JP5733986B2 - 細胞の付着、培養、及び剥離のための方法、表面改質されたプレート、並びに組成物 - Google Patents

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本願は、２００８年２月２１日出願の米国特許仮出願第６１／０３０，５４４号に優先権を主張するものである。

本発明は、哺乳動物細胞の培養の分野に関するものであり、少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であり、フィーダー細胞層を欠き、吸着層を欠く固体基質表面への細胞の付着、該基質上での細胞の培養、及び該基質からの細胞の剥離のための方法並びに組成物を提供するものである。本発明の一実施形態では、細胞をＲｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物で処理する。別の実施形態では、細胞をＲｈｏ活性の阻害能を有する化合物で処理する。

哺乳動物細胞の培養は、生命及び健康科学における多くの操作の１つである。足場依存性細胞（anchorage-dependent cells）を用いた哺乳動物細胞の培養及び分析用の容器は、容器の表面に細胞を付着させるために更なる表面処理を頻繁に必要とする、ガラス又は例えばポリスチレンのようなポリマーからしばしば形成されている。こうした処理では、例えば、吸着、グラフト、又はプラズマ重合法によって表面に吸着層を与える場合がある。また、こうした表面処理は、容器表面自体の化学改質によって行ってもよく、これは例えば、大気コロナ放電、高周波真空プラズマ、直流グロー放電、及びマイクロ波プラズマ処理によって行うことができる。これらの表面処理は、表面の元素の組成及び化学基を変化させるものである。結果として得られる特定の化学的性質は、表面処理の方法、エネルギー、及び時間、並びに使用されるガスの組成に依存する。

例えば米国特許第５４４９３８３号は、バルクポリマー材料と、細胞増力を支持するのに適した薄いポリマー層とを有する基質であって、細胞を付着させるためのアミド基を与えるプラズマ重合されたアミドモノマーを含む再配向耐性ポリマーを含み、前記アミドモノマーが、ジメチルホルムアミド、及び式Ｒ¹−ＣＯ−Ｎ（Ｒ²）Ｒ³（式中、Ｒ¹は、それぞれ場合により、ハロゲン原子又は水酸基によって置換されてよい脂肪族、脂環族、又は芳香族基であり、Ｒ²及びＲ³は、それぞれ独立して水素又はアルキル基である）を有するアミドからなる群から選択され、前記薄いポリマー層が前記細胞の付着及び増殖を促進するような基質を開示している。

別の例として、欧州特許公開第ＥＰ０３４８９６９Ａ１号は、窒素を含むガス状物質から生成されたプラズマとポリマー表面を接触させることによって前記ポリマー表面が表面アミノ基を有するように改質する工程と、前記改質された表面に充分な内皮細胞を適用することによって細胞を増殖させる必要なく前記アミノ基含有表面上に細胞のコンフルエントな層を形成する工程と、を含む、ポリマー表面を内皮細胞で被覆するための方法を開示している。

別の例として、欧州特許公開第ＥＰ００９２３０２Ａ２号は、基質上の培地中の培養細胞の増殖に影響を与えるための方法であって、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、ハロゲン、又はこれらの元素のいずれかの化合物から生成されたプラズマに基質の表面を曝露することによって基質の表面の化学的性質を改変することを特徴とする方法を開示している。

別の例として、米国特許第６，６１７，１５２Ｂ２号は、ポリマー基質表面を処理するための装置であって、（ａ）ガス吸気口、マイクロ波エネルギー源、及び、ガス吸気口及びマイクロ波エネルギー源の両方と流体連通したプラズマ混合室を備え、（ｂ）外側処理室の内部に収容され、前記外側処理室と流体連通した開口部を有する内側処理室を有する２室処理領域を備え、（ｃ）前記プラズマ混合室は小孔によって前記外側処理室と流体連通しており、（ｄ）前記外側室に取り付けられた真空排気線を備え、（ｅ）前記内側処理室の前記開口部は前記小孔と整列され、前記小孔から所定の距離だけ離間している装置を開示している。

一例として、米国特許出願公開第２００３／０１８０９０３Ａ１号は、作業表面であって該表面上で細胞を培養することが可能であり、化学分析用電子顕微鏡法によって測定した約５０オングストロームの深さにおける該表面の酸素含有量が少なくとも２５％であるような作業表面を有するポリマー基質を開示している。

一例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００６１１４０９８号は、外科インプラント用の微小構造化生体適合性材料、及び細胞案内組織培養表面を開示している。生体材料表面の微小構造は、未分化のＥＳ細胞の増殖を促進するか、ＥＳ細胞の神経分化を促進するか、又はＥＳ細胞の分化を促進するように選択される。

別の例として、Ｂｉｇｄｅｌｉら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３３：１４６〜１５３，２００８）は、ヒトＥＳ細胞を、無フィーダー細胞条件下で分化させることなく、かつ細胞外マトリクスタンパク質によって固体基質表面を前処理することなく培養されるように適合及び／又は選択する方法であって、（ｉ）ヒト２倍体胚性肺線維芽細胞で調整した培地から新生児軟骨細胞で調整した培地に培地を変え、（ｉｉ）次いでマウス胚性フィーダー細胞層からＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理プレートへ、次いでＣｏｓｔａｒ（商標）プレートへ、最終的にＰｒｉｍａｒｉａ（商標）プレートへと細胞を酵素的に継代し、（ｉｉｉ）最初に使用した培地に再び変えることを行う方法について述べている。この方法を行ったヒトＥＳ細胞では確立された細胞株はほとんど得られず、この方法ではヒトＥＳ細胞を培養条件によって選択していることを示唆している。

表面自体の元素の組成及び化学基を変化させるような表面処理によって、多くの種類の哺乳動物細胞を培養するためのポリマー固体基質を調製することが首尾よく行われている。しかしながら、例えば多能性幹細胞及びヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞のような特定の種類の哺乳動物細胞を用いた場合に付着性及び／又は培養性が低いという点で大きな制約がある。

Ｇｒａｈａｍら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２，１９７７）は、細胞株ＨＥＫ２９３の生成について開示している。

ＨＥＫ２９３細胞の付着性は、ＨＥＫ２９３細胞を培養容器に加えるのに先立って、例えば細胞外マトリクスタンパク質、ポリリシン、ポリオルニチン、又はポリエチレンイミンを用いて固体基質表面上に吸着層を設けることによって高めることができる。しかしながら、こうした吸着層の調製には時間がかかり、通常得られるのは、剥き出しの固体基質よりも保存寿命が短い無滅菌固体基質である。したがって、吸着層を欠いた固体基質に対するＨＥＫ２９３細胞の付着性を高めるための方法及び材料が強く求められている。

現在用いられている多能性幹細胞、特に胚性幹（ＥＳ）細胞の培養法は、例えば胚性幹細胞を固体基質表面上でフィーダー細胞層とともに培養する、又は固体基質表面上で細胞外マトリクスタンパク質の吸着層とともに培養するといった複雑な培養条件を必要とする。これらの方法を用いた培養系では、培養される幹細胞の生物種とは異なる種から得られたフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質（異種材料）をしばしば用いる。フィーダー細胞に接触させることで得られる培地、すなわち未分化のＥＳ細胞以外の細胞で調整した培地を使用してＥＳ細胞を培養することが可能であり、培地に動物血清を添加してもよい。

例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９〜４０４，２０００）及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７，１９９８）は、マウス胚性繊維芽細胞のフィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からのＥＳ細胞株の培養について開示している。

別の例では、Ｘｕら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：９７１〜９７４，２００１）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体基質表面を処理するためのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）及びラミニンの使用について開示している。

別の例では、Ｖａｌｌｉｅｒら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８：４４９５〜４５０９，２００５）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体基質表面を処理するためのウシ胎児血清の使用について開示している。

別の例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて作製される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と呼ばれる分化かつ不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって調整される。」と述べている。

別の例として、Ｗａｎａｔａｂｅら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：６８１〜６８６，２００７）は、「ＲＯＣＫ阻害剤は、解離したヒト胚性幹細胞を生存させる」と述べており、解離誘導性アポトーシスの低下によりクローニング効率が高くなる（約１％から約２７％へと）こと、及び、フィーダー細胞としてマウス胚性線維芽細胞を、細胞外マトリクスタンパク質としてコラーゲン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を、及びＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２すなわちＦａｓｕｄｉｌを使用することにより、遺伝子導入後のサブクローニングが促進されることを示している。更に、Ｙ−２７６３２で処理した解離ヒトＥＳ細胞は、無血清懸濁培養中でアポトーシスから保護された。

別の例として、Ｐｅｅｒａｎｉら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２６：４７４４〜４７５５，２００７）は、「ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養の空間的構造の複雑さにより、ｈＥＳＣの運命に影響する異成分からなる微小環境（ニッチ）が形成される。この研究により、ｈＥＳＣ分化の速度及び道筋を、ｈＥＳＣのニッチの性質を操作することによって制御することが可能であることが示された。ニッチのサイズ及び組成によって、分化誘導因子と分化阻害因子とのバランスが調節される。機構的には、ｈＥＳＣとｈＥＳＣ由来の胚体外内胚葉（ＥｘＥ）とのアンタゴニスト相互作用によってＳｍａｄ１によるシグナル伝達のニッチサイズに依存した空間的勾配が生ずる。こうした相互作用は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）のＥｘＥによる、及びそのアンタゴニストである増殖分化因子３（ＧＤＦ３）のｈＥＣＳによる局所的分泌によって媒介される。ＧＤＦ３、ＢＭＰ２及びＳｍａｄ１に対し低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡによる処理、及びＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤による処理を行ったｈＥＳＣのマイクロパターニングによって、Ｓｍａｄ１活性化の独立した制御により、ｈＥＳＣのコロニーサイズ依存性分化が防御されることが示された。我々の結果は、ｈＥＳＣの自己複製及び分化の空間的情報の集積、及びニッチサイズ依存性制御におけるＳｍａｄ１の役割を初めて示したものである。」と述べている。

別の例として、Ｋｏｙａｎａｇｉら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ ７（出版に先立ち電子出版））は、「Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼは、神経細胞などの多くのタイプの細胞のアポトーシスにおいて関連が示唆されているが、その作用機序は完全には理解されていない。今回、我々は胚性幹細胞由来の神経前駆細胞を移植した際のアポトーシスにおけるＲｈｏ及びＲＯＣＫの役割を調べた。我々は、神経前駆細胞の解離によってＲｈｏが活性化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。Ｒｈｏ阻害剤であるＣ３菌体外酵素、及び／又はＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２による処理によって解離誘導性アポトーシス（アノイキス）が２０〜３０％減少した。アポトーシスの初期の形態的兆候である膜泡形成、カスパーゼ３の開裂、及びミトコンドリアからのシトクロムｃの放出もＲＯＣＫの阻害によってやはり低減した。これらの結果は、神経前駆細胞の解離によって、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路を介して少なくとも部分的に媒介される内在的な細胞死の経路が誘導されることを示唆するものである。更に、動物移植モデルにおいて、Ｒｈｏ及び／又はＲＯＣＫの阻害によって移植細胞の急性アポトーシスが抑制された。移植後、移植片の周辺において腫瘍壊死因子α及びプロ神経成長因子の強い発現が認められた。ＲＯＣＫの阻害により、これらの炎症性サイトカインによって昂進するアポトーシスが抑制される。以上を総合すると、これらの結果は、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫによるシグナル伝達の阻害によって細胞置換療法における移植細胞の生存率が向上しうることを示している。」と述べている。

別の例として、Ｙｏｎｅｄａら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７０：４４３〜４５３，Ａｕｇｕｓｔ ３，２００５）は、「相同的な哺乳動物のＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ１及び２）は、主としてキナーゼコンストラクトの過剰発現に基づき、機能的に重複しているものと考えられる。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの下流のエフェクターであるこれらのＲｈｏキナーゼの主要な基質はミオシン軽鎖及びミオシンホスファターゼである。いずれのキナーゼもマイクロフィラメント束の組織化及び平滑筋の収縮性に関与していることが示されている。これに関して、フィブロネクチンに対する線維芽細胞の接着の分析により、ＲＯＣＫ２の方がより多く存在するもののその活性は常にＲＯＣＫ１よりも低いことが示された。ｓｉＲＮＡによるＲＯＣＫ１の特異的抑制により、持続性のＲＯＣＫ２及びグアニン三リン酸結合ＲｈｏＡの存在にも関わらずストレスファイバー及び接着斑が消失する。これに対し、微小線維細胞骨格はＲＯＣＫ２の発現低下によって増強された。フィブロネクチンコーティングしたビーズの食細胞による取り込みは、ＲＯＣＫ２欠損細胞では顕著に低下したがＲＯＣＫ１の欠損細胞では低下しなかった。これらの効果は、ＲＯＣＫのプレクストリン相同ドメインの顕著な脂質結合選択性に一部起因するものである。ＲＯＣＫ２はホスファチジルイノシトール−３，４，５−Ｐ₃に結合し、その濃度に感受性を示した。これはＲＯＣＫ１には見られない性質である。したがって、内因性のＲＯＣＫは、それぞれ調節のされ方が異なり、異なるミオシン部分に関与している。」と述べている。

別の例として、Ｈａｒｂら（ＰｌｏＳ ＯＮＥ ３（８）：ｅ３００１．ｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３００１，Ａｕｇｕｓｔ ２００８）は、マウス及びヒトＥＳ細胞の両方における基本的な細胞間情報伝達の調節におけるＲｈｏ−ＲＯＣＫ−ミオシン信号伝達軸の基本的な役割について開示しており、ヒト多能性幹細胞の医学的に適合した異種成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）環境での［ｓｉｃ］（[sic]）を進歩させるうえで寄与するものである。

異種成分含有材料の使用は、多能性幹細胞を用いる特定の用途では不適当な場合がある。代替的な材料を使用することが可能である。例えば、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：８９５〜９０２，２００５）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体基質表面を処理するためのヒト血清の使用について開示している。

代替的な培養システムでは、ＥＳ細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用する。

例えばＣｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０；１９ Ｏｃｔ ２００５）は、ＥＳ細胞の自己複製を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非条件血清置換培地中でＥＳ細胞を維持する無フィーダー細胞、無血清培地システムを開示している。

別の例として、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、繊維芽細胞又は条件培地の非存在下で、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を添加した培地を使用してヒトＥＳ細胞を長期間培養する方法を開示している。

別の例として、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１種類のトランスフェリン又はトランスフェリン代用物質、少なくとも１種類のインスリン又はインスリン代用物質を含有する培地中で幹細胞を培養することを含む、無血清、無フィーダー線維芽細胞の合成培地中でヒトＥＳ細胞を培養するための方法であって、その培地は、哺乳動物胎児血清を基本的に含有せず、ＦＧＦシグナル伝達受容体を活性化することが可能な少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含有し、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層以外の供給源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は条件培地なしで未分化状態の幹細胞の増殖を支持するようなものである方法を開示している。

別の例として、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液中、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。与えられた培養中、この特定の培地は、基本培地、並びに実質的に未分化の始原幹細胞の増殖を支持するうえで必要とされる塩基性ＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸のそれぞれの所定量を含有する。

別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態において、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで有効な低浸透圧、低内毒素の基本培地を含む、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地が提供される。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで有効な栄養血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の細胞外マトリクス成分からなる群より選択される基質と組み合わされる。この培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を更に含む。」と述べている。

別の例として、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様において、本発明は霊長類胚性幹細胞の培養方法を提供する。基本的に哺乳動物胎児血清を含まない（基本的にいかなる動物血清も含まないことが好ましい）培養液中で、線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給された線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい形態において、以前に幹細胞培養液の支持に必要であった繊維芽細胞フィーダー層は、十分な繊維芽細胞増殖因子を加えることにより不必要となっている。」と述べている。

別の例として、国際特許出願公開ＷＯ２００５０６５３５４号は、ａ．基本培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量の塩基性線維芽細胞増殖因子、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量のインスリン、及び、ｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量のアスコルビン酸を含む、基本的に無フィーダーかつ無血清の合成等張培地を開示している。

別の例として、国際特許出願公開ＷＯ２００５０８６８４５は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、幹細胞を、細胞を未分化の状態に維持するうえで充分な量のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリータンパク質の１つ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の１つ、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るうえで充分な時間暴露することを含む方法を開示している。

多能性幹細胞は、研究及び薬剤スクリーニングの潜在的供給源を与えるものである。現在のところ、ヒトＥＳ細胞株の大規模培養には問題が多く、大きな課題を与えるものである。これらの課題に対する可能な解決策の１つは、ヒトＥＳ細胞を単一細胞として継代及び培養することである。単一細胞は、例えば細胞数測定、トランスフェクションなどの標準的な組織培養法により適合している。

例えばＮｉｃｏｌａｓらは、レンチウイルスベクターによる遺伝子改変の後、蛍光活性化細胞選別法（fluorescence-activated cell sorting）によって単離された単一細胞からヒトＥＳ細胞株を生成及び増殖させるための方法を提供している（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１６：１０９〜１１８，２００７）。

別の例として、米国特許出願第２００５１５８８５２号は、「単一のヒト胚性幹細胞の増殖及び生存を向上させるための方法を開示している。この方法は、単一の未分化ｈＥＳ細胞を得る工程と、単一の未分化細胞を細胞外マトリクスと混合して細胞を包囲する工程と、混合物を増殖環境中で栄養培地とともにフィーダー細胞上に接種する工程とを含む。」
別の例として、Ｓｉｄｈｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１５：６１〜６９，２００６）は、フローサイトメトリーによる単一細胞調製物の選別によって親細胞株ｈＥＳ３から誘導された３つのヒトＥＳ細胞クローンｈＥＳ３．１、３．２、及び３．３について最初に報告している。

しかしながら、ヒトＥＳ細胞の単一細胞としての継代及び培養は、遺伝子的異常及び多能性の喪失につながる。培養条件は多能性及び遺伝子の安定性の維持に重要である。一般に、ヒトＥＳ細胞株の継代は人の手で行うか、あるいはコラゲナーゼ、リベラーゼ、又はジスパーゼなどの酵素剤を使用して行われる。

例えば、Ｄｒａｐｅｒらは、「３系統の独立したヒト胚性幹細胞株において５回の独立した場合に１７ｑ染色体が獲得される核型の変化」の存在について述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３〜５４，２００４）。

別の例として、Ｂｕｚｚａｒｄらは、「我々はこれまでに１つの核型変化の事象を検出したに過ぎない．．．我々の方法が他の多くのグループが使用した方法とは明らかに異なっていることを考えると、使用した培養方法が我々の結果になんらかの影響を与えた可能性がある。通常、我々は７日後のヒトＥＳ細胞を、折れたピペットの角で最初にコロニーを壊すことによって継代する．．．この方法では細胞を解離させるために酵素的又は化学的な方法を一切用いない。我々は、このことが我々のｈＥＳ（ヒトＥＳ）細胞が比較的細胞遺伝学的な回復力が高かったことを説明するのではないかと考えている。」と述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３８１〜３８２，２００４）。

別の例として、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａらは、「大量継代法は．．．培養中で長期の継代の後、異数体の細胞集団を永続させうるものであるが、核型に支障をきたすことなくより短期間（少なくとも継代数１５まで）で使用することも可能である．．．人の手による継代法のみによって得られるよりも大量のｈＥＳ細胞を必要とする実験では、人の手による継代条件下で長期の継代の後、限られた大量継代を行ってｈＥＳ細胞の正常な核型を維持することが可能かもしれない。」と述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１９〜２０，２００５）。

別の例として、Ｈｅｎｇらは、「これらの結果により、第２のプロトコール（トリプシン処理をして静かにピペット攪拌）は、第１のプロトコール（コラゲナーゼ処理をして掻き落とす）よりも細胞の生存率に対する悪影響は大幅に低いことが示された。これは、ひいてはより高い凍結解凍後の生存率に結びついた。」と述べている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：３３〜３７，２００７）。

別の例として、Ｈａｓｅｇａｗａらは、「我々は完全な解離に耐えうるｈＥＳＣ亜系統を確立した。これらの細胞は、高い再プレーティング効率、更に高いクローニング効率を示し、三胚葉への分化能を維持している。」と述べている（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：２６４９〜２６６０，２００６）。

したがって、細胞の多能性を維持しつつフィーダー細胞及び吸着層の非存在下で多能性幹細胞の培養を行う、哺乳動物細胞の培養のための方法及び組成物が強く求められている。

一実施形態では、本発明は、少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であり、フィーダー細胞層を欠き、かつ吸着層を欠く固体基質表面への細胞の付着、該基質上での細胞の培養、及び該基質からの細胞の剥離のための方法並びに組成物を提供する。

一実施形態では、本発明は、少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であり、フィーダー細胞層を欠き、かつ吸着層を欠く表面への細胞の付着を促進するための方法であって、
ａ．細胞の懸濁液を得る工程と、
ｂ．細胞の懸濁液を、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物、及びＲｈｏ活性の阻害能を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１つの化合物で処理する工程と、
ｃ．細胞の懸濁液を表面に加えて細胞を付着させる工程と、を含む方法を提供する。

一実施形態では、表面に細胞が付着した後に細胞が培養中で維持される。別の実施形態では、少なくとも１つの化合物は除去される。

一実施形態では、細胞は、少なくとも１つの化合物を除去することにより表面から剥離される。

一実施形態では、細胞の懸濁液は細胞塊の懸濁液である。別の実施形態では、細胞の懸濁液は単一細胞の懸濁液である。

一実施形態では、細胞は多能性幹細胞である。別の実施形態では、細胞は幹細胞である。

一実施形態では、本発明は、少なくとも約０．９％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が２２．３％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であり、フィーダー細胞層を欠き、かつ吸着層を欠く表面への細胞の付着を促進するための方法であって、
ａ．細胞の懸濁液を得る工程と、
ｂ．細胞の懸濁液を表面に加えて細胞を付着させる工程と、を含む方法を提供する。

表面改質されたプレート２、３又は４上でリベラーゼにより細胞塊として２回継代したヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞の位相差顕微鏡写真（４ｘ）。希釈率１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプレート、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）プレート上で培養したヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞の画像も示す。 ヒトＥＳ細胞の表面改質プレートへの付着に対する１０μＭのＹ−２７６３２の影響を示す図。図は、表面改質プレート３及び４上で細胞塊として２回継代したヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞の位相差顕微鏡写真（４ｘ）を示す。次いで細胞を１０μＭのＹ−２７６３２を含むＭＥＦ条件培地中、表面改質プレート２、３又は４上に継代した。細胞は写真の撮影前に４日間培養した。Ｙ−２７６３２の非存在下で培養した細胞をコントロールとした。 本発明の表面改質プレート上で培養したヒトＥＳ細胞に対する化合物処理の時間的経過を示す概略図。ヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞を、表面改質したプレート３又は４上でリベラーゼ処理により細胞塊として４回継代し、ＭＥＦ条件培地中で培養した。細胞は、継代後の最初の２日間１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、又は０．５ｎｇ／ｍＬのＲｈｏ阻害剤である菌体外酵素Ｃ３トランスフェラーゼの細胞透過性の形態のいずれかで処理した。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２で処理した後、各継代後の最初の２日間表面改質プレート３上でＹ−２７６３２により処理した細胞を「７ｓ」と呼ぶものとする。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２で処理した後、各継代後の最初の２日間表面改質プレート４上でＹ−２７６３２により処理した細胞を「３ｓ」と呼ぶものとする。Ｒｈｏ阻害剤で２日間処理した後、各継代後の２日間Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２で処理し、その後、継代後の最初の２日間表面改質プレート３上でＹ−２７６３２により処理した細胞を「５ｓ」と呼ぶものとする。Ｒｈｏ阻害剤で２日間処理した後、各継代後の２日間Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２で処理し、その後、継代後の最初の２日間表面改質プレート４上でＹ−２７６３２により処理した細胞を「１ｓ」と呼ぶものとする。 ｑＲＴ−ＰＣＲによって調べた、図６に概要を示すプロトコールにしたがって処理したヒトＥＳ細胞における多能性及び分化に関連したマーカーの発現を示す図。 継代数４（ｐ４）、継代数９（ｐ９）、及び再び継代数１０、１１、又は１２（ｐ１２、ｐ１１又はｐ１２）においてフローサイトメトリーによって調べた、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞の多能性マーカーの発現を示す図。 表面改質プレート４上でリベラーゼ処理により細胞塊として連続的に継代し、ＭＥＦ条件培地中で培養したヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞の免疫蛍光画像。多能性のマーカーに関連したタンパク質の発現が、表面改質プレート４で１１回継代培養した細胞において検出された。細胞は各継代後２日間、１０μＭのＹ−２７６３２で処理した。 表面改質プレート上で培養後のヒトＥＳ細胞の胚体内胚葉を形成する能力を示す図。ヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞を、表面改質プレート３又は４上でリベラーゼ処理によって細胞塊として１１回継代し、ＭＥＦ条件培地中で培養した。継代数８（ｐ８）及び再度継代数１０又は１１（ｐ１０〜１１）において、０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で細胞を２日間処理した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で更に３日間処理した。グラフのＹ軸は、フローサイトメトリーによって得られたＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を示す。表５も参照されたい。 表面改質プレート上で培養後のヒトＥＳ細胞の膵臓内胚葉を形成する能力を示す図。ヒトＥＳ細胞株Ｈ１の細胞を、表面改質したプレート３又は４上でリベラーゼ処理により細胞塊として８回継代し、ＭＥＦ条件培地中で培養した。継代数８（ｐ８）において、細胞を０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で２日間処理した後、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で更に３日間処理することにより、胚体内胚葉へと分化させた。次いで細胞を２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０、及び１μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で４日間処理することにより胚前腸へと更に分化させた。次いで細胞を１％Ｂ−２７、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０，１μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ及び２μＭのレチノイン酸を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で４日間処理することにより膵臓内胚葉へと分化させた。細胞を免疫蛍光法によりＰＤＸ−１（緑）及びＥ−カドヘリン（赤）について染色し、全細胞数をＨｏｅｃｈｓｔ色素（青）により調べた。 表面改質プレート上で培養したヒトＥＳ細胞の胚様体形成能を示す図。 表面改質プレート４上で培養したヒトＥＳ細胞の核型を示す図。 ヒトＥＳ細胞の表面改質プレートへの付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＹ−２７６３２、Ｓｉｇｍａより販売されるＹ−２７６３２、ファスジル、及びヒドロキシファスジル）による処理の影響を示す図。細胞は、図に示す化合物を図に示す濃度で含む培地で３日間培養した。細胞をクリスタルバイオレットで染色し、画像を撮影した。 ヒトＥＳ細胞の表面改質プレートへの付着に対するＹ−２７６３２の用量反応を示す図。異なる濃度のＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を初日に図に示す濃度（０、１、２、４又は１０μＭのＹ−２７６３２）で各培養に加えた。次いで細胞を２日目以降、１０μＭのＹ−２７６３２を含む培地中で培地を毎日交換しながら５日間維持した。５日目にプレートから培地を除去し、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色して画像を撮影した。 １０μＭのＹ−２７６３２を添加した場合と添加しない場合における、表面改質プレート２、３、又は４上への継代４日後のヒトＥＳ細胞のコロニーの形成を示す図。 １０μＭのＹ−２７６３２を添加した場合と添加しない場合における、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理プレート上への継代４日後のヒトＥＳ細胞のコロニーの形成を示す図。 ヒトＥＳ細胞をＹ−２７６３２で継続的に処理した場合と断続的に処理した場合とにおける、表面改質プレートへの細胞の付着の差異を示す図。 単一細胞として継代され、１０μＭのＹ−２７６３２を含む（Ｂ）又は含まない（Ａ）ＭＥＦ条件培地中、表面改質プレート３上に播種したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の画像。画像は播種の２４時間後に撮影したものである。 ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて単一細胞として５回継代し、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｙ）を加えるか又は加えない表面改質プレート３及び４上に播種したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の多能性に関連したマーカーの発現を示す図。各多能性マーカーをＸ軸上に示し、陽性細胞の比率をＹ軸上に示す。 単一細胞として継代し、表面改質プレート３及び４上に播種したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の全細胞数を示す図。細胞数に対する１０μＭのＹ−２７６３２（Ｙ）の影響をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で継代した細胞で調べ（ナイーブ＝Ｎ）、細胞を表面改質プレート上で１０回継代した（馴化＝Ａ）。異なる細胞条件をＸ軸上に示し、細胞数を１０⁴で割った値をＹ軸に示す。 実験に先立ってＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理したプレート上で単一細胞として継代したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の増殖速度を示す図。細胞は、１０⁴／ｃｍ²で播種し、表面改質プレート３及び４上で１０μＭのＹ−２７６３２を加えるか又は加えないＭＥＦ条件培地中で培養した。Ｙ軸は、播種の２、３、又は４日後に回収された細胞数（１０⁴で割った値）を示す。 実験に先立って表面改質プレート上で単一細胞として１０回継代したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の増殖速度を示す図。細胞は、１０⁴／ｃｍ²で播種し、表面改質プレート３及び４上で１０μＭのＹ−２７６３２を加えるか又は加えないＭＥＦ条件培地中で培養した。Ｙ軸は、播種の２、３、又は４日後に回収された細胞数（１０⁴で割った値）を示す。 単一細胞として継代し、９６ウェル形式の表面改質プレート２〜４及び１３上に播種したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の画像。ＭＥＦ条件培地は１０μＭのＹ−２７６３２を含有するものを用いた。画像は播種の４８時間後に撮影したものである。 単一細胞として継代し、表面改質プレート３及び４上に播種したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の胚体内胚葉への分化能を示す図。胚体内胚葉の形成の程度をフローサイトメトリーによってＣＸＣＲの発現を測定することによって求めた。胚体内胚葉の形成に対する１０μＭのＹ−２７６３２の影響を調べた。細胞を増殖に際してＹ−２７６３２で処理した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で増殖及び分化させた細胞をコントロールとした。Ｙ軸は、フローサイトメトリーによって得られたＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を示す。 単一細胞として継代し、表面改質プレート３及び４上に播種したヒトＥＳ細胞株Ｈ９からの細胞の膵臓内胚葉への分化能を示す図。細胞は表面改質プレート上に播種し、１０μＭのＹ−２７６３２を含むＭＥＦ条件培地中で培養し、分化に先立って表面改質プレート上で８回継代した。Ｙ軸は、後部前腸ステージ（ＰＦ）及びホルモン発現内分泌細胞ステージ（ＥＮ）におけるｑ−ＰＣＲによる膵臓分化マーカーの発現（Ｎｇｎ３、Ｐｄｘ１、インスリン）の増加倍率を示す。 表面改質プレートへのヒトＥＳ細胞の付着を示す図。継代数５０のヒトＥＳ細胞Ｈ９を表面３及び４、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）上に希釈率１：２で播種した。播種２４時間後にプレートから培地を除去し、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色して画像を撮影した。矢印はコロニーを示している。 表面改質プレートへのヒトＥＳ細胞の付着を示す図。継代数５０のヒトＥＳ細胞Ｈ９を、異なる濃度のＹ−２７６３２の存在下（０、１、２、４、１０及び２０μＭ）で、表面３及び４、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）上に希釈率１：２で播種した。播種２４時間後にプレートから培地を除去し、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色して画像を撮影した。コロニーはウェル上の暗色のスポットである。矢印を用いて非処理ウェル上のコロニーを示している。 ヒトＥＳ細胞の表面改質プレートへの付着を示す図。継代数５３のヒトＥＳ細胞Ｈ９を、Ｙ−２７６３２の非存在下又は存在下（０又は２０μＭ）で、表面２〜４及び１３、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）上に希釈率１：３で播種した。播種４８時間後にプレートから培地を除去し、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色して画像を撮影した。コロニーはウェル上の暗色のスポットである。矢印を用いて非処理ウェル上のコロニーを示している。 表面改質プレート１４及び１５にヒトＨ９ＥＳ細胞を付着させる第１の試み（１０月）及び第２の試み（１２月）、並びに表面改質プレート１４及び１５にヒトＨ１ＥＳ細胞を付着させる１つの試みを示す図。継代数４２及び継代数５３のＨ９ヒトＥＳ細胞並びに継代数５７のＨ１ヒトＥＳ細胞を、２０μＭのＹ−２７６３２の存在下で改質された表面に希釈率１：２又は１：３で播種した。播種２４〜４８時間後にプレートから培地を除去し、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色して画像を撮影した。コロニーはウェル上の暗色のスポットである。矢印を用いてプレート上のコロニーを示している。 合成培地ｍＴｅＳＲ（商標）中でのヒトＥＳ細胞の表面改質プレート４への付着を示す図。継代数５０のＨ９ヒトＥＳ細胞を、非処理の、又はタンパク質（０．１％ゼラチン、２％ＢＳＡ、０．３４ｍｇ／ｍＬラットコラーゲンＩ、１：１０００に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又は１：５０００に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標））で処理したウェル中で、Ｙ−２７６３２の非存在下又は存在下（０又は２０μＭ）で改質された表面に希釈率１：２で播種した。播種４８時間後にプレートから培地を除去し、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色して画像を撮影した。コロニーはウェル上の暗色のスポットである。 静的固着液滴法（static sessile drop method）を用いて１１週間にわたって測定した表面改質プレートの水接触角を示す図。最初の測定は、表面処理及び滅菌の１週間後に行った。各データ点は、平均接触角（７個の液滴のそれぞれについて１回測定したもの）を表わす。Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）プレート上での接触角を、表面１〜４及び１３と同じ実験条件下で測定したが、表面処理及び滅菌は最初の測定の１２週間よりも前に行った（Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）^*は最初の測定の１週間前に滅菌した）。 正に帯電したクリスタルバイオレットと各表面の反応性として測定した表面改質プレート上の負電荷の密度を示す図。各表面の３つの試料を試験し、各試料から脱着されたクリスタルバイオレット上で吸光度の測定を３重に行った。９個の測定値の平均及び標準偏差を示す。 化学合成無血清Ｐｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ（商標）培地（Ａ）、又は１０％ウシ胎児血清を添加したＥＭＥＭ培地（Ｂ）中でＨＥＫ２９３細胞の付着及び増殖に対する固体基質表面及びＹ−２７６３２の影響を示す図。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面、又は表面４を有する９６ウェルプレートに播種した。これらの表面に付着したＨＥＫ２９３細胞の数を、培養条件及びＹ−２７６３２の濃度の関数として示す。細胞には、（ｉ）Ｙ−２７６３２を加えた培養中で９６時間の一定の処理（Ｙ−２７６３２ ９６時間オン）、又は（ｉｉ）Ｙ−２７６３２を加えた培養中で４８時間の一定の処理の後、培地を交換し、Ｙ−２７６３２を加えない培養中で４８時間の処理（Ｙ−２７６３２ ４８時間オン／４８時間オフ）のいずれかを行った。培地にＹ−２７６３２を加えずに培養したＨＥＫ２９３細胞（Ｙ−２７６３２なし）は、Ｙ−２７６３２を加えて培養した細胞と同様にして扱った（培地を交換せずに９６時間、又は４８時間後に培地を交換）。Ｙ−２７６３２は、２．０及び５．０μＭの濃度で加えられた場合に表面４及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面上へのＨＥＫ２９３細胞の付着を促進した。４８時間のインキュベーションの後にＹ−２７６３２を除去すると、表面４及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面から相当数の細胞が剥離した。３つの測定値の平均及び標準偏差を示す。 １０％ウシ胎児血清を添加したＥＭＥＭ培地中でのＨＥＫ２９３細胞の増殖に対する各固体基質表面並びにＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２の影響を示す図。ＨＥＫ２９３細胞は、表面４（Ａ）又は非処理（ただしγ線（２５ｋＧｙ）照射した）ポリスチレン表面（Ｂ）のいずれかを有するマルチディッシュ２４ウェルプレートに播種した。 ＨＥＫ２９３細胞の付着及び形態に対するＨ−１１５２及び表面４の影響を示す図。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清及びＨ−１１５２を添加したＥＭＥＭ培地中、マルチディッシュ１２ウェルプレートに播種し、自動インキュベーター内顕微鏡（automated, in-incubator microscope）内で６７時間インキュベートした。Ａの増殖曲線及びＢの顕微鏡写真は、表面４上へのＨＥＫ２９３細胞の付着及び増殖に対するＨ−１１５２の一般的影響、並びにＨ−１１５２の存在下又は非存在下における表面４上へのＨＥＫ２９３細胞の付着及び形態に対する培地の交換の影響を示す。 ２．５μＭのＹ−２７６３２の非存在下又は存在下で表面４及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面上で増殖させたＨＥＫ２９３細胞の継代数３にわたる増殖曲線を示す図。１０％ウシ胎児血清を添加したＥＭＥＭ培地中のＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理によって３回継代した。 表面改質プレート４、１８及び１９、並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を示す図。ウェルＡ及びＢはすべての表面上でコントロールウェルである。ウェルＣ及びＤは１０μＭのＹ−２７６３２を含有している。ウェルＥ及びＦは３μＭのＨ１１５２−グリシルを含有している。ウェルＧ及びＨは１０μＭのＨ１１５２−グリシルを含有している。 表面改質プレート３０へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を示す図。（−−）＝非処理。（ＲＩ）＝３μＭのＨ１１５２−グリシル。（ＭＧ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬの吸着層。（ＭＧ＋ＲＩ）＝希釈率１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ＋３μＭのＨ１１５２−グリシルの吸着層。 表面改質プレート３１へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を示す図。（−−）＝非処理。（ＲＩ）＝３μＭのＨ１１５２−グリシル。（ＭＧ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬの吸着層。（ＭＧ＋ＲＩ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ＋３μＭのＨ１１５２−グリシルの吸着層。 表面改質プレート３２へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を示す図。（−−）＝非処理。（ＲＩ）＝３μＭのＨ１１５２−グリシル。（ＭＧ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬの吸着層。（ＭＧ＋ＲＩ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ＋３μＭのＨ１１５２−グリシルの吸着層。 表面改質プレート３３へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を示す図。（−−）＝非処理。（ＲＩ）＝３μＭのＨ１１５２−グリシル。（ＭＧ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬの吸着層。（ＭＧ＋ＲＩ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ＋３μＭのＨ１１５２−グリシルの吸着層。 表面改質プレート３４へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を示す図。（−−）＝非処理。（ＲＩ）＝３μＭのＨ１１５２−グリシル。（ＭＧ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬの吸着層。（ＭＧ＋ＲＩ）＝希釈率１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬ＋３μＭのＨ１１５２−グリシルの吸着層。 静的固着液滴法を用いて４０週間にわたって測定した表面改質プレートの水接触角を示す図。 静的固着液滴法を用いた表面改質プレートの水接触角を示す図。 正に帯電したクリスタルバイオレットと各表面の反応性として測定した表面改質プレート上の負電荷の密度を示す図。 正に帯電したクリスタルバイオレットとの各表面の反応性として測定した表面改質プレート４、２２〜２４及び２９上の負電荷の密度を示す図。各表面の３つの試料を試験し、各試料から脱着されたクリスタルバイオレット上で吸光度の測定を３重に行った。表面４、２２〜２４及び２９の負電荷の密度はＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面の負電荷の密度に対して標準化した。９個の測定値の平均及び標準偏差を示す。

開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、発明の詳細な説明を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は図示する下記の小項目に分ける。

用語の定義
本明細書で言うところの「吸着層」とは、共有結合（グラフトとしても知られる）又は非共有結合（吸着としても知られる）によって固体基質の表面上に分子を付着させることによって表面上に形成された層を指して言う。吸着層の形成に用いられる分子は、例えば細胞外マトリクスタンパク質、アミノ酸などを含むタンパク性分子、及び例えばポリエチレンイミンなどの非生体分子であってよい。

「β細胞系統」とは、転写因子ＰＤＸ−１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の内の少なくとも１つの遺伝子発現が陽性の細胞を指して言う。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、β細胞が挙げられる。

本明細書で言うところの「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ−４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で言うところの「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で言うところの「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１αの内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系統の細胞が挙げられる。

本明細書で言うところの「胚体内胚葉」とは、原腸胚形成時に胚盤葉上層から生ずる細胞の特徴を有し、消化管及びその派生器官を形成する細胞を指して言う。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわちＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、ケルベロス（Cerberus）、ＯＴＸ２、グースコイド（goosecoid）、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１を発現する。

「細胞外マトリクスタンパク質」とは、身体又は胎盤の細胞間に通常見られるタンパク性分子を指して言う。細胞外マトリクスタンパク質は、組織、例えば血液などの体液、又は非組み換え細胞若しくは組み換え細胞若しくは細菌によって調整した培地に由来するものを用いることができる。

本明細書で言うところの「胚体外内胚葉」とは、以下のマーカー、すなわちＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣの内の少なくとも１つを発現する細胞の集団を指して言う。

「ＨＥＫ２９３細胞」とは、Ｇｒａｈａｍら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２，１９７７）によって述べられるような正常なヒト胚性腎細胞の培養の形質転換によって生ずる細胞株、及びこの親細胞株から誘導されるすべての細胞を指して言う。

本明細書で言うところの「マーカー」とは、対象とする細胞で発現の仕方が異なる核酸又はポリペプチド分子である。ここで言う異なる発現の仕方とは、陽性のマーカーでは発現レベルの上昇を、陰性のマーカーでは発現レベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

本明細書で言うところの「マトリクス」とは、細胞が付着することができる３次元的な支持構造を指して言う。

本明細書で言うところの「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ−１７、ＧＡＴＡ−６の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。

本明細書で言うところの「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指して言う。

本明細書で言うところの「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。

本明細書で言うところの「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＮｏｄａｌ、又はＦＧＦ−８の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。

本明細書で言うところの「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわちブラキュリ（Brachiury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ−４の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。

本明細書で言うところの「表面」とは、細胞の培養又は分析に使用することを目的とした固体基質容器又はマトリクスの分子の最外層を指して言う。表面の元素組成、粗さ、及び濡れ性は、それぞれ、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、及び接触角測定によって分析することができる。

「表面改質プレート」とは、実施例１６、１７及び２６に述べられる表面１〜３４のいずれか１つを有する容器、又はＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）、及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）の商品名で販売されている表面を有するプレートを指して言う。容器は、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、又はスチレンアクリロニトリルコポリマー（ＳＡＮ）などのポリマーで形成することができる。

幹細胞とは、単一の細胞レベルで自己複製し、かつ、自己複製性の前駆細胞、非自己複製性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような前駆細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から異なる細胞系統の機能性細胞へとインビトロで分化する能力、並びに、移植後に複数の胚葉の組織を生ずる能力、及び胚盤胞への注入後にすべての組織とまではいかないにしてもほぼ大部分の組織に分化する能力によっても特徴付けられる。

幹細胞は、発生上の能力によって、（ｉ）すべての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する分化全能性、（ｉｉ）すべての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する分化万能性、（ｉｉｉ）細胞系統のサブセットを生ずる能力を有するが、それらがすべて特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分であるすべての細胞型及び要素（例、血小板）を含む子孫細胞を生じうる）、（ｉｖ）多能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生ずる能力を有することを意味する分化寡能性、及び（ｖ）単一の細胞系統（例、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する分化単一性に分類される。

分化とは、特化していない（「分化決定していない」）か又は完全には特化していない細胞が、例えば神経細胞や筋細胞のような特化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞、又は分化誘導された細胞とは、細胞のその系統内においてより特化した（「分化決定した」）位置を占めるものである。分化のプロセスについて用いられる場合、「分化決定した」なる用語は、通常の条件下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットにまで分化し続けるが、通常の条件下では異なる細胞型には分化できず、分化のより未熟な細胞型にも戻ることができない点にまで分化経路を進んだ細胞のことを指して言う。脱分化とは、細胞が、細胞の系統においてより特化（又は分化決定）していない位置にまで戻るプロセスのことを指して言う。本明細書で言うところの細胞の系統とは、その細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から生じたものであり、どのような細胞を生じうるか、ということを定義するものである。ある細胞の系統とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定していない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。

培養中の細胞を述べるために様々な用語が用いられる。「維持」とは、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下で増殖培地中に入れられた細胞のことを一般に指して言うものであり、より大きな細胞集団が形成される場合もそうでない場合もある。「継代」とは、１つの培養容器から細胞を取り出して、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下でこれらの細胞を第２の培養容器に入れるプロセスのことを指して言う。

特定の細胞集団又は細胞株は、しばしば継代された回数によって呼称されるか特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養の後、細胞は２次培養（Ｐ１又は継代数１）と称される。２回目の継代培養の後では細胞は３次培養（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者であれば、継代期間中に集団は何度も倍加しうるものであり、したがってある培養の集団倍加の回数は継代数よりも大きいことは理解されるであろう。各継代間の期間における細胞の増殖（すなわち集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、培養条件、及び継代間の時間等を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。

一実施形態では、本発明は、少なくとも約０．９％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が２２．３％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であり、フィーダー細胞層を欠き、かつ吸着層を欠く表面への細胞の付着を促進するための方法であって、
ａ．細胞の懸濁液を得る工程と、
ｂ．細胞の懸濁液を表面に加えて細胞を付着させる工程と、を含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であり、フィーダー細胞層を欠き、かつ吸着層を欠く表面への細胞の付着を促進するための方法であって、
ａ．細胞の懸濁液を得る工程と、
ｂ．細胞の懸濁液を、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物、及びＲｈｏ活性の阻害能を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１つの化合物で処理する工程と、
ｃ．細胞の懸濁液を表面に加えて細胞を付着させる工程と、を含む方法を提供する。

一実施形態では、細胞の懸濁液は細胞塊の懸濁液である。別の実施形態では、細胞の懸濁液は単一細胞の懸濁液である。

一実施形態では、細胞は多能性幹細胞である。別の実施形態では、細胞は幹細胞である。

一実施形態では、表面は吸着層を有する。一実施形態では、吸着層は、例えば基底膜由来のもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成しうるものなどの細胞外マトリクス成分である。一実施形態では、吸着層はＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で形成される。ＭＡＴＲＩＧＥＬは、室温でゲル化して再構成された基底膜を形成するＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞から調製される可溶性製剤である。このタンパク性吸着層は、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などを単独で又は異なる組み合わせとして用いて形成することもできる。

一実施形態では、表面に細胞が付着した後に細胞が培養中で維持される。別の実施形態では、少なくとも１つの化合物は表面に細胞が付着した後に除去される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１つの化合物を除去することにより表面から剥離される。

一実施形態では、細胞の懸濁液は、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物で処理される。別の実施形態では、細胞の懸濁液は、Ｒｈｏ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物で処理される。別の実施形態では、細胞の懸濁液は、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物、及びＲｈｏ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物で処理される。

Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、Ｙ−２７６３２、ファスジル、及びヒドロキシファスジルからなる群から選択される。

一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、Ｙ−２７６３２である。

Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、約１０μＭの濃度で使用される。

一実施形態では、Ｒｈｏ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ阻害剤である。

一実施形態では、Ｒｈｏ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、菌体外酵素Ｃ３トランスフェラーゼである。

Ｒｈｏ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、Ｒｈｏ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、約０．５μｇ／ｍＬの濃度で使用される。

表面改質プレート
本発明における使用に適した表面改質プレートは、その表面が少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であるように改質された容器であってよい。また、例えばこの表面は細胞が付着できる多孔質の足場のような３次元のマトリクスであってもよい。

一実施形態では、表面改質プレートは、その表面が少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であるプレートを含む。別の実施形態では、表面改質プレートは、その表面が少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１９．５％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、本明細書で表面改質プレート１と呼ぶ、その表面が少なくとも約１．３％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約２４．９％であり、接触角が少なくとも約２０．７°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、本明細書で表面改質プレート２と呼ぶ、その表面が少なくとも約１．７％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約２９．６％であり、接触角が少なくとも約１４．３°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、本明細書で表面改質プレート３と呼ぶ、その表面が少なくとも約２．０％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約３０．７％であり、接触角が少なくとも約１８．４°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、本明細書で表面改質プレート４と呼ぶ、その表面が少なくとも約２．１％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約３０．２％であり、接触角が少なくとも約１７．４°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、本明細書で表面改質プレート１３と呼ぶ、その表面が少なくとも約１．８％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約２８．２％であり、接触角が少なくとも約１８．８°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、ＣＥＬＬＢＩＮＤの商品名で販売される、その表面が少なくとも約１．０％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約２７．８％であり、接触角が少なくとも約４４．３°であるプレートを含む。

一実施形態では、表面改質プレートは、ＰＲＩＭＡＲＩＡの商品名で販売される、その表面が少なくとも約１０．２％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が少なくとも約２３．０％であり、接触角が少なくとも約３９．５°であるプレートを含む。

表面改質プレートの特性評価
一実施形態では、表面改質プレートの表面の元素組成は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって分析することができる。ＸＰＳは、化学分析用電子分光法（Electron Spectroscopy for Chemical Analysis（ＥＳＣＡ））としても知られ、固体基質の表面にどのような元素又は原子が存在するかを調べ（水素及びヘリウムを除き、０．１原子％未満の濃度のすべての元素を検出可能）、こうした元素又は原子の結合環境を調べるための方法として用いられる。一例として、ポリスチレン（炭素と水素のみを含む）固体試料のＸＰＳ分析により、通常、９７％よりも多い炭素、３％未満の酸素、及び０％の窒素という結果が得られる（水素は検出されない。例えば放射線照射による滅菌の結果として表面のポリスチレン鎖の酸化のために異なる濃度の酸素が検出されうる。）（Ｂｒｅｖｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６：３０３９〜３０５３，２００５；Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｈｏｒｂｅｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５７：３３６〜３４５，２００１）。

一実施形態では、表面改質プレートの表面の粗さを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって分析することができる。ＡＦＭによって表面の原子又は分子を横方向の解像度１オングストローム、縦方向の解像度０．１オングストロームにまで画像化することが可能である。

一実施形態では、表面改質プレートの表面の濡れ性を接触角を測定することによって分析することができる。例えば、静的固着液滴法による接触角測定により、固体基質の表面と液体との間の相互作用についての情報が与えられる。接触角は、固体基質の表面上に静止している液滴の形状を定義するものであり、液体、固体及び気体が出会う接触線において液体内部で測定される、固体基質の表面上の液体の接触角である。水接触角が９０°よりも大きい表面は疎水性であるとされ、水接触角が９０°よりも小さい表面は親水性であるとされる。親水性が極めて高い表面、すなわち水に親和性が高い表面上では、水滴は完全に拡がる（有効接触角＝０°）。

一実施形態では、表面改質プレートの負電荷密度を、表面とクリスタルバイオレットとの反応性を測定することによって分析することができる。クリスタルバイオレットは正電荷を有し、これにより負に帯電した分子及び分子の部分、例えばポリマー表面上に存在する負に帯電した官能基に結合することができる。クリスタルバイオレット反応性が高い表面は、クリスタルバイオレット反応性が低い表面と比較した場合、これらの表面が同じ粗さ、したがって面積を有するものと仮定すると、負電荷の密度が高い。

多能性幹細胞
多能性幹細胞の特性評価
多能性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上、及びＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現しうる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるＯｃｔ−４及びＴＥＲＴを通常更に発現している。

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３胚葉からの細胞型の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。また、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３胚葉に関連したマーカーの存在について評価することによって調べることもできる。

増殖させた多能性幹細胞系は、標準的なＧバンド法を用いて核型を決定し、対応する霊長類種の公表されている核型と比較することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましい。これは、細胞が、ヒトの染色体がすべて揃っていてかつ目立った変化のない正倍数体であることを意味する。

多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞等）、胚性組織、胎児組織等の、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒトＥＳ細胞又はヒト胚性生殖細胞の株化細胞系がある。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から得られる細胞も、フィーダー細胞の存在下で既に培養された多能性幹細胞集団と同様、好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）等の変異型ヒトＥＳ細胞株も好適である。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７））によって開示される細胞のような成人ヒト体細胞から誘導される細胞も好適である。

一実施形態では、ヒトＥＳ細胞をＴｈｏｍｓｏｎらによって述べられるように調製する（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）。

多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞を、本発明の方法にしたがって培養するのに先立って、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質の層上で培養する。例えば、多能性幹細胞を、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するフィーダー細胞層上で培養する。フィーダー細胞層上での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、（ｉ）フィーダー細胞層を含んだ培養容器を得て、（ｉｉ）別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は、例えば無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地を用いることで支持される。

別の例では、多能性幹細胞を、基本的にフィーダー細胞を含まないにも関わらず、多能性幹細胞を大きく分化させることなくその増殖を支持する培養システム中で培養する。無フィーダー細胞培養中での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、（ｉ）１以上の細胞外マトリクスタンパク質を有する固体基質表面上の吸着層、及び（ｉｉ）別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は、例えば無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地を用いることで支持される。

別の実施形態では、多能性幹細胞を、別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は、例えば無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地中、少なくとも約０．５％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９°である表面改質プレート上で培養する。

培地：本発明における使用に適した細胞培地の一例を、米国特許出願公開第２００２００７２１１７号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許第６６４２０４８号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許出願公開第２００７００１００１１号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０；１９ Ｏｃｔ ２００５）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許第６８００４８０号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０６５３５４号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０８６８４５号に見出すことができる。

好適な培地は、以下の成分、すなわち例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＬ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．７５２２；ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９等から調製することもできる。

多能性幹細胞の分化
本発明の一実施形態では、多能性幹細胞をその多能性を維持しつつ培養中で増殖させる。細胞の多能性の時間による変化を、多能性に関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって調べることができる。また、多能性の変化を、分化に関連したマーカー又は別の細胞型に関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって監視することもできる。

別の実施形態では、多能性幹細胞を培養中で増殖させた後、別の細胞型への分化を促進するように処理する。他の細胞型は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。また、細胞型は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。また、細胞型は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。

本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、当該術分野における任意の適当な方法によって他の様々な細胞型に分化させることができる。

例えば、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化させることができる。

例えば、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、国際特許出願公開第ＷＯ２００７０３０８７０号に開示される方法にしたがって神経前駆細胞及び心筋細胞に分化させることができる。

別の例では、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号に開示される方法にしたがって肝細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１，２００５に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２，２００４に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８，２００７に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ−８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ−４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ−１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。

多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法により膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１αからなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを発現することが可能である。膵臓内分泌系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。

本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６の内の少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。

本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１）
ヒト胚性幹細胞の細胞塊としての継代及び維持
ヒトＥＳ細胞株Ｈ１及びＨ９をマイトマイシンＣで不活化した初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で最初に維持した。このヒトＥＳ細胞をＭＥＦフィーダーからＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に切り換えて繰り返し継代を行った。

Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）による表面の処理：増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を４℃で解凍した後、冷たいＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に１：３０に希釈した。表面を覆うだけの充分な量を６ｃｍ径の培養皿（２ｍＬ）のそれぞれ、又は６ウェルプレートのウェルのそれぞれ（１ｍＬ）に加え、室温で１時間培養した。処理表面は数時間以内に使用するか、最大で２週間４℃で保存した。

ヒトＥＳ細胞の培養：未分化のヒトＥＳ細胞のコロニー（Ｈ９又はＨ１株からのもの）を、ＤＭＥＦ／Ｆ１２中、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で１０分間インキュベートした後、ピペットで掻き落とすことによってフィーダー層から採取した。細胞の凝集塊を６００×ｇで４分間遠心することでペレット化し、得られたペレットを２ｍＬのピペットで静かに分散させてコロニーを細胞の小さな塊に壊した。これらの細胞塊を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理した培養皿上に、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＣＭ）で調整し更にｂＦＧＦ（８ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を添加した培地中に、６ｃｍ径の培養皿１個当たり５ｍＬの増殖培地中５０〜１５０個のコロニーとなるように播種した。培地は毎日交換した。ＭＥＦ−ＣＭ中のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上のコロニーは大きくなり、約３〜４日毎にコロニーが表面積の７０〜８０％を占めた時点で継代した。コロニー中のヒトＥＳ細胞は、細胞質に対する核の比が大きく、フィーダー上で維持したヒトＥＳ細胞と同様、著明な核小体を有していた（図１）。分化した細胞は培養中の全細胞の５％未満であった。

ＭＥＦ−ＣＭ中の細胞のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上での通常の継代には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えた１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ中で細胞を最大で６０分間インキュベートし、掻き落としながらＤＭＥＭ／Ｆ１２の強制的な流れによって培養皿から剥離した。細胞をペレット化し、分散して１：３又は１：４の比で播種した。

（実施例２）
ヒト胚性幹細胞の単一細胞としての継代
細胞株Ｈ９のヒトＥＳ細胞をＬｉｆｅＳｃａｎ Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願ＬＦＳ５１６３ＵＳＰＳＰに開示される方法にしたがって単一細胞として増殖させた。細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで３７℃で５分間処理することによって継代し、基質表面１ｃｍ²当たり１０，０００個の細胞となるように播種した。

（実施例３）
細胞外マトリクスタンパク質／成分及びフィーダー細胞を欠いた表面改質プレートを用いたヒト胚性幹細胞の付着、培養及び多能性の維持
継代数４９の細胞株Ｈ１のヒトＥＳ細胞を、実験前に希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）プレート上でＭＥＦ調整培地中に維持した。細胞を１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ解離処理、又は手による掻き落としによって継代のために表面から解離させた。

次いでこれらの細胞を表面改質プレート（６ウェル形式）の２個の非処理ウェル上に播種した。更に、各プレートの１個のウェルをコントロールとして０．１％の異種成分不含ヒトゼラチンで処理した。更に細胞を、ネガティブコントロールとしてＣｏｓｔａｒ（商標）（カタログ番号３５１６、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）（カタログ番号３５１１４６、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）（カタログ番号１４０６７５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）６ウェルプレートの非処理及びゼラチン処理ウェル上に直接播種し、更にポジティブコントロールとして、希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したウェル上に播種した。すべての処理について、細胞はＭＥＦ調整培地中に維持した。

我々は、２回の継代の後、表面改質プレート２、３及び４にはＥＳ細胞のコロニーが付着し、これらは酵素による解離後に各プレートに再付着して増殖することを観察した。ゼラチン処理又は非処理のウェルでは表面改質プレート２、３、又は４と比較して付着又は増殖の速度に明らかな差は認められなかった。

希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプレートから機械的に解離させた細胞は表面改質プレート２、３、及び４に対する付着性が低かったのに対して、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼにより酵素的に解離させた細胞は表面改質プレート２、３、又は４のゼラチン又は非処理ウェルに対する付着性は高かった。

表面改質プレート１及び５〜１２、並びに非処理又はゼラチン処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）プレート、Ｆａｌｃｏｎ（商標）プレート、及びＣｏｓｔａｒ（商標）プレートに加えたＨ１ｐ４９ＥＳ細胞は付着しなかった。同じ細胞が、希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプレートには付着し、これらの細胞が基質表面に付着する能力を有していることが示された。

希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上に播種されたＨ１株のＥＳ細胞の通常の継代時間は３〜４日間であったが、表面改質プレート２、３及び４に播種した細胞は、継代が可能となるまでに７日間の培養を要した。これは、表面２、３及び４と比較してより多くの開始コロニーが播種直後にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理表面上に見られたことから、処理表面上への付着速度が低いことによるものと恐らく考えられる。

継代数（ｐ）５０の細胞を１：２の比に分割し、試料の半分をＲＮＡ精製用に回収し、多能性マーカーの発現にして試験した（表１）。各試料の残りの半分を表面改質プレート上に再播種した。この継代数（ｐ５１）で形成されたコロニーは、継代が可能となるまでにやはり７日間の培養を要した。４日間のみの培養後に形成された小さなコロニーを図１に示す。これらのコロニーは典型的なＥＳ細胞のコロニーの形態を維持していた。

表面改質プレート２、３及び４上での培養を継代数４で停止し、試料をｑＲＴ−ＰＣＲにより多能性マーカーについてアッセイし（表２）、胚体内胚葉（ＤＥ）運命に分化させた。継代数４の細胞は典型的な多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、及びＴＥＲＴの発現を維持していた。更に、これらの細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、及び０．５〜２．０％ＦＢＳを含む培地に曝露すると胚体内胚葉運命に分化し（表３）、４回の継代を通じて細胞に多能性が維持されたことが示された。

（実施例４）
細胞外マトリクスタンパク質／成分及びフィーダー細胞を欠いた表面改質プレート上でのヒト胚性幹細胞の付着、培養及び多能性の維持：Ｒｈｏ阻害及びＲｈｏキナーゼ阻害の影響
継代数４９の細胞株Ｈ１のヒトＥＳ細胞を、実験前に希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）プレート上でＭＥＦ調整培地中に維持した。細胞を１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ解離処理によって継代のために表面から解離させた。

次いでこれらの細胞を表面改質プレート（６ウェル形式）の非処理ウェル上に播種した。更に細胞を、ネガティブコントロールとしてＣｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）６ウェルプレートの非処理及びゼラチン処理ウェル上に直接播種し、更にポジティブコントロールとして、希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したウェル上に播種した。すべての処理について、細胞はＭＥＦ調整培地中に維持した。

表面改質プレート１及び５〜１２、並びに非処理又はゼラチン処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）プレート及びＣｏｓｔａｒ（商標）プレートに加えた継代数４９のＨ１株のヒトＥＳ細胞は付着しなかったが、これらの細胞は表面改質プレート２、３及び４には付着した。同じ細胞が、希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプレートには付着し、これらの細胞が基質表面に付着する能力を有していることが示された。

希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上に播種されたＨ１ＥＳ細胞の通常の継代時間は３〜４日間であったが、表面改質プレート２、３及び４に播種した細胞は、継代が可能となるまでに７日間の培養を要した。これは、表面改質プレート２、３及び４と比較してより多くの開始コロニーが播種直後にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理表面上に見られたことから、表面改質プレート上への付着速度が低いことによるものと恐らく考えられる。

継代数（ｐ）５０の細胞を１：２の比に分割し、試料の半分をＲＮＡ精製用に回収し、多能性マーカーの発現にして試験した（表１）。各試料の残りの半分を表面改質プレート上に再播種した。この継代数（ｐ５１）で形成されたコロニーは、継代が可能となるまでにやはり７日間の培養を要した。４日間のみの培養後に形成された小さなコロニーを図１に示す。これらのコロニーは典型的なＥＳ細胞のコロニーの形態を維持していた。

継代のこうした遅れのため、細胞は１：２の比で分割し、継代数４の試料の半分をＭＥＦ調整培地、又は細胞の増殖動態を向上させる目的で１０μＭの濃度のＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤であるＹ−２７６３２を添加したＭＥＦ調整培地に播種した。細胞を継代後４８時間播種した培地に維持し、新鮮な無添加のＭＥＦ調整培地に培地を変えた。

１０μＭ濃度のＹ−２７６３２を添加することにより、細胞（ｐ５２）の播種効率が大幅に高まり、コロニーの増殖率の向上が播種４日後に明らかとなった（図２）。また、コラーゲンによる解離処理に先立ってＨ１株のヒトＥＳ細胞を０．５ｎｇ／ｍＬのＲｈｏ阻害剤の細胞透過形態であるＣ３エキソトランスフェラーゼで更に処理した場合にも、細胞の播種効率が向上した。

１０μＭのＹ−２７６３２中で播種した細胞が播種４日後に継代可能となったのに対して、ＲＯＣＫ阻害剤なしで播種した細胞は播種４日後にも分割可能とはならなかった。Ｒｈｏ阻害剤であるＣ３エキソトランスフェラーゼで処理した細胞も播種４日後に継代可能とならず、細胞は線維芽細胞状の形態へとより多く分化した。したがって、継代数４でＲｈｏ阻害剤で処理した細胞をその後のすべての継代においてＹ−２７６３２で処理した（図３）。

細胞を表面改質プレート３及び４上で少なくとも１０回更に継代し、多能性に関連した以下のマーカーの存在について試験した。すなわち、遺伝子はｑＲＴ−ＰＣＲにより、細胞表面のマーカーの発現はフローサイトメトリーにより、細胞表面及び核タンパク質は免疫蛍光法により試験した（図４〜６）。細胞の多能性を、胚体内胚葉、膵臓内胚葉への分化能、及び３胚葉からなる胚葉体の形成能を試験することによって更に確認した（図７〜９）。細胞を核型の安定性について更に試験したところ、細胞が正常な核型を維持することを観察した（図１０）。

（実施例５）
Ｒｈｏキナーゼ阻害を介したヒト胚性幹細胞の付着及び剥離
継代数４０のＨ９株のヒトＥＳ細胞を、実験前に希釈率１：３０の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）プレート上でＭＥＦ調整培地中に維持した。細胞を１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ解離処理、又は手による掻き落としによって継代のために表面から解離させた。

次いでこれらの細胞を、増大する量の以下のＲｈｏキナーゼ阻害剤、すなわち、Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、又はＥＭＤ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ファスジル（Ｓｉｇｍａ）、又はヒドロキシファスジル（Ｓｉｇｍａ）の内の１つの存在下、表面改質プレート２、３、４及び１３（１２ウェル形式）上に播種し、３日間維持して毎日培地と化合物を交換した。３日目の最後に培地を除去し、プレートをクリスタルバイオレット（０．５％水溶液）で染色してコロニーを可視化した。

３日目までに、増大する量のＲｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で表面改質プレート２、３、４及び１３にＥＳ細胞コロニーが付着したことを観察した。Ｙ−２７６３２（１０μＭ）の使用により最良の結果が得られたが、一部のコロニーはＲｈｏキナーゼ阻害剤であるファスジル及びヒドロキシファスジルを用いた場合に付着及び増殖が認められた（図１１）。

我々は、培養の初日に細胞を広範囲のプレーティング濃度のＹ−２７６３２で処理することによって細胞の結合を促進するＹ−２７６３２の最適用量の決定を試みた。初日の培養の後、細胞を１０μＭ濃度のＹ−２７６３２でその後の日に処理した。我々は、ＥＳ細胞の付着及び増殖を刺激する最大濃度は１０μＭであることを観察し（図１２）、これが表面改質プレート２、３、４、１３及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上で起こることを観察した。

細胞をＹ−２７６３２の単回投与により連続的に処理した場合の付着及び増殖に対する影響についても試験を行った。細胞に０、１、４、又は１０μＭのＹ−２７６３２を４日間にわたって与えた。非処理（０μＭ）の表面改質プレート上でもある程度の結合が認められたがＥＳ細胞の付着及び増殖を刺激する最適濃度は表面改質プレート２、３、４、１３上で１０μＭのＹ−２７６３２であった（表４）。

ＲＯＣＫ阻害剤の添加により、非処理細胞に対して表面改質プレート２、３及び４上における播種及び増殖動態が大幅に促進された（図１３）ことから、これが適正な細胞付着の維持によるものか、あるいは細胞増殖の増大によるものかを調べることにした。我々は、Ｙ−２７６３２で処理した細胞が非処理細胞と同様の密度で増殖したことから、Ｒｈｏキナーゼ阻害により細胞増殖が増大しないことを観察した（図１４）。代わりに、Ｙ−２７６３２処理は表面に対する細胞の付着を維持し、通常の増殖動態で細胞を増殖させた（図１５）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で播種したＥＳ細胞の増殖培地からＲｈｏキナーゼ阻害剤を除去することにより、表面から細胞が剥離した。３胚葉系統への分化をともなう胚葉体の形成は、懸濁液中でＥＳ細胞を培養することによって行われる。したがって、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を後に再添加することにより細胞の付着性が予想されたように回復した（図１５）が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を２４時間培養から除去し、細胞を懸濁液中で２４時間剥離、増殖させ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を再添加した試料では培養ＥＳ細胞の顕著な分化が認められた。

（実施例６）
表面改質プレート上でＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓにより継代したＨ９ヒトＥＳ細胞は、Ｙ−２７６３２による接着性が向上する。

Ｈ９ヒトＥＳ細胞を表面改質プレート上に最初に継代した。連続的に１０μＭのＹ−２７６３２を加えることにより接着性が向上した。これは試験を行った４つの表面改質プレート（２、３，４、及び１３）で同様であった。表面３上に播種後２４時間のＨ９細胞の画像を図１６に示す。

（実施例７）
表面改質プレート上でＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓとともに継代したＨ９単一ヒト胚性幹細胞は多能性を維持する。

ヒトＥＳ細胞は多能性細胞であり、すべての細胞系統に分化する能力を有している。細胞の多能性状態は細胞が増殖する表面によって維持されなければならない。表面改質プレートがヒトＥＳ細胞の多能性を維持できるか否かを調べるため、ヒトＥＳ細胞を コラゲナーゼにより３８回継代し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｅｒｓｓにより３８回継代した後、表面改質プレート３（表面３）、表面改質プレート４（表面４）、又は希釈率１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で５回継代した。１０μＭのＹ−２７６３２を、示した試料の培地に加えた。多能性マーカーであるＴｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４の発現をフローサイトメトリーによって評価した。結果を図１７に示す。陽性細胞の比率をＹ軸上に示す。表面改質プレート３及び４上で増殖させた単一のヒトＥＳ細胞はその多能性を維持した。

（実施例８）
Ｒｈｏキナーゼ阻害は、表面改質プレート上で単一細胞として増殖させたヒト胚性幹細胞株Ｈ９からの細胞のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）からの移行時の接着及び増殖を促進する。

ヒトＥＳ細胞の接着及び細胞増殖におけるＹ−２７６３２の役割を表面改質プレートとの関連において調べた。Ｈ９ヒトＥＳ細胞をコラゲナーゼにより３８回継代し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｅｒｓｓにより５０回継代した後、表面改質プレート３又は４上に播種した（ナイーブ細胞）。また、Ｈ９ヒトＥＳ細胞をコラゲナーゼにより３８回、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｅｒｓｓにより３８回継代した後、表面改質プレート３（表面３、馴化細胞）又は表面改質プレート４（表面４、馴化細胞）上で９回継代した。細胞をＭＥＦ調整培地中に１０⁴／ｃｍ²の密度で播種し、１０μＭのＹ−２７６３２の存在下又は非存在下で２日間増殖させた。結果を図１８に示す。Ｙ−２７６３２は、表面改質プレート３及び４に対するナイーブ細胞の付着性を高めた。Ｙ−２７６３２は表面改質プレート３又は４に対する馴化細胞の付着性は高めなかった。表面改質プレート３はナイーブ細胞の付着性及び／又は増殖性を高めた。表面改質プレート４は馴化されたヒトＥＳ細胞の付着性及び／又は増殖性を高めた。細胞は全体で４日間追跡した（図１９及び２０）。ナイーブな単一細胞は、表面改質プレート３を用いて１０μＭのＹ−２７６３２の存在下で培養した場合に高い増殖速度を示し、若干の利点を示した（図１９）。馴化された単一細胞は１０μＭのＹ−２７６３２の非存在下で高い増殖速度を示した（図２０）。

（実施例９）
表面改質プレートを使用して化合物をスクリーニングすることができる。

９６ウェル型及びＳＢＳ（生体分子スクリーニング協会（Society for Biomolecular Screening））標準形式の表面改質プレートを使用して１０μＭのＹ−２７６３２の存在下で単一のヒトＥＳ細胞を増殖させることができる。９６ウェルプレートのウェルに播種されたＨ９単一細胞の画像を図２１に示す。これにより、それぞれマウス胚線維芽細胞やＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）のような中間細胞又は吸着層を用いることなく９６ウェルプレート中で化合物を直接スクリーニングすることが可能である。

（実施例１０）
表面改質プレート上で培養した単一胚性幹細胞は胚体内胚葉への分化能を有する。

目標の１つは、ヒトＥＳ細胞を異なる細胞系統に分化させることである。表面改質プレートが分化を支持できるか否かを調べるため、ヒトＥＳ細胞をコラゲナーゼにより３８回継代し、更にＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｅｒｓｓにより３８回継代した後、表面改質プレート３（表面３）又は表面改質プレート４（表面４）上で９回継代した。ポジティブコントロールとして、ヒトＥＳ細胞を希釈率１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で増殖させた。１０μＭのＹ−２７６３２を、示した細胞試料を増殖させる際に培地に加えた。細胞の増殖後、培養細胞の胚体内胚葉の形成能を評価した。簡単に述べると、７０％コンフルエンスの培養をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に加えた１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、及び０．５％のＦＢＳによって２日間処理した。この処理の後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えた１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び２％ＦＢＳによって３日間処理した。胚体内胚葉に分化した細胞をフローサイトメトリーによりＣＸＣＲ４タンパク質の発現によって識別した（図２２）。陽性細胞の比率をＹ軸上に示す。単一細胞として培養したヒトＥＳ細胞は、表面改質プレート３及び４上でＹ−２７６３２の存在下又は非存在下で胚体内胚葉へと分化した。

（実施例１１）
表面改質プレート上で培養した単一胚性幹細胞は膵臓内胚葉への分化能を有する。

胚体内胚葉プロトコールの終了後、細胞を３日間、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に加えたＦＧＦ−７（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２％ＦＢＳでインキュベートした。この時点で、増殖に際してＹ−２７６３２で処理しなかった細胞は表面改質プレート３及び４から剥離した。増殖に際してＹ−２７６３２で処理した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２に加えたＦＧＦ−７（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、レチノイン酸（１μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で更に４日間インキュベートした（後部前腸ステージ、ＰＦ）。この時間の後、細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２に加えたエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＡＰＴ（１μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及び１％Ｂ２７中で更に４日間インキュベートした。分化を膵臓内胚葉ステージ（ＥＮ）にまで継続させた。これには、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、ＩＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍＬ）、及び１％Ｂ２７を含むＣＭＲＬ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による３日間の処理を要した。ＲＮＡ試料をステージＰＦ及びＥＮにおいて表面改質プレート３及び４の１個のウェルから採取した。次いでこれらの試料をこの段階で膵臓マーカーであるＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、ＨＮＦ３ｂ、Ｐｔｆ１ａ、インスリン及びＡＦＰについてリアルタイムＰＣＲによって分析した。同じ膵臓内胚葉マーカーの評価をこのステージで繰り返し行った。同じ細胞株の非処理のヒトＥＳ細胞から得たＲＮＡ試料に、処理を行った試料と並行してリアルタイムＰＣＲを行った。処理試料は、倍率変化＝１に設定した非処理のコントロールに対して標準化した。Ｐｄｘ１及びインスリンの発現を観測し、各表面改質プレート間で比較した。

表面改質プレート３及び４上で処理した細胞において膵臓内胚葉マーカーの誘導が認められたが、発現量は表面改質プレート３上で処理した細胞においてより高かった（図２３）。増殖に際してＹ−２７６３２の存在下ではいずれの表面改質プレートも単一のヒトＥＳ細胞の後方前腸及び膵臓内胚葉への分化を支持したのに対して、増殖に際してＹ−２７６３２で処理しなかった単一細胞は後方前腸へ分化する前に剥離してしまった。

（実施例１２）
Ｈ１及びＨ９ヒトＥＳ細胞は表面改質プレートに接着し、接着性は細胞をＹ−２７６３２で処理することによって向上する。

予め１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプラスチック容器に播種し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中で増殖させた継代数４９のＨ９ヒトＥＳ細胞をリベラーゼ処理し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したか、あるいは（not otherwise）増大する濃度のＹ−２７６３２による処理又は添加をしたＭＥＦ調整培地中、表面改質プレートに播種した。我々は、表面改質プレートにＨ９ヒトＥＳ細胞を播種した２４及び４８時間後に、クリスタルバイオレットで染色した表面２〜４及び１３、並びにＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）、並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）（カタログ番号３５３８４６、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）上に小さいコロニーが認められることを観察した（図２４〜２６）。更に、Ｈ９ヒトＥＳ細胞コロニーの接着性がＹ−２７６３２を加えることによって向上し、その効果は用量反応関係を示した（図２５）。低濃度のＹ−２７６３２（１〜２μＭ）では、非処理のヒトＥＳ細胞に対するヒトＥＳ細胞の付着性の向上は最小に留まった（図２５）のに対し、高濃度のＹ−２７６３２（４〜２０μＭ）では、クリスタルバイオレット染色によって測定される表面改質プレートへのヒトＥＳ細胞の接着性は促進された（図２５及び２６）。

細胞の培地にＹ−２７６３２を加えることによるヒトＥＳ細胞の付着性の動的な調節以外に、我々はＹ−２７６３２の存在下では異なる表面改質プレートに対するヒトＥＳ細胞の接着速度が異なることを観察した。例えば、持続的なＹ−２７６３２処理の存在下であっても細胞はＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）プレートに対する接着性は低く、時間とともにＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）プレートから剥離する傾向が見られたが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２で処理した場合に細胞は表面改質プレート３、４、又は１３又はＰｒｉｍａｒｉａ（商標）に対して高い接着性を示し、より剥離しにくかった（図２５及び２６）。

（実施例１３）
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１及びＨ９からの細胞はＹ−２７６３２の存在下で表面改質プレート上に異なる速度で付着し、コロニーを形成する。

予め１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプラスチック容器に播種し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中で増殖させたＨ１及びＨ９ヒトＥＳ細胞をリベラーゼ処理し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したか、あるいは（not otherwise）２０μＭのＹ−２７６３２による処理又は添加をしたＭＥＦ調整培地中、表面改質プレートに播種した。表面改質プレート１４及び１５にＨ９ヒトＥＳ細胞を播種した４８時間後では、２０μＭのＹ−２７６３２を培地に添加した場合に小さなコロニーが観察された（付着性及びコロニー形成は実験によって変動した）（図２７）。Ｈ１ヒトＥＳ細胞もまた、２０μＭのＹ−２７６３２を添加した培地では表面１４及び１５の両方に付着してコロニーを形成し、これはＨ９ヒトＥＳ細胞で見られた結合よりも顕著であった。これらのデータは、固体基質表面上への付着性及び表面上でのコロニー形成にはヒトＥＳ細胞の株によって変動が見られることを示すものである。

（実施例１４）
合成培地を用いた表面改質プレートへのヒトＥＳ細胞の付着
継代数４９のＨ９ヒトＥＳ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）処理したプラスチック容器上で合成培地であるｍＴｅＳＲ（商標）中で２回継代した。次いで細胞をリベラーゼ処理し、ｍＴｅＳＲ（商標）培地中、表面改質プレートであるＮｕｎｃ４上に播種した。細胞は２０μＭのＹ−２７６３２の存在下又は非存在下で培地に播種した。細胞を播種する３０分前に各ウェルを異なるタンパク質（非処理、０．１％ゼラチン、２％ＢＳＡ、０．３４ｍｇ／ｍＬのラットコラーゲンＩ、１：１０００のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、又は１：５０００のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標））で更に処理することによってこれらのタンパク質がＹ−２７６３２の存在下又は非存在下で合成培地中でヒトＥＳ細胞の接着性を促進するか否かを調べた（図２８）。我々は、Ｙ−２７６３２の非存在下では、合成培地中で表面改質プレート上に播種されたヒトＥＳ細胞は、コラーゲンＩ又は１：１０００のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの細胞外マトリクスタンパク質の存在下であっても付着しないことを観察した。しかしながら、２０μＭのＹ−２７６３２を合成培地であるｍＴｅＳＲ（商標）培地に加えた場合には、ヒトＥＳ細胞は表面Ｎｕｎｃ４に接着した。更に、この接着性は非処理のウェルと、０．１％ゼラチン、２％ＢＳＡ、及び０．３４ｍｇ／ｍＬのラットコラーゲンＩで処理したウェルとで同等であった。低濃度のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（希釈率１：１０００及び１：５０００）を用いたウェルではヒトＥＳ細胞の付着性にある程度の増大が認められたが、これらの濃度のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）はＹ−２７６３２の非存在下で接着性を促進するには不充分であった。これらの結果は、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２の存在下では、ヒトＥＳ細胞を合成培地中で改質されたプラスチック基質上で培養することが可能であり、約１：１０００又は１：５０００の低濃度のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）がこの接着性を高めうることを示すものである。

（実施例１５）
フラスコ形式の表面改質プレートはヒトＥＳ細胞の付着並びに胚体内胚葉及び膵臓内胚葉への分化を促進しうる。

予め１：３０のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で処理したプラスチック容器に播種し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中で増殖させたＨ１及びＨ９ヒトＥＳ細胞をリベラーゼ処理し、改質された表面を有する異なるサイズのフラスコに１：２又は１：３の播種密度でＴ２５、Ｔ７５、Ｔ１５０、及びＴ１７５フラスコに播種した。この細胞を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び２０μＭのＹ−２７６３２を添加したＭＥＦ調整培地に播種した。この後、ヒトＥＳ細胞のコロニーを、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び２０μＭのＹ−２７６３２を添加したＭＥＦ調整培地を毎日交換しながら各プレートが約５０％コンフルエンスに達するまで増殖させた。この時点で、２％ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、及び２０μＭのＹ−２７６３２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地を変え、細胞をこの培地中に２日間、毎日培地を交換しながら維持した。３日目及び４日目に、２％ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０μＭのＹ−２７６３２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地を変えた。次いで細胞をＴｒｙｐＬＥで表面から剥離し、胚体内胚葉（ＤＥ）表面マーカーであるＣＸＣＲ４の発現についてフローサイトメトリーでアッセイした。我々は、これらの条件下でヒトＥＳ細胞がＣＸＣＲ４の陽性率が高い細胞集団（約９０％がＣＸＣＲ４＋）に分化することを観察したが、このことは細胞の大部分が胚体内胚葉に分化したことを示すものである（表５）。更に、培地からＹ−２７６３２を取り除くとプラスチックから細胞が剥離したことから、増殖時又は分化時の培養表面への細胞の付着性はＲＯＣＫ阻害の維持に依存していた。

我々は、フラスコ形式の表面改質プレート上で誘導された胚体内胚葉から膵臓内胚葉が形成されるかどうかを調べることにした。そのため、我々は、細胞をＹ−２７６３２（２０μＭ）、ＦＧＦ−７（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤシクロパミン（２．５μＭ）、及び１％Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ−Ｆ１２中で更に４日間培養した後、レチノイン酸（１μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したこの培地中で更に４日間培養することによって細胞を膵臓内胚葉ステージにまで分化させた。次いでＲＮＡ試料を採取し、膵臓マーカーであるＰｄｘ１についてリアルタイムＰＣＲにより分析した。処理試料は、倍率変化＝１に設定した非処理のコントロールに対して標準化した。我々は、これらの試料は未分化のヒトＥＳ細胞に対してＰｄｘ１のレベルが高く、分化した細胞では未分化のヒトＥＳ細胞と比較してｍＲＮＡレベルが少なくとも２５６倍高いことを観察した。

（実施例１６）
表面処理及び表面改質プレート
コロナプラズマ処理又はマイクロ波プラズマ処理を用いて射出成形された成形物を処理することによって表面改質プレートを作製した（表６）。射出成形に用いたポリマー材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリカーボネートとポリスチレンとの配合物、及び環状オレフィンコポリマーであった。これらの表面改質プレートを個別にプラスチックバッグに入れ、γ線照射（２５ｋＧｙ）によって滅菌し、最後に細胞培養又は表面の特性評価を行う実験で使用するまで室温で保存した。表面改質プレート１８、３０及び３１〜３２は、それぞれ表面改質プレート１９、３３及び３４と同じポリマー材料を用いて成形したがプラズマ処理は行わなかった。表面１４及び３１はγ線照射を行わなかった。

コロナプラズマ処理は、１個の電極のみがチャンバ内に配置されてチャンバの内部から電気的に絶縁された金属製の真空チャンバ内で行った（Ｃ−Ｌａｂ Ｐｌａｓｍａ、Ｖｅｔａｐｈｏｎｅ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。金属壁が対電極（接地）として機能する。自動調整式コロナ発生装置によって、チャンバ全体にプラズマを発生させるのに充分なエネルギーを与える電場を発生させた。処理すべき成形物はチャンバの底部に置いた。チャンバを閉鎖し、１Ｐａ（１０^-2ｍｂａｒ）の圧力にまで脱気した。この圧力で真空ポンプに通じる弁を閉鎖し、コロナ発生装置を起動した。発生装置は２０００Ｗの出力を発生するように設定した。プラズマは５〜６０秒間励起した。次いでガス吸気口（空気）を開放し、チャンバ内の圧力を大気レベルに戻した。

マイクロ波プラズマ処理は、石英真空チャンバ（表面改質プレート５〜１２に対してはモデル３００Ｅ、表面改質プレート１４及び１５に対してはモデル４４０。いずれもＴｅｃｈｎｉｃｓ Ｐｌａｓｍａ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で行った。プラズマを発生させるためのエネルギーは、チャンバ外部の２．４３ＧＨｚのマイクロ波発生装置によって供給した。処理すべき成形物はチャンバ内部のガラスプレート上に置いた。チャンバを閉鎖し、３０〜５０Ｐａ（０．３〜０．５ｍｂａｒ）の圧力にまで脱気した。真空ポンプに通じる弁は開いたままとし、ガス吸気弁によりガス（空気又は酸素）流を調節することによって圧力を所望の値に維持した。次いでマイクロ波発生装置を起動させた。発生装置は５００又は６００Ｗの出力を発生するように設定した。次いでポンプ弁を閉鎖し、空気吸入弁を開放することによってチャンバ内の圧力を大気レベルに戻した。

表６は、コロナプラズマ又はマイクロ波プラズマによって表面改質プレートの作製に用いられる出力、時間、圧力及びガスを示す。

（実施例１７）
本発明の表面改質プレートの表面の特性評価
水接触角
表面改質プレート１〜４及び１３を個別にプラスチックバッグに入れ、滅菌し、試験期間全体を通じて室温で保存した。接触角を表面処理及び滅菌１週間後に最初に測定し、図２９に示した各時点で再び測定した。すべての接触角の測定は、静的固着液滴法及びＦＩＢＲＯ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎより販売されるＰＧ−Ｘ測定ヘッド（ビデオカメラとコンピューターソフトウェア（ｖ．３．１）からなる角度計）を用いて行った。接触角の計算には接線法（tangent leaning method）を用いた。４．０μＬのＭｉｌｌｉＱ水の水滴を、自動液滴塗布装置を製造者の指示にしたがって静止モードで使用して付着させた。各水滴の接触角を１回ずつ測定した（各試料にそれぞれの時点で７滴を付着させた）。前の測定からの影響を防止するために各時点で新しい試料を使用した。Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面上での測定は、表面１〜４及び１３上での測定と同じ実験条件下で行ったが、表面処理及び滅菌は最初の測定の１２週間よりも前に行った（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）^*は最初の測定の１週間前に滅菌した）。図２９は、表面改質プレート１〜４及び１３は同様の親水性を有し、Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面よりも親水性が高い（水接触角がより小さい）ことを示している。表面改質プレート１〜４及び１３の親水性は、表面処理及び滅菌後少なくとも１２週間にわたって安定であった。

ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）は、接触角が１３．４°であるものとして以前に記載されている（標準偏差＝４°）［コーニング社技術報告書（２００５）、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標名）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標名）表面：細胞付着性を向上させるための改良表面（Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（ＣＬＳ−ＡＮ−０５７ ＲＥＶ１）ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ２．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｍｅｄｉａ／ｐｄｆ／ｔ＿ＣｅｌｌＢＩＮＤ＿Ｉｍｐｒｏｖｅｄ＿Ｓｕｒｆａｃｅ＿ＣＬＳ＿ＡＮ＿０５７．ｐｄｆ］。

負電荷密度
表面改質プレート１〜４及び１３、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）表面、Ｆａｌｃｏｎ（商標）表面、並びに非処理（ただし滅菌した）ポリスチレン表面（いずれも３ｃｍ径の培養皿形式）上の負電荷の密度を調べた。３ｍＬのクリスタルバイオレット水溶液（０．０１５％ｗ／ｖ）を各培養皿に入れ、培養皿を静かに震盪（５０ｒｐｍ）しながら室温で６０分インキュベートした。表面に結合しなかったクリスタルバイオレットを除去するため、培養皿を３ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した後、６０℃で一晩乾燥させた。表面に結合したクリスタルバイオレットは１．５ｍＬの０．１Ｍ塩酸／エタノール溶液（９９％）を加え、培養皿を静かに震盪しながら（５０ｒｐｍ）室温で２分間インキュベートすることによって脱着させた。脱着されたクリスタルバイオレットを含む塩酸／エタノール溶液の吸光度をＥｎＶｉｓｉｏｎ２１００マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて５９０ｎｍにて測定した。吸光度の値は塩酸／エタノール溶液のバックグラウンド吸光度に対して補正した。負電荷の密度を１つの表面につき３個の培養皿で測定し、吸光度の測定を各培養皿について３重に行った。

各表面改質プレートの負電荷密度を図３０に示す。表面改質プレート１〜４及び１３の負電荷密度は同様であったが、５〜６０秒の間隔のより長い表面処理時間において表面の負電荷密度はより低くなる傾向が見られた。表面１〜４及び１３はＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面及び２００７年に処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面よりも大幅に低い負電荷密度を有していた。表面１〜４及び１３は、２００５年に処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面と同レベルの負電荷密度を有し、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）表面、Ｆａｌｃｏｎ（商標）表面、及び非処理（ただし滅菌した）ポリスチレン表面よりも大幅に高い負電荷密度を有していた。２００７年に処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面よりも２００５年に処理したＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）の負電荷密度が低かったことは、表面処理したポリスチレンは時間の経過とともに負の帯電がやや弱くなることを示唆するものである。ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）の高レベルの負電荷密度は高い表面粗さ、したがって大きな表面積によるものではない（本実施例のＡＦＭ分析を参照）。

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
表面改質プレート１〜４及び１３〜１５、並びにＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面を有するプレートをＸＰＳ法を用いて分析した。各プレートから切片を切断し、これをステンレス鋼の試料ホルダー上にバネクリップにより装着することによってＸ線源に曝した。各試料にＡｌ ｋα線（１４８６ｅＶ）を照射した。試料と分析機との間の角度を４５°として分析を行った。スペクトルは機器の販売者であるＰｈｙｓｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓによって提供されるソフトウェアパッケージを使用してカーブフィットした。このソフトウェアは市販のＭａｔｌａｂ（商標）ルーチンを利用してデータ処理を行うものである。分析で使用した機器はＰｈｙｓｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓモデル５４００Ｘ腺光電子分光計である。各プレートの表面処理した部分の直径約１ｍｍの領域において最も外側の深さ２〜５ｎｍを、１つの表面につき２個のプレートのそれぞれで分析した。

原子％の単位で表わした表面の元素組成を表７に示す。表面改質プレートはすべて、炭素、酸素、及び窒素を表面に含有していた（水素はＸＰＳでは検出されない）。表面１〜４、表面１３及びＣｅｌＢＩＮＤ（商標）表面は分析を行った他の表面と比較してより多くの酸素を含有していた。表面１〜４及び表面１３〜１５はＰｒｉｍａｒｉａ（商標）よりも窒素含量は少なかったが、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）プレートの表面よりも窒素含量は多かった。酸素及び窒素レベルはより長い表面処理時間と正の相関を示し（表面１〜４及び１３）、これら両方の元素の最も高いレベルは、３０秒又は６０秒のコロナプラズマ処理を用いた場合に得られた（それぞれ表面３及び表面４）。表面３と４とは元素の組成が似ていた。表面２と１３とは元素組成が似ており、その元素組成は表面１よりも表面３及び４により近かった。

文献に見られるような化学種のピーク幅及びエネルギー位置を用いることによって表面内の炭素の結合環境を特定及び定量化するため、Ｃ１ｓスペクトルピークをカーブフィットした（カイ二乗で最もよくフィットした）（表８）。濃度は、面積％に原子濃度を掛けることによって得られる原子％の単位で表わしたものである。表面２〜４及び１３は炭素結合環境の観点から似ていた。Ｃ^*−Ｃ−Ｏ−Ｃ−Ｃ^*結合環境にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面２〜４及び１３において低かった。Ｏ−［Ｃ＝Ｏ］−Ｏ結合環境にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面２〜４及び１３において高かった。表面２〜４及び１３並びに表面１、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面、並びに／又はＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面間の類似性も確認された。Ｃ−Ｏ−Ｃ又はＣ−ＮＨ３⁺結合環境（スペクトル内の同じエネルギー位置）にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面１〜４及び１３において高かった。Ｃ−Ｏ−Ｃ^*＝Ｏ結合環境にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面２〜４、表面１３、及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面において高かった。ＣＯ₃−結合環境にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面２〜４、表面１３、及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面において高かった。Ｃ＝Ｏ結合環境にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面１〜４、表面１３、及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面において高かった。Ｃ−［Ｏ］−Ｃ結合環境にある炭素の比率は、分析を行った他の表面よりも表面１〜４、表面１３、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面、及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面において高かった。芳香族Π→Π^*遷移によりエネルギー損失ピークが生じたが、これは表面の芳香族性の指標である。

Ｏ１ｓスペクトルピークはほぼガウス分布にしたがい、カーブフィットすることはできなかった。文献に見られるような化学種のピーク幅及びエネルギー位置を用いることによって表面内の窒素の結合環境を特定及び定量化するため、Ｎ１ｓスペクトルピークをカーブフィットした（カイ二乗で最もよくフィットした）（表９）。濃度は、面積％に原子濃度を掛けることによって得られる原子％の単位で表わしたものである。Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、及びＦａｌｃｏｎ（商標）表面からのＮ１ｓシグナルは弱く、したがってこれらの表面で窒素の結合環境の特定を行うことは不可能であった。Ｎ１ｓスペクトルは表面改質プレート１〜４及び１３では区別ができず、２つの代表的なＮ１ｓスペクトルのカーブフィッティングから得られたデータを示してある。−ＮＨ₃ ⁺結合環境にある窒素の比率は、表面１４及び１５並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面よりも表面１〜４及び１３において高かった。−ＮＨ₂結合環境にある窒素は、表面１４及び１５並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面においてのみ検出された。−ＮＯ₂結合環境にある窒素は、表面１〜４及び１３、並びに表面１５の１つの試料においてのみ検出された。−ＮＯ₃結合環境にある窒素は、表面１５及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面においてのみ検出された。

ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）は、炭素７０．４％、酸素２９．０％、窒素０．６％、及び他の元素＜０．０１％の元素組成を有し、ＥＳＣＡによって分析した場合に比較的高い濃度のＣ−［Ｏ］−Ｃ、Ｃ＝Ｏ、及びＣＯＯＨ／Ｒ基を有するものとして以前に記載されている［コーニング社技術報告書（２００５）、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）表面：細胞付着性を向上させるための改良表面（Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（ＣＬＳ−ＡＮ−０５７ ＲＥＶ１）ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ２．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｍｅｄｉａ／ｐｄｆ／ｔ＿ＣｅｌｌＢＩＮＤ＿Ｉｍｐｒｏｖｅｄ＿Ｓｕｒｆａｃｅ＿ＣＬＳ＿ＡＮ＿０５７．ｐｄｆ］。

Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）は、炭素７４．６％、酸素１４．１％、窒素１１．１％及び他の元素０．２％の元素組成を有し、ＥＳＣＡによって分析した場合に主としてニトリル（Ｃ≡Ｎ）及び尿素［ＨＮ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ］の炭素−窒素結合環境を有するものとして以前に記載されている。

原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
表面改質プレート１〜４及び１３、並びにＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面を有するプレートをＡＦＭを用いて分析した。試料は、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製マルチモード原子間力顕微鏡をタッピングモードで使用して分析した。使用した先端部はタッピングモード先端部（タイプＴＥＳＰ７）である。試料は両面粘着テープで試料ディスクに取り付けた。各プレートの表面処理した部分の１０μｍ×１０μｍ及び５００ｎｍ×５００ｎｍの領域を分析した。ナノメートルの単位で表わした表面の平均粗さ（Ｒａ）及び最大高さ（Ｒｍａｘ）を表１０に示す。Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面を有するプレートと同様、表面改質プレート１〜４及び１３は比較的平滑であり、Ｒａ及びＲｍａｘは２回の走査のいずれにおいても表面処理時間との相関は見られなかった。細胞培養を目的とした非処理のポリスチレン及び酸化ポリスチレン表面、並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面の分析についてはＳｈｅｎ及びＨｏｒｂｅｔｔ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５７：３３６〜３４５，２００１）によって述べられている（３つの表面すべてで表面粗さは約４ｎｍ）。

（実施例１８）
ヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成に関連しての表面の元素組成及び接触角
表面の元素組成のＸＰＳ分析、表面接触角の測定、及びヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成実験の結果の概要を表１１に示す。

Ｒｈｏ又はＲｈｏキナーゼの阻害能を有する化合物の非存在下での固体基質へのヒトＥＳ細胞の付着及び固体基質上でのコロニー形成（１０ｃｍ²の表面につき少なくとも１５個のコロニー）は、表面改質プレート２〜４及び１３、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）プレート、並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）プレート上でのみ観察された（細胞は細胞の塊の懸濁液として各表面に供与された）。表面改質プレート２〜４及び１３は細胞の付着、コロニー形成、及び継代を支持した。約３回の継代後、細胞の形態は細胞が分化していないことを示したが、表面改質プレート２〜４及び１３上のヒトＥＳ細胞の増殖速度は自然に低下した（Ｒｈｏ阻害及びＲｈｏキナーゼ阻害の非存在下においてのみ）。更に、多能性マーカーの発現は表面３上で４回継代した細胞で維持された。ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）プレートは、ヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持したが、細胞の分化は最初の継代の前に観察された。細胞の形態観察に基づけば、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プレートは分化の兆候なしでヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持した（継代は試験しなかった）。表面の酸素（例えば表面１４に対する表面２）及び窒素（例えばＣｏｓｔａｒ（商標）に対するＰｒｉｍａｒｉａ（商標）、及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）に対する表面２及び１３）含量は、いずれも、Ｒｈｏ阻害及びＲｈｏキナーゼ阻害の非存在下でヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持する各表面の能力に影響を与えた。窒素含量が少なくとも約０．９％であり、酸素と窒素の含量の合計が少なくとも約２２．３％であり、水接触角が少なくとも約１３．９°である表面は、Ｒｈｏ阻害又はＲｈｏキナーゼ阻害の非存在下でヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持した。

Ｒｈｏ又はＲｈｏキナーゼ阻害能を有する化合物の存在下での固体基質上へのヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成（１０ｃｍ²の表面につき少なくとも１５個のコロニー）は、表面改質プレート１〜１５、表面改質プレート１９、表面改質プレート３３、表面改質プレート３４、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）上で観察された（細胞は細胞の塊の懸濁液として各表面に供与された）。我々は、ヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を促進するうえで、表面２〜４及び１３並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）が表面１、１９、３３及び３４並びにＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）よりも良好であり、表面１、１９、３３及び３４並びにＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）は更に表面５〜１２、１４及び１５よりも良好であることを認めた。表面改質プレート３及び４上でかつＲｈｏキナーゼ阻害剤の存在下では、ヒトＥＳ細胞は付着して、増殖して少なくとも１０回継代可能なコロニーを形成し、正常な核型を有する多能性細胞を生じた（核型は表面４上で増殖した細胞でのみ試験した）。表面の酸素（例えばＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）に対するＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標））及び窒素（例えばＣｏｓｔａｒ（商標）に対するＰｒｉｍａｒｉａ（商標）、及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）に対する表面２及び１３）含量は、いずれも、Ｒｈｏキナーゼ阻害の存在下でヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持する各表面の能力に影響を与えた。窒素含量が少なくとも約０．５％であり、酸素と窒素の含量の合計が少なくとも約１７．２％であり、水接触角が少なくとも約１３．９°である表面は、Ｒｈｏキナーゼ阻害の存在下でヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持した。窒素含量が少なくとも約０．５％であり、酸素と窒素の含量の合計が少なくとも約１７．３％であるが１９．９％未満であり、水接触角が少なくとも約９．４°である表面は、ある場合（表面１４）にはＲｈｏキナーゼ阻害の存在下でヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を支持し、他の場合（表面２２〜２４）には支持しなかった。

我々は、表面改質プレート４上で培養したヒトＥＳ細胞培養からＲｈｏキナーゼ阻害剤を除去すると、固体基質の表面からヒトＥＳ細胞が分離することを認めた。この後、細胞をＲｈｏキナーゼ阻害剤で再処理することによって表面に再付着させることができた。ヒトＥＳ細胞の酵素的継代は潜在的なストレス因子であって、核型の不安定性をもたらしうることを考慮すると、ヒトＥＳ細胞を継代するためにＲｈｏキナーゼ阻害剤を一時的に除去することによって酵素的継代のストレスをなくすことが可能である。

ヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を、無動物由来成分培地、Ｒｈｏキナーゼ阻害、及び表面改質プレート４を用いて更に実証した。表面改質プレート４を細胞外マトリクスタンパク質で前処理することにより、より多くのコロニーが形成されたが、これはＲｈｏキナーゼ阻害の存在下においてのみ見られた。

細胞を塊として継代することによってコロニー状態の培養条件を維持する酵素的方法によってヒトＥＳ細胞を継代する以外にも、ヒトＥＳ細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）又はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）のような酵素を使用して単一細胞として継代することも可能である。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下では、ヒトＥＳ細胞のコロニーは表面改質プレート３及び４に付着させたＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いることで単一細胞の懸濁液中に解離し、少なくとも５回継代することが可能な、多能性マーカーを有する細胞を生ずるコロニーを形成した。

単一細胞の懸濁液として継代することによって調製したヒトＥＳ細胞培養からＲｈｏキナーゼ阻害剤を除去することによって、固体基質の表面からヒトＥＳ細胞が剥離することはなかったが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を除去しなかった場合よりも増殖の速いコロニーが生じた。

（実施例１９）
Ｙ−２７６３２による処理は表面改質プレートへのＨＥＫ２９３細胞の付着を促進する。

ヒト胚性腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３、ＥＣＡＣＣ番号：８５１２０６０２）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｏｎｚａ）を含んだイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で維持した。細胞は、血清添加ＥＭＥＭ及びＰｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地を３：１、１：１、１：３、１：７及び最後に０：１の連続した比で使用して徐々に数回の継代を行うことによって、接着性ＨＥＫ２９３の培養に最適化された化学合成無血清培地であるＰｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地（Ｌｏｎｚａ）に適合させた。細胞の維持及び適合のため、ＨＥＫ２９３細胞をＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を有する７５ｃｍ²のフラスコ中に２．０×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で播種し、７０〜８０％コンフルエンスでトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離させて継代した。

１．０、４．０又は１０μＭの濃度でＹ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＰｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地（１００μｌ）を、表面４、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面、又はＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面を有する平底の９６ウェルプレート中に分配した。更に１００μｌのＰｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地をＨＥＫ細胞とともに各ウェルに加えた（４．０×１０⁴細胞／ｃｍ²）。次いで培養を空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、３７℃で（ｉ）９６時間、又は（ｉｉ）４８時間インキュベートした後、培養を２００μｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）で１回洗い、次いでＹ−２７６３２を加えない２００μｌのＰｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地を加え、最後に培養を更に４８時間インキュベートした。

次いでウェル内の生存細胞の数を、Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより販売される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性キットを使用して調べた。簡単に述べると、各ウェルをＰｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地で洗い、接着細胞を２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む１００μｌのＤＰＢＳ中で３７℃で３０分のインキュベーションの間に溶解した。溶解物及び１００μｌ触媒及び色素試薬混合物を混合し、２５℃で３０分、暗所でインキュベートした。５０μｌの１．０Ｍ塩酸を加えることによって反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｇｅｎｉｏｓ Ｐｒｏ；Ｔｅｃａｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）で測定した。これらの試料及び既知の数の細胞からのＬＤＨを含む標準溶液から得られたＡ４９０の値を用いて細胞の数を計算した。

Ｐｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地中でのＨＥＫ２９３細胞の付着及び増殖に対する各固体基質表面及びＹ−２７６３２の影響を図３１ａに示す。図中、Ｙ−２７６３２に９６時間継続的に曝露した場合を「Ｙ−２７６３２ ９６時間オン」として示し、Ｙ−２７６３２への４８時間の継続的な曝露の後、培地を換えてＹ−２７６３２の非存在下で４８時間インキュベートした場合を「Ｙ−２７６３２ ４８時間オン／４８時間オフ」として示している。Ｙ−２７６３２の非存在下では、ＨＥＫ２９３細胞は３つの表面のすべてに付着した。４８時間のインキュベーション後に培地を交換することによって、９６時間のインキュベーション後に測定された培養中の細胞の数は大幅に減少した。Ｙ−２７６３２は、２．０及び５．０μＭの濃度で加えられた場合に表面４及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面上へのＨＥＫ２９３細胞の付着を促進した。４８時間のインキュベーション後にＹ−２７６３２を除去すると３つの表面のすべてから細胞が顕著に剥離した。

１ｃｍ²当たり２．０×１０⁴個の適合していないＨＥＫ２９３細胞及び全体を通じて１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭを使用した以外は同様の実験を行った。１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭ中でのＨＥＫ２９３細胞の付着及び増殖に対する各固体基質表面及びＹ−２７６３２の影響を図３１ｂに示す。図中、Ｙ−２７６３２に９６時間継続的に曝露した場合を「Ｙ−２７６３２ ９６時間オン」として示し、Ｙ−２７６３２への４８時間の継続的な曝露の後、培地を換えてＹ−２７６３２の非存在下で４８時間インキュベートした場合を「Ｙ−２７６３２ ４８時間オン／４８時間オフ」として示している。Ｙ−２７６３２の非存在下では、ＨＥＫ２９３細胞は３つの表面のすべてに付着した。４８時間のインキュベーション後に培地を交換することによって、９６時間のインキュベーション後に測定された培養中の細胞の数は大幅に減少した。Ｙ−２７６３２は、２．０及び５．０μＭの濃度で加えられた場合に表面４及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面上へのＨＥＫ２９３細胞の付着を促進した。４８時間のインキュベーションの後にＹ−２７６３２を除去すると、表面４及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）から細胞が顕著に剥離した。

（実施例２０）
Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２による処理は、表面改質プレート上でのＨＥＫ２９３細胞の増殖を促進する。

ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を含むＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。細胞を、７０〜８０％コンフルエンスでトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離させて継代し、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を有する７５ｃｍ²のフラスコ中に２．０×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で播種した。

１．０、５．０、１０、１５又は２０μＭのＹ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、又は０．４、１．２、１．６、２．４又は２．８μＭのＨ−１１５２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭ（５００μｌ）を、表面４又は非処理（ただしγ線（２５ｋＧｙ）照射した）ポリスチレン表面のいずれかを有するマルチディッシュ２４ウェルプレートに分配した。１０％ＦＢＳを添加し、ＨＥＫ２９３細胞を含む更に５００μｌのＥＭＥＭを各ウェルに加えた（２．０×１０⁴細胞／ｃｍ²）。培養をＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓ（Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）に入れ、空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓは、ＣＯ₂インキュベーターの内部に収まるように構成され、使用者によって定められる時間に使用者によって定められる培養中の位置において細胞の位相差画像を取得することによって動的かつ非侵襲的な生きた細胞の画像を与えるように設計された自動画像化プラットフォームである。この装置の主たる測定基準は培養のコンフルエンス、すなわち細胞によって覆われた表面の割合である。ＨＥＫ２９３細胞を、操作を行わずに７２時間インキュベートし、３重の培養の９箇所の位置において２時間ごとに画像を取得した。培養のコンフルエンスをＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓソフトウェア（ｖ．３．４．１．２５９６６）を使用して求めた。

Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２の濃度を増大させると、表面４上のＨＥＫ２９３細胞の付着及び増殖が促進された（図３２ａ）。ＨＥＫ２９３の付着及び増殖に対する非処理の細胞培養表面及びＹ−２７６３２又はＨ−１１５２の影響を図３２ｂに示す。ＨＥＫ２９３細胞の増殖及び付着は１０μＭのＹ−２７６３２及び０．６〜１．２μＭのＨ−１１５２の存在下でわずかに促進された。しかしながら、非処理の細胞培養表面上でのＨＥＫ２９３細胞の増殖及び付着の促進は、表面４と比較してわずかであった。

（実施例２１）
Ｈ−１１５２による処理は表面改質プレートへのＨＥＫ２９３細胞の増殖及び付着を促進する。

ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を含むＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。細胞を、７０〜８０％コンフルエンスでトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離させて継代し、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を有する７５ｃｍ²のフラスコ中に２．０×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で播種した。

０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４又は２．８μＭのＨ−１１５２を含む、１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭ（１．０ｍＬ）を、表面４を有するマルチディッシュ１２ウェルプレートに分配した。１０％ＦＢＳを添加し、ＨＥＫ２９３細胞を含む更に１．０ｍＬのＥＭＥＭを各ウェルに加えた（４．０×１０⁴細胞／ｃｍ²）。培養を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓに入れ、空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、３７℃で４２時間インキュベートした（画像は６時間ごとに取得した）。この後、１ｍＬの培地をピペットで取り、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２及び１．４μＭのＨ−１１５２を含む、１０％ＦＢＳを添加した１．０ｍＬのＥＭＥＭを加えた。培養を再びＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓに入れ、画像をその後２５時間にわたって毎時間取得した。画像は３重の培養の９箇所の位置において取得し、培養のコンフルエンスをＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して求めた。Ｈ−１１５２（０．６μＭ）の非存在下又は存在下で増殖させたＨＥＫ２９３細胞の培養の特定の位置において取得されたＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓからの画像を読み出し、位相差顕微鏡写真として示すことによって以下の時点におけるＨＥＫ２９３培養の形態を比較した。すなわち、インキュベートの開始時（０時間）、培地交換の直前（４２時間）、培地交換の１時間後（４３時間）、及び最後に５２時間のインキュベーション後。

Ｈ−１１５２の非存在下及び０．２μＭ又は０．４μＭのＨ−１１５２の存在下では、４２時間のインキュベーション後に培地の５０％を交換することによって培養のコンフルエンスが大幅に減少した（図３３ａ）。０．６μＭ、０．８μＭ又は１．４μＭのＨ−１１５２の存在下では、培地の交換の影響は最小に留まった。Ｈ−１１５２の存在下で表面４上で増殖させたＨＥＫ２９３細胞は、Ｈ−１１５２の非存在下で表面４上で増殖させたＨＥＫ２９３細胞よりも均一に固体基質表面を覆った（図３３ｂ）。Ｈ−１１５２の非存在下では、ＨＥＫ２９３細胞は大きな塊を形成したのに対して、Ｈ−１１５２の存在下ではＨＥＫ２９３細胞は細胞密度の低い小さな塊を形成した。

（実施例２２）
Ｙ−２７６３２による処理は、表面改質プレート上で３回の継代にわたってＨＥＫ２９３細胞の増殖を促進する。

５．０μＭのＹ−２７６３２を含む、１０％のＦＢＳを添加したＥＭＥＭ（５００μｌ）を表面４又はＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面を有するマルチディッシュ２４ウェルプレートのウェルに分配した。１０％ＦＢＳを添加し、ＨＥＫ２９３細胞を含む更に５００μｌのＥＭＥＭを各ウェルに加え（２．０×１０⁴細胞／ｃｍ²）、培地を空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中３７℃で３日間インキュベートした。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で２分間、３７℃で処理することによって継代し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔ細胞カウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して全細胞数を求めた。その後の継代では、ＨＥＫ２９３細胞を２．０×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で播種した。表面４及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面上でのＨＥＫ２９３細胞の増殖は、２．５μＭのＹ−２７６３２の存在によって促進された（図３４）。

（実施例２３）
細胞外マトリクスタンパク質／成分及びフィーダー細胞を欠いた表面改質プレート４、１８、及び１９を用いたヒト胚性幹細胞の付着、培養及び維持
１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプラスチック容器上、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中で維持した継代数４２のＨ１ ｈＥＳ細胞をＬＩＢＥＲＡＳＥ（商標）酵素処理によって浮かせ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中、１：２の希釈率で表面改質された９６ウェル形式のプレートに播種した。細胞は改質表面４、１８若しくは１９、又はＰｒｉｍａｒｉａ（商標）上に播種した。改質表面への結合に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を調べるため、１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、又は３μＭ若しくは１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２グリシルのいずれかで細胞を処理した。非処理の細胞をコントロールとした。２４時間の培養後、各ウェルを吸引し、細胞を乾燥して、各ウェルをクリスタルバイオレットで染色した。

我々は、２４時間の培養後、表面改質プレート４及び１９並びにＰｒｉｍａｒｉａ（商標）プレート上でＲｈｏキナーゼ阻害剤により処理した場合にＥＳ細胞のコロニーが付着及び増殖するが、同じ効果は表面改質プレート１８では認められないことを観察した（図３５）。

（実施例２４）
細胞外マトリクスタンパク質／成分及びフィーダー細胞を欠いた表面改質プレート３０、３１、３２、３３及び３４を用いたヒト胚性幹細胞の付着、培養及び維持
１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプラスチック容器上、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中で維持した継代数４７のＨ１ ｈＥＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）酵素処理によって浮かせ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中、１：３の希釈率で表面改質された９６ウェル形式のプレートに播種した。細胞は改質表面３０、３１、３２、３３又は３４に播種した。改質表面への結合に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を調べるため、３μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２グリシルで細胞を処理した。非処理の細胞をコントロールとした。更に、細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で前処理した表面改質プレートのウェルに播種した。播種２４時間後、培地を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した新鮮なＭＥＦ調整培地に交換し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で播種した細胞については培地に３μＭのＨ−１１５２グリシルを添加した。４８時間の培養後、各ウェルを吸引し、細胞を乾燥して、各ウェルをクリスタルバイオレットで染色した。

我々は、４８時間の培養後、表面改質プレート３３及び３４上でＲｈｏキナーゼ阻害剤により処理した場合にＥＳ細胞のコロニーが付着及び増殖するが（それぞれ図３９及び４０）、同じ効果は表面改質プレート３０、３１又は３２では認められないことを観察した（それぞれ図３６〜４０）。

（実施例２５）
細胞外マトリクスタンパク質／成分及びフィーダー細胞を欠いた表面改質プレート２２、２３、２４又は２９を用いたヒト胚性幹細胞の付着、培養及び維持
１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングしたプラスチック容器上、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中で維持した継代数４６のＨ１ ｈＥＳ細胞をＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）酵素処理によって浮かせ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ調整培地中、１：３の希釈率で表面改質された６０ｍｍ径の培養皿に播種した。細胞は表面改質プレート３、４、２２、２３、２４及び２９に播種した。改質表面への結合に対するＲｈｏキナーゼ阻害の影響を調べるため、３μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２グリシルで細胞を処理することによって細胞を播種した。細胞の播種２４時間後に、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２グリシルを添加した新鮮なＭＥＦ調整培地に培地を交換した。改質表面３、４又はｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティングしたプラスチックに播種された細胞をコントロールとした。各プレートを播種２４時間及び４８時間後に位相差顕微鏡によって観察した。我々は、４８時間の培養後、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で播種したＥＳ細胞のコロニーは、表面改質プレート２２、２３、２４又は２９に付着しなかったが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で表面改質プレート３又は４に播種した細胞は付着して増殖したことを観察した。

（実施例２６）
本発明の表面改質プレートの更なる表面特性評価
水接触角
表面改質プレート１〜４及び１３を個別にプラスチックバッグに入れ、滅菌し、４０週間の試験期間全体を通じて室温で保存した。接触角を表面処理及び滅菌の１週間後に最初に測定し、図４１に示した各時点で再び測定した。すべての接触角の測定は実施例１７で述べたのと同様にして行った。Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面上での測定は、表面１〜４及び１３上での測定と同じ実験条件下で行ったが、表面処理及び滅菌は最初の測定の１２週間よりも前に行った（Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）^*は最初の測定の１週間前に滅菌した）。図４１は、表面改質プレート１〜４及び１３は同様の親水性を有し、Ｎｕｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面よりも親水性が高い（水接触角がより小さい）ことを示している。表面改質プレート１〜４及び１３の親水性は、表面処理及び滅菌後少なくとも４１週間にわたって安定であった。

接触角を表面改質プレート５〜１２、２２〜２４、２９、３０及び３３上でも測定した。表面改質プレート５〜１２、２２〜２４、２９、３０及び３３はプラスチックバッグに入れ、実施例１６で述べたのと同様にして滅菌し、室温で９週間保存した（２８週間保存した表面改質プレート２９を除く）。表面改質プレート１８、１９、３２及び３４は単一マイクロウェル形式のものであり、したがって接触角の測定に使用することはできなかった。表面改質プレート３０及び３３はマイクロウェルプレート形式のものであり、接触角の測定はウェルの内部ではなく、プレートの裏面で行った。接触角は実施例１７で述べたのと同様にして測定した（親水性の高い表面改質プレート２９については２．５μｌのＭｉｌｌｉＱ水のより小さな液滴を付着させた）が、３重の試料を分析し、各試料について７滴を付着させた。Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面を有するプレート上での測定は同様の実験条件下で行ったが、表面処理及び滅菌は最初の測定の１２週間よりも前に行った。図４２は、表面改質プレート５〜１２は、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）、Ｃｏｓｔａｒ（商標）及びＦａｌｃｏｎ（商標）表面よりも親水性が高い（水接触角がより小さい）ことを示している。表面５〜１２の親水性は、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）表面の親水性と同等であり、表面１〜４及び１３の親水性よりも高かった（図４１に示す）。表面改質プレート２２〜２４及び３３の親水性が表面１〜４及び１３の親水性と同等であった（図４１に示す）のに対して、表面３０の親水性は、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）、Ｃｏｓｔａｒ（商標）及びＦａｌｃｏｎ（商標）表面の親水性と同等であった。表面改質プレート２９は、分析を行った他の表面よりも大幅に親水性が高かった。

負電荷密度
表面改質プレート５〜１２（いずれも５ｃｍ径の培養皿形式）、１８、１９、３０、３２、３３及び３４（いずれもマイクロウェル形式）、表面改質プレート２２〜２４及び２９（いずれも６ｃｍ径の培養皿形式）、並びにＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面（３ｃｍ径の培養皿形式）、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）表面（マルチディッシュ６形式）並びにＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面（３ｃｍ径の培養皿形式）上の負電荷の密度を調べた。過剰量のクリスタルバイオレット水溶液（０．０１５％ｗ／ｖ）を各形式に入れ（培養皿形式では０．３４ｍＬ／ｃｍ²、及びマイクロウェル形式では０．１３ｍＬ／ｃｍ²）、静かに震盪（５０ｒｐｍ）しながら室温で６０分インキュベートした。表面に結合しなかったクリスタルバイオレットを除去するため、培養皿形式については培養皿を３ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄し、マイクロウェル形式では３５０μｌのＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄してから、６０℃で一晩乾燥させた。表面に結合したクリスタルバイオレットは、０．１７ｍＬ／ｃｍ²の０．１Ｍ塩酸／エタノール溶液（９９％）を加え、培養皿を静かに震盪しながら（５０ｒｐｍ）室温で２分間インキュベートすることによって脱着させた。脱着されたクリスタルバイオレットを含む塩酸／エタノール溶液の吸光度をＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１００マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて５９０ｎｍにて測定した。吸光度の値は塩酸／エタノール溶液のバックグラウンド吸光度に対して補正した。負電荷密度を、表面改質プレート５〜１２、２２〜２４、２９、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）、及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）について３個の培養皿で測定し、吸光度の測定を各培養皿について３重に行った。表面改質プレート１８、１９、３０、３２、３３及び３４については、１つの試料に３重の測定を行って試験した。

表面改質プレート５〜１２の負電荷密度は同様であり、これらの表面はＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面よりも大幅に低い負電荷密度を有したが、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）表面よりは大幅に高い負電荷密度を有していた（図４３）。表面改質プレート１９、３３及び３４の負電荷密度は、それぞれ同じポリマー材料の非処理表面である表面改質プレート１８、３０及び３２の負電荷密度よりも大幅に高かった。表面改質プレート２２〜２４及び２９の負電荷密度はＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面の負電荷密度に対して標準化したものであり、図４４は、表面改質プレート２２〜２４がＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面よりも高い負電荷密度を有していたのに対して、表面改質プレート２９の負電荷密度はＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面（及び表面４）の負電荷密度よりも大幅に低かったことを示している。

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
表面改質プレート５〜１２、１８、１９、２２〜２４、２９、３０、３１〜３４を実施例１７で述べたのと同様にしてＸＰＳを用いて分析した。原子％の単位で表わした表面の元素組成を表１２に示す。窒素を含有していなかった表面改質プレート３１及び３２（プラズマ処理していない）を除き、すべての表面が炭素、酸素、及び窒素を含有していた（水素はＸＰＳでは検出されない）。表面改質プレート５〜１２の酸素含量は表面改質プレート１〜４及び１３よりも小さかったが、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面よりも大幅に大きかった（表７に示す）。表面改質プレート５〜１２はマイクロ波プラズマ処理によって作製したものであるのに対して、表面改質プレート１〜４及び１３はコロナプラズマ処理によって作製したものである。コロナプラズマ処理によって作製したが（表面改質プレート１〜４及び１３の作製に用いた）ポリスチレン以外のポリマーから射出成形された表面改質プレート１９、３３及び３４の酸素含量は、表面改質プレート１〜４及び１３の酸素含量と同等であった。表面改質プレート２２〜２４の酸素含量は、表面改質プレート１〜４及び１３よりも小さかった。表面改質プレート２９の酸素含量は表面改質プレート１〜４及び１３と同等であった。表面改質プレート５〜１２、１９、３３及び３４の窒素含量は表面改質プレート１〜４及び１３よりも小さかったが、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、及びＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）表面よりも大きかった（表７に示す）。表面改質プレート２９の窒素含量は、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）表面を含む分析を行った他の表面よりも大幅に大きかった。

文献に見られるような化学種のピーク幅及びエネルギー位置を用いることによって表面改質プレート中の炭素の結合環境を特定及び定量化するため、Ｃ１ｓスペクトルピークをカーブフィットした（カイ二乗で最もよくフィットした）（表１３）。濃度は、面積％に原子濃度を掛けることによって得られる原子％の単位で表わしたものである。表面１０、２２〜２４及び２９を除くすべてのプラズマ処理表面は、炭素の結合環境の点で似ていた。Ｃ−［Ｏ］−Ｃにある炭素の比率は、表面５〜１２、１８、３０及び３２並びに表面１〜４及び１３よりも表面１９、３３及び３４において大幅に高かった（表８に示す）。Ｏ−［Ｃ＝Ｏ］−Ｏ結合環境にある炭素の比率は、表面１〜４及び１３よりも表面５〜１２、１９、３３及び３４において低かった。Ｃ^*−Ｃ−Ｏ−Ｃ−Ｃ^*にある炭素の比率は、表面５〜９、１１、１２、１９、３３及び３４において表面１〜４及び１３よりも大幅に高かったが、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ（商標）及びＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）表面と同等であった。Ｃ−Ｏ−Ｃ又はＣ−ＮＨ₃ ⁺結合環境（スペクトルの同じエネルギーの位置）にある炭素の比率は、表面５〜１２、１９、３３及び３４において表面１〜４及び１３よりも低かったが、Ｃｏｓｔａｒ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（商標）、及びＰｒｉｍａｒｉａ（商標）表面よりも高かった。Ｃ−Ｏ−Ｃ^*＝Ｏ結合環境にある炭素の比率は、表面１９、３３及び３４において表面５〜１２よりも高かったが、表面１〜４及び１３におけるレベルと同等であった。Ｃ＝Ｏ結合環境にある炭素の比率は、表面５〜１２において表面１９、３３及び３４よりも高かったが、表面１〜４及び１３よりも低かった。ＣＯ₃ ^-結合環境にある炭素の比率は、表面５〜１２において表面１９、３３及び３４よりも高く、表面１〜４及び１３におけるレベルと同等であった。表面２２〜２４は、炭素結合環境の点で似ていた。表面２２〜２４では、Ｃ−［Ｏ］−Ｃ、Ｏ−［Ｃ＝Ｏ］−Ｏ、Ｃ−Ｏ−Ｃ又はＣ−ＮＨ₃ ⁺、Ｃ−Ｏ−Ｃ^*＝Ｏ及びＣ＝Ｏにある炭素の比率は、表面１〜４及び１３におけるよりも大幅に低かった。ＣＯ₃ ^-及びＣ^*−Ｃ−Ｏ−Ｃ−Ｃ^*結合環境にある炭素の比率は、表面２２〜２４において表面１〜４及び１３よりも高かった。表面２９の炭素の結合環境は、他のすべてのプラズマ処理表面の炭素の結合環境と異なっていた。Ｃ−［Ｏ］−Ｃにある炭素の比率は表面１〜４及び１３と同等であった。Ｏ−［Ｃ＝Ｏ］−Ｏ、ＣＯ₃ ^-及びＣ^*−Ｃ−Ｏ−Ｃ−Ｃ^*結合環境にある炭素の比率は、表面２９において表面１〜４及び１３よりも低かった。Ｃ−Ｏ−Ｃ又はＣ−ＮＨ₃ ⁺、Ｃ−Ｏ−Ｃ^*＝Ｏ及びＣ＝Ｏ結合環境にある炭素の比率は、表面２９において表面１〜４及び１３よりも高かった。芳香族Π→Π^*遷移によりエネルギー損失ピークが生じたが、これは表面の芳香族性の指標である。

Ｏ１ｓスペクトルピークはほぼガウス分布にしたがい、カーブフィットすることはできなかった。文献に見られるような化学種のピーク幅及びエネルギー位置を用いることによって表面内の窒素の結合環境を特定及び定量化するため、Ｎ１ｓスペクトルピークをカーブフィットした（カイ二乗で最もよくフィットした）（表１４）。濃度は、面積％に原子濃度を掛けることによって得られる原子％の単位で表わしたものである。表面９を除くすべての表面において−ＮＨ₃ ⁺結合環境にある窒素の比率は、表面１〜４及び１３におけるよりも低かった。表面５〜１２、１９、３３及び３４の−ＮＨ₂結合環境にある窒素はばらつきがあったが、表面１〜４及び１３におけるよりも高かった。表面５〜１２、１９、３３及び３４の−ＮＯ₂結合環境にある窒素はばらつきがあったが、表面１〜４及び１３におけるよりも低かった。表面５〜１２、１９、３３及び３４の−ＮＯ₃結合環境にある窒素はばらつきがあったが、表面１〜４及び１３におけるよりも高かった。表面２２〜２４及び２９の窒素の結合環境は他のプラズマ処理表面と異なっていた。表面２２〜２４及び２９の−ＮＨ₂結合環境にある窒素の比率はばらつきがあったが、表面１〜４及び１３におけるよりも大幅に高かった。−ＮＯ₂結合環境にある窒素の比率は、表面２２〜２４及び２９で表面１〜４及び１３におけるよりも低かった。Ｏ＝Ｃ−Ｎ−Ｃ＝Ｏ結合環境にある窒素の比率は、表面２２〜２４及び２９、並びに表面１〜４及び１３において同等であった。

この文書の全体を通じて引用された刊行物は、その全体を参照により本明細書に援用するものである。以上、本発明の様々な態様を、実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は上記の記載によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されることは理解されるであろう。

ＲＩに曝露：９６時間培養のＹ−２７６３２の濃度（μＭ）

^*γ線照射による滅菌を行わなかった

^*他の元素は０．４％の濃度で検出された。

^*官能基は１つの試料においてのみ特定された。

^*Ｎ１ｓスペクトルは表面改質プレート１〜４及び１３では区別がつかず、２つの代表的なＮ１ｓスペクトルのカーブフィッティングから得られたデータを示してある。
^**官能基は１つの試料においてのみ特定された。

「−」は、１０ｃｍ²につき１５個未満のコロニー形成を意味する。
「＋」、「＋＋」、及び「＋＋＋」は、それぞれ、一部（１０ｃｍ²につき１５個以上のコロニー）、それよりも多い、及び最も多いヒトＥＳ細胞の付着及びコロニー形成を意味する。
「ＲＩ」は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、「ＮＤ」は実験が行われなかったことを意味する。
「ＰＳ」はポリスチレンを意味し、「ＰＣ」はポリカーボネートを意味し、「ＰＳ／ＰＣ」はポリスチレンとポリカーボネートの配合物を意味し、「ＣＯＣ」は環状オレフィンコポリマーを意味し、「ＣＰ」はコロナプラズマを意味し、「ＭＰ」はマイクロ波プラズマを意味する。
^*ヒトＥＳ細胞は付着し、約３回継代可能なコロニーに増殖した（その後増殖速度は自然に低下した）。
^**ヒトＥＳ細胞は付着し、最初の継代前に自然に分化するコロニーに増殖した。
^***ヒトＥＳ細胞は付着し、コロニーに増殖した（継代は試験しなかった）。
^****分析に使用可能な試料は１つのみであった。

^*プラズマ処理を行わなかった。
^**他の元素は０．２〜２．０％の濃度で検出された。

^*プラズマ処理を行わなかった。

^*プラズマ処理を行わなかった。
^**ＮＤ：分析を行ったが検出されなかった。

Claims (8)

1. 少なくとも１．３％の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が２４．９％以上であり、接触角が少なくとも２０．７°であり、フィーダー細胞層を欠く表面への細胞の付着を促進するための方法であって、
   ａ．前記細胞の懸濁液を得る工程と、
   ｂ．前記細胞の懸濁液を、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物、及びＲｈｏ活性の阻害能を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１つの化合物で処理する工程と、
   ｃ．前記細胞の懸濁液を前記表面に加えて前記細胞を付着させる工程と、を含む方法。
2. 前記表面が吸着層を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記表面に前記細胞が付着した後に前記細胞が培養中に維持される、請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞が前記表面に付着した後に前記少なくとも１つの化合物が除去される、請求項３に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの化合物を除去することによって前記細胞が前記表面から剥離される、請求項１に記載の方法。
6. 前記細胞の懸濁液が細胞の塊の懸濁液である、請求項１に記載の方法。
7. 前記細胞の懸濁液が単一細胞の懸濁液である、請求項１に記載の方法。
8. 前記表面が容器又はマトリクスの一部である、請求項１に記載の方法。

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