたこと（実験医学、７巻、５０頁、１９８
９年）などの報告があり、自己抗体の産生が疾患の原
因、あるいは増悪に関わっていると考えられているいわ
ゆる自己免疫疾患の中には、ＩＬ−６が強く関わってい
る疾患が数多くあるものと推定されている。
性が注目されており、多数報告されている。まず、自己
免疫疾患との関連については、慢性関節リウマチ患者の
関節液中のヒトＩＬ−６濃度が、変形性関節症患者のそ
れに比較して著しく高値であるという報告をはじめ（Eu
ropean Journal of Immunology、１８巻、１７９７
頁）、心房内粘液腫患者のＩＬ−６を構成的に産生して
いる原発腫瘍を切除することにより自己免疫疾患症状が
改善すること（Proceedings of National Academy of S
cience U.S.A.、８４巻、２２８頁、１９８７年）、高
γグロブリン血症を呈するキャッスルマン症候群におい
て、病巣リンパ節組織培養上清中に高濃度のヒトＩＬ−
６が検出されたこと（実験医学、７巻、５０頁、１９８
９年）などの報告があり、自己抗体の産生が疾患の原
因、あるいは増悪に関わっていると考えられているいわ
ゆる自己免疫疾患の中には、ＩＬ−６が強く関わってい
る疾患が数多くあるものと推定されている。
【０００４】また、癌の領域においては、多発性骨髄腫
患者より採取した腫瘍細胞は構成的にＩＬ−６を産生し
ており、ＩＬ−６を添加することにより更に増殖が生ず
ることから、ＩＬ−６が多発性骨髄腫のオートクライン
増殖因子であるとの報告を始めとして（Nature、３３２
巻、８３頁、１９８８年）、他の血液癌であるリンネル
トＴリンパ腫、Ｂ型慢性リンパ球性白血病等において
も、ＩＬ−６がその増殖因子として疑われている。ま
た、マウスモデルにおいて種々の癌細胞株の肝臓への転
移が癌細胞株のＩＬ−６産生能と相関すること（Japane
se Journal of Cancer Research、８２巻、１２９９
頁、１９９１年）、更に担癌マウスにおいて血中ＩＬ−
６が高値を示し（Journal of Immunology、１４３巻、
１６２頁、１９８９年）、マウスＩＬ−６遺伝子を導入
したＣＨＯ細胞（Chinese hamster ovary cells）を接
種したヌードマウスにおいて体重減少が生ずることなど
より（Endocrinology、１２８巻、２６５７頁、１９９
１年）、ＩＬ−６と癌悪液質との関連も強く示唆されて
いる。
患者より採取した腫瘍細胞は構成的にＩＬ−６を産生し
ており、ＩＬ−６を添加することにより更に増殖が生ず
ることから、ＩＬ−６が多発性骨髄腫のオートクライン
増殖因子であるとの報告を始めとして（Nature、３３２
巻、８３頁、１９８８年）、他の血液癌であるリンネル
トＴリンパ腫、Ｂ型慢性リンパ球性白血病等において
も、ＩＬ−６がその増殖因子として疑われている。ま
た、マウスモデルにおいて種々の癌細胞株の肝臓への転
移が癌細胞株のＩＬ−６産生能と相関すること（Japane
se Journal of Cancer Research、８２巻、１２９９
頁、１９９１年）、更に担癌マウスにおいて血中ＩＬ−
６が高値を示し（Journal of Immunology、１４３巻、
１６２頁、１９８９年）、マウスＩＬ−６遺伝子を導入
したＣＨＯ細胞（Chinese hamster ovary cells）を接
種したヌードマウスにおいて体重減少が生ずることなど
より（Endocrinology、１２８巻、２６５７頁、１９９
１年）、ＩＬ−６と癌悪液質との関連も強く示唆されて
いる。
【０００５】感染症の領域では、敗血症患者において血
中ＩＬ−６濃度が非常に高く、血中ＩＬ−６の高い患者
ほど生存率が悪くなること（Journal of Experimental
Medicine、１６９巻、３３３頁、１９８９年；Blood、
７４巻、１７０４頁、１９８９年）や、羊水感染を起こ
した胎児の単核球がＩＬ−６を高産生していること（Cl
inical Immunological Immunopathology、５５巻、３０
５頁、１９９０年）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
感染患者の髄液中にＩＬ−６が高値であること（Journa
l of Neuroimmunology、２３巻、１０９頁、１９８９
年）、ＡＩＤＳ患者によくみられるカポジ肉腫由来細胞
がＩＬ−６を構成的に産生し、またＩＬ−６依存的に増
殖すること（Proceedings of National Academy of Sci
ence U.S.A.、８７巻、４０６８年、１９９０年）な
ど、ＩＬ−６と細菌感染やウイルス感染の関連も多数報
告されている。
中ＩＬ−６濃度が非常に高く、血中ＩＬ−６の高い患者
ほど生存率が悪くなること（Journal of Experimental
Medicine、１６９巻、３３３頁、１９８９年；Blood、
７４巻、１７０４頁、１９８９年）や、羊水感染を起こ
した胎児の単核球がＩＬ−６を高産生していること（Cl
inical Immunological Immunopathology、５５巻、３０
５頁、１９９０年）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
感染患者の髄液中にＩＬ−６が高値であること（Journa
l of Neuroimmunology、２３巻、１０９頁、１９８９
年）、ＡＩＤＳ患者によくみられるカポジ肉腫由来細胞
がＩＬ−６を構成的に産生し、またＩＬ−６依存的に増
殖すること（Proceedings of National Academy of Sci
ence U.S.A.、８７巻、４０６８年、１９９０年）な
ど、ＩＬ−６と細菌感染やウイルス感染の関連も多数報
告されている。
【０００６】更に炎症性疾患としては、メサンギウム増
殖性腎炎の患者由来のメサンギウム細胞がＩＬ−６を産
生していること（Journal of Immunology、１４３巻、
３９４９頁、１９８９年）、Ｂ細胞特異的に恒常的にＩ
Ｌ−６を発現させるようなＩＬ−６トランスジェニック
マウスにおいてメサンギウム細胞の増殖が見られること
より（Proceedings of National Academy of Science
U.S.A.、８６巻、７５４７頁、１９８９年）、メサンギ
ウム増殖性腎炎において、ＩＬ−６がオートクラインに
働いている可能性が示唆されている。また、ケラチノサ
イトの増殖性疾患である尋常性乾癬患者においても血中
ＩＬ−６の高値、皮膚組織でのＩＬ−６の産生が報告さ
れている（Proceedings of National Academy of Scien
ce U.S.A.、８６巻、６３６７頁、１９８９年）。この
他にも、発熱、悪寒、倦怠感等の炎症諸症状への関与も
言われている。（American Journal of Physiology、２
５８巻、７９８頁、１９９０年）
殖性腎炎の患者由来のメサンギウム細胞がＩＬ−６を産
生していること（Journal of Immunology、１４３巻、
３９４９頁、１９８９年）、Ｂ細胞特異的に恒常的にＩ
Ｌ−６を発現させるようなＩＬ−６トランスジェニック
マウスにおいてメサンギウム細胞の増殖が見られること
より（Proceedings of National Academy of Science
U.S.A.、８６巻、７５４７頁、１９８９年）、メサンギ
ウム増殖性腎炎において、ＩＬ−６がオートクラインに
働いている可能性が示唆されている。また、ケラチノサ
イトの増殖性疾患である尋常性乾癬患者においても血中
ＩＬ−６の高値、皮膚組織でのＩＬ−６の産生が報告さ
れている（Proceedings of National Academy of Scien
ce U.S.A.、８６巻、６３６７頁、１９８９年）。この
他にも、発熱、悪寒、倦怠感等の炎症諸症状への関与も
言われている。（American Journal of Physiology、２
５８巻、７９８頁、１９９０年）
【０００７】上記以外にも、アルツハイマー病、アミロ
イドーシス、Ｉ型糖尿病、高脂血症、骨粗髭症、真性多
血症、多血小板血症、心筋梗塞など種々の疾患において
もＩＬ−６の関与が疑われている。
イドーシス、Ｉ型糖尿病、高脂血症、骨粗髭症、真性多
血症、多血小板血症、心筋梗塞など種々の疾患において
もＩＬ−６の関与が疑われている。
【０００８】このようにヒトＩＬ−６は種々の疾患、特
に炎症性、リンパ増殖性の疾患の原因、あるいは増悪に
関係している可能性が高く、ヒトＩＬ−６の作用を抑制
する事ができれば、それらの疾患の治療が可能となるも
のと考えられる。実際、上記の疾患のうちいくつかにつ
いては、マウスモデル実験においてＩＬ−６の作用を抑
制することにより疾患の改善をみている。例えば、多発
性骨髄腫を接種したマウスへ、マウスＩＬ−６の作用を
抑制する活性を有する抗マウスＩＬ−６抗体、あるいは
抗マウスＩＬ−６受容体抗体を投与する事により、骨髄
腫細胞の増殖を抑制するとともに生存率を上昇させるこ
とができること（Journal of Experimental Medicine、
１７２巻、９９７頁、１９９０年）、癌細胞株の肝臓へ
の転移を抗マウスＩＬ−６抗体の投与で抑制できること
（Japanese Journal of Cancer Research、８２巻、１
２９９頁、１９９１年）、致死量の大腸菌を感染させた
マウスに、マウスＩＬ−６の作用を抑制する活性を有す
る抗マウスＩＬ−６抗体を事前投与しておくと生存する
こと（Journal of Immunology、１４５巻、４１８５
頁、１９９０年）、癌を接種すると悪液質を起こすマウ
スモデルにマウスＩＬ−６の作用を抑制する活性を有す
る抗マウスＩＬ−６抗体を投与すると、体重減少を始め
とする悪液質症状の改善がみられること（Journal od C
linical Investigation、８９巻、１６８１頁、１９９
２年）などの報告がある。これらのことは、上述の疾患
においてＩＬ−６が関与していることを直接示すととも
に、ＩＬ−６の作用を抑制できれば、治療が可能となる
ことを併せて示すものである。
に炎症性、リンパ増殖性の疾患の原因、あるいは増悪に
関係している可能性が高く、ヒトＩＬ−６の作用を抑制
する事ができれば、それらの疾患の治療が可能となるも
のと考えられる。実際、上記の疾患のうちいくつかにつ
いては、マウスモデル実験においてＩＬ−６の作用を抑
制することにより疾患の改善をみている。例えば、多発
性骨髄腫を接種したマウスへ、マウスＩＬ−６の作用を
抑制する活性を有する抗マウスＩＬ−６抗体、あるいは
抗マウスＩＬ−６受容体抗体を投与する事により、骨髄
腫細胞の増殖を抑制するとともに生存率を上昇させるこ
とができること（Journal of Experimental Medicine、
１７２巻、９９７頁、１９９０年）、癌細胞株の肝臓へ
の転移を抗マウスＩＬ−６抗体の投与で抑制できること
（Japanese Journal of Cancer Research、８２巻、１
２９９頁、１９９１年）、致死量の大腸菌を感染させた
マウスに、マウスＩＬ−６の作用を抑制する活性を有す
る抗マウスＩＬ−６抗体を事前投与しておくと生存する
こと（Journal of Immunology、１４５巻、４１８５
頁、１９９０年）、癌を接種すると悪液質を起こすマウ
スモデルにマウスＩＬ−６の作用を抑制する活性を有す
る抗マウスＩＬ−６抗体を投与すると、体重減少を始め
とする悪液質症状の改善がみられること（Journal od C
linical Investigation、８９巻、１６８１頁、１９９
２年）などの報告がある。これらのことは、上述の疾患
においてＩＬ−６が関与していることを直接示すととも
に、ＩＬ−６の作用を抑制できれば、治療が可能となる
ことを併せて示すものである。
【０００９】ヒトＩＬ−６作用を抑制する方法として
は、ＩＬ−６の産生細胞よりのＩＬ−６産生阻害、産生
されたＩＬ−６のＩＬ−６応答細胞上の受容体への結合
阻害、ＩＬ−６応答細胞におけるＩＬ−６シグナル阻害
など種々の方法が考えられるが、ＩＬ−６のＩＬ−６応
答細胞上の受容体への結合を阻害する方法がＩＬ−６作
用のみを選択的に抑制でき、臨床応用を念頭においた場
合最も副作用が少ない方法と考えられる。
は、ＩＬ−６の産生細胞よりのＩＬ−６産生阻害、産生
されたＩＬ−６のＩＬ−６応答細胞上の受容体への結合
阻害、ＩＬ−６応答細胞におけるＩＬ−６シグナル阻害
など種々の方法が考えられるが、ＩＬ−６のＩＬ−６応
答細胞上の受容体への結合を阻害する方法がＩＬ−６作
用のみを選択的に抑制でき、臨床応用を念頭においた場
合最も副作用が少ない方法と考えられる。
【００１０】しかしながら、現在までヒトＩＬ−６のヒ
トＩＬ−６受容体への結合を特異的に阻害する薬剤はマ
ウスモノクローナル抗ＩＬ−６抗体、マウス抗ＩＬ−６
受容体抗体以外には全く知られていない。しかし、唯一
知られているこれらの抗体はマウスのハイブリドーマよ
り調製した異種蛋白質であり、マウス蛋白をその構成成
分とする。従って、ヒトに投与した場合、マウス蛋白に
対する免疫反応が生じて、アナフィラキシーショックや
血清病などの重篤な副作用が起こったり、マウス蛋白に
対する中和抗体の生成により、効果が減弱してしまう。
このようにマウス由来抗体を患者への適用を目的として
臨床に応用することは困難である。従って、現在、臨床
に供することが可能なヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容
体への結合を特異的に阻害する物質は知られておらず、
上記の多くの疾患の治療薬として臨床応用可能なヒトＩ
Ｌ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害する薬剤の
開発が待たれていた。
トＩＬ−６受容体への結合を特異的に阻害する薬剤はマ
ウスモノクローナル抗ＩＬ−６抗体、マウス抗ＩＬ−６
受容体抗体以外には全く知られていない。しかし、唯一
知られているこれらの抗体はマウスのハイブリドーマよ
り調製した異種蛋白質であり、マウス蛋白をその構成成
分とする。従って、ヒトに投与した場合、マウス蛋白に
対する免疫反応が生じて、アナフィラキシーショックや
血清病などの重篤な副作用が起こったり、マウス蛋白に
対する中和抗体の生成により、効果が減弱してしまう。
このようにマウス由来抗体を患者への適用を目的として
臨床に応用することは困難である。従って、現在、臨床
に供することが可能なヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容
体への結合を特異的に阻害する物質は知られておらず、
上記の多くの疾患の治療薬として臨床応用可能なヒトＩ
Ｌ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害する薬剤の
開発が待たれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
ＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害するペプ
チド、該ペプチドを含有するヒトＩＬ−６の作用抑制
剤、抗炎症薬、免疫抑制剤または自己免疫疾患治療薬、
該ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を有するプラ
スミド、該プラスミドを有する形質転換体、並びに該形
質転換体を培養することによる該ペプチドの製造方法を
提供することである。本ペプチドは、慢性関節リウマ
チ、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患治療薬、細菌感
染治療薬、細菌感染に伴う敗血性ショック治療薬、ウイ
ルス感染治療薬、多発性骨髄腫等の癌の治療薬、癌の転
移抑制薬、癌悪液質改善薬、メサンギウム増殖性腎炎等
の炎症性疾患治療薬として使用され得る。
ＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害するペプ
チド、該ペプチドを含有するヒトＩＬ−６の作用抑制
剤、抗炎症薬、免疫抑制剤または自己免疫疾患治療薬、
該ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を有するプラ
スミド、該プラスミドを有する形質転換体、並びに該形
質転換体を培養することによる該ペプチドの製造方法を
提供することである。本ペプチドは、慢性関節リウマ
チ、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患治療薬、細菌感
染治療薬、細菌感染に伴う敗血性ショック治療薬、ウイ
ルス感染治療薬、多発性骨髄腫等の癌の治療薬、癌の転
移抑制薬、癌悪液質改善薬、メサンギウム増殖性腎炎等
の炎症性疾患治療薬として使用され得る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下の方法によ
り、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害
し、ＩＬ−６の作用を抑制するペプチドを見いだし、本
発明を完成するに至った。
解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下の方法によ
り、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害
し、ＩＬ−６の作用を抑制するペプチドを見いだし、本
発明を完成するに至った。
【００１３】すなわち本発明は、ヒトＩＬ−６のヒトＩ
Ｌ−６受容体への結合を阻害するペプチド、該ペプチド
を含有するヒトＩＬ−６の作用抑制剤、抗炎症薬、免疫
抑制剤または自己免疫疾患治療薬、該ペプチドをコード
する遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、該プラスミ
ドを有する形質転換体、並びに該形質転換体を培養する
ことによる該ペプチドの製造方法を提供するものであ
る。
Ｌ−６受容体への結合を阻害するペプチド、該ペプチド
を含有するヒトＩＬ−６の作用抑制剤、抗炎症薬、免疫
抑制剤または自己免疫疾患治療薬、該ペプチドをコード
する遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、該プラスミ
ドを有する形質転換体、並びに該形質転換体を培養する
ことによる該ペプチドの製造方法を提供するものであ
る。
【００１４】本発明のペプチドは、ヒトＩＬ−６のヒト
ＩＬ−６受容体への結合を特異的に阻害し、ヒトＩＬ−
６の作用を抑制するものであり、慢性関節リウマチ、全
身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患治療薬、細菌感染治療
薬、細菌感染に伴う敗血性ショック治療薬、ウイルス感
染治療薬、多発性骨髄腫等の癌の治療薬、癌の転移抑制
薬、癌悪液質改善薬、メサンギウム増殖性腎炎等の炎症
性疾患治療薬として使用され得る。これらの用途範囲は
本発明でいうヒトＩＬ−６の作用抑制剤、抗炎症薬、免
疫抑制剤または自己免疫疾患治療薬に含まれるものであ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
ＩＬ−６受容体への結合を特異的に阻害し、ヒトＩＬ−
６の作用を抑制するものであり、慢性関節リウマチ、全
身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患治療薬、細菌感染治療
薬、細菌感染に伴う敗血性ショック治療薬、ウイルス感
染治療薬、多発性骨髄腫等の癌の治療薬、癌の転移抑制
薬、癌悪液質改善薬、メサンギウム増殖性腎炎等の炎症
性疾患治療薬として使用され得る。これらの用途範囲は
本発明でいうヒトＩＬ−６の作用抑制剤、抗炎症薬、免
疫抑制剤または自己免疫疾患治療薬に含まれるものであ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】ＩＬ−６あるいはＩＬ−６受容体に結合し
てＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害するモノク
ローナル抗体は、非常に特異性の高い結合阻害剤として
有用であるが、一般にヒトの分子に対するモノクローナ
ル抗体はマウス等の異種動物を免疫して得られる異種蛋
白である。従って、モノクローナル抗体をヒトの生体内
に投与した場合、投与した抗体分子に対する抗体が生じ
たり、食細胞、補体系等を介する免疫反応が惹起される
ためにアレルギー、血清病と総称されるショック症状が
派生する可能性が高い。
てＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害するモノク
ローナル抗体は、非常に特異性の高い結合阻害剤として
有用であるが、一般にヒトの分子に対するモノクローナ
ル抗体はマウス等の異種動物を免疫して得られる異種蛋
白である。従って、モノクローナル抗体をヒトの生体内
に投与した場合、投与した抗体分子に対する抗体が生じ
たり、食細胞、補体系等を介する免疫反応が惹起される
ためにアレルギー、血清病と総称されるショック症状が
派生する可能性が高い。
【００１６】抗体分子は、抗原との結合に直接関与する
可変領域（以下Ｖ領域と略する）と、直接抗原との結合
には関与せず、食細胞へ結合して活性化を促したり、補
体系を活性化したり、種々の免疫反応を惹起する役割を
有する定常領域（以下Ｃ領域と略する）から構成される
ことが知られている。これらの領域のうち、Ｃ領域は抗
体分子のほぼ２／３を占めており、一般に異種の動物に
投与した場合、抗体が産生されやすいと言われている。
可変領域（以下Ｖ領域と略する）と、直接抗原との結合
には関与せず、食細胞へ結合して活性化を促したり、補
体系を活性化したり、種々の免疫反応を惹起する役割を
有する定常領域（以下Ｃ領域と略する）から構成される
ことが知られている。これらの領域のうち、Ｃ領域は抗
体分子のほぼ２／３を占めており、一般に異種の動物に
投与した場合、抗体が産生されやすいと言われている。
【００１７】一方、抗ＩＬ−６抗体あるいは抗ＩＬ−６
受容体抗体によりＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を
阻害する場合、抗体分子構造のうちで、抗原との結合に
関与するＶ領域は必要であるが、抗体のＣ領域は必ずし
も必要ではない。上述のように生体内投与した場合に抗
体に対する抗体が産生されたり、血中を流れる抗原と免
疫複合体を形成して、腎臓などにトラップされて炎症が
生じたり、マクロファージなどの食細胞に結合し取り込
まれて、炎症性のサイトカイン、ケミカルメディエータ
ーや酵素などを放出して炎症を増悪させたりする可能性
があり、むしろＣ領域はない方が好ましいのである。
受容体抗体によりＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を
阻害する場合、抗体分子構造のうちで、抗原との結合に
関与するＶ領域は必要であるが、抗体のＣ領域は必ずし
も必要ではない。上述のように生体内投与した場合に抗
体に対する抗体が産生されたり、血中を流れる抗原と免
疫複合体を形成して、腎臓などにトラップされて炎症が
生じたり、マクロファージなどの食細胞に結合し取り込
まれて、炎症性のサイトカイン、ケミカルメディエータ
ーや酵素などを放出して炎症を増悪させたりする可能性
があり、むしろＣ領域はない方が好ましいのである。
【００１８】さて、抗体分子は、Ｈ鎖（重鎖）及びＬ鎖
（軽鎖）がそれぞれＣ領域においてＳＳを介して結合し
たものが、更にＨ鎖同士がＣ領域においてＳＳを介して
結合しているヘテロダイマー構造をとっているため、抗
体のＶ領域のみからなる分子を製造するには、抗体分子
のＨ鎖、及びＬ鎖のＶ領域をそれぞれ蛋白分解酵素によ
り限定分解することにより得、さらに何らかの方法によ
りそれらを結合させて機能的な抗体のみからなるＶ領域
分子を作成する方法と、遺伝子組換え技術によりＨ鎖及
びＬ鎖のＶ領域遺伝子を同時に形質転換体に発現させて
調製する方法が考えられるが、現在の技術では両者とも
効率よくしかも簡便に機能的な抗体Ｖ領域のみからなる
分子を製造することは不可能である。
（軽鎖）がそれぞれＣ領域においてＳＳを介して結合し
たものが、更にＨ鎖同士がＣ領域においてＳＳを介して
結合しているヘテロダイマー構造をとっているため、抗
体のＶ領域のみからなる分子を製造するには、抗体分子
のＨ鎖、及びＬ鎖のＶ領域をそれぞれ蛋白分解酵素によ
り限定分解することにより得、さらに何らかの方法によ
りそれらを結合させて機能的な抗体のみからなるＶ領域
分子を作成する方法と、遺伝子組換え技術によりＨ鎖及
びＬ鎖のＶ領域遺伝子を同時に形質転換体に発現させて
調製する方法が考えられるが、現在の技術では両者とも
効率よくしかも簡便に機能的な抗体Ｖ領域のみからなる
分子を製造することは不可能である。
【００１９】そこで本発明者らは、以下の方法に適合す
るモノクロ−ナル抗体を鋭意スクリ−ニングし、その幾
つかより遺伝子組換え法を用いて、モノクローナル抗ヒ
トＩＬ−６抗体のＨ鎖とＬ鎖のＶ領域をペプチドリンカ
ーにより繋いだ一本鎖ペプチドを考案して、効率よく、
ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を特異的に
阻害し、ＩＬ−６の作用を抑制する活性を有し、明確な
薬効を示すペプチドを製造する方法を発明した。
るモノクロ−ナル抗体を鋭意スクリ−ニングし、その幾
つかより遺伝子組換え法を用いて、モノクローナル抗ヒ
トＩＬ−６抗体のＨ鎖とＬ鎖のＶ領域をペプチドリンカ
ーにより繋いだ一本鎖ペプチドを考案して、効率よく、
ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を特異的に
阻害し、ＩＬ−６の作用を抑制する活性を有し、明確な
薬効を示すペプチドを製造する方法を発明した。
【００２０】すなわち、まずヒトＩＬ−６に特異的に結
合し、かつヒトＩＬ−６とヒトＩＬ−６受容体との結合
を阻害してＩＬ−６の作用を抑制する活性を有するマウ
スモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクロー
ンを各種作製した。以下にマウスモノクローナル抗ヒト
ＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製
法を記す。
合し、かつヒトＩＬ−６とヒトＩＬ−６受容体との結合
を阻害してＩＬ−６の作用を抑制する活性を有するマウ
スモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクロー
ンを各種作製した。以下にマウスモノクローナル抗ヒト
ＩＬ−６抗体を産生するハイブリドーマクローンの調製
法を記す。
【００２１】ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細
胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞とし
ては、精製した天然のヒトＩＬ−６、あるいは大腸菌な
どの原核細胞や酵母、動物細胞などの真核細胞などを用
いて生産したリコンビナントヒトＩＬ−６で免疫された
マウスやラットなどの動物からの脾臓またはリンパ節細
胞を用いればよい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来す
る動物の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよい
が、通常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られ
る。本発明実施のための一つの好ましいハイブリドーマ
は、大腸菌で生産したリコンビナントヒトＩＬ−６で免
疫したマウスの脾臓細胞またはリンパ節細胞と、マウス
骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。例えば、リ
コンビナントヒトＩＬ−６をフロインドの完全アジュバ
ントとともに免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞とBalb/c
マウスの骨髄腫細胞X63-Ag8-6.5.3の間のハイブリドー
マで後記の実施例でも示す様に優れた結果が得られた。
骨髄腫細胞としては、X63-Ag8-6.5.3のほかに、SP2/0-A
g14、P3-X63-Ag8-U1、P3-X63-Ag8、P3-NSI/1-Ag4-1、MP
C11-4.5.6.TG.1.7（以上マウス細胞）、210.RCY.Ag1.2.
3（ラット細胞）、SK0-007、GH15006TG-A12（以上ヒト
細胞）等の８アザグアニン耐性の細胞株を用いてもよ
い。
胞を融合することにより製造される。抗体産生細胞とし
ては、精製した天然のヒトＩＬ−６、あるいは大腸菌な
どの原核細胞や酵母、動物細胞などの真核細胞などを用
いて生産したリコンビナントヒトＩＬ−６で免疫された
マウスやラットなどの動物からの脾臓またはリンパ節細
胞を用いればよい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来す
る動物の種は、両細胞が融合可能な限り異なってもよい
が、通常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られ
る。本発明実施のための一つの好ましいハイブリドーマ
は、大腸菌で生産したリコンビナントヒトＩＬ−６で免
疫したマウスの脾臓細胞またはリンパ節細胞と、マウス
骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。例えば、リ
コンビナントヒトＩＬ−６をフロインドの完全アジュバ
ントとともに免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞とBalb/c
マウスの骨髄腫細胞X63-Ag8-6.5.3の間のハイブリドー
マで後記の実施例でも示す様に優れた結果が得られた。
骨髄腫細胞としては、X63-Ag8-6.5.3のほかに、SP2/0-A
g14、P3-X63-Ag8-U1、P3-X63-Ag8、P3-NSI/1-Ag4-1、MP
C11-4.5.6.TG.1.7（以上マウス細胞）、210.RCY.Ag1.2.
3（ラット細胞）、SK0-007、GH15006TG-A12（以上ヒト
細胞）等の８アザグアニン耐性の細胞株を用いてもよ
い。
【００２２】ハイブリドーマの作成と、更にその中から
ＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合
を阻害することによりＩＬ−６の作用を抑制できるモノ
クローナル抗体を産生しているクローンの選択は、例え
ば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、ある
いはセンダイウイルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄
腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみ
が、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む
培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる。得られ
たハイブリドーマがすべて抗体を産生しているわけでは
ないし、抗体を産生しているハイブリドーマがすべて目
的とする抗体を産生しているわけではないので、それら
のハイブリドーマクローンの中からＩＬ−６に結合し、
ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害することによ
りＩＬ−６の作用を抑制できるモノクローナル抗体を産
生しているハイブリドーマクローンを選択しなければな
らない。その選択は例えば以下の様な方法を用いて行う
ことができる。すなわち、一次スクリーニングとしてヒ
トＩＬ−６をコートしたプレートを作成し、ハイブリド
ーマ培養上清を反応させ、125Ｉ標識抗マウスＩｇＧの
結合量の高いものを選択する。二次スクリーニングとし
て、ハイブリドーマ培養上清による125Ｉ標識ＩＬ−６
のＩＬ−６受容体発現細胞への結合阻害活性、及びＩＬ
−６依存性に増殖する細胞株の増殖阻害活性を測定し、
阻害活性の高いものを選択すれば良い。
ＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合
を阻害することによりＩＬ−６の作用を抑制できるモノ
クローナル抗体を産生しているクローンの選択は、例え
ば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、ある
いはセンダイウイルスなどを用いて抗体産生細胞と骨髄
腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみ
が、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む
培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる。得られ
たハイブリドーマがすべて抗体を産生しているわけでは
ないし、抗体を産生しているハイブリドーマがすべて目
的とする抗体を産生しているわけではないので、それら
のハイブリドーマクローンの中からＩＬ−６に結合し、
ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害することによ
りＩＬ−６の作用を抑制できるモノクローナル抗体を産
生しているハイブリドーマクローンを選択しなければな
らない。その選択は例えば以下の様な方法を用いて行う
ことができる。すなわち、一次スクリーニングとしてヒ
トＩＬ−６をコートしたプレートを作成し、ハイブリド
ーマ培養上清を反応させ、125Ｉ標識抗マウスＩｇＧの
結合量の高いものを選択する。二次スクリーニングとし
て、ハイブリドーマ培養上清による125Ｉ標識ＩＬ−６
のＩＬ−６受容体発現細胞への結合阻害活性、及びＩＬ
−６依存性に増殖する細胞株の増殖阻害活性を測定し、
阻害活性の高いものを選択すれば良い。
【００２３】こうして得られたハイブリドーマクローン
よりtotalＲＮＡを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領
域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明
者らはより迅速に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を
鋭意工夫し、以下の様な方法により抗体のＶ領域をコー
ドするｃＤＮＡを取得した。すなわち、まず既に遺伝子
の塩基配列が報告されているマウスＩｇＧのＨ鎖及びＬ
鎖の塩基配列を基に、それぞれのＶ領域の遺伝子の５’
端、及び３’端に共通性の高い２０〜３０個の塩基配列
（プライマーＤＮＡ）を考案する。その際、５’側プラ
イマーは５’側から３’側の方向にデザインし、Ｌ鎖Ｖ
領域プライマーに、翻訳開始コドンであるＡＴＧ配列を
その５’側に付加する。３’側プライマーはＡＴＧ配列
を付加しなかった鎖、即ちＨ鎖のプライマーに翻訳終止
コドンをその３’側に付加する。３’側プライマーの場
合には、その相補的配列を３’側から５’側へ向かって
デザインし直せばよい。もちろん、Ｈ鎖Ｖ領域プライマ
ーの５’側にＡＴＧ配列を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域にプライ
マーに３’側に終止コドンを付加しても良い。終止コド
ンとしてはTAA、TAG、TGAのいずれを用いても良い。
尚、本発明の実施例に於いては、終止コドンとしてTGA
を用いた。
よりtotalＲＮＡを抽出し、モノクローナル抗体のＶ領
域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を取得する。本発明
者らはより迅速に目的とするｃＤＮＡを取得する方法を
鋭意工夫し、以下の様な方法により抗体のＶ領域をコー
ドするｃＤＮＡを取得した。すなわち、まず既に遺伝子
の塩基配列が報告されているマウスＩｇＧのＨ鎖及びＬ
鎖の塩基配列を基に、それぞれのＶ領域の遺伝子の５’
端、及び３’端に共通性の高い２０〜３０個の塩基配列
（プライマーＤＮＡ）を考案する。その際、５’側プラ
イマーは５’側から３’側の方向にデザインし、Ｌ鎖Ｖ
領域プライマーに、翻訳開始コドンであるＡＴＧ配列を
その５’側に付加する。３’側プライマーはＡＴＧ配列
を付加しなかった鎖、即ちＨ鎖のプライマーに翻訳終止
コドンをその３’側に付加する。３’側プライマーの場
合には、その相補的配列を３’側から５’側へ向かって
デザインし直せばよい。もちろん、Ｈ鎖Ｖ領域プライマ
ーの５’側にＡＴＧ配列を付加し、Ｌ鎖Ｖ領域にプライ
マーに３’側に終止コドンを付加しても良い。終止コド
ンとしてはTAA、TAG、TGAのいずれを用いても良い。
尚、本発明の実施例に於いては、終止コドンとしてTGA
を用いた。
【００２４】次にＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれのプライマー
ＤＮＡの５’側（３’側プライマーはデザインし直した
ものの５’側）に、発現ベクターに挿入するための適当
な制限酵素サイトを導入しておく。デザインしたプライ
マーＤＮＡはＤＮＡ合成機などを用いて化学合成する。
ＤＮＡの５’側（３’側プライマーはデザインし直した
ものの５’側）に、発現ベクターに挿入するための適当
な制限酵素サイトを導入しておく。デザインしたプライ
マーＤＮＡはＤＮＡ合成機などを用いて化学合成する。
【００２５】更に、得られたハイブリドーマより公知の
方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’
側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、
５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを
用い、Taqポリメラーゼによる Polymerase Chain React
ion法（ＰＣＲ法、Science、２３０巻、１３５０頁、１
９８５年）にて抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコードす
るＤＮＡ断片のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
方法に従ってtotalＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と３’
側プライマーＤＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製し、
５’側プライマーＤＮＡ及び３’側プライマーＤＮＡを
用い、Taqポリメラーゼによる Polymerase Chain React
ion法（ＰＣＲ法、Science、２３０巻、１３５０頁、１
９８５年）にて抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコードす
るＤＮＡ断片のみをそれぞれ選択的に増幅し取得する。
【００２６】さて、取得したこれらのＶ領域をコードす
る遺伝子を大腸菌等で発現させ、機能的な抗体Ｖ領域分
子を調製する場合、既に述べたようにそれぞれの遺伝子
を単独、あるいは１つのベクターに同時に組み込んで発
現させ、その後それらをアッセンブリさせてもよいが、
その効率は極めて悪いことが知られている（Science、
２４０巻、１０３８頁、１９８８年）。最近になって、
それぞれのＶ領域をリンカーを用いて連結させ、一本鎖
の分子として大腸菌で発現させる技術が開発された（Sc
ience、２４２巻、４２３頁、１９８８年）。そこで、
本発明者らはその技術を応用、更に工夫、改良を加える
ことにより抗ヒトＩＬ−６抗体のＶ領域のみからなる一
本鎖ペプチドを発現させ、かつ、ヒトＩＬ−６のヒトＩ
Ｌ−６受容体への結合を阻害する機能を損なわずに、維
持向上させることに成功した。
る遺伝子を大腸菌等で発現させ、機能的な抗体Ｖ領域分
子を調製する場合、既に述べたようにそれぞれの遺伝子
を単独、あるいは１つのベクターに同時に組み込んで発
現させ、その後それらをアッセンブリさせてもよいが、
その効率は極めて悪いことが知られている（Science、
２４０巻、１０３８頁、１９８８年）。最近になって、
それぞれのＶ領域をリンカーを用いて連結させ、一本鎖
の分子として大腸菌で発現させる技術が開発された（Sc
ience、２４２巻、４２３頁、１９８８年）。そこで、
本発明者らはその技術を応用、更に工夫、改良を加える
ことにより抗ヒトＩＬ−６抗体のＶ領域のみからなる一
本鎖ペプチドを発現させ、かつ、ヒトＩＬ−６のヒトＩ
Ｌ−６受容体への結合を阻害する機能を損なわずに、維
持向上させることに成功した。
【００２７】すなわち、まず、上流からプロモーター領
域、リボゾーム結合領域、ＡＴＧ配列を付加した５’側
プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖３’側プラ
イマーに導入した制限酵素サイト、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗
体Ｈ鎖Ｖ領域とを繋ぐための適当な長さのリンカーペプ
チドをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＧ配列を付加してい
ない５’側プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖
３’側プライマーに導入した制限酵素サイト、最後にタ
ーミネーター領域の順に含有する発現ベクターを構築す
る。この際、ＰＣＲにより増幅したそれぞれのＶ領域Ｄ
ＮＡを挿入する場合、リンカーペプチド、及びその後の
Ｖ領域ＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。
域、リボゾーム結合領域、ＡＴＧ配列を付加した５’側
プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖３’側プラ
イマーに導入した制限酵素サイト、抗体Ｌ鎖Ｖ領域と抗
体Ｈ鎖Ｖ領域とを繋ぐための適当な長さのリンカーペプ
チドをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＧ配列を付加してい
ない５’側プライマーに導入した制限酵素サイト、同鎖
３’側プライマーに導入した制限酵素サイト、最後にタ
ーミネーター領域の順に含有する発現ベクターを構築す
る。この際、ＰＣＲにより増幅したそれぞれのＶ領域Ｄ
ＮＡを挿入する場合、リンカーペプチド、及びその後の
Ｖ領域ＤＮＡの翻訳がずれないように注意する。
【００２８】さて、本発明においてプロモーターの由来
は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモータ
ー、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモー
ターや、さらにはλファージのλＰLプロモーター、λ
ＰRプロモーターなどを用いることができる。リボゾー
ム結合領域は、例えば大腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺの
リボゾーム結合領域や、λファージのＣII蛋白のリボゾ
ーム結合領域を用いることができる。あるいは化学合成
したＤＮＡ配列を用いることができる。また、目的とす
るペプチドを大腸菌体内に顆粒状として大量に蓄積させ
るために、リボゾーム結合領域を２つ以上としてもよ
い。
は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモータ
ー、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモー
ターや、さらにはλファージのλＰLプロモーター、λ
ＰRプロモーターなどを用いることができる。リボゾー
ム結合領域は、例えば大腸菌のtrpＬやtrpＥ、lacＺの
リボゾーム結合領域や、λファージのＣII蛋白のリボゾ
ーム結合領域を用いることができる。あるいは化学合成
したＤＮＡ配列を用いることができる。また、目的とす
るペプチドを大腸菌体内に顆粒状として大量に蓄積させ
るために、リボゾーム結合領域を２つ以上としてもよ
い。
【００２９】それぞれの抗体Ｖ領域を繋ぐためのリンカ
ーペプチドの配列は、調製した抗体Ｖ領域分子が機能的
である限りいかなる配列でもよいが、生体内投与時の副
作用を最小限とするためになるべく短く、独自の構造を
有しないような配列とした方が望ましい。また、ペプチ
ドが発現しても、Ｖ領域の機能が消失したり、減弱しな
いための工夫が必要である。ターミネーターとしては、
例えば大腸菌のtrpＡターミネーター、rrnＢターミネー
ター、recＡターミネーターなどを用いることができ
る。また、発現プラスミドのコピー数は一般的に多い方
が好ましく、複製起点としてpBR系の複製起点よりpUC系
の方が望ましい。
ーペプチドの配列は、調製した抗体Ｖ領域分子が機能的
である限りいかなる配列でもよいが、生体内投与時の副
作用を最小限とするためになるべく短く、独自の構造を
有しないような配列とした方が望ましい。また、ペプチ
ドが発現しても、Ｖ領域の機能が消失したり、減弱しな
いための工夫が必要である。ターミネーターとしては、
例えば大腸菌のtrpＡターミネーター、rrnＢターミネー
ター、recＡターミネーターなどを用いることができ
る。また、発現プラスミドのコピー数は一般的に多い方
が好ましく、複製起点としてpBR系の複製起点よりpUC系
の方が望ましい。
【００３０】構築した発現プラスミドＤＮＡにＰＣＲに
て増幅したＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡをそれぞれ挿入す
る。挿入後、この発現プラスミドを通常の方法で宿主に
形質転換させ、そして発現させれば良い。宿主として
は、原核生物及び真核生物の何れであってもよい。原核
生物の例としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることが
できる。真核細胞は例えば酵母、ＣＨＯ細胞などを用い
れば良い。好ましくは原核細胞、更に好ましくは大腸菌
を宿主として用いるのが良い。
て増幅したＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡをそれぞれ挿入す
る。挿入後、この発現プラスミドを通常の方法で宿主に
形質転換させ、そして発現させれば良い。宿主として
は、原核生物及び真核生物の何れであってもよい。原核
生物の例としては、大腸菌、枯草菌などを挙げることが
できる。真核細胞は例えば酵母、ＣＨＯ細胞などを用い
れば良い。好ましくは原核細胞、更に好ましくは大腸菌
を宿主として用いるのが良い。
【００３１】発現ベクターをこれらの宿主に組み込む方
法も公知の方法を利用すればよく、例えば大腸菌では、
対数増殖期の細胞を５０mMの塩化カルシウムで氷中約３
０分処理することにより、大腸菌の細胞壁の構造が変化
し、続いてプラスミドＤＮＡを注入し約１０分後３０℃
〜４２℃で２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０
℃〜３７℃で約６０分培養することにより、発現プラス
ミドＤＮＡを生物に組み込むことができる。
法も公知の方法を利用すればよく、例えば大腸菌では、
対数増殖期の細胞を５０mMの塩化カルシウムで氷中約３
０分処理することにより、大腸菌の細胞壁の構造が変化
し、続いてプラスミドＤＮＡを注入し約１０分後３０℃
〜４２℃で２分間の熱処理を施した後、培地を加え３０
℃〜３７℃で約６０分培養することにより、発現プラス
ミドＤＮＡを生物に組み込むことができる。
【００３２】目的とするヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受
容体への結合を阻害するペプチドは、このような生物細
胞を培養することによって当該細胞の内部あるいは培地
中に蓄積させることができる。培地は各細胞を培養しう
るそれぞれの公知の培地を利用すればよく、培養条件も
公知の条件でよい。培養後は、公知の方法により目的と
するペプチドを採取すればよい。
容体への結合を阻害するペプチドは、このような生物細
胞を培養することによって当該細胞の内部あるいは培地
中に蓄積させることができる。培地は各細胞を培養しう
るそれぞれの公知の培地を利用すればよく、培養条件も
公知の条件でよい。培養後は、公知の方法により目的と
するペプチドを採取すればよい。
【００３３】さて、本発明のペプチドは、ヒトＩＬ−６
のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害し、ヒトＩＬ−６
の作用を抑制する活性を有しており、ＩＬ−６が発症、
あるいは悪化の原因と考えられている慢性関節リウマ
チ、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患治療薬、細菌感
染治療薬、細菌感染に伴う敗血性ショック治療薬、ウイ
ルス感染治療薬、多発性骨髄腫等の癌の治療薬、癌の転
移抑制薬、癌悪液質改善薬、メサンギウム増殖性腎炎等
の炎症性疾患治療薬として利用し得る有用な物質であ
る。
のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻害し、ヒトＩＬ−６
の作用を抑制する活性を有しており、ＩＬ−６が発症、
あるいは悪化の原因と考えられている慢性関節リウマ
チ、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患治療薬、細菌感
染治療薬、細菌感染に伴う敗血性ショック治療薬、ウイ
ルス感染治療薬、多発性骨髄腫等の癌の治療薬、癌の転
移抑制薬、癌悪液質改善薬、メサンギウム増殖性腎炎等
の炎症性疾患治療薬として利用し得る有用な物質であ
る。
【００３４】また、本発明のペプチドの構造は配列表の
配列番号１記載の配列に限定されるものではなく、ＩＬ
−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害し、ＩＬ−６の作
用を抑制する活性を有する限り本発明のペプチドに含ま
れる。例えば、（１）配列番号１記載のペプチド構造中
のＮ末端及び／またはＣ末端より１もしくは複数個のア
ミノ酸が欠損し、かつ連続しているアミノ酸配列を有す
る直鎖状あるいは環状ペプチド、（２）配列番号１記載
のペプチド構造中の１もしくは複数個のアミノ酸を他の
アミノ酸に置換した構造を有するペプチド、（３）配列
番号１記載のペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１
もしくは複数個のアミノ酸が付加された構造を有するペ
プチド、（４）配列番号１記載のペプチドのうち１もし
くは複数個のアミノ酸がアセチル化、アミド化もしくは
ポリエチレングリコール付加された構造を有するペプチ
ド等もヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻
害し、ヒトＩＬ−６の作用を抑制する活性を有する限り
本発明のペプチドに含まれる。特に、配列表の配列番号
１記載のペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現
する過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末
端がAspとなる場合がある。このペプチドも上記活性を
有している限り本発明のペプチドに含まれる。また、Me
tが結合した形で生産させた後、アミノペプチダーゼ等
の酵素でＮ末端Metをはずしたものも上記活性を有する
限り本発明のペプチドに含まれる。また、必要により本
発明のペプチドのうち、いわゆるフレームワークと呼ば
れる領域をヒト由来のフレームワークに変換したペプチ
ドも、抗体の構造上、変換前のペプチドと同様の活性を
有することが当然であり、上記活性を有する限り本発明
のペプチドに含まれる。更に、必要により本発明のペプ
チドに毒素を付加したものを用いても良い。
配列番号１記載の配列に限定されるものではなく、ＩＬ
−６のＩＬ−６受容体への結合を阻害し、ＩＬ−６の作
用を抑制する活性を有する限り本発明のペプチドに含ま
れる。例えば、（１）配列番号１記載のペプチド構造中
のＮ末端及び／またはＣ末端より１もしくは複数個のア
ミノ酸が欠損し、かつ連続しているアミノ酸配列を有す
る直鎖状あるいは環状ペプチド、（２）配列番号１記載
のペプチド構造中の１もしくは複数個のアミノ酸を他の
アミノ酸に置換した構造を有するペプチド、（３）配列
番号１記載のペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１
もしくは複数個のアミノ酸が付加された構造を有するペ
プチド、（４）配列番号１記載のペプチドのうち１もし
くは複数個のアミノ酸がアセチル化、アミド化もしくは
ポリエチレングリコール付加された構造を有するペプチ
ド等もヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への結合を阻
害し、ヒトＩＬ−６の作用を抑制する活性を有する限り
本発明のペプチドに含まれる。特に、配列表の配列番号
１記載のペプチドのＮ末端のMetは微生物を用いて発現
する過程又は精製過程において切断され、その結果Ｎ末
端がAspとなる場合がある。このペプチドも上記活性を
有している限り本発明のペプチドに含まれる。また、Me
tが結合した形で生産させた後、アミノペプチダーゼ等
の酵素でＮ末端Metをはずしたものも上記活性を有する
限り本発明のペプチドに含まれる。また、必要により本
発明のペプチドのうち、いわゆるフレームワークと呼ば
れる領域をヒト由来のフレームワークに変換したペプチ
ドも、抗体の構造上、変換前のペプチドと同様の活性を
有することが当然であり、上記活性を有する限り本発明
のペプチドに含まれる。更に、必要により本発明のペプ
チドに毒素を付加したものを用いても良い。
【００３５】本発明に係る免疫抑制剤は上記ペプチドを
0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％〜70重量
％の割合で含有すればよい。したがって、本発明のペプ
チドをそのまま投与してもよいし、また通常製剤用担体
と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体
としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペ
プチドと反応しない物質が用いられる。注射剤の場合に
は、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、
必要に応じて生理食塩水、ぶどう糖溶液に溶解させても
よく、また緩衝剤、保存剤、安定化剤あるいは賦形剤を
含有させてもよい。また、これらの製剤は治療上価値の
ある他の成分を含有していてもよい。
0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％〜70重量
％の割合で含有すればよい。したがって、本発明のペプ
チドをそのまま投与してもよいし、また通常製剤用担体
と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体
としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペ
プチドと反応しない物質が用いられる。注射剤の場合に
は、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、
必要に応じて生理食塩水、ぶどう糖溶液に溶解させても
よく、また緩衝剤、保存剤、安定化剤あるいは賦形剤を
含有させてもよい。また、これらの製剤は治療上価値の
ある他の成分を含有していてもよい。
【００３６】本発明に係る免疫抑制剤の投与方法として
は、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもか
まわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投
与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１
回0.001〜1000ｍｇ、好ましくは0.01〜10ｍｇを１日当
り１〜３回投与すればよい。
は、経口、注射、直腸内などいずれの方法を用いてもか
まわないが、注射による投与が好ましい。投与量は、投
与方法、患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１
回0.001〜1000ｍｇ、好ましくは0.01〜10ｍｇを１日当
り１〜３回投与すればよい。
【００３７】
【実施例】以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説
明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではな
い。
【００３８】実施例１（ハイブリドーマの調製） ６〜８週令の雌のBALB/cマウスに、リコンビナントヒト
ＩＬ−６をフロインドの完全アジュバントとともに１匹
あたり１００μｇ皮下投与することにより免疫した。そ
の３週間後、同様の操作により追加免疫し、更にその５
日後、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べる参考
例に示す方法に従って、ＩＬ−６への結合活性を調べる
ことにより抗体価を測定した。抗体価の高かったマウス
を更に同様の操作にて最終免疫し、その３日後、脾臓を
摘出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（X63-Ag8-6.5.
3）とを、５０％ポリエチレングリコール＃４０００
（ナカライテスク社製）存在下にて細胞数で１０：１の
割合で混合し、細胞融合させた。融合細胞を、１０％牛
胎児血清（ギブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社
製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１穴
あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺細胞を含有する９６穴
平底プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分注
した。１日、２日、３日、６日後に培地の半量をヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡ
Ｔ培地）と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返
した。融合より約２週間後、融合した細胞（ハイブリド
ーマ）の増殖してきた各穴の培養上清について、ＩＬ−
６への結合活性を有していた穴に含まれるハイブリドー
マを、限界希釈法にてクローン化した。更にそれぞれの
ハイブリドーマクローンの培養上清中のＩＬ−６への結
合活性を測定して、抗ＩＬ−６抗体産生ハイブリドーマ
を得た。更に、得られた抗ＩＬ−６抗体産生ハイブリド
ーマの培養上清について、以下の方法にてＩＬ−６の作
用の抑制能を調べた。１０％牛胎児血清を含むRPMI1640
培地にて２００ｐｇ／ｍｌに調製したヒトリコンビナン
トＩＬ−６溶液を１穴あたり５０μｌずつ９６穴平底マ
イクロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０
μｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更
に、１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて１Ｘ１０
5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したＭＨ６０細胞液
を１穴あたり１００μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下
３７℃にて３日間培養した。最後の６時間は１μＣｉの
3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養し、細胞
内に取り込まれた放射活性量をシンチレーシンカウンタ
ー（パッカード社製）にて測定することにより、培養上
清によるＩＬ−６の作用を抑制する活性を調べた。この
ような方法にてＩＬ−６に対する抗体を産生するハイブ
リドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマ
としてＨＨ６１−１０がある（特開平3-61496号公報参
照）。
ＩＬ−６をフロインドの完全アジュバントとともに１匹
あたり１００μｇ皮下投与することにより免疫した。そ
の３週間後、同様の操作により追加免疫し、更にその５
日後、マウスの眼窩静脈より採血して、後に述べる参考
例に示す方法に従って、ＩＬ−６への結合活性を調べる
ことにより抗体価を測定した。抗体価の高かったマウス
を更に同様の操作にて最終免疫し、その３日後、脾臓を
摘出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（X63-Ag8-6.5.
3）とを、５０％ポリエチレングリコール＃４０００
（ナカライテスク社製）存在下にて細胞数で１０：１の
割合で混合し、細胞融合させた。融合細胞を、１０％牛
胎児血清（ギブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社
製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、１穴
あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺細胞を含有する９６穴
平底プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分注
した。１日、２日、３日、６日後に培地の半量をヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡ
Ｔ培地）と交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返
した。融合より約２週間後、融合した細胞（ハイブリド
ーマ）の増殖してきた各穴の培養上清について、ＩＬ−
６への結合活性を有していた穴に含まれるハイブリドー
マを、限界希釈法にてクローン化した。更にそれぞれの
ハイブリドーマクローンの培養上清中のＩＬ−６への結
合活性を測定して、抗ＩＬ−６抗体産生ハイブリドーマ
を得た。更に、得られた抗ＩＬ−６抗体産生ハイブリド
ーマの培養上清について、以下の方法にてＩＬ−６の作
用の抑制能を調べた。１０％牛胎児血清を含むRPMI1640
培地にて２００ｐｇ／ｍｌに調製したヒトリコンビナン
トＩＬ−６溶液を１穴あたり５０μｌずつ９６穴平底マ
イクロプレートに分注して、サンプルの培養上清を５０
μｌ加え、３７℃、３０分間インキュベートした。更
に、１０％牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて１Ｘ１０
5個／ｍｌの濃度となるように懸濁したＭＨ６０細胞液
を１穴あたり１００μｌずつ加えて、５％ＣＯ2存在下
３７℃にて３日間培養した。最後の６時間は１μＣｉの
3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加えて培養し、細胞
内に取り込まれた放射活性量をシンチレーシンカウンタ
ー（パッカード社製）にて測定することにより、培養上
清によるＩＬ−６の作用を抑制する活性を調べた。この
ような方法にてＩＬ−６に対する抗体を産生するハイブ
リドーマを調製した。こうして得られたハイブリドーマ
としてＨＨ６１−１０がある（特開平3-61496号公報参
照）。
【００３９】実施例２（ハイブリドーマより抗体のＶ領
域ｃＤＮＡの調製） ５Ｘ１０6個のハイブリドーマＨＨ６１−１０をPBSにて
洗浄後、guanidine thiocyanate、N-lauryl sarcosin
e、EDTAを含むＲＮＡ抽出用緩衝液（ファルマシア社
製）を加えて懸濁した後、あらかじめ等容量のCesium C
loride溶液（ρ=1.51g/ml、ファルマシア社製）を入れ
たチューブに重層し、１２５，０００ｘｇにて１６時間
遠心した。上清を吸い取ったのち、１ｍＭEDTAを含む１
０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて懸濁
し、新しいチューブに入れ、６５℃で５分間インキュベ
ートした。更に、２Ｍ Potassium Acetate（ｐＨ５．
０）（ファルマシア社製）を１／１０容量とエタノール
（ナカライテスク社製）を３倍容量加えて、−２０℃に
一晩放置した。５，０００ｘｇにて２０分間遠心して、
上清を捨てた後、８０％エタノールにて遠心洗浄し、沈
澱を乾燥させた。沈澱を１ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶解してtotalＲＮ
Ａ画分とした。次に、totalＲＮＡ画分溶液に、あらか
じめデザインした抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の３’側に
相補的なプライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyN
TP混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、
RNAase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transc
riptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応
させｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シー
タス社製）、deoxyNTP混合液、抗体Ｈ鎖、及び抗体Ｌ鎖
Ｖ領域ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマー、及び３’側プ
ライマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及びTaq Polyme
rase（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマ
ルサイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４
℃）、アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステ
ンション１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイ
クル毎にプライマーイクステンションの時間を１５秒ず
つ延長させた。反応後、１ｍＭEDTAを含む４０ｍＭトリ
ス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）にてアガロースゲル電気泳
動を行い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、
ジーンクリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽
出・精製した。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用
いたプライマーの配列を図１に示した。
域ｃＤＮＡの調製） ５Ｘ１０6個のハイブリドーマＨＨ６１−１０をPBSにて
洗浄後、guanidine thiocyanate、N-lauryl sarcosin
e、EDTAを含むＲＮＡ抽出用緩衝液（ファルマシア社
製）を加えて懸濁した後、あらかじめ等容量のCesium C
loride溶液（ρ=1.51g/ml、ファルマシア社製）を入れ
たチューブに重層し、１２５，０００ｘｇにて１６時間
遠心した。上清を吸い取ったのち、１ｍＭEDTAを含む１
０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて懸濁
し、新しいチューブに入れ、６５℃で５分間インキュベ
ートした。更に、２Ｍ Potassium Acetate（ｐＨ５．
０）（ファルマシア社製）を１／１０容量とエタノール
（ナカライテスク社製）を３倍容量加えて、−２０℃に
一晩放置した。５，０００ｘｇにて２０分間遠心して、
上清を捨てた後、８０％エタノールにて遠心洗浄し、沈
澱を乾燥させた。沈澱を１ｍＭEDTAを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶解してtotalＲＮ
Ａ画分とした。次に、totalＲＮＡ画分溶液に、あらか
じめデザインした抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域の３’側に
相補的なプライマー溶液（最終濃度で１μＭ）、deoxyN
TP混合液、ｃＤＮＡ合成用緩衝液（アマシャム社製）、
RNAase Inhibitor（宝酒造社製）、及びReverse Transc
riptase（宝酒造社製）を加えて４２℃にて１時間反応
させｃＤＮＡを合成した。更に、ＰＣＲ用緩衝液（シー
タス社製）、deoxyNTP混合液、抗体Ｈ鎖、及び抗体Ｌ鎖
Ｖ領域ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマー、及び３’側プ
ライマー（それぞれ最終濃度１μＭ）、及びTaq Polyme
rase（宝酒造社製）を加えＰＣＲ（シータス社、サーマ
ルサイクラー）を行った。反応は変性３０秒（９４
℃）、アニール３０秒（５５℃）、プライマーイクステ
ンション１分（７２℃）にて３０サイクル行い、各サイ
クル毎にプライマーイクステンションの時間を１５秒ず
つ延長させた。反応後、１ｍＭEDTAを含む４０ｍＭトリ
ス酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）にてアガロースゲル電気泳
動を行い、該当するｃＤＮＡフラグメントを切り出し、
ジーンクリーンキット（バイオ１０１社製）を用いて抽
出・精製した。なお、ｃＤＮＡの合成、及びＰＣＲに用
いたプライマーの配列を図１に示した。
【００４０】実施例３（発現ベクターの構築） 図３に示すように、まずpT13SNco（本プラスミドを含有
する E. coli AJ-12447は、FERM P-10757 として寄託さ
れている。）［J. Biochem.、１０４巻、３０頁、１９
８８年に記載］を制限酵素ClaI、BamHI（いずれも宝酒
造社製）にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、通
常の方法で作成した図２に示された配列を有する合成Ｄ
ＮＡ断片（リンカー）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
社製）を用いて連結した。次に、同じく図３に示す通
り、合成ＤＮＡ断片とプラスミドpT13SNcoを制限酵素Cl
aIとBamHIで切断して得られる大きい断片を連結する。
この連結したプラスミドを制限酵素EcoRI、PvuII（いず
れも宝酒造社製）にて切断して得られる小さいＤＮＡ断
片と、pUC18（Methods in Enzymology、１０１巻、２０
頁、１９８３年）のHindIIIサイトとNdeIサイトを、制
限酵素で切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）
で平滑化し、更にＴ４リガーゼを用いて連結することに
より消失させたものを、EcoRI、HincII（宝酒造社製）
にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片とをＴ４リガー
ゼにて連結することにより、複製起点をpUC系とするpFv
-DEを得た。
する E. coli AJ-12447は、FERM P-10757 として寄託さ
れている。）［J. Biochem.、１０４巻、３０頁、１９
８８年に記載］を制限酵素ClaI、BamHI（いずれも宝酒
造社製）にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、通
常の方法で作成した図２に示された配列を有する合成Ｄ
ＮＡ断片（リンカー）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
社製）を用いて連結した。次に、同じく図３に示す通
り、合成ＤＮＡ断片とプラスミドpT13SNcoを制限酵素Cl
aIとBamHIで切断して得られる大きい断片を連結する。
この連結したプラスミドを制限酵素EcoRI、PvuII（いず
れも宝酒造社製）にて切断して得られる小さいＤＮＡ断
片と、pUC18（Methods in Enzymology、１０１巻、２０
頁、１９８３年）のHindIIIサイトとNdeIサイトを、制
限酵素で切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）
で平滑化し、更にＴ４リガーゼを用いて連結することに
より消失させたものを、EcoRI、HincII（宝酒造社製）
にて切断して得られる大きいＤＮＡ断片とをＴ４リガー
ゼにて連結することにより、複製起点をpUC系とするpFv
-DEを得た。
【００４１】実施例４（pFv-DEへの抗体Ｖ領域ｃＤＮＡ
の組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調
製） 図４に示すように、まずpFv-DEを制限酵素NdeI、SalI
（宝酒造社製）で切断して得られる大きいＤＮＡ断片
と、ＰＣＲを行った後回収したＨＨ６１−１０のＬ鎖Ｖ
領域ｃＤＮＡを同じくNdeI、SalIで切断した断片をＴ４
リガーゼにて連結した。ＨＨ６１−１０のＬ鎖Ｖ領域は
配列表の配列番号１に示される塩基配列中の４−３２４
番目に当たる。尚、両配列に於いて塩基配列中の１−３
番目は翻訳開始コドンＡＴＧである。次に、その連結し
たプラスミドを更に制限酵素XhoI、HindIII（宝酒造社
製）で切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、ＰＣＲ後
回収したＨＨ６１−１０のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを同様に
XhoI、HindIIIで切断した断片をＴ４リガーゼにて連結
することにより、Ｖ領域のみからなる抗体を発現するpF
v(HH61-10)-DEを構築、取得した。続いてそれぞれのプ
ラスミドを大腸菌HB101株に形質転換し、Ｖ領域のみか
らなる抗体を生産する菌（E. Coli pFv(HH61-10)-DE/HB
101 AJ-12789、FERM P- 13366）を得た。尚、ＨＨ６１
−１０のＨ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に示される塩
基配列中の３６７−７３８番目にあたる。
の組み込み、及びＶ領域のみからなる抗体生産菌の調
製） 図４に示すように、まずpFv-DEを制限酵素NdeI、SalI
（宝酒造社製）で切断して得られる大きいＤＮＡ断片
と、ＰＣＲを行った後回収したＨＨ６１−１０のＬ鎖Ｖ
領域ｃＤＮＡを同じくNdeI、SalIで切断した断片をＴ４
リガーゼにて連結した。ＨＨ６１−１０のＬ鎖Ｖ領域は
配列表の配列番号１に示される塩基配列中の４−３２４
番目に当たる。尚、両配列に於いて塩基配列中の１−３
番目は翻訳開始コドンＡＴＧである。次に、その連結し
たプラスミドを更に制限酵素XhoI、HindIII（宝酒造社
製）で切断して得られる大きいＤＮＡ断片と、ＰＣＲ後
回収したＨＨ６１−１０のＨ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡを同様に
XhoI、HindIIIで切断した断片をＴ４リガーゼにて連結
することにより、Ｖ領域のみからなる抗体を発現するpF
v(HH61-10)-DEを構築、取得した。続いてそれぞれのプ
ラスミドを大腸菌HB101株に形質転換し、Ｖ領域のみか
らなる抗体を生産する菌（E. Coli pFv(HH61-10)-DE/HB
101 AJ-12789、FERM P- 13366）を得た。尚、ＨＨ６１
−１０のＨ鎖Ｖ領域は配列表の配列番号１に示される塩
基配列中の３６７−７３８番目にあたる。
【００４２】実施例５（Ｖ領域のみからなる抗体生産菌
より、生産物の取得） 得られた形質転換株 E. Coli pFv(HH61-10)-DE/HB101
（FERM P-13366）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む２ｘＴＹ［１．６％トリプトン、１％酵母エキス、
（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐＨ７．０］５ｍ
ｌ中で３７℃一晩生育させた。ついで、その培養懸濁液
５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培地（０．６％
Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０５％NaCl、
０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、０．００１４
７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２％カザミノ
酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プロリン、
０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて３時間培
養した。その後、２５μｇ／ｍｌとなるように3-インド
ールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０
時間誘導培養した。この一部の菌体懸濁液を位相差顕微
鏡により約１５００倍にて観察すると、大腸菌体内の顆
粒形成が認められた。続いて上記の如く培養した菌体懸
濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるよ
うに、３０ｍＭNaClを含む２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を添加し、懸濁後、０．５ＭEDTA（ｐＨ
８．０）で１ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたリゾチー
ム溶液３７．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて
１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６
０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で顆粒を回収した。こ
の顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、目的ペプチド
濃度が１００μｇ／ｍｌ、及び３．５Ｍ塩酸グアニジン
溶液となるように調製した後、これに酸化型グルタチオ
ン３μＭと還元型グルタチオン３０μＭとなるように添
加し、ｐＨ８．０で室温で１０〜１６時間放置した。次
に、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析を
行い粗精製ペプチドを得た。次に、粗精製ペプチドを、
あらかじめ１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡
化したＳ−セファロースカラム（ファルマシア社製）に
かけ結合させ、５０ｍＭNaClを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）にて溶出後、ＰＢＳに対して透析する事
により目的とするペプチドを得た。本物質はＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により、その分子量は実施
例６に従って推定されたアミノ酸配列から計算された値
とそれぞれほぼ一致し、また、プロテインシークエンサ
ーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、予想さ
れたアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加した配列
を有することが確認された。
より、生産物の取得） 得られた形質転換株 E. Coli pFv(HH61-10)-DE/HB101
（FERM P-13366）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む２ｘＴＹ［１．６％トリプトン、１％酵母エキス、
（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐＨ７．０］５ｍ
ｌ中で３７℃一晩生育させた。ついで、その培養懸濁液
５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培地（０．６％
Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０５％NaCl、
０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、０．００１４
７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２％カザミノ
酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プロリン、
０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて３時間培
養した。その後、２５μｇ／ｍｌとなるように3-インド
ールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０
時間誘導培養した。この一部の菌体懸濁液を位相差顕微
鏡により約１５００倍にて観察すると、大腸菌体内の顆
粒形成が認められた。続いて上記の如く培養した菌体懸
濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、２倍濃縮となるよ
うに、３０ｍＭNaClを含む２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を添加し、懸濁後、０．５ＭEDTA（ｐＨ
８．０）で１ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたリゾチー
ム溶液３７．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて
１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６
０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で顆粒を回収した。こ
の顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、目的ペプチド
濃度が１００μｇ／ｍｌ、及び３．５Ｍ塩酸グアニジン
溶液となるように調製した後、これに酸化型グルタチオ
ン３μＭと還元型グルタチオン３０μＭとなるように添
加し、ｐＨ８．０で室温で１０〜１６時間放置した。次
に、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析を
行い粗精製ペプチドを得た。次に、粗精製ペプチドを、
あらかじめ１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡
化したＳ−セファロースカラム（ファルマシア社製）に
かけ結合させ、５０ｍＭNaClを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）にて溶出後、ＰＢＳに対して透析する事
により目的とするペプチドを得た。本物質はＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により、その分子量は実施
例６に従って推定されたアミノ酸配列から計算された値
とそれぞれほぼ一致し、また、プロテインシークエンサ
ーにてＮ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、予想さ
れたアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加した配列
を有することが確認された。
【００４３】 実施例６（塩基配列の決定、及びアミノ酸配列の推定） 構築したＶ領域のみからなるペプチドを発現するプラス
ミドpFv(HH61-10)-DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、
市販されているシークエンス用プライマーＭ４、あるい
はＲＶ（宝酒造社製）を用い、7-DEAZAシークエンスキ
ット（宝酒造社製）にて塩基配列を決定した。得られた
塩基配列よりアミノ酸配列配列を推定した。なお、配列
表の配列番号１にペプチドFv(HH61-10)をコードする塩
基配列とそれに対応するアミノ酸配列を示した。即ち、
配列表の配列番号１に示されるように、ペプチドFv(HH6
1-10)はＮ末端にMet、Ｃ末端にSerを有する２４６個の
アミノ酸からなるペプチドである。
ミドpFv(HH61-10)-DEをアルカリＳＤＳ法にて精製し、
市販されているシークエンス用プライマーＭ４、あるい
はＲＶ（宝酒造社製）を用い、7-DEAZAシークエンスキ
ット（宝酒造社製）にて塩基配列を決定した。得られた
塩基配列よりアミノ酸配列配列を推定した。なお、配列
表の配列番号１にペプチドFv(HH61-10)をコードする塩
基配列とそれに対応するアミノ酸配列を示した。即ち、
配列表の配列番号１に示されるように、ペプチドFv(HH6
1-10)はＮ末端にMet、Ｃ末端にSerを有する２４６個の
アミノ酸からなるペプチドである。
【００４４】 実施例７（ペプチドFv(HH61-10)の活性の検定） （１）ＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合阻害活性 ０．５％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3を含むＲＰＭＩ１
６４０培地にて適当な濃度に希釈したペプチドFv(HH61-
10)とボルトンハンター法により125Ｉ標識したヒトリコ
ンビナントＩＬ−６とを混合し、室温にて１時間反応さ
せた。反応後、同培地にて懸濁した５Ｘ１０5個のＵ２
６６細胞を添加して４℃にて１時間反応させ、細胞に結
合した放射活性を測定した。図５に示すように、ペプチ
ドFv(HH61-10)は、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体
への結合を阻害する活性を有していることが明らかとな
った。
６４０培地にて適当な濃度に希釈したペプチドFv(HH61-
10)とボルトンハンター法により125Ｉ標識したヒトリコ
ンビナントＩＬ−６とを混合し、室温にて１時間反応さ
せた。反応後、同培地にて懸濁した５Ｘ１０5個のＵ２
６６細胞を添加して４℃にて１時間反応させ、細胞に結
合した放射活性を測定した。図５に示すように、ペプチ
ドFv(HH61-10)は、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体
への結合を阻害する活性を有していることが明らかとな
った。
【００４５】 （２）ＩＬ−６依存性細胞株の増殖阻害活性 １０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて適当な濃
度に希釈したペプチドFv(HH61-10)と、０．４ｎｇ／ｍ
ｌのヒトリコンビナントＩＬ−６とを混合し、３７℃に
て３０分間反応させた。反応後、同培地にて懸濁した５
Ｘ１０3個のＫＴ−３細胞を添加して３７℃にて２日間
培養した。培養後、５ｍｇ／ｍｌの濃度に同培地にて調
製したＭＴＴ試薬（シグマ社製）を添加し、３７℃にて
４時間培養後、０．０４ＮＨＣｌを含むイソプロパノー
ルにより細胞を溶解して、５７０ｎｍの吸光度を測定す
ることにより生細胞数を測定した。その結果、図６に示
すように、ペプチドFv(HH61-10)は、ＫＴ−３細胞のＩ
Ｌ−６依存性増殖を阻害する活性を有していることが明
らかとなった。すなわち、本ペプチドFv(HH61-10)は、
多発性骨髄腫、慢性関節リウマチ、メサンギウム増殖性
腎炎など、ＩＬ−６が細胞を異常増殖させることが発症
原因となる疾患の治療に有用な物質であることが示され
た。
度に希釈したペプチドFv(HH61-10)と、０．４ｎｇ／ｍ
ｌのヒトリコンビナントＩＬ−６とを混合し、３７℃に
て３０分間反応させた。反応後、同培地にて懸濁した５
Ｘ１０3個のＫＴ−３細胞を添加して３７℃にて２日間
培養した。培養後、５ｍｇ／ｍｌの濃度に同培地にて調
製したＭＴＴ試薬（シグマ社製）を添加し、３７℃にて
４時間培養後、０．０４ＮＨＣｌを含むイソプロパノー
ルにより細胞を溶解して、５７０ｎｍの吸光度を測定す
ることにより生細胞数を測定した。その結果、図６に示
すように、ペプチドFv(HH61-10)は、ＫＴ−３細胞のＩ
Ｌ−６依存性増殖を阻害する活性を有していることが明
らかとなった。すなわち、本ペプチドFv(HH61-10)は、
多発性骨髄腫、慢性関節リウマチ、メサンギウム増殖性
腎炎など、ＩＬ−６が細胞を異常増殖させることが発症
原因となる疾患の治療に有用な物質であることが示され
た。
【００４６】（３）ＩＬ−６による急性期蛋白質の産生
誘導の阻害活性 １０％ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ギブ
コ社製）にて適当な濃度に希釈したペプチドFv(HH61-1
0)と、１００ｎｇ／ｍｌのヒトリコンビナントＩＬ−６
とを混合し、３７℃にて３０分間反応させた。反応後、
あらかじめ同培地にて１ウェル当たり１Ｘ１０4ずつ入
れ３７℃、１６時間培養したＨｅｐ３Ｂ細胞にかけ、３
７℃にて２日間培養した。次に、それぞれのウェルより
培養上清を抜き取り、ＥＬＩＳＡ法により上清中のハプ
トグロビン量を定量した。ＥＬＩＳＡ法は、まず９６穴
プレート（フロー社製）にＰＢＳにて１μｇ／ｍｌの濃
度に溶解したヒツジ抗ヒトハプトグロビン抗体（バイン
ディングサイト社製）を入れ、４℃にて一晩反応させ
た。反応後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加え、
室温にて１時間放置した。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ
溶液を捨て、同溶液にて４倍に希釈した培養上清を添加
し、室温で２時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液にて３回洗浄し、０．５％
ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液にて１０００倍希釈したアルカ
リフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトハプトグロビン抗
体（バインディングサイト社製）を添加し、室温にて２
時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ溶液にて３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて調製したｐ−ニ
トロフェノールフォスフェート（シグマ社製）を加えて
１５分間放置して４０５ｎｍの吸光度を測定した。その
結果、図７に示すように、ペプチドFv(HH61-10)は、Ｉ
Ｌ−６によるＨｅｐ３Ｂ細胞からの急性期蛋白質の一種
のハプトグロブリンの産生を阻害する活性を有している
ことが明らかとなった。すなわち、本ペプチドFv(HH61-
10)は、炎症性疾患の治療に有用な物質であることが示
された。
誘導の阻害活性 １０％ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ギブ
コ社製）にて適当な濃度に希釈したペプチドFv(HH61-1
0)と、１００ｎｇ／ｍｌのヒトリコンビナントＩＬ−６
とを混合し、３７℃にて３０分間反応させた。反応後、
あらかじめ同培地にて１ウェル当たり１Ｘ１０4ずつ入
れ３７℃、１６時間培養したＨｅｐ３Ｂ細胞にかけ、３
７℃にて２日間培養した。次に、それぞれのウェルより
培養上清を抜き取り、ＥＬＩＳＡ法により上清中のハプ
トグロビン量を定量した。ＥＬＩＳＡ法は、まず９６穴
プレート（フロー社製）にＰＢＳにて１μｇ／ｍｌの濃
度に溶解したヒツジ抗ヒトハプトグロビン抗体（バイン
ディングサイト社製）を入れ、４℃にて一晩反応させ
た。反応後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加え、
室温にて１時間放置した。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ
溶液を捨て、同溶液にて４倍に希釈した培養上清を添加
し、室温で２時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液にて３回洗浄し、０．５％
ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液にて１０００倍希釈したアルカ
リフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトハプトグロビン抗
体（バインディングサイト社製）を添加し、室温にて２
時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ溶液にて３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて調製したｐ−ニ
トロフェノールフォスフェート（シグマ社製）を加えて
１５分間放置して４０５ｎｍの吸光度を測定した。その
結果、図７に示すように、ペプチドFv(HH61-10)は、Ｉ
Ｌ−６によるＨｅｐ３Ｂ細胞からの急性期蛋白質の一種
のハプトグロブリンの産生を阻害する活性を有している
ことが明らかとなった。すなわち、本ペプチドFv(HH61-
10)は、炎症性疾患の治療に有用な物質であることが示
された。
【００４７】
【発明の効果】本発明のペプチドは、ヒトＩＬ−６のヒ
トＩＬ−６受容体への結合を阻害する活性を有してお
り、ＩＬ−６が発症あるいは悪化の原因と考えられてい
る慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾
患治療薬、細菌感染治療薬、細菌感染に伴う敗血性ショ
ック治療薬、ウイルス感染治療薬、多発性骨髄腫等の癌
の治療薬、癌の転移抑制薬、癌悪液質改善薬、メサンギ
ウム増殖性腎炎等の炎症性疾患治療薬として利用し得る
有用な物質である。
トＩＬ−６受容体への結合を阻害する活性を有してお
り、ＩＬ−６が発症あるいは悪化の原因と考えられてい
る慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾
患治療薬、細菌感染治療薬、細菌感染に伴う敗血性ショ
ック治療薬、ウイルス感染治療薬、多発性骨髄腫等の癌
の治療薬、癌の転移抑制薬、癌悪液質改善薬、メサンギ
ウム増殖性腎炎等の炎症性疾患治療薬として利用し得る
有用な物質である。
【００４８】
配列番号：１ 配列の長さ：７３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 細胞の種類：ハイブリドーマ クローン名：HH61-10 配列 ATG GAC ATC CTG CTG ACA CAG TCT CCA AAA TTC CTG CTT GTA TCA GCA 48 Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 GGA GAC AGG GTT ACC ATA ACC TGC AAG GCC AGT CAG AGT GTG AGT ACT 96 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr 20 25 30 GAT GTA AGT TGG TAC CAA CAG AAG CCA GGG CAG TCT CCT AAA CTA CTG 144 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 ATA TAC TAT GCA TCC AAT CGC TAC ACT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACT 192 Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 50 55 60 GGC AGT GGA TAT GGG ACG GAT TTC ACT TTC ACC ATC AGC ACT GTG CAG 240 Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln 65 70 75 80 GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG CAG GAT TAT AGG TCT CCA 288 Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Arg Ser Pro 85 90 95 TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA GTC GAC AAA TCC 336 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Val Asp Lys Ser 100 105 110 TCA GGA TCT GGC TCC GAA TCC AAA AGC ACG CAG GTC AAA CTC GAG GAG 384 Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln Val Lys Leu Glu Glu 115 120 125 TCT GGC CCT GGG ATA TTG CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT 432 Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys 130 135 140 TCT TTC TCT GGG TTT TCA CTG AGC ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC TGG 480 Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp 145 150 155 160 ATT CGT CAG CCT TCA GGG AAG GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TAT 528 Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr 165 170 175 TGG GAT GAT GAC AAA CAC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC CGG CTC ACA 576 Trp Asp Asp Asp Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr 180 185 190 ATC TCC AAG GAT ACC TCC ACC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC ACC AGT 624 Ile Ser Lys Asp Thr Ser Thr Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser 195 200 205 GTG GAC ACT GCA GAT ACT GCC ACA TAC TTC TGT GCT CGA AGA AGT CTC 672 Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Leu 210 215 220 TAT GGT AAT TGG GGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC 720 Tyr Gly Asn Trp Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 TCA GTC ACC GTC TCC TCA 738 Ser Val Thr Val Ser Ser 245
【図１】 プライマーの配列を示す。
【図２】 Ｌ鎖Ｖ領域とＨ鎖Ｖ領域をつなぐ為のリンカ
ーのＤＮＡ配列を示す。
ーのＤＮＡ配列を示す。
【図３】 プラスミドpFv-DEの構築工程を示す図面であ
る。
る。
【図４】 プラスミドpFv(HH61-10)-DEの構築工程を示
す図面である。
す図面である。
【図５】 ペプチドFv(HH61-10)が、125Ｉ標識ＩＬ−６
のＵ２６６細胞への結合を阻害する活性を有することを
示す図面である。
のＵ２６６細胞への結合を阻害する活性を有することを
示す図面である。
【図６】 ペプチドFv(HH61-10)が、ＫＴ−３細胞のＩ
Ｌ−６依存性増殖を阻害する活性を有することを示す図
面である。
Ｌ−６依存性増殖を阻害する活性を有することを示す図
面である。
【図７】 ペプチドFv(HH61-10)が、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の
ＩＬ−６によるハプトグロビン産生を阻害する活性を有
することを示す図面である。
ＩＬ−６によるハプトグロビン産生を阻害する活性を有
することを示す図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年２月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】さて、本ヒトＩＬ−６の各種疾患との関連
性が注目されており、多数報告されている。まず、自己
免疫疾患との関連については、慢性関節リウマチ患者の
関節液中のヒトＩＬ−６濃度が、変形性関節症患者のそ
れに比較して著しく高値であるという報告をはじめ（Eu
ropean Journal of Immunology、１８巻、１７９７頁、
１９８８年）、心房内粘液腫患者のＩＬ−６を構成的に
産生している原発腫瘍を切除することにより自己免疫疾
患症状が改善すること（Proceedings of National Acad
emy of Science U.S.A.、８４巻、２２８頁、１９８７
年）、高γグロブリン血症を呈するキャッスルマン症候
群において、病巣リンパ節組織培養上清中に高濃度のヒ
トＩＬ−６が検出されたこと（実験医学、７巻、５０
頁、１９８９年）などの報告があり、自己抗体の産生が
疾患の原因、あるいは増悪に関わっていると考えられて
いるいわゆる自己免疫疾患の中には、ＩＬ−６が強く関
わっている疾患が数多くあるものと推定されている。
性が注目されており、多数報告されている。まず、自己
免疫疾患との関連については、慢性関節リウマチ患者の
関節液中のヒトＩＬ−６濃度が、変形性関節症患者のそ
れに比較して著しく高値であるという報告をはじめ（Eu
ropean Journal of Immunology、１８巻、１７９７頁、
１９８８年）、心房内粘液腫患者のＩＬ−６を構成的に
産生している原発腫瘍を切除することにより自己免疫疾
患症状が改善すること（Proceedings of National Acad
emy of Science U.S.A.、８４巻、２２８頁、１９８７
年）、高γグロブリン血症を呈するキャッスルマン症候
群において、病巣リンパ節組織培養上清中に高濃度のヒ
トＩＬ−６が検出されたこと（実験医学、７巻、５０
頁、１９８９年）などの報告があり、自己抗体の産生が
疾患の原因、あるいは増悪に関わっていると考えられて
いるいわゆる自己免疫疾患の中には、ＩＬ−６が強く関
わっている疾患が数多くあるものと推定されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】実施例１（ハイブリドーマの調製） ６〜８週令の雌のBALB/cマウスに、リコンビナントヒト
ＩＬ−６をフロインドの完全アジュバントとともに１匹
あたり１００μｇ皮下投与することにより免疫した。そ
の３週間後、同様の操作により追加免疫し、更にその５
日後、マウスの眼窩静脈より採血して、以下に述べる方
法に従って、ＩＬ−６への結合活性を調べることにより
抗体価を測定した。すなわち、PBSにて溶解したリコン
ビナントヒトＩＬ−６（２μｇ／ｍｌ）を９６穴プレー
ト（フロー社製）に入れ、４℃にて一晩放置した。次に
０．５％BSAを含むPBS溶液（BSA-PBS）を入れ室温にて
１時間放置した。更に、BSA-PBSにて適当な濃度に希 釈
したサンプル血清を加え 、室温にて２時間反応させた。
０．０５％Tween 20（ ナカライテスク社製）を含 むPBS
溶液（PBS-Tween）に て洗浄後、抗マウスIg抗体（ダコ
社製）を加えた。２時間反応させた後、PBS-Tweenにて
洗浄し、２，２′− アジノ−ビス（３−エチル ベンゾチ
アゾリン−６−スルフリック酸）（ABTS、シグマ社 製）
と過酸化水素を加えて 吸光度（Ａ405）を測定した 。抗
体価の高かったマウスを更に同様の操作にて最終免疫
し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞とマウス骨髄
腫細胞（X63-Ag8-6.5.3）とを、５０％ポリエチレング
リコール＃４０００（ナカライテスク社製）存在下にて
細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。融
合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRPMI
1640培地（ギブコ社製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなる
ように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺細
胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）に
１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後に
培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごとに
同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合し
た細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養上
清について、ＩＬ−６への結合活性を有していた穴に含
まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化し
た。更にそれぞれのハイブリドーマクローンの培養上清
中のＩＬ−６への結合活性を測定して、抗ＩＬ−６抗体
産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた抗ＩＬ−６
抗体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下の方
法にてＩＬ−６の作用の抑制能を調べた。１０％牛胎児
血清を含むRPMI1640培地にて２００ｐｇ／ｍｌに調製し
たヒトリコンビナントＩＬ−６溶液を１穴あたり５０μ
ｌずつ９６穴平底マイクロプレートに分注して、サンプ
ルの培養上清を５０μｌ加え、３７℃、３０分間インキ
ュベートした。更に、１０％牛胎児血清を含むRPMI1640
培地にて１Ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁し
たＭＨ６０細胞液を１穴あたり１００μｌずつ加えて、
５％ＣＯ2存在下３７℃にて３日間培養した。最後の６
時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加
えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチ
レーシンカウンター（パッカード社製）にて測定するこ
とにより、培養上清によるＩＬ−６の作用を抑制する活
性を調べた。このような方法にてＩＬ−６に対する抗体
を産生するハイブリドーマを調製した。こうして得られ
たハイブリドーマとしてＨＨ６１−１０がある（特開平
3-61496号公報参照）。
ＩＬ−６をフロインドの完全アジュバントとともに１匹
あたり１００μｇ皮下投与することにより免疫した。そ
の３週間後、同様の操作により追加免疫し、更にその５
日後、マウスの眼窩静脈より採血して、以下に述べる方
法に従って、ＩＬ−６への結合活性を調べることにより
抗体価を測定した。すなわち、PBSにて溶解したリコン
ビナントヒトＩＬ−６（２μｇ／ｍｌ）を９６穴プレー
ト（フロー社製）に入れ、４℃にて一晩放置した。次に
０．５％BSAを含むPBS溶液（BSA-PBS）を入れ室温にて
１時間放置した。更に、BSA-PBSにて適当な濃度に希 釈
したサンプル血清を加え 、室温にて２時間反応させた。
０．０５％Tween 20（ ナカライテスク社製）を含 むPBS
溶液（PBS-Tween）に て洗浄後、抗マウスIg抗体（ダコ
社製）を加えた。２時間反応させた後、PBS-Tweenにて
洗浄し、２，２′− アジノ−ビス（３−エチル ベンゾチ
アゾリン−６−スルフリック酸）（ABTS、シグマ社 製）
と過酸化水素を加えて 吸光度（Ａ405）を測定した 。抗
体価の高かったマウスを更に同様の操作にて最終免疫
し、その３日後、脾臓を摘出して脾臓細胞とマウス骨髄
腫細胞（X63-Ag8-6.5.3）とを、５０％ポリエチレング
リコール＃４０００（ナカライテスク社製）存在下にて
細胞数で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。融
合細胞を、１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含むRPMI
1640培地（ギブコ社製）にて５Ｘ１０6個／ｍｌとなる
ように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０5個のマウス胸腺細
胞を含有する９６穴平底プレート（コーニング社製）に
１００μｌずつ分注した。１日、２日、３日、６日後に
培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを含む培地（ＨＡＴ培地）と交換し、以後３日ごとに
同様の操作を繰り返した。融合より約２週間後、融合し
た細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた各穴の培養上
清について、ＩＬ−６への結合活性を有していた穴に含
まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン化し
た。更にそれぞれのハイブリドーマクローンの培養上清
中のＩＬ−６への結合活性を測定して、抗ＩＬ−６抗体
産生ハイブリドーマを得た。更に、得られた抗ＩＬ−６
抗体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下の方
法にてＩＬ−６の作用の抑制能を調べた。１０％牛胎児
血清を含むRPMI1640培地にて２００ｐｇ／ｍｌに調製し
たヒトリコンビナントＩＬ−６溶液を１穴あたり５０μ
ｌずつ９６穴平底マイクロプレートに分注して、サンプ
ルの培養上清を５０μｌ加え、３７℃、３０分間インキ
ュベートした。更に、１０％牛胎児血清を含むRPMI1640
培地にて１Ｘ１０5個／ｍｌの濃度となるように懸濁し
たＭＨ６０細胞液を１穴あたり１００μｌずつ加えて、
５％ＣＯ2存在下３７℃にて３日間培養した。最後の６
時間は１μＣｉの3Ｈ−チミジン（デュポン社製）を加
えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性量をシンチ
レーシンカウンター（パッカード社製）にて測定するこ
とにより、培養上清によるＩＬ−６の作用を抑制する活
性を調べた。このような方法にてＩＬ−６に対する抗体
を産生するハイブリドーマを調製した。こうして得られ
たハイブリドーマとしてＨＨ６１−１０がある（特開平
3-61496号公報参照）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】実施例５（Ｖ領域のみからなる抗体生産菌
より、生産物の取得） 得られた形質転換株 E. Coli pFv(HH61-10)-DE/HB101
（FERM P-13366）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む２ｘＹＴ［１．６％トリプトン、１％酵母エキス、
（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐＨ７．０］５ｍ
ｌ中で３７℃一晩生育させた。ついで、その培養懸濁液
５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培地（０．６％
Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０５％NaCl、
０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、０．００１４
７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２％カザミノ
酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プロリン、
０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて３時間培
養した。その後、２５μｇ／ｍｌとなるように3-インド
ールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０
時間誘導培養した。この一部の菌体懸濁液を位相差顕微
鏡により約１５００倍にて観察すると、大腸菌体内の顆
粒形成が認められた。続いて上記の如く培養した菌体懸
濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、５０ｍｌの３０ｍ
ＭNaClを含む２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．
５）を添加し、懸濁後、０．５ＭEDTA（ｐＨ８．０）で
１ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたリゾチーム溶液１
２．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて１時間放
置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６０００ｒ
ｐｍ、５分間の遠心分離で顆粒を回収した。この顆粒を
６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、目的ペプチド濃度が１
００μｇ／ｍｌ、及び３．５Ｍ塩酸グアニジン溶液とな
るように調製した後、これに酸化型グルタチオン３μＭ
と還元型グルタチオン３０μＭとなるように添加し、ｐ
Ｈ８．０で室温で１０〜１６時間放置した。次に、１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析を行い粗精
製ペプチドを得た。次に、粗精製ペプチドを、あらかじ
め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡化したＳ
−セファロースカラム（ファルマシア社製）にかけ結合
させ、５０ｍＭNaClを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）にて溶出後、ＰＢＳに対して透析する事により
目的とするペプチドを得た。本物質はＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により、その分子量は実施例６に
従って推定されたアミノ酸配列から計算された値とそれ
ぞれほぼ一致し、また、プロテインシークエンサーにて
Ｎ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、予想されたア
ミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加した配列を有す
ることが確認された。
より、生産物の取得） 得られた形質転換株 E. Coli pFv(HH61-10)-DE/HB101
（FERM P-13366）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む２ｘＹＴ［１．６％トリプトン、１％酵母エキス、
（以上バクト社製）、０．５％NaOH、ｐＨ７．０］５ｍ
ｌ中で３７℃一晩生育させた。ついで、その培養懸濁液
５ｍｌを１００ｍｌのＭ９−カザミノ酸培地（０．６％
Na2HPO4・12H2O、０．３％KH2PO4、０．０５％NaCl、
０．１％NH4Cl、０．０５％MgSO4・7H20、０．００１４
７％CaCl2、０．２％グルコース、０．２％カザミノ
酸、０．０２％L-ロイシン、０．０２％L-プロリン、
０．０００２％チアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン、ｐＨ６．９）へ接種し、３７℃にて３時間培
養した。その後、２５μｇ／ｍｌとなるように3-インド
ールアクリル酸（IAA）を添加し、更に３７℃にて２０
時間誘導培養した。この一部の菌体懸濁液を位相差顕微
鏡により約１５００倍にて観察すると、大腸菌体内の顆
粒形成が認められた。続いて上記の如く培養した菌体懸
濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、５０ｍｌの３０ｍ
ＭNaClを含む２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．
５）を添加し、懸濁後、０．５ＭEDTA（ｐＨ８．０）で
１ｍｇ／ｍｌになるように溶かしたリゾチーム溶液１
２．５ｍｌを添加し、攪はんした後、氷中にて１時間放
置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊し、６０００ｒ
ｐｍ、５分間の遠心分離で顆粒を回収した。この顆粒を
６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、目的ペプチド濃度が１
００μｇ／ｍｌ、及び３．５Ｍ塩酸グアニジン溶液とな
るように調製した後、これに酸化型グルタチオン３μＭ
と還元型グルタチオン３０μＭとなるように添加し、ｐ
Ｈ８．０で室温で１０〜１６時間放置した。次に、１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析を行い粗精
製ペプチドを得た。次に、粗精製ペプチドを、あらかじ
め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡化したＳ
−セファロースカラム（ファルマシア社製）にかけ結合
させ、５０ｍＭNaClを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）にて溶出後、ＰＢＳに対して透析する事により
目的とするペプチドを得た。本物質はＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により、その分子量は実施例６に
従って推定されたアミノ酸配列から計算された値とそれ
ぞれほぼ一致し、また、プロテインシークエンサーにて
Ｎ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、予想されたア
ミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが付加した配列を有す
ることが確認された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ 8214−4Ｂ
Claims (14)
- 【請求項１】 ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６受容体への
結合を阻害する活性を有するペプチド。 - 【請求項２】 ペプチドが抗ヒトＩＬ−６抗体のＨ鎖可
変領域及びＬ鎖可変領域をペプチドリンカーにより結合
してなる請求項１記載のペプチド。 - 【請求項３】 ペプチドが配列番号１記載のアミノ酸配
列を有する請求項２記載のペプチド。 - 【請求項４】 ペプチドが配列番号１記載のアミノ酸配
列のＮ末端Ｍｅｔが除かれたペプチドである請求項２記
載のペプチド。 - 【請求項５】 ペプチドが（１）配列番号１記載のアミ
ノ酸配列の一部を削除、（２）配列番号１記載のアミノ
酸配列の一部を他のアミノ酸に置換、（３）配列番号１
記載のアミノ酸配列にアミノ酸もしくはペプチドを付
加、または（４）配列番号１記載のアミノ酸配列の一部
をアセチル化、アミド化もしくはポリエチレングリコー
ル付加したものである請求項２記載のペプチド。 - 【請求項６】 請求項１ないし５記載のペプチドを含有
するＩＬ−６作用抑制剤。 - 【請求項７】 請求項１ないし５記載のペプチドを含有
する抗炎症薬。 - 【請求項８】 請求項１ないし５記載のペプチドを含有
する免疫抑制剤または自己免疫疾患治療薬。 - 【請求項９】 請求項１ないし５記載のペプチドをコー
ドする遺伝子。 - 【請求項１０】 遺伝子が配列表の配列番号１記載のＤ
ＮＡ配列を有する請求項９記載の遺伝子。 - 【請求項１１】 請求項９または１０記載の遺伝子を有
するプラスミド。 - 【請求項１２】 請求項１１記載のプラスミドを有する
形質転換体。 - 【請求項１３】 形質転換体が大腸菌である請求項１２
記載の形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１２または１３記載の形質転換
体を培養することにより、請求項１ないし５記載のペプ
チドを生産させ、該ペプチドを取得することを特徴とす
る該ペプチドの製造方法。
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