CN1950498A

CN1950498A - 培养胚胎干细胞的组合物和方法

Info

Publication number: CN1950498A
Application number: CNA2005800149072A
Authority: CN
Inventors: 阿尔伯特·哈耶克; 吉莉安·贝蒂; 安娜·洛佩斯
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2007-04-18
Also published as: WO2005086845A3; EP1730261A4; AU2005221079B2; US20090155218A1; JP2007528226A; AU2005221079A1; CA2558486A1; EP1730261A2; WO2005086845A2

Abstract

本发明涉及干细胞未分化状态和/或多能性维持的方法、复合物和试剂盒，包括胚胎干细胞。也涉及维持于未分化状态的干细胞。本发明提供了使用富含TGFβ家族成员蛋白，FGF家族成员蛋白和/或烟酰胺的培养基，而不使用成纤维细胞饲养层，条件培养基，或白血病抑制因子。

Description

培养胚胎干细胞的组合物和方法

交叉引用相关的申请

[001]本申请要求临时专利申请NO.US60/552,318的优先权，申请日为2004年3月10日，所有在此公开的内容应作为整体考虑。

技术领域

[002]本发明涉及分子和细胞生物学领域，尤其涉及胚胎干细胞在未分化状态时的培养，并且将这些细胞用于细胞生产过程的研究以及医用产品的开发。

背景技术

[003]由于胚胎干细胞的多能性，使得其在许多人类疾病的治疗方面具有很大潜能。胚胎干细胞是一种重要的资源，由于其能分化成多种类型的细胞，从而对多种细胞类型、组织和器官疾病和病症等治疗方法的研究开发产生影响。因此，当前研究的焦点集中于研究开发其处于未分化状态时的培养和维持方法，控制其分化，产生满足治疗目的的细胞类型。

[004]已经有人提出，包括成熟干细胞和胚胎干细胞的干细胞，通过引入新基因或缺失替换缺陷基因，从而被分离或修饰，用于替换或补充缺陷的或失去的身体组织和器官，这些组织和器官往往产生重要的物质影响健康和生命。对这一类研究和其后的治疗而言，未分化多能干细胞的培养是必需的。然而，这种培养极其困难。将胚胎干细胞于不包含补充添加物的培养基中培养时，未分化的干细胞自然地开始快速分化，然后减慢或停止分裂，这种现象非常典型。因此，迄今为止，用于研究和治疗开发的干细胞仅有极少数。为了克服这些难题，研究者开始尝试设计干细胞的培养方法，即通过加入外源物质，抑制其分化但却可以继续分裂，使其保持未分化的状态。

[005]小鼠胚胎干细胞(mESC)和人胚胎干细胞(hESC)是两种研究最多的胚胎干细胞类型。在小鼠胚胎干细胞的培养过程中，维持其未分化状态和多能性需要小鼠成纤维细胞饲养层(mEFs)的存在，或者白血病抑制因子(LIF)激活STAT3。同样，hESC的培养也要置于mEFs上，或者置于从成纤维细胞的培养物中获得的培养基中。因为人胚胎干细胞系在近期才用于研究，其自我更新和分化的细胞内途径还不是十分清楚。然而，结果逐渐表明hESC生长所需要的物质与mESC生长所需要的物质有很大不同。例如，近来发现，与mESC不同，当培养于mEFs上或者使用mEFs条件培养基时，激活STAT3并不能充分的阻止hESC的分化4。另外，在本申请的优先权文件申请日之后出版的一篇报道公开了基本成纤维细胞因子(bFGF)，即角质化细胞生长因子(KGF)的一种类型，与noggin一起抑制hESC的分化(Xu，R-H等，2005)。因此，根据作者的观点，在不需要饲养细胞的情况下，在培养基中加入bFGF，能够维持hESC持续生长。

[006]尽管干细胞的培养已经有很大进步，尤其是胚胎干细胞，但未分化干细胞的维持和生长仍然需要实用可靠的方法和材料。尤其需要未分化的hESC生长维持的方法和材料。

发明内容

[007]本发明提供了维持未分化干细胞生长的方法、复合物和试剂盒，其中也包括胚胎干细胞。因此，本发明涉及维持胚胎干细胞未分化状态和/或多能性的领域。这些方法、复合物和试剂盒适用于胚胎干细胞培养的研究、医疗物质和生产的研究、疾病和病症的治疗，尤其是影响人类的疾病和病症。

[008]一方面，本发明提供了维持未分化干细胞生长的方法。总的来说，该方法包括干细胞转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族的一个成员，如激活素A，在足够长的时间内，其数量能足够维持细胞未分化状态，从而得到希望的结果。希望的结果可能是任何医学或科学相关的结果，例如，但不限制于此，特定物质的生产，培养板上培养的融合，为了转移至新的培养基(即传代)时大量细胞的生产，或者为了植入一定物体时大量细胞的生产。方法可能包括暴露干细胞于数量足够维持细胞生长的成纤维细胞生长因子蛋白家族(FGF)的某成员，如KGF(也称为FGF7)，但不限制于通过多次传代生长，如10次传代或更多。因此，发明中各种不同方法至少能够在10次传代培养中维持细胞处于未分化状态。同样，可以使干细胞暴露于足够数量的烟酰胺(NIC)，通过多次传代，如约10代、20代、30代或更多，使之能够维持细胞于培养基中的生长。这些方法能够在缺少饲养细胞、条件培养基、和/或白血病抑制因子(LIF)的情况下维持细胞于培养基中的生长。在实施例中，这些方法能够使细胞处于多能状态。

[009]第二方面，发明提供了培养和/或维持干细胞未分化或多能状态的复合物。总体来讲，这些复合物包括TGFβ家族的成员，如激活素A，FGF家族的成员如KGF，或NIC，或两个或所有三个的联合，在足够长时间内，以足够的数量和形式，维持未分化状态干细胞的至少一种状态的培养，从而达到希望的结果。按照以上讨论的方法，希望的结果可能是任何医学或科学相关的结果。因此，在实施例中，这些复合物可以包含足够数量的KGF，在足够长的时间内，培养和/或维持未分化干细胞一种状态的培养，达到希望的结果。在实施例中，这些复合物包含足够数量的NIC，在足够长的时间内，培养和/或维持未分化状态干细胞的一种培养，达到希望的结果。在不同实施例中，复合物包含激活素A，KGF和NIC中两个或三个的联合。除TGFβ家族成员外，通常，本发明的复合物包含一个成分即FGF家族成员，和/或NIC。其他成分可以是已知的与干细胞，或将干细胞或由干细胞产生的物质引入动物或受试人体后的生长相适合，或相容的任何物质，在实施例中，是培养基。鉴于本发明在培养和维持干细胞方面的有效性，显然，本发明的复合物本身可以包含干细胞，包括胚胎干细胞，如hESC。

[010]第三方面，本发明提供了含有培养和/或维持干细胞未分化或多能状态的部分或所有材料的试剂盒。其最基本的形式至少包括一个容器，含有TGFβ蛋白家族的一个成员，FGF蛋白家族的一个成员，和/或NIC，并且可以满足其在足够长时间内，以足够的数量和形式，维持干细胞的培养，从而达到希望的结果。这些可能是任何医学或科学相关的结果，如可检测数量的特定物质的生产，培养板上培养的融合，为了植入受试者足够数目细胞的产生，等。

[011]第四方面，本发明提供了未分化和多能性干细胞。干细胞在本发明所提供的复合物中生长和维持。在实施例中，所提供给干细胞的复合物不包括饲养细胞、来源于小鼠胚胎饲养细胞层的条件培养基和/或STAT3激活。

附图说明

[012]附图共同构成本说明书的一部分，与文字描述一起图解发明实施例的一些特点，用于解释本发明的某些方面。

[013]图1是在缺少激活素A时hES细胞的分化。图1a是在相差显微镜观察下HSF6细胞的形态学和分化状态(上层)，以及免疫组织化学结果(下层)。图1b是在不同条件下，hES细胞生长于mEFs(第1泳道)或层粘连蛋白(第2-5泳道)上时，oct-4和nanog的半定量RT-PCR(26循环)检测结果。图1c是一个利用FACS比较细胞表面抗原表达的代表试验。图1d表示存在激活素A(A)、NIC(N)、KGF(K)或者3个的联合体(ANK)和添加了FGF2的条件培养基时比较hES细胞的增殖情况的代表试验。

[014]图2是在mEF上加入激活素/卵泡抑素后对HSF6细胞产生的影响。图2a是图1中第I组中的HSF6细胞，在卵泡抑素存在时于mEFs上培养1周(左边组)和2周(右边组)的情况。图2b是存在或缺少卵泡抑素时HSF6细胞于mEFs上培养时，oct-4和nanog的半定量RT-PCR(26循环)检测结果。图2c是在来源于CF-1小鼠的mEFs中的激活素A转录物和mEF条件培养基中前体蛋白的RT-PCR和Western blots的鉴定结果。图2d是HSF6细胞中激活素途径中信号元件的鉴定结果。

[015]图3是hES细胞在使用激活素A，NIC和KGF培养时，其多能性的长期维持结果。图3a是HSF6细胞使用激活素A，KGF和NIC传代20次时干细胞标记的分析结果。图3b是畸胎瘤在裸鼠中的形成。图3c是存在激活素A，KGF和NIC时，培养的hES细胞中谱系特异标记的RT-PCR分析结果。

具体实施方式

[016]下面详细介绍本发明中各种可仿效的参考实施例。本发明具体实施例的下列详细描述不应解释为以任何方式限制本发明，而应理解为对帮助理解本发明工艺中各种技术的实施例的解释。

[017]定义

[018]除非有其他具体描述，本文中所使用的所有术语在使用时应根据分子生物学和细胞生物学行业中一般的和习惯用法确定。以下术语定义如下：

[019]这里使用的术语“一”和“这”单数形式包括所有单数和复数形式，除非句子上下文清楚地说明了其他情况。

[020]这里使用的术语“或”表示一个或所列出选择中的两个或多个的联合。

[021]这里使用的术语“包含”，在描述发明方法时，使用于步骤的详述前表示该方法除了已经详细描述的以外，还包括一个或多个步骤，另外的一个或多个步骤在所述步骤之前，中间和/或之后完成。例如，某方法包含步骤a，b和c，而c包括一种方法a、b、x和c，步骤a、b、c和x的方法，同样一种步骤x、a、b和c的方法。另外，将术语“包含”用于步骤描述之前时，并非必须要求所列步骤连续执行，除非句子中上下文有其他清楚地描述。例如，一种方法包含步骤a，b和c，而c包括一种方法，即按顺序执行步骤a，c和b，步骤c，b和a，和步骤c，a和b，等。

[022]这里使用的术语“接触”和“暴露”可以互换使用，当联系细胞和一种物质时，表示将该物质置于某一位置，在该条件下使之接触细胞，以便产生“接触的”或“暴露的”细胞。

[023]这里使用的术语“细胞”指单一的细胞，也指一个种群(即，多于一种)。种群可以是包含一种细胞类型的纯种群，也可以包含多种细胞类型。在本发明中，对种群包含的细胞类型的数目没有限制。另外，此处所使用的“细胞培养”指任何细胞的体外培养。本术语包括连续的细胞系(即具有永久表型)，原代细胞培养，有限细胞系(即非转化细胞)，任何其他在体内维持的细胞种群，包括卵母细胞和胚胎。

[024]这里使用的术语“混合的细胞培养”指两种或多种细胞类型的混合物。在一些实施例中，细胞是非基因工程细胞系，而在其他实施例中，细胞是基因工程细胞系。在一些实施例中，细胞包含基因工程分子，本发明对此没有限制，包含任何适于畸态瘤生产或者样品中凋亡检测，鉴定和/或定量的细胞类型联合，包括混合的细胞培养于所有使用的细胞类型不是基因工程细胞系；混合物中一种或多种细胞类型是基因工程细胞系，其余则不是；混合物中所有的细胞类型是基因工程细胞系。

[025]这里使用的术语“原代细胞”是指在没有培养的情况下，直接从动物的组织(例如，血)或器官的获得的细胞，包括人类。尽管并非必然，典型情况是原代细胞在死亡和/或增值停止之前能够在体外传代10次或更少。相反，“培养的细胞”是已经在体外维持和/或增值10代或更多代的细胞。

[026]这里使用的术语“培养的细胞”，与相同来源的原代细胞相比，指在停止增值和/或死亡前能够在体外多次传代的细胞。培养的细胞包括“细胞系”和“原代培养的细胞”。

[027]这里使用的术语“细胞系”指体外培养的细胞，包括原代细胞系、有限细胞系、连续细胞系和转化细胞系。术语并不要求培养的细胞的数目无限大。细胞系可以自发的或者经转化产生。

[028]这里使用的术语“原代细胞培养”和“原代培养”指直接从体内细胞获得的细胞培养，例如从动物或昆虫的组织获得。这些培养物可以来源于成人或者胎儿的组织。

[029]这里使用的术语“单层”，“单层培养”和“单层细胞培养”指黏附于基质上，一个细胞厚度的单层培养。单层细胞可以以任何形式生长，包括但不限制于培养瓶、试管、盖玻片(即，壳瓶)、滚瓶，等。单层细胞也可以生长吸附于微载体上，包括但不限制于珠子。

[030]这里使用的术语“悬浮”和“悬浮“培养”指细胞在不吸附到基质时可以生长和增殖。悬浮培养可用于造血细胞，转化细胞系和恶性肿瘤细胞的培养。

[031]这里使用的术语“培养基”和“细胞培养基”指适于细胞体外培养的介质(即细胞培养物)。此术语并没有限制于任何特定的培养基。例如，此定义除了包含维持培养基外，也包含副产品。的确，此术语包括与细胞生长相适应的任何培养基。

[032]这里使用的术语“体外”指人为环境，和在其中的过程和反应。体外环境通过试管和细胞培养进行例证，但不限制于此。

[033]这里使用的术语“体内”指自然环境(即动物或细胞)和在其中的过程和反应。

[034]这里使用的术语“增殖”和“生长”，可以交换使用，指细胞数目的增加。相反，维持指细胞或细胞种群连续存活，但并非必须是细胞数目增加的存活。

[035]这里使用的术语“分化”和其所有的形式指细胞经历的成熟过程，由此产生独特的性状，和/或执行特殊的功能，和/或很少可能分裂。

[036]这里使用的术语“分离”和“纯化”及其所有形式指样品中至少一种污染物(例如蛋白和/或核酸序列)的数量减少。因此纯化结果是样品中目标蛋白和/或核酸序列的数量“浓缩”(即增加)。

[037]这里使用的术语“氨基酸序列”指天然存在的氨基酸序列或者基因工程蛋白分子。“氨基酸序列”和同类术语，例如“多聚肽”，“肽”或“蛋白”，并非意味着限制氨基酸序列于所列出的蛋白分子相关的完整的和天然的氨基酸序列。

[038]这里使用的术语“受体蛋白”和“膜受体蛋白”指跨膜蛋白或其部分，连接配体(即，gp130，一个微生物分子；内毒素，例如脂多糖、脂肪酸转酰酶、dsRNA，等)。

[039]这里使用的术语“配体”指与另外一个分子连接的分子。特定的分子指配体和另外一个分子中的任一个或两个。另外一个分子的例子包括配体的受体，和连接配体的抗体。

[040]这里使用的术语“激活”，用于生化反应(例如激酶活性)和/或细胞反应(例如细胞增殖)时指生物化学和/或细胞反应的增加。这里使用的术语“活化的”，用于细胞时指经历反应改变其生理特性，形成生物反应，逐渐成为生物学的“活跃的”，随后“活化的”。例如，单核细胞活化后成熟为巨噬细胞。另一个例子，巨噬细胞接触内毒素(如LPS)变为活化的状态，其中活化的巨噬细胞能产生与激活相关的增强的分子水平和/或类型(即iNOS，MMP-12金属弹性蛋白酶和类似物)。另外一个例子，不成熟的树突状细胞成为活化状态，成熟为功能树突状细胞。尽管可能，但“活化的”细胞并非必然会生长或增殖。

[041]这里使用的术语“天然存在”和“野生型”，用于分子或混合物时(例如核苷酸序列，氨基酸序列，细胞，凋亡泡，外部的磷脂酰丝氨酸等)，指能够发现分子或混合物的自然状态，并非人类有意修饰的。例如，天然存在的多肽序列指多肽序列存在于有机体，在自然状态下可以分离出来，其中多肽序列并非是人类有意修饰的。

[042]这里使用的术语“衍生于”和“建立于”，用于此处所公开的任何细胞时指从组织母细胞中获得的(即分离，纯化等)，可以采用任何操作方式，例如，不限制于此，病毒感染，DNA转染，采用化学、辐射等方法处理和/或突变，包含于培养的母细胞的任何细胞的选择(如连续培养)。根据衍生的细胞对生长因子、细胞因子、细胞因子处理的选择过程、黏附性、黏附性缺失、分选程序，等的反应，从混合种群中进行选择。

[043]这里使用的术语“生物学活性”指分子(即肽、核酸序列、碳水化合物分子、有机或无机分子，等)在体外有相应的结构，和/或生化功能。

[044]除非有其他定义，在说明分子和/或现象时，术语“缩减”，“抑制”，“变小”，“禁止”，“减少”等其各种形式，当用于比较第一份样品与第二份样品的任何分子(即蛋白，核酸序列，蛋白序列，增殖，分化率等。)和现象(即蛋白-蛋白之间相互作用，催化作用，凋亡，细胞死亡，细胞存活，细胞增殖，细胞分化，半胱天冬酶剪切，受体聚和，受体复合物形成，DNA断裂，分子易位，与分子的结合，核酸序列的表达，核酸序列的转录，酶活，等。)时，说明第一份样品中分子和/或现象的任何可检测的数量低于第二份样品。

[045]除非有其他定义，在说明分子和/或现象时，术语“增加”，“升高”，“增高”等其各种形式，当用于比较第一份样品与第二份样品中的任何分子(即蛋白，核酸序列，蛋白序列，增殖，分化率等。)，现象(即蛋白-蛋白之间相互作用，催化作用，凋亡，细胞死亡，细胞存活，细胞增殖，细胞分化，半胱天冬酶剪切，受体聚和，受体复合物形成，DNA断裂，分子易位，与分子的结合，核酸序列的表达，核酸序列的转录，酶活，等。)时，说明第一份样品中分子和/或现象的任何数量高于第二份样品，用任何可接受的统计学方法进行分析，都具有显著的统计学意义。

[046]这里使用的术语“凋亡”指非坏死死亡的过程，发生于多细胞动物细胞，随后是内在细胞自杀程序的活化。凋亡是多细胞动物自身发育和平衡的一个正常过程，通常导致细胞的死亡。凋亡也会由于微生物感染引起病理学的改变，导致凋亡和/或完全死亡的易感性增加。凋亡涉及序列形态和生化特征的改变。凋亡的一个早期标志是质膜磷脂酰丝氨酸由内至外的倒转，细胞起泡，称作“沸腾运动”，质膜释放包含RNA和DNA等细胞物质的小囊泡，即凋亡小体。在凋亡期间，凋亡小体释放，细胞收缩，随后细胞膨胀，在某些核小体位置，由于内源核酸酶的活化，细胞溶解，核崩溃，核染色体断裂。典型的，凋亡小体被其他细胞吞噬，尤其是免疫细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，未成熟树突状细胞，等等。本行业中的一个技术减少了凋亡的可能性，导致细胞存活增加，没有必然的增加细胞增殖(尽管可能包括)。相应的，这里使用的术语“减少凋亡”和“增加存活”是等同的。同时，这里使用的术语“增加凋亡”和“减少存活”也是等同的。

[047]这里使用的术语“细胞反应”指细胞活性的增加或减少。例如，“细胞反应”可以包括但不限制于这一过程的凋亡、死亡、DNA断裂、起泡、增殖、分化、吸附、分泌、DNA/RNA合成、基因转录和翻译，和/或细胞因子分泌或停止。“细胞反应”可以包含脱磷酸作用、磷酸化作用、钙流出、目标分子分裂、蛋白-蛋白相互作用、核酸-核酸相互作用，和/或蛋白/核酸相互作用等的增加或减少。这里使用的术语“目标分子的剪切”指分子的剪切(例如在凋亡的过程中，胱门蛋白酶解切成碎片，DNA剪切成可判定大小的片断等)。这里使用的术语“相互作用”指相互之间的作用或两个或更多分子对彼此的作用。

[048]这里使用的术语“转基因”，当用于细胞时指细胞包含转基因，或者其基因组由于引入了转基因而改变；当用于组织时，指组织包含一个或多个细胞包含转基因，或者其基因组由于引入了转基因而改变。转基因细胞和组织包含通过人类如本行业的技术人员的干预将核酸(通常是DNA)引入目标细胞或转基因整合于目标细胞的染色体。

[049]这里使用的“转基因”指将任何核酸序列通过实验手段引入细胞，转基因可以是“内源核酸序列”或“异源DNA序列”(即“外源DNA”)。与自然存在的序列相比较，术语“内源DNA序列”指在细胞中自然发现的被引入的没有经过修饰(即点突变，选择性标记基因的存在等)核酸序列。术语“外源DNA序列”指核酸序列连接于，或被处理后连接于一个核酸序列，该核酸序列在自然状态下没有被连接，或在自然状态下连接于不同的位置。异源DNA指非细胞内源的序列，即从其他细胞获得的序列被引入细胞。异源DNA也包括经过修饰的内源DNA序列。通常，尽管非必然，异源DNA编码不属于细胞本身的RNA，并表达产生蛋白。异源DNA的例子包括报告基因、转录和翻译控制序列、选择性标记蛋白(即耐药性蛋白)，等。

[050]这里使用的术语“试剂”、“检测试剂”、“分子”、“检测分子”、“复合物”和“检测复合物”在此处可以互换使用，指任何来源的(例如植物、动物、原生生物和环境来源，等)任何类型的分子(例如肽、核酸、碳水化合物、类脂、有机分子和无机分子，等)任何联合分子(例如糖脂，等)，或者通过任何方法(例如自然存的分子的纯化，化学合成，和基因工程的方法等)制备的分子。因此，这些术语与“物质”是同义的。在一个实施例中，术语“检测试剂”指任何化学个体，可用于治疗或防止身体疾病或功能失调的任何化学个体，药物和药品等。检测试剂包括已知的和潜在的治疗试剂。使用本发明的方法可以筛选检测试剂可否用于治疗。一种“已知的治疗试剂”指一种治疗试剂在治疗或预防过程中(例如，通过动物实验或人类给药的前期经验)被证明是有效的。换而言之，一种已知的治疗试剂不限制于在疾病(即，癌症)的治疗过程中有效的试剂。例如，这些试剂包含抗体，核酸序列如核糖核酸序列，其他将进一步介绍，但不限制于此。通过本发明的方法鉴定的检测试剂包括从任何来源获得或通过任何方法(如自然存在的分子的纯化，化学合成和基因工程方法，等)制备的任何类型的分子(例如肽、核酸、碳水化合物、类脂、有机和无机分子，等)。

[051]除非有其他定义，术语“确切的”，“精确的”或者其他等同的术语，此处用于表示成分的数量，特性如分子量，反应条件，等的所有数字，在所有实例中应理解为经术语“大约”修饰，因此自然包括与试剂数字相比大于或小于10％的变量。相应的，除非有相反的说明，此处的数字参数是近似值，可能随着本发明中目标特性的不同而不同。至少，每个数字参数是根据报告数字的有效数字，并使用一般的舍入方式来解释。尽管描述本发明主要范围的数值域和参数是近似值，具体实例中报告的数值是尽可能精确的。然而，任何数值内在包含标准偏差，这是由数值检测方法的必然误差引起的。

[052]这里使用的术语“改变”和其所有形式，在说明任何分子(即核酸序列、蛋白序列、凋亡泡、外部磷脂酰丝氨酸，等)和/或现象(即凋亡、细胞死亡、细胞存活、细胞增殖、半胱天冬酶剪切、受体二聚作用、受体复合物形成、DNA断裂、分子易位、与一个分子连接、核酸序列的表达、核酸序列的转录、酶活，等)的水平时，指分子和/或现象的数量增加或减少，不管这些数量是主观和/或客观的测定的。

[053]这里任何具体命名的蛋白(如激活素A多肽，角质化细胞生长因子，等)指任何和所有等同的片断，融合蛋白和具体命名蛋白的变体，具有至少一种具体命名的蛋白的生物学活性(这里公开的)，其中生物学活性通过任何方法可以检测到。因此，蛋白的命名包括蛋白的所有形式，包括此处提到的属类中蛋白的具体形式。

[054]术语“片断”用于说明一种蛋白(例如激活素A，角质化细胞生长因子，等)时，指部分蛋白片断，大小从4个连续的氨基酸残基至仅缺少一个氨基酸残基的整个氨基酸序列。因此，包含“至少一个氨基酸序列的一部分”的多肽序列等同于一个“片断”和包含整个氨基酸序列的4个连续氨基酸残基。

[055]这里使用的术语“变体”和“同族体”(例如激活素A多肽，KGF，等)是这样一些蛋白，与通过插入，缺失和/或一个或多个氨基酸的替换的对照蛋白不同，这些插入，缺失，和/或替换并没有改变对照蛋白的主要生物学功能。变体和同族体包括与对照蛋白有相同的结构和功能特点的蛋白，但来源于不同的种。在实施例中，替换是保守改变一个或多个氨基酸。术语氨基酸的“保守替换”指氨基酸与具有相同的疏水性，极性，和/或结构的氨基酸的替换，例如，以下氨基酸具有中性侧链可以保守的相互替换，包括氨基乙酸、丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，丝氨酸和苏氨酸。具有中性侧链的芳香族氨基酸也可以适当的相互替换，包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。半胱氨酸和甲硫氨酸属于含硫氨基酸，也可以适当的相互替换。同样，天冬酰胺可以保守的替换谷酰胺，反之亦然，因为二者都是二羟酰胺类氨基酸。另外，天冬氨酸也可以与谷氨酸相互保守的替换，因为二者都是碱性的，带电荷(亲水性的)氨基酸。确定哪个或者多少氨基酸能否被替换，插入或者缺失而不改变生物学和/或免疫学活性，可以使用本行业熟知的计算机程序来解决，例如DNAStar^TM软件。因此，蛋白家族的成员，例如TGFβ家族和FGF家族成员，包含家族其他成员的变体和同族体。

[056]“TGFβ家族”指具有TGFβ家族成员已知结构和功能特点的蛋白。TGFβ蛋白家族无论从结构还是功能方面都具有良好的特性。包括蛋白TGFβ系列、抑制素(包括抑制素A和抑制素B)、激活素(包括激活素A，激活素B，激活素AB)、MIS(Müllerian抑制物质)、BMP(骨形成蛋白)、dpp(decapentaplegic)、Vg-1，MNSF(单克隆非特异抑制因子)和其他。在具有不同特点的TGFβ家族成员中，对正常的和转化的上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、神经元细胞，淋巴样细胞和其他造血细胞来说，TGFβ是最具有潜能的生长抑制因子。该蛋白家族的活性是基于与不同类型细胞的某些受体特异结合而产生的。该家族的成员的序列上某些区域具有一致性，尤其在C末端，与其功能相关。TGFβ家族包括100多种不同的蛋白，所有这些蛋白至少有一个区域的氨基酸序列是一致的。该家族的成员包括，但不限制于下列蛋白，GenBank登录号如下：P07995，P18331，P08476，Q04998，P03970，P43032，P55102，P27092，P42917，P09529，P27093，P04088，Q04999，P17491，P55104，Q9WUK5，P55103，O88959，O08717，P58166，O61643，P35621，P09534，P48970，Q9NR23，P25703，P30884，P12643，P49001，P21274，O46564，O19006，P22004，P20722，Q04906，Q07104，P30886，P18075，P23359，P22003，P34821，P49003，Q90751，P21275，Q06826，P30885，P34820，Q29607，P12644，Q90752，O46576，P27539，P48969，Q26974，P07713，P91706，P91699，P27091，O42222，Q24735，P20863，O18828，P55106，Q9PTQ2，O14793，O08689，O42221，O18830，O18831，O18836，O35312，O42220，P43026，P43027，P43029，O95390，Q9R229，O93449，Q9Z1W4，Q9BDW8，P43028，Q7Z4P5，P50414，P17246，P54831，P04202，P01137，P09533，P18341，O19011，Q9Z1Y6，P07200，Q9Z217，095393，P55105，P30371，Q9MZE2，Q07258，Q96S42，P97737，AAA97415.1，NP_776788.1，NP_058824.1，EAL24001.1，1S4Y，NP_001009856.1，NP_032406.1，NP_999193.1，XP_519063.1，AAG17260.1，CAA40806.1，NP_001009458.1，AAQ55808.1，AAK40341.1，AAP33019.1，AAK21265.1，AAC59738.1，CAI46003.1，B40905，AAQ55811.1，AAK40342.1，XP_540364.1，P55102，AAQ55810.1，NP_990727.1，CAA51163.1，AAD50448.1，JC4862，PN0504，BAB17600.1，AAH56742.1，BAB17596.1，CAG06183.1，CAG05339.1，BAB17601.1，CAB43091.1，A36192，AAA49162.1，AAT42200.1，NP_789822.1，AAA59451.1，AAA59169.1，XP_541000.1，NP_990537.1，NP_002184.1，AAC14187.1，AAP83319.1，AAA59170.1，BAB16973.1，AAM66766.1，WFPGBB，1201278C，AAH30029.1，CAA49326.1，XP_344131.1，AAH48845.1，XP_148966.3，I48235，B41398，AAH77857.1，AAB26863.1，1706327A，BAA83804.1，NP_571143.1，CAG00858.1，BAB17599.1，BAB17602.1，AAB61468.1，PN0505，PN0506，CAB43092.1，BAB17598.1，BAA22570.1，BAB16972.1，BAC81672.1，BAA12694.1，BAA08494.1，B36192，C36192，BAB16971.1，NP_034695.1，AAA49160.1，CAA62347.1，AAA49161.1，AAD30132.1，CAA58290.1，NP_005529.1，XP_522443.1，AAM27448.1，XP_538247.1，AAD30133.1，AAC36741.1，AAH10404.1，NP_032408.1，AAN03682.1，XP_509161.1，AAC32311.1，NP_651942.2，AAL51005.1，AAC39083.1，AAH85547.1，NP_571023.1，CAF94113.1，EAL29247.1，AAW30007.1，AAH90232.1，A29619，NP_001007905.1，AAH73508.1，AAD02201.1，NP_999793.1，NP_990542.1，AAF19841.1，AAC97488.1，AAC60038.1，NP_989197.1，NP_571434.1，EAL41229.1，AAT07302.1，CAI19472.1，NP_031582.1，AAA40548.1，XP_535880.1，NP_037239.1，AAT72007.1，XP_418956.1，CAA41634.1，BAC30864.1，CAA38850.1，CAB81657.2，CAA45018.1，CAA45019.1，BAC28247.1，NP_031581.1，NP_990479.1，NP_999820.1，AAB27335.1，S45355，CAB82007.1，XP_534351.1，NP_058874.1，NP_031579.1，1REW，AAB96785.1，AAB46367.1，CAA05033.1，BAA89012.1，1ES7，AAP20870.1，BAC24087.1，AAG09784.1，BAC06352.1，AAQ89234.1，AAM27000.1，AAH30959.1，CAG01491.1，NP_571435.1，1REU，AAC60286.1，BAA24406.1，A36193，AAH55959.1，AAH54647.1，AAH90689.1，CAG09422.1，BAD16743.1，NP_032134.1，XP_532179.1，AAB24876.1，AAH57702.1，AAA82616.1，CAA40222.1，CAB90273.2，XP_342592.1，XP_534896.1，XP_534462.1，1LXI，XP_417496.1，AAF34179.1，AAL73188.1，CAF96266.1，AAB34226.1，AAB33846.1，AAT12415.1，AAO33819.1，AAT72008.1，AAD38402.1，BAB68396.1，CAA45021.1，AAB27337.1，AAP69917.1，AAT12416.1，NP_571396.1，CAA53513.1，AAO33820.1，AAA48568.1，BAC02605.1，BAC02604.1，BAC02603.1，BAC02602.1，BAC02601.1，BAC02599.1，BAC02598.1，BAC02597.1，BAC02595.1，BAC02593.1，BAC02592.1，BAC02590.1，AAD28039.1，AAP74560.1，AAB94786.1，NP_001483.2，XP_528195.1，NP_571417.1，NP_001001557.1，AAH43222.1，AAM33143.1，CAG10381.1，BAA31132.1，EAL39680.1，EAA12482.2，P34820，AAP88972.1，AAP74559.1，CAI16418.1，AAD30538.1，XP_345502.1，NP_038554.1，CAG04089.1，CAD60936.2，NP_031584.1，B55452，AAC60285.1，BAA06410.1，AAH52846.1，NP_031580.1，NP_036959.1，CAA45836.1，CAA45020.1，Q29607，AAB27336.1，XP_547817.1，AAT12414.1，AAM54049.1，AAH78901.1，AAO25745.1，NP_570912.1，XP_392194.1，AAD20829.1，AAC97113.1，AAC61694.1，AAH60340.1，AAR97906.1，BAA32227.1，BAB68395.1，BAC02895.1，AAW51451.1，AAF82188.1，XP_544189.1，NP_990568.1，BAC80211.1，AAW82620.1，AAF99597.1，NP_571062.1，CAC44179.1，AAB97467.1，AAT99303.1，AAD28038.1，AAH52168.1，NP_001004122.1，CAA72733.1，NP_032133.2，XP_394252.1，XP_224733.2，JH0801，AAP97721.1，NP_989669.1，S43296，P43029，A55452，AAH32495.1，XP_542974.1，NP_032135.1，AAK30842.1，AAK27794.1，BAC30847.1，EAA12064.2，AAP97720.1，XP_525704.1，AAT07301.1，BAD07014.1，CAF94356.1，AAR27581.1，AAG13400.1，AAC60127.1，CAF92055.1，XP_540103.1，AAO20895.1，CAF97447.1，AAS01764.1，BAD08319.1，CAA10268.1，NP_998140.1，AAR03824.1，AAS48405.1，AAS48403.1，AAK53545.1，AAK84666.1，XP_395420.1，AAK56941.1，AAC47555.1，AAR88255.1，EAL33036.1，AAW47740.1，AAW29442.1，NP_722813.1，AAR08901.1，AAO15420.2，CAC59700.1，AAL26886.1，AAK71708.1，AAK71707.1，CAC51427.2，AAK67984.1，AAK67983.1，AAK28706.1，P07713，P91706，P91699，CAG02450.1，AAC47552.1，NP_005802.1，XP_343149.1，AW34055.1，XP_538221.1，AAR27580.1，XP_125935.3，AAF21633.1，AAF21630.1，AAD05267.1，Q9Z1W4，NP_031585.2，NP_571094.1，CAD43439.1，CAF99217.1，CAB63584.1，NP_722840.1，CAE46407.1，XP_417667.1，BAC53989.1，BAB19659.1，AAM46922.1，AAA81169.1，AAK28707.1，AAL05943.1，AAB17573.1，CAH25443.1，C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[057]“FGF家族”指具有已知FGF家族成员结构和功能特点的的蛋白。FGF蛋白家族无论从结构还是功能方面都具有很好的特点。至少包括20个不同的成员(不包括变异体和同族体)，包括特定的FGF蛋白系列(FGF1和FGF2)，K-FGF(发现于卡波西肉瘤细胞)，和KGF蛋白。迄今为止，已经明确该家族成员中有30-70％氨基酸序列同源性。该家族成员包括，但不限制于下列蛋白，GenBank登录号如下：P21781，P79150，P48808，Q9N198，P36363，Q02195，P70492，O15520，O35565，Q9ESS2，Q9HCT0，P36364，P54130，P31371，O43320，Q91875，Q9NP95，O54769，P48801，P36386，P05524，P11487，P48802，Q92915，P12034，P48807，P15656，P70379，P48806，Q8R5L7，P48805，P70377，P48804，Q92913，P61329，Q11184，P10767，Q92914，P21658，P70378，P08620，P61148，Q6I6M7，P48800，P34004，P15655，P13109，P09038，P48803，Q6PBT8，P05230，P03969，Q7SIF8，P20003，P48798，P12226，Q6GLR6，P20002，P03968，Q7M303，P19596，Q60487_3，Q6SJP8，P48799，O76093，O89101，O88182，P11403，O60258，P63075，P37237，Q9N1S8，P55075，Q90722，Q805B2，O35622，O95750，Q9JJN1，Q9NSA1，Q9GZV9，P41444，O10284，Q9EPC2，Q8VI82，O62682，Q9JYA0，Q9JT82，P01030_3，NP_002000.1，AAA67335.1，AAX19003.1，NP_001003237.1，NP_001009235.1，NP_032034.1，S26049，AAF26734.1，BAC39707.1，NP_071518.1，AAL16059.1，AAG31597.1，BAD84165.1，AAH88532.1，AAR87872.1，B46289，C46289，NP_001007762.1，CAB90393.1，D46289，NP_004456.1，XP_526931.1，NP_037083.1，BAB60779.1，AAM46926.1，CAG46489.1，NP_032028.1，BAD74123.1，AAL05875.1，AAK59700.1，NP_001009230.1，AAR37413.1，NP_990027.1，CAB76368.1，CAD29182.1，AAC78789.1，CAG08586.1，NP_878290.1，AAL16959.1，NP_570107.1，NP_075793.1，AAH10956.1，BAC57976.1，AAQ93357.1，AAC25096.1，AAL16963.1，AAO25617.1，AAG29501.1，NP_989730.1，NP_998966.1，CAC17692.1，NP_038546.1，NP_037084.1，NP_003859.1，XP_420304.1，NP_068639.1，BAB71729.1，AAT85804.1，NP_085117.1，CAF99081.1，NP_076451.1，NP_085113.1，BAC34892.1，CAF91044.1，XP_426335.1，CAA87635.1，CAG13262.1，CAA80987.1，AAH81367.1，CAG01370.1，NP_032033.1，NP_570830.1，NP_571366.1，NP_005238.1，AAC06148.1，BAC22069.1，XP_529049.1，AAH76721.1，NP_001001743.1，AAF31398.1，AAO33291.1，AAL16957.1，CAA44480.1，NP_991265.1，AAN16025.1，AAB18918.1，CAI15768.1，NP_034330.2，NP_990108.1，NP_445880.1，AAF31392.1，AAB71606.1，P70379，XP_542656.1，NP_071559.2，NP_997550.1，CAA44479.1，AAL83904.1，NP_001012382.1，NP_001009561.1，AAW69551.1，AAN04097.1，TVHUF5，NP_004455.1，P12034，NP_378668.1，NP_004105.1，AAH85439.1，CAI43189.1，CAI42700.1，CAI42699.1，BAD72887.1，CAG09626.1，NP_001009563.1，XP_534534.1，XP_524019.1，NP_001012380.1，NP_071547.1，NP_034333.1，NP_990219.1，AAF31390.1，XP_549094.1，CAA76422.1，CAG07674.1，NP_004104.3，XP_526425.1，XP_535845.1，XP_521287.1，NP_570827.1，CAH91802.1，AAH22524.1，P48804，AAB71607.1，AAV90630.1，CAF98890.1，AAB53825.2，CAH93046.1，CAG01557.1，H88481，JG0184，AAB18786.3，CAA94240.1，NP_004103.1，XP_511297.1，CAD19830.1，AAC98812.1，BAB88673.1，NP_066276.2，XP_543862.1，CAA45054.1，CAI51960.1，XP_546591.1，XP_485825.1，NP_570829.1，CAG07288.1，CAA35925.1，CAA94239.1，BAC39686.1，BAB63249.1，AAA62261.1，2020426A，NP_571983.1，NP_571710.1，CAG04681.1，CAG09818.1，CAF99854.1，AAL16961.1，CAF99073.1，CAB37648.2，AAP32155.1，1BFG，1IIL，1FQ9，1BLD，1BFC，1BAS，AAH37601.1，BAD24666.1，NP_957054.1，A60721，CAG11711.1，1K5V，NP_001998.1，1JY0，BAD69615.1，CAG00679.1，AAH32697.1，CAI29610.1，BAC22072.1，AAB29057.2，1JQZ，1605206A，CAI43097.1，CAE72484.1，1IJT，A48834，NP_001001398.1，NP_990764.1，AAH74391.1，1P63，CAF94666.1，1JTC，AAA52534.1，A32398，P09038，AAQ73204.1，AAV74297.1，NP_001997.4，AAV70487.1，AAA52532.1，1JT4，1JT3，1BFF，2BFH，NP_062178.1，1E0O，XP_526572.1，NP_032032.1，1HKN，1DZD，1DZC，1EVT，2AXM，XP_544946.1，AAL82819.1，Q7SIF8，1JT5，P48803，CAA42869.1，1PZZ，1M16，S00185，P48798，NP_776481.1，NP_001009769.1，AAV67380.1，XP_533298.1，A40117，1Q03，GKBOB，AAC35912.1，CAA78854.1，JC4268，S31622，BAB40835.1，AAA72209.1，BAA89483.1，AAA57275.1，1JT7，CAA46341.1，AAH74324.1，1Q04，BAC38631.1，1NZK，CAG02426.1，1K5U，1DJS，NP_776480.1，NP_034332.1，BAC22070.1，CAG06239.1，1AFC，BAC22066.1，1201195A，CAA43863.1，Q7M303，NP_999973.1，XP_522091.1，NP_990511.1，CAG02165.1，AAK52308.1，BAC22067.1，Q604873，XP_426414.1，XP_540801.1，1BAR，AAV38378.1，NP_032031.1，NP_062072.1，P48799，NP_990045.1，AAK37962.1，CAG04671.1，BAA13958.1，XP_544322.1，NP_446261.1，AAQ89228.1，NP_003858.1，XP_522325.1，XP_528080.1，NP_062071.1，BAC38656.1，AAF75524.1，AAO38854.1，BAD74124.1，XP_396434.1，BAD72875.1，AAP22372.1，CAF90784.1，AAC60303.1，AAF73225.1，CAF90913.1，AAP92385.1，BAB68397.1，NP_034335.1，AAF73226.1，AAH86718.1，CAA71365.1，AAO15593.1，AAG45674.1，AAB82614.1，AAA93298.1，AAM22684.1，Q90722，CAF91385.1，NP_149354.1，NP_579820.1，AAB34255.1，AAM55238.1，AAH48734.1，AAH69106.1，AAN73036.1，BAC02894.1，AAH82344.1，CAB64349.1，AAK52310.1，AAK52309.1，AAA48616.1，AAL16958.1，XP_543982.1，AAO25618.1，CAE11791.1，CAF95430.1，AAD13853.1，EAL29203.1，NP_990005.1，XP_543258.1，XP_547883.1，XP_527117.1，NP_878276.1，BAC03477.1，CAC86028.1，NP_001012379.1，NP_732452.1，NP_732453.1，AAO41473.1，AAC47427.1，NP_001012246.1，XP_522624.1，AAQ89954.1，AAH66859.1，NP_032029.1，YP_164239.1，XP_549294.1，1PWA，BAD06584.1，AAF70374.1，NP_570109.1，AAQ88669.1，AAP36636.1，YP_195014.1，CAG06656.1，NP_570108.1，BAA85130.1，AAQ89444.1，XP_524333.1，NP_064397.1，AAH18404.1，NP_061986.1，BAA85129.1，NP_001009564.2，BAD69717.1，BAC22071.1，AAN28104.1，AAQ88689.1，AAF65566.1，AAB71608.1，XP_540802.1，CAI25614.1，AAC59026.1，AAD15898.1，AAA85394.1，CAG06655.1，CAA41788.1，AAA66662.1，XP_541510.1，CAG01371.1，BAD02829.1，BAC22068.1，XP_425663.1，BAC55965.1，NP_073148.1，XP_421720.1，BAD607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[058]术语“畸胎瘤”指来源于3个胚胎生殖细胞层的细胞肿瘤，即外胚层，中胚层和内胚层。此处所用的术语“胚胎生殖细胞层”指胚胎内的细胞层逐渐具有了具体的功能，最终发育形成特定的形式(即外胚层，中胚层和内胚层)。术语“内胚层”指内胚层生殖层的细胞发育成为肠道。术语“中胚层”指中胚层生殖层的细胞发育为血管。术语“内胚层”指内胚层生殖层的细胞发育为中枢和外周神经，皮肤表皮。

[059]术语“干细胞”，“无特定功能细胞”，“未定型细胞”和“未分化细胞”指细胞具有独特的能力进行自我更新，并产生特定类型的细胞，构成身体的组织和器官。胚胎干细胞没有组织特异性结构和组织特异性功能(即心肌细胞，神经细胞，等)。干细胞可以来源于胚胎(即胚胎干细胞)，胎儿和成人的组织。术语“特定的”，“定型的”和“分化的”指具有组织特异性结构和/或功能的细胞(即心肌细胞，神经细胞等)。术语“分化”用于说明细胞时指无特定功能的细胞到获得特定功能的过程(即心，肝或肌肉细胞)。

[060]术语“祖细胞”指在胎儿和/或成人组织中的细胞，且部分具体功能化，能分裂，产生分化细胞。

[061]术语“胚胎干细胞”，和“多能细胞”指来源于胚胎内细胞团未分化的细胞，具有成为特定功能细胞类型的潜能。术语“胚胎生殖细胞”指来源于胚胎组织的细胞，例如来源于5-10周胎儿的生殖嵴的原生殖细胞。

[062]术语“哺乳动物胚胎干细胞”指来源于哺乳动物的胚胎干细胞。并不是限制具有干细胞的哺乳动物，因此，这包括人类(hES)、猴子、大猩猩、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠和大鼠等。

[063]术语“成人干细胞”，“多能干细胞”和“身体干细胞，，指未分化的细胞，可以在分化的组织中增殖和分化产生特定功能类型的细胞。

[064]术语“来源于干细胞的克隆形成能力”指由一个干细胞的分裂产生干细胞，其遗传特性等同。

[065]术语“全能的”，“多能性的”和“多能的”指处于不同发展阶段的细胞。术语“全能的干细胞”指受精卵分裂之后形成的，可以形成胚泡，并发展为一个完整的个体(即小鼠Oct-4+细胞)。术语“多能性的细胞”指具有潜能发育为任何类型的细胞。术语“多能的干细胞”指在成熟组织中存在的细胞，具有分化成为至少两种或多种分化的后代细胞，可以由身体形成，代替组织和器官中老化的细胞(即，血细胞等)。

[066]术语“多能性”指干细胞从一种成人组织的细胞产生其他组织分化的特定类型细胞的能力。

[067]术语“饲养层”指为了达到所希望的结果而使用的共同培养的细胞，例如为了维持多能性干细胞。

[068]术语“条件培养基”指与活细胞接触的培养基，包含许多细胞来源的分子(即生长物质等)，当与随后的细胞接触时促进其生长或分化。术语“非条件培养基”指细胞培养基没有接触细胞。没有具体说明时，一般认为培养基是非条件培养基。

[069]术语“成纤维细胞层”指包含成纤维细胞的饲养层。术语“成纤维细胞”指星状的(星星形状的)或梭状的细胞，具有连接组织的胞质突，能够形成纤维，例如胶原纤维。术语“小鼠成纤维饲养细胞”和“mEF”指包含小鼠成纤维细胞的饲养层，然而，“来源于小鼠成纤维饲养细胞条件培养基”指暴露于小鼠成纤维细胞的培养基。

[070]术语“层粘连蛋白”和“LAM”指细胞外基质蛋白，包含许多功能结构域，可以聚集成片作为一个细胞吸附基质发挥作用，并且作为一个配体起生长因子的作用(即，包括分化等)。

[071]术语“POU”是个缩写形式，来源于3个哺乳动物转录因子的名字，即脑下垂体特异的Pit-1，八聚物结合蛋白Oct-1和Oct-2，来源于秀丽隐杆线虫的神经中枢的Unc-86。术语“POU转录因子”指POU基因家族的成员，是一个DNA结合蛋白，能够活化基因的转录，具有包含八聚体序列的顺式作用元件，称为八聚体模序，其中包含启动子或增强子区域。

[072]术语“Oct-4POU转录因子”、“八聚体结合转录因子3”、“OCT3”、“八聚体结合转录因子4”、“OCT4”、“POU5F1”、“OTF3”、“V级POU因子Oct-3”，和“POU结构域，5级，转录因子1”指未分化干细胞的一个POU转录因子。

[073]术语“nanog”指存在于未分化干细胞中的同源框转录因子。

[074]术语“肿瘤排斥抗原”，“TRA”和“人类胚胎瘤标记抗原”指角蛋白硫酸盐相关的抗原。包括使用单克隆抗体TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-1-85、TRA-2-54和TRA-2-49检测的蛋白。

[075]术语“阶段特异性胚胎抗原”、“SSEA-1”、“SSEA-2”、“SSEA-3”和“SSEA-4”

指碳水化合物抗原，其细胞表面通过分化而改变。例如在鼠类ES细胞，未分化的鼠类多能细胞表达SSEA-1，然而分化后，SSEA-1表达消失，在一些例子中，可能伴有SSEA-3和SSEA-4的出现。例如，在人类，未分化的人类EC，ES，和EG细胞表达抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，然而分化中的人类EC和ES细胞SSEA-1表达增加，SSEA-3和SSEA-4则下调。

[076]术语“激活素A”、“ACTA”、“ACTa”和“ACT”指“抑制素β-A链”或“激活素β-A链”的同型二聚体。术语“激活素B”指“抑制素β-B链”的同型二聚体或“激活素β-B链”的同型二聚体。术语“激活素AB”指“抑制素β-A链和β-B链”的二聚体。所有这些蛋白是激活素蛋白组的成员，这些是TGFβ蛋白家族的成员。术语“抑制素”和其复数形式指TGFβ家族的成员，抑制不同的生物学功能，例如下丘脑和垂体激素分泌，性激素分泌，干细胞发育和成熟，红细胞系统分化，胰岛素分泌，神经细胞存活，胚胎轴发育，骨生长等，可能与激活素的功能相反，其中它们的功能与其亚单元成分相关。术语抑制素包括抑制素A和抑制素B。

[077]术语“角质化细胞生长因子”、“KGF”、“成纤维细胞生长因子-7”、“FGF-7”、“HBGF-7”，和“肝磷脂结合生长因子-7”，指对角质化细胞有活化作用的成纤维细胞生长因子家族的一个生长因子。术语“角质化细胞”指产生角质素的一种细胞。术语“角质素”指存在于特定表皮细胞的大分子，例如皮肤，毛发，指甲，和动物角的上层。

[078]术语“白血病抑制因子”、“LIF”、“白血病抑制因子前体”、“分化刺激因子”、“D因子”、“源于黑色素瘤的LPL抑制因子”、“HILDA”，“人DA细胞介素”和“骨髓生长因子人DA细胞介素”指抑制干细胞分化的细胞信使蛋白，在正常的和髓细胞性白血病细胞中，包括白血病细胞的末端和造血分化。

[079]术语“胚胎”指从受精开始到显著的分化发生过程中发育的有机体，例如人类妊娠后8周，这时已经是胎儿了。

[080]术语“STAT”和“信号转导蛋白和转录激活剂”指蛋白家族中调控基因(即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6，等)的分子。术语“STAT3”指涉及细胞周期蛋白D1、c-Myc、bcl-x1，等，也涉及促细胞周期前进，细胞转化和防止凋亡。

[081]这里使用的术语“蛋白激酶”指催化从核苷三磷酸磷酸基，变为蛋白的氨基酸。激酶是已知的最多的酶超家族，并且其目标蛋白变化很大。激酶分为几类，磷酸化酪氨酸残基(即Janus家族酪氨酸激酶(JAK))的蛋白酪氨酸激酶(PTKs)，磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸残基的蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)，等。

[082]这里使用的术语“蛋白磷酸酶”指一种蛋白去除另一种蛋白的磷酸基。蛋白磷酸酶一般分为两类，受体型和非受体型(即细胞内的)蛋白。一个附加的基团包括双专一性磷酸酶。蛋白磷酸酶包括，但不限制于，人蛋白磷酸酶(PROPHO)、FIN13、cdc25酪氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)20、PTP 1D、PTP-D1，PTP.lambda、PTP-S31(参见美国专利5,853,997；5,976,853；5,294,538；6,004,791；5,589,375；5,955,592；5,958,719；5,952,212，可以作为参考)。蛋白质磷酸酶靶点的例子是STATs。

[083]这里使用的术语“受试者”是任何活体，干细胞或干细胞产生的物质可以引入其中，包括，但不限制于动物。这里使用的术语“动物”包括人类，除非其他说明指“非人类动物”。

[084]实施例描述：

[085]本发明涉及干细胞未分化状态和/或多能性的维持。在具体实施例中，涉及未分化干细胞的维持，例如人胚胎干细胞系，使用加入了一种TGFβ家族成员如激活素A的培养基，一种FGF家族成员如角质化细胞生长因子，烟酰胺(NIC)，或两个或所有这些的联合，并不使用成纤维细胞饲养层或白血病抑制因子。

[086]第一方面，本发明提供了一种维持未分化干细胞的维持方法，该方法包含暴露胚胎干细胞于一种或多种足够数量的TGFβ家族蛋白，维持细胞处于未分化状态，在足够长时间内，达到希望的结果。在一些实施例中，TGFβ家族成员是激活素，如激活素A。在一些实施例中，FGF家族成员是FGF。实施例中的方法也是未分化干细胞培养的方法，该方法包含使用另外的(即，新的)TGFβ家族成员蛋白，FGF家族成员，和/或NIC的重复暴露步骤，与初次暴露时使用相同的或不同的数量。该方法优先选择体外方法。

[087]如上所述，干细胞可能是单一细胞或细胞群。另外，细胞可以是任何物种的细胞，包括人、小鼠、大鼠、猴子、狗、猫、马、羊和猪等。同样，干细胞可以是天然的也可以是重组的。在一些实施例中，可以用新鲜活组织检查来提供干细胞。另外一些实施例中，使用了培养的干细胞。后者的目的不是限制本发明于特定的培养物质和特定的方法。在一个实施例中，方法中所使用的干细胞是培养于无血清培养基中的。在一个实施例中，方法中所用的干细胞是培养于添加有其他成分的DSR培养基中的(如实施例1所述)。

[088]在一些实施例中，发明提供了一种方法，其中目标细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施例中，发明提供了一种方法，其中目标细胞是人类细胞。本发明提供的复合物和方法可用于多种类型干细胞的培养，包括但不限制于由胚胎或胎儿干细胞组成的干细胞群。其目的也不是限制本发明干细胞的来源。因此，在实施例中，干细胞来源于胎儿组织，在其他实施例中，干细胞来源于血液。

[089]如上所述，本方法不限制干细胞的种属来源。许多不同的种属可以作为干细胞的来源，包括但不限制于人类、大猩猩、猴子、牛、马、羊、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠、金鱼、非洲蟾蜍和斑纹鱼，等。另外，本发明不限制暴露于此处所述的不同物质时细胞的分化状态。因此，在实施例中，发明提供了一种方法，其中感兴趣的细胞是未分化的。在其他实施例中，发明提供了一种方法，其中接触的细胞是未分化的。在另一个实施例中，发明提供了一种方法，其中接触的细胞在体内是多能的。在另一个实施例中，发明提供了一种方法，其中接触的细胞与感兴趣的细胞具有相同的核型。

[090]根据本发明的方法，暴露可以是任何允许TGFβ家族蛋白，例如激活素A，接触干细胞的行为。因此，暴露可以是简单的加入TGFβ家族蛋白如激活素A于存在干细胞的培养基中。也可以是加入TGFβ家族蛋白如激活素A的前体，与一种细胞，蛋白或化学物质一起加入，可以使蛋白前体转换为功能蛋白，例如激活素A。暴露可以是手工加入(即，人工加入激活素A于干细胞培养物中)或自动加入(即，通过机器加入)。

[091]暴露于细胞所用的TGFβ家族蛋白的数量随着细胞类型、希望的结果、细胞的数目、细胞生长培养基的体积和所希望的速度的不同而不同。尽管所加入物质的数量要根据这些或其他参数来确定，本发明计划使用大约5ng/ml至500ng/mlTGFβ家族成员蛋白(终浓度取中间值)。因此，实施例中，该方法包含加入至少一种足够数量的TGFβ家族成员蛋白，达到终浓度为5ng/ml，6ng/ml，7ng/ml，9ng/ml，10ng/ml，12ng/ml，14ng/ml，17ng/ml，20ng/ml，24ng/ml，26ng/ml，30ng/ml，35ng/ml，40ng/ml，45ng/ml，50ng/ml，55ng/ml，60ng/ml，70ng/ml，85ng/ml，100ng/ml，120ng/ml，140ng/ml，170ng/ml，200ng/ml，240ng/ml，290ng/ml，350ng/ml，400ng/ml，450ng/ml，或500ng/ml，或5-500ng/ml之间任何具体数量。在实施例中，TGFβ家族成员蛋白是激活素A。

[092]也可以选择TGFβ家族成员蛋白以大约0.01nM至100nM的浓度存在于培养基中。因此，在不同的实施例中，培养基包含确切的或大约0.01nM，0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，2nM，3nM，4nM，5Nm，8nM，10nM，16nM，25nM，32nM，45nM，64nM，75nM，85nm，或100nM(或任何其他具体的浓度0.01nM至100nM之间的浓度)TGFβ家族成员蛋白，例如激活素A。

[093]细胞维持未分化状态的时间长短决定于最终希望的结果，可以从1小时或更少至几天，几周，几年，例如，时间可以是约10周或更多，约15周或更多，约20周或更多，约25周或更多，约30周或更多。操作者控制干细胞维持和生长的方法是调节TGFβ家族成员蛋白暴露于细胞的数量，暴露的时间，以及暴露重复的次数。至少部分要考虑到第一次暴露后的下一次暴露操作时要额外加入TGFβ家族成员。根据本发明，用TGFβ家族成员进行的随后暴露，仅包含以前暴露于细胞的同一种TGFβ家族成员，仅是第一次暴露以后的一次延伸。细胞生长传代的次数可以方便的表示暴露的时间。通常，该方法可以使细胞维持或生长至少1代至30多代。因此，在具体实施例中，该方法可以使细胞维持或生长1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、16代、17代、18代、19代、20代、21代、22代、23代、24代、25代、26代、27代、28代、29代、30代，或更多。另外，根据本发明，暴露干细胞于TGFβ家族成员，例如激活素A，可以使细胞维持一代的一部分，例如1/10代、1/5代、1/3代、1/2代、2/3代和4/5代。实际上，该方法可以使操作者维持和/或培养干细胞几天、几周、几月，或几年。

[094]为了将来使用，考虑到细胞的分裂，并节约细胞培养，发明依据本发明的方法处理细胞进行保存。可以使用任何已知的技术进行保存，包括长期保存细胞的冰冻法。

[095]细胞经过维持和/或生长能获得任何医学或科学相关的希望的结果，例如，但不限制于，特定物质的生产，培养皿上培养的融合，为了转移至新的培养基(即，为了传代)足够数量细胞的生产，为了植入受试体足够数量细胞的生产。已经提出干细胞有许多不同的用途，并且一些已经被应用，包括但不限制于，癌症治疗后的血细胞再生，CNS变性疾病的治疗，如阿耳茨海默病和帕金森病，和糖尿病的治疗，依照现在的方法。

[096]TGFβ蛋白可以是天然条件下获得的，或者是重组体。另外，这里使用的关于发明方法的术语激活素A，包括如上下文所描述的激活素A的片断和衍生物。术语激活素A包含的一种特定的人激活素A的序列如SEQ ID NO：1。激活素A其他非限制性的例子如SEQ ID NO：2-16所示，然而，编码激活素A的核酸非限制性的例子如SEQ ID NO：33-34所示。

[097]本发明的方法包含暴露干细胞于FGF蛋白家族的成员，例如KGF，以足够的数量在足够长的时间内维持和/培养细胞达到希望的结果。发现加入FGF家族成员，例如KGF，培养干细胞以改善细胞的生长。尤其是FGF家族成员的加入阻止干细胞在培养时观察到的典型现象减慢和停止。确实，加入FGF家族成员于干细胞培养物后发现，例如KGF，可以维持其生长多代，包括但不必需限制于10代或更多。在同时包含TGFβ家族蛋白如激活素A时，这种效果尤其显著。

[098]在实施例中，FGF家族成员蛋白与TGFβ家族成员蛋白一起暴露于细胞，FGF家族成员可以在细胞暴露于TGFβ家族成员蛋白之前，同时或之后加入。

[099]有证据表明，当FGF家族成员蛋白与TGFβ家族成员蛋白暴露于相同细胞时，上述关于细胞的暴露，与包含暴露的细胞于FGF家族成员蛋白应用的方法相同。同样，这些希望的结果与上述公开的方法重叠，可以是通过本行业的技术得到的任何希望的结果。

[100]依据上述讨论，FGF家族蛋白可以以达到希望结果的任何足够数量暴露于细胞。关于TGFβ家族成员蛋白，暴露可以是任何行为。在希望的预期结果中，尤其有趣的例子是干细胞相对长时间的培养，例如10代或更多代。相应的，时间可以是1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代或更多。按照上面的讨论，时间可以是任何上至30代中的任何代数或部分代数，或更多。另外，1代或更多代的任何部分可以是希望的时间数。因此，时间可以从少于1h至1d或更多，至1w或更多，时间可以是大约5周，大约10周，大约15周，大约20周，大约25周，大约30周，或更多，包括范例数字中间的任何具体的周数。

[101]在不同的实施例中，FGF家族蛋白以0.5ng/ml至1mg/ml的浓度，置于包含细胞的培养基中，以这样一种方式暴露于细胞。因此，在具体实施例中，FGF家族成员蛋白，例如KGF，以确切的或大约0.50ng/ml，0.75ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，3ng/ml，5ng/ml，7.5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，30ng/ml，40ng/ml，45ng/ml，50ng/ml，55ng/ml，60ng/ml，75ng/ml，85ng/ml，100ng/ml，125ng/ml，150ng/ml，175ng/ml，200ng/ml，250ng/ml，350ng/ml，或500ng/ml(或0.50ng/ml至1mg/ml中间的任何数量的数量存在)。

[102]与暴露细胞于TGFβ家族成员蛋白一样，暴露细胞于FGF家族成员蛋白也包含重复的暴露步骤。暴露FGF家族成员蛋白于细胞的重复操作时，要考虑到与上述讨论的关于暴露TGFβ成员蛋白于细胞，例如激活素A相同的参数。

[103]FGF家族成员蛋白可以是天然获得的或者是重组体。另外，这里使用的关于本发明方法的具体实施例，术语KGF包括KGF片段和衍生物，也包括KGF种的分子，如上文或下文所定义的。术语KGF包含的一个具体的人KGF的序列如SEQ ID NO：17所示。KGF的其它非限制性的例子如SEQ ID NO：18-24所示，而编码KGF核酸的非限制性的例子如SEQ ID NO：25-31所示。

[104]发明的方法同样包含暴露的干细胞于烟酰胺(NIC)，通过多次传代，以足够的数量，使细胞维持和生长。已经发现在NIC中培养的干细胞能够使细胞维持和生长的时间延长。因此，依照方法的实施例，希望的结果是细胞的通过至少1、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，或更多次传代(包括此范围内的任何整数或小数)。

[105]暴露细胞于NIC可以用有关TGFβ家族蛋白和/或FGF家族蛋白所考虑的方法来完成。同样，除了延长细胞的维持和生长外，NIC可以以本行业的技术人员显然知道的任何原因暴露于细胞中，包括上述与TGFβ家族成员蛋白相关的讨论。细胞和上列特性可以等同应用于包含暴露细胞于NIC的实施例，与有关重复暴露的结果和原因一样。

[106]与TGFβ和FGF家族成员一样，暴露于细胞的NIC数量可以根据希望的结果，细胞的数量和其它参数的不同而不同。通常，NIC在包含细胞的培养基中的数量可以在大约0.5mM至500mM之间变化。因此，在具体实施例中，NIC在培养基中的浓度，精确或大约为0.5mM，1mM，1.5mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，15mM，17mM，20mM，24mM，26mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，60mM，70mM，85mM，100mM，120mM，140mM，170mM，200mM，240mM，290mM，350mM，400mM，450mM或500mM。

[107]如上所述，细胞暴露于NIC使细胞的生长期延长，且多能性状态或核型没有改变。另外，在延长暴露于NIC之后，某些熟知的表面标记仍然存在于细胞表面。

[108]通常，本发明的方法能使干细胞在缺少任何饲养细胞，条件培养基，和/或白血病抑制因子(LIF)的情况下维持和生长。在不同的实施例中，方法可以维持细胞于多能状态。在不同实施例中，该方法是抑制或延长未分化的干细胞分化的方法。在实施例中，该方法是抑制或延长干细胞多能性消失的方法(即，延长干细胞定型于特定的细胞类型)。

[109]由上述公开来看，很显然本发明提供了一种维持和/或增殖哺乳动物胚胎干细胞(ES)的方法，该方法包含：a)提供i)目标干细胞，和ii)一种或多种激活素A，角质化细胞生长因子，和烟酰胺；b)激活素A、角质化细胞生长因子，和/或烟酰胺接触胚胎干细胞，产生接触的胚胎干细胞。在其它情况中，该方法提供了一种维持未分化干细胞的方法，一种通过细胞分裂促进细胞增殖的方法，和一种为了增加未分化细胞的数目，可以维持细胞于未分化状态同时促进细胞增殖的方法。在实施例中，发明方法中的接触是缺少小鼠成纤维细胞饲养层细胞的情况下进行的。而在另一个实施例中，发明方法中接触是在缺少来源于小鼠饲养层细胞的条件培养基的情况下进行的。另外一个实施例中，发明方法中接触是在缺少白血病抑制因子的情况下进行的。另外，在，获得维持的实施例中，和使细胞与激活素A，KGF，和/或NIC在保持接触足够的一段时间使细胞生长的实施例中，至少部分的，接触是在缺少小鼠成纤维细胞饲养细胞，来源于小鼠成纤维细胞的条件培养基，和/或白血病抑制因子的情况下进行的。其目的不是限制本发明中干细胞维持和生长的方式。

[110]在具体实施例中，本发明提供了一种维持和/或增殖哺乳动物胚胎干细胞(ES)的方法，其中包括：a)提供i)目标ES细胞，和ii)与SEQ ID NO：1至少具有90％同源性的第一个多肽的一种或多种和/或)与SEQ ID NO：17至少具有90％同源性的第二个多肽；和b)用第一个和第二个多肽在体外与ES细胞接触产生接触的ES细胞。在实施例中，本发明提供了一种方法，其中第一种多肽的浓度能维持接触的干细胞于未分化的状态。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中，第二种多肽的浓度能维持上述ES细胞的增殖。

[111]注意到依照本发明的方法处理的干细胞典型的显示出未分化细胞的正常核型和标记，典型的，保持着多能性。

[112]发明的第二方面，本发明提供了可以用于维持和/或生长干细胞的复合物，以一种未分化的或多能性状态，或包含干细胞的复合物。通常，复合物包含干细胞和/或一种TGFβ家族成员蛋白，例如激活素A，一种FGF家族蛋白，例如KGF，和/或NIC，以一种足够维持数量或形式，维持干细胞一种未分化状态，在足够长时间内，达到希望的结果。按照上述讨论的方法，希望的结果可以是任何医学或科学相关的结果，包括用于储存的细胞足够数量的制备。因此，依据发明的这一方面来看的复合物是在实施本发明方法中有用的复合物。在实施例中，FGF家族成员不是基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)。在实施例中，复合物是药学复合物，包含一种干细胞、一种TGFβ家族成员、一种FGF家族成员、NIC、或其两种或三种的联合。这些复合物可以用于干细胞的治疗。

[113]包含TGFβ家族成员蛋白的复合物可能包含任何来源，任何形式的成员蛋白。相应的，包含激活素A的复合物可能包含任何来源任何形式的蛋白。如上述讨论的，激活素A的许多蛋白的许多例子的序列，在这里列出其GenBank登录号。包含的其他物质也同样。同样，衍生物，例如序列表中列出的或者本行业已知的序列，但是具有翻译后修饰的衍生物，不会消极的影响激活素A促进干细胞未分化状态的维持和生长，包含于本发明中。例如，与这里所列出的或者本行业所熟知的一种或多种序列，如激活素A序列，具有实际上等同氨基酸序列的变异体包含于其中。因此，包含与这里所公开的一种或多种序列(如，SEQ ID NO：1)具有80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％等同性的一种蛋白的复合物，包含于本复合物。在实施例中，发明提供了一种包含重组激活素A的复合物，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列一致性。相应的其他实施例中，重组激活素A多肽与SEQ ID NOs：1或3-16至少具有90％，95％，96％，97％，98％，99％(或更多)的序列一致性。在具体实施例中，发明提供了一种包含重组人激活素A的复合物。

[114]在某些实施例中，复合物可能包含一种编码TGFβ家族成员的核酸，例如激活素A。在这些实施例中，复合物也包含其他能够使核酸表达为激活素A的物质。在这些实施例中，核酸是这里公开的或本行业技术人员熟知的。核酸也包括，可以在严格的杂交条件下与一种或多种激活素A编码的核酸杂交的核酸，或者与一种或多种激活素A编码的核酸具有高度一致性的核酸，如80％，90％，95％，98％，99％，或更多。

[115]包含FGF家族成员蛋白的复合物可能包含任何来源任何形式的成员蛋白。相应的，包含KGF的复合物可能包含任何来源的及任何形式的成员蛋白。如上所述，KGF蛋白的许多例子如序列表所述。包含的其他情况也同样，例如，但不限制于，成纤维细胞生长因子(FGF)。同样，衍生物，例如序列表中列出的或者本行业已知的序列，但是具有翻译后修饰的衍生物，不会消极的影响FGF家族成员蛋白促进干细胞未分化状态的维持和生长，包含于本发明中。例如，与这里所列出的或者本行业所熟知的一种或多种序列，如KGF序列，具有实际上一致的氨基酸序列的变异体包含于其中。因此，包含于这里所公开的一种或多种序列(如，SEQ ID NO：17)具有80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％一致性的一种蛋白，包含于本复合物。

[116]在某些实施例中，复合物包含一种编码FGF家族成员蛋白的核酸，例如KGF。在这些实施例中，复合物也包含能够使核酸表达蛋白的其他物质。在这些实施例中，核酸是这里公开的或本行业技术人员熟知的。核酸也包括，可以在严格的杂交条件下与一种或多种FGF家族编码的核酸杂交的核酸，或者与一种或多种FGF家族编码的核酸具有高度一致性的核酸，如80％，90％，95％，98％，99％，或更多。正如本行业技术人员所理解的，这将会有利于产生编码有兴趣蛋白的核酸序列，其中的核酸序列具有非自然状态下的密码子。因此，在一些实施例中，通过特定的原核和真核宿主密码子优化选择(Murray等，核酸研究，1989，17)，例如，增加表达率，或者产生具有希望特性的重组RNA转录子，如与自然存在的序列相比具有较长的半衰期。本发明不限制有兴趣核酸和/或蛋白的来源(即，细胞类型、组织、动物，等)，特性(即，合成的，重组的，细胞提取物纯化的，等)。

[117]在实施例中，发明提供了包含一个TGFβ家族成员和一个FGF家族成员的复合物。在一个实施例中，发明提供了一个包含激活素A(ACTa)和角质化细胞生长因子(KGF)的复合物，其中复合物中ACTa的浓度维持胚胎干细胞于未分化状态，复合物中KGF的浓度维持胚胎干细胞的增殖。在一个实施例中，本发明涉及复合物中的激活素A对未分化状态的维持，角质化细胞生长因子，NIC，或二者联合使细胞增殖的增加。

[118]在实施例中，激活素A，KGF，或二者的联合是重组体。

[119]在一个实施例中，发明提供了一种复合物，其中第一个多肽与SEQ ID NO：1具有至少90％的一致性，第二个多肽与SEQID NO：17具有至少90％的一致性，其中，复合物中第一个多肽的浓度足够维持胚胎干细胞于未分化状态，复合物中第二个多肽的浓度足够维持胚胎干细胞的增殖。相应的，在其他实施例中，第一个多肽与SEQ ID NOs：1 and 3-16至少具有90％，95％，96％，97％，98％，99％(或更多)的一致性。同样，在其他实施例中，第二个多肽与SEQ ID NOs：17-24至少具有90％，95％，96％，97％，98％，99％(或更多)的一致性。

[120]在一个实施例中，存在激活素A和/或KGF的变异体，每个变异体的序列相对独立，与这里公开的序列具有至少95％的同源性，至少90％的同源性，至少85％的同源性，至少80％的同源性，至少75％的同源性，至少70％的同源性，和/或至少65％的同源性。

[121]在另一个实施例中，发明提供了一种复合物，包含一个KGF重组体，其中重组角质化生长因子包含一个与SEQ ID NO：17具有至少90％同源性的多肽。在另一个实施例中，发明提供了一个复合物，其中角质化生长因子是SEQ ID NOs：11-14中的一种或多种。相应的在其他实施例中，第二个多肽与SEQ ID NOs：17-24中的任何一种至少具有90％，95％，96％，97％，98％，99％(或更多)的同源性。

[122]根据本发明的复合物包含烟酰胺。复合物中足够的数量NIC可以在希望的时间内使干细胞至少一种培养维持活力和/或生长。

[123]TGFβ和FGF家族成员和NIC可以独立的以任何天然形式提供，包括液体或固体(干粉)形式。当以液体形式提供时，为了有助于保存可以加入其它稳定剂。干粉形式可能包含其它物质，这些物质是在干燥过程中加入的，有助于干燥过程或再水化时的稳定性。

[124]本发明的复合物除了TGFβ和FGF家族成员及NIC以外，通常包含一种成分。其他成分可能是已知与干细胞生长相适合或者相容的任何物质，或者与干细胞或其产生物质引入动物或人类受试体相适合或相容的任何物质。例如，可能包括水或任何含盐(即，NaCl)，去污剂(即，SDS)水溶液和其他成分(即，Denhardt′s溶液、奶粉、鲑精DNA，等)。备选的，复合物可以包含血或血制品，例如血清或血成分。因此，复合物可以是生长(即，培养)基质，包括生长基质，本行业中通常已知的如“KO”血清培养基或包含“KO”血清的培养基。培养基可以包含一个TGFβ家族成员，一个FGF家族成员，NIC，或其两个或三个的联合。然而复合物中每种成分不需要都是生物学相容的，优选那些具有生物学相容的，或者其浓度足够低，使其消极效应降至可以接受的水平，基于典型的用于评价生物相容性标准的任何数字。更好的，包含TGFβ和FGF家族成员及NIC的复合物是无菌的(当然有意包括于复合物的有关干细胞或其他细胞除外)。由本发明的复合物在生长和维持干细胞中的使用来看，显然，发明的复合物自身可能包含干细胞，包括胚胎干细胞，例如hESC。

[125]如上述刚提到的，在某些实施例中，复合物包含干细胞。干细胞可能生长于存在一种或多种TGFβ家族成员，一种或多种FGF家族成员，NIC，或两种或所有三种的联合的环境中。干细胞可以是未分化状态，但不必需限制于此。另外，虽然总是希望所有的细胞处于未分化状态，经验证，由于细胞生长和存活的异质性，有可能复合物中少于100％的细胞具有希望的特点。这一事实不是理解为排除那些具有处于未分化或全能状态的细胞重要数字(即，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％，或更多)的复合物。

[126]第三方面，本发明提供了试剂盒，包含需要生长和/或维持胚胎干细胞处于未分化或多能状态的一些或所有材料。试剂盒最基本的形式至少包含一个容器，容器一个TGFβ家族成员如激活素A，一个FGF家族成员如KGF，NIC，或两者或所有三者的联合，具有足够的数量，生长和维持干细胞在足够的时间内培养，达到希望的结果。希望的结果可能是任何医学或科学相关的结果，如一种特定物质可检测数量的生产，培养皿中培养的融合，接种于受试体时足够数量细胞的生产，等。在实施例中，试剂盒包括实施本发明方法实施例所需要的所有的材料。附属成分在有关试剂盒的某些实施例中也有说明，是按照本发明使用该试剂盒材料的指南。

[127]因此，在某些实施例中，试剂盒只包含一个容器，其中含有一种TGFβ家族成员蛋白(如激活素A)，一种FDF家族成员(如KGF)，NIC，或两者或所有三者的联合。在其他实施例中，试剂盒包含两个或多个容器，每个容器包含TGFβ家族成员的一种或多种如激活素A，一种FGF家族成员如KGF，和NIC。在后一个例子中，成套联合分别提供容器(即，在一个包装中，可以但不是必需试剂盒自身)。这是一个包含如激活素A，KGF，NIC，或两者或所有三者联合的复合物，包含于第一个容器，另一个复合物独立的含有这些成分(任何数量)的一种或多种包含于第二个不同的容器，二者包装于一个包装中。按照本发明，包含不同复合物(也有本发明中其他有用的复合物)的多种容器可以包装于一个试剂盒中，操作者可以使用材料的不同体积，如实施本发明的方法。这样，操作者可以多次实施本发明或者使用于大量的细胞，而不需要获得多个试剂盒。

[128]分别独立的选择TGFβ和FGF家族成员蛋白和/或NIC的数量，使之能够满足干细胞的至少一种培养在足够长的时间内维持或生长。每一种物质可以包含于其自身的容器，或两种或多种可以包含于一个容器。这样，操作者可以选择适当的物质或物质的组合，满足具体的应用要求。

[129]在某些实施例中，至少TGFβ家族成员蛋白中的两种如激活素A，FGF家族成员蛋白如KGF和NIC一起被提供成套包装。这样，试剂盒中至少两种，优先三种包含于一个容器中。试剂盒中一起提供的两种或三种蛋白，操作者不需要在打开试剂盒后再混合，减少了实施发明方法的时间，或者减少了测量复合物或材料损失时因为溢出等造成的差错。其他实施例中，按照实施例，试剂盒包括多个容器，每个容器含有同样的材料，不同的材料或联合，其中一些容器含有与其他含有同样的材料，然而一些容器含有唯一的成分。

[130]在实施例中，一个或多个独立的成分(即，激活素A，KGF，和NIC)的多个(两个，三个，四个，五个，六个)容器包含于试剂盒中。在实施例中，两个或多个成分一起的多个(即两个，三个，四个，五个，六个)容器包含于试剂盒中。在实施例中，试剂盒中也包括手套和/或其他辅助材料或试剂(包括，但不限制于此，溶解试剂盒中一种或多种成分的无菌水或无菌水溶液)。

[131]从上述讨论中可以看出，期望的结果，除了TGFβ家族成员蛋白，FGF家族成员蛋白，和/或NIC之外的其他希望的成分可以包含于试剂盒中。例如，包含这些物质的溶剂或稀释剂可以，例如，注射器，移液管，等。其他每种成分可以一个或多个进行包装，独立包装或不包装。

[132]任何适于包装TGFβ家族蛋白，FGF家族蛋白和/或NIC，和/或可选择的其他成分的容器均可使用。因此，可以是金属、塑料、橡胶、莎纶和玻璃制造的试管，小玻璃管，管形瓶，罐，盒子或坛子。在实施例中，容器可以是递送设施，如注射器或移液管，适于供应成分于包含干细胞的培养基中。容器优选可以重新封口或自动封口，在初次打开以后，可以保存未使用的内含物。容器和其内含物优选无菌的(或开口之前经过灭菌的)。

[133]试剂盒本身可以用任何合适的材料制成，如厚纸板、塑料、金属或玻璃。厚纸板和塑料是试剂盒优选的材料。

[134]试剂盒中包括试剂盒一种或多种成分使用方法或者为了实施本发明方法的使用指南。该指南可以以独立的部分提供，如纸、卡片、塑料板等上打印的材料。也可选择提供于试剂盒上，例如，试剂盒的底部，顶部或一侧。也可选择提供于试剂盒中含有某种成分的容器中。

[135]第四方面，本发明提供了未分化的和多能性的干细胞。提供的干细胞可以处于不包含饲养细胞，小鼠胚胎饲养层的条件培养基，和/或STAT3激活的复合物中。在实施例中，提供的干细胞处于包含TGFβ家族成员蛋白如激活素A，FGF家族成员蛋白如KGF，NIC，或两者或多者的联合。在实施例中，复合物包含激活素A，KGF，和NIC。尽管干细胞可以是上述公开的任何细胞，在优选的实施例中，细胞是人类干细胞，如人胚胎干细胞。

[136]通常，干细胞是通过本发明方法所产生的细胞。本发明的干细胞是通过干细胞暴露于TGFβ家族成员蛋白，FGF家族成员蛋白，NIC，或两者或所有三者的联合而获得的。在缺少条件培养基，饲养细胞或LIF的情况下，干细胞暴露于这些物质中的一种或多种。如上所述，干细胞可以是经过多次传代的细胞。

实施例

[137]通过以下的实施例将进一步解释本发明，其目的是清楚的说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。

[138]实例1：干细胞在缺少饲养细胞或条件培养基时多能性的维持。

[139]本发明涉及使用富含TGFβ家族成员，FGF家族成员，和/或NIC维持胚胎干细胞未分化状态和多能性的的复合物和方法，尤其是未分化的人类胚胎干细胞系。该实例是在TGFβ家族成员激活素A存在时，维持干细胞的多能性，再加入FGF家族成员角质化细胞生长因子(KGF)延长了细胞生长或进入老化的时间。实例也显示在培养基中加入NIC可以延长细胞生长或进入老化的时间。

[140]小鼠胚胎干细胞未分化状态和多能性维持需要小鼠成纤维细胞饲养层(mEFs)的存在或白血病抑制因子(LIF)STAT3的激活¹。人类胚胎干细胞系(hES)只是最近才用于研究^2，3，其自身更新和分化的细胞内途径还很不清楚。近来，本发明者及同事⁴和其他人⁵发现，当生长于mEFs或使用来源于mEFs的条件培养基处理时，STAT3激活不能完全阻止人胚胎干细胞的分化。本实例表明富含激活素A的培养基能够维持hESs至少10代处于未分化状态，而且不需要饲养层，来源于mEFs的条件培养基，或STAT3激活。hES细胞保持未分化细胞的标记，包括OCT-4，nanog和TRA-1-60，并且具有多能性，畸胎瘤的体内形成可以说明这一点。

[141]据报道，只有当hES生长于mEFs^2，3，来源于mEFs的条件培养基⁶，或人饲养细胞层时⁷，其多能性才能够维持。另外，报道说从饲养层获得信号不是通过LIF/gp130途径产生的^4，5。因此，可能通过hES细胞接触饲养层和/或存在于条件培养基(CM)中的可溶因子而引发其他可选择的途径必须能够维持其多能性。正如发明者和其同事以前相差显微镜和组织学染色观察表明⁴，HSF6的生长于饲养细胞层和包被的层粘连蛋白的盘子中时，其生长和表型特点相似。因此，饲养层分泌的可溶性因子似乎对多能性的维持是起作用的。为了测定这些因子是什么，根据我们在人类胎儿胰腺组织培养时的经验，我们检测了不同生长因子的联合。根据预试验，发明者使用层粘连蛋白1进行吸附，发现hES细胞中a6b1出现高水平表达⁶。然而，这应理解为其他已知的吸附底物，如纤连蛋白和胶原蛋白，可以以等同效果使用。

[142]此处显示，当hES细胞生长于存在激活素A和KGF的层粘连蛋白上时，在连续生长10代以上后，这些细胞仍然保持未分化状态，与生长于饲养层或CM上相比较，干细胞标记TRA-A-60染色一致。与生长于饲养层的克隆相比，细胞单层的RT-PCR检测也发现Oct-4，nanog和端粒酶基因表达很强。形态逐渐从通常的紧密型状变成一致形状细胞的不规则单层，显然大于原始克隆。如果允许，细胞最终形成连续的单层，在培养皿中隆起。然而，这些形态改变是可逆的；当将细胞放回饲养层时，逐渐变回在饲养层上的形态。

[143]当将激活素A从培养基中去除以后，细胞形态很快变成了一种更加分化型，一周后此细胞不再表达nanog，同时免疫反应的TRA-1-60消失，OCT-4蛋白的水平减少。当BMP-4代替激活素A时，细胞不能再维持其未分化表型，1周后，nanog，oct-4和端粒末端转移酶的表达消失；当去除KGF后，细胞能维持其未分化表型，但增殖速率降低，而且，这些细胞的传代培养不能再超过一代。

[144]激活素A，转化生长因子β家族成员，最初是从猪卵泡液中分离出^8，9，作为FSH合成和分泌的刺激因子。“激活素”、“激活素A”、“激活素B”、“激活素AB”，“红细胞系统分化蛋白”和“EDF”是TGF-β家族成员，这些蛋白可以激活不同的生物学功能，如下丘脑和垂体激素和分泌，性激素分泌，干细胞发育和成熟，红细胞系统分化，胰岛素分泌，神经细胞存活、胚胎轴形成、骨生长，等，其功能也涉及其亚单位复合物。经鉴定，很多组织是不同生物功能的自分泌或旁分泌调控子(参见10)。重要的，发明者发现，在mEFs中激活素A的高表达，在来源于mEF的条件培养基有大量分泌蛋白。而且，当HSF6细胞生长于存在卵泡抑素(激活素A的天然抑制剂)的mEFs上时会分化。10。有趣的是，激活素A是由其他间充质细胞分泌的，FGF2上调其分泌，11，于mEFs上培养hES时，通常使用FGF2。简单讲这些数据放在一起，mEFs分泌的激活素A负责hESs细胞中“干性”的维持。

[145]激活素A特异负责hES细胞分化的抑制。然而，另一个TGFβ家族成员BMP-4可以维持小鼠ES细胞的多能性¹²，这与hES细胞不同。这并非这两株细胞之间唯一的不同，mEFs和hES的维持对LIF的依赖性也不同⁴。在mES细胞中，BMP-4在细胞多能性和分化的维持中，起一种矛盾的作用^12，13。多数情况下，其作用依靠其他存在的因子或者发育的阶段来决定。在BMP-4和KGF存在时，hESs细胞分化很快，培养1周后，oct-4，nanog和端粒酶的表达消失。

[146]激活素A与mES分化为中胚层也有关系¹³，人胰腺前提细胞分化为β细胞，抑制神经细胞的分化^15，16，和最近的内胚层导入hES细胞¹⁷。然而，本发明公开的是激活素A在维持其未分化状态和其在来源于mEFs条件培养基中的重要作用的第一份资料。

[147]hES在激活素A和KGF存在时生长于细胞单层，移植这些细胞于裸鼠后，畸胎瘤生长，显示了许多外胚层，内胚层和中胚层结构。另外，对胚状体的RNA进行RT-PCR，结果显示特异的所有3个胚细胞层的基因表达。这些数据显示，hES细胞在含有激活素A的培养基中多能性的维持，不需要与其他外源物质和人类细胞的共培养。

[148]非跨膜PTKs与质膜受体的细胞溶质结构域形成信号复合体。信号通过非跨膜PTKs的受体包括细胞因子(即，糖蛋白130(gp130)家族)，激素，和抗原特异性淋巴细胞受体。许多癌细胞中的PTKs是首次被鉴定为原癌基因产物，其中，PTK激活不再受正常细胞的控制。事实上，大约三分之一已知的原癌基因编码PTKs。另外，细胞转化(肿瘤生成)经常伴随酪氨酸磷酸化激活的增加²²。因此，PTK激活的调控可能是控制一些癌症类型的重要策略。

[149]材料和方法：下面是本实施例所使用材料和方法的详细描述。

[150]干细胞培养：hES细胞系中HSF6在丝裂霉素C处理的CF1小鼠饲养层(mEFs)上，37℃，5％CO2，DSR培养基中培养，如前所述培养基包括DMEM高糖培养基，其含有去除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，，0.1mMβ-巯基乙醇¹⁹(均来自Gibco，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，www.invitrogen.com)，或于包被层粘连蛋白(20g/ml，Chemicon，www.chemicon.com)的板子上，或于包含50ng/ml的人重组激活素A(ACTA)，50ng/ml的人重组角质化细胞生长因子(KGF)，二者均来自PreprotechInc.(岩石山，新泽西州；www.preprotech.com)。这些浓度是通过前面的实验使用人胎儿胰腺细胞培养来测定的^14，20。。在一些实验中，按照操作指南，使用10ng/ml人重组骨形成蛋白4(BMP-4，R&D系统，明尼阿波利断，明尼阿波利斯；www.RnDSystems.com)来代替ACTA，和0.4g/ml卵泡抑素(R&D系统)加入生长于mEFs上的ES细胞，充分中和50ng/ml的ACTA。生长于mEFs上细胞的培养基每天更换，与生长因子一起生长于层粘连蛋白上细胞的培养基隔天更换。细胞每周以1∶3或1∶4稀释传代。

[151]如前所述⁴，可选择hES细胞系中的HSF6在丝裂霉素C处理过的CF1小鼠饲养层(mEFs)，于37℃，5％CO2 DSR培养基中培养。如这里说描述的试验，传代43hES细胞培养于来源于mEFs的条件培养基(CM)中，其中层粘连蛋白(20μg/ml，Chemicon，www.chemicon.com)包被的培养板，另外加入10ng/ml基本成纤维生长因子(FGF2；Preprotech Inc.岩石山，新泽西州；www.preprotech.com)，或者培养于含有50ng/ml人重组激活素A、50ng/ml人重组KGF(二者均来源于Preprotech)和10mM烟酰胺(NIC；西格玛公司，圣路易斯市，密苏里州)的DSR培养基中层粘连蛋白上。以5，50，和100ng/ml的激活素A与hES细胞进行剂量响应，发现50ng/ml是维持细胞未分化状态的最佳浓度。

[152]在一些实验中，按照操作指南，使用10ng/ml人重组骨形成蛋白4(BMP-4，R&D系统，R&D系统，明尼阿波利斯，明尼阿波利斯；www.RnDSystems.com)来代替ACTA，和2μg/ml重组小鼠FS-288卵泡抑素(R&D系统)加入生长于mEFs上的ES细胞，充分中和50ng/ml的ACTA。生长于mEFs上细胞的培养基每天更换，与生长因子一起生长于层粘连蛋白上细胞的培养基隔天更换。细胞使用1mg/ml胶原蛋白酶IV(Gibco BRL)小心处理5min，刮下来后，每周以1∶3或1∶4稀释传代。

[153]免疫组织化学：干细胞培养于包被mEFs或层粘连蛋白的盖玻片上，经4％的多聚甲醛固定并染色。干细胞标记TRA-1-60和Oct-4蛋白表达使用一抗小鼠抗-TRA-1-60(Chemicon)和兔抗-OCT-4抗血清(翰氏世卡乐博士的一份慷慨礼物，宾西法尼亚大学)进行分析。将载玻片与小鼠IgM和兔IgG一起孵育。亲和力，纯化的罗丹红结合驴抗小鼠IgM和荧光黄结合驴抗兔IgG(杰克逊免疫研究)直接与一抗发生作用。盖玻片包埋于抗消失培养基(Biomeda Corp，福思特市，加利福尼亚州；http：//biomeda.com)，并在配备了荧光附件的Nicon eclipseE800纤维镜(尼康美国，梅尔维尔，纽约；www.nikonusa.com)下观察。SPOT数码相机进行拍照(诊断仪器有限公司，斯特林·海特，密歇根州；www.diaginc.com)，通过Image Pro Plus 4.0(媒体控制，银泉市，马里兰州；www.mediacy.com)获得。使用AdobePhotoshop 7.0(Adobe系统，山景城，加利福尼亚州；www.adobe.com)软件进行颜色合成。

[154]如前所述，也可选择干细胞培养于包被mEFs或层粘连蛋白的盖玻片上，经4％的多聚甲醛固定免疫染色⁴。干细胞标记TRA-1-60、SSEA-4和Oct-4蛋白表达使用一抗小鼠抗-TRA-1-60(Chemicon)、小鼠抗SSEA-4IgG3(DSHB，爱荷华州大学，爱荷华市，爱荷华州)和兔抗-OCT-4抗血清(翰氏世卡乐博士的一份慷慨礼物，宾西法尼亚大学)进行分析。将载玻片与小鼠IgM或IgG和兔IgG一起孵育。

[155]RT-PCR：使用包括DNase处理的RNeasy minikit(Qiagen，巴伦西亚，加利福尼亚州；www.qiagen.com)，使用AMV和3.2μg随机引物进行反转录，20μl反应体系中含有1μg总RNA，每50μlPCR反应体系中使用1μl cDNA。β-肌动蛋白表达用于样品量化和比较(即作为内参)。

[156]人oct-4、nanog和端粒酶特异引物的制备。实例中使用的寡核苷酸引物序列如下：

β-激动蛋白正向：cgcaccactggcattgtcat

反向：ttctccttgatgtcacgcac

oct-4 正向：gagcaaaacccggaggagt

反向：ttctctttcgggcctgcac

Nanog 正向：gcttgccttgctttgaagca

反向：ttcttgactgggaccttgtc

激活素A 正向：cttgaagaagagacccgat

反向：cttctgcacgctccactac

Neuro-D：正向：gagactatcactgctcagga

反向：gataagcccttgcaaagcgt

鼠短尾突变体表型

T基因：正向：caaccaccgctggaagtac

反向：ccgctatgaactgggtctc

α-胎儿-

球蛋白：正向：agaacctgtcacaagctgtg

反向：gacagcaagctgaggaggatc

ALK-4：正向：cacgtgtgagacagatggg

反向：ggcggttgtgatagacacg

ACVR-2：正向：gggagctgctgcaaagttg

反向：ccacatcaacactggtgcc

ACVR-

2B：正向：caccatcgagctcgtgaag

反向：gagcccttgtcatggaagg

hTERT 正向：cagctcccatttcatcagca

反向：cgacatccctgcgttcttg

[157]PCR产物置于1.2％琼脂糖凝胶电泳(htert使用1.6％琼脂糖凝胶)，经溴化乙锭染色。

[158]多能性：在移植hES细胞于裸鼠的肾囊下后，在8周内测量畸胎瘤的形成，在体内评估多能性，如前所述，分析胰腺前体胰岛细胞分化²¹。。简单的，将hES从层粘连蛋白或mEFs中去除，使之在Costar ULC培养皿(康宁有限公司，康宁纽约，www.corning.com)中培养过夜形成胚状体。将其离心至小团，收集于10μl正压移液管中，小心插入肾囊下。这种方法在实验胰岛移植中已经非常成功，而且在来源于hES细胞畸胎瘤形成分析中也非常有效。去除移植物，经苏木精和伊红固定染色。下列所述的胚状体的形成，通过基因表达的检测评估其多能性。

[159]可选择的，在移植hES细胞于裸鼠的肾囊下后，在8周内测量畸胎瘤的形成，在体内评估其多能性，如前所述，分析胰腺前体胰岛细胞分化²⁰。去除移植物，苏木精和伊红固定染色。通过分析来源于hES细胞且培养17天的胚状体的基因表达，在体外检测其多能性。

[160]增殖试验量化不同培养条件下的增殖速率：细胞培养于6孔板层粘连蛋白上，同时存在加入来源于饲养层的FGF-2的CM或激活素A，KGF，NIC，或这3个因子的联合。使用1μCi/ml[甲基³H]胸腺嘧啶脱氧核苷对新装曼的培养基进行脉冲。16h后，收获细胞，胸腺嘧啶核苷与细胞结合，如上所述进行定量²³。荧光测定法测量DNA含量，通过对声处理细胞的三氯乙酸液体闪烁计数，测定³H胸腺嘧啶核苷的结合。使用Statview IV(AbacusConcepts，Berkeley CA)，在95％的水平下，进行方差分析和Fischer′s显著性检验，可以看到有显著性的差异。

[161]流式细胞检测分析：使用流式细胞仪定量不同培养条件下未分化的细胞。收获细胞后，胶原酶处理60min，剪切成单一的细胞悬液，使用70μm细胞滤器过滤。使用小鼠抗TRA-1-60或小鼠IgM(作为对照)和FITC-结合的驴抗-小鼠IgM(杰克森免疫学研究)对每种条件下的单一细胞进行标记。使用BectonDickinson FACScan对细胞进行分析，同时使用CellQuest软件定量细胞表面蛋白的表达。

[162]双向电泳：来源于mEFs的不分次条件培养基单独生长或与hES细胞一起作为饲养层，如上所述在第二个方向，通过等电位聚焦电泳进行分析。24。将样品转移至硝酸纤维素膜上，并且用兔抗猪激活素抗体(Sunichi Shimisaki博士的一份慷慨的礼物，UCSD)形成斑点印迹。

[163]蛋白质印迹法：如上所述，蛋白质印迹法用于硝酸纤维Smad2分析，在HSF6细胞的裂解液上进行。4。在存在激活素A的细胞培养物在清洁剂中溶解，含有加入钒酸盐(10μM)和微囊藻素(1μM)缓冲液，第一次印迹使用磷光体-Smad2(ser465/467)抗体(细胞信号，cellsignal.com)。斑点呈条带状，使用Smad2抗体进行再生(细胞信号)。

[164]核型：在我们实验室或通过UCSD细胞遗传学实验室使用标准的方法(Giemsa显带技术)进行核型分析。每个样品至少检测15个细胞。

[165]附图结果描述：

[166]使用HSF6细胞测定激活素A对细胞生长、形态学和干细胞分化状态的影响。涉及本实例的实验操作如上所述，是从实验中获得结果的讨论和总结。实验的结果在不同部分和附图1的小节中有描述。

[167]图1是hES细胞在缺少激活素A时的分化。更具体的，图1a是每个阶段相差显微镜观察到的HSF6细胞分化状态和形态(上层)，为了进行免疫组织化学分析，使用了针对人干细胞标记TRA-1-60(细胞质的)和Oct-4(核的)的抗体。第I组是培养于mEFs上的HSF6细胞显示出典型的集落形成，对干细胞标记统一进行染色。第II组是培养于层粘连蛋白上的HSF6细胞，在激活素A，NIC，和KGF(ANK)存在时生长成不规则的单层，与其生长于mEFs上时相比，细胞较大，但TRA-1-60和Oct-4染色较强，这是其处于未分化状态的证明。第III组是来源于第II组的细胞，再置于mEFs上时，1周后集落形态重新形成。第IV组是来自第II组的细胞，当于缺少激活素A(NK)生长1周，形态和表型具有显著的改变，没有出现TRA-1-60染色，Oct-4染色很弱，提示已经分化。第V组是来自第II组的细胞于缺少KGF和NIC的培养物中生长1周(A)，表型没有改变。然而，增殖减少，并且不能再次传代。放大率＝100μM

[168]图1b是hES细胞培养于mEFs(第1泳道)或层粘连蛋白(第2-5泳道)上不同培养条件时，oct-4和nanog的半定量RT-PCR(26循环)结果。在缺少激活素A(第3，5泳道)的层粘连蛋白上培养1周，干细胞标记表达丢失。mEF＝小鼠饲养层，ANK＝激活素A+NIC+KGF，NK＝NIC+KGF，BMP＝BMP-4，+/-反转录酶

[169]图1c是使用FACS对细胞表面抗原表达比较的代表实验。不同培养条件下单细胞悬浮液TRA-1-60的免疫染色，并使用Becton Dickinson FacScan和CellQuest软件进行分析。上面部分：流式细胞检测分析含有ANK的培养物，使用小鼠抗-TRA-1-60或小鼠IgM(对照)进行染色。下面部分：(CM＝条件培养基，ANK＝激活素A+NIC+KGF，NK＝NIC+KGF)。使用ANK培养细胞20代，使用NK培养1周，和在条件培养基中＜1周(去除污染的mEFs)。

[170]图1d是存在激活素A(A)，NIC(N)，KGF(K)或所有三者联合(ANK)，和添加了FGF2的CM中进行hES细胞的增殖时进行比较的代表实验。四组空中，每种培养条件3H脱氧胸腺嘧啶脉冲16h。与其他处理相比，在激活素处理过的细胞增殖速率显著降低，存在KGF时，增殖速率与ANK时相同，并且显著高于CM，表明KGF在hES细胞复制中的作用。n＝4；p＜0.0001ANK对A，K对A，CM对Ap＜0.005ANK对N，N对A，K对N.p＜0.05K对CM，ANK对K，ANK对CM，N对CM。

[171]图2是激活素/卵泡抑素对mEF上生长的HSF6细胞多能性的维持中的作用。更加具体的，图2a是来自于图1第I组的HSF6细胞，存在卵泡抑素的mEFs上培养1周(左边部分)和2周(右边部分)。1周后，集落显示出显著的形态改变(上面部分)，并且TRA-1-60染色消失(细胞质的)，Oct-4染色减弱(核的)(下面部分)。存在卵泡抑素2周后，集落继续生长，但确定的形状消失，并且Oct-4免疫反应活性已经完全消失，显示已经分化。放大率＝100μM。

[172]图2b是存在和缺失卵泡抑素时，生长于mEFs上的HSF6细胞上oct-4和nanog标记的半定量RT-PCR(26循环)结果。存在卵泡抑素时在mEFs上培养1周，干细胞标记不再表达(nanog)或显著减少(oct-4)，培养2周后，则完全消失，提示细胞已经分化。RT＝反转录酶。

[173]图2c是使用RT-PCR和免疫印迹实验对来源于CF-1小鼠的mEFs中激活素A转录子和在mEF条件培养基中的前体蛋白的鉴定。左边部分：RT-PCR显示激活素A的表达，PCR产物大小是262bp；+/-：反转录酶。右边部分：免疫印迹实验显示激活素A前体蛋白。样品经双向电泳分析，免疫印迹使用抗-激活素抗体。

[174]图2d是HSF6细胞中，激活素途径信号成分的鉴定。左边部分：HSF6细胞中，类型1受体ALK-4，类型II受体ACVR-2和ACVR-2B转录子。PCR产物大小分别为346bp，783bp和611bp；+/-：反转录酶。右边部分：使用抗Smad2抗体进行免疫印迹实验，显示了HSF6细胞生长于存在激活素A时磷酸化的Smad2。Smad-2MW＝60kDa。细胞在清洁剂中添加了钒酸盐(10μM)和微囊藻素(1μM)的缓冲液中裂解。印迹使用抗-磷酸-Smad2(ser/465/467)(第I组)进行检查，条带状出现，抗-Smad2再生(第II组)。

[175]图3是存在激活素A、NIC和KGF时，hES细胞多能性的长期维持。更具体的，图3a是存在激活素A、NIC和KGF，HSF6细胞传代20次时，干细胞标记的分析。上面部分：免疫组化分析显示TRA-1-60，SSEA-4(红)和Oct-4(绿)。放大率＝200μM。下面部分：oct-4，nanog(26循环)和hTERT(35个循环)；产物＝114bp)的RT-PCR分析。为了比较培养于mEFs上细胞，在同一实验中，对一个可比较的传代数目进行了分析，指出了所有标记的可比较的水平。

[176]图3b是在裸鼠中畸胎瘤的形成。存在激活素A，KGF和NIC时培养的HSF6细胞移植于裸鼠肾囊下后，呈现典型的组织学特点。8周后，去除肾，可以观察到畸胎瘤的3个细胞层。C＝软骨细胞(中胚层)，PNC＝围神经(施沃恩)细胞(外胚层)，RE＝呼吸上皮(内胚层)。放大率＝100μM。

[177]图3c是hES细胞在存在激活素A，KGF和NIC的培养基中培养时，来源于hES细胞胚状体谱系特异标记的RT-PCR分析。神经D＝外胚层，T基因＝中胚层；α-FP＝内胚层，+/-：反转录酶。

[178]实施例总结

[179]本研究中，hES细胞生长于层粘连蛋白上，当激活素A，烟酰胺(NIC)，和角质化生长因子(KGF)存在时，连续生长传代20次后仍然保持未分化状态。

[180]在起始的实验中，我们致力于开发培养hES细胞的培养基，使之能直接分化为胰腺内分泌谱系。为了细胞吸附，基于α6β1在hES细胞中的高表达，我们使用了层粘连蛋白1⁶。。前面所述的不同生长因子和化学物质结合共同调节人胎儿胰脏细胞的生长和分化，对其结合进行了检测。意外的是，在这种条件下培养细胞几周后，细胞形态没有改变。随后，每种因子连续除去，通过对人类已知干细胞标记的检测来评估其多能性：TRA-1-60，nanog，和Oct-4(数据未显示)。维持hES细胞在未分化的状态下复制的生长因子和化学物质的联合限制在激活素A，NIC，和KGF，并且单独使用每种生长因子或不同的联合进行了重复实验。与生长于饲养层(图3a，第I组)或生长于来自mEFs的条件培养基(未显示)相比，包含所有3种因子(A，N，K)的培养物干细胞标记TRA-1-60和Oct-4(图3a，第II组)染色结果一致。与生长于饲养层的集落的获得物相比，RT-PCR观察到细胞单层中Oct-4和nanog的基因的强表达(图1b)。

[181]干细胞的一个品质证明和“干性”是群生长。有趣的是，hES细胞的形状逐渐改变，从通常紧密的克隆形态至统一形状细胞的不规则单层。细胞形状大于在原始克隆中观察到的(图1a，第II组)。连续生长，他们最终形成连续的细胞单层，并在板在形成小堆。然而，这些改变是可以逆转的；当细胞再次放置于饲养层以后，他们逐渐重新开始集落的形成，类似于以前在饲养层上观察到的(图1a，第III组)。

[182]从培养基中去除激活素A导致细胞形态快速改变为分化的表型(图1a，第IV组)；1周后，没有激活素A时，细胞不再表达nanog(图1b)。流式细胞计数细胞表面抗原的表达进行了定量，以此验证免疫组织化学实验和RT-PCR数据。与前面报道的TRA-1-60在ES细胞系H7和H14的表达一致25，生长于存在mEF条件培养基的层粘连蛋白上的HSF6细胞，其中60.3％表达TRA-1-60。在所述培养基中生长的细胞中，45.96％的细胞在第2代表达抗原，60.46％在第10代表达抗原，71.9％在第20代表达抗原，与母细胞的表达谱相似(图1c)。相反，从培养基中去除激活素1周后，表达水平减少至3.9％。

[183]检测所述培养基中生长20代及以上细胞的多能性标记，发现所有检测标记的表达：TRA-1-60、SSEA-4、Oct-4(免疫组织化学分析)、oct-4nanog和端粒酶反转录酶(htert)(RT-PCR)(图3a)。

[184]从培养基中去除KGF和NIC会产生不同的效果；细胞维持其未分化表型(图1a第五组，和图1b)。然而，当单独使用激活素A，KGF，或NIC与联合使用3个因子(A，N，K)培养相比较时，细胞的增殖有显著的不同。单独使用激活素培养时细胞不分化(A：图1a第五组图；图1b)；然而，与联合培养(ANK)或单独使用KGF或NIC相比其增殖率显著降低(图1d，n＝4；p＜0.0001对ANK or KGF，，p＜0.005对NIC)。相反，与联合培养相比，使用KGF培养时，细胞增殖率没有统计差异。单独使用NIC培养时，细胞的增殖率居中；尽管显著小于KGF或ANK处理的细胞(Fig.1d，n＝4；p＜0.005)，其增殖率显著高于激活素处理过的细胞(Fig.1d，n＝4；p＜0.005)。从这些数据，我们得出结论：激活素对多能性的维持是重要的，也许是必需的。KGF和较少的NIC帮助维持细胞的增殖和连续生长。然而，在缺少NIC的情况下，使用激活素和KGF(AK)培养时，细胞在短期内能保持未分化状态，比国内且生长很好，与包含NIC的培养基培养时(数据未显示)相比较，几次传代后，其生长欠佳，可能是由于其已证明的抗凋亡作用的影响²⁶。因此，在传代20次的过程中，生长因子的联合包括NIC。更加重要的是，在20次传代过程中，除了维持未分化细胞的标记外，也要保持这些细胞的正常核型(数据未列出)。

[185]接下来我们探查了转化生长因子-β(TGFβ)超家族的另一个成员能够维持细胞的多能性。像激活素一样，骨形成蛋白(BMPs)是分泌蛋白，调控许多细胞反应²⁷，包括hES细胞分化成营养外胚层²⁸。除了其在分化中的作用，BMP-4也能维持mESs细胞的多能性¹²。相反，当BMP-4代替培养基中的激活素A时，hES细胞不能维持其分化表型，1周后，nanog和oct-4的表达完全消失(图1b)。在维持mES细胞的多能性和分化的作用中，BMP-4起着一个自相矛盾的作用^12，13，很可能是由于在特定发育阶段与其他生长因子的相互作用和暴露于细胞的多肽浓度的不同引起的²⁹。激活素A和hES细胞也可能出现同样的情况，如已经描述的激活素A在特定情况下诱导hES细胞分化³⁰。

[186]在多种不同的组织中已经鉴定出激活素A，是一种不同生物学功能的自分泌或旁分泌调控子^8，10。特别的，我们发现激活素A转录子在mEFs上和分泌的激活素A前体蛋白在来自于mEFs条件培养基的高表达(图2c)。另外，HSF6细胞高水平的表达I型和II型激活素受体和强烈的Smad2磷酸化作用(图2d)。

而且，存在激活素抑制因子卵泡抑素2周后，生长于mEFs的HSF6细胞分化，ES细胞标记TRA-1-60，Oct-4和nanog完全消失(图2a-b)，与从所述培养基中去除激活素A的效果相似。FS-288，本试验中使用的卵泡抑素的等同形式，与激活素A亲和力极高，与BMP家族的亲和力较低，与TGFβ不结合^10，31。我们已经发现，BMP-4对hES细胞多能性的维持是没有效果的；因此，我们看见的分化可能是由于激活素/卵泡抑素相互作用的结果。

[187]激活素A也涉及mES细胞分化为中胚层¹³，人胰脏前体细胞分化为β细胞¹⁴，抑制神经细胞的分化^15，16，最近发现，可以诱导hES细胞内胚层的产生¹⁷。然而，这是第一次记录来自mEFs的条件培养基存在激活素A，并且其在维持细胞多能性时的新作用。我们检测到在hES细胞中几个Wnts的表达(数据未列出)。因此，我们的发现与最近报道的通过激活Wnts信号途径⁵来维持hES细胞多能性一起可以帮助阐明一个维持hES细胞多能性的分子信号途径。

[188]畸胎瘤在体内形成进一步证明了含有激活素A的培养基能维持hES细胞多能性。将hES细胞移植入裸鼠肾囊下后，移植物出现外胚层、内胚层和中胚层结构(图3b)。另外，对17天的胚状体进行RT-PCR获得谱系特异基因表达谱，该胚状体同样来源于含有激活素A的细胞培养物，与所有3个胚胎细胞层的表达有相似的特性(图3c)。这些数据表明hES细胞在含有激活素A的培养基中培养时可以维持其多能性，不需要其他外源或人类细胞共培养。

[189]作为介导这些细胞事件的关键因子，激活素A因子的鉴定将有助于阐明保持“干性”的生物化学途径。潜在的临床应用的人类干细胞产生和培养效率的提高非常及时，最近报道的17种新衍生的干细胞系可以用于非联邦支持的研究¹⁸。这里报道的这些结果，将有利于新的人类胚胎细胞系在不使用动物或人类饲养细胞层时的衍生。

[190]显然，对于本行业的技术人员来说，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，实施本发明的过程中会出现不同的修饰和变更。对本行业的技术人员来说，考虑本发明的说明和操作时，本发明的其他实施例是显而易见的。说明和实施例仅用作范例，本发明的真实范围和精神由下列权利要求来说明。

参考文献

以下参考资料与其他任何内容一起，在此处作为整体考虑。

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序列表

SEQ ID NO：01：

抑制素βA亚基(激活素A) 智人 (Homo sapiens)(PeproTech和GenBank X04447)巨噬细胞系U937(ATCC CRL 1539)氨基酸序列：

GLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLS

FHSTVINHYRMRGHS PFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECG

CS

SEQ ID NO：02：

抑制素βA链(激活素β-A链) 智人 (Homo sapiens)(GenBankX04447)3’-区域巨噬细胞系U937(ATCC(RL 1539)核酸序列：

ggcttggagtgtgatggcaaggtcaacatctgctgtaagaaacagttctttgtcagt

ttcaaggacatcggctggaatgactggatcattgctccctctggctatcatgccaac

tactgcgagggtgagtgcccgagccatatagcaggcacgtccgggtcctcactgtcc

ttccactcaacagtcatcaaccactaccgcatgcggggccatagcccctttgccaac

ctcaaatcgtgctgtgtgcccaccaagctgagacccatgtccatgttgtactatgat

gatggtcaaaacatcatcaaaaaggacattcagaacatgatcgtggaggagtgtggg

tgctcatag

SEQ ID NO：03：

抑制素βA链(激活素β-A链) 智人 (Homo sapiens)(Swiss-Prot P08476)(GenBank M13436)(红细胞分化蛋白)(EDF)卵巢氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKV

TIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVDARKSTWHVFPVSSSIQ

RLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEK

EQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAP

SGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPM

SMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：04：抑制素B亚基-重组抑制素专利：

WO 8606076-A 14 23-OCT-1986(GeneBank A14422)氨基酸序列：

ARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGE

CPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNI

IKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：05：在睾丸中的抑制素B亚基智人(Homo sapiens)(GeneBank X72498)氨基酸序列：

GLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLS

FHSTVINHYACGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGC

S

SEQ ID NO：06：抑制素B亚基红细胞分化蛋白mRNA(EDF)，急性单核细胞白血病细胞系THP-1，智人 (Homo sapiens)(GeneBank J03634)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKV

TIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVDARKSTWHVFPVSSSIQ

RLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEK

EQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAP

SGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPM

SMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：07：

抑制素βA链(激活素β-A链)(Swiss-Prot Swiss-Prot Q04998)(GenBank X69619；BC053527)- 小家鼠 (Mus musculus)(小鼠)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHGSAPDCPSCALATLP

KDGPNSQPEMVEAVKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVE

IEDDIGRRAEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLK

VPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDTGDEAEEMGLKGERSELLLSEKVVDARKSTW

HIFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEVDGDGKKKDGSD

GGLEEEKEQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWN

DWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPT

KLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：08：

抑制素3A链(激活素β-A链)(Swiss-Prot P18331)(GenBank M37482)- 褐家鼠 (Rattus norvegicus)(大鼠)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHGAAPDCPSCALATLP

KDGPNSQPEMVEAVKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVE

IEDDIGRRAEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLK

VPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDMGDEAEEMGLKGERSELLLSEKVVDARKSTW

HIFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEVDGDGKKKDGSD

GGLEEEKEQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWN

DWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPT

KLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：09：

抑制素βA链(激活素β-A链)(Swiss-Prot P27092)(GenBank U26946；U42377；M61167；M57407)- 红原鸡 ( Gallus gallus)(鸡)氨基酸序列：

MPLLWKRGFLLVICWIIVRSSPTPGSEGHSSVADCPSCALTTLSKDVPSSQPEMVEA

VKKHILNMLHLRDRPNITQPVPKAALLNATKKLHVGKVGDDGYVEIEDDVGRRAEMN

EVVEQTSEIITFAESGTPKKTLHFEISKEGSELSVVEHAEVWLFLKVSKANRSRTKV

TIRLFQQQRQPKGNSEAAEDMEDMGLKGERSETLISEKAVDARKSTWHIFPISSSVQ

RLLDQGQSSLDVRIACDLCQETGASLVLLGKKKKKEDDGEGKEKDGGELTGEEEKEQ

SHRPFLMMLARHSEDRQHRRRERGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWSDWIIAPTG

YHANYCEEECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSM

LYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：10：

抑制素βA链(激活素β-A链)(Swiss-Prot P07995)(GenBank U16239；U16238连接的；M13274)- 家牛 (Bos taurus)(牛)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALATLPKDVPNSQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEIWLFLKVPKANRTRSKV

TIRLFQQQKHLQGSLDAGEEAEEVGLKGEKSEMLISEKVVDARKSTWHIFPVSSCIQ

RLLDQGKSSLDIRIACEQCQETGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKRDGEGGAGGDEEKE

QSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPS

GYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMS

MLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：11：

抑制素βA链(激活素β-A链)(Swiss-Prot P55102)(GenBankD50326)- 野马 (Equus caballus)(马)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVKSSPTPGSEGHSAAPNCPSCALATLPKDVPNAQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRSKV

TIRLLQQQKHPQGSSDTREEAEEADLMEERSEQLISEKVVDARKSTWHIFPVSSSIQ

RLLDQGKSSLDIRIACDQCHETGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKDGGEAGAGVDEEK

EQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAP

SGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINQYRLRGHNPFANLKSCCVPTKLRPM

SMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：12：

抑制素βA链(激活素β-A链)(Swiss-Prot P03970)(GenBankX03266)- 野猪 (Sus scrofa)(猪)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSGGHSAAPDCPSCALATLPKDVPNSQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVELEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAEAGTARKTLRFEISKEGSDLSVVERAEIWLFLKVPKANRTRTKV

SIRLFQQQRRPQGSADAGEEAEDVGFPEEKSEVLISEKVVDARKSTWHIFPVSSSIQ

RLLDQGKSALDIRTACEQCHETGASLVLLGKKKKKEEEAEGRKRDGEGAGVDEEKEQ

SHRPFLMLQARQSEEHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSG

YHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSM

LYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：13：

抑制素βA链(激活素β-A链)(Swiss-Prot P43032)(GenBankL19218)- 绵羊 (Ovis aries)(羊)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALATLPKDVPNSQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISQEGSDLSVVERAEIWLFLKVPKANRTRSKV

TIRLFQQQKHLQGSLDAGEEAEEVGLKGEKSEMLISEKVVDARKSTWHIFPVSSCIQ

RLLDQGKSSLDIRIACEQCQETGASLVLLGKKKRKEEEGEGKKRDGEGGAGGDEEKE

QSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFYVSFKDIGWNDWIIAPS

GYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMS

MLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：14：

抑制素βA链(激活素β-A链)(GenBank BC056742)- 家猫 (Felis catus)(猫)氨基酸序列：

MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGPGAAPDCPSCALATLPKDVPNSQPEMVEA

VKKHILNMLHLKKRPEVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMN

ELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKV

TIQLLQKQPQGGVDAGEEAEEMGLMEERNEVLISEKVVDARKSTWHIFPVSSSIQRL

LDQGKSSLDVRIACEQCHETGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKDGGDGGAGADEDKEQ

SHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSG

YHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSM

LYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：15：

抑制素βA链(激活素β-A链)(GenBank BC056742)- 蓝斑马 (Danio rerio)(斑马鱼)氨基酸序列：

MSPLPLLSGILLLLIRSCSLSAMVTKGSLPMSEQQAGATVCPSCALARFRKGVSESE

DEGAQQDVVEAVKRHILNMLHLQERPNITHPVPRAALLNAIRKVHVGRVAKDGSVLI

EDEASNRAETEQAEQTEIITFAETGEAPGIVNFLISKEGGEMSVVDQANVWIFLRLP

KGNRTRANVNIRLLLQQGAGEKILAEKSVDTRRSGWHTFPASESVQSLLQRGGSTLS

LRVSCPLCADARATPVLVSPGGSEREQSHRPFLMAVVRQMDELSLRRRRKRGLECDG

KARVCCKRQFYVNFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGDCASNVASITGNSLSFHSTVI

SHYRIRGYSPFTNIKSCCVPTRLRAMSMLYYNEEQKIVKKDIQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：16：

抑制素βA链(激活素β-A链)(GenBank BC056742)- 湘云鲫 (Carassius auratus)(金鱼)氨基酸序列：

MSSLTLVNRGTAALRLFVRGLLTHSSREWLSGDGEPDDPVTPCP

SCALAQRQKDSEEQTDMVEAVKRHILNMLHLNTRPNVTHPVPRAALLNAIRRLHVGRV

GEDGTVEMEEDGGGLGEHREQSEEQPFEIITFAEPGDAPDIMKFDISMEGNTLSVVEQ

ANVWLLLKVAKGSRGKGKVSVQLLQHGKADPGSADGPQEAVVSEKTVDTRRSGWHTLP

VSRTVQTLLDGDSSMLSLRVSCPMCAEAGAVPILVPTESNKGKEREQSHRPFLMVVLK

PAEEHPHRRSKRGLECDGKIRVCCKRQFYVNFKDIGWSDWIIAPSGYHANYCEGDCPS

HVASITGSALSFHSTVINHYRMRGYSPFNNIKSCCVPTRLRAMSMLYYNEEQKIIKKD IQNMIVEECGCS

SEQ ID NO：17：

角质形成细胞生长因子(PeproTech) 智人 (Homo sapiens)(人)氨基酸序列：

MCNDMTPEQMATNVNCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKG

TQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEFYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELIL

ENHYNTYASAKWTHNGGEMFVALNQKGIPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：18：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P21781)(GenBank M60828；S81661)- 智人 (Homo sapiens)(人)氨基酸序列：

MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLACNDMTPEQMATNVNCSSPERHTRSYD

YMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

SEFYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHNGGEMFVALNQKG

IPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：19：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P36363)(GenBank Z22703；U58503；BC052847)- 小家鼠 (Mus musculus)(小鼠)氨基酸序列：

MRKWILTRILPTLLYRSCFHLVCLVGTISLACNDMSPEQTATSVNCSSPERHTRSYD

YMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNSYNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

SEYYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHSGGEMFVALNQKG

IPVKGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：20：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P79150)(GenBank U80800)-家犬 (Canis familiaris)(狗)氨基酸序列：

MRKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLACNDMTPEQMATNV

NCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNSYNIMEIRT

VAVGIVAIKGVE SEYYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHSG

GEMFVALNQKGVPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：21：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot Q9N198)(GenBank AF217463)- 野猪 (Sus scrofa)(猪)氨基酸序列：

MRKWILTWILPSLLHRSCFHIICLVGTLSLDCNDMTPEQMATNV

NCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYPRIGKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRT

VAVGIVAIKGVVSEYYLAMNKEGKLYAKKEYNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHSG

GEMFVALNQKGVPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：22：

角质形成细胞生长因子(HBGF-7)(Swiss-Prot Q02195)(GenBankX56551)- 褐家鼠 (Rattus norvegicus)(大鼠)氨基酸序列：

MRKWILTRILPTPLYRPCFHLVCLVGTISLACNDMSPEQTATSV

NCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMRNSYNIMEIMT

VAVGIVAIKGVESEYYLAMNKQGELYAKKECNEDCNFKELILENHYNTSASAKWTHSG

GEMFVALNQKGLPVKGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：23：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P48808)(GenBank Z46236)-绵羊 (Ovis aries)(羊)氨基酸序列：

MRKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLACNDMTPEQMAINV

NCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNSYNIMEIRT

VAVGIVAIKGVESEYYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHSG

GEMFVALNQKGVPVRGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

SEQ ID NO：24：

角质形成细胞生长因子(FGF-7)(GenBank AF420232)- 北美水貂 (Mustela vison)(美洲貂)氨基酸序列：

MRKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLACNDMTPEQMATNV

NCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNSYNIMEIRT

VAVGIVAIKGVESEYYLAMNKEGKLYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHSG GEMFVALNQKGVPVRGKKTKKEQKQP

SEQ ID NO：25：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P21781)(GenBank S81661)-智人 (Homo sapiens)(人)核酸序列：

acgcgctcacacacagagagaaaatccttctgcctgttgatttatggaaacaattatga

ttctgctggagaacttttcagctgagaaatagtttgtagctacagtagaaaggctcaag

ttgcaccaggcagacaacagacatggaattcttatatatccagctgttagcaacaaaac

aaaagtcaaatagcaaacagcgtcacagcaactgaacttactacgaactgtttttatga

ggatttatcaacagagttatttaaggaggaatcctgtgttgttatcaggaactaaaagg

ataaggctaacaatttggaaagagcaagtactctttcttaaatcaatctacaattcaca

gataggaagaggtcaatgacctaggagtaacaatcaactcaagattcattttcattatg

ttattcatgaacacccggagcactacactataatgcacaaatggatactgacatggatc

ctgccaactttgctctacagatcatgctttcacattatctgtctagtgggtactatatc

tttagcttgcaatgacatgactccagagcaaatggctacaaatgtgaactgttccagcc

ctgagcgacacacaagaagttatgattacatggaaggaggggatataagagtgagaaga

ctcttctgtcgaacacagtggtacctgaggatcgataaaagaggcaaagtaaaagggac

ccaagagatgaagaataattacaatatcatggaaatcaggacagtggcagttggaattg

tggcaatcaaaggggtggaaagtgaattctatcttgcaatgaacaaggaaggaaaactc

tatgcaaagaaagaatgcaatgaagattgtaacttcaaagaactaattctggaaaacca

ttacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggggaaatgtttgttgcct

taaatcaaaaggggattcctgtaagaggaaaaaaaacgaagaaagaacaaaaaacagcc

cactttcttcctatggcaataacttaattgcatatggtatataaagaacccagttccag

cagggagatttctttaagtggactgttttctttcttctcaaaattttctttccttttat

tttttagtaatcaagaaaggctggaaaaactactgaaaaactgatcaagctggacttgt

gcatttatgtttgttttaag

SEQ ID NO：26：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P36363)(GenBank Z22703)-小家鼠 (Mus musculus)(小鼠)核酸序列：

atgcgcaaatggatactgacacggatcctgccaactctgctctacagatcatgcttcca

cctcgtctgtctagtgggcactatatctctagcttgcaatgacatgagtccggagcaaa

cggctacgagtgtgaactgttccagccccgagcgacacaccagaagttatgactacatg

gaaggaggggatataagggtgagaagactgttctgtcgcacccagtggtacctgaggat

tgacaaacgaggcaaagtgaaagggacccaggagatgaagaacagctacaacatcatgg

aaatcaggaccgtggcagttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtgaatactat

cttgccatgaacaaggaagggaaactctatgcaaagaaagaatgcaatgaggattgcaa

cttcaaagaactgattctggaaaaccattataacacctatgcatcagctaaatggacac

acagcggaggggaaatgttcgttgccttaaatcaaaaggggattcctgtcaaagggaag

aaaacgaagaaagaacaaaaaacagcccattttcttcctatggcaataacctaa

SEQ ID NO：27：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P79150)(GenBank U80800)-家犬 (Canis familiaris)(狗)核酸序列：

agaggtcaatgacccaggagcaacaatcaactcaagatttaattttcattatgttatt

catgaacacccggagcactacactataatgcgcaaatggatactgacatggatcctgc

caactttgctctacagatcatgctttcacattatctgtctagtgggcactatatcttt

agcttgcaatgacatgactccagagcaaatggctacaaatgtgaactgttccagccct

gagcgacatacaagaagttatgattacatggaaggaggggatataagagtgagaagac

tcttctgtcgaacacagtggtatctgaggattgataaacgaggcaaagtcaaagggac

ccaagagatgaagaacagttacaatatcatggaaatcaggacagtggcagttggaata

gtggcaatcaaaggggtggaaagtgaatattatcttgcaatgaataaggaaggaaagc

tctatgcaaagaaagaatgcaatgaagattgcaacttcaaagaattaattctggaaaa

ccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacagcggaggagaaatgtttgtt

gctttaaatcaaaagggggttcctgtaagggggaaaaaaacgaagaaagaacaaaaaa

cagcccactttcttcctatggcaataacataatcatatatggtatata

SEQ ID NO：28：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot Q9N198)(GenBank AF217463)- 野猪 (Sus scrofa)(猪)核酸序列：

aatctacaattcacagataggaagaggtcagtgacctaggagcaacgatcaactcaag

atttattttcattatgttattcatgaacacccggagcactatactataatgcgcaaat

ggatactgacatggatcctgccaagtttgctccacagatcatgcttccacattatctg

tctggtgggcactttatctttggattgcaatgacatgactccagagcaaatggctaca

aatgtgaactgttccagccctgagcgacatacaagaagttatgattacatggaaggag

gggatataagagtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtatccgaggattggcaa

acgaggcaaagtcaaagggactcaagagatgaagaacaattacaacatcatggaaatc

aggacagtggctgttggaattgtagcaatcaaaggagtggtaagtgaatattatcttg

caatgaacaaggaaggaaaactctatgcaaagaaagaatacaatgaagattgtaactt

caaagaattaattctggaaaaccattacaacacgtatgcatcagctaaatggacacac

agtggaggagaaatgtttgttgccttaaatcaaaagggggttcctgtaagagggaaaa

aaaccaagaaagaacaaaaaacagcccactttcttcctatggcaataactaa

SEQ ID NO：29：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot Q02195)(GenBank X56551)-褐家鼠 (Rattus norvegicus)(大鼠)核酸序列：

caatctacaattcacagataggaggaggcccatgacctaggagtagcgatcaactcaa

ggtccagttctcattatgttattcatggacacccggggcactgctctataatgcgca

aatggatactgacacggatcctgccgactccgctctacagaccgtgcttccacctcg

tctgtcttgtgggcaccatatctttagcttgcaatgacatgagtccagagcagacggc

cacgagcgtgaactgttctagccccgagcgacacacgagaagttatgactacatggaa

ggaggggatataagggtgaggagactgttctgtcgcacccagtggtacctgaggattg

acaaacgaggcaaagtgaaagggacccaggagatgaggaacagctacaacatcatgga

aatcatgactgtggcagttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtgaatactat

cttgccatgaacaaacaaggggaactctatgcaaagaaagaatgcaatgaggattgca

acttcaaagaactgattctggaaaaccattacaacacctctgcatcagctaaatggac

acacagcggaggggaaatgttcgtggccttaaatcaaaaggggcttcctgtcaaaggg

aagaaaacgaagaaagaacaaaaaacggcccactttcttcctatggcaataacttaa

SEQ ID NO：30：

角质形成细胞生长因子(Swiss-Prot P48808)(GenBank Z46236)-绵羊 (Ovis aries)(羊)核酸序列：

ttatgttattcatgaacacccggagcactatactataatgcgcaaatggatactgaca

tggatcctgccaagtttgctctacagatcatgcttccacattatctgtctagtgggca

ctatatctttagcttgcaatgacatgactccagagcaaatggctacaaatgtgaactg

ttccagccccgagcgacatacaagaagttatgattacatggaaggaggagatataaga

gtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtatctgaggattgataaacgaggcaaag

tcaaagggactcaagagatgaagaataattacaacatcatggaaatcaggacagtggc

tgttggaattgtagcaatcaaaggagtggaaagtgaatattaccttgcaatgaacaag

gaaggaaaactctatgcaaagaaagaatgtaacgaagactgcaacttcaaagaattaa

ttctggaaaatcattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacagtggaggaga

aatgtttgttgccttaaattcaaaaggggttccagtaagagggaagaaaacgaagaaa

gaacaaaaaacagcccactttcttcctatggcaataacttaa

SEQ ID NO：31：

角质形成细胞生长因子(FGF-7)(GenBank AF420232)- 北美水貂 (Mustela vison)(美洲貂)核酸序列：

atgcgcaaatggatactgacatggatcctgccaactttgctctacagatcatgctt

tcacattatctgtctagtgggcactatatctttagcttgcaatgacatgactccagag

caaatggctacaaatgtgaactgttccagccctgagcgacatacaagaagttatgatt

acatggaaggaggggatataagagtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtatct

gaggattgataaacgaggcaaggtcaaaggaacccaagagatgaagaacagttacaat

atcatggaaatcaggacagtggcagttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtg

aatattatcttgcaatgaataaggaaggaaaactctatgcaaagaaagaatgcaatga

agattgcaacttcaaagaattaattctggaaaaccattacaacacatatgcatcagct

aaatggacacacagcggaggagaaatgtttgttgctttaaatcaaaagggggttcctg

taagggggaaaaaaacgaagaaagaacaaaaacagccccc

SEQ ID NO：32：

抑制素βA链(激活素β-A链) 智人 (Homo sapiens)(GenBankM13436)(红细胞分化蛋白)(EDF)卵巢氨基酸序列：

tgctccctgacagccacaaacctacagcactgactgcattcagagaggaacctgcaa

acaaaacttcacagaaaactttttgttcttgttccagagaatttgctgaagaggaga

aggaaaaaaaaaacaccaaaaaaaaaaataaaaaaatccacacacacaaaaaacctg

cgcgtgaggggggaggaaaagcagggccttttaaaaaggcaatcacaacaacttttg

ctgccaggatgcccttgctttggctgagaggatttctgttggcaagttgctggatta

tagtgaggagttcccccaccccaggatccgaggggcacagcgcggcccccgactgtcc

gtcctgtgcgctggccgccctcccaaaggatgtacccaactctcagccagagatggtg

gaggccgtcaagaagcacattttaaacatgctgcacttgaagaagagacccgatgtca

cccagccggtacccaaggcggcgcttctgaacgcgatcagaaagcttcatgtgggcaa

agtcggggagaacgggtatgtggagatagaggatgacattggaaggagggcagaaat

gaatgaacttatggagcagacctcggagatcatcacgtttgccgagtcaggaacagc

caggaagacgctgcacttcgagatttccaaggaaggcagtgacctgtcagtggtgga

gcgtgcagaagtctggctcttcctaaaagtccccaaggccaacaggaccaggaccaa

agtcaccatccgcctcttccagcagcagaagcacccgcagggcagcttggacacagg

ggaagaggccgaggaagtgggcttaaagggggagaggagtgaactgttgctctctgaa

aaagtagtagacgctcggaagagcacctggcatgtcttccctgtctccagcagcatc

cagcggttgctggaccagggcaagagctccctggacgttcggattgcctgtgagcag

tgccaggagagtggcgccagcttggttctcctgggcaagaagaagaagaaagaagag

gagggggaagggaaaaagaagggcggaggtgaaggtggggcaggagcagatgaggaa

aaggagcagtcgcacagacctttcctcatgctgcaggcccggcagtctgaagaccac

cctcatcgccggcgtcggcggggcttggagtgtgatggcaaggtcaacatctgctgt

aagaaacagttctttgtcagtttcaaggacatcggctggaatgactggatcattgct

ccctctggctatcatgccaactactgcgagggtgagtgcccgagccatatagcaggc

acgtccgggtcctcactgtccttccactcaacagtcatcaaccactaccgcatgcgg

ggccatagcccctttgccaacctcaaatcgtgctgtgtgcccaccaagctgagaccc

atgtccatgttgtactatgatgatggtcaaaacatcatcaaaaaggacattcagaac

atgatcgtggaggagtgtgggtgctcatagagttgcccagcccagggggaaagggag

caagagttgtccagagaagacagtggcaaaatgaagaaatttttaaggtttctgagt

taaccagaaaaatagaaattaaaaacaaaaca

SEQ ID NO：33：

抑制素B亚基-重组抑制素专利：WO 8606076-A 14 23-OCT-1986(GenBank A14422)：

gcccggcagtctgaagaccaccctcatcgccggcgtcggcggggcttggagtgtgat

ggcaaggtcaacatctgctgtaagaaacagttctttgtcagtttcaaggacatcggc

tggaatgactggatcattgctccctctggctatcatgccaactactgcgagggtgag

tgcccgagccatatagcaggcacgtccgggtcctcactgtccttccactcaacagtc

atcaaccactaccgcatgcggggccatagcccctttgccaacctcaaatcgtgctgt

gtgcccaccaagctgagacccatgtccatgttgtactatgatgatggtcaaaacat

catcaaaaaggacattcagaacatgatcgtggaggagtgtgggtgctcatagagtt

gcccagcccagggggaaagggagcaaga

SEQ ID NO：34：

用于编码在睾丸中的成熟亚基β(A)抑制素的核苷酸序列，智人( Homo sapiens)(GenBank X72498)：

ggcctggagtgcgacggcaaggtcaacatctgctgtaagaaacagttctttgtcag

tttcaaggacatcggctggaatgactggatcattgctccctctggctatcatgcca

actactgcgagggtgagtgcccgagccatatagcaggcacgtccgggtcctcactg

tccttccactcaacagtcatcaaccactacgcatgcggccatagcccctttgccaa

cctcaaatcgtgctgtgtgcccaccaagctgagacccatgtccatgttgtactatg

atgatggtcaaaacatcatcaaaaaggacattcagaacatgatcgtggaggagtgc

gggtgctcctaa

SEQ ID NO：35：

人红细胞分化蛋白mRNA(EDF)，原始材料版本：急性单核细胞白血病细胞系THP-1，智人 ( Homo sapiens)(GenBank J03634)：

tccacacacacaaaaaacctgcgcgtgaggggggaggaaaagcagggcctttaaaa

aggcaatcacaacaacttttgctgccaggatgcccttgctttggctgagaggattt

ctgttggcaagttgctggattatagtgaggagttcccccaccccaggatccgaggg

gcacagcgcggcccccgactgtccgtcctgtgcgctggccgccctcccaaaggatg

tacccaactctcagccagagatggtggaggccgtcaagaagcacattttaaacatg

ctgcacttgaagaagagacccgatgtcacccagccggtacccaaggcggcgcttct

gaacgcgatcagaaagcttcatgtgggcaaagtcggggagaacgggtatgtggaga

tagaggatgacattggaaggagggcagaaatgaatgaacttatggagcagacctcg

gagatcatcacgtttgccgagtcaggaacagccaggaagacgctgcacttcgagat

ttccaaggaaggcagtgacctgtcagtggtggagcgtgcagaagtctggctcttcc

taaaagtccccaaggccaacaggaccaggaccaaagtcaccatccgcctcttccag

cagcagaagcacccgcagggcagcttggacacaggggaagaggccgaggaagtggg

cttaaagggggagaggagtgaactgttgctctctgaaaaagtagtagacgctcgga

agagcacctggcatgtcttccctgtctccagcagcatccagcggttgctggaccag

ggcaagagctccctggacgttcggattgcctgtgagcagtgccaggagagtggcgc

cagcttggttctcctgggcaagaagaagaagaaagaagaggagggggaagggaaaa

agaagggcggaggtgaaggtggggcaggagcagatgaggaaaaggagcagtcgcac

agacctttcctcatgctgcaggcccggcagtctgaagaccaccctcatcgccggcg

tcggcggggcttggagtgtgatggcaaggtcaacatctgctgtaagaaacagttct

ttgtcagtttcaaggacatcggctggaatgactggatcattgctccctctggctat

catgccaactactgcgagggtgagtgcccgagccatatagcaggcacgtccgggtc

ctcactgtccttccactcaacagtcatcaaccactaccgcatgcggggccatagcc

cctttgccaacctcaaatcgtgctgtgtgcccaccaagctgagacccatgtccatg

ttgtactatgatgatggtcaaaacatcatcaaaaaggacattcagaacatgatcgt

ggaggagtgtgggtgctcatagagttgcccagcccagggggaaagggagcaagagt

tgtccagagaagacagtggcaaaatgaagaaatttttaaggtttctgagttaacca

gaaaaatagaaattaaaaacaaaacaaaacaaaaaaaaaaacaaaaaaaaacaaaa

gtaaattaaaaacaaacctgatgaaacagatgaaacagatgaaggaagatgtggaa

atcttagcctgccttagccagggctcagagatgaagcagtgaagagacagattggg

agggaaagggagaatggtgtaccctttatttcttctgaaatcacactgatgacatc

agttgtttaaacggggtattgtcctttccccccttgaggttcccttgtgagcttga

atcaaccaatctgatctgcagtagtgtggactagaacaacccaaatagcatctaga

aagccatgagtttgaaagggcccatcacaggcactttcctagcctaat

β-肌动蛋白 forward： cgcaccactggcattgtcat

reverse： ttctccttgatgtcacgcac

oct-4 forward： gagcaaaacccggaggagt

reverse： ttctctttcgggcctgcac

nanog forward： gcttgccttgctttgaagca

reverse： ttcttgactgggaccttgtc

激活素A forward： cttgaagaagagacccgat

reverse： cttctgcacgctccactac

Neuro-D forward： gagactatcactgctcagga

reverse： gataagcccttgcaaagcgt

鼠短尾突变体表型 forward： caaccaccgctggaagtac

T基因 reverse： ccgctatgaactgggtctc

α-胎儿-球蛋白 forward： agaacctgtcacaagctgtg

reverse： gacagcaagctgaggatgtc

ALK-4： forward： cacgtgtgagacagatggg

reverse： ggcggttgtgatagacacg

ACVR-2： forward： gggagctgctgcaaagttg

reverse： ccacatcaacactggtgcc

ACVR-

2B： forward： caccatcgagctcgtgaag

reverse： gagcccttgtcatggaagg

hTERT forward： cagctcccatttcatcagca

reverse： cgacatccctgcgttcttg

Claims

1.一种维持未分化干细胞的方法，所述的方法包含暴露干细胞于足够量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)，以在足够长的时间内，维持细胞处于未分化状态，由此达到希望的结果。

2.权利要求1所述的方法，其中该方法包含暴露所述的细胞于TGFβ家族成员，FGF家族成员，和NIC中的两种或多种。

3.权利要求1所述的方法，其中该方法包含暴露所述的细胞于TGFβ家族成员，FGF家族成员，和NIC。

4.权利要求1所述的方法，其中所述的TGFβ家族成员是激活素A。

5.权利要求1所述的方法，其中所述的FGF家族成员是角质化细胞生长因子(KGF)。

6.权利要求1所述的方法，其中所述的暴露导致所述细胞的生长。

7.权利要求1所述的方法，其中所述的暴露至少重复1次。

8.权利要求1所述的方法，其中所述的干细胞是哺乳动物干细胞。

9.权利要求1所述的方法，其中所述的干细胞是人类干细胞。

10.权利要求1所述的方法，其中所述的干细胞是胚胎干细胞。

11.权利要求1所述的方法，其中希望的结果包含培养所述的干细胞至10代以上。

12.权利要求1所述的方法，其中希望的结果包含培养所述的干细胞至30代以上。

13.权利要求1所述的方法，其中TGFβ家族成员显示与SEQID NO：1 30％以上的序列同源性。

14.权利要求1所述的方法，其中TGFβ家族成员显示与SEQID NO：1 80％以上的序列同源性。

15.权利要求1所述的方法，其中TGFβ家族成员显示与SEQID NO：1 90％以上的序列同源性。

16.权利要求1所述的方法，其中TGFβ家族成员显示与SEQID NO：1 95％以上的序列同源性。

17.权利要求1所述的方法，其中TGFβ家族成员显示与SEQID NO：1 99％以上的序列同源性。

18.权利要求1所述的方法，其中FGF家族成员显示与SEQID NO：17 30％以上的序列同源性。

19.权利要求1所述的方法，其中FGF家族成员显示与SEQID NO：17 80％以上的序列同源性。

20.权利要求1所述的方法，其中FGF家族成员显示与SEQID NO：17 90％以上的序列同源性。

21.权利要求1所述的方法，其中FGF家族成员显示与SEQID NO：17 95％以上的序列同源性。

22.权利要求1所述的方法，其中FGF家族成员显示与SEQID NO：17 99％以上的序列同源性。

23.一种组合物，包含a)培养基和b)TGFβ家族成员，FGF家族成员，NIC，或它们中两者或多者的组合。

24.权利要求23所述的组合物，其中TGFβ家族成员是激活素A。

25.权利要求23所述的组合物，其中FGF家族成员是KGF。

26.权利要求23所述的组合物，另外还包含一种干细胞。

27.权利要求26所述的组合物，其中所述的干细胞是哺乳动物细胞。

28.权利要求26所述的组合物，其中所述的干细胞是人类干细胞。

29.权利要求26所述的组合物，其中所述的干细胞是胚胎肝细胞。

30.权利要求23所述的组合物，其中TGFβ家族成员显示与SEQ ID NO：1 30％以上的序列同源性。

31.权利要求23所述的组合物，其中TGFβ家族成员显示与SEQ ID NO：1 80％以上的序列同源性。

32.权利要求23所述的组合物，其中TGFβ家族成员显示与SEQ ID NO：1 90％以上的序列同源性。

33.权利要求23所述的组合物，其中TGFβ家族成员显示与SEQ ID NO：1 95％以上的序列同源性。

34.权利要求23所述的组合物，其中TGFβ家族成员显示与SEQ ID NO：1 99％以上的序列同源性。

35.权利要求23所述的组合物，其中FGF家族成员显示与SEQ ID NO：17 30％以上的序列同源性。

36.权利要求23所述的组合物，其中FGF家族成员显示与SEQ ID NO：17 80％以上的序列同源性。

37.权利要求23所述的组合物，其中FGF家族成员显示与SEQ ID NO：17 90％以上的序列同源性。

38.权利要求23所述的组合物，其中FGF家族成员显示与SEQ ID NO：17 95％以上的序列同源性。

39.权利要求23所述的组合物，其中FGF家族成员显示与SEQ ID NO：17 99％以上的序列同源性。

40.一种组合物，包含a)至少一种纯化的TGFβ家族成员蛋白，b)至少一种纯化的FGF家族成员蛋白，和3)纯化的NIC中的两种或多种的组合。

41.权利要求40所述的组合物，其为干细胞培养基。

42.权利要求41所述的组合物，其中该干细胞是哺乳动物干细胞。

43.权利要求41所述的组合物，其中该干细胞是人类干细胞。

44.权利要求41所述的组合物，其中该干细胞是胚胎干细胞。

45.权利要求41所述的组合物，其中该TGFβ家族成员是激活素A。

46.权利要求41所述的组合物，其中该FGF家族成员是KGF。

47.一种来源于至少传代10次的培养物的未分化的多能干细胞。

48.权利要求47所述的干细胞，其中该培养物已经传代至少20次。

49.权利要求47所述的干细胞，其中该培养物已经传代至少30次。

50.权利要求47所述的干细胞，其中该干细胞已经在包含TGFβ家族成员，FGF家族成员，或NIC的培养基存在下传代，但是不在存在条件培养基，饲养细胞或LIF下传代。

51.权利要求47所述的干细胞，其中该干细胞是哺乳动物干细胞。

52.权利要求47所述的干细胞，其中该干细胞是人类干细胞。

53.权利要求47所述的干细胞，其中该干细胞是胚胎干细胞。

54.一种干细胞，通过如下方法生产，该方法包含暴露干细胞于足够量的转化生长因子β蛋白家族成员(TGFβ)，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)下，以维持干细胞处于未分化状态。

55.包含下列中2个或多个的试剂盒

1)TGFβ家族成员，

2)FGF家族成员，

3)NIC

4)胚胎干细胞，和

5)干细胞培养基。

56.权利要求55所述的试剂盒，其中该TGFβ家族成员是激活素A。

57.权利要求55所述的试剂盒，其中该FGF家族成员是KGF。

58.权利要求55所述的试剂盒，其中该干细胞是哺乳动物干细胞。

59.权利要求55所述的试剂盒，其中该干细胞是人类干细胞。

60.权利要求55所述的试剂盒，其中该干细胞是胚胎干细胞。

61.一种维持未分化干细胞的方法，所述的方法包含暴露干细胞于足够量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)，以在足够的时间内，维持细胞处于未分化状态，由此获得希望的结果，其中干细胞同样不暴露于饲养细胞，条件培养基，或白血病抑制因子下。

62.一种组合物，包含a)培养基和b)TGFβ家族成员，FGF家族成员，NIC或其两者或多者的组合，其中所述组合物不包含饲养细胞，条件培养基或LIF。

63.一种来源于通过包含暴露干细胞于足够量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)，以维持细胞处于未分化状态的方法来生长或维持的干细胞的分化的细胞。

64.一种胚胎干细胞，其通过包含暴露干细胞于足够量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)，以维持细胞处于未分化状态的方法来生长或维持。

65.一种药物组合物，包含通过暴露干细胞于足够量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)，以维持细胞处于未分化状态的方法来生长或维持的干细胞。

66.一种细胞，其来源于通过包含暴露干细胞于足够量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)，以维持细胞处于未分化状态的方法来生长或维持的干细胞。