BR122017025207B1 - superfície que faz parte de um recipiente ou matriz destinada para uso em uma cultura de células ou análises, desprovida de uma camada de células alimentadoras e desprovida de uma camada adsorvente - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao campo de cultura de célula de mamífero, e fornece métodos e composições para a adesão, cultivo e desprendimento celular a partir de uma superfície de substrato sólido contendo pelo menos cerca de 0,5% N, uma soma de O e N de mais de ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, desprovida de uma camada de célula alimentadora e desprovida de uma camada adsorvente. Em uma modalidade da presente invenção, as células são tratadas com um composto capaz de inibir a atividade da Rho-quinase. Em outra modalidade, as células são tratadas com um composto capaz de inibir a atividade da Rho.

Description

Dividido do PI0908033-3, depositado em 19.02.2009. CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Este pedido de patente reivindica a prioridade sobre o pedido provisório de número de série 61/030.544, depositado em 21 de fevereiro de 2008.

[002] A presente invenção refere-se ao campo da cultura de células de mamíferos, e fornece métodos e composições para a adesão da célula, o cultivo, e o desprendimento da célula de uma superfície de substrato sólido que contém pelo menos cerca de 0,5% de N, uma soma de O e N maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, e que não tem uma camada de célula ali- mentadora e uma camada adsorvente. Em uma modalidade da presente invenção, as células são tratadas com um composto capaz de inibir a atividade da Rho-quinase. Em outra modalidade, as células são tratadas com um composto capaz de inibir a atividade da Rho.

ANTECEDENTES

[003] O cultivo de células de mamíferos é um dos muitos processos nas ciências da vida e saúde. Vasos para a cultura e análise de células de mamíferos envolvendo células dependentes de ancoragem são frequentemente feitos de vidro ou de um polímero, como, por exemplo, poliestireno, que frequentemente precisa de tratamento adicional de superfície para permitir a adesão das células na superfície do vaso. Tais tratamentos podem incluir a aplicação de uma camada ad- sorvente na superfície por, por exemplo, técnicas de adsorção, de enxertia ou de polimerização a plasma. Por outro lado, o tratamento da superfície pode ser feito através de modificação química da superfície do vaso em si, o que pode ser obtido por, por exemplo, radiação atmosférica, plasma a vácuo por frequência de rádio, descarga lumines- cente DC, e tratamentos por plasma de micro-ondas. Estes tratamentos de superfície mudam a composição dos elementos e grupos químicos na superfície. A química particular que resulta depende do método de tratamento da superfície, energia, e tempo, bem como da composição dos gases usados.

[004] Por exemplo, a US5449383 descreve um substrato que compreende um volume de material polimérico e uma camada polimé- rica fina que é adequada para apoiar o crescimento celular, que compreende um polímero resistente à reorientação que compreende mo- nômeros de amida polimerizada por plasma que apresenta grupos amida para a adesão de células, em que os ditos monômeros de ami- da são selecionados dentre o grupo de dimetilformamida e amidas que têm a fórmula R1-CO-N(R2)R3 em que R1 é um grupo alifático, alicícli- co, ou aromático, cada um dos quais pode ser opcionalmente substitu-ído por átomos de halogênio ou grupo hidroxila, e R2 e R3 são, cada um, independentemente, hidrogênio ou um grupo alquila, e em que a dita camada polimérica fina promove a adesão e a proliferação das ditas células.

[005] Em outro exemplo, EP0348969A1 descreve um método para a endotelização de uma superfície polimérica que compreende o contato de uma superfície polimérica com um plasma gerado a partir de um material gasoso que compreende nitrogênio de modo que a dita superfície polimérica é modificada para conter grupos amino na superfície, e a aplicação na dita superfície modificada de um número suficiente de células endoteliais para formar uma camada confluente de células na dita superfície contendo grupo amino, sem a necessidade de proliferação celular.

[006] Em outro exemplo, EP0092302A2 descreve um método para influenciar o crescimento de cultura celular em um meio de crescimento em um substrato, caracterizado pelo fato de que a química da superfície do substrato é modificada através da exposição do substrato a um plasma, que é produzido a partir de carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, um halogênio, ou uma combinação de qualquer um destes elementos.

[007] Em outro exemplo, US 6.617.152B2 descreve um aparelho para o tratamento de uma superfície de substrato polimérico que compreende: (a) uma entrada de gás, uma fonte de energia de microondas e uma câmara de mistura de plasma, estando a câmara de mistura de plasma em comunicação fluida com ambos a entrada de gás e a fonte de energia de micro-ondas; (b) uma área de tratamento de duas câmaras que tem uma câmara de tratamento interna contida em uma câmara de tratamento externa, tendo a dita câmara de tratamento interna um orifício em comunicação fluida com a dita câmara externa; (c) a dita câmara de mistura de plasma em comunicação fluida com a dita câmara de tratamento externo por meio de uma abertura; (d) uma linha de saída de vácuo fixada à dita câmara externa; e (e) por onde o dito orifício na dita câmara de tratamento interna é alinhado com a dita abertura, sendo o dito orifício espaçado em relação à dita abertura em uma distância predeterminada.

[008] Em um exemplo, US2003/0180903A1 descreve um substrato polimérico que tem uma superfície de trabalho sobre as quais as células podem ser cultivadas sendo que o teor de oxigênio da superfície é de pelo menos 25 porcento quando medido por microscopia eletrônica para análise química na profundidade de cerca de 50 Angs- trons.

[009] Em um exemplo, WO2006114098 descreve um material biocompatível microestruturado para implantes cirúrgicos e superfícies de cultura de tecido orientadoras de célula. A microestrutura da superfície de biomaterial é selecionada para promover o crescimento de células ES não diferenciadas, promover a diferenciação neuronal de células ES, ou promover a diferenciação de células ES.

[0010] Em outro exemplo, Bigdeli et al. (J. Biotechnol. 133:146 a 153, 2008) descrevem um método de adaptação e/ou seleção de células ES humanas para serem cultivadas sem diferenciação, sem célula alimentadora e sem um tratamento prévio da superfície do substrato sólido com proteína de matriz extracelular, que envolve (i) alterar o meio condicionado por fibroblasto pulmonar embrionário diploide humano para o meio condicionado por condrócitos neonatal; (ii) então, passar as células enzimaticamente da camada de célula alimentadora embrionárias de camundongo para placas tratadas com Matrigel®, então para placas Costar® e, finalmente, para placas Primaria®; e (iii) retornar para o primeiro meio usado. Muito poucas das células ES hu-manas sujeitas a este método originaram linhagens de células estabelecidas, sugerindo que este método envolve a seleção de células ES humanas nas condições de cultura.

[0011] Tratamentos de superfície que mudam a composição dos elementos e grupos químicos na superfície em si foram usados sem problemas no preparo de substratos sólidos de polímero para a cultura de muitos tipos de células de mamíferos. Entretanto, existem limitações significativas em termos de adesão e/ou cultivo inadequados com o uso de certos tipos de células de mamíferos, por exemplo, células- tronco pluripotentes e células de rim de embrião humano (HEK) 293.

[0012] Graham et al., (J. Gen. Virol. 36:59 a 72, 1977) descrevem a geração da linhagem de células HEK293.

[0013] A adesão das células HEK293 pode ser aprimorada com a formação de uma camada adsorvente no substrato sólido, com o uso, por exemplo, de proteínas de matriz extracelular, polilisina, poliornitina, ou polietileno imina, antes da adição das células HEK293 ao vaso de cultura. A preparação da camada adsorvente é, no entanto, demorada e resulta tipicamente em um substrato sólido não estéril com uma vida útil mais curta do que o substrato sólido descoberto. Portanto, existe uma necessidade significativa de métodos e materiais para aprimorar a adesão de células HEK293 a substratos sólidos sem uma camada adsorvente.

[0014] Métodos atuais de cultivo de células-tronco pluripotentes, em particular, células-tronco embrionárias (ES), exigem condições complexas de cultura como, por exemplo, o cultivo das células-tronco embrionárias em um substrato sólido com uma camada de célula ali- mentadora, ou em uma superfície de substrato sólido com uma camada adsorvente de proteína de matriz extracelular. Os sistemas de cultura que empregam estes métodos usam, com frequência, células ali- mentadoras ou proteínas de matriz extracelular obtidas a partir de uma espécie diferente daquela das células-tronco sendo cultivadas (material xenogênico). Meios obtidos por exposição a células alimentadoras, isto é, meios condicionados por células diferentes de células ES não indiferenciadas, podem ser usados para a cultura de células ES, e meios pode ser suplementados com soro animal.

[0015] Por exemplo, Reubinoff et al. (Nature Biotechnol. 18:399 a 404, 2000) e Thompson et al. (Science 282:1145 a 1147, 1998) descrevem a cultura de linhagens de célula ES a partir de blastocisto humano com o uso de uma camada de célula alimentadora de fibroblasto embrionário de camundongo.

[0016] Em outro exemplo, Xu et al. (Nature Biotechnology 19:971 a 974, 2001) descrevem o uso de Matrigel® e laminina para o tratamento de superfícies de substrato sólido antes do cultivo de células ES humanas sem diferenciação e sem célula alimentadora.

[0017] Em outro exemplo, Vallier et al. (J. Cell Sci. 118:4495 a 4509, 2005) descrevem o uso de soro fetal bovino (SFB) para o tratamento de superfícies de substrato sólido antes do cultivo de células ES humanas sem diferenciação e sem o uso de célula alimentadora.

[0018] Em outro exemplo, WO2005014799 descreve um meio condicionado para a manutenção, a proliferação e a diferenciação de células de mamífero. WO2005014799 afirma: "O meio de cultura produzido de acordo com a presente invenção é condicionado pela atividade de secreção celular de células murinas, em particular, aqueles hepatócitos transgênicos diferenciados e imortalizados, chamados MMH (Hepatócito Murina Met)".

[0019] Em outro exemplo, Wanatabe et al. (Nature Biotechnol. 35:681 a 686, 2007) declaram que "um inibidor de ROCK permite a sobrevivência de células-tronco embrionárias humanas dissociadas", que demonstram reduzida apoptose induzida por dissociação, aumenta a eficácia da clonagem (de aproximadamente 1% a aproximadamente 27%) e facilita a subclonagem após transferência de gene, com o uso de fibroblastos embrionários de camundongo como células ali- mentadoras, colágeno e Matrigel® como proteína de matriz extracelu- lar, e Y-27632 ou Fasudil como inibidores de ROCK. Além disso, células ES humanas dissociadas tratadas com Y-27632 foram protegidas de apoptose em cultura de suspensão isenta de soro.

[0020] Em outro exemplo, Peerani et al. (EMBO Journal 26:4744 a 4755, 2007) declaram que "A complexidade na organização espacial de culturas de células-tronco embrionárias humanas (hESC) cria mi- croambientes heterogêneos (nichos) que influenciam o destino de hESC. Este estudo demonstra que a taxa e a trajetória da diferenciação de hESC podem ser controladas por controle das propriedades de nicho de hESC. O tamanho e a composição do nicho regulam o equilíbrio entre fatores inibitivos de diferenciação e indutivos de diferenciação. Mecanicamente, um gradiente espacial dependente do tamanho de nicho de sinalização Smad1 é gerado como resultado de interações antagônicas entre hESCs e endoderma extra-embrionário (ExE) derivada de hESC. Estas interações são mediadas pela secreção localizada de proteína-2 morfogenética óssea (BMP2) por ExE e seu antagonista, o fator de diferenciação de crescimento-3 (GDF3) por hESCs. A micropadronização de hESCs tratadas com pequeno RNA de interferência (si) contra GDF3, BMP2 e Smad1, bem como tratamentos com um inibidor de quinase associada à Rho (ROCK) demonstram que controle independente da ativação de Smad1 pode resgatar a diferenciação dependente do tamanho da colônia de hESCs. Nossos resultados ilustram, pela primeira vez, uma função para Smad1 na integração de informação espacial e no controle dependente do tamanho de nicho da auto-renovação e diferenciação de hESC".

[0021] Em outro exemplo, Koyanagi, M et al. (J Neurosci Res. 2007 Sep 7 [versão para impressão Epub]) declaram que "GTPase Rho foi implicada na apoptose de muitos tipos de células, incluindo neurônios, mas o mecanismo pelo qual ela age não é completamente compreendido. Aqui, nós investigamos os papéis de Rho e ROCK em apoptose durante o transplante de células precursoras neurais derivadas de células-tronco embrionárias. Nós encontramos que a dissociação de precursores neurais ativa a Rho e induz a apoptose. O tratamento com o inibidor exoenzima C3 de Rho e/ou o inibidor Y-27632 de ROCK diminui a quantidade de apoptose induzida por dissociação (anoikis) em 20 a 30%. A formação de vesícula na membrana, que é um sinal morfológico precoce de apoptose; a clivagem de caspase-3; e a liberação de citocromo c da mitocôndria também são reduzidos pela inibição de ROCK. Estes resultados sugerem que a dissociação de células precursoras neurais produz uma rota intrínseca de morte celular que é pelo menos parcialmente através da rota de Rho/ROCK. Além disso, em um modelo de transplante animal, a inibição de Rho e/ou ROCK suprime a apoptose aguda de células enxertadas. Após o transplante, o fator-alfa de necrose tumoral e o fator de crescimento pró-nervo são fortemente expressos pelo enxerto. A inibição de ROCK também suprime a apoptose aprimorada por estas citoquinas inflamatórias. Se combinados, estes resultados indicam que a inibição da sinalização de Rho/ROCK pode otimizar a sobrevivência de células enxertadas na terapia de substituição celular.).

[0022] Em outro exemplo, Yoneda et al. (J. Cell Biol. 170: 443 a 453, 3 de agosto de 2005) declaram que "presume-se que as Rho- quinases de mamíferos homólogas (ROCK I e II) sejam funcionalmente redundantes, com base amplamente na superexpressão de construção de quinase. Como efetores a jusante de GTPases Rho, seus maiores substratos são a cadeia leve de miosina e a miosina fosfatase. Ambas as quinases estão envolvidas no conjunto de feixes de microfi- lamento e na contractilidade de músculo liso. Aqui, a análise de adesão de fibroblasto à fibronectina revelou que embora a ROCK II fosse mais abundante, sua atividade era sempre menor que a de ROCK I. A redução específica de ROCK I por siRNA resultou em perda de fibras de tensão e adesões focais, apesar do persistente ROCK II e RhoA ligado a guanina trifosfato. Em contraste, o citoesqueleto de microfila- mento foi aprimorado pela regulação descendente de ROCK II. A absorção fagocítica de microesferas revestidas de fibronectina foi fortemente regulada descendentemente em células isentas de ROCK II mas não em aquelas sem ROCK I. Estes efeitos originaram, em parte, de preferências distintas de ligação de lipídio de domínios de homolo- gia de plecstrina ROCK. ROCK II ligou-se a fosfatidil inositol 3,4,5P3 e era sensível a seus níveis, propriedades não compartilhadas pelo ROCK I. Portanto, ROCKs endógenos são regulados de modo distinto e, por sua vez, são envolvidos com compartimentos de miosina diferentes".

[0023] Em outro exemplo, Harb et al. (PloS ONE 3(8): e3001. oi: 10.1371/journal.pone.000300 1 de agosto de 2008) descrevem um papel essencial do eixo de sinalização de Rho-Rock-Miosina para a regulação de comunicações básicas de célula a célula tanto em células ES humanas como de camundongos, e contribuiram para avançar [sic] em células-tronco pluripotentes humanas em ambientes isentos de xeno medicamente compatíveis.

[0024] O uso de material xenogênico pode ser inadequado para certas aplicações utilizando células-tronco pluripotentes. Materiais alternativos podem ser usados. Por exemplo, Stojkovic et al. (Stem Cells 23:895 a 902, 2005) descrevem o uso de soro humano para o tratamento de superfícies de substrato sólido antes do cultivo de células ES humanas sem diferenciação e sem o uso de células alimentadoras.

[0025] Um sistema alternativo de cultura emprega um meio isento de soro suplementado com fatores de crescimento capazes de promover a proliferação de células ES.

[0026] Por exemplo, Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biol- reprod.105.046870; 19 de outubro de 2005) descrevem um sistema de cultura sem soro e sem célula alimentadora no qual as células ES são mantidas em um meio não condicionado de substituição de soro suplementado com diferentes fatores de crescimento capazes de ativar a auto-renovação de células ES.

[0027] Em outro exemplo, Levenstein et al. (Stem Cells 24:568 a 574, 2006) descrevem métodos para a cultura a longo prazo de células ES humanas na ausência de fibroblastos ou de meio condicionado, com o uso de meios suplementados com fator de crescimento de fi- broblasto básico (FGF).

[0028] Em outro exemplo, US20050148070 descreve um método para cultivar células ES humanas em meios definidos isentos de soro e sem células alimentadoras de fibroblasto, que compreende: cultivar as células-tronco em um meio de cultura que contém albumina, ami- noácidos, vitaminas, minerais, pelo menos uma transferrina ou substituto de transferrina, pelo menos uma insulina ou substituto de insulina, sendo que o meio de cultura é essencialmente isento de soro fetal mamífero e contém pelo menos cerca de 100 ng/mL de um FGF capaz de ativar um receptor de sinalização FGF, sendo que o fator de crescimento é fornecido de uma fonte além de apenas uma camada ali- mentadora de fibroblasto, o meio suportou a proliferação de células- tronco em um estado não diferenciado sem células alimentadoras ou um meio condicionado.

[0029] Em outro exemplo, em US20050233446 descreve um meio definido útil para a cultura de células-tronco, inclusive para células- tronco primordiais de primata não diferenciadas. Em solução, o meio é substancialmente isotônico, em comparação com as células-tronco sendo cultivadas. Em uma dada cultura, o meio particular compreende um meio de base e uma quantidade de cada: FGF básico, insulina, e ácido ascórbico, necessários para suportar substancialmente o crescimento indiferenciado das células-tronco primordiais.

[0030] Em outro exemplo, em US6800480 declara-se que: "Em uma modalidade, é apresentado um meio de cultura celular para proliferação células-tronco primordiais derivadas de primatas em um estado substancialmente não diferenciado, o que inclui um meio básico com baixa pressão osmótica e baixo teor de endotoxina, o qual é eficaz no suporte à proliferação de células-tronco primordiais derivadas de primatas. O meio básico é combinado com um soro nutriente que é eficaz para suportar a proliferação de células-tronco primordiais derivadas de primata, e um substrato selecionado do grupo consistindo em células alimentadoras e um componente de matriz extracelular, derivado de células alimentadoras. O meio inclui, ainda, aminoácidos não essenciais, um antioxidante, e um primeiro fator de crescimento selecionado do grupo consistindo em nucleosídeos e um sal piruvato".

[0031] Em outro exemplo, em US20050244962 declara-se que: "Em um aspecto, a invenção provê um método para cultura de células- tronco embrionárias de primata. As células-tronco são cultivadas em um meio de cultura essencialmente isento de soro fetal de mamífero (de preferência também essencialmente isento de qualquer soro de origem animal) e na presença de fator de crescimento de fibroblastos, o qual é fornecido a partir de uma fonte que difere de uma simples camada alimentadora de fibroblastos. De modo preferencial, a camada alimentadora de fibroblastos, anteriormente necessária para sustentar uma cultura de células-tronco, é tornada desnecessária pela adição suficiente de fator de crescimento de fibroblastos".

[0032] Em outro exemplo, WO2005065354 descreve um meio de cultura definido, isotônico que é essencialmente isento de alimentador e isento de soro, que compreende: a. um meio básico; b. uma quantidade de fator de crescimento de fibroblasto básico suficiente para suportar o crescimento de células-tronco mamíferas substancialmente indiferenciadas; c. uma quantidade de insulina suficiente para suportar o crescimento de células-tronco mamíferas substancialmente indiferenciadas; e d. uma quantidade de ácido ascórbico suficiente para suportar o crescimento de células-tronco mamíferas substancialmente indiferenciadas.

[0033] Em outro exemplo, WO2005086845 descreve um método para a manutenção de uma célula-tronco indiferenciada, o dito método compreende expor uma célula-tronco a um membro da família de proteínas do fator de crescimento de transformação-beta (TGFβ), um membro da família de proteínas do fator de crescimento de fibroblasto (FGF), ou nicotinamida (NIC) em uma quantidade suficiente para manter a célula em um estado indiferenciado durante uma quantidade de tempo suficiente para se obter um resultado desejado.

[0034] Células-tronco pluripotentes fornecem um recurso potencial para a pesquisa e triagem de fármacos. Atualmente, a cultura de grande escala de linhagens de células ES humanas é problemática e fornece desafios substanciais. Uma possível solução a estes desafios é "passar" e cultivar as células ES humanas como células únicas. Células únicas respondem melhor a técnicas padrão de cultura de tecido como, por exemplo, contagem, transfecção, e similares.

[0035] Por exemplo, Nicolas et al. provê um método para a produção e expansão de linhagens de células ES humanas a partir de células únicas que foram isoladas por seleção celular ativada por fluorescência seguindo a modificação genética por vetores lentivirais (Stem Cells Dev. 16:109 a 118, 2007).

[0036] Em outro exemplo, o pedido de patente americana US2005158852 descreve um método "para melhorar o crescimento e a sobrevivência de células-tronco embrionárias humanas únicas. O método inclui a etapa de obter uma célula hES indiferenciada única; misturar a célula indiferenciada única com uma matriz extracelular para abranger a célula; e inocular a mistura em células alimentadoras com um meio nutriente em um ambiente de crescimento".

[0037] Em outro exemplo, Sidhu et al. (Stem Cells Dev. 15:61 a 69, 2006) descrevem o primeiro relato de três clones de célula ES humana, hES 3.1, 3.2 e 3.3, derivadas da linhagem parental hES3 pela seleção de preparações de célula única por citometria de fluxo.

[0038] Entretanto, a passagem e a cultura de células ES humanas como células únicas leva a anomalias genéticas e à perda de pluripo- tência. As condições de cultura são importantes na manutenção de pluripotência e estabilidade genética. Em geral, a passagem de linhagens de célula ES humana é conduzida manualmente ou com agentes enzimáticos como colagenase, liberase ou dispase.

[0039] Por exemplo, Draper et al. notaram a presença de "mudan- ças cariotípicas envolvendo o ganho de cromossomo 17q em três linhagens de células-tronco embrionárias humana independentes em cinco ocasiões independentes". (Nature Biotechnol. 22:53 a 54, 2004).

[0040] Em outro exemplo, Buzzard et al. declaram, "nós apenas detectamos um evento de mudança de cariotipo...os métodos de cultura usados podem ter algum peso em nossos resultados, uma vez que nossos métodos são distintamente diferentes daqueles usados pela maioria dos outros grupos. Tipicamente, passamos células ES humanas após 7 dias por, primeiramente, dissecção da colônia com a borda de uma pipeta quebrada. Nenhum método químico ou enzimáti- co de dissociação celular é incorporado neste método. Especulamos que isto possa explicar a resiliência citogenética relativa de células hES (ES humanas) em nossas mãos". (Nature Biotechnol. 22:381 a 382, 2004).

[0041] Em outro exemplo, Mitalipova et al. declaram que "métodos de passagem em volume. Podem perpetuar populações de células aneuploides após a passagem prolongada em cultura, mas podem também ser usados por períodos de tempo mais curtos (até pelo menos 15 passagens) sem comprometer os cariótipos.pode ser possível manter um cariótipo normal em células hES, sob condições de propagação manual a longo prazo, seguidas de passagem, limitada, em volume em experimentos que exigem quantidades maiores de células hES do que os métodos de passagem manuais, apenas, podem fornecer". (Nature Biotechnol. 23:19 a 20, 2005).

[0042] Em outro exemplo, Heng et al. declaram que "os resultados demonstram que o segundo protocolo (tripsinização com pipetagem suave) é muito menos prejudicial à viabilidade celular do que é o segundo protocolo (tratamento de colagenase com arranhões). Isto, por sua vez, se traduziu em taxas de congelamento-degelo mais altas". (Biotechnology and Applied Biochemistry 47:33 a 37, 2007).

[0043] Em outro exemplo, Hasegawa et al. declaram que, "nós estabelecemos sublinhas hESC tolerantes à completa dissociação. Estas células exibem alta eficiência de replaqueamento e também alta eficiência de clonagem e elas mantêm sua habilidade de se diferenciar nas três camadas germinativas". (Stem Cells 24:2649 a 2660, 2006).

[0044] Portanto, existe uma necessidade significativa de métodos e composições para a cultura de células de mamíferos, incluindo a cultura de células-tronco pluripotentes na ausência de células alimentado- ras e de uma camada adsorvente, que ainda mantenha a pluripotência das células.

SUMÁRIO

[0045] Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos e composições para adesão, cultura e desprendimento de células de uma superfície de substrato sólido que contém pelo menos cerca de 0,5% de N, uma soma de O e N maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, sem uma camada ali- mentadora de células e sem uma camada adsorvente.

[0046] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar a adesão de células a uma superfície que contém pelo menos cerca de 0,5% de N, uma soma de O e N de maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, sem uma camada de células alimentadoras e sem uma camada adsorvente, compreendendo as etapas:

[0047] Obter uma suspensão de células,

[0048] Tratar a suspensão de células com pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase, e um composto capaz de inibir a atividade de Rho, e

[0049] Adicionar a suspensão de células à superfície e permitir que as células se fixem.

[0050] Em uma modalidade, as células são mantidas em cultura depois que as células se fixam à superfície. Em uma modalidade alternativa o pelo menos um composto é removido.

[0051] Em uma modalidade, as células são desprendidas da superfície na remoção do pelo menos um composto.

[0052] Em uma modalidade a suspensão de células é uma suspensão de agrupamentos de células. Em uma modalidade alternativa, a suspensão de células é uma suspensão de células únicas.

[0053] Em uma modalidade, as células são células-tronco pluripo- tentes. Em uma modalidade alternativa, as células são células-tronco.

[0054] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar a adesão das células a uma superfície que contém pelo menos cerca de 0,9% de N, uma soma de O e N de maior ou igual a 22,3% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, sem uma camada de células alimentadoras e sem uma camada adsorvente, que compreende as etapas de:

[0055] Obter uma suspensão de células, e

[0056] Adicionar a suspensão de células à superfície e permitir que as células se fixem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0057] A figura 1 mostra micrógrafos de contraste de fase (4x) da linhagem de células ES humanas H1 que foram passados duas vezes como agrupamentos com LIBERASE nas placas de superfície modificada 2, 3 ou 4. Também são mostradas imagens de células da linhagem de células ES humanas H1, cultivadas em placas tratadas com uma diluição de 1:30 de Matrigel®, e em placas Nunclon Delta®.

[0058] A figura 2 mostra o efeito de de Y-27632 a 10 μM na adesão de células ES humanas às placas de superfície modificada. A figura mostra micrógrafos de contraste de fase (4x) de células da linhagem de células ES humanas H1 que foram passadas duas vezes como agrupamentos em placas de superfície modificada 3 e 4. As células foram então passadas para as placas de superfície modificada 2, 3 ou 4, em meio condicionado em MEF que contém Y-27632 a 10 μM. As células foram cultivadas por quatro dias antes de serem fotografadas. As células cultivadas na ausência de Y-27632 foram incluídas como controles.

[0059] A figura 3 mostra um desenho esquemático do curso do tempo do tratamento de compostos em células ES humanas cultivadas nas placas de superfície modificada da presente invenção. As células da linhagem de células ES humanas H1 foram passadas quatro vezes como agrupamentos com tratamento de LIBERASE nas placas de superfície modificada 3, ou 4, e cultivadas em meio condicionado em MEF. As células foram tratadas nos dois primeiros dias após a passagem com 10 μM do inibidor de Rho-quinase, Y-27632, ou com 0,5 ng/mL de inibidor de Rho, uma forma da transferase C3 de exoenzima permeável à célula. As células que foram tratadas com o inibidor de Rho-quinase, Y-27632, e que foram posteriormente tratadas nos dois primeiros dias após cada passagem com Y-27632 na placa de superfície modificada 3 são chamadas de "7s". As células que foram tratadas com o inibidor de Rho-quinase, Y-27632, e que foram posteriormente tratadas nos dois primeiros dias após cada passagem com Y-27632 na placa de superfície modificada 4 são chamadas de "3s". As células que foram tratadas com o inibidor de Rho por dois dias e que foram então tratadas com o inibidor de Rho-quinase, Y-27632, por dois dias após cada passagem e posteriormente tratadas nos dois primeiros dias após a passagem com Y-27632 na placa de superfície modificada 3 são chamadas "5s". As células que foram tratadas com o inibidor de Rho por dois dias e que foram então tratadas com o inibidor de Rho- quinase, Y-27632, por dois dias após cada passagem e posteriormen-te tratadas nos dois primeiros dias após a passagem com Y-27632 naplaca de superfície modificada 4 são chamadas de "1s".

[0060] A figura 4 mostra a expressão de marcadores associados à pluripotência e à diferenciação em células ES humanas tratadas de acordo com o protocolo descrito na figura 6 conforme determinado por qRT-PCR.

[0061] A figura 5 mostra a expressão de marcadores de pluripo- tência em células da linhagem de células ES humanas H1, conforme determinado por citometria de fluxo, na passagem 4 (p4), passagem 9 (p9), e novamente nas passagens 10, 11, ou 12 (p10, p11, ou p12).

[0062] A figura 6 mostra imagens imuno-fluorescentes de células da linhagem de células ES humanas H1 que foram passadas em série como agrupamentos com tratamento de LIBERASE na placa de superfície modificada 4, e cultivadas em meio condicionado em MEF. A expressão de proteínas associadas aos marcadores de pluripotência foi detectada em células cultivadas por 11 passagens na placa de superfície modificada 4. As células foram tratadas com Y-27632 a 10 μM por dois dias após cada passagem.

[0063] A figura 7 mostra a habilidade de células ES humanas de formar o endoderma definitivo após a cultura em placas de superfície modificada. As células da linhagem de células ES humanas H1 foram passadas 11 vezes como agrupamentos com tratamento de LIBERA- SE nas placas de superfície modificada 3 ou 4 e cultivadas em meio condicionado em MEF. Na passagem 8 (p8) e novamente na passagem 10 ou 11 (p10-11) as células foram tratadas com meio DMEM:F12 contendo 0,5% de SFB, 100 ng/mL de ativina A, e 20 ng/mL de Wnt3a por dois dias e, então, tratadas com meio DMEM:F12 contendo 2% de SFB e 100 ng/mL de ativina A por mais três dias. O eixo y no gráfico mostra a porcentagem de células CXCR4 positivas obtidas por citome- tria de fluxo. Veja também a tabela 5.

[0064] A figura 8 mostra a habilidade de células ES humanas de formar o endoderma pancreático após a cultura em placas de superfície modificada. As células da linhagem de células ES humanas H1 foram passadas oito vezes como agrupamentos com tratamento de LI- BERASE nas placas de superfície modificada 3 ou 4 e cultivadas em meio condicionado em MEF. Na passagem 8 (p8) as células foram submetidas à diferenciação para o endoderma definitivo por tratamento com meio DMEM:F12 contendo 0,5% de SFB, 100 ng/mL de ativina A, e 20 ng/mL de Wnt3a por dois dias e então foram tratadas com o meio DMEM:F12 contendo 2% de SFB e 100 ng/mL de ativina A por mais três dias. As células foram então adicionalmente diferenciadas para intestino anterior embrionário com quatro dias de tratamento com o meio DMEM:F12 contendo 2% de SFB, 100 ng/mL de FGF-10, e 1 μM de ciclopamina-KAAD. As células, foram então diferenciadas para o endoderma pancreático com quatro dias de tratamento com meio DMEM:F12 contendo 1% de B-27, 100 ng/mL de FGF-10, 1 μM de ci- clopamina-KAAD e 2 μM de ácido retinóico. As células foram coradas por imunofluorescência por PDX-1 (verde) e E-caderina (vermelho) e o número total de células foi identificado por corante Hoechst (azul).

[0065] A figura 9 mostra a habilidade de células ES humanas cultivadas em placas de superfície modificada para formar corpos embrioi- des.

[0066] A figura 10 mostra o cariótipo de células ES humanas cultivadas na placa de superfície modificada 4.

[0067] A figura 11 mostra o efeito do tratamento com inibidores de Rho-quinase (Y-27632 de EMD biosciences, Y-27632 de Sigma, Fa- sudil, e Hidroxifasudil) na adesão de células ES humanas a placas de superfície modificada. As células foram cultivadas por três dias em meio contendo os compostos indicados, nas concentrações listadas. As células foram coradas com cristal violeta e as imagens capturadas.

[0068] A figura 12 mostra a resposta à dosagem de Y-27632 na adesão de células ES humanas às placas de superfície modificada. Várias concentrações do inibidor de Rho-quinase, Y-27632, foram adicionadas às culturas a uma determinada concentração (Y-27632 a 0, 1, 2, 4, ou 10 μM) no primeiro dia. As células foram então mantidas do dia 2 em diante em meio contendo Y-27632 a 10 μM com mudanças diárias do meio por cinco dias. O meio foi removido das placas no dia cinco e as células foram coradas com 0,5% de cristal violeta, e as imagens foram capturadas.

[0069] A figura 13 mostra a formação de colônias de células ES humanas quatro dias após a passagem para as placas de superfície modificada 2, 3, ou 4 com ou sem Y-27632 a 10 μM.

[0070] A figura 14 mostra a formação de colônias de células ES humanas quatro dias após a passagem para placas tratadas em Matri- gel® com ou sem Y-27632 a 10 μM.

[0071] A figura 15 mostra a diferença entre o tratamento contínuo e intermitente de células ES humanas com Y-27632, na adesão de células às placas de superfície modificada.

[0072] A figura 16 demonstra as imagens de células da linhagem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares, semeadas na placa de superfície modificada 3 em meio condicionado em MEF contendo (B) ou sem (A) Y-27632 a 10 μM. As imagens foram capturadas 24 horas após a semeadura.

[0073] A figura 17 demonstra a expressão de marcadores associados à pluripotência em células da linhagem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares para 5 passagens, com o uso de TrypLE® Express, e plaqueadas nas placas de superfície modificada 3 e 4, com ou sem Y-27632 a 10 μM (Y). Os marcadores de plu- ripotência estão listados no eixo x e a porcentagem de células positivas é mostrada no eixo y.

[0074] A figura 18 demonstra o número total de células da linha- gem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares, plaqueadas nas placas de superfície modificada 3 e 4. O efeito de Y-27632 a 10 μM (Y) no número de células foi examinado nas células passadas em Matrigel® (N nativo), e nas células passadas 10 vezes nas placas de superfície modificada (aclimatadas, A). As diferentes condições de célula são listadas no eixo x e o número de células dividido por 104 é mostrado no eixo y.

[0075] A figura 19 demonstra a taxa de crescimento de células da linhagem de células ES humana H9, que foram passadas como unicelulares em placas tratadas em Matrigel® anteriormente ao estudo. As células foram semeadas em 104/cm2 e cultivadas em meio condicionado em MEF com ou sem Y-27632 a 10 μM nas placas de superfície modificada 3 e 4. O eixo y mostra o número de células coletadas 2, 3 ou 4 dias depois da semeadura (dividido por 104).

[0076] A figura 20 demonstra a taxa de crescimento de células da linhagem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares por 10 passagens em placas de superfície modificada anteriormente ao estudo. As células foram semeadas em 104/cm2 e cultivadas em meio condicionado em MEF com ou sem Y-27632 a 10 μM nas placas de superfície modificada 3 e 4. O eixo y mostra o número de células coletadas 2, 3 ou 4 dias depois da semeadura (dividido por 104).

[0077] A figura 21 demonstra imagens de células da linhagem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares, semeadas nas placas de superfície modificada 2 a 4 e 13 em um formato de 96 cavidades. O meio condicionado em MEF continha Y-27632 a 10 μM. As imagens foram capturadas 48 horas após a semeadura.

[0078] A figura 22 mostra a habilidade das células da linhagem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares, semeadas nas placas de superfície modificada 3 e 4 de diferenciar em endoderma definitivo. A extensão de formação do endoderma definitivo foi determinada por citometria de fluxo pela medição da expressã de CXCR. O efeito de Y-27632 a 10 μM na formação do endoderma definitivo foi investigado. As células foram tratadas com Y-27632 durante a expansão. As células expandidas e diferenciadas em Matrigel® foram incluídas como um controle. O eixo y mostra a porcentagem de células CXCR4 positivas obtida por citometria de fluxo.

[0079] A figura 23 mostra a habilidade das células da linhagem de células ES humanas H9, que foram passadas como unicelulares, semeadas nas placas de superfície modificada 3 e 4, de diferenciar em endoderma pancreático. As células foram plaqueadas nas placas de superfície modificada e cultivadas em meio condicionado em MEF contendo Y-27632 a 10 μM, e passadas 8 vezes nas placas de superfície modificada anteriormente à diferenciação. O eixo y mostra o aumento de vezes da expressão de marcadores de diferenciação pancreática (Ngn3, Pdx1, insulina) por q-PCR no estágio posterior de intestino anterior (PF) e o estágio de célula endócrina expressando hormônio (EN).

[0080] A figura 24 mostra a adesão de células ES humanas às placas de superfície modificada. As células Es humanas H9 da passagem 50 foram plaqueadas em uma diluição de 1:2 nas superfícies 3 e 4, CellBIND®, e Primaria®. O meio foi removido das placas 24 horas depois do plaqueamento e as células foram coradas com 0,5% de cristal violeta, e as imagens foram capturadas. As setas indicam as colônias.

[0081] A figura 25 mostra a adesão de células ES humanas às placas de superfície modificada. As células ES humanas H9 da passagem 50 foram plaqueadas em uma diluição 1:2 nas superfícies 3 e 4, CellBIND®, e Primaria® na presença de várias concentrações de Y- 27632 (0, 1, 2, 4, 10 e 20 micromolar). O meio foi removido das placas 24 horas depois do plaqueamento e as células foram coradas com 0,5% de cristal violeta, e as imagens foram capturadas. As colônias são manchas escuras na cavidade. As setas são usadas para realçar as colônias nas cavidades não tratadas.

[0082] A figura 26 mostra a adesão de células ES humanas às placas de superfície modificada. Células ES humanas H9 da passagem 53 foram plaqueadas em uma diluição de 1:3 nas superfícies 2 a 4 e 13, CellBIND®, e Primaria® na ausência ou presença de Y-27632 (0 ou 20 micromolar). O meio foi removido das placas 48 horas após o plaqueamento e as células foram coradas com 0,5% de cristal violeta, e as imagens foram capturadas. As colônias são manchas escuras na cavidade. As setas são usadas para realçar as colônias nas cavidades não tratadas.

[0083] A figura 27 mostra a primeira tentativa (outubro) e a segunda tentativa (dezembro) de fixar células ES humanas H9 às placas de superfície modificada 14 e 15 e uma tentativa de fixar células ES humanas H1 às placas de superfície modificada 14 e 15. Células ES humanas H9 da passagem 42 e da passagem 53, e as células ES humanas H1 da passagem 57 foram plaqueadas em uma diluição de 1:2 ou 1:3 às superfícies modificadas na presença de de Y-27632 a uma concentração de 20 micromolar. O meio foi removido das placas de 24 a 48 horas depois do plaqueamento e as células foram coradas com 0,5% de cristal violeta, e as imagens foram capturadas. As colônias são manchas escuras na cavidade. Setas são usadas para realçar as colônias nas placas.

[0084] A figura 28 mostra a adesão de células ES humanas a uma placa de superfície modificada 4 em meio definido, mTeSR®. As células ES humanas H9 da passagem 50 foram plaqueadas em uma diluição de 1:2 às superfícies modificadas na ausência ou presença de Y- 27632 (0 ou 20 micromolar) em cavidades que não foram ou foram tra- tadas com proteínas (0,1% de gelatina, 2% de BSA, 0,34 mg/mL de colágeno de rato I, Matrigel® diluído em 1:1000, ou Matrigel® diluído em 1:5000). O meio foi removido das placas 48 horas após o plaque- amento e as células foram coradas com 0,5% de cristal violeta, e as imagens foram capturadas. As colônias são manchas escuras na cavidade.

[0085] A figura 29 mostra os ângulos de contato da água das placas de superfície modificada medidos durante 11 semanas com o uso do método de gotejamento séssil estático. A primeira medição foi feita uma semana após o tratamento e a esterilização da superfície. Cada ponto de dados representa o ângulo médio de contato (uma medição em cada uma das 7 gotas). Os ângulos de contato em placas Nuclon Delta® e CellBIND® foram medidos sob as mesmas condições experimentais que as superfícies 1 a 4 e 13, mas o tratamento e a esterilização de superfície foram feitos mais de 12 semanas antes da primeira medição (Nuclon Delta® * foi esterilizado uma semana antes da primeira medição).

[0086] A figura 30 mostra a densidade das cargas negativas nas placas de superfície modificada medida como a reatividade das superfícies com cristal violeta de carga positiva. Três amostras de cada superfície foram testadas, e medições de absorbância em cristal violeta dessorvido de cada amostra foram executadas em triplicata. A média e o desvio-padrão de nove medições são dados.

[0087] A figura 31 mostra o efeito de superfícies de substrato sólido e Y-27632 na adesão e crescimento de células HEK293 em meio Pro293a-CDM® quimicamente definido, isento de soro (A) ou em meio EMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (B). As células HEK293 foram semeadas em placas de 96 cavidades com superfície CellBIND®, superfície Nunclon Delta® ou superfície 4. O número de células HEK293 fixadas a estas superfícies é mostrado como uma fun- ção de condições de cultura e concentração de Y-27632. As células receberam ou: (i) 96 horas de tratamento constante na cultura com Y- 27632 (Y-27632 ativo por 96 horas); ou (ii) 48 horas de tratamento constante em cultura com Y-27632 seguido de uma mudança de meio e, então, 48 horas em cultura sem Y-27632 (Y-27632 ativo por 48 ho- ras/inativo por 48 horas). As células HEK293 cultivadas sem Y-27632 no meio (número Y-27632) foram tratadas da mesma forma que as células cultivadas com Y-27632, isto é, por 96 horas sem uma mudança de meio, ou com uma mudança de meio após 48 horas. O Y-27632 aprimorou a adesão de células HEK293 na superfície 4 e na superfície CellBIND® quando aplicado em concentrações de 2,0 e 5,0 μM. A remoção do Y-27632 após 48 horas de incubação resultou no desprendimento de um número significativo de células da superfície 4 e da superfície CellBIND®. A média e o desvio-padrão de três medições são mostrados.

[0088] A figura 32 mostra o efeito de superfícies de substrato sólido e inibidores de Rho-quinase, Y-27632 e H-1152, no cultivo de células HEK293 no meio EMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células HEK293 foram semeadas em placas Multidish de 24 cavidades com a superfície 4 (A) ou com uma superfície de poliestireno não tratada (mas irradiada por gama; 25 kGy) (B).

[0089] A figura 33 mostra o efeito de H-1152 e da superfície 4 na adesão e na morfologia de células HEK293. As células HEK293 foram semeadas em placas Multidish de 12 cavidades em meio suplementado EMEM com 10% de soro fetal bovino e H-1152, e incubadas por 67 horas em um microscópio automatizado, interno à incubadora. Curvas de crescimento em A e fotomicrografia em B mostram o efeito geral de H-1152 na adesão e crescimento das células HEK293 na superfície 4, e o efeito de uma mudança de meio na adesão e na morfologia de células HEK293 na superfície 4 na presença ou ausência de H-1152.

[0090] A figura 34 mostra as curvas de crescimento através de 3 passagens para células HEK293 cultivadas na superfície 4 e superfície Nunclon Delta® na ausência ou presença de Y-27632 a 2,5 μM. As células HEK293 em meio suplementado EMEM com 10% de soro fetal bovino foram passadas 3 vezes por tripsinização.

[0091] A figura 35 mostra o efeito de inibição de Rho-quinase na adesão de células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1 às placas de superfície modificada 4, 18 e 19, e Primaria®. As cavidades A&B foram cavidades de controle em todas as superfícies. As cavidades C&D continham de Y-27632 a 10 μM. As cavidades E&F continham H1152-glicila a 3 μM. As cavidades G&H continham H1152- glicila a 10 μM.

[0092] A figura 36 mostra o efeito da inibição da Rho-quinase na adesão de células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1 à placa de superfície modificada 30. (--) = nenhum tratamento. (RI) = H1152-glicila a 3 μM. (MG) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL. (MG+RI) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL + H1152-glicila a 3 μM.

[0093] A figura 37 mostra o efeito de inibição de Rho-quinase na adesão de células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1 à placa de superfície modificada 31. (--) = nenhum tratamento. (RI) = H1152-glicila a 3 μM. (MG) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL. (MG+RI) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL + H1152-glicila a 3 μM.

[0094] A figura 38 mostra o efeito da inibição de Rho-quinase na adesão de células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1 à placa de superfície modificada 32. (--) = nenhum tratamento. (RI) = H1152-glicila a 3 μM. (MG) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL. (MG+RI) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL + H1152-glicila a 3 μM.

[0095] A figura 39 mostra o efeito da inibição de Rho-quinase na adesão de células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1 à placa de superfície modificada 33. (--) = nenhum tratamento. (RI) = H1152-glicila a 3 μM. (MG) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL. (MG+RI) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL + H1152-glicila a 3 μM.

[0096] A figura 40 mostra o efeito da inibição de Rho-quinase na adesão de células da linhagem de células-tronco embrionárias humana H1 à placa de superfície modificada 34. (--) = sem tratamento. (RI) = H1152-glicil a 3 μM. (MG) = camada adsorvente de diluição de 1:30 de MATRIGEL. (MG+RI) = camada adsorvente de diluição 1:30 de MATRIGEL + H1152-glicila a 3 μM.

[0097] A figura 41 mostra os ângulos de contato da água da placas de superfície modificada medidos durante 40 semanas com o uso do método da gota séssil estática.

[0098] A figura 42 mostra os ângulos de contato da água da placas de superfície modificada com o uso do método da gota séssil estática.

[0099] A figura 43 mostra a densidade de cargas negativas na placas de superfície modificada medida conforme a reatividade de superfície com cristal violeta positivamente carregado.

[00100] A figura 44 mostra a densidade de cargas negativas nas placas de superfície modificada 4, 22 a 24 e 29 medidas conforme a reatividade de superfícies com cristal violeta positivamente carregado. Três amostras de cada superfície foram testadas, e medições de ab- sorbância em cristal violeta dessorvido de cada amostra foram executadas em triplicata. A densidade de carga negativa das superfícies 4, 22 a 24 e 29 foi normalizada à densidade de carga negativa da superfície Nunclon Delta®. A média e o desvio-padrão de nove medições são dados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00101] Para tornar a descrição mais objetiva, mas sem que isto constitua uma limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas subseções a seguir, que descrevem ou ilustram determinadas características, modalidades ou aplicações da presente invenção.

Definições

[00102] "Camada adsorvente", conforme usado no presente documento, se refere a uma camada que é formada em uma superfície de um substrato sólido pela adesão de moléculas à superfície através de ligações covalentes (também chamado de enxerto) ou não covalentes (também chamado de adsorção). As moléculas usadas na fabricação de uma camada adsorvente podem, por exemplo, ser moléculas pro- teináceas, que podem incluir, por exemplo, proteínas de matriz extra- celular, aminoácidos e similares, e moléculas não biológicas como, por exemplo, polietileno imina.

[00103] "Linhagem celular-β" refere-se a células com expressão gênica positiva para o fator de transcrição PDX-1 e pelo menos um dos seguintes fatores de transcrição: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4, e Pax6. As células que expressam marcadores característicos da linhagem celular-β incluem as células β.

[00104] "Células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo", conforme usado no presente documento, refere-se às celulas que expressam pelo menos um dos seguintes marcadores: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF-8, Brachyury, proteína homeobox do tipo mistura, FGF-4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF-17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, ou OTX2. As células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo incluem células precursoras de linha primitiva, células de linha primitiva, células do mesendode- rma e células do endoderma definitivo.

[00105] "Células que expressam marcadores característicos da li- nhagem do endoderma pancreático", conforme usado no presente documento, refere-se a células que expressam pelo menos um dos seguintes marcadores: PDX-1, HNF-1 beta, PTF-1 alfa, HNF-6, ou HB9. As células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático incluem as células do endoderma pancreático.

[00106] "Células que expressam marcadores característicos de linhagem pancreática endócrina", conforme usado no presente documento, refere-se às células que expressam pelo menos um dos seguintes marcadores: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, ou PTF-1 alfa. As células que expressam marcadores característicos da linhagem pancreática endócrina incluem células pancreáti- cas endócrinas, células que expressam hormônio pancreático, células que secretam hormônio pancreático e células da linhagem celular-β.

[00107] "Endoderma definitivo", conforme usado no presente documento, refere-se às células que têm as características das células que surgem do epiblasto durante gastrulação e que formam o trato gastrointestinal e seus derivados. As células do endodermo definitivo expressam os seguintes marcadores: CXCR4, HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoide, c-Kit, CD99, e Mixl1.

[00108] "Proteínas de matriz extracelular" refere-se às moléculas proteináceas normalmente encontradas entre células no corpo ou na placenta. As proteínas de matriz extracelular podem ser derivadas de tecido, fluidos corpóreos como, por exemplo, sangue, ou meio condicionado por células não recombinantes ou células ou bactérias recombi- nantes.

[00109] "Endoderma extraembrionário", conforme usado no presente documento, refere-se a uma população de células que expressam pelo menos um dos seguintes marcadores: SOX-7, AFP, e SPARC.

[00110] "Células HEK293" referem-se a uma linhagem celular gerada pela transformação de uma cultura de células renais embrionárias humanas normais, conforme descrito por Graham et al. (J. Gen. Virol. 36:59 a 72, 1977), e quaisquer células derivadas a partir desta linhagem celular original.

[00111] "Marcadores", conforme usado no presente documento, são moléculas de ácidos nucléicos ou moléculas de polipeptídeos que são diferencialmente expressados em uma célula em questão. Nesse contexto, "expressão diferencial" significa um nível aumentado para um marcador positivo e um nível diminuído um marcador negativo. O nível detectável do ácido nucléico ou polipeptídeo do marcador é suficientemente maior ou menor nas células em questão, em comparação com outras células, de modo que a célula em questão pode ser identificada e distinguida de outras células com o uso de qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica.

[00112] "Matriz", conforme usado no presente documento, refere-se a um suporte tridimensional ao qual as células podem se fixar.

[00113] "Célula do mesendoderma", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dos seguintes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF-17, GATA-6.

[00114] "Célula pancreática endócrina" ou "célula que expressa hormônio pancreático", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula capaz de expressar pelo menos um dos seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostatina, e polipeptídeo pancreá- tico.

[00115] "Célula que secreta hormônio pancreático", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula capaz de secretar pelo menos um dos seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostati- na, e polipeptídeo pancreático.

[00116] "Célula de linha pré-primitiva", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dos seguintes marcadores: Nodal ou FGF-8.

[00117] "Célula de linha primitiva", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dos seguintes marcadores: Brachyury, proteína homeobox do tipo mistura, ou FGF-4.

[00118] "Superfície", conforme usado no presente documento, refere-se à camada mais externa de moléculas de um vaso ou matriz de substrato sólido destinado ao uso em cultura ou análise celular. A composição elementar, a rugosidade e a molhabilidade da superfície podem ser analisadas através de espectroscopia fotoeletrônica de raio X (XPS), microscopia de força atômica(AFM) e medição de ângulo de contato, respectivamente.

[00119] "Placa de superfície modificada" refere-se a um vaso que contém qualquer uma das superfícies de 1 a 34, descritas nos exemplos 16, 17 e 26, ou placas que contêm superfícies que são vendidas sob o nome comercial de Nunclon Delta®, Costar ®, Falcon®, CellBIND® e Primaria®. O vaso pode, por exemplo, ser feito de um polímero, como poliestireno (PS), copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato (PC), metacrilato de polimetila (PMMA), ou copolímero esti- reno e acrilonitrila (SAN).

[00120] As células-tronco são células não diferenciadas definidas por sua capacidade, em nível unicelular, tanto para autorrenovação como para diferenciação para produzir células progenes, inclusive progenitoras autorrenováveis, progenitoras não renováveis e células terminalmente diferenciadas. As células-tronco são também caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar, in vitro, em células funcionais de várias linhagens celulares de múltiplas camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma), bem como por sua capacidade de originar, após transplante, tecidos de múltiplas camadas germi- nativas e de contribuir substancialmente para a maioria, senão todos,dos tecidos após a injeção em blastocistos.

[00121] As células-tronco são classificadas por seu potencial de de-senvolvimento, como: (i) totipotente, ou seja, com capacidade de criar todos os tipos celulares embrionários e extraembrionários; (ii) pluripo- tente, ou seja, com capacidade de criar todos os tipos celulares embrionários; (iii) multipotente, ou seja, com capacidade de criar um subconjunto de linhagens celulares, mas todas em um tecido, órgão ou sistema fisiológico particular (por exemplo, células-tronco hematopoé- ticas (HSC) podem produzir progênie que inclui HSC (autorrenovação), progenitores oligopotentes restritos de células sanguíneas e todos os tipos e elementos celulares (por exemplo, plaquetas) que são componentes normais do sangue); (iv) oligopotente, ou seja, com capacidade de criar um conjunto de linhagens celulares mais restrito que as células-tronco multipotentes; e (v) unipotente, ou seja, com capacidade de criar uma única linhagem celular (por exemplo, células-tronco esper- matogênica).

[00122] Diferenciação é o processo pelo qual uma célula não especializada ("não comprometida") ou menos especializada adquire as características de uma célula especializada, como uma célula nervosa ou muscular. Uma célula diferenciada ou induzida por diferenciação é aquela que assumiu uma posição mais especializada ("comprometida") dentro da linhagem de uma célula. O termo "comprometido", quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que procedeu na rota de diferenciação a um ponto em que, sob circunstâncias normais, continuará a se diferenciar em um tipo celular específico ou subconjunto de tipos celulares, e não pode, sob circunstâncias normais, se diferenciar em um tipo celular diferente ou reverter para um tipo celular diferenciado. A desdiferenciação refere-se ao processo pelo qual uma célula retorna a uma posição menos especializada (comprometida) na linhagem de uma célula. Conforme usado no pre sente documento, a linhagem de uma célula define a hereditariedade da célula, isto é, de quais células a mesma pode vir e quais células a mesma pode criar. A linhagem de uma célula a coloca dentro de um esquema hereditário de desenvolvimento e diferenciação. Um marcador específico de linhagem refere-se a uma característica especificamente associada ao fenótipo das células de uma linhagem em questão, e pode ser usado para avaliar a diferenciação de uma célula não comprometida em relação à linhagem em questão.

[00123] Vários termos são usados para descrever as células em cultura. "Manutenção" refere-se genericamente à celulas localizadas em um meio de crescimento sob condições que facilitam a divisão e/ou o crescimento celular que pode, ou não, resultar em uma maior população das células. "Passar/passagem" refere-se ao processo de remoção das células de um vaso de cultura e colocação das células em um segundo vaso de cultura sob condições que facilitam a divisão e/ou o crescimento celular.

[00124] Uma população específica de células, ou uma linhagem celular, é referida ou caracterizada pelo número de vezes que a mesma passou. Por exemplo, uma população celular cultivada que passou dez vezes pode ser referida como uma cultura P10. A cultura primária, isto é, a primeira cultura após a isolação de células de tecido, é designada como P0. Após a primeira subcultura, as células são descritas como uma cultura secundária (P1 ou passagem 1). Após a segunda subcul- tura, as células se tornam uma cultural terciária (P2 ou passagem 2), etc. Será compreendido por aquele versado na técnica que pode haver muitas duplicações de populações durante o período de passagem; o número de duplicações de populações de uma cultura é, portanto, maior que o número de passagens A expansão de células (isto é, o número de duplicações de populações) durante o período entre passagens, depende de muitos fatores, incluindo, mas não se limitando a, densidade de cultivo, substrato, meio, condições de crescimento, e tempo entre passagens.

[00125] Em uma modalidade, a presente invenção descreve um método para acentuar a adesão de células a uma superfície que contém pelo menos cerca de 0,9% N, uma soma de O e N maior ou igual a 22,3% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, que não tem uma camada de célula alimentadora e nem uma camada adsorvente, que compreende as etapas de:

[00126] Obter uma suspensão de células e

[00127] Adicionar a suspensão de células à superfície e permitir que as células se fixem.

[00128] Em uma modalidade, a presente invenção descreve um método para acentuar a adesão de células a uma superfície que contém pelo menos cerca de 0,5% N, uma soma de O e N maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus, que não tem uma camada de célula alimentadora e nem uma camada adsorvente, que compreende as etapas de:

[00129] Obter uma suspensão de células,

[00130] Tratar a suspensão de células com pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em: um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase, e um composto capaz de inibir a atividade de Rho, e

[00131] Adicionar a suspensão de células à superfície e permitir que as células se fixem.

[00132] Em uma modalidade a suspensão de células em uma suspensão de agrupamentos de células. Em uma modalidade alternativa, a suspensão de células é uma suspensão de células únicas.

[00133] Em uma modalidade, as células são células-tronco pluripo- tentes. Em uma modalidade alternativa, as células são células-tronco.

[00134] Em uma modalidade, a superfície tem uma camada adsor- vente. Em uma modalidade, a camada adsorvente é um componente de matriz extracelular como, por exemplo, aqueles derivados da membrana basal ou que podem formar parte dos acoplamentos do recep- tor-ligante da molécula de adesão. Em uma modalidade, a camada adsorvente é produzida de MATRIGEL (Becton Dickenson). MATRI- GEL é uma preparação solúvel obtida de células tumorais Engelbreth- Holm Swarm que forma um gel à temperatura ambiente para formar uma membrana basal reconstituída. A camada adsorvente proteinácea pode também ser formada de laminina, fibronectina, proteoglicano, en- tactina, heparan sulfato, e similares, sozinhos ou em várias combinações.

[00135] Em uma modalidade, as células são mantidas em cultura depois que as células se fixam à superfície. Em uma modalidade alternativa, o ao menos um composto é removido após a adesão celular à superfície. Em uma modalidade, as células são desprendidas da superfície na remoção do pelo menos um composto.

[00136] Em uma modalidade, a suspensão de células é tratada com ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase. Em uma modalidade alternativa, a suspensão de células é tratada com ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho. Em uma modalidade alternativa, a suspensão de células é tratada com ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase e ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho.

[00137] O ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase é selecionado do grupo que consiste em: Y-27632, Fasu- dil, e Hidroxifasudil.

[00138] Em uma modalidade, o ao menos composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase é Y-27632.

[00139] O ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase pode ser usado a uma concentração de cerca de 0,1 μM a cerca de 100 μM. Em uma modalidade, o ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho-quinase é usado a uma concentração de cerca de 10 μM.

[00140] Em uma modalidade, o ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho é um inibidor de Rho GTPase.

[00141] Em uma modalidade, o ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho é Transferase C3 de exoenzima.

[00142] O ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho pode ser usado a uma concentração de cerca de 0,01 μg/mL a cerca de 5 μg/mL. Em uma modalidade, o ao menos um composto capaz de inibir a atividade de Rho é usado a uma concentração de cerca de 0,5 μg/mL.

Placas de Superfície Modificada

[00143] As placas de superfície modificada adequadas ao uso na presente invenção podem ser vasos cujas superfícies foram modificadas para conter pelo menos cerca de 0,5% N, uma soma de O e N maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus. Alternativamente, a superfície pode ser uma matriz tridimensional como, por exemplo, um arcabouço poroso, ao qual as células podem se fixar.

[00144] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 0,5% N, uma soma de O e N maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus. Em uma modalidade alternativa, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 0,5% N, uma soma de O e N maior ou igual a 19,5% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus.

[00145] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 1,3% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 24,9% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 20,7 graus, que é referido no presente documento como placa de superfície modificada 1.

[00146] Em uma modalidade, as placasde superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 1,7% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 29,6% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 14,3 graus, que é referido no presente documento como placa de superfície modificada 2.

[00147] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 2,0% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 30,7% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 18,4 graus, que é referido no presente documento como placa de superfície modificada 3.

[00148] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 2,1% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 30,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 17,4 graus, que é referido no presente documento como placa de superfície modificada 4.

[00149] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 1,8% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 28,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 18,8 graus, que é referido no presente documento como placa de superfície modificada 13.

[00150] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 1,0% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 27,8% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 44,3 graus, que é vendida sob o nome comercial CELLBIND.

[00151] Em uma modalidade, as placas de superfície modificada compreendem uma placa cuja superfície contém pelo menos cerca de 10,2% N, uma soma de O e N de pelo menos cerca de 23,0% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 39,5 graus, que é vendida sob o nome comercial PRIMARIA.

Caracterização das Placas de Superfície Modificada

[00152] Em uma modalidade, a composição elementar da superfície das placas de superfície modificada pode ser analisada por espectros- copia fotoeletrônica de raios X (XPS). XPS, também chamada de es- pectroscopia eletrônica para análise química (ESCA), é usado como um método para determinar quais elementos ou átomos estão presentes na superfície de um substrato sólido (todos os elementos em concentrações menores que 0,1 em porcentagem atômica podem ser detectados, exceto hidrogênio e hélio), e para determinar o ambiente de ligação de tais elementos ou átomos. Como um exemplo, uma análise por XPS de um amostra sólida de poliestireno (contém apenas carbono e hidrogênio) daria tipicamente mais que 97% de carbono, menos que 3% de oxigênio, e 0% de nitrogênio (hidrogênio não é detectado; níveis diferentes de oxigênio podem ser detectados devido à oxidação das cadeias de poliestireno na superfície, por exemplo, como um resultado de esterilização por irradiação) (Brevig et al., Biomaterials 26:3039 a 3053, 2005; Shen e Horbett, J. Biomed. Mater. Res. 57:336 a 345, 2001).

[00153] Em uma modalidade, a rugosidade da superfície das placas de superfície modificada pode ser analisada por microscopia de força atômica (AFM). Os átomos ou moléculas da superfície com uma resolução lateral a 1Â e uma resolução vertical a 0,1Â podem ser captados por AFM.

[00154] Em uma modalidade, a molhabilidade da superfície das placas de superfície modificada pode ser analisada mediante a medição do ângulo de contato. Por exemplo, a medição do ângulo de contato pelo método da gota séssil estática fornece informação na intera- ção entre a superfície de um substrato sólido e um líquido. O ângulo de contato descreve o formato de uma gota de líquido que resta sobre a superfície do substrato sólido, e é o ângulo de contato do líquido sobre a superfície do substrato sólido, medido com o líquido na linha de contato onde o líquido, sólido e gás se encontram. Uma superfície com um ângulo de contato da água maior que 90° é design ado como hidro- fóbico, e uma superfície com ângulo de contato da água menor que 90° é designado como hidrofílico. Em superfícies ex tremamente hidro- fílicas, isto é, superfície que têm uma alta afinidade com água, uma gotícula de água será completamente aspergida (um ângulo de contato eficaz de 0°).

[00155] Em uma modalidade, a densidade de carga negativa da superfície das placas de superfície modificada pode ser analisada mediante a medição da reatividade da superfície com cristal violeta. O cristal violeta transporta uma carga positiva, que habilita o mesmo a se ligar às moléculas negativamente carregadas e partes de molécula, por exemplo, grupos funcionais carregados negativamente presentes em uma superfície polimérica. Uma superfície com uma alta reativida- de de cristal violeta tem uma densidade mais alta de cargas negativas que uma superfície com uma baixa reatividade de cristal violeta, dado que as superfícies têm a mesma rugosidade e, desta forma, área.

Células-Tronco Pluripotentes Caracterização de células-tronco pluripotentes

[00156] As células-tronco pluripotentes podem expressar um ou mais dos antígenos embrionários estágio-específicos (SSEA) 3 e 4, bem como marcadores detectáveis com o uso dos anticorpos designados Tra-1-60 e Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145 1998). A diferenciação de células-tronco pluripotentes in vitro resulta na perda de expressão de SSEA-4, Tra-1-60, e Tra-1-81 (caso esteja presente) e na expressão diminuída de SSEA-1. As células-tronco pluripotentes não diferenciadas tipicamente têm atividade de fosfatase alcalina, que pode ser detectada através da fixação das células com 4% de para- formaldeído e, então, desenvolver com Vetor Vermelho como um substrato, conforme descrito pelo fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Califórnia, EUA). As células-tronco pluripotentes não diferenciadas também expressam, tipicamente, Oct-4 e TERT, conforme detectado por meio de RT-PCR.

[00157] Outro fenótipo desejável de células-tronco pluripotentes propagadas é um potencial para se diferenciar em células de todas as três camadas germinais: tecidos do endoderma, mesoderma e ectoderma. A pluripotência de células-tronco pode ser confirmada, por exemplo, através da injeção de células em camundongos com imunodeficiência combinada severa (SCID), que fixa os teratomas que se foram com o uso de 4% de paraformaldeído e, então, que examina his- tologicamente os mesmos em busca de evidência de tipos celulares a partir das três camadas germinais. Alternativamente, a pluripotência pode ser determinada criando-se corpos embroides e avaliando-os quanto à presença de marcadores associados com as três camadas germinais.

[00158] As linhagens de células-tronco pluripotentes propagadas podem ser submetidas a cariotipagem com o uso de uma técnica- padrão de bandamento G, sendo então comparadas aos cariótipos publicados das espécies de primata correspondentes. É desejável a obtenção de células que tenham um "cariótipo normal", o que significa que as células são euploides, em que todos os cromossomos humanos estão presentes e sem alterações perceptíveis.

Fontes de células-tronco pluripotentes

[00159] Os tipos de células-tronco pluripotentes que podem ser usados incluem linhagens estabelecidas de células pluripotentes derivadas de tecido formado após a gestação, inclusive tecido pré- embrionário (como um blastocisto), tecido embrionário, ou tecido fetal coletado a qualquer tempo durante a gestação, tipicamente porém não necessariamente antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestação. Os exemplos não limitadores são linhagens estabelecidas de células ES humanas ou células germinais embrionárias humanas como, por exemplo, as linhagens celulares ES H1, H7 e H9 humanas (WiCell). É também contemplado o uso das composições desta descrição durante o estabelecimento inicial ou a estabilização dessas células, caso no qual as células-fonte seriam células pluripotentes primárias coletadas diretamente dos tecidos-fonte. São também adequadas células tomadas de uma população de células-tronco pluripotentes já cultivadas na ausência de células alimentadoras, bem como de uma população de células-tronco pluripotentes já cultivadas na presença de células alimentadoras. Também adequadas são as linhagens celulares ES humanas mutantes como, por exemplo, BG01v (BresaGen, Atenas, Grécia). São também adequada as células derivadas de células somáticas de seres humanos adultos como, por exemplo, células apresentadas em Takahashi et al., Cell 131: 1 a 12 (2007).

[00160] Em uma modalidade, as células ES humanas são preparadas conforme descrito por Thomson et al. (U.S. patente n° 5.843.780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92:7844, 1995).

Cultura de células-tronco pluripotentes

[00161] Em uma modalidade, as células-tronco pluripotentes são cultivadas em uma camada de célula alimentadora ou proteína de matriz extracelular que suportam as células-tronco pluripotentes de várias maneiras, anteriormente à cultivação, de acordo com os métodos da presente invenção. Por exemplo, as células-tronco pluripotentes são cultivadas em uma camada de célula alimetadora que suporta a proliferação de células-tronco pluripotentes sem passar por uma diferenci- ação substancial. O crescimento de células-tronco pluripotentes em uma camada de célula alimetadora sem diferenciação é suportado com o uso de (i) obtenção de um vaso de cultura que contém uma camada de célula alimetadora; e (ii) um meio condicionado através da prévia cultivação com outro tipo celular, ou um meio não condicionado, por exemplo, sem soro ou até quimicamente definido.

[00162] Em outro exemplo, as células-tronco pluripotentes são cultivadas em um sistema de cultura que é essencialmente livre de células alimentadoras, mas que, apesar disso, suporta a proliferação de células-tronco pluripotentes sem passar por uma diferenciação substancial. O crescimento de células-tronco pluripotentes em uma cultura livre de células alimentadoras sem diferenciação é suportado com o uso de (i) uma camada adsorvente em uma superfície de substrato sólido com uma ou mais proteínas de matriz extracelular; e (ii) um meio condicionado através da prévia cultivação com outro tipo celular, ou um meio não condicionado, por exemplo, sem soro ou até quimicamente definido.

[00163] Em uma modalidade alternativa, as células-tronco pluripo- tentes são modificadas em uma placa de superfície modificada que contém pelo menos cerca de 0,5% N, uma soma de O e N maior ou igual a 17,2% e um ângulo de contato de pelo menos cerca de 13,9 graus em um meio condicionado através da prévia cultivação com outro tipo celular, ou em um meio não condicionado, por exemplo, sem soro ou até quimicamente definido.

[00164] Meio de Cultura: Um exemplo de meio de cultura celular, adequado ao uso na presente invenção, pode ser encontrado em US20020072117. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em US6642048. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em WO2005014799. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em Xu et al. (Stem Cells 22: 972 a 980, 2004). Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em US20070010011. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870; 19 outubro 2005). Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568 a 574, 2006). Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em US20050148070. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em US20050233446. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em US6800480. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em US20050244962. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em WO2005065354. Outro exemplo de meio de cultura celular adequado ao uso na presente invenção pode ser encontrado em WO2005086845.

[00165] Os meios de cultura adequados podem também ser produzidos a partir, por exemplo, dos seguintes componentes: meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco No 11965-092; meio de Eagle modificado de Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gibco No 10829018; meio basal DMEM F12/50% de Ham; 200 mM de L-glutamina, Gibco No 15039-027; solução de aminoácidos não essenciais, Gibco 11140-050; β-mercapto etanol, Sigma No M7522; fator de crescimento de fibroblasto básico recombinante humano (bFGF), Gibco No 13256029.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes

[00166] Em uma modalidade da presente invenção, as células- tronco pluripotentes são propagadas em cultura, enquanto mantêm sua pluripotência. Alterações na pluripotência das células com o tempo podem ser determinadas através da detecção de alterações nos níveis de expressão de marcadores associados à pluripotência. Alternativamente, as alterações na pluripotência podem ser monitoradas através da detecção de alterações nos níveis de expressão de marcadores associados à diferenciação ou de marcadores associados a outro tipo celular.

[00167] Em uma modalidade alternativa, as células-tronco pluripo- tentes são propagadas em cultura e então tratadas de uma maneira que promove sua diferenciação em outro tipo celular. O outro tipo celular pode ser uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo. Alternativamente, o tipo celular pode ser uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático. Alternativamente, o tipo celular pode ser uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem pancreática endócrina. Alternativamente, o tipo celular pode ser uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem celular-β.

[00168] As células-tronco pluripotentes tratadas de acordo com os métodos da presente invenção podem ser diferenciadas em uma variedade de outros tipos celulares por meio de qualquer método adequado na técnica.

[00169] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes tratadas de acordo com os métodos da presente invenção podem ser diferenciadas em células neurais, células cardíacas, hepatócito, e similares.

[00170] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes tratadas de acordo com os métodos da presente invenção podem ser diferenciadas em progenitores neurais e cardiomiócitos de acordo com os métodos apresentados em WO2007030870.

[00171] Em outro exemplo, as células-tronco pluripotentes tratadas de acordo com os métodos da presente invenção podem ser diferenciadas em hepatócitos de acordo com os métodos apresentados na patente U.S. 6.458.589.

[00172] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo de acordo com os métodos descritos em D’Amour et al., Nature Biotechnol. 23:1534 a 1541, 2005.

[00173] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo de acordo com os métodos descritos em Shinozaki et al., Development 131:1651 a 1662, 2004.

[00174] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo de acordo com os métodos descritos em McLean et al., Stem Cells 25:29 a 38, 2007.

[00175] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo de acordo com os métodos descritos em D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392 a 1401, 2006.

[00176] Os marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo são selecionados a partir do grupo que consiste em SOX17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF-8, Brachyury, proteína de homeobox do tipo mistura, FGF-4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF-17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 e OTX2. A célula adequada ao uso na presente invenção é a célula que expressa ao menos um dos marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula precursora da linha primitiva. Em um aspecto alternativo, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula do mesendoderma. Em um aspecto alternativo, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula do endoderma definitivo.

[00177] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático de acordo com os métodos descritos em D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392 a 1401, 2006.

[00178] Os marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático são selecionados a partir do grupo consistindo em Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 e PROX1. Uma célula que expressa ao menos um dos marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático é adequada ao uso na presente invenção. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático é uma célula do endoderma pancreático.

[00179] As células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem pan- creática endócrina por qualquer método na técnica.

[00180] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem pancreática endócrina de acordo com os métodos descritos em D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392 a 1401, 2006.

[00181] Por exemplo, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem pancreática endócrina pelos métodos descritos em D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392 a 1401, 2006.

[00182] Os marcadores característicos da linhagem endócrina pan- creática são selecionados a partir do grupo consistindo em: NGN-3, NeuroD, ilhota-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, e PTF-1 alfa. Em uma modalidade, uma célula pancreática endócrina é capaz de expressar pelo menos um dos seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostati- na, e polipeptídeo pancreático. É adequada ao uso na presente invenção uma célula que expressa pelo menos um dos marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática é uma célula pancreática endócrina. A célula pancreática endócrina pode ser uma célula que expressa o hormônio pancreático. Alternativamente, a célula pancreática endócri- na pode ser uma célula que secreta hormônio pancreático.

[00183] Em um aspecto da presente invenção, a célula pancreática endócrina é uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem de célula β. Uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem celular-β expressa Pdx1 e pelo menos um dos seguintes fatores de transcrição: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4, e Pax6. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem celular-β é uma célula β.

[00184] A presente invenção é ilustrada com mais detalhes pelos exemplos a seguir, porém não é limitada pelos mesmos.

Exemplos Exemplo 1 Passagem e manutenção de Células-Tronco Embrionárias Humanas como Agrupamento Celular

[00185] As linhagens celulares ES humanas H1 e H9 foram inicialmente mantidas em fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) primários inativados com mitomicina C. As células ES humanas foram trocadas dos alimentadores MEF para Matrigel® (Becton-Dickinson, Bedford, MA, EUA) por passagens repetidas.

[00186] Tratamento de superfícies com Matrigel®: O fator de crescimento reduzido Matrigel® foi descongelado a 4°C e então diluído na razão de 1:30 em DMEM/F12 resfriado (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Foram adicionados volumes suficientes para cobrir a superfície em cada prato de 6 cm (2 mL) ou em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades (1 mL), e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. As superfícies tratadas foram usadas por poucas horas ou armazenadas a 4°C por duas semanas.

[00187] Cultura celular ES humana: Colônias de célula ES humana não diferenciadas (tanto da linhagem H9 quanto H1) foram colhidas a partir das camadas alimentadoras por incubação em colagenase IV a 1 mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em DMEM/F12 por 10 minutos, seguido de raspagem com uma pipeta. Os nódulos celulares foram peletizados por centrifugação a 600 X g por quatro minutos e o pélete suavemente dispersado com uma pipeta de 2 mL para quebrar as colônias em pequenos agrupamentos de células. Estes agrupamentos celulares foram cultivados em pratos tratados em Matrigel® em meio condicionado com fibroblastos embrionários murinos (MEF-CM), adicionalmente suplementados com bFGF (8 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA), em 50 a 150 colônias por prato de 6 cm em meio de crescimento de 5 mL. O meio foi alterado diariamente. As colônias em Matrigel® em MEF-CM se tornam maiores e passaram a ocupar de 70 a 80% da área de superfície, aproximadamente a cada 3 a 4 dias. As células ES humanas nas colônias tiveram uma alta razão núcleo/citoplasma e tiveram nucléolos prominientes, similares às células ES humanas mantidas em alimentadores (figura 1). As células diferenciadas representaram menos que 5% do total de células em cultura.

[00188] Para a passagem de rotina de células em MEF-CM em Ma- trigel®, as células foram incubadas em colagenase IV a 1 mg/mL emDMEM/F12 por até 60 minutos e removidos dos pratos por fortes correntes de DMEM/F12 com raspagem. As células foram peletizadas, dispersadas e cultivadas a uma razão de 1:3 ou 1:4.

Exemplo 2 Passagem de Células-Tronco Embrionárias Humanas como Células Únicas

[00189] As células ES humanas da linhagem celular H9 foram desenvolvidas como células únicas de acordo com os métodos descritos no pedido de patente U.S. LFS5163USPSP, atribuído ao LifeScan Inc. As células passaram por tratamento com TrypLE® Express por cinco minutos a 37°C, e cultivadas em superfícies do substrato de 10.000 células/cm2.

Exemplo 3 Adesão, Cultivo e Manutenção de Pluripotência de Células-Tronco Embrionárias Humanas com o Uso de Componentes/Proteínas de Matriz Extracelular sem Placas de Superfície Modificada e sem Células Alimentadoras

[00190] As células ES humanas da linhagem H1, na passagem 49, foram mantidas em meio condicionado de MEF em placas de Nunclon Delta® tratadas com uma diluição de 1:30 de fator de crescimento reduzido Matrigel®, anteriormente ao estudo. As células foram dissociadas da superfície para passagem por dissociação por colagenase a 1 mg/mL ou por raspagem manual.

[00191] Estas células foram então cultivadas em duas cavidades não tratadas das placas de superfície modificadas (formato de 6 cavidades). Adicionalmemte, uma cavidade de cada placa foi tratada com gelatina humana livre de xeno a 0,1% como um controle. As células foram também diretamente plaqueadas em placas de 6 cavidades em cavidades não tratadas e tratadas em gelatina de Costar® (cat. no 3516; Corning, Corning, NY, EUA), Falcon® (cat. no 351146; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) e Nunclon Delta® (cat. no 140675; Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) para controles negativos, e plaqueadas em cavidades tratadas com Matrigel® com diluição de fator de crescimento reduzido a 1:30 para fornecer como controles positivos. Em todos os tratamentos, as células foram mantidas em meio condicionado de MEF.

[00192] Após duas passagens, as placas de superfície modificada 2, 3, e 4 tinham fixado as colônias de células ES, que se reafixaram às placas e se desenvolveram após a dissociação enzimática. Não houve nenhuma diferença aparente na taxa de adesão ou crescimento nas cavidades não tratadas ou com gelatina das placas de superfície modificada 2, 3, ou 4.

[00193] As células mecanicamente dissociadas das placas tratadas em Matrigel® com diluição a 1:30 de fator de crescimento reduzido foram fracamente fixadas às placas de superfície modificada 2, 3 e 4, enquanto as células enzimaticamente dissociadas com colagenase a 1 mg/mL foram bem fixadas nas cavidades não tratadas ou com gelatina das placas de superfície modificada 2, 3 ou 4.

[00194] As células ES H1p49 adicionadas às placas de superfície modificada 1 e 5 a 12 e às placas Nunclon Delta® tratadas com gelatina ou não tratadas, às placas Falcon® e às Costar® não se fixaram. As mesmas células não se fixaram às placas tratadas em Matrigel® com diluição de fator de crescimento reduzido a 1:30, o que indica que as células se fixaram de forma competente a uma superfície do substrato.

[00195] O tempo normal de passagem das células ES da linhagem H1 plaqueadas em Matrigel® com diluição a 1:30 de fator de crescimento foi de 3 a 4 dias, entretanto, as células plaqueadas nas placas de superfície modificada 2, 3 e 4 levaram 7 dias de cultivo antes de estarem prontas para a passagem. Isto provavelmente ocorreu devido à taxa reduzida de adesão nas superfícies tratadas, uma vez que mais colônias de início ficaram aparentes nas superfícies tratadas em Matri- gel® imediatamente após o plaqueamento nas superfícies 2, 3 e 4.

[00196] As células de passagem (p) 50 foram divididas a uma razão de 1 para 2 e metade da amostra foi coletada para a purificação de RNA e testada quanto à expressão de marcadores de pluripotência (tabela 1). A outra metade de cada amostra foi replaqueada às placas de superfície modificada. As colônias que se formaram nesta passagem (p51) também precisaram de 7 dias de cultivo antes de ficarem prontas para serem passadas, e as pequenas colônias que se desenvolveram após apenas 4 dias de cultivo são mostradas na figura 1. Estas colônias mantiveram a morfologia clássica de colônias de célula ES.

[00197] As culturas foram interrompidas na passagem 4 nas placas de superfície modificada 2, 3 e 4 e as amostras foram testadas quanto aos marcadores de pluripotência por meio de qRT-PCR (tabela 2) e diferenciadas até um destino do endoderma definitivo (DE). As células na passagem 4 mantiveram a expressão dos marcadores clássicos de pluripotência: Oct4, Nanog, Sox2, e TERT. Além disso, as células foram capazes de se diferenciar até um destino endodérmico definitivo sob exposição a um meio que contém DMEM/F12, ativina A a 100 ng/mL, Wnt3a a 20 ng/mL e SFB a 0,5 a 2,0% (tabela 3) que indica que a pluripotência foi mantida nas células através da passagem 4.

Exemplo 4 Adesão, Cultivo e Manutenção da Pluripotência de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Placas de Superfície Modificada sem Componentes/Proteínas de Matriz Extracelular e sem Células Alimen- tadoras: Efeitos na inibição de Rho e na inibição da Rho quinase

[00198] As células ES humanas da linhagem H1, na passagem 49, foram mantidas em meio condicionado de MEF em placas tratadas Nunclon Delta® em Matrigel® com uma diluição de 1:30 de fator de crescimento reduzido, anteriormente ao estudo. As células foram dissociadas a partir da superfície para passagem por dissociação por co- lagenase a 1 mg/mL.

[00199] Estas células foram então cultivadas em cavidades não tratadas de placas de superfície modificada (formato de 6 cavidades). As células foram também diretamente plaqueadas em cavidades tratadas de gelatina e não tratadas de placas de 6 cavidades Costar®, Falcon® e Nunclon Delta® para controles negativos e plaqueadas em cavidades tratadas com diluição de fator de crescimento reduzido a 1:30 Ma- trigel® para fornecer como controles positivos. Em todos os tratamentos, as células foram mantidas em meio condicionado de MEF.

[00200] As células ES humanas da linhagem H1, na passagem 49, adicionadas às placas de superfície modificada 1 e 5 a 12 e às placas Nunclon Delta® tratadas de gelatina ou não tratadas e as placas Costar® não se fixaram, contudo, as mesmas se fixaram às placas de superfície modificada 2, 3 e 4. As mesmas células se fixaram às placas tratadas em diluição de 1:30 de Matrigel® reduzido de fator de crescimento, o que indica que as células se fixaram de forma competente a uma superfície do substrato.

[00201] O tempo normal de passagem para células ES H1 plaquea- das em diluição 1:30 de Matrigel® reduzido de fator de crescimnto foi de 3 a 4 dias, entretanto, as células plaqueadas nas placas de superfície modificada 2, 3 e 4 levaram 7 dias de cultivo antes de ficarem prontas para a passagem. Isso foi, provavelmente, devido à taxa reduzida de adesão sobre as placas de superfície modificada, visto que mais colônias de início ficaram aparentes sobre superfícies tratadas em Ma- trigel® imediatamente após o plaqueamento do que sobre as placas de superfície modificada 2, 3 e 4.

[00202] As células de passagem (p) 50 foram divididas a uma razão de 1 para 2 e metade da amostra foi coletada para a purificação de RNA e testada quanto à expressão dos marcadores de pluripotência (tabela 1). A outra metade de cada amostra foi replaqueada às placas de superfície modificada. As colônias que se formaram nesta passagem (p51) também precisaram de 7 dias de cultivo antes de ficarem prontas para serem passadas, e as pequenas colônias que se desen-volveram após apenas 4 dias de cultivo são mostradas na figura 1. Estas colônias mantiveram a morfologia clássica de colônia de célula ES.

[00203] Devido ao atraso na passagem, as células foram divididas a uma razão de 1 para 2 e metade das amostras da passagem 4 foram plaqueadas em meio condicionado em MEF ou meio condicionado em MEF suplementado com o inibidor de Rho-quinase (ROCK), Y-27632, em uma concentração de 10 μM em uma tentativa de otimizar as cinéticas de crescimento celular. As células foram mantidas no meio de plaqueamento por 48 horas após a passagem, e nesse momento o meio foi mudado para um meio condicionado fresco de MEF não suplementado.

[00204] A adição de Y-27632 a uma concentração de 10 μM aumentou significativamente a eficiência de plaqueamento das células (p52) e o aprimoramento em crescimento de colônia foi aparente após 4 dias de pós-plaqueamento (figura 2). Alternativamente, antes da dissociação de colagenase, as células ES humanas da linhagem H1 também foram tratadas com 0,5 ng/mL de uma forma permeável de célula do inibidor de Rho, exotransferase de C3, que também aumentou a eficiência de plaqueamento das células.

[00205] Enquanto as células plaqueadas em Y-27632 (10 μM) poderiam ser passadas 4 dias após o plaqueamento, as células plaquea- das sem o inibidor de ROCK não estavam prontas para serem divididas 4 dias após o plaqueamento. As células tratadas com inibidor de Rho, exotransferase de C3 também não estavam prontas para a pas- sagem 4 dias após o plaqueamento e as células exibiram diferenciação aumentada para uma morfologia parecida com fibroblasto. Consequentemente, as células tratadas com inibidor de Rho na passagem 4 foram tratadas com Y-27632 em todas as passagens subsequentes (figura 3).

[00206] As células foram adicionalmente passadas para pelo menos 10 passagens sobre as placas de superfície modificada 3 e 4 e foram testadas para a presença de marcadores associados com pluripotên- cia: genes através de qRT-PCR; expressão de marcador de superfície celular através de citometria de fluxo e imunofluorescência de superfície celular e proteínas nucleares (figuras 4 a 6). A pluripotência celular foi também confirmada através do teste de sua capacidade de diferenciação em endoderma definitivo, endoderma pancreático e formação de corpos embrioides compostos das três camadas germinativas (figuras 7 a 9). As células também foram testadas para estabilidade cariotí- pica e observou-se que células poderiam manter um cariotipo normal (figura 10).

Exemplo 5 Adesão e Desprendimento de Células-tronco Embrionárias Humanas Através de Inibição de Rho-quinase

[00207] As células ES humanas da linhagem H9, na passagem 40 foram mantidas em meio condicionado em MEF em placas Nunclon Delta® tratadas com uma diluição de 1:30 de fator de crescimento reduzido Matrigel®, antes do estudo. As células foram dissociadas da superfície para a passagem através de dissociação por colagenase (1 mg/mL) ou através de raspagem manual.

[00208] Essas células foram então semeadas sobre as placas de superfície modificada 2, 3, 4 e 13 (formato de cavidade 12) na presença de uma quantidade crescente dos seguintes inibidores de Rho- quinase: Y-27632 (de Sigma, St. Louis, MO, EUA ou EMD, San Diego, CA, EUA), Fasudil (Sigma) ou Hidróxifasudil (Sigma), e mantidas por 3 dias, substituindo-se o meio e composto todos os dias. Ao final do terceiro dia, o meio foi removido e as placas foram coradas com cristal violeta (0,5% em água) para revelar as colônias.

[00209] No terceiro dia, as placas de superfície modificada 2, 3, 4 e 13 fixaram as colônias de célula ES na presença de quantidade crescente de inibidor de Rho-quinase. Os melhores resultados foram obtidos através do uso de Y-27632 (10 μM), embora pode-se observar que algumas colônias se fixaram e cresceram com os inibidores de Rho- quinase, Fasudil e Hidróxifasudil (figura 11).

[00210] Objetivando determinar a dose mais adequada de Y-27632 para promover a ligação celular, através do tratamento das células com uma faixa de concentrações de plaqueamento de Y-27632 para o primeiro dia de cultura. Após o primeiro dia em cultura, as células foram tratadas em dias subsequentes com Y-2763210 a uma concentração de 10 μM. Foi observado que a concentração máxima para estimular a adesão e o crescimento de células ES foi de 10 μM (figura 12) e que isso ocorreu nas placas de superfície modificada 2, 3, 4, 13 e CellBIND® (Corning, Corning, NY).

[00211] Foi também testado o efeito sobre a adesão e crescimento do tratamento contínuo de células com uma única dose de Y-27632. As células foram dosadas com Y-27632 a 0, 1, 4, ou 10 μM por 4 dias. Alguma ligação foi observada sobre as placas de superfície modificada sem tratamento (0 μM), entretanto, a concentração de Y-27632 mais adequada para estimular a adesão e o crescimento de células ES foi de 10 μM (tabela 4) sobre as placas de superfície modificada 2, 3, 4, 13.

[00212] Posto que a adição de inibidor de ROCK acentua significativamente as cinéticas de plaqueamento e de crescimento sobre as placas de superfície modificada 2, 3, e 4 versus células não tratadas (figura 13), desejou-se determinar se isso foi devido à manutenção de adesão celular apropriada ou devido à proliferação celular aumentada. Observou-se que a inibição de Rho-quinase não aumenta a proliferação celular porque as células tratadas com Y-27632 crescem em uma densidade similar à das células não tratadas (figura 14). Ao invés, o tratamento com Y-27632 mantém a adesão das células à superfície e permite que elas cresçam com cinéticas de proliferação normal (figura 15). A remoção de um inibidor de Rho-quinase do meio de crescimento de células ES plaqueadas na presença de inibidor de Rho-quinase resulta em desprendimento das células a partir da superfície. A formação de corpos embrioides com diferenciação para as 3 linhagens ger- minativas é realizada através da cultura de células ES em uma suspensão. Consequentemente, embora a reaplicação tardia de um inibidor de Rho-quinase tenha restaurado a adesão de células (figura 15), conforme esperado, a diferenciação substancial da cultura de célula ES foi observada em amostras onde o inibidor de Rho-quinase foi removido durante 24 horas da cultura e permitiu-se que as células se desprendessem, crescessem em suspensão durante 24 horas e o inibidor de Rho-quinase foi, então, reaplicado.

Exemplo 6 Células ES humanas H9 que passaram com TrypLE® Express sobre as Placas de Superfície Modificada mostram Adesão Aprimorada com Y-27632

[00213] Passagem inicial de células ES humanas H9 sobre placas de superfície modificada. A adesão é aprimorada com uma concentração contínua de 10 μM de Y-27632. Isso é verdadeiro para as quatro placas de superfície modificada testadas: 2, 3, 4 e 13. As imagens das células H9 24 horas após a semeadura sobre a superfície 3 são mostradas na figura 16.

Exemplo 7 Células-Tronco Embrionárias Humanas Únicas H9 que passaram com TrypLE® Express sobre as Placas de Superfície Modificada Permanecem Pluripotentes

[00214] As células ES humanas são pluripotentes e têm a capacidade de se diferenciar em todas as linhagens celulares. O estado plu- ripotente das células deve ser mantido através da superfície na qual elas crescem. Para determinar se as placas de superfície modificada podem manter a pluripotência de célula ES humana, as células ES humanas foram passadas 38 vezes com colagenase e 38 vezes com TrypLE® Express seguidas de 5 passagens sobre a placa de superfície modificada 3 (superfície 3), placa de superfície modificada 4 (superfície 4) ou Matrigel® em diluição de 1:30. O Y-27632 a 10 μM foi adicionado ao meio de amostras indicadas. A expressão dos marcadores de pluripotência Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3 e SSEA-4, foi avalia-da através de citometria de fluxo. Os resultados são mostrados na figura 17. A porcentagem de células positivas é indicada sobre o eixo geométrico y. As células ES humanas únicas que crescem sobre as placas de superfície modificada 3 e 4 podem manter sua pluripotência. Exemplo 8 Inibição de Rho-quinase Promove a Adesão e Crescimento de Células a partir da Linhagem de Células-Tronco Embrionárias Humanas H9, Cultivadas como Células Únicas sobre Placas de Superfície Modificada mediante Transferência a partir de Matrigel®

[00215] Foi estudada a função do Y-27632 na adesão celular e no crescimento celular de célula ES humana em relação às placas de superfície modificada. As células ES humanas H9 foram passadas 38 vezes com colagenase e 50 vezes com TrypLE® Express seguidas da semeadura sobre as placas de superfícies modificadas 3 ou 4 (células nativas). Alternativamente, as células ES humanas H9 passaram 38 vezes com colagenase e 38 vezes com Triple Express seguidas de 9 passagens sobre a placa de superfície modificada 3 (superfície 3, células aclimadas) ou a placa de superfície modificada 4 (superfície 4, células aclimadas). As células foram semeadas em uma densidade de 104/cm2 em meio condicionado em MEF e cultivadas durante dois dias com ou sem a presença de Y-27632 a 10 μM. Os resultados são mostrados na figura 18. O Y-27632 aprimora a adesão de células naturais nas placas de superfície modificada 3 e 4. O Y-27632 não aprimora a adesão de células aclimadas nas placas de superfície modificada 3 ou 4. A placa de superfície modificada 3 aprimorou a adesão e/ou o crescimento de células nativas. A placa de superfície modificada 4 aprimorou a adesão e/ou crescimento de células ES humanas aclimadas. As células foram acompanhadas por um total de 4 dias (figuras 19 e 20). As células únicas nativas exibiram um aumento da taxa de crescimento quando cultivadas com Y-27632 a 10 μM e a placa de superfície modificada 3 mostrou uma leve vantagem (figura 19). As células únicas aclimadas exibiram taxas de crescimento aprimoradas sem o Y- 27632 a 10 μM (figura 20).

Exemplo 9 Placas de Superfície Modificada podem ser usadas para Triar Compostos

[00216] As placas de superfície modificada em uma configuração de 96 cavidades e no formato-padrão da Society for Biomolecular Screening (SBS) podem ser usadas para cultivar células ES humanas únicas na presença de Y-27632 a 10 μM. As imagens de células únicas H9 plaqueadas em cavidades de placa de 96 cavidades são mostradas na figura 21. Isso poderia permitir a triagem de componentes diretamente em placas de 96 cavidades sem a interferência de células ou camadas adsorventes, como fibroblastos embrionários de camundongo ou Matrigel®, respectivamente.

Exemplo 10 Células-Tronco Embrionárias Únicas Cultivadas em Placas de Superfície Modificada são Capazes de se Diferenciar em Endoderma Definitivo

[00217] Um objetivo é diferenciar células ES humanas em linhagens celulares diferentes. Para determinar se as placas de superfície modificada podem suportar a diferenciação, as células ES humanas foram passadas 38 vezes com colagenase e 38 vezes com TrypLE® Express seguidas de 9 passagens sobre a placa de superfície modificada 3 (superfície 3) ou a placa de superfície modificada 4 (superfície 4). Como um controle positivo, as células ES humanas foram cultivadas em Matrigel® em diluição de 1:30. Foi adicionado Y-27632 a 10 μM ao meio durante a expansão das amostras celulares indicadas. Após a expansão celular, foi avaliada a capacidade das células cultivadas de formarem endoderma definitivo. Brevemente, 70% de culturas confluentes foram tratadas com 100 ng/mL de Ativina A, 10 ng/mL de Wnt3a e 0,5% de SFB em meio de DMEM-F12 durante dois dias. O tratamento foi seguido de 3 dias com 100 ng/mL de Ativina A e 2% de SFB em DMEM/F12. As células diferenciadas em endoderma definitivo são identificadas pela expressão da proteína CXCR4, através de citometria de fluxo (figura 22). A porcentagem de células positivas é indicada sobre o eixo geométrico y. As células ES humanas cultivadas como células únicas podem se diferenciar em endoderma definitivo na presença ou ausência de Y-27632 sobre as placas de superfície modificada 3 e 4.

Exemplo 11 Células-Tronco Embrionárias Únicas Cultivadas em Placas de Superfície Modificada são Capazes de se Diferenciar em Endoderma Pan- creático

[00218] Após o término do protocolo do endoderma definitivo, as células foram incubadas por 3 dias com FGF-7 (50 ng/mL; Sistemas R&D), o inibidor de sonic hedgehog, ciclopamina KAAD (2,5 μM; Sigma-Aldrich) e 2% de SFB em meio DMEM-F12. Nesse ponto, as células não tratadas com Y-27632 durante a expansão se desprenderam das placas de superfície modificada 3 e 4. As células tratadas com Y- 27632 durante a expansão foram incubadas por mais quatro dias com FGF-7 (50 ng/mL), ciclopamina KAAD (2,5 μM), ácido retinóico (1 μM; Sigma-Aldrich) e 1% de B27 (Invitrogen) em DMEM-F12 (estágio do intestino anterior posterior, PF). Após esse tempo, as células foram incubadas por quatro dias adicionais em Exendin 4 (50 ng/mL; Sigma- Aldrich), DAPT (1 μM; Calbiochem), e 1% de B27 em DMEM-F12. A diferenciação foi continuada até o estágio do endoderma pancreático (EN). Isso exigiu um terceiro dia de tratamento com meio CMRL (Invi- trogen) contendo 50 ng/mL, HGF, IGF (Sistemas R&D), e Exendin 4 (50 ng/mL), e 1% de B27. As amostras de RNA foram tiradas nos estágios PF e EN a partir de uma cavidade das placas de superfície mo-dificada 3 e 4. Essas amostras foram, então, analisadas por PCR em tempo real, nessa etapa, para os marcadores pancreáticos Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, Pax4, NeuroD, HNF3b, Ptf1a, insulina e AFP. A avaliação dos mesmos marcadores do endoderma pancreático foi repetida nessa etapa. As amostras de RNA a partir de células ES humanas não tratadas da mesma linhagem foram submetidas a PCR em tempo real paralelamente às amostras tratadas. As amostras tratadas foram normalizadas para configurações de controles não tratados a uma razão de expressão de 1. A expressão de Pdx1 e de insulina foi monitorada e comparada entre as placas de superfície modificada.

[00219] A indução de marcadores do endoderma pancreático foi observada a partir de células tratadas nas placas de superfície modificada 3 e 4, embora a expressão tenha sido maior com células tratadas na placa de superfície modificada 3 (figura 23). Ambas as placas de superfície modificada na presença de Y-27632 podem, durante a ex- pansão, suportar a diferenciação de células ES humanas únicas em endoderma pancreático e em intestino anterior posterior ao passo que células únicas não tratadas com Y-27632 durante a expansão se desprenderam antes da diferenciação do intestino anterior posterior.

Exemplo 12 Células ES Humanas H1 e H9 Aderem às Placas de Superfície Modificada e a Aderência é Melhorada Através de Tratamento das Células com Y-27632

[00220] As células ES humanas H9 de passagem 49 anteriormente plaqueadas em vasilhame de plástico tratado com 1:30 de Matrigel® e cultivadas em meio condicionado em MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF foram tratadas com LIBERASE e plaqueadas em placas de superfície modificada em meio condicionado em MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e, não de outro modo, tratadas ou suplementadas com aumento de concentrações de Y-27632. Foi observado que 24 e 48 horas após o plaqueamento das células ES humanas H9 nas placas de superfície modificada, pequenas colônias puderam ser observadas sobre as superfícies 2 a 4 e 13, e CellBIND®, e Primaria® (cat. n° 353846, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) com manchas de cristal violeta (figuras 24 a 26). Além disso, a aderência de colônias de célula ES humanas H9 foi aprimorada pela adição de Y- 27632 e o efeito apresentou resposta à dosagem (figura 25). Baixas concentrações de Y-27632 (1 a 2 micromolares) mostraram um aprimoramento mínimo na adesão de células ES humanas versus células ES humanas não tratadas (figura 25) enquanto maiores concentrações de Y-27632 (4 a 20 micromolares) promoveram a aderência de células ES humanas às placas de superfície modificada conforme medidas por manchas de cristal violeta (figuras 25 e 26).

[00221] Além da regulação dinâmica da adesão de células ES humanas pela adição de Y-27632 ao meio de cultura celular, taxas dife- rentes de adesão de células ES humanas para vários plásticos de superfície modificada na presença de Y-27632 foram observadas. Por exemplo, as células foram menos aderentes à placas de CellBIND® e se mostraram mais aptas, ao longo do tempo, para se desprenderem das placas de CellBIND® mesmo na presença do tratamento com Y- 27632 prolongado, enquanto as células foram mais aderentes e menos aptas a se desprenderem das placas de superfície modificada, 3, 4, ou 13 ou Primaria® quando tratadas com o inibidor de Rho-quinase, Y- 27632 (figuras 25 e 26).

Exemplo 13 Células das Linhagens de Células-Tronco Embrionárias Humanas H1 e H9 se Fixam e Formam Colônias a Taxas Diferentes sobre as Placas de Superfície Modificada na Presença de Y-27632

[00222] As células ES humanas H1 e H9 anteriormente plaqueadas em vasilhame de plástico tratado com 1:30 de Matrigel® e cultivadas em meio condicionado em MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF foram tratadas com LIBERASE e plaqueadas em placas de superfície modificada em meio condicionado em MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e, não de outra maneira, tratado ou suplemento com 20 micromolares de Y-27632. Quarenta e oito horas após o plaquea- mento das células ES humanas H9 em placas de superfície modificada 14 e 15, pequenas colônias foram observadas quando o meio foi suplementado com Y-27632 (20 micromolares) (a adesão e formação de colônia foram variáveis de experimento para experimento) (figura 27). As células ES humanas H1 também se fixaram e formaram colônias em ambas as superfícies 14 e 15 em meio suplementado com Y- 27632 (20 micromolares), e isso foi mais prevalecente do que a ligação observada com as células ES humanas H9. Esses dados indicam que existe uma variabilidade de linhagem para linhagem de célula ES humana na adesão e formação de colônia em superfícies de substratosólido.

Exemplo 14 Adesão de Célula ES Humana às Placas de Superfície Modificada com Uso de Meio Definido

[00223] As células ES humanas H9 de passagem 49 foram passadas duas vezes no meio definido, mTeSR®, em vasilhame de plástico tratado com Matrigel®-. As células foram, então, tratadas com LIBE- RASE e plaqueadas sobre a placa de superfície modificada Nunc4 em meio mTeSR®. As células foram plaqueadas em meio com ou sem Y- 27632 a 20 micromolares. As cavidades também foram tratadas com várias proteínas por 30 minutos antes da semeadura de células (sem tratamento, 0,1% de gelatina, 2% de BSA e 0,34 mg/mL de colágeno I de rato, 1:1000 de Matrigel® ou 1:5000 Matrigel®) para determinar se essas proteínas poderiam promover a adesão de célula ES humana em meio definido com ou sem Y-27632 (figura 28). Na ausência de Y- 27632, as células ES humanas plaqueadas sobre a placa de superfície modificada em meio definido não se fixam - mesma na presença de proteínas de matriz extracelular como colágeno I ou 1:1000 de Matri- gel®. Entretanto, quando Y-27632 (20 micromolares) foram adicionados para definir o meio mTeSR®, as células ES humanas se aderiram à superfície Nunc4. Além disso, essa aderência foi equivalente em cavidades não tratadas e em cavidades tratadas com 0,1% de gelatina, 2% de BSA e 0,34 mg/mL de colágeno I de rato. Houve um aumento modesto na adesão de célula ES humana em cavidades com baixas concentrações de Matrigel® (diluições de 1:1000 e 1:5000), entretanto, essas concentrações de Matrigel® foram insuficientes para promover a adesão na ausência de Y-27632. Esses resultados demonstram que na presença do inibidor de ROCK, Y-27632, as células ES humanas podem ser cultivadas em substratos plásticos modificados em meio definido e que baixas concentrações de Matrigel® de cerca de 1:1000 ou 1:5000 podem aprimorar essa adesão.

Exemplo 15 Placas de Superfície Modificada em um Formato de Frasco podem Promover a Adesão de Célula ES Humana e a Diferenciação para Endoderma Definitivo e Endoderma Pancreático

[00224] As células ES humanas H1 e H9 anteriormente plaqueadas em vasilhame de plástico tratado com 1:30 de Matrigel® e cultivadas em meio condicionado em MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF foram tratadas com LIBERASE e plaqueadas em frascos T25, T75, T150, e T175 em uma densidade de semeadura de 1:2 ou 1:3 sobre frascos de vários tamanhos com superfícies modificadas. As células foram semeadas em um meio condicionado em MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e Y-27632 (20 micromolares). Permitiu-se que colônias de célula ES humana fossem então cultivadas no meio condicionado em MEF suplementado, alterado diariamente, com 8 ng/mL de bFGF e Y-27632 (20 micromolares), até que as placas fossem aproximadamente 50% confluentes. Nesse momento, o meio foi alterado para um meio de DMEM/F12 contendo 2% de BSA, 100 ng/mL de ativina A, 20 ng/mL de Wnt3a e Y-27632 (20 micromolares) e as células foram mantidas nesse meio por 2 dias com alterações diárias de meio. Nos dias 3 e 4, o meio foi alterado para o meio de DMEM/F12 contendo 2% de BSA, 100 ng/mL de ativina A e Y-27632 (20 micromolares). As células foram então liberadas a partir da superfície com TrypLE e testadas por citometria de fluxo para expressão do marcador de superfície do endoderma definitivo (DE), CXCR4. Foi observado que sob essas condições as células ES humanas se diferenciaram em uma população altamente positiva de CXCR4, que foi tão elevada quanto quase 90% de CXCR4+, indicando que as células foram, na maioria, diferenciadas em endoderma definitivo (tabela 5). Além disso, a adesão das células à superfície de cultura durante o crescimento ou durante a dife- renciação foi dependente da manutenção de inibição de ROCK, visto que a remoção de Y-27632 do meio de cultura resultou em desprendimento celular do plástico.

[00225] Para determinar se o endoderma pancreático poderia ser formado a partir do endoderma definitivo derivado nas placas de superfície modificada em formato de frasco. As células foram incubadas durante mais quatro dias com Y-27632 (20 micromolares), FGF-7 (50 ng/mL), ciclopamina KAAD (2,5 micromolares) e 1% de B27 (Invitro- gen) em DMEM-F12 e, então, mais quatro dias nesse meio suplementado com ácido retinóico (1 micromolar; Sigma-Aldrich) para diferenciar as células para um estágio de endoderma pancreático. As amostras de RNA foram então tiradas e analisadas através de PCR em tempo real para o marcador pancreático Pdx1. As amostras tratadas foram normalizadas para configurações de controles não tratados para uma ra-zão de expressão de 1. Foi observado que as amostras aumentaram níveis de PDX1 versus células ES humanas indiferenciadas, com níveis de mRNA pelo menos de 256 vezes maior nas células diferenciadas do que naqueles observados em células ES humanas indiferenciadas.

Exemplo 16 Tratamento de Superfície e Placas de Superfície Modificada

[00226] As placas de superfície modificada foram preparadas através do tratamento de itens moldados por injeção com o uso de um tratamento por plasma de corona ou um tratamento por plasma de microondas (tabela 6). Os materiais de polímero usados em modelagem por injeção foram poliestireno, policarbonato, uma mistura de policarbonato e poliestireno e copolímero de olefina cíclica. As placas de superfície modificada foram embaladas individualmente em bolsas plásticas, então, esterilizadas através de irradiação gama (25 kGy) e, finalmente, armazenadas em temperatura ambiente até serem usadas em cultura celular ou experimentos de caracterização de superfície. As placas de superfície modificada 18, 30 e 31 e 32 foram moldadas com o uso dos mesmos materiais poliméricos como placas de superfície modificada 19, 33 e 34, respectivamente, mas não foram tratadas por plasma. As superfícies 14 e 31 não foram irradiadas por gama.

[00227] O tratamento por plasma de corona foi executado em uma câmara de metal à vácuo com apenas um eletrodo dentro da câmara e eletricamente isolado a partir de dentro da câmara (Plasma C-Lab; Ve- taphone A/S, Dinamarca). As paredes metálicas serviram como contra- eletrodo (terra). Um gerador de corona de autoafinação gerou o campo elétrico fornecendo energia suficiente para gerar plasma em toda a câmara. Um item a ser tratado foi colocado no fundo da câmara. A câmara foi fechada e evacuada para uma pressão de 1 Pa (10-2 mbar). Nessa pressão, a válvula para a bomba de vácuo foi fechada e o gerador de corona acoplado. O gerador foi configurado para gerar uma saída de 2.000 W. O plasma foi energizado durante 5 a 60 segundos. A válvula de entrada de gás (ar) foi então aberta e a pressão dentro da câmara retornou ao nível atmosférico.

[00228] O tratamento por plasma de micro-ondas foi executado em câmaras de vácuo de um quarto de galão (Modelo 300-E para placas de superfície modificada 5 a 12 e Modelo 440 para placas de superfície modificada 14 e 15; ambas de Technics Plasma GmbH, Alemanha). A energia para gerar o plasma foi fornecida através de um gerador de micro-ondas de 2,43 GHz fora da câmara. Um item a ser tratado foi colocado sobre uma placa de vidro dentro da câmara. A câmara foi fechada e evacuada para uma pressão entre 30 e 50 Pa (0,3 e 0,5 mbar). A válvula para a bomba de vácuo foi mantida aberta e a pres-são foi mantida no valor desejado através do ajuste do fluxo de gás (ar ou oxigênio) com a válvula de entrada de gás. O gerador de microondas foi então acoplado. O gerador foi configurado para gerar uma saída de 500 ou 600 W. A válvula da bomba foi então fechada e a válvula de entrada de ar foi aberta para elevar a pressão dentro da câmara para o nível atmosférico.

[00229] A tabela 6 mostra energia, tempo, pressão e gases usados no preparo de placas de superfície modificada por plasma de corona ou plasma de micro-ondas.

Exemplo 17 Caracterização da Superície das Placas de Superfície Modificada da Presente Invenção Ângulos de Contato com a Água

[00230] Placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 foram individualmente embaladas em bolsas plásticas, esterilizadas e armazenadas em temperatura ambiente durante o período de teste. Os ângulos de contato foram primeiramente medidos uma semana após a esterilização e tratamento de superfície, e, então, novamente nos pontos de tempo dados na figura 29. Todas as medições de ângulos de contato foram feitas com o uso do método de gotejamento séssil estático e uma cabeça de medição de PG-X de FIBRO Systems AB, Suécia [go- niômetro consistindo em software de computador e câmera de vídeo (v. 3.1)]. O método de inclinação tangencial foi usado para calcular os ângulos de contato. Gotas de 4,0 μL de água MilliQ foram aplicadas com o uso de aplicação de gota automática em modo estático, de acordo com as instruções de fabricação. O ângulo de contato de cada gota foi medido uma vez (7 gotas foram aplicadas em cada amostra por ponto de tempo). Para cada ponto de tempo, uma nova amostra foi usada com a finalidade de evitar qualquer influência de medições anteriores. As medições nas superfícies Nunclon Delta® e CellBIND® foram executadas sob as mesmas condições experimentais das medições nas superfícies 1 a 4 e 13, mas a esterilização e tratamento de superfície foram feitos mais de 12 semanas antes da primeira medição (Nunclon Delta®* foi esterilizada uma semana antes da primeira medição). A figura 29 mostra que as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 tiveram capacidade hidrofílica similar e foram mais hidrofílicas (menores ângulos de contato com a água) do que as superfícies Nunclon Delta® e CellBIND®. A capacidade hidrofílica das placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 foi estável por pelo menos 12 semanas após a esterilização e tratamento de superfície.

[00231] A CellBIND® foi previamente descrita como tendo ângulos de contato de 13,4 graus (desvio-padrão de 4 graus) [Corning Technical Report (2005), Superfície Corning® CellBIND®: An Improved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1) em http://catalog2.corning.eom/Lifesciences/media/pdf/t CellBIND Improv ed Surface CLS AN 057.pdf].

Densidade de Carga Negativa

[00232] Foi determinada a densidade de cargas negativas sobre placas de superfície modificada 1 a 4 e 13, superfície Nunclon Delta®, superfície CellBIND®, superfície Primaria®, superfície Falcon® e uma superfície de poliestireno não tratada (mas esterilizada) (todas em formato de prato de 3 cm). Três mL de solução aquosa de cristal violeta (0,015% de peso por volume) foram dispensados em cada prato e os pratos foram incubados durante 60 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave (50 rpm). Com a finalidade de remover o cristal violeta não ligado às superfícies, os pratos foram lavados três vezes com 3 mL de água MilliQ e, então, secos de um dia para outro a 60°C. O cristal violeta ligado à superfície foi dessorvido pela adição de 1,5 mL de 0,1 M de HCl em solução de EtOH (99%) e os pratos foram incubados durante 2 minutos à temperatura ambiente sob agitação sua-ve (50 rpm). A absorbância da solução de HCl:EtOH com cristal violeta dessorvido foi medida a 590 nm com o uso de um leitor de microplaca EnVision 2100 (Perkin Elmer; Waltham, MA, EUA). Os valores de ab- sorbância foram corrigidos para a absorbância antecedente de solução de HCl:EtOH. A densidade de carga negativa foi medida em três pratos por superfície e a medida de absorbância foi executada em triplica- ta para cada prato.

[00233] A densidade de carga negativa para placas de superfície modificada é mostrada na figura 30. As densidades de carga negativa das superfícies 1 a 4 e 13 foram similares, mas o tempo maior de tratamento de superfície no intervalo de 5 a 60 segundos tende a resultar em uma menor densidade de carga negativa da superfície. As superfícies 1 a 4 e 13 tinham densidades de carga negativa significativamente menor que a superfície CellBIND® e uma superfície Nunclon Delta® tratadas em 2007. As superfícies 1 a 4 e 13 tinham densidades de carga negativa no mesmo nível que uma superfície Nunclon Delta® tratada em 2005, e densidade de carga negativa significativamente maiores do que a superfície Primaria®, superfície Falcon® e uma superfície de poliestireno não tratada (mas esterilizada). A densidade menor da carga negativa da superfície Nunclon Delta® tratada em 2005 que a superfície Nunclon Delta® tratada em 2007, sugere que o poliestireno com tratamento de superfície se torna levemente menos carregado negativamente ao longo do tempo. O alto nível de densidade de carga negativa de CellBIND® não é devido à rigosidade maior da superfície e, assim, da área superficial (Vide análise de AFM nesse exemplo).

Espectroscopia Fotoeletrônica de Raios X (XPS)

[00234] As placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 a 15 e as placas com as superfícies Nunclon Delta®, Costar®, Falcon®, CellBIND® e Primaria® foram analisadas com o uso de XPS. A amostra foi apresentada para a fonte de raios X através do corte de seções a partir das placas e montagem dessas com grampos com mola sobre um suporte para amostra de aço inoxidável. As amostras foram irradiadas com ra- diação Al kα (1486 eV). A análise foi executada com um ângulo de 45° entre a amostra e o analisador. Os espectros foram ajustados a uma curva com o uso do pacote de software fornecido pelo fornecedor de instrumentos, Physical Electronics. O software utilizou rotinas comerciais Matlab® para o processamento de dados. O instrumento usado para a análise foi um espectômetro fotoeletrônico de raios X Physical Electronics Modelo 5400. Os dois nanômetros mais externos dentre cinco, em profundidade, em uma região de cerca de um milímetro em diâmetro das partes tratadas de superfície das placas foram analisados em cada uma das duas placas por superfície.

[00235] A composição elementar de superfície em unidades de porcentagem atômica é mostrada na tabela 7. Todas as placas de superfície modificada continham carbono, oxigênio e nitrogênio (hidrogênio não foi detectado em XPS) na superfície. As superfícies 1 a 4, superfície 13 e superfície CellBIND® continham mais oxigênio do que outras superfícies analisadas. As superfícies 1 a 4 e superfícies 13 a 15 continham menos nitrogênio do que Primaria®, mas mais nitrogênio do que as superfícies de placas Nunclon Delta®, Costar®, Falcon® e CellBIND®. Os níveis de oxigênio e nitrogênio correlacionaram positivamente com tempo maior de tratamento de superfície (superfícies 1 a 4 e 13), e os níveis mais altos de ambos desses elementos foram obtidos com o uso de 30 ou 60 segundos de tratamento por plasma de corona (superfície 3 e superfície 4, respectivamente). As superfícies 3 e 4 eram similares em composição elementar. As superfícies 2 e 13 eram similares em composição elementar e ainda mais similares as superfícies 3 e 4 do que a superfície 1 em composição elementar.

[00236] Os picos dos espectros C1s foram ajustados a uma curva (melhor ajuste qui-quadrado), com a finalidade de identificar e quantificar os ambientes de ligação para carbono nas superfícies, através do uso de largura de pico e localizações de energia para espécie confor- me encontrada na literatura (tabela 8). As concentrações são relatadas em unidades de percentual atômico, que foram obtidas pela multiplicação da porcentagem da área pela concentração atômica. As superfícies 2 a 4 e 13 foram similares em termos de ambientes de ligação de carbono. A proporção de carbono em ambiente de ligação C*-C-O-C- C* foi menor nas superfícies 2 a 4 e 13 do que nas outras superfícies analisadas. A proporção de carbono em ambiente de ligação O-[C=O]- O foi maior nas superfícies 2 a 4 e 13 do que nas outras superfícies analisadas. Similaridades entre as superfícies 2 a 4 e 13 e a superfície 1, superfície CellBIND®, e/ou superfície Primaria® também foram identificadas. A proporção de carbono no ambiente de ligação C-O-C ou C-NH3+ (mesma localização de energia nos espectros) foi maior nas superfícies 1 a 4 e 13 do que nas outras superfícies analisadas. A proporção de carbono no ambiente de ligação C-O-C*=O foi maior nas superfícies 2 a 4, superfície 13, e superfície Primaria® do que nas outras superfícies analisadas. A proporção de carbono no ambiente de ligação CO3 foi maior nas superfícies 2 a 4, superfície 13 e superfície CellBIND® do que nas outras superfícies analisadas. A proporção de carbono no ambiente de ligação C=O foi maior nas superfícies 1 a 4, superfície 13, e superfície CellBIND® do que nas outras superfícies analisadas. A proporção de carbono no ambiente de ligação C-[O]-C foi maior nas superfícies 1 a 4, superfície 13, superfície CellBIND® e superfície Primaria® do que nas outras superfícies analisadas. O pico de perda de energia foi resultado de uma transição aromática n^n* e é um indicador da aromaticidade de superfície.

[00237] Os picos de espectros O1s foram quase gaussianos e não poderiam ser ajustados a uma curva. Os picos de espectros N1s foram ajustados a uma curva (melhor ajuste qui-quadrado), com a finalidade de identificar e quantificar os ambientes de ligação para o nitrogênio nas superfícies, através do uso de largura de pico e localizações de energia para espécie conforme encontrada na literatura (tabela 9). As concentrações são relatadas em unidades de percentual atômico, que foram obtidas pela multiplicação da porcentagem da área pela concentração atômica. Os sinais N1s de superfícies Nunclon Delta®, CellBIND®, Costar® e Falcon® foram fracos e não foi, portanto, possível indentificar os ambientes de ligação para nitrogênio nestas superfícies. Os espectros N1s foram indistinguíveis para as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13, e os dados que resultaram do ajuste da curva de dois espectros N1s representativos são mostrados. A proporção de nitrogênio em ambiente de ligação -NH3+ foi maior nas superfícies 1 a 4 e 13 do que nas superfícies 14 e 15 e na superfície Primaria®. Foi detectado nitrogênio em ambiente de ligação -NH2 apenas nass Superfícies 14 e 15 e na superfície Primaria®. Foi detectado nitrogênio em ambiente de ligação -NO2 apenas nas superfícies 1 a 4 e 13 e em uma amostra única da superfície 15. Foi detectado nitrogênio em ambiente de ligação -NO3 apenas na superfície 15 e na superfície Primaria®.

[00238] A CellBIND® foi previamente descrita como tendo uma composição elementar de 70,4% de carbono, 29,0% de oxigênio, 0,6% de nitrogênio e <0,01% de outros elementos, e uma concentração relativamente alta do grupo C-[O]-C, C=O e do grupo de COOH/R, conforme analisado por ESCA [Corning Technical Report (2005), Corning® CellBIND® Superfície: An Improved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1) em http://catalog2.coming.com/ Lifes- ciences/media/pdf/t CellBIND Improved Surface CLS AN 057.pdf].

[00239] A Primaria® foi previamente descrita como tendo uma composição elementar de 74,6% de carbono, 14,1% de oxigênio, 11,1% de nitrogênio e 0,2% de outros elementos, com ambientes de ligação carbono-para-nitrogênio de radicias, principalmente, [HN(C=O)NH] (ureia) e (C=N) (nitrila), conforme analisado por ESCA.

Microscopia de Força Atômica (AFM)

[00240] As placas de superfície modificada 1 a 4 e 13, e as placas com superfícies Nunclon Delta® e CellBIND® foram analisadas com o uso de AFM. As amostras foram analisadas com o uso de microscópia de força atômica de múltiplos modos da Digital Instruments em modo de não contato. A ponta usada foi uma ponta de modo não contato, do tipo TESP7. As amostras foram fixadas ao discos de amostra com fita adesiva dupla. Foram analisadas as regiões de 10 μm x 10 μm e de 500 nm x 500 nm da parte da superfície tratada das placas. São mostradas na tabela 10 a rugosidade média de superfície (Ra) e a altura máxima (Rmax) em unidade de nanômetros. Semelhante às placas com superfícies Nunclon Delta® e CellBIND®, as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 são relativamente suaves, e Ra e Rmax não se correlacionam com o tempo de tratamento da superfície em nenhuma das duas varreduras. A análise de superfícies de poliestireno oxidado e de poliestireno não tratado destinadas à cultura celular, e a superfície Primaria® foi descrita por Shen e Horbett (J. Biomed. Mater. Res. 57:336 a 345, 2001): A rugosidade de superfície tem aproximadamente 4 nm em todas as três superfícies.

Exemplo 18 Composição elementar de Superfície e Ângulo de Contato em Relação à Adesão de Célula ES Humana e Formação de Colônia

[00241] A tabela 11 descreve um sumário dos resultados da análise por XPS da composição elementar de superfície, da medição do ângulo de contato de superfície, e dos experimentos de adesão de célula ES humana e de formação de colônia.

[00242] A adesão de célula ES humana à e a formação de colênia (ao menos 15 colônias por superfície de 10 cm2) em uma superfície de substrato sólido na ausência de um composto capaz de inibir Rho- quinase ou Rho foi observada apenas em placas de superfície modificada 2 a 4 e 13, placas CellBIND®, e placas Primaria® (as células fo- ram apresentadas às superfícies como uma suspensão de agrupamentos de células). As placas de superfície modificada 2 a 4 e 13 suportaram a adesão celular, a formação de colônia e a passagem. Após cerca de três passagens, a taxa de crescimento de células ES humanas em placas de superfície modificada 2 a 4 e 13 declinou espontaneamente (apenas na ausência de inibição de Rho e de inibição de Rho-quinase), embora a morfologia celular indicou que as células não estavam se diferenciando. Além disso, a expressão do marcador de pluripotência foi mantida em células que passaram quatro vezes na superfície 3. As placas CellBIND® suportaram a adesão de célula ES humana e a formação de colônia, porém a diferenciação das células foi observada antes da primeira passagem. Com base nas observações da morfologia celular, as placas Primaria® suportaram a adesão de célula ES humana e a formação de colônia, sem sinais de diferenciação (não foi testada a passagem). Tanto o teor de oxigênio (por exemplo, superfície 2 versus superfície 14) como de nitrogênio (por exemplo, Primaria® versus Costar®; e as superfícies 2 e 13 versus CellBIND®) das superfícies produziram um efeito na capacidade das superfícies de suportar a adesão de célula ES humana e a formação de colônia na ausência de inibição Rho e inibição de Rho-quinase. As superfícies com um teor de nitrogênio de ao menos cerca de 0,9%, uma soma de teor de nitrogênio de oxigênio de ao menos cerca de 22,3%, e um ângulo de contato da água de ao menos cerca de 13,9 graus suportaram adesão de célula ES humana e formação de colônia na ausência de inibição Rho ou inibição de Rho-quinase.

[00243] A adesão de célula ES humana e a formação de colônia (ao menos 15 colônias por superfície de 10 cm2) em uma superfície de substrato de sólido na presença de um composto capaz de inibir Rho ou Rho-quinase foi obervada nas placas de superfície modificada 1 a 15, placa de superfície modificada 19, placa de superfície modificada 33, placa de superfície modificada 34, CellBIND® e Primaria® (as células foram apresentadas às superfícies como uma suspensão de agrupamentos de células). Observou-se que as superfícies 2 a 4 e 13 e Primaria® foram melhores que as superfícies 1, 19, 33 e 34 e CellBIND®, que por sua vez foram melhores que as superfícies 5 a 12, 14 e 15, ao promover a adesão de célula ES humana e a formação de colônia. Nas placas de superfície modificada 3 e 4 e na presença de inibidor de Rho-quinase, as células ES humanas se fixaram e formaram colônias que se expandiram e poderiam ter passado ao menos 10 vezes, criando células pluripotentes com cariótipo normal (cariótipo testado apenas no crescimento celular na superfície 4). Tanto o teor de oxigênio (por exemplo, CellBIND® versus Nunclon Delta®) quanto o de nitrogênio (por exemplo, Primaria®versus Costar®; e as superfí-cies 2 e 13 versus CellBIND®) de superfícies produziram um efeito na capacidade das superfícies de suportar a adesão de célula ES humana e a formação de colônia na presença de inibição de Rho-quinase. As superfícies com um teor de nitrogêio de ao menos cerca de 0,5%, uma soma de teor de nitrogênio de oxigênio de ao menos cerca de 17,2%, e um ângulo de contato da água de ao menos cerca de 13,9 graus suportaram a adesão de célula ES humana e a formação de colônia na presença de inibição de Rho-quinase. As superfícies com um teor de nitrogênio de ao menos cerca de 0,5%, uma soma de teor de nitrogênio de oxigênio de ao menos cerca de 17,3%, porém menor que 19,9%, e um ângulo de contato da água de ao menos cerca de 9,4 graus suportaram a adesão de célula ES humana e a formação de colônia na presença de inibição de Rho-quinase em alguns casos (superfície 14), porém não em outros (superfícies 22 a 24).

[00244] Observou-se que a remoção do inibidor de Rho-quinase das culturas de células ES humanas cultivadas na placa de superfície modificada 4 resultou no desprendimento das células ES humanas da superfície do substrato sólido. As células poderiam então ser reafixa- das à superfície por retratamento com um inibidor de Rho-quinase. Dado que a passagem enzimática de células ES humanas é um agente de estresse potencial e pode causar instabilidade cariotípica, o uso de remoção temporária do inibidor de Rho-quinase para passar as células ES humanas poderia eliminar o estresse da passagem enzimáti- ca.

[00245] A adesão de células ES humanas e a formação de colônia foram também demonstradas usando-se um meio livre de componente animal, inibição de Rho-quinase e a placa de superfície modificada 4. O pré-tratamento da placa de superfície modificada 4 com proteínas de matriz extracelular resultou em mais colônias, porém apenas na presença de inibição de Rho-quinase.

[00246] Além da passagem das células ES humanas com métodos enzimáticos que mantêm as condições de cultura com formação de colônia, pela passagem das células como agrupamentos, as células ES humanas também poderiam ser passadas como células únicas com o uso de enzimas do tipo TrypLE® ou Accutase®. Na presença ou na ausência de inibidor de Rho-quinase, as colônias de células ES humanas dissociaram-se em uma suspensão de células únicas com o uso de TrypLE® afixado às placas de superfície modificada 3 e 4, e formaram colônias que poderiam ser passsadas ao menos 5 vezes e criar células com marcadores de pluripotência.

[00247] A remoção do inibidor de Rho-quinase das culturas de células ES humanas preparadas através da passagem de células como uma suspenção de células únicas não resultou em desprendimento das células ES humanas da superfície do substrato sólido, mas em colônias que cresceram mais rápido do que teriam crescido se o inibidor de Rho-quinase não tivesse sido removido.

Exemplo 19 Tratamento com HEK293 Acentua a Adesão de Células às Placas de Superfície Modificada

[00248] Células renais embrionárias humanas 293 (HEK293, ECACC n° 85120602) foram mantidas no meio essencial mínimo de Eagle (EMEM; Lonza, Verviers, Bélgica) que contém 10% de soro bovino fetal (SFB; Lonza). As células foram adaptadas ao meio Pro293a- CDM (Lonza), um meio sem soro quimicamente definido otimizado para cultivo de HEK293 aderente, usando, gradualmente e por várias passagens, as razões sequênciais de 3:1, 1:1, 1:3, 1:7 e, finalmente, de 0:1 de meio EMEM suplemetado com soro e meio Pro293a-CDM. Para manutenção e adaptação, as células HEK293 foram cultivadas a 2,0 x 104 células/cm2 em frascos de 75 cm2 com superfície Nunclon Delta™ (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) e passadas em uma confluência de 70 a 80% com o uso de Trypsin/EDTA para dissociação.

[00249] O meio Pro293a-CDM (100 μl) suplementado com Y-27632 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) em concentrações de 1,0, 4,0 ou 10 μM foi dispensado em placas com 96 cavidades com fundo plano com a superfície 4, superfície Nunclon Delta®, ou superfície CellBIND®. Outros 100 μl do meio Pro293a-CDM com células HEK293 foi adicionado às cavidades (4,0 x 104 células/cm2). As culturas foram então incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 em ar por: (i) 96 horas; ou (ii) 48 horas, seguido de lavagem das culturas uma vez com 200 μl de solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco (DPBS; Lonza), então de adição de 200 μl do meio Pro293a- CDM sem Y-27632 e, finalmente, incubação das culturas por outras 48 horas.

[00250] O número de células viáveis nas cavidades foi então determinado com o uso de um kit de atividade de desidrogenase láctica (LDH) disponível junto à Roche, Suíça. Brevemente, as cavidades fo- ram lavadas com meio de Pro293a-CDM, e as células aderentes foram lisadas em 100 μl de DPBS com 2% (v/v) de Triton X-100 (Sigma Chemical Co.) durante uma incubação de 30 minutos a 37°C. O lisado e a mistura de 100 μl de catalisador e reagente de corante foram misturados e incubados no escuro a 25°C por 30 minutos . A reação foi interrompida através da adição de 50 μl de HCl 1,0 M, e a absorbância a 490 nm foi medida em um leitor de microplaca (Genios Pro; Tecan, Austria). O número de células foi calculado com o uso dos valores de A490 a partir dessas amostras e a partir dos padrões que contêm LDH provenientes de um número conhecido de células.

[00251] O efeito das superfícies de substrato sólido e do Y-27632 na adesão e crescimento das células HEK293 no meio de Pro293a- CDM é mostrado na figura 31a, em que a exposição contínua por 96 horas a Y-27632 é identificada como "Y-27632 ativa por 96 horas" e a exposição contínua por 48 horas a Y-27632 sucedida por uma alteração de meio e 48 horas de incubação na ausência de Y-27632 é identificada como "Y-27632 ativa por 48 horas/inativa por 48 horas". Na ausência de Y-27632, as células HEK293 são fixadas às três superfícies. Uma alteração no meio após 48 horas de incubação resultou em significativamente menos células nas culturas, medidas após 96 horas de incubação. O Y-27632 aprimorou a adesão das células HEK293 na superfície 4 e na superfície de CellBIND® quando aplicado a concentrações de 2,0 e 5,0 μM. A remoção de Y-27632 após 48 horas de incubação resultou em um desprendimento significativo de células a partir das três superfícies.

[00252] Foi realizado um experimento similar, porém usando células HEK293 não adaptadas de 2,0 x 104 por cm2 e EMEM suplementado com 10% de SFB durante todo o experimento. O efeito das superfícies de substrato sólido e de Y-27632 na adesão e crescimento das células HEK293 em EMEM suplementado com 10% de SFB é mostrado na figura 31b, em que a exposição contínua por 96 horas a Y-27632 é identificada como "Y-27632 ativo por 96 horas" e a exposição contínua por 48 horas a Y-27632 seguida de uma alteração de meio e 48 horas de incubação na ausência de Y-27632 é identificada como "Y-27632 ativa por 48 horas/inativa por 48 horas". Na ausência de Y-27632, as células HEK293 são fixadas às três superfícies. Uma alteração no meio após 48 horas de incubação resultou em significativamente menos células nas culturas, medidas após 96 horas de incubação. O Y- 27632 aprimorou a adesão das células HEK293 na superfície 4 e na superfície de CellBIND® quando aplicado a concentrações de 2,0 e 5,0 μM. A remoção de Y-27632 após 48 horas de incubação resultou no desprendimento significativo de células da superfície 4 e da CellBIND®.

Exemplo 20 Tratamento com Y-27632 e H-1152 Aprimora o Crescimento de Célula HEK293 nas Placas de Superfície Modificada

[00253] Células HEK293 foram mantidas em EMEM (Lonza) contendo 10% de SFB (Lonza). As células foram passadas em confluência de 70 a 80% com o uso de Tripsina/EDTA para obter dissociação, e cultivadas na c de 2,0 x 104 células/cm2 em frascos de 75 cm2 com superfície de Nunclon Delta® (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca).

[00254] O EMEM (500 μl) suplementado com 10 % de SFB contendo 1,0, 5,0, 10, 15 ou 20 μM de Y-27632 (Sigma Chemical Co.), ou 0,4, 1,2, 1,6, 2,4 ou 2,8 μM de H-1152 (Calbiochem, EMD Chemicals Inc., Darmstadt, Alemanha) foi dispensado em placas Multidish com 24 cavidades com a superfície 4 ou com uma superfície de poliestireno não tratada (porém, irradiada por gama; 25 kGy). Outros 500 μl de EMEM suplementado com 10% de SFB e contendo células HEK293 foram adicionados às cavidades (2,0 x 104 células/cm2). As culturas foram colocadas em uma IncuCyte® Plus (Essen Instruments, Michigan, EUA) e incubadas a 37°C em uma atmosfera umidi ficada de 5% de CO2 no ar. A IncuCyte® Plus é uma plataforma de formação de imagens automatizada, configurada para se adaptar no interior de uma incubadora de CO2, e designada para fornecer a formação de imagens de célula ao vivo não invasiva e cinética, através da aquisição de imagens de contraste de fase das células em períodos de tempo e locais definidos pelo usuário nas culturas. A métrica primária do instrumento é a confluência de cultura, isto é, a fração da superfície que é coberta pelas células. As células HEK293 foram incubadas por 72 horas sem manipulações, e as imagens foram coletadas a cada duas horas em 9 posições em culturas triplicadas. A confluência de cultura foi determinada com o uso do software da IncuCyte® Plus (v. 3.4.1.25966).

[00255] O aumento da concentração de Y-27632 e de H-1152 aperfeiçoa a adesão e o crescimento de células HEK293 na superfície 4 (figura 32a). O efeito de uma superfície de cultura celular não tratada e de Y-27632 ou de H-1152 na adesão e no crescimento de HEK293 é mostrado na figura 32b. O crescimento e a adesão de células HEK293 foram levemente aprimorados na presença de Y-27632 a 10 μM e H- 1152 a 0,6 a 1,2 μM. Entretanto, o aprimoramento do crescimento e da adesão de células HEK293 em uma superfície de cultura celular não tratada é insignificante em comparação à superfície 4.

Exemplo 21 Tratamento com H-1152 Aprimora o Crescimento e a Adesão da Célula HEK293 às Placas de Superfície Modificada

[00256] As células HEK293 foram mantidas em EMEM (Lonza) contendo 10% de SFB (Lonza). As células foram passadas em confluência de 70 a 80% com o uso de Tripsina/EDTA para obter dissociação, e cultivadas na c de 2,0 x 104 células/cm2 em frascos de 75 cm2 com superfície de Nunclon Delta® (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dina-marca).

[00257] O EMEM (1,0 mL) suplementado com 10 % de SFB contendo 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 2,4 ou 2,8 μM de H-1152 foi dispensado em placas Multidish com 12 cavidades com a superfície 4. Outro 1,0 mL de EMEM suplementado com 10% de SFB e contendo células HEK293 foi adicionado às cavidades (4,0 x 104 células/cm2). As culturas foram colocadas em uma IncuCyte® Plus, e incubadas a 37°C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO2 no ar por 42 horas (as imagens foram coletadas a cada 6 horas). Um mL de meio de cultura foi então removido por pipetagem e foi adicionado 1,0 mL de EMEM suplementado com 10% de SFB contendo 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 e 1,4 μM de H-1152. As culturas foram colocadas na IncuCyte® Plus novamente, e as imagens foram coletadas a cada hora durante as 25 horas seguintes. As imagens foram coletadas em 9 posições em culturas triplicadas, e a confluência de cultura foi determinada com o uso do software da IncuCyte® Plus. As imagens provenientes da IncuCyte® Plus coletadas em posições específicas nas culturas de célula HEK293 cultivadas na ausência ou presença de H-1152 (0,6 μM) foram recuperadas e apresentadas como micrógrafos de contraste de fase para a comparação da morfologia de cultura de HEK293 nos pontos no tempo a seguir: início da incubação (0 horas), imediatamente antes da alteração do meio (42 horas), 1 hora após a alteração do meio (43 horas), e, finalmente, após 52 horas de incubação.

[00258] Na ausência de H-1152 e na presença de H-1152 a 0,2 μM ou 0,4 μM, a alteração de 50% do meio após 42 horas de incubação resultou em uma redução significativa na confluência de cultura (figura 33a). Na presença de H-1152 a 0,6 μM, 0,8 μM ou 1,4 μM, o efeito da alteração do meio foi mínimo. As células HEK293 cultivadas na superfície 4 na presença de H-1152 cobrem as superfícies de substrato sólido de maneira mais uniforme do que as células HEK293 cultivadas na superfície 4 na ausência de H-1152 (figura 33b). Na ausência de H- 1152, as células HEK293 formam grandes agrupamentos, enquanto que na presença de H-1152 as células HEK293 formam agrupamentos menores com menor densidade de célula.

Exemplo 22 Tratamento com Y-27632 Aprimora o Crescimento da Célula HEK293 Ao Longo de Três Passagens nas Placas de Superfície Modificada

[00259] EMEM (500 μl) suplementado com 10% de SFB contendo Y-27632 a 5,0 μM foi dispensado em cavidades de placas Multidish de 24 cavidades com a superfície 4 ou a superfície Nunclon Delta®. Outros 500 μl de EMEM suplementado com 10% de SFB e contendo células HEK293 foram adicionados às cavidades (2,0 x 104 células/cm2), e as culturas foram incubadas a 37°C em uma atmosfe ra humidificada de 5% de CO2 no ar por 3 dias. As células foram passadas por tratamento com Tripsina/EDTA (Lonza, Verviers, Bélgica) por dois minutos a 37°C, e o número de célula total foi determinado com o uso de um contador de célula NucleoCount (Chemometec A/S, Aller0d, Dinamarca). Para passagens sucessivas, as células HEK293 foram cultivadas a 2,0 x 104 células/cm2. O crescimento de células HEK293 na superfície 4 e na superfície Nunclon Delta® foi aprimorado pela presença de Y-27632 a 2,5 μM (figura 34).

Exemplo 23 Adesão, Cultivo e Manutenção de Células-tronco Embrionárias Humanas com o Uso de Placas de Superfície Modificada 4, 18, e 19 que não têm Componentes/Proteína de Matriz Extracelular e nem Células Ali- mentadoras

[00260] Células hES de H1 de passagem 42 mantidas em vasilhame plástico revestido com MATRIGEL de 1:30 no meio condicionado de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF foram suspensas através do tratamento enzimático de LIBERASE® e plaqueadas às placas de superfície modificada de formato de 96 cavidade a uma diluição de 1 para 2 em meio condicionado de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF. As células foram plaqueadas às superfícies modificadas 4, 18, ou 19, ou Primaria®. Para determinar o efeito da inibição de Rho- quinase na ligação à superfície modificada, as células foram tratadas com 10 μM do inibidor de Rho quinase Y-27632, ou 3 ou 10 μM do inibidor de Rho quinase H-1152glicil. As células não tratadas funcionam como controles. Após 24 horas na cultura, as cavidades foram aspiradas, as células foram secas, e as cavidades foram coradas com cristal violeta.

[00261] Após 24 horas em cultura, observou-se que colônias de células ES foram fixadas e difundidas quando tratadas com os inibidores de Rho quinase nas placas de superfície modificada 4 e 19 e na placa Primaria®, no entanto, o mesmo efeito não foi observado na placa de superfície modificada 18 (figura 35).

Exemplo 24 Adesão, Cultivo e Manutenção de Células-tronco Embrionárias Humanas com o Uso de Placas de Superfície Modificada 30, 31, 32, 33, e 34 que não têm Componentes/Proteína de Matriz Extracelular e nem Células Alimentadoras

[00262] Células hES de H1 da passagem 47 mantidas em vasilhame plástico revestido com MATRIGEL de 1:30 no meio condicionado de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF foram suspensas através de tratamento enzimático TrypLE® e plaqueadas às placas de formato com 96 cavidades de superfície modificada a uma diluição de 1;3 no meio condicionado de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF. As células foram plaqueadas às superfícies modificadas 30, 31, 32, 33, ou 34. Para determinar o efeito da inibição de Rho-quinase na ligação à superfície modificada, as células foram tratadas com 3 μM do inibidor de Rho quinase H-1152glicil. As células não tratadas funcio- nam como controles. Adicionalmente, as células foram cultivadas em cavidades na placa de superfície modificada que foram pré-tratadas com Matrigel®. Vinte e quartro horas após o plaqueamento, o meio foi alterado com um meio condicionado fresco de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF, e, para células cultivadas na presença do inibidor de Rho quinase, o meio foi suplementado com 3 μM de H-1152glicil. Após 48 horas na cultura, as cavidades foram aspiradas, as células foram secas, e as cavidades coradas com cristal violeta.

[00263] Observou-se que, após 48 horas na cultura, as colônias de célula ES foram fixadas e difundidas quando tratadas com inibidores de Rho quinase nas placas de superfície modificada 33 e 34 (figura 39 e 40, respectivamente), entretanto, o mesmo efeito não foi observado nas placas de superfície modificada 30, 31 ou 32 (figuras 36 a 40, respectivamente).

Exemplo 25 Adesão, Cultivo e Manutenção de Células-tronco Embrionárias Humanas com o Uso de Placas de Superfície Modificada 22, 23, 24 ou 29 que não têm Componentes/Proteína de Matriz Extracelular e nem Células Alimentadoras

[00264] Células hES de H1 da passagem 46 mantidas em vasilhame plástico revestido com MATRIGEL a 1:30 no meio condicionado de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF foram suspensas através de tratamento enzimático Liberase® e plaqueadas às pratos de 60 mm de superfície modificada a uma diluição de 1 a 3 no meio condicionado de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF. As células foram pla- queadas às placas de superfície modificada 3, 4, 22, 23, 24 e 29. Para determinar o efeito da inibição de Rho-quinase na ligação à superfície modificada, as células foram tratadas com 3 μM do inibidor de Rho quinase H-1152glicil para plaquear as células. O meio foi mudado com um meio condicionado fresco de MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e 1 μM do inibidor de Rho quinase H-1152glicil 24 horas após o plaqueamento das células. As células cultivadas na superfície modificada 3, 4 ou no plástico revestido com matrigel® funcionaram como controles. As placas foram observadas através de microscopia de fase 24 e 48 horas após o plaqueamento. Após 48 horas na cultura, observou-se que colônias de células ES não haviam se fixado às placas de superfície modificada 22, 23, 24 ou 29 plaqueadas com ou sem o inibidor de Rho quinase, enquanto as células plaqueadas à placa de superfície modificada 3 ou 4 na presença do inibidor de Rho quinase se fixaram e difundiram.

Exemplo 26 Caracterização Adicional da Superfície das Placas de Superfície Modificada da Presente Invenção Ângulos de Contato com a Água

[00265] As placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 foram individualmente embaladas em bolsas plásticas, esterilizadas e armazenadas à temperatura ambiente durante um período de teste de 40 semanas. Os ângulos de contato foram primeiramente medidos uma semana após o tratamento e a esterilização da superfície e, então, novamente, em pontos no tempo determinados na figura 41. Todas as medições de ângulo de contato foram realizadas conforme descrito no exemplo 17. As medições em superfícies Nunclon Delta® e CellBIND® foram executadas sob as mesmas condições experimentais das medições na superfície 1 a 4 e 13, porém, o tratamento e a esterilização da superfície foram feitos mais de 12 semanas antes da primeira medição (Nuclon Delta®* foi esterilizada uma semana antes da primeira medição). A figura 41 mostra que as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 apresentavam uma capacidade hidrofílica similar e eram mais hi- drofílicas (menores ângulos de contato da água) do que as superfícies Nunclon Delta® e CellBIND®. A capacidade hidrofílica das placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 se manteve estável por pelo menos 41 semanas após o tratamento e a esterilização da superfície.

[00266] Os ângulos de contato foram também medidos nas placas de superfície modificada 5 a 12, 22 a 24, 29, 30 e 33, as quais foram embaladas em bolsas plásticas, esterilizadas conforme descrito no exemplo 16, e armazenadas à temperatura ambiente por 9 semanas (exceto para a placa de superfície modificada 29, a qual foi armazenada por 28 semanas). As placas de superfície modificada 18, 19, 32 e 34 estavam em um formato de uma única microcavidade e não poderiam, portanto, ser usadas para medições de ângulos de contato. As placas de superfície modificada 30 e 33 em um formato de placa com microcavidade, e as medições de ângulo de contato foram realizadas na parte posterior da placa e não no interior das cavidades. Os ângulos de contato foram medidos conforme descrito no exemplo 17 (para a placa de superfície modificada altamente hidrofílica 29 foi aplicada uma gota menor de 2,5 μl de água MilliQ), porém, as amostras triplicadas foram analisadas, sendo que 7 gotas foram aplicadas por amostra. As medições nas placas com superfícies Costar®, Falcon®, Primaria® e Nunclon Delta® foram realizadas sob as mesmas condições experimentais, porém, o tratamento e a esterilização da superfície foram realizados mais de 12 semanas antes da primeira medição. A figura 42 mostra que as placas de superfície modificada 5 a 12 eram mais hidro- fílicas (menores ângulos de contato da água) do que as superfícies Nunclon Delta®, Costar® e Falcon®. A capacidade hidrofílica das superfícies 5 a 12 foi comparável à capacidade hidrofílica da superfície- Primaria®, e maior do que a capacidade hidrofílica das superfícies 1 a 4 e 13 (mostradas na figura 41). A capacidade hidrofílica das placas de superfície modificada 22 a 24 e 33 foi comparável à capacidade hidro- fílica das superfícies 1 a 4 e 13 (mostradas na figura 41), ao passo que a capacidade hidrofílica da superfície 30 foi comparável à capacidade hidrofílica das superfícies Nunclon Delta®, Costar® e Falcon®. A placa de superfície modificada 29 era significantemente mais hidrofílica do que as outras superfícies analisadas.

Densidade de Carga Negativa

[00267] Foi determinada a densidade de cargas negativas nas placas de superfície modificada 5 a 12 (todas em formato de prato de 5 cm), 18, 19, 30, 32, 33 e 34 (todas em formato de microcavidade), nas placas de superfície modificada 22 a 24 e 29 (todas em formato de prato de 6 cm), e na superfície CellBIND® (formato de prato de 3 cm), na superfície Primaria® (formato de Multidish-6) e superfície Nunclon Delta® (formato de prato de 3 cm). Solução de cristal violeta aquosa (0,015% de peso por volume) em excesso foi adicionada a cada formato (0,34 mL/cm2 para o formato de prato e 0,13 mL/cm2 para o formato de microcavidade), e foi incubada por 60 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave (50 rpm). Para remover o cristal violeta não ligado às superfícies, os pratos foram lavados três vezes com 3 mL de água MilliQ para o formato de prato e três vezes com 350 μl de água MilliQ para o formato de microcavidade, e, então, secos de um dia para o outro a 60°C. O cristal violeta ligado à superfície foi dessor- vido através da adição de 0,17 mL/cm2 de HCl 0,1 M em solução de EtOH (99%) e através da incubação dos pratos por 2 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave (50 rpm). A absorbância da solução de HCl:EtOH com cristal violeta dessorvido foi medida a 590 nm com o uso de um leitor de microplaca EnVision 2100 (Perkin Elmer; Waltham, MA, EUA). Os valores de absorbância foram corrigidos para a absorbância antecedente de solução de HCl:EtOH. A densidade de carga negativa foi medida em três pratos com placas de superfície modificada 5 a 12, 22 a 24, 29, CellBIND®, Primaria® e Nunclon Delta®, e as medições de absorbância foram realizadas em triplicata para cada prato. Para as placas de superfície modificada 18, 19, 30, 32, 33e 34, uma amostra foi testada com medições triplicadas.

[00268] As densidades de carga negativa das placas de superfície modificada 5 a 12 foram similares, e essas superfícies tiveram densidades de carga negativa significantemente menores que as da superfície CellBIND® e da superfície Nunclon Delta®, porém, densidades de carga negativa significantemente maiores que a da superfície Primaria® (figura 43). As densidades de carga negativa de placas de superfície modificada 19, 33 e 34 foram significantemente maiores que as densidades de carga negativa das placas de superfície modificada 18, 30 e 32, sendo as últimas, as superfícies não tratadas respectivas no mesmo material polimérico. As densidades de carga negativa das placas de superfície modificada 22 a 24 e 29 foram normalizadas em relação à densidade de carga negativa da superfície Nunclon Delta®, e a figura 44 mostra que as placas de superfície modificada 22 a 24 têm densidades de carga negativa maiores que superfície Nunclon Delta®, ao passo que a densidade de carga negativa para aplaca de superfície modificada 29 era significantemente menor que a densidade de carga negativa da superfície Nunclon Delta® (e superfície 4).

Espectroscopia Fotoeletrônica de Raios X (XPS)

[00269] As placas de superfície modificada 5 a 12, 18, 19, 22 a 24, 29, 30, 31 a 34 foram analisadas com o uso de XPS, conforme descrito no exemplo 17. A composição elementar da superfície em unidades de porcentagem atômica é mostrada na tabela 12. Todas as superfícies continham carbono, oxigênio e nitrogênio (hidrogênio não é detectado em XPS), exceto as placas de superfície modificada 31 e 32 (não tratadas por plasma), as quais não continham nitrogênio. As placas de superfície modificada 5a 12 continham menos oxigênio do que as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13, porém, significantemen- te mais oxigênio que as superfícies Costar®, Falcon® e Nunclon Delta® (mostradas na tabela 7). As placas de superfície modificada 5 a 12 foram preparadas através de tratamento por plasma de micro-ondas, enquanto as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13 foram produzidas por tratamento por plasma de corona. As placas de superfície modificada 19, 33 e 34, as quais foram preparadas através de tratamento por plasma de corona, porém, moldadas por injeção a partir de outros polímeros diferentes de poliestireno (o qual foi usado na preparação de placas de superfície modificada 1 a 4 e 13), continham teores de oxigênio comparáveis àqueles das placas de superfície modificada 1 a 4 e 13. As placas de superfície modificada 22 a 24 continham menos oxigênio do que as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13. A placa de superfície modificada 29 continha oxigênio em um teor comparável às placas de superfície modificada 1 a 4 e 13. As placas de superfície modificada 5 a 12, 19, 33 e 34 continham menos nitrogênio do que as placas de superfície modificada 1 a 4 e 13, porém, mais nitrogênio do que as superfícies Costar®, Falcon® e Nunclon Delta® (mostradas na tabela 7). A placa de superfície modificada 29 continha significante- mente mais nitrogênio do que outras superfícies analisadas, incluindo a superfície Primaria®.

[00270] Os picos de espectros C1s foram ajustadas a uma curva (melhor ajuste de qui-quadrado), para identificar e quantificar os ambientes de ligação para carbono nas placas de superfície modificada, através do uso de larguras de pico e locais de energia para a espécie, conforme encontrado na literatura (tabela 13). As concentrações são relatadas em unidades de percentual atômico, que foram obtidas pela multiplicação da porcentagem da área pela concentração atômica. Todas as superfícies tratadas com plasma, exceto as superfícies 10, 22 a 24 e 29, eram similares em termos dos ambientes de ligação de carbono. A proporção de carbono em C-[O]-C era significantemente maior nas superfícies 19, 33 e 34 do que nas superfícies 5 a 12, 18, 30 e 32 e nas superfícies 1 a 4 e 13 (mostradas na tabela 8). A proporção de carbono no ambiente de ligação O-[C=O]-O era menor nas superfícies 5 a 12, 19, 33 e 34 do que nas superfícies 1 a 4 e 13. A proporção de carbono em C*-C-O-C-C* era significantemente maior nas superfícies 5 a 9, 11, 12, 19, 33 e 34 do que nas superfícies 1 a 4 e 13, porém, comparável às superfícies Nunclon Delta® e CellBIND®. A proporção de carbono no ambiente de ligação C-O-C ou C-NH3+ (mesmo local de energia em espectros) era menor nas superfícies 5 a 12, 19, 33 e 34 do que nas superfícies 1 a 4 e 13, porém, era maior do que nas superfícies Costar®, Falcon®, CellBIND® e Primaria®. A proporção de carbono no ambiente de ligação C-O-C*=O era maior nas superfícies 19, 33 e 34 do que nas superfícies 5 a 12, e comparável ao teor nas superfícies 1 a 4 e 13. A proporção de carbono no ambiente de ligação C=O era maior nas superfícies 5 a 12 do que nas superfícies 19, 33 e 34, porém, menor do que nas superfícies 1 a 4 e 13. A proporção de carbono no ambiente de ligação CO3- era maior nas superfícies 5 a 12 do que nas superfícies 19, 33 e 34, e comparável ao teor nas superfícies 1 a 4 e 13. As superfícies 22 a 24 eram similares em termos de ambientes de ligação de carbono. A proporção de carbono em C-[O]- C, O-[C=O]-O, C-O-C ou C-NH3+, C-O-C*=O e C=O para as superfícies 22 a 24 era significantemente menor do que para as superfícies 1 a 4 e 13. A proporção de carbono nos ambientes de ligação CO3- e C*-C- O-C-C* era maior para as superfícies 22 a 24 do que para as superfícies 1 a 4 e 13. O ambiente de ligação de carbono de superfície 29 era diferente do ambiente de ligação de carbono de todas as outras superfícies tratadas com plasma. A proporção de carbono em C-[O]-C era comparável às superfícies 1 a 4 e 13. As proporções de carbono nos ambientes de ligação O-[C=O]-O, CO3- e C*-C-O-C-C* eram menores para a superfície 29 do que para as superfícies 1 a 4 e 13. As proporções de carbono nos ambientes de ligação C-O-C ou C-NH3+, C-O- C*=O e C=O era maior para a superfície 29 do que para as superfícies1 a 4 e 13. O pico de perda de energia foi resultado de uma transição de π^π* aromática, e é um indicador de aromaticidade de superfície.

[00271] Os picos dos espectros O1s foram quase gaussianos e não poderiam ser ajustados a uma curva. Os picos de espectros N1s foram ajustados a uma curva (melhor ajuste de qui quadrado) para identificar e quantificar os ambientes de ligação para nitrogênio nas superfícies através do uso de larguras de pico e locais de energia para espécie, conforme encontrado na literatura (tabela 14). As concentrações são relatadas em unidades de percentual atômico, que foram obtidas pela multiplicação da porcentagem da área pela concentração atômica. A proporção de nitrogênio no ambiente de ligação -NH3+ em todas as superfícies, exceto a superfície 9, era menor do que nas superfícies 1 a 4 e 13. O nitrogênio no ambiente de ligação -NH2 nas superfícies 5 a 12, 19, 33 e 34 variou, porém, era maior do que nas superfícies 1 a 4 e 13. O nitrogênio no ambiente de ligação -NO2 nas superfícies 5 a 12, 19, 33 e 34 variou, porém, era menor do que nas superfícies 1 a 4 e 13. O nitrogênio no ambiente de ligação -NO3 nas superfícies 5 a 12, 19, 33 e 34 variou, porém, era maior do que nas superfícies 1 a 4 e 13. Os ambientes de ligação de nitrogênio das superfícies 22 a 24 e 29 eram diferentes das outras superfícies tratadas com plasma. A proporção de nitrogênio no ambiente de ligação -NH2 nas superfícies 22 a 24 e 29 variou, porém, era significantemente maior do que nas superfícies 1 a 4 e 13. A proporção de nitrogênio no ambiente de ligação -NO2 era menor nas superfícies 22 a 24 e 29 do que nas superfícies 1 a 4 e 13. A proporção de nitrogênio no ambiente de ligação O=C-N-C=O era comparável nas superfícies 22 a 24 e 29 e nas superfícies 1 a 4 e 13.

[00272] As publicações citadas ao longo deste documento estão aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade. Embora os vários aspectos da invenção tenham sido ilustrados acima, por meio de referência a exemplos e modalidades preferenciais, deve-se com- preender que o escopo da invenção é definido não pela supracitada descrição, mas pelas reivindicações apresentadas a seguir, adequadamente interpretadas sob os princípios da legislação de patentes. Tabelas Tabela 1: Expressão de Marcadores de Pluripotência nas Células da Linhagem de Células-tronco Embrionárias Humanas H1 na Passagem 50 Cultivadas nas Placas de Superfície Modificada da Presente Invenção

Tabela 2: Expressão de Marcadores de Pluripotência nas Células daLinhagem de Células-tronco Embrionárias Humanas na Passagem 53Cultivadas nas Placas de Superfície Modificada da Presente Invenção

Tabela 3: Expressão de Marcadores Característicos da Linhagem do Endoderma Definitivo nas Células da Linhagem de Células-tronco embrionárias Humanas na Passagem 51 (p2) e Passagem 53 (p4) cultivadas nas Placas de Superfície Modificada da Presente Invenção, Tra- tadas com Ativina AExpressão da % do marcador de superfície CXCR4 seguindo a diferenciação de células ES humanas H1 para o Endoderma definitive

Tabela 4: Confluência percentual (área de captura ocupada pelos objetos) e o total de colônias de células-tronco embrionárias humanas H9 maiores que 50.000 microns quadrados na área de captura após umapassagem nas placas de superfície modificada da presente invenção

Continuação

Exposição de IR: concentração em μM de Y-27632 por 96 horas de culturaTabela 5: Expressão de Marcadores Característicos da Linhagem do Endoderma Definitivo nas Células da Linhagem de Células-tronco embrionárias Humanas na Passagem 51 Cultivadas nas Placas de Superfície Modificada da Presente Invenção, Tratadas com Ativina A Expressão da % do marcador de superfície CXCR4 seguindo a diferenciação de células ES humanas H1 para o endoderma definitivo

Tabela 6: Preparação das Placas de Superfície Modificadas da Pre sente Invenção

Tabela 7: Composição elementar da Superfície das Placas de Superfície Modificada conforme Determinado pelo XPS

* Outro elementos foram detectados a uma concentração de 0,4%Tabela 8: Ambiente de Ligação de Carbono através de Ajuste da Curva dos Espectros C1s

* O grupo funcional foi identificado em somente uma amostra.Tabela 9: Ambiente de Ligação de Nitrogênio através de Ajuste deCurva dos Espectros N1s

1Os espectros N1s foram indistinguíveis para placas de superfície modificada 1 a 4 e 13, e os dados resultantes da ajuste de curva de dois espectros N1s representativos são determinados.2* O grupo funcional foi identificado em somente uma amostra.Tabela 10: Rugosidade de Superfície das Placas de Superfície Modifi-cada da Presente Invenção conforme Determinado pelo AFM

Tabela 11: Resumo dos Resultados da Análise de XPS da Composição elementar de Superfície, da Adesão de Células-tronco Embrionárias Humanas e dos Experimentos de Formação de Colônia nas Placas de Superfície Modificadada Presente Invenção

"-" significa a formação de menos que 15 colônias por 10 cm2 "+", "++", e "+++" significa pequena (15 ou mais colônias por 10 cm2), média e alta adesão de células ES humana e formação de colônias, respectivamente. "RI" significa inibidor de Rho Quinase; "ND" significa experimento não realizado "PS" significa poliestireno; "PC" significa policarbonato; "PS/PC" significa mistura de poliestireno e policarbonato; "COC" significa copolíme- ro de olefina cíclica; "CP" significa plasma de corona; "MP" significa plasma de micro-ondas 1A adesão de células ES humanas cresce em colônias que podem ser passadas cerca de 3 vezes (então, a taxa de crescimento decai es- pontaneamente) 2* Células ES humanas aderem e crescem em colônias que se diferenciam espontaneamente antes da primeira passagem 3** Células ES humanas aderem e crescem em colônias (passagem não testada) 4*** Uma única amostra disponível para análise Tabela 12: Composição elementar de Superfície conforme Determinado por XPS

1Não é plasma tratado. 2* Outros elementos foram detectados a uma concentração de 0,2a 2,0%.Tabela 13: Ambiente de Ligação de carbono através de Ajuste da Curva dos Espectros C1s

* Não é plasma tratado,Tabela 14: Ambiente de Ligação de Nitrogênio através de Ajuste deCurva dos Espectros N1s

* Não é plasma tratado, ** ND: analisada, porém, não detectada.

Claims (15)

1.Superfície que faz parte de um recipiente ou matriz destinada para uso em uma cultura de células ou análises, desprovida de uma camada de células alimentadoras e desprovida de uma camada adsorvente, caracterizada pelo fato de que a dita superfície permite a fixação e cultivo das células, sendo que a dita superfície: (a)contém pelo menos 1,3% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 24,9% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 20,7 graus; (b)contém pelo menos 1,7% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 29,6% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 14,3 graus; (c)contém pelo menos 2,0% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 30,7% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 18,4 graus; ou (d)contém pelo menos 2,1% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 30,2% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 17,4 graus.

2.Superfíciedeacordocomareivindicação1, caracterizada pelo fato de que apresenta uma camada adsorvente.

3.Superfíciedeacordocomareivindicação1, caracterizadapelo fato dequeas células sãomantidas em cultura após as células se fixarem à superfície.

4.Superfíciedeacordocomareivindicação1, caracterizada pelo fato de que compreende poliestireno tratado com plasma de corona, poliestireno tratado com plasma de micro-ondas, copolímero de olefina cíclica tratada com plasma corona ou uma mistura tratada com plasma corona de poliestireno e policarbonato.

5.Superfície de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a soma de O e N é superior a 19,5%.

6.Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos 1,3% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 24,9% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 20,7 graus.

7.Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos 1,7% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 29,6% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 14,3 graus.

8.Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos 2,0% de N, apresenta uma soma de O e N de pelo menos 30,7% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 18,4 graus.

9.Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos 2,1% de N, apresenta uma soma de O e N de a pelo menos 30,2% e apresenta um ângulo de contato de pelo menos 17,4 graus.

10.Superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende poliestireno, copolímero de olefina cíclica, policarbonato, metacrilato de polimetila, ou copolímero de estireno e acrilonitrila.

11.Superfície de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende poliestireno.

12.Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que faz parte de um recipiente.

13.Superfície de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o recipiente compreende poliestireno, copolímero de olefina cíclica, policarbonato, metacrilato de polimetila, ou copolímero de estireno e acrilonitrila.

14. Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma matriz tridimensional.

15.Superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é um arcabouço poroso.

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