CN1867666A - 改进对es细胞自我更新和谱系特化的控制以及用于此目的的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用Id基因产物和gp130下游信号传导途径的组合促进培养中的多能细胞自我更新。

Description

改进对ES细胞自我更新和谱系特化的控制以及用于此目的的培养基

本发明涉及用于促进干细胞自我更新和预防或控制干细胞分化的培养多能干细胞的培养基、培养条件和方法。本发明也提供衍生、分离和维持多能干细胞均质制剂的方法。提供的方法和组合物适合培养和分离多能干细胞，如胚胎干细胞(ES)，具体是哺乳动物包括人的干细胞。

在含有血清和白血病抑制因子(LIF)的条件下建立和维持多能干细胞的体外培养物是从所周知的(Smith等，Nature.336：688-90，1988)。已利用这类方法维持了许可的小鼠品系的多能干细胞许多代。当将干细胞在饲养细胞，通常为小鼠成纤维细胞或其提取物存在下培养时，进一步支持了多能干细胞培养物的维持和自我更新。在这种条件下能维持培养的人ES细胞处在多能状态许多代。

该领域后续的问题是尽管作了大量努力，只有少数动物产生的多能ES细胞培养物才能维持较长时间，并且即使这些动物也不是所有的胚胎都能形成ES细胞培养物。某些情况下可鉴定到多能细胞但不能维持培养足够时间来研究细胞或对它们进行遗传操作。这特别发生在啮齿类动物(除某些小鼠品系外)细胞。

迄今，另一问题是要将ES细胞培养物维持于多能状态许多代，只有采用含血清或血清提取物的培养基才有可能，或所用的培养条件要求存在其它细胞，如采用作为饲养细胞的成纤维细胞方能维持人ES细胞。然而，要使ES细胞经过后续控制分化成为所需的细胞类型，采用成分不明确的培养基或存在异源细胞是不利的。

通常用于培养多能干细胞的血清是胎牛(牛)血清，已知其含有复杂的混合细胞因子和其它信号分子。为了控制分化途径，在培养基中加入未知的细胞因子是不利的，因为它们会不确定地影响分化的最终结果而可能有潜在的有害作用。另外，每批血清不统一可引起培养方案的变化。

因此，用这种复杂的培养基培养获得的ES细胞及其分化的后代，有污染培养基和/或维持ES细胞所需饲养细胞某些成分的危险。这些因素违背了ES细胞及其子代细胞的治疗应用和其它应用的优良生产规程的开发。

当从ES细胞培养物产生分化的细胞群时，需要使高比例的ES细胞转化成同一类型的子代细胞，即尽可能维持均质性细胞群。然而，实际上观察到分化后获得的细胞群含有异质性混合的细胞。因此需要用获得较纯的子代细胞群的方式或因素来进行ES细胞的分化。

本申请人以前的专利申请WO-A-03/095628，是关于在无血清培养基中培养多能干细胞如ES细胞，该培养基含有gp130(即LIF)和TGF-β超家族(如BMP4)信号传导途径的激动剂，用以促进干细胞多次传代进行自我更新。存在gp130信号传导分子时，TGF-β超家族信号传导途径的激动剂令人惊奇地提供了自我更新的刺激作用，而不是促分化信号。

本发明的一个目的是提供培养多能干细胞的另一种，优选改进的方法和适合的培养基，能支持所述干细胞以非分化状自我更新传代多次。本发明另一目的是提供另一种能维持多能干细胞的体外培养直到以可控制的方式诱导其分化的培养系统。本发明还有一目的是提供增强多能干细胞的衍生和分离，和促进它们从难驾驭的生物体或还没分离得到过多能干细胞的生物体衍生与分化成ES细胞的方法和组合物。

根据本发明，在存在gp130信号传导分子时多能细胞中的Id蛋白可抑制其分化和促进其自我更机新。

本发明将多能干细胞，如SE细胞培养在无血清而含有gp130信号传导途径激动剂(即LIF)同时表达Id基因的培养基中，例如通过(i)直接激活Smad途径而表达Id诸基因或表达一个Id基因，或(ii)存在产生Id基因的细胞或或等价信号。从而促进了干细胞的多次传代自我更新。因此，在存在gp130信号传导时，多能细胞中的Id基因活性提供了自我更新的刺激。

本发明因此提供了Id基因产物促进培养的多能细胞自我更新的应用。遵照本发明，在细胞中有意提供Id基因产物和/或Id基因或等价物目的是激活。同时利用gp130信号传导，具体利用细胞因子如LIF，获得了多能细胞的自我更新。

从本发明人先前的专利申请可知，LIF和激活TGF-β超家族受体的下游信号传导可促进自我更新。在本发明中，Id基因激活与LIF组合可导致ES细胞的自我更新。因此本发明提供了另一种通过提供自我更新信号的方法，即通过以下的组合：

(i)一种Id蛋白或能增强Id蛋白活性的制剂，所述制剂是TGF-β超家族受体信号传导途径下游激活剂之外的制剂；和

(ii)一种gp130下游信号传导途径的激活剂。

Id蛋白指包括Id蛋白与其它蛋白如转位结构域的融合物，和如下所述含有Id蛋白的组合物。(i)中所述制剂是能诱导Id基因表达和/或诱导Id蛋白激活但不通过TGF-β超家族受体起作用的适当的外源因子。例子包括：纤连蛋白、纤连蛋白受体激动剂、整合素信号传导激活剂、nanog和上述能诱导Id基因表达或Id蛋白活性的所有制剂的同类物。本发明的方法适合培养多能干细胞，特别是胚胎干细胞。

在以下例子中，我们诱导Id基因表达不促进自我更新。本发明另一实施方式中，也如下所述，例如我们用遗传学方法通过在多能细胞中导入一含有Id基因的载体，操纵了多能细胞使其表达Id基因。利用该载体中的诱导型启动子可达到精确控制。当细胞用于药物筛选时此种形式的基因修饰是可接受的，但当这些细胞或其子代用于治疗时不可接受，此时宜采用外源因子来促进自我更新。

在下述具体方法更详细的描述中，促进培养的多能细胞自我更新的方法包括：(i)表达Id基因或诱导Id基因的表达，和(ii)激活gp130下游信号传导。Id基因可方便地通过游离型载体表达。

本发明另一方面提供联用以下制剂以促进培养的多能细胞自我更新：

(a)Id基因表达激活剂和/或导致Id基因表达的Id蛋白活性；及

(b)gp130下游信号传导途径激活剂。

本发明还有一方面提供联用以下制剂以促进培养的多能细胞自我更新：

(a)Id基因产物；和

(b)gp130下游信号传导途径激活剂。

在下面更详细描述的本发明一具体实施方式中，在培养组成性表达Id1的ES细胞的培养基中加入LIF。增强了自我更新证明LIF和Id基因的表达有协同作用。

本发明的一个优点是在细胞中直接提供Id基因产物以促进自我更新。由于直接诱导了自我更新从而更大程度控制了自我更新，由于此途径激活的几个阶段不需要自我更新机制的制剂而副作用少。

Id基因意指包括文献中定义的那些基因，如Id1、Id2、Id3和Id4，也意指包括它们的模拟物，包括其显示具有Id基因性能(即能抑制bHLH因子，如myoD和mash1转录活性)的功能性片段和衍生物。小鼠、大鼠、犬和人Id蛋白的具体序列见SEQ IDNO：1-4。其它Id蛋白的具体序列可通过公众可得的序列数据库中获得。可适当通过预防或降低bHLH基因的表达和活性，或预防或降低E蛋白的表达或活性来模拟Id基因的活性。可采用基因敲除或抑制RNA的方法或通过消除外源性诱导因子来实现此目的。在一种RNA靶向方法中采用反义RNA，或可采用siRNA方法。

可通过(i)bHLH基因抑制剂，(ii)myoD抑制剂，(iii)mash1抑制剂，(iv)提高的hes基因活性，(v)提高的hes蛋白活性，和(vi)以上一种或多种方法的组合来提供能增强Id蛋白活性的信号。

在现有技术中，采用诸如BMP等因子来激活TGF-β超家族受体的一种或多种下游信号传导途径。本发明的不同处在于，例如本发明依靠通过表达Id基因的载体直接在细胞中提供Id基因的活性，或依靠Id基因的表达和/或Id蛋白的活性，而不是通过TGF-β超家族的受体或直接模拟这种活性的作用。本发明比现有技术有更高的目的，能比目前更精确地维持自我更新表型。

可利用通过gp130起作用的细胞因子，如LIF受体的细胞因子或其它激动剂来实现对一种或多种gp130下游信号传导途径的激活。

能通过gp130起作用从而激活gp130信号转导的细胞因子包括：LIF、CNTF、心养蛋白、抑瘤蛋白M、IL-6加sIL-6受体和hyper II-6。适合的细胞因子包括能结合gp130和/或通过gp130激活信号传导的模拟物、融合蛋白或嵌合蛋白。已明确知晓存在血清时这些细胞因子可通过gp130起作用，但在缺乏血清时这些细胞因子能否维持细胞不分化知识有限。

因此本发明在一实施方式中提供在无血清、血清提取物、饲养细胞和饲养细胞提取物的培养基中另一种和/或改进的ES细胞培养的方法。采用本发明一具体实施方式的含有LIF和直接表达Id基因和/或Id蛋白活性的激活培养基培养，可延长ES细胞的传代。

本发明培养系统的另一优点是与含血清培养相比，ES细胞的分化减少。这具有显著意义，因为在血清中大多数多能ES细胞常倾向于分化，使它们的操纵和扩增成为问题。结果显示本发明的培养条件能使ES细胞在缺乏血清时自我更新。

已报导了许多哺乳动物来源的胚胎干细胞，包括小鼠(Bradley等，Nature.309：255-56，1984)、美洲鼬(Mol Reprod Dev.Dec；33(4)：418-31，1992)、猪和绵羊(J Reprod Fertil Suppl.43：255-60，1991)、仑鼠(Dev Biol.May；127(1)：224-7，1988)和牛(Roux Arch Dev Biol.201：134-141，1992)。可理解本发明的方法适合采纳培养其它哺乳动物的多能细胞培养物，包括灵长动物特别是人、啮齿动物特别是小鼠和大鼠、和禽类的ES细胞。

关于人ES细胞，具体知道人ES细胞可对LIF发生反应，因此本发明的培养基和方法中，在对LIF和Id蛋白联用的反应中获得的自我更新可应用于人ES细胞。

适合本发明方法的细胞密度根据所用的多能细胞和所需的子代细胞性质而不同。已获得的良好结果是将胚胎干细胞培养成单层，解离胚胎干细胞然后以单层形式培养胚胎干细胞，培养的表面密度为0.2-2.5×10⁴细胞/cm²，更具体说密度为0.5-1.5×10⁴细胞/cm²。细胞增殖成粘附性单层，并观察到比生长在含血清培养基与LIF中的ES细胞多二倍。

培养本发明ES细胞及其子代细胞的典型表面是本领域已知的培养细胞所用的表面，这些表面包括：塑料、金属、组合物表面，但可采用从商业上可广泛得到的常用表面，如塑料组织培养板。这类培养板常为几厘米直径。为了放大规模，可采用大得多的直径和采用具有许多重复单元的板。

其它常用的培养表面含有细胞粘附蛋白，常包被在该表面上。可利用细胞上的能结合蛋白质或其它细胞培养基质的受体或其它分子。这可促进与表面的粘附而促进生长。经常可获得的明胶包被板适合于本发明，也可采用其它蛋白质。

在本发明一实施方式中，在培养基中至少一部分培养期间可含有能抑制分化的制剂，如FGF受体或MEK/Erk信号传导的抑制剂，发观这样可抑制ES细胞的分化倾向。在一实施方式中，在明确无血清的含LIF和FGF受体抑制剂的培养基中培养ES细胞一特定时间，然后除去FGF受体抑制剂用Smad信号传导的直接激活剂代替。具体可用于人细胞之外细胞的FGF受体抑制剂例子包括：化合物SU5402和PD173074。或者，可采用的FGF受体竞争性抑制剂合适的是该受体的可溶形式。合适的MEF/Erk抑制剂包括：PD98059、U0126和PD184352。

在另一实施方式中，选择不除去FGF受体或MEK/Erk抑制剂。因此在培养基中存在该抑制剂一段时间，同时存在或缺乏Id蛋白的诱导剂。在存在LIF和FGF抑制剂的N2B27培养基中可培养ES细胞至少20代。如果不从培养基中去除该抑制剂，此抑制剂宜是一种特定的抑制剂对其它受体无活性或极小活性。

本发明第二方面提供一种培养ES细胞以促进ES细胞自我更新的方法，该方法包括将ES细胞维持在含有以下物质的培养基中：

(1)(a)胞内信号传导途径的激活剂，而不是通过导致Id基因表达的TGF-β超家族受体起作用的制剂，或(b)Id基因产物；和

(2)gp130下游信号传导途径的激活剂。

可采用本发明的方法刺激在无血清和无血清提取物的培养基中ES细胞的自我更新，而SE细胞原先需在血清或血清物中培养才能传代。优选也可在缺乏饲养细胞和/或饲养细胞提取物时进行此种培养。例如，培养ES细胞可包括以下步骤：

-任选在饲养细胞上存在通过gp130起作用的细胞因子和血清或血清提取时维持培养的ES细胞于多能状态；

-传代ES细胞至少一次；

-撤除培养基中的血清或血清提取物，并撤除饲养细胞(如果存在)，使培养基无饲养细胞、血清和血清提取物；和

-然后在存在Id基因表达和/或Id蛋白活性(而不是通过TGF-β受体起作用的制剂)直接激活剂或效应剂和gp130下游信号传导途径激活剂时将ES细胞维持在多能状态。

在撤除培养基中的血清或血清提取物时，任选在培养基中加入能抑制分化的制剂，如FGF受体抑制剂。一种选择是同时撤除分化抑制剂或随后在存在Id蛋白时维持SE细胞。可在撤除饲养细胞或其提取物的同时、之前或之后撤除血清或其提取物。

本发明还提供获得转染的ES细胞群的方法，该方法包括：

-用编码一选择标记的构建物转染ES细胞；

-接种该ES细胞；

-在存在Id基因表达和/或Id蛋白活性直接激活剂或效应剂和gp130下游信号传导途径激活剂时培养该ES细胞；和

-选出表达该选择标记的细胞。

所述选择标记可编码抗生素抗性、细胞表面标记或如EP-A-0695351中所述的其它选择标记，并宜含有编码该选择标记的核苷酸序列，所述选择标记操作性连接于优先在所需细胞中表达该选择标记的启动子。

在另一实施方式中，本发明提供培养ES细胞的方法，该方法的步骤包括将ES细胞单个转移到培养器皿中，例如培养板的单个孔中，在存在Smad信号传导途径的直接激活剂或效应剂和gp130下游信号传导途径激活剂时培养该ES细胞，而获得克隆的ES细胞群，它们的所有细胞都是一个ES细胞的后代。

一旦获得稳定的均质性的ES细胞培养物，可改变培养条件来引导细胞分化成为选自外胚层、中胚层或内胚层细胞的一种或多种细胞类型。此外或撤除细胞因子或信号传导因子后，可高效衍生特异性分化的细胞群。可在存在通过gp130起作用的细胞因子和Smad信号传导途径直接激活剂或效应剂时维持ES细胞，然后撤除细胞因子同时维持Smad信号传导途径的直接激活剂或效应剂和/或加入能引导分化的另一信号传导分子，使ES细胞向非神经外胚层分化。上述方法均可任选包括获得和/或分离此过程产生的分化细胞的步骤。

例如，在缺乏LIF时接触BMP4可导致诱生中胚层的内胚层类型细胞。撤除gp130和TGF-β信号传导途径的激动剂和/或阻断此二途径可导致诱生神经外胚层细胞表型。或者，可在培养条件中加入其它信号传导因子以引导其它分化途径，例如活化素、sonic hedgehog(shh)、Wnts和FGF。

应用时，到ES细胞培养结束，引起分化之前需要至少传代一次去除Smad信号，以确保该信号衰减以后分化时不再遗留此信号。一实施方式中，在一次至二次传代的培养物中加入FGF受体拮抗剂，同时去除Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂。

本发明的其它方面提供ES细胞自我更新的细胞培养基，一种这类培养基包含：

-基础培养基；

-Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂；

-gp130下游信号传导途径激活剂；和

-铁转运蛋白；

其中所述培养基任选无血清和无血清提取物。

人多能干细胞的优选培养基包含：Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，gp130下游信号传导途径激活剂，和FGF受体激动剂。人干细胞以外的多能干细胞的优选培养基包含：Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，gp130下游信号传导途径激活剂，和ES细胞分化抑制剂。

基础培养基是能提供ES细胞所需的碳和/或维生素和/或矿物质基本来源的培养基。基础培养基通常不含蛋白质不能自身支持ES细胞的自我更新。所述铁转运蛋白提供了铁的来源或提供了从培养基中摄取铁的能力。合适的铁转运蛋白包括运铁蛋白和脱铁运铁蛋白。

优选该培养基还包含一种或多种胰岛素或胰岛素样生长因子和白蛋白(优选重组的)，没有饲养细胞和饲养细胞提取物。

本发明的具体培养基包含有LIF、BMP、胰岛素、白蛋白和运铁蛋白，有或没有其它基础培养基。

本发明还提供含有以下物质的培养基：

-Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂；

-通过gp130起作用的细胞因子。

所述培养基任选可添加上述ES细胞分化抑制剂，或当需要分化时，添加能ES细胞向特定表型分化的信号传导因子。

优选该培养基不含血清或血清提取物。最优选该培养基是成分完全明确的。

本发明一优选实施方式中，培养基包含gp130受体结合细胞因子LIF，其浓度在10U/ml-1000U/ml之间。更优选在50U/ml-500U/ml之间，甚至更优选为100U/ml。

具体的人多能细胞培养基含有：(a)LIF，(b)BMP和(c)FGF。非人多能干细胞的具体培养基含有：(a)LIF，(b)BMP和(c)FGF抑制剂。可如本文所述进行培养基组分的置换。

本发明还提供从胚泡产生多能细胞的方法，该方法包括：

(1)获得胚泡；

(2)在存在gp130下游信号传导途径激活剂时培养该胚泡以获得内细胞团；

(3)分解该内细胞团；

(4)从分解的内细胞团分离获得细胞；

(5)在存在gp130下游信号传导途径的激活剂和Id基因表达激活剂或Id基因表达产物时培养该分离的细胞。

该方法宜包括用LIF培养胚泡，更优选培养2-4天。

分离的细胞宜培养在无血清培养基中。通常这些细胞以集落再接种。在下面的实施例中，我们联用LIF和BMP受体激动剂获得了良好结果。

也宜将胚泡培养在无血清培养基中，任选缺乏BMP受体激动剂。

本发明还提供含有操作性连接于一启动子的Id基因的载体。

所述启动子宜为诱导型启动子，而可利用外界因素控制表达。可以是游离型载体，如以下实施例中所述。

本发明的另一种培养基是含有能诱导Id蛋白表达的制剂，而不含有通过TGF-β超家族受体起作用的制剂的培养基。例子包括：纤连蛋白、纤连蛋白受体激动剂、整合素信号传导激活剂、nanog和所有上述能诱导Id基因表达和/或Id蛋白活性的同类物。

该培养基含有Id蛋白，如连接有转位结构域的Id蛋白，以促进Id蛋白转位穿过多能细胞的细胞膜。

“转位结构域”指蛋白中能影响其自身和/或其它蛋白和物质穿过细胞膜或脂质双层的结构域或片段，包括保留这种结合功能的天然结构域和片段。所述细胞膜可以是转位过程中发生受体介导的内吞作用的内体膜。通常在低pH时通过在脂质膜中形成可检测的小孔能力来鉴定转位结构域(见Shone等，Eur J Biochem.167：175-180，1987所述的相宜试验)。因此可利用转位结构域的这种性能来鉴定本发明其它蛋白质结构中可能起转位作用的结构域。衍生自细菌神经毒素的转位结构域的例子如下：

肉毒杆菌A型神经毒素    -氨基酸残基(449-871)

肉毒杆菌B型神经毒素    -氨基酸残基(441-858)

肉毒杆菌C型神经毒素    -氨基酸残基(442-866)

肉毒杆菌D型神经毒素    -氨基酸残基(446-862)

肉毒杆菌E型神经毒素    -氨基酸残基(423-845)

肉毒杆菌F型神经毒素    -氨基酸残基(440-864)

肉毒杆菌G型神经毒素    -氨基酸残基(442-863)

破伤风神经毒素         -氨基酸残基(458-879)

其它合适的转位结构域是TAT(如来自HIV-1的)和穿透蛋白(penetratin)，即一种能内化共价连接的肽和输送它们，或能将它们输送到细胞核的短氨基酸序列。其它称为蛋白质转导结构域的合适结构域，如VP22、antp基因(antennapedia)的衍生物等，见Wadia等(2002)的描述。可通过化学方法，如通过巯基将这些结构域连接于Id蛋白，或可表达含有Id蛋白和该结构域的融合蛋白。具体的结构域见SEQ ID NO：5-6。具体的融合蛋白包括Id蛋白和蛋白的转位结构域见SEQ ID NO：7-9。连接的分子、融合蛋白和组合物含有本发明另一方面的相同内容。可利用这些东西，例如作为培养基的添加物，用作以Id基因转染细胞的另一种方法。

与转位结构域相关的“转位”指与细胞表面结合后发生的内化活动。这些活动导致物质转运入细胞的胞质溶胶中。

因此将某因子输送给ES细胞的组合物含有：

该因子，和能将该因子转位至ES细胞内的转位结构域，适合的是梭状芽胞杆菌毒素的H_N结构域。

该结构域也可选自(1)白喉毒素的H_N结构域，(2)基本上保留了白喉毒素H_N结构域转位活性的(1)的片段或衍生物，(3)融合性肽，(4)膜破坏性肽，和(5)(3)和(4)的转位片段和衍生物。

本发明还提供利用能提高多能细胞中Id蛋白活性的制剂来促进多能细胞的自我更新。该制剂将在本文适当处进行描述，可以是能提高细胞Id蛋白表达量的或增强Id蛋自在细胞中活性的制剂。

本领域技术人员可理解，可通过TGF-β受体的上游激动剂(如受体的配体)、组成性活性受体，或激活该信号传导途径的下游组分，如SMAD信号转导分子，来影响TGF-β超家族受体的下游信号传导途径的激活。同样gp130信号转导途径的上游效应(如细胞因子)和下游效应剂(如Stats)也能激活此通路。因此本发明的实施方式指激活TGF-β受体的下游信号传导途径，例如，使ES细胞衍生的方法包括所有含能激活TGF-β受体超家族信号传导途径分子的组合物，优选通过BMP受体起作用以促进多能干细胞的自我更新。BMP受体的合适配体包括BMP和GDF。

按照本发明，还优选以粘附性培养形式来培养细胞，本发明实施例中，可发现维持细胞于多能状态后，可诱导出高度均一性和高细胞活力的分化。通过加入细胞粘附性蛋白可促进粘附性培养，在本发明具体实施例中，已采用明胶作为培养基质的包被层。

还优选以单层培养物形式培养本发明的多能细胞，但可任选悬浮培养细胞或作为预先细胞凝聚物培养，可将细胞培养在小珠上或其它适合的支架上，如膜或其它三维结构物上。

培养本发明多能细胞培养基中宜存在的其它成分是能促进细胞存活和/或代谢的因子。在本发明一具体实施方式中，在存在胰岛素时培养细胞。可代替采用的另一因子是胰岛素样生长因子和其它促存活和/或促代谢因子。

本发明实施例中所用的培养基还宜含血清白蛋白。可采用其纯化或重组形式，如采用重组形式优点是没有潜在的污染因素、细胞因子等。培养基中不需要含有血清白蛋白，此成分可删去或用另一种丰富的蛋白质或合成的多聚物(聚乙烯醇)代替，见Wiles等所述。

本发明特别优选的培养基是成分完全明确的培养基。此种培养基不含不明确的组分，即不含成分不知的或含有不明确或可变因子的无特定功能的成分。采用成分完全明确的培养基的优点是培养方法可高效一致和可后续操纵多能细胞。此外，发现可以更高效率和更大的预见性维持细胞于多能状态，当用成分明确的培养基培养细胞诱导分化时，其对分化信号的反应比用成分不明确的培养基更为均一。

可用本发明的培养基培养任何成年人组织的多能干细胞。

本发明的方法还包括获得分化细胞的方法，该方法包括如上所述培养多能细胞并使细胞分化，当细胞含有选择标记时，与其它类型细胞相比，其能在所需的分化细胞(包括多能干细胞)中差异性表达，该选择标记的表达导致所需要的分化细胞优先分离和/或存活和/或分裂。

分化的细胞可能是组织干细胞或子代细胞，可能是终末分化细胞。

本发明还提供分离多能干细胞或EG或SC细胞的方法，该方法包括在含有以下物质的培养基中培养胚胎细胞或组织，或胎儿或成年人的体细胞：

-通过gp130起作用的细胞因子；和

-Id蛋白或Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂；和/或

-FGF受体或MEK/Erk的抑制剂。

优选该培养基是成分完全明确的培养基。

本发明还延伸到用以下描述的本发明任一方法获得细胞。本发明的细胞可用于试验中来发现药物。本发明的细胞也可用作细胞治疗，因此本发明的方法包括联合利用本发明的gp130信号传导和Id蛋白活性和/或其表达来产生和/或维持多能细胞，将产生的细胞用于细胞治疗，和在细胞治疗中运用这些细胞。

本发明提供重新程序化细胞，从非多能细胞产生多能细胞的方法。因此获得多能细胞的方法包括在细胞中表达Id基因或诱导Id基因的表达，可在含有Id蛋白的培养基中培养细胞，激活细胞中的gp130下游信号传导途径，从胎儿或成年人的体细胞或组织获得多能细胞。所得到的多能细胞特征优选为Rex1、Oct4和nanog阳性。

本发明提供检测能替代Id蛋白活性的某因子的试验，所述试验包括：

(1)在存在Id蛋白活性和gp130下游信号传导时培养细胞，从而将此细胞维持在多能状态；

(2)去除或降低Id蛋白活性；

(3)在细胞中引入该因子；和

(4)测定细胞是否保持在多能状态或发生分化。

(1)中，在存在Id蛋白活性时培养细胞宜包括：(a)表达Id基因，(b)诱导Id基因的表达，或(b)在培养该细胞的培养基中加入Id蛋白，在细胞中加入该因子宜包括：(a)表达该因子，或(b)在培养细胞的培养基中加入该因子。本发明另一方面扩大到获得该因子。

Id基因是未分化ES细胞中BMP/Smad信号传导的主要靶子。Id是负螺旋-环-螺旋因子，能螯合E蛋白阻止bHLH因子如myoD和mash1转录活性(Jen等，1992；Lyden等，1999)，是造血生成的候选负调节剂(Nogueira等，2000)。在本发明一具体实施方式中，用只加有LIF的Id自我更新无血清培养基转染ES细胞，确定BMP/Smad的关键性贡献是诱导了Id的表达。

撤除LIF时，表达Id的ES细胞易于分化但不产生神经前体细胞。因此Id蛋白是以谱系特异性方式起作用，抑制神经前体细胞的定型，不影响或很少影响中胚层或原始内胚层的定型。因此Id通过弥补STAT3对其它谱系的阻断而产生自我更新作用(图7)。Id的功能至少一部分是阻断过早表达的促神经原因子的作用。Id的可能作用是使干细胞与谱系引发的功能性后果相分隔(Hu等，1997)。

因此LIF/STAT3和BMP/Smad联合作用支持了ES细胞的自我更新。这二条途径还介导了非洲爪蟾(Xenopus)胚胎的腹侧生成(Nishinakamura等，1999)。此例中，各基因的活动是充分独立于其它基因的，STAT3和Smad1之间没有交叉调节的证据。

同源域蛋白Nanog可绕过含血清培养基中激活STAT3的需求(Chambers等，2003)。Nanog也可用于替代对BMP/血清刺激的需求，至少部分可使Id组成性表达。

现在给予以下本发明的说明性实施例及附图：

图1显示LIF加BMP可维持ES细胞在无血清培养基中的自我更新；

图2显示ES细胞在含LIF加BMP的N2B27中的集落形成、潜能和衍生能力；

图3显示ES细胞中BMP的信号传导；

图4显示ES细胞中Id的表达和功能；

图5显示Id抑制了神经原的分化，此为ES细胞自我更新的需要；

图6显示Nanog绕过对BMP/血清的需要而诱导了Id；和

图7显示BMP/Id和LIF/STAT3对协作性细胞谱系的限制。

更详细的内容可参见以下实施例。

图1显示LIF加BMP可维持ES细胞在无血清培养基中的自我更新能力：

A.用所示细胞因子在N2B27中培养的Oct4-GiP细胞的相差和荧光显微镜图象。TuJ1免疫染色检测到神经原分化，绿荧光反映了在未分化的ES细胞中Oct4启劝子的活性。标尺条：50微米。

B.在含FCS加LIF的常规培养基中，或在含LIF(10ng/ml)加BMP4(10ng/ml)的N2B27中连续传代时Oct4-GFP阳性未分化ES细胞累积数的标示图。每隔48小时用细胞解离缓冲液传代培养物，再接种每10cm²的孔4×10⁵个细胞。每次传代用FACS分析测定GFP阳性细胞数。

C.对在(1)用含LIF加BMP的N2B27培养的ES细胞，(2)用含LIF的血清培养的ES细胞，(3)8天的胚胎样小体，(4)用视黄酸处理的8天胚胎样小体中Oct4、Nanog、T(短尾)和Sox1 mRNA的RT-PCR分析。

图2显示ES细胞在含LIF加BMP的N2B27中的集落形成、潜能和衍生能力：

A.通过电穿孔E14Tg2a细胞和用嘌呤霉素选择分离得到的CAG-taugfp转染子集落。

B.单个CAG-taugfp转染子ES细胞和衍生的集落。

C.在含LIF加BMP的N2B27中传代6次后TP6.3ES细胞产生的妊娠中期胚胎嵌合体。GFP荧光标出了ES细胞的子代。

D.CAG-taugfp转染的ES细节与C57BI/6母体和子代形成的雄性嵌合体。花白皮毛色标出了子代细胞的ES细胞起源。

E.用含LIF加BMP的N2B27培养衍生的第一代SF1ES细胞的集落。从SF1ES细胞产生的嵌合体。标尺条：50微米。

图3显示ES细胞中BMP的信号传导：

A.Oct-GiP细胞RNA样品的逆转录-PCR分析，具体是(1)在含LIF加BMP的N2B27中培养6代，(2)血清+LIF，无逆转录酶的对照，(3)血清+LIF，(4)接种于不含LIF或BMP的N2B27中1天后，(5)不含LIF或BMP，培养5天。

B.免疫印迹显示对模拟处理(non)或用LIF、BMP或者LIF加BMP刺激15分钟或在N2B27中培养过夜后1小时的Smad1、erk和p38反应。

C.免疫印迹显示对LIF、BMP和LIF加BMP的STAT3酪氨酸磷酸化反应。

D.在存在血清和LIF时Smad7游离体型转染子分化和表达了神经原前体细胞(Sox1-GFP)和神经原(TuJ)标记。

E.SB203580(30μM)p38抑制剂不能抑制在LIF加BMP中的自我更新或单独在LIF中的神经原分化。Oct4-GFP标出了未分化的ES细胞，TuJ1免疫印迹鉴定了神经原。

F.ES细胞中活性Smad1和STAT3的共免疫沉淀。左图：用FLAG标记的Smad1转染后的FLAG免疫沉淀。右图：未操作的ES细胞的STAT3免疫沉淀。细胞如所示刺激1小时。标尺条：50微米。

图4显示ES细胞中Id的表达和功能

A.用光循环逆转录PCR分析法分析对LIF、BMP或LIF+BMP的反应中基因的诱导。ESN2B27中培养过夜，然后刺激45分钟。

B.Oct4-GiP细胞中Id mRNA表达的Northern杂交。Con：维持在含血清加LIF培养基中的稳定态ES细胞。泳道2-11：在不含细胞因子的N2B27中培养过夜然后如所示刺激45分钟。Fn：纤连蛋白。

C.只用载体转染培养在含血清加LIF培养基中的46C ES细胞的Id蛋白稳态水平，在Id1和fld1稳定整合子克隆中和46C/T细胞游离体超转染后的过度表达。后者印迹只接触了10秒钟。转染的Id1加有FLAG尾，因此与内源Id1相比移动滞后。

D.培养在含LIF的N2B27中的Id1稳定整合子ES细胞集落的Nanog和Oct4mRNA原位杂交。用Id2和Id3转染子获得同样结果。标尺条：50微米。

图5显示Id抑制了神经原的分化，此为ES细胞自我更新的需要：

A.在没有细胞因子的N2B27中分化6天后，载体和Id3稳定整合子46C克隆的相差和GFP荧光显微镜图象。Id1和Id2转染子显示了对神经原分化的相似抑制。

B.上图：fld1转染子46C细胞在单含LIF的N2B27中形成了自我更新的集落。中图：Cre切割的fld1C细胞在LIF中分化后需要LIF加BMP才能形成ES集落。下图：在切除两侧加上loxP位点的(floxed)Id1-STOP盒后，fld1C集落中组成性CAG单元驱动的GFP表达。

C.撤除N2B27中的LIF时fld1细胞经历了非神经原分化，但不激活Sox1-GFP或表达TuJ。Cre切割后，fld1C细胞显示恢复了TuJ阳性神经原细胞的分化。(由于GFP的组成性激活不能在fldC细胞中特异性检测到Sox1-GFP)。

D.ES细胞中和神经原分化时mash1和ngn2表达的逆转录PCR分析。样品同图3A。

E.E47的过度表达阻抑了ES细胞质自我更新，可通过提高Id1拯救。用E47超转染46C/T ES细胞，或用E47加Id1游离型表达载体协同超转染，在含血清和LIF的培养基中经嘌呤霉素和零霉素双选择培养6天。

F.提高E47克服了Id1对神经原分化的抑制。如E中超转染46C/T ES细胞，转染后24小时转移到N2B27中不加细胞因子，双选择培养6天。标尺条：50微米。

图6显示Nanog绕过对BMP/血清的需要而诱导了Id；

A.在N2B27或在N2B27加BMP中培养EF4C细胞6天。在所示条件下培养EF4 Nanog转染子6代，然后拍照。标尺条；50微米。

B和C.在血清加LIF(Con)中培养的，或在不含细胞因子的N2B27中培养过夜的E14Tg2a亲代ES细胞和EF4 Nanog转染子的Id1和Id3 mRNA的Northern杂交，和mRNA水平。

图7显示BMP/Id和LIF/STAT3对协作性细胞谱系的限制：

ES细胞的自我更新需要抑制细胞谱系的定型。BMP诱导的Id基因或其它信号阻断进入神经原谱系，这只能用LIF/STAT3来部分防止。同时，BMP诱导中胚层和内胚层分化的能力受到STAT3的约束，可能涉及到直接及间接机制。因此撤除LIF可导致将BMP的作用从支持自我更新转变到促进细胞谱系的定型。

在本发明的序列表中，以下的序列编号SEQ ID NO对应于以下序列：

1.小鼠Id3的氨基酸序列

2.大鼠Id3的氨基酸序列

3.犬Id3的氨基酸序列

4.人Id3的氨基酸序列

5.Tat的蛋白质转导结构域

6.antp基因的蛋白质转导结构域

7.Tat-人Id3融合物

8.antp基因-人Id3融合物

9.小鼠Id3-antp基因融合物

实施例

对在最低基础培养基中培养的未分化ES细胞的活力而言，胎牛血清很重要(Wiles和Johansson，1999)。然而富含N2和B27添加剂的基础培养基中，ES细胞的活力维持高水平(Ying和Smith，2003)。这使我们要检验LIF是否能在缺乏血清因子时驱动自我更新的不断循环。

在单纯N2B27培养基中，粘附性ES细胞能有效转化为Sox1阳性神经原前体细胞(Ying等，2003)在这些条件下LIF减少了但不是消除了神经原人分化。在含LIF的N2B27培养基中连续传代时，我们发现未，未分化的ES细胞数经最初增长达到一平台，2-3代后开始下降。这种发现用，和种分化的ES细胞系得到重复。这些培养物中的许多细胞具有神经原前体细胞或不成熟神经原的形态。通过46C ES细胞中的Sox1-GFP神经原报告剂的激活证实了神经原的分化(Ying等，2003)。这些观察表明，需要LIF/STAT3的其它信号传导途径来促进ES细胞质自我更新，特别是抑制神经原的定型。

BMP是熟知的脊椎动物胚胎中的抗神经(anti-neural)因子(Wiles和Hemmati-Brivanlou，1995；Wiles和Edlund，2001)已证明基能拮抗ES细胞分化成神经原(Tropepe等，2001；Ying等，2003)。BMP只能促进ES细胞最终分化成非神经原(Johansson和Wiles，1005；Wiles和Johansson，1999；Ying等，2003)，因此真实不可能视为候选的自我更新因子。然而，我们检验了加入BMP是否可能与LIF的共刺激结合来抑制分化。我们发现LIF加BMP4(或BMP2)组合增强了自我更新，在N2B27中传代2或3次后导致高纯度的未分化ES细胞群(图1A)。这些培养物可继续扩增许多代而生长速度或活力不下降，没有神经原分化(图1A、B)。在起源于3种独立衍生物的11个不同的ES细胞系的每一个中都观察到此种反应。代表性的Oct4阳性未分化细胞群的倍增时间略高于用血清加LIF培养时获得的(图1B)。SSEA-1和碱性磷酸酶(未显示)和ES细胞特异性转录因子Nanog和Oct4的表达，与缺乏中胚层(T)和神经外胚层(Sox1)标记，证实了ES细胞的状态(图1C)。

N2和B27组分可改善细胞活力但不是自我更新所必须。在只添加了运铁蛋白的基础培养基中，LIF加BMP可维持未分化的ES细胞自我更新和扩增许多代，但单用LIF不行。因此B27组分不会导致对BMP的需要。

我们测试了BMP的相关生长和分化因子-6(GDF-6)，发现在存在LIF时它可类似地支持ES细胞的自我更新(图1A)。然而，这不是TGF-β超家族的一般特征而是限于BMP受体的配体。TGF-β1对ES细胞没有可辨别的作用，而活化素增强了ES细胞的活力和/或增殖，但不抑制分化。

为了测试LIF加BMP支持的ES细胞增殖，我们进行了电穿孔和稳定转染子的选择。容易地分离得到了能稳定表达tauGFP的集落(图2A)并扩增成大培养物，显示了在遗传操作方案中利用此无血清系统的可行性。

然后研究了分离得到的ES细胞的自我更新。将单个ES细胞转移到96孔N2B27培养基中，只加LIF或LIF与BMP4(图2B)。只存在LIF时形成了单个集落，含有高比例的分化细胞不能进一步扩增。相反，在LIF加BMP4的192个孔中有12个形成了未分化集落，其中10个不用血清可扩增(表)。

在LIF加BMP中培养的ES细胞经多次传代维持了二倍体染色体互补。它们也保留了分化潜力。撤除LIF和BMP将导致原分化，去除LIF但保留BMP导致分化成为扁平上皮样细胞片层。对BMP的这种自我更新反应仍然依赖于持续的LIF信号传导。

小鼠ES细胞的明确功能是它们能够重新进入胚胎发育在嵌合小鼠中产生分化组织的完全组分。在用N2B27和LIF加BMP培养增殖3周后，我们将含有GFP报告剂的ES细胞注射到小鼠胚泡中。分析妊娠中期鉴定到的含许多ES细胞的几个嵌合体的组织类型(图2C)。由于测试更严格，我们采用了以taugfp转染的在LIF加BMP中选择和扩增的ES细胞。获得了活体出生的嵌合体和遗传了ES细胞基因组的二个雄性动物(2D)。

不用饲养细胞或血清衍生ES细胞

我们研究了对BMP的反应是否适合建立的ES细胞培养或显示ES细胞衍生的最初阶段。我们将胚泡接种在添加了BMP和LIF的N2B27培养基中。几天后分解扩增的内细胞团(ICM)再接种在同样的培养条件下。在初步试验中，培养5-6天(ES细胞衍生的标准时间)后的JCM分解不能获得ES细胞集落(Nichols等，1990；Robertson，1987)。然而在缺乏血清存在BMP时，LIF显示能降低生长速度和更迅速发生明显的分化。因此我们后来只在LIF中培养胚泡4天后分解ICM和在接种时加入BMP。在这些条件下原代ES细胞集落确实形成了(图2E)。这些集落能传代和扩增成形态为未分化的ES细胞。一个细胞系(SF1)也具有此特征。撤除LIF和BMP时，SF1细胞经历了体内神经原分化。然而，SF1细胞产生了数目众多的嵌合小鼠(图2F)。12个嵌合体都是雄性，表明由于主要是XY ES细胞而发生性别转变(Bradley等，1984)。

因此，按照本发明在存在gp130信号传导和TGF-β超家族爱体的下游信号传导时培养不规则接种的细胞我们衍生了ES细胞。

未分化的ES细胞表达功能性BMP信号传导机制

在LIF加BMP中培养只能形成单个细胞克隆几乎完全没有分化，提示我们BMP可能直接作用于ES细胞，而不是通过分化的子代细胞介导。然而先前研究报告，ES细胞分化时有BMP受体表达和BMP反应不能确定是否未分化状态的ES细胞可对BMP产生确切反应。为了证实这一点，我们利用对Oct4转基因活性的选择(Ying等，2002)来纯化用于RNA和蛋白质分析的未分化的细胞。

BMP通过1型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异质二聚体起作用(Shi和Massaque，2003)。未分化ES细胞很少或没有I型Bmprlb mRNA，但表达I型Bmprla和II型BmprII受体mRNA(图3A)。在未分化ES细胞中也易检测到BMP4和GDF6转录物。BMP受休的主要下游因子是Smad转录因子(Attisano和Wrana，2002；vonBubnoff和Cho，2001)。活性BMP受体复合物可募集和磷酸化R-Smad1、5和8，然后与Smad4组合转位于核中。我们用丝氨酸磷酸化活性形式的Smad1特异性抗体作免疫印迹研究了Smad的激活。加入BMP4后显示未分化ES细胞中Smad1的磷酸化化增加(图3B)。BMP刺激也提高了p38的，一小时后提高了erk丝裂原-活化的蛋白激酶的基础活性(图3B)。这些资料确定未分化的ES细胞具有对BMP刺激起反应的信号转导机制，因而它们可能具有通过产生BMP4和GDP进行自分泌刺激的潜能。

BMP通过Smad激活支持自我更新

LIF的自我更新作用是通过转录因子STAT3介导的(到Matsuda等，1999；Niwa等，1998)。经酪氨酸705的磷酸化测定，单独BMP不能激活STAT3(图3C)。LIF也不能提高STAT3的活性。gp130的下游Erk激活是ES细胞自我更新不需要的，但它似乎是促分化信号(Burdon等，1999a)。因此降低erk活性有利于ES细胞的衍生(Buehr和Smith，2003)和促进自我更新(Burdon等，1999b)。然而，对LIF反应时Erk的激活不宜因存在BMP而受到抑制(图3B)。这些资料表明，BMP不能调节ES细胞中的gp130信号转导，提示信号传导途径直接对自我更新起作用。

我们将抑制性gp130家族成员Smad6和Smad7(Shi和Massague，2003；von Bubnoff和Cho，2001)导入ES细胞中来拮抗BMP信号传导。在存在血清和LIF嘌呤霉素选择下转染和培养细胞。与空载体相比，Smad6和Smad7表达载体产生了少量和较小的ES细胞集落。此外，传代后Smad6，甚至加上Smad7转染子扩增差。在转染的细胞群中表现出高水平的分化。在粘附性培养中通常血清可抑制神经原的分化，但这在Smad7转染后易于出现(图3D)。

除阻抑Smad激活外，Smad6/7也能抑制BMPR的下游TAK/p38途径(Kimura等，2000)。为了评估p38在ES细胞中的潜在作用，我们采用了特异性抑制剂SB203580(Cuenda等，1995)。此试剂对BMP支持自我更新的能力没有显而易见的作用(图3E)。在只用LIF时。SB203580不能改变自我更新与神经原分化之间的平衡，但看来能提高细胞的整体活力，提示在ES细胞和其它类型细胞中，p38具有促凋亡作用(Kimura等，2000)。因此Smad途径可能是自我更新信号的转导器。

已特征鉴定了神经上皮细胞中Smad和STAT3之间协作性转录调节的机制(Nakashima等，1999；Sun等，2001)。这涉及到形成由遍在转录协同激活剂p300桥连的三元复合体，导致协同激活胶质细胞持异性启动子。我们研究了用LIF加BMP刺激的ES细胞中是否可能形成含有STAT3和Smad的复合体。用FLAG加尾的Smad1转染后进行免疫沉淀，表明活化的STAT3和Smad1可共定位(图3F)。在LIF加BMP刺激后内源磷酸化的Smad1和STAT3的共免疫沉淀证实了此结论。

ES细胞中的BMP靶基因

为了引起ES细胞自我更新，可同时操纵对不同靶基因的BMP/Smad和LIF/STAT3信号传导，和/或可会聚于共同的靶基因，例如，通过与p300的三元复合体。我们利用实时RT-PCR在Oct-选择的ES细胞中检测了LIF、BMP或LIF加BMP所诱导的候选基因(图4A)。已知的二个LIF靶基因tisll和c-fos显示对BMP不反应。其它二junB和特别是socs3在存在BMP时看来可被LIF更好诱导。这些资料提示，STAT3靶基因的一个亚组可能对BMP的共刺激起反应。然而junB和Socs3均不是自我更新效应的候选基因：junB裸ES细胞显示没有缺损(Schorpp-Kistner等，1999)，而SOCS3功能是gp130信号传导的负反溃调节剂(Schmitz等，2000)，当过度表达时阻抑了自我更新。

我们也检测了Id基因的表达，该基因编码负调节bHLH因子，证明在神经上皮细胞(Nakashima等，2001)和C2C12肌母细胞(Lopez-Rovira等，2002)中可被BMP/Smad诱导。也有报导在分化的ES细胞培养物中BMP可诱生Id mRNA(Hollnagel等，1999)。我们发现BMP(和GDF，资料未显示)，但不是LIF可强效诱导Id1和Id3(图4A)。Northern杂交证实了这些发现，并将其延伸到Id2(图4B)。活化素(资料未显示)或TGF-β1均不能诱导Id基因表达，表明此反应是对BMP受体下游的Smad特异的。

胎牛血清和纤连蛋白也可诱导Id基因，虽然程度比BMP差(图4B)。血清培养的ES细胞显示能容易地检测到稳定状态的Id mRNA量。我们检验了诱导Id2和Id3的纤连蛋白在N2B27培养中能否替代BMP。可溶性纤连蛋白与LIF组合可扩增未分化Oct4-GiP细胞至少10代，虽然比BMP有更多的分化和较慢的细胞群扩增。

组成性Id可绕过BMP或血清需求使ES细胞自我更新

我们假设诱导Id可能对神经原分化提供特定限制而弥补STAT3的自我更新活性。因此我们制备了Id1、Id2和Id3的表达构建物，将它们导入ES细胞中。通过游离型载体超转染和常规的稳定整合，不难回收到许多集落。免疫印迹证实Id1的蛋白表达升高(图4C)。靶基因的过度表达看来与内源性Id1蛋白的减少相关，提示反溃或自身调节起了作用。

迫使Id表达并不损伤ES细胞的自我更新也不阻断存在血清时的分化。在这些条件下，转染子与亲代ES细胞或空载体转染子没有显著不同。相反，在无血清的N2B27培养时，Id转染子虽然维持对LIF的依赖，但不需要BMP。这些细胞在单用LIF时可增殖，速度与用LIF加BMP培养的亲代ES细胞几乎无差别。培养物可传代多次而未分化形态或因子依赖性不改变。表达Oct4和Nanog mRNA证实了ES细胞表型(图4D)。由于严格测试到Id表达能替代血清或BMP/GFP，我们在N2B27中接种了单个细胞。只用LIF形成了未分化的传代细胞集落，其产生频率(10％)与用LIF加BMP培养分离细胞形成的集落相当(表)。

Id蛋白对ES细胞分化具有谱系特异性阻抑作用

在我们的培养物中，LIF为Id转染子自我更新所必须，因为Id不会完全阻抑ES细胞的分化。如果撤除含血清培养基中的LIF，Id转染细胞象亲代ES细胞那样分化。在粘附性培养中，它们主要产生扁平状上皮样细胞和一些成纤维细胞。凝聚时它们形成胚胎样小体并表达中胚层(T)和内胚层(Hnf4)标记(资料未显示)，自发产生的收缩性表明有心肌细胞分化。然而，在缺乏LIF的N2B27培养时，Id转染子的表现与其它ES细胞不同。以形态学和Sox1-GFP激活评估的神经原分化很少(图5A)。而是这些转染子分化成扁平上皮样细胞的片层，类似于只接触BMP的亲代ES细胞(cf图1A)。

我们制备了可逆性表达构建物来测试自我更新和阻抑神经原分化是否依赖于持续性Id表达。我们制备了表达两侧加上loxP位点的Id1的46C ES细胞(fld1细胞)和后续Cre处理的Id1转基因已被切除的衍生克隆(fld1C)。切除Cre后，fld1C细胞显示没有FLAG-Id1，恢复到内源性Id1水平(图4C)。将fld1和fld1C细胞以克隆密度接种于含LIF或LIF加BMP的N2B27培养基中。fld1细胞在单用LIF时有效形成了干细胞集落，但fld1C细胞丢失了这种能力在无BMP的LIF培养时只产生分化的细胞(5B)。在单用N2B27培养时，fld1细胞无神经原分化，而fld1C细胞表现与亲代ES细胞相同，产生了高比例的TuJ阳性神经原(图5C)。

这些观察表明Id表达特异性地阻断了神经原谱系的定型，使分化中的ES细胞转变成另一结局，如在缺乏LIF时用BMP处理经常观察到那样(Ying等，2003)。表达Id的ES细胞完全依赖于LIF/STAT3才能抑制非神经原谱系的定型并维持多能性。

在CNS发育中已知Id蛋白可拮抗神经原性bHLH转录因子的作用(Lyden等，1999)。神经系发生前这些bHLH因子的体内作用没见报导，然而培养的ES细胞预计只在分化谱系中才能发现其mRNA的表达(Ramalho-Santos等，2002)因此我们研究了二种bHLH基因mash1和neurogenin2在Oct4选择的ES细胞中的可能表达。虽然未测到neurogenin2 mRNA高于背景水平，但mash1 mRNA看来较为丰富(图5D)。因此我们提出Id表达可能是防止过早表达mash1和其它促神经原bHLH因子所触发的ES细胞继续分化成为神经原所必须。这种作用也可能包括非bHLH伴侣，如Pax和Ets因子(Norton，2000)。

Id蛋白能以高亲合力结合遍在性HLH因子E蛋白(Norton，2000)。二者之一的过度表达可隔断可阻断另一因子的活性。为了评估Id蛋白是否为ES细胞增殖所需，我们通过游离型载体单独超转染，或与Id1或Id3共转染过度表达了E47蛋白。E47单独或与空载体共转染产生了很少和很小的不健康集落(图5E)。相反，E47和Id载体共转染产生了健康的ES细胞集落。共转染子集落外观与含血清培养基培养的单用Id或用空载体转染的细胞不能区别。这提示E47无显著毒性，但由于隔断了Id具有特异性生长抑制作用。如在其它类型细胞中所见，ES细胞增殖可能需要某种水平的游离Id(Norton，2000)。当转移到无LIF或BMP的N2B27中培养时，此共转染子发生神经原而不是非神经原分化，如Sox1-GFP激活所显示的那样(图5F)。因此E47中和了Id的神经原抑制作用。这与Id作用是限制与促神经原性bHLH因子相伴的E蛋白利用度相一致。

Nanog可绕过对BMP或血清的需求

提高各种同源域蛋白Nanog的水平在存在血清时赋予了ES细胞不依赖LIF/STAT3的自我更新(Chambers等，2003)。我们检验了过度表达Nanog的ES细胞在N2B27中培养时自我更新是否需要LIF和/或BMP。图6A显示表达两侧加上loxP位点的Nanog转基因的EF4细胞可在没有LIF或BMP的N2B27中增殖。这种现象直接归因于Nanog，因为产生的EF4C细胞(其Nanog转基因已被Cre重组酶切除)可迅速经历神经原分化。单项奖加入BMP对EF4细胞无明显作用，除非维持培养物不传代6天以上某些分化变得明显(见讨论)。除LIF外，加或不加BMP，EF4细胞更均匀地粘附于培养皿(图6A)，细胞群倍增速度提高。这与先前发现LIF/STAT3和Nanog在ES细胞中具有组合性作用相一致(Chambers等，2003)。

因为Nanog使BMP或血清的刺激作用成为多余，我们提问EF4细胞是否表达Id？在不含LIF或BMP的N2B27中培养过夜后，亲代E14Tg2a细胞中Id1和Id3的表达显著下调。相反，EF4细胞中，Id1 mRNA降低然而仍有相当量，而Id3 mRNA确实增加(图6B)。可利用Nanog的过度表达来维持基本水平的Id组成性表达。

实验方法

ES细胞培养

不用饲养细胞维持ES细胞培养。对于无血清培养，将ES细胞接种在明胶包N2B27培养基中，添加10ng/ml LIF(Sigma)和10ng/ml BMP4或200ng/ml GDF6(R&DSystems)(Ying和Smith，2003)。每隔2-3天用不含酶的细胞分解缓冲液(Invitrogen)或0.025％胰蛋白酶/1％鸡血清传代细胞一次。将分解的细胞收集在N2B27中离心沉淀。吸去上清将细胞沉淀重悬于N2B27直接再接种。对于单细胞克隆，用预先装有N2B27液的移液器挑取单个细胞一滴10微升。将单个细胞滴转移到预先装有150微升N2B27的96孔板中各孔含有LIF或LIF加BMP。8天后，鉴定ES细胞集落并传代。为了产生嵌合体，将ES细胞注射到C57BI/6胚泡中。通过使雄性嵌合体与雌性C57BI/6交配测试种系传递。

在无血清培养基中ES细胞的衍生

取出妊娠第三天129品系小鼠的卵细胞，胚胎停育4天(Nichols等，1990)。将完整的胚泡接种在明胶包被的塑料板孔中，N2B27培养基添加有LIF(10ng/ml)。3-6天后，挑出每个外植体的中心团块，用PBS淋洗，置于一滴胰蛋白酶中几分钟。通过精细抽吸移液器中预先装载的培养基挑出细胞团，确保尽量不携带胰蛋白酶，轻轻研碎推到加有LIF和BMP(10ng/ml)的N2B27培养基的新鲜孔中。将得到的原代ES细胞集落在96孔板中分别传代。然后离心和吸取胰酶消化整个培养物，使其扩增用于再接种。

RNA分析

将Oct4-GIp ES细胞培养在嘌呤霉素中4天以去除分化细胞(Ying等，2002)。将纯化的ES细胞培养在完全培养基加LIF中24小时，然后用PBS洗一次，转移到N2B27培养基中过夜，然后用20ng/ml LIF、50ng/ml BMP4、LIF加BMP4、10ng/mlTGF-β1(所有均购自R&D Systems)或15％FCS刺激45分钟。用光循环仪(Roche)进行定量RT-PCR。数据按Oct4扩增标准化。按需要利用引物对和反应条件。对5微升等份的总RNA进行Northern杂交。

质粒构建和转染

Smad6和Smad7质粒为Hitoshi Niwa友好提供，FLAG加尾Id1质粒为Tetsuya Taga提供。用PCR扩增小鼠Id2、Id3的E47开放读框，克隆入pCR2.1中，经序列分析证实无突变。将表达载体以游离形式或稳定的整合形式导入ES细胞中。用Chambers等(2003)所述方法衍生两侧加上loxP位点的Id1和Cre切除产生的ES细胞。

免疫化学

将预先选出的Oct4-GiP ES细胞转移到N2B27培养基中过夜，然后用LIF(20ng/ml)、BMP4(50ng/ml)或LIF加BMP4刺激15分钟或1小时。用免疫印迹法(Cell Signalling Technology)检测磷酸化的stat3、smad1、erk1/2和p38。细胞裂解液和免疫沉淀物(Nakashima等，1997)采用抗-FLAG(Sigma)或抗-Stat3(Transduction Labs)印迹。如Ying等所述进行免疫染色。

参考文献

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表

转染后单个ES细胞在含有LIF加BMP，或只有LIF的无血清培养基中的增殖情况

	亲代ES细胞		Id1转染子
					LIF	LIF+BMP4	LIF	LIF+BMP4
	挑取的单个细胞数	96	192	192					192
8天后形成的集落数					1	12	19	22
	扩增的集落数	0	10	16					20

                          序列表

以下列出本发明具体实施方式所用的序列以及本发明的具体融合蛋白。

SEQ ID No：

1  小鼠Id3的氨基酸序列

2  大鼠Id3的氨基酸序列

3  犬Id3的氨基酸序列

4  人Id3的氨基酸序列

5  Tat的蛋白转导结构域

6  antp基因的蛋白转导结构域

7  Tat-人Id3融合物

8  antp基因-人Id3融合物

9  小鼠Id3-antp基因融合物

SEQ ID NO：1-小鼠Id3

MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSTEEPLSLLDDMNHCYSRLREL

VPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVIS

KDKRSFCH

SEQ ID NO：2-大鼠Id3

MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSAEEPLSLLDDMNHCYSRLREL

VPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVIS

KDKRSFCH

SEQ ID NO：3-犬Id3

MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLREL

VPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVIS

NDKRSFCH

SEQ ID NO：4-人Id3

MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLREL

VPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVIS

NDKRSFCH

SEQ IDNO：5-Tat的蛋白转导结构域

YGRKKRRQRRR

SEQ IDNO：6-antp基因的蛋白转导结构域

RQIKIWFQNRRMKWKK

SEQIDNO：7-Tat-人Id3融合物

YGRKKRRQRRRMKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLD

DMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHL

PIQTAELAPELVISNDKRSFCH

SEQ ID NO：8-antp基因-人Id3融合物

RQIKIWFQNRRMKWKKMKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPL

SLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPD

GPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCH

SEQ IDNO：9-小鼠Id3-antp基因融合物

MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSTEEPLSLLDDMNHCYSRLREL

VPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVIS

KDKRSFCHRQIKIWFQNRRMKWKK

Claims (55)

1.Id基因产物在促进培养的多能细胞自我更新中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将Id基因产物与gp130下游信号传导途径的激活剂联合应用。

3.联合应用

(i)能增强Id蛋白表达或活性的制剂；和

(ii)gp130下游信号传导途径激活剂

来促进培养的多能细胞的自我更新。

4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述gp130下游信号传导途径激活剂是LIF。

5.如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述多能细胞是胚胎干细胞。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胚胎干细胞是小鼠细胞或人的细胞。

7.如权利要求3-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述制剂(i)选自纤连蛋白、纤连蛋白受体激动剂、整合素信号传导激活剂、nanog和能诱导Id基因表达或Id蛋白活性的所有上述物质的同类物。

8.如权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括诱导Id基因的表达。

9.如权利要求1-8中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括用遗传方法操纵多能细胞使其表达Id基因。

10.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其特征在于，所述应用包括在多能细胞中导入含有Id基因的载体。

11.如权利要求1-11中任一项所述的用途，其特征在于，所述Id基因产物是Id蛋白。

12.一种促进培养的多能细胞自我更新的方法，该方法包括：(1)在细胞中表达Id基因或诱导Id基因的表达，或在含有Id蛋白的培养基中培养该细胞，和(2)激活gp130下游信号传导。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该方法包括在细胞中以游离体形式表达Id基因。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该方法包括表达含有诱导型启动子的游离型载体中的Id基因。

15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括通过在含有经gp130起作用的细胞因子的培养基中培养所述细胞来刺激gp130下游信号传导。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞因子选自：LIF、CNTF、心养蛋白、抑瘤蛋白M和IL-6加sIL-6受体的组合。

17.联合应用

(a)Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，而非通过TGF-β超家族受体起作用的制剂；和

(b)gp130下游信号传导途径激活剂；

来促进培养的多能细胞的自我更新。

18.一种培养ES细胞以促进ES细胞自我更新的方法，该方法包括将ES细胞维持在含有以下物质的培养基中：

(a)Id蛋白或Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，而非通过TGF-β超家族受体起作用的制剂；和

(b)gp130下游信号传导途径激活剂。

19.一种培养ES细胞的方法，该方法包括：

(a)任选在饲养细胞上，在存在通过gp130起作用的细胞因子和血清或血清提取物时，将ES细胞维持培养在多能状态；

(b)传代ES细胞至少一次；

(c)撤除培养基中的血清或血清提取物，如果存在饲养细胞则将其撤除，使该培养基不含饲养细胞、血清和血清提取物；和

(d)在存在(i)Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂而非通过TGF-β超家族受体起作用的制剂；和(ii)gp130下游信号传导途径激活剂时，继续维持ES细胞于多能状态。

20.一种获得转染的ES细胞群的方法，该方法包括：

(a)用编码操作性连接于一启动子的选择标记的构建物转染ES细胞，该启动子优先在ES细胞中表达该选择标记；

(b)接种这些ES细胞；

(c)在存在以下物质时培养该ES细胞：

(i)Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，而非通过TGF-β超家族受体起作用的激活剂；和

(ii)gp130下游信号传导途径激活剂；和

(d)选出表达该选择标记的细胞。

21.一种培养ES细胞的方法，该方法包括将单个SE细胞转移到培养容器中，并在存在以下物质时培养ES细胞：

(a)Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，而非通过TGF-β超家族受体起作用的制剂；和

(b)gp130下游信号传导途径激活剂，

从而获得ES细胞的克隆群体，该群体中的每一个细胞都是单个ES细胞的子代。

22.一种引导ES细胞最终分化为非神经外胚层(non-neurectodermal)的方法，该方法包括：

(a)在存在通过gp130起作用的细胞因子和Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，而非通过TGF-β超家族受体起作用的制剂时维持ES细胞，和

(b)撤除该细胞因子，同时

(c1)维持Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，和/或

(c2)加入其它能引导分化的信号传导分子。

23.一种用于ES细胞自我更新的培养基，该培养基包含：

(1)基础培养基；

(2)Id基因表达和/或Id蛋白活性的直接激活剂或效应剂，而非通过TGF-β超家族受体起作用的制剂；

(3)gp130下游信号传导途径激活剂；和

(4)铁转运蛋白；

其中所述培养基不含血清或血清提取物。

24.一种从胚泡产生多能细胞的方法，该方法包括：

(1)获得胚泡；

(2)在存在gp130下游信号传导途径激活剂时培养该胚泡获得内细胞团；

(3)分解该内细胞团；

(4)从该分解的内细胞团分离细胞；和

(5)在存在gp130下游信号传导途径激活剂和Id基因表达激活剂或Id基因表达产物时培养分离的细胞。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，该方法包括用LIF培养胚泡。

26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，该方法包括联用LIF和BMP受体激动剂培养分离的细胞。

27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括培养胚泡2-4天。

28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括用无血清培养基培养分离的细胞。

29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括用无血清培养基培养胚泡。

30.如权利要求24-29中任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括在缺乏BMP受体激动剂时培养胚泡。

31.一种载体，其含有操作性连接于一启动子的Id基因。

32.如权利要求31所述的载体。其特征在于，所述启动子是诱导型启动子。

33.如权利要求31或32所述的载体。其特征在于，所述载体是游离型载体

34.一种培养基，其含有诱导Id蛋白表达的制剂，而不含有通过TGF-β超家族受体起作用的制剂。

35.一种含有Id蛋白的培养基。

36.如权利要求35所述的培养基，其特征在于，该培养基含有连接于一转位结构域的Id蛋白，以促进该Id蛋白通过多能细胞的细胞膜转位。

37.如权利要求35或36所述的培养基，其特征在于，该培养基含有与TAT、VP22或穿透蛋白相连的Id蛋白。

38.一种组合物，其含有Id蛋白和转位结构域。

39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有融合蛋白。

40.如权利要求38或39所述的组合物，其特征在于，所述转位结构域包括TAT、VP22或穿透蛋白。

41.一种能提高多能细胞中Id蛋白活性的制剂在促进多能细胞自我更新中的应用。

42.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述制剂能提高细胞中Id蛋白的量。

43.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述制剂含有权利要求38-40中任一项所述的组合物。

44.一种在存在gp130信号信号传导和Id蛋白活性和/或表达时体外培养多能细胞所获得的细胞。

45.一种获得分化细胞的方法，该方法包括：

(1a)在细胞中表达Id基因或诱导Id基因的表达，和

(1b)激活该细胞中的gp130下游信号传导；

(2)分化该细胞；和

(3)获得分化的细胞。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，步骤(1)的细胞含有的构建物中，编码选择标记的核苷酸序列操作性连接于一启动子，该启动子可在所需细胞中优先表达此选择标记。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，该方法包括选择表达所述选择标记的细胞。

48.一种用权利要求45-47中任一项所述方法获得的细胞。

49.一种获得多能细胞的方法，该方法包括：

在细胞中表达Id基因或诱导Id基因的表达，或在含有Id蛋白的培养基中培养细胞，并激活该细胞的gp130下游信号传导，其中所述细胞获自胎儿或成人的体细胞或组织。

50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述多能细胞的特征是Rex1、Oct4和nanog阳性。

51.一种用权利要求49-50中任一项所述方法获得的细胞。

52.一种测试其活性能替代Id蛋白的因子的试验，该试验包括：

(1)在存在Id蛋白活性和gp130下游信号传导时培养细胞，从而维持该细胞于多能状态；

(2)去除或降低Id蛋白的活性；

(3)将所述因子引入该细胞；和

(4)测定该细胞是否维持于多能状态或者发生分化。

53.如权利要求52所述的试验，其特征在于，(1)中，在存在Id蛋白活性时培养所述细胞包括：(a)表达Id基因，(b)诱导Id基因表达或(b)在培养该细胞的培养基中加入Id蛋白。

54.如权利要求52或53所述的试验，其特征在于，将细胞因子加入细胞中包括：(a)表达该因子，或(b)在培养该细胞的培养基中加入该因子。

55.一种按权利要求52-54中任一项所述方法获得的细胞因子。

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