CN1646562A

CN1646562A - 多能性决定因子及其应用

Info

Publication number: CN1646562A
Application number: CNA038076519A
Authority: CN
Inventors: I·钱伯斯; A·G·史密斯
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2005-07-27
Also published as: DE60304037D1; DK1698639T3; EP1698639A3; US20050255573A1; ES2308616T3; DE60320599D1; DK1470155T3; KR20040093699A; US20100144039A1; GB0202149D0; ATE320446T1; DE60320599T2; EP1698639B1; JP2005536183A; US7687266B2; EP1698639A2; WO2003064463A2; EP1470155A2; WO2003064463B1; EP1470155B1

Abstract

本发明描述的是一种多能性决定因子，该因子在缺乏gp130激活的情况下在细胞内发挥作用并且将多能细胞维持于多能状态，该因子维持或者产生了人类干细胞的多能性，该因子维持或者产生了小鼠ES细胞的多能性，并且该因子维持或者产生了来自非容许性小鼠品系干细胞的多能性。该因子和编码或者激活该因子的载体被用于维持和产生多能细胞，特别是高等哺乳类(包括人类)的多能细胞。

Description

多能性决定因子及其应用

本发明涉及到多能性决定因子(pluripotency determining factors)以及这些因子的应用。本发明特别涉及到对小鼠、人类和其它物种多能细胞培养物的维持和衍生化。

来自于小鼠的特定品系的胚胎干细胞(ES)可通过提供某种细胞因子而在培养物中进行衍生化和维持在多能状态下，该细胞因子通过LIF受体/gp130复合体而激活信号转导。然而，该方法被限制于小鼠并且不足以用于人类多能细胞的繁殖。

细胞外活性ESRF的发现(Dani et al，1998)为依赖于LIF受体/gp130的途径对ES特征的维持提供了证据。然而，ESRF未经充分地鉴定并且除gp130细胞因子之外的细胞外调节物的分子特性尚属未知。

另外，多能性的转录决定未被完全了解。gp130靶STAT3和POU因子Oct-4被认为具有重要的作用，但是这些分子单独不足以特化ES细胞的特征。

WO 02/097090描述了通过检视核苷酸序列数据库而对ECAT(ES细胞相关转录物)基因的鉴定，以及随后对该鼠类和人类ECAT基因的表达模式的分析。WO 02/097090还描述了探针对于鉴定ES细胞的应用以及使用ECAT基因对ES细胞的选择性分离。Oct-4为一种ECAT基因以及多能细胞的特异性标记物，尽管它还在卵母细胞、分裂胚胎(cleavage embryos)和卵圆柱期有所表达。

WO 01/66697描述了ES细胞在无动物血清并含成纤维细胞生长因子的培养基中的培养。在优选的情况下这些ES细胞在成纤维细胞饲养层存在的情况下生长。

本申请人名下的WO 97/30151描述了ESRF，这是一种能够抑制ES细胞分化的细胞因子。

WO 96/22693涉及到自体更新的造血干细胞的维持。特别地，WO96/22693描述了一种能够将造血干细胞维持在未分化状态并且支持未分化的造血干细胞繁殖的“F因子”。

Berger C.N.和Sturm K.S.，Growth Factors 1997，第14卷，第145-159页描述了ES细胞在缺乏外源LIF和饲养细胞情况下的自体更新。但是，Berger和Sturm并未描述能够在这些条件下促进ES细胞进行自体更新的任何因子的分离。

Genbank编号AK010332，2001和AK022643，2000提供了含有蛋白的同源框结构域的小鼠和人类cDNA的序列。没有属于这些分子的功能。

已知人类胚胎干细胞和胚胎生殖细胞多能性的维持可通过与外源细胞的饲养层(Amit et al.，Dev.Biol.2000)或其提取物(Xu et al.，Nat.Biotech 2001)的共培养而进行。但是，对于饲养细胞的依赖产生了大量的问题。饲养细胞和多能细胞的共培养可能掩盖了危险的培养条件。共培养有污染多能培养物/其所产生的分化产物的风险。为产生作为细胞的备选的饲养细胞提取物，必须维持和加工分离的饲养细胞群体并将提取物贮藏。由于该提取物未经鉴定，这可能成为另一个产品污染源。对多能细胞的分化的分析和加工受到饲养细胞或者不明确的提取物存在的损害。

对于其它多种物种，特别是猪、牛和大鼠，在培养物中衍生化和稳定地维持多能ES细胞仍是不可能的。

本发明的一种目的在于提供小鼠和人类多能细胞的改进的培养，并且本发明的具体的实施方案的一个目的在于在多能细胞的培养中消除对饲养细胞的依赖。一个进一步的目的为提供来自其它物种的多能细胞的衍生化和维持。

因此，本发明提供了一些哺乳动物多能性决定因子，在第一个实施方案中该因子的例子为在哺乳细胞中维持多能性的因子。

在ES细胞的培养中，该因子已被发现足以赋与这些细胞多能性。根据本发明，该因子可在多能细胞中维持于一个水平，该水平导致自体更新的多能表型的维持。该因子可为内源产生——该因子的细胞水平通过一种内源基因的激活而维持——或者被引入该细胞从而使该细胞的多能性表型稳定地维持。

本发明的一个特定的因子在细胞内发挥作用，将细胞维持于一种多能状态并且在细胞培养中该因子具有组成型活性。在上下文中，提及的细胞作用指的是活性位点位于该细胞内。由此，该因子并非，例如，细胞表面受体的配基，就象LIF和其它细胞因子那样，并且该因子的作用不依赖gp130受体的信号转导。

本发明进一步的多能性决定因子将多能性细胞维持于多能性状态，该细胞在缺乏gp130激活物的ES细胞培养基中培养。因此，该因子能够在缺乏gp130激活的情况下将哺乳类细胞维持于多能状态并且可在缺乏激活gp130-受体复合物的细胞因子的培养基中促进多能性的维持。在下面的实施例中，我们已经证明，表达本发明的优选的因子的细胞无需gp130刺激并且对视黄酸、3-甲氧基苯甲酰胺和聚集的反应表现出减弱的分化或者无分化，因此它们的反应于这些刺激的分化受到抑制。进一步，具体例子中的因子并非gp130的下游转录靶。本发明的因子已被分离并且适用于动物多能性细胞的维持，这些动物细胞包括小鼠、人类、灵长类、绵羊、大鼠、猪、母牛以及其它动物的细胞。本发明的一种因子维持了人类ES、EC或者EG细胞或者其它人类多能细胞的多能性。本发明的另一种因子维持了小鼠ES、EC或者EG细胞的多能性，并且在细胞内发挥作用并具有组成型活性。本发明的一种进一步的因子允许了来自非容许性小鼠品系的多能细胞在培养中的繁殖。

本发明的一个优势在于在培养中使多能细胞稳定增殖的能力。本发明的因子可被用于培养物以将人类和/或小鼠细胞维持于繁殖性的多能状态。本发明进一步提供了对来自非人类和小鼠的物种的ES细胞进行分离和维持的可能性，在此之前这是不可能的。

一个具体的实施方案的因子为一种转录因子。该因子在细胞核内发挥作用，引起了该ES细胞的自体更新。下文一个实施例中描述和使用的一种优选的因子含有同源域(homeodomain)。

在本发明的一种因子的使用中，在缺乏饲养层或者饲养细胞提取物以及缺乏gp130细胞因子的情况下，该因子将细胞维持于多能状态。由此，该因子的供给足以在培养中维持细胞的多能性。该因子可被加入至标准的ES细胞培养基或者被直接引入细胞，例如通过电穿孔或者微注射，或者通过本文披露的多种方法在该细胞中产生。在下文详述的本发明的具体实施例中，表达该因子的载体通过对细胞的附加体转染(episomal transfection)和对细胞的染色体整合而支持了不依赖细胞因子的ES细胞繁殖；一个进一步的选择是诱导或者增强编码该因子的内源序列的表达从而使ES细胞能够自体更新，该选择并非作为例子具体提出。

在本发明的一个进一步的实施方案中，该因子可根据其维持非LIF反应性细胞(LIF non-responsive cells)于多能状态的性质而鉴定。

该因子在适当的情况下为一种具有200到400个氨基酸的多肽。特定情况下，本发明的小鼠多能性决定因子为SEQ ID NO 2，人类多能性决定因子为SEQ ID NO 4，大鼠多能性决定因子为SEQ ID NO 6，猕猴多能性决定因子为SEQ ID NO 8。

本发明的第二个方面在于一种因子，该因子将细胞维持于一种多能状态，在细胞内发挥作用并且含有一种同源域，特别是与SEQ ID NO：2、4、6或者8的同源域具有至少50％的序列一致性，或者相对于用于给定物种细胞的因子，该因子与同物种的多能性决定因子的该同源域具有至少50％的序列一致性。通常情况下，同源域在长度上约为60个氨基酸上下，并且本发明的因子含有一种同源域，在该同源域中任意一个20个氨基酸的片段均与SEQ ID NO：2、4、6或者8的同源域具有至少35％的序列一致性。在优选的情况下，该因子将非LIF反应性细胞维持于多能状态。

一个进一步的实施方案的因子是在缺乏饲养细胞和饲养细胞提取物的情况下将来自非容许性品系小鼠的外胚层培养细胞维持于多能状态的因子。第二种这样的因子是在缺乏饲养细胞和饲养细胞提取物的情况下将人胚胎衍生的细胞(包括ES和EG细胞)维持于多能状态的因子。

对饲养细胞或者饲养细胞提取物的规避具有降低非必需细胞对该培养物的污染的优点。小鼠细胞已被用作为人类多能细胞培养物的饲养细胞，并且因此本发明显著地降低了并且可能根除该人类多能细胞群体被非人类细胞污染的风险。如果ES细胞衍生产物被用于移植治疗，确保没有非人类细胞很可能是关键性的，无论对于细胞的初始分离还是所后的繁殖均是如此。

本发明还提供了该因子与另一种功能结构域的偶联物。第一种这样的偶联物包括第一和第二结构域，其中该第一结构域含有本发明的一种因子并且该第二结构域促进了该第一结构域被细胞的摄入，该结构域的例子为触角足(antennapedia)、HIV TAT蛋白或者HSV-1 VP22的蛋白质转导结构域(Schwarze et al.，2000)。因此，该偶联物可被用作为培养基组分。对于第二种结构域，一个进一步的选择是包括一种核定位序列以辅助该因子在摄入细胞后向细胞核的运送。

为使该第一结构域在应用时从该第二结构域中释放，一种优选的偶联物的第一结构域可在该细胞中从第二结构域上切去。该第一结构域与第二结构域的连接可通过二硫桥——它允许了该第一结构域在该细胞的还原性环境中的释放。该第一结构域与第二结构域可共价连接，以允许该连接通过存在于该细胞的一种蛋白酶而切去。对于第二种结构域，可任选地进一步含有调控该因子的活性序列，例如类固醇激素受体(Picard，2000)。

本发明的进一步分离的多肽包括(a)含有SEQ ID NO：2、4、6或者8所设定的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的天然变体；(c)(a)或者(b)的定向进化同源物，以及(d)它们的具有生物活性以及在诊断或者治疗上可用的片段、类似物和衍生物。

本发明的多肽可为一种重组多肽，天然多肽或者合成多肽，在优选的情况下为重组多肽。

术语“片段”、“衍生物”和“类似物”在涉及本发明的多肽时意指与该多肽基本保持相同的生物学功能或者活性的多肽。该本发明的多肽的片段、衍生物或者类似物可为(i)具有一个或者多个氨基酸残基被保守或者非保守氨基酸残基(在优选的情况下为保守的氨基酸残基)所替代的多肽片段、衍生物或者类似物，并且这样的替代氨基酸残基可为遗传密码所编码或非如此，或者(ii)具有一个或者多个含有取代基团的氨基酸残基的多肽的片段、衍生物或者类似物，或者(iii)成熟多肽与另一种化合物进行融合的多肽片段、衍生物或者类似物，例如一种用于提高该多肽的半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)，或者(iv)具有额外的氨基酸被融合入该成熟多肽的多肽片段、衍生物或者类似物，该氨基酸可用于，例如，促进该成熟多肽的纯化。这样的片段、衍生物和类似物被认为属于该领域的技术人员从本文指导所获知的范围。

本发明的多肽还可以被用于制备特异性结合于多能性决定因子表位、肽或者多肽的抗体。用于制备多克隆和单克隆抗体的方法在该领域中为人所熟知(例见，Harlow和Lane，Using Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999；以及Hurrell，J.G.R.，Ed.，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications，CRCPress，Inc.，Boca Raton，Fla.，1982，这些在此引为参考)。多克隆抗体可产生自多种动物，例如马、母牛、山羊、绵羊、犬、雏鸡、兔、小鼠以及大鼠。

多能性决定因子多肽的免疫原性可通过使用佐剂而提高，佐剂的例子如明矾(氢氧化铝)或者弗氏完全佐剂或者弗氏不完全佐剂。可用于免疫接种的多肽还包括融合多肽，例如多能性决定因子或其一部分与免疫球蛋白多肽或者麦芽糖结合蛋白的融合物。该多肽免疫原可为一全长分子或其部分。如果该多肽部分是“类半抗原”，这样的部分可有利地融入或者连接于一种大分子载体(例如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者破伤风类毒素)以用于免疫接种。

本文所使用的术语“抗体”包括多克隆抗体、亲合纯化的多克隆抗体、单克隆抗体以及抗原结合片段，例如F(ab’)2以及Fab蛋白酶解片段。经遗传工程处理的完整抗体或者片段，例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等等以及合成的抗原结合肽和多肽，同样包括在内。非人类抗体可通过仅仅将非人类的CDR嫁接入人类框架和恒定区而进行人源化，或者通过引入完整的非人类可变结构域(任选地，通过置换暴露残基而以类人类表面对其进行“遮盖”，其所产生的为“镶饰(veneered)”抗体)而进行人源化。在一些情况下，人源化抗体可在该人类可变区框架中维持非人类残基从而提高适当的结合特性。通过对抗体的人源化可提高生物半寿期并且降低对人类施用而造成的不良免疫反应的潜力。用于产生或者选择本发明可用的抗体的备选技术包括将淋巴细胞在体外暴露于多能性决定因子蛋白或者肽并且在噬菌体或者类似载体中对抗体展示文库进行选择(例如，通过使用免疫接种或者经标记的多能性决定因子蛋白或者肽)。

如果抗体与多能性决定因子以10⁶M^-1或者更高，在优选的情况下为10⁷M^-1或者更高，更为优选的情况下为10⁸M^-1或者更高，最为优选的情况下为10⁹M^-1或者更高的结合亲合力(Ka)结合，则抗体被定义为特异性结合。抗体的结合亲合力可通过已知的方法容易地测定(例如，通过Scatchard分析)。

该领域的技术人员所知的多种分析可被用于检测特异性地结合于多能性决定因子蛋白或者肽的抗体。示例性的分析在Using Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane(Eds.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1999有所详述。这样的分析的代表性例子包括并行免疫电泳(concurrent immunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA)、点印迹或者Western印迹分析、抑制或者竞争分析以及夹心式分析。另外，可比对抗体结合野生型和突变体多能性决定因子蛋白或者多肽而进行筛选。

本发明的多肽额外地包括SEQ ID NO：2、4、6和8的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽具有至少50％相似性(优选情况下至少50％的一致性)的多肽，该多肽在较优选的情况下与SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽具有至少90％相似性(较优选情况下至少90％的一致性)，更为优选的情况下与SEQ ID NO：2、4、6和8的多肽具有至少95％相似性(更为优选情况下至少95％的一致性)，本发明的多肽还包括这些多肽的一部分，该多肽的该部分一般含有至少30个氨基酸，并且更优选的情况下至少50个氨基酸。两个多肽之间的“相似性”通过将一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代与第二种多肽的序列相比较而测定。已知多种不同的方法用于计算序列相似性和一致性。一般情况下，实施这些计算的适当方法是使用诸如Smith-Waterman、BLAST或者FASTA这样的程序进行数据库搜索，并且使用一种或者优选情况下使用两种或甚至三种相似性表。Blosum和PAM(可接受点突变(Point Accepted Mutation))矩阵是用于数据库搜索和序列排列比较的合适的氨基酸相似性矩阵。如果使用了Smith-Waterman或FASTA，则保证开放缺隙罚分(opengap penalty)足够大是恰如其分的，并且如果初始的运行不能发现任何同源性序列则应尝试不同的算法——若以启发式算法BLAST或者FASTA开始更为如此。

本发明的另一个方面在于含有该因子或该偶联物的组合物，并且包括一种药物组合物，该组合物含有该因子或者偶联物，根据描述它们还有一种药学可接受的载体；本发明还包括一种细胞培养基，该培养基如上所述含有该因子或者偶联物。

含有本发明的因子和/或偶联物的细胞培养基可额外地含有一种或者多种选自GMEM、血清、血清替代品、必需氨基酸、β-巯基乙醇、丙酮酸盐和谷氨酰胺的组分。

该培养基任选地可进一步含有gp130的一种激活剂，适当的激活剂包括作用于LIF受体的细胞因子，例如LIF，以及与可溶的IL-6受体相组合的IL-6。该培养基可被用于维持多能ES细胞，尤其是ES、EC和EG细胞，并且用于多能细胞的自体更新，尤其是ES、EC和EG细胞。该培养基可被进一步用于维持体细胞，尤其是体干细胞，并且在本发明的一个特定的实施方案中提供了一种体细胞自体更新的方法，该方法包括在存在本培养基的情况下培养该细胞，并且在优选的情况下在该培养基中繁殖该细胞。该培养基的另一种用途是对多能细胞衍生的细胞进行维持和/或繁殖。

本发明的另一种应用在于扩大细胞群体，例如扩大体细胞群体。可利用本发明实施的一种活体外(ex vivo)治疗包括从患者体内取出细胞群体，在本发明的细胞培养基上培养这些细胞以使该细胞群体扩大并且随后将这些细胞移植或者重新引入该患者。

本发明的进一步培养方法包括使用本发明的因子同Oct-4的表达和/或Oct-4的激活相组合，从而维持和/或繁殖细胞。该因子可作为其本身或者根据本文描述通过偶联物或使用载体进行引入。可通过对内源Oct-4基因的表达进行上调或者向这些细胞引入含有Oct-4的表达载体而进行Oct-4的表达。本发明的因子和Oct-4的组合可被用于对这些细胞进行维持和/或自体更新和/或繁殖。该组合特别可被用于提供增强的多能细胞自体更新和/或增强的多能性维持。该组合可被进一步用于多能细胞群体的衍生化。在本发明的一个具体的实施方案中，已经发现该因子和Oct-4的一种组合引起了多能细胞改善的自体更新，并且这种改善被用于新多能细胞系的衍生化，特别是人类细胞，但也包括其它的动物，包括鼠类，例如小鼠和大鼠；灵长类，例如猴，特别是猕猴；猪；绵羊；以及牛的多能细胞。

多能细胞，特别是ES细胞，适合于通过在铺平板之前或之时转染胚泡而进行衍生化，例如在传统上使用饲养细胞的时候或者在内细胞团延展于平板之上的时候。该转染可在饲养层或者不在饲养层上对细胞进行实施，尽管避免待转染细胞与饲养细胞之间的任何接触是有利的。已知多能细胞的转基因是可在该阶段完成的，包括用于预移植的胚胎，因此，将一种本发明的因子进行表达而进行的转染用于衍生化稳定的多能细胞群体。

所述技术的另一种应用在于细胞或者细胞核的再编程(reprogramming)，并且因此本发明还提供了一种对体细胞的细胞核进行再编程的方法，该方法包括将该细胞同本发明的一种因子进行接触并且激活该细胞中的gp130信号转导，或者包括将该细胞与本发明的一种因子进行接触并且在该细胞中表达Oct-4。例如，使用含有编码本发明因子的核苷酸序列的第一种载体转染该细胞，并且使用含有编码一种LIF受体配基的核苷酸序列或者含有编码Oct-4的核苷酸序列的第二种载体转染该细胞，从而实施该再编程。

本发明额外地提供了编码本发明的因子的多核苷酸。这该因子的应用之中，可能提出不同的方法用于控制或者介导该因子的表达从而促进细胞在培养物或其它情况下中的多能性。因此，任选地在该多核苷酸中包括一个序列，该序列调控了该因子的表达。该序列可为一种启动子，并且还可以是使活性受控的启动子。本发明的进一步的多核苷酸编码了上文所述的偶联物。

为在某种给定的细胞内控制因子的水平可激活一种编码该因子并且存在于该细胞之中的基因。可使用内源或者外源启动子以及其它的调控元件，以及作用于这些调控元件的因子。一种方法是使用一种多核苷酸以用于向细胞的基因组中插入调控序列，其中该调控序列在插入时调控了一种编码该因子的基因的表达。通过这种方式可启动一种内源基因或者维持其表达。该调控序列可通过同源重组而插入编码该因子的原住基因(resident gene)。该调控序列可为一种受控的启动子——例如可使用一种诱导型启动子从而当培养基含有该诱导物时使该因子表达，除去该诱导物导致该因子的表达降低以及多能性表型的丧失。还可以包括入实现该启动子的去除或者灭活的序列，从而允许对该因子的表达进行进一步的控制。

在细胞中控制因子水平的另一种方法是设计或者选择与识别内源PDF基因的启动子序列的序列特异性DNA结合多肽结构域，例如通过使用噬菌体展示(Isalan和Choo，2001 Methods in Enzymology 340 p593-609)。这样的序列特异性DNA结合结构域可通过与转录激活结构域融合而被用于激活或者维持该内源PDF基因的转录。或者，这样的序列特异性DNA结合多肽结构域与沉默子结构域的融合可被用于降低PDF表达。另外，这些融合物可被连接于其它的结构域，该结构域促进该融合蛋白被该细胞的摄取。通过这种方法，作用于该内源PDF基因本身的分子可被对细胞进行施用或者在细胞内表达。

本发明的多核苷酸可以为RNA的形式或者DNA的形式，该DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。该DNA可为双链或者单链，单链可为编码链或者非编码(反义)链。编码该成熟多肽的编码序列可与在SEQ ID NO：1、3、5或7中所示的序列相同，可为不同的编码序列，该序列由于遗传密码子的冗余度和简并性而编码与该DNA相同的成熟多肽。

本发明的被分离的多核苷酸可编码(a)多肽分子，这些分子含有SEQ ID NO：2、4、6or8中的氨基酸序列；(b)(a)的天然变体；(c)(a)或者(b)的定向进化同源物，以及(d)它们的具有生物活性以及在诊断或者治疗上可用的片段、类似物和衍生物。

编码这些多肽的多核苷酸还可以包括额外的编码序列和/或非编码序列，例如内含子或者该成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。因此，对“多核苷酸”的引用包括仅仅含有多肽的编码序列的多核苷酸以及含有额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明进一步涉及本文上述多核苷酸的变体，该变体编码具有该指定氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。该多核苷酸的变体可为该多核苷酸的天然变体或者非天然变体。

由此，本发明包括SEQ ID NO：1、3、5或7中所示的多核苷酸，这些多核苷酸编码相同的成熟多肽，以及这些多核苷酸的变体，这些变体编码该因子的片段、衍生物或者类似物。这样的核苷酸变体包括缺失变体、替代变体和添加或者插入变体。

根据上文显示，该多核苷酸可具有一种编码序列，该序列为SEQID NO：1、3、5或7中所示的编码序列的天然变体。根据该领域所知，多核苷酸序列的一种替代形式可具有一个或者多个核苷酸的替代、缺失或者添加，这些在基本上并不改变该编码多肽的功能。

本发明进一步涉及到一些多核苷酸，这些多核苷酸与本文上述的一种或者多种序列杂交，如果这些序列间具有至少70％的一致性，在优选的情况下至少90％，更为优选的情况下至少95％。本发明特别地涉及到一些多核苷酸，这些多核苷酸在严苛的条件下与本文上述的多核苷酸进行杂交。本文所使用的术语“严苛的条件”意味着杂交仅仅在序列间存在至少95％一致性的情况下进行，在优选的情况下至少97％的一致性。在一个优选的实施方案中与本文上述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码一些多肽，这些多肽与SEQ ID NO：1、3、5或7的cDNA所编码的成熟多肽具有基本相同的生物功能或者活性。

或者，该多核苷酸可具有至少20个碱基，在优选的情况下至少30个碱基，更为优选的情况下至少50个碱基，这些碱基与上文所述的本发明的多核苷酸或者与其具有一定的一致性的多核苷酸杂交，并且它们维持或者不维持活性。例如，这样的多核苷酸可被用作为SEQID NO：1、3、5或7的多核苷酸的探针，例如，用于该多核苷酸的回收或者作为诊断探针或者PCR引物。

本发明还提供了用于表达本发明的因子的载体。第一种载体含有本文上述的本发明的一种多核苷酸。本发明下文更为详尽描述的一种实施例中所描述和使用的一种载体被设计用于转染一种细胞，从而使该因子在该细胞中表达并且使该被转染细胞维持于多能状态。通常情况下，这些载体含有以下可操作连接的元件：转录启动子；DNA片段，该片段含有本发明的多核苷酸；以及多腺苷酸化信号。该载体可任选地进一步编码一种选择性标记物，其选择用于鉴定摄入并且表达该载体的细胞。例如，该载体可编码抗生素抗性，通过向该培养物中添加抗生物以鉴定成功的转染子。在该细胞的转染后，该载体可被整合入染色体或者维持在染色体外，并且该载体上的编码序列被表达从而在该细胞中维持的该因子水平足以保持该细胞于多能状态。特定的载体被设计用于转染表达或者含有多瘤病毒大T抗原的细胞。这样的载体可具有多瘤病毒的复制起点，从而使该载体在多瘤病毒大T抗原存在的情况下稳定地在该细胞中维持。

通过在该载体中使用活性受控的启动子可以赋予该系统以进一步的控制和灵活性。因此，在转染之后，该启动子可处于一种非活性状态，从而允许该使用者对何时激活该启动子进行选择，例如，在使用可诱导启动子时可向培养基中加入该诱导物。作为备选，该启动子可在起始状态下被激活，但其活性可通过向培养基中加入一种抑制物质而降低或者关闭——这使得该使用者在将这些细胞维持于多能状态下一定时间后可以决定终止该载体中的多能性决定因子的表达，从而允许这些细胞进行分化并且从培养物中对任何残余的多能细胞进行基本清除。在分化子代的制备中需要除去未分化的细胞，因此本发明的要素提供了这一能力。一种合适的系统为tet调控系统(Baron & Bujard，2000)。该载体可经额外地构建从而通过位点特异性重组实现其随后的清除或者对编码该因子的序列的清除。

本发明的一个进一步的实施方案的载体含有一种核苷酸序列，该序列编码一种调控因子，其中该调控因子调控编码本发明的因子的基因。该调控因子可被用于激活或者打开或者增强该基因的表达，该基因可为一种内源基因或者可位于染色体外。这一特定的载体具有多种用途。可制备一种转基因的动物品系，该动物品系中编码多能性决定因子的一种基因被基本关闭。该转基因动物可随后被用于产生胚胎和多能细胞，该胚胎和细胞从该动物体内取出并且以该载体进行转染从而使该载体的调控因子开启该多能性决定因子的表达，实现对多能性细胞培养物的维持。或者，可产生一种双重转基因动物，其中含有该转录因子的载体以及一种多能性决定因子的可调控基因。后者在体内进行诱导并且从而动员干细胞。

该因子的一种主要应用为维持细胞于多能状态，无论直接还是通过编码该因子的核苷酸序列的表达均是如此。该多核苷酸可为一种对于该细胞来说是内源的序列，例如可激活该天然序列以获得对多能性的维持，或者可以使用一种被引入该细胞的核苷酸序列。该被引入序列也可以位于一种质粒上。编码该因子的核苷酸还可位于稳定整合的转基因之上。

本发明因此而提供了一种维持多能细胞群体的方法，该方法包括给该群体施用本发明的一种因子。一种进一步的培养方法是通过激活该细胞中的编码本发明因子的基因而将该细胞维持于多能状态。另一种用于将细胞维持于多能状态的进一步的培养方法包括在该细胞中维持或者提高某种基因的表达，该基因编码本发明的一种因子。

本发明的多能性决定因子还可被用于提高一种体细胞或者非多能性细胞的潜能。因此，本发明的一种方法包括通过将该细胞暴露于一种多能性决定因子而提高细胞的潜能，这一暴露任选地可通过将该因子引入该细胞或者在该细胞中表达编码该因子的核苷酸序列而进行。细胞潜能的提高可以为对该细胞的细胞核进行再程序化，从而导致该体细胞或者非多能性细胞被转变成为多能干细胞。或者，本发明的因子对细胞的作用可以是提高其潜能但是并不将其潜能提高至赋予其多能性的地步。一旦细胞的潜能有所提高，该细胞可随后分化成为一种不同的谱系，并且因此本发明的因子可被用于对一种给定细胞的谱系进行重新特化。

该因子实现了多种不同的获得多能细胞的策略的实施。在一种这样的策略中，通过产生一种转基因动物而对一种多能非人类细胞进行了分离，该动物含有一种构建体，其中一种编码本发明的因子的核苷酸序列处于一种受控启动子的控制之下。随后从该转基因动物体内获得转基因的胚，并且从该胚中获取某种细胞，例如外胚层细胞或者原生殖细胞。通过激活该启动子，该因子在该细胞内进行表达并且随后可分离多能细胞。因此，在该途径中该转基因动物被作为一种初始步骤，并且这一途径特别适于存在产生转基因动物程序的情况。在另一种途径中，例如适于无法制造转基因动物或者制备转基因动物技术过于苛刻的物种的途径，编码本发明的因子的一种核苷酸被引入处于新鲜分离的细胞群体中的某种细胞并且此后对多能细胞进行分离。在后一种途径中，来自新鲜分离的细胞群体的细胞被迅速转染，这就是说，在至少一个细胞被转染从而使该因子在其中被表达之前，不允许这些细胞在培养物中存留足以使其分化的时间。如上所述，在从不能制造转基因动物的哺乳动物或其它动物获得并且维持多能细胞的过程中，该途径具有特别的作用。因此，本发明还包括了可通过这些方法获得的转基因动物以及含有编码本发明的因子的核苷酸序列的转基因动物，该核苷酸序列处于一种可调控启动子的控制之下。

本文描述了一些方法，在这些方法中该因子以及功能类似物、变体、片段和衍生物被用于促进多能性的维持。本发明以及多能性决定因子的鉴定的另一个优点是，我们如今有机会设计这些多能性决定因子的拮抗剂，这些拮抗剂可被用于抑制多能性决定因子的活性或者作为这些因子的拮抗剂发挥作用。这些因子的拮抗剂可被用于促进某种多能细胞的分化，并且这在一些情况下具有用途，例如需要从培养物中或者体内清除多能细胞的情况下。本发明还实现了一些动物的产生，这些动物对于该因子是显性失活的，例如含有编码该因子基因的显性隐形变体或者其它显性失活突变体的动物。

因此，本发明还提供了一种组合物，该组合物含有一种药学可接受的载体以及本发明的一种因子的拮抗剂。一些拮抗剂可被用于在向患者引入多能细胞衍生的子代之前对多能细胞进行有效地清除，例如在细胞治疗之中，这样可避免诸如畸胎瘤和/或其它由于移植物被多能细胞的污染所导致的其它肿瘤。这可在体内或者体外应用。该拮抗剂的另一种应用是作为避孕剂。本发明的拮抗剂的进一步的应用通常为肿瘤的治疗，特别是与本发明的因子的不适当表达所相关的肿瘤。

本发明的提供了一些细胞，这些细胞中本发明的一种因子的表达或者活性受到了操作处理。这些细胞可被维持于一种多能状态。本发明的第一种细胞在超过2周的期间表达本发明的一种因子。本发明的进一步的细胞为(1)含有本发明的载体的细胞，(2)一种人类多能细胞，该细胞在缺乏饲养细胞以及缺乏饲养细胞提取物的情况下维持于多能状态，以及(3)一种细胞，该细胞含有一种编码本发明的一种因子的基因，其中该基因已被激活。

本发明的细胞还可以被用于对干扰本发明的因子功能的分子进行的筛选。一种这样的筛选包括，在存在本发明的因子的情况下培养一种多能细胞，该因子的存在可通过，例如，在细胞培养基中提供或者在该细胞中表达，该筛选还包括，在存在某种测试物质的情况下培养该细胞，并且观察是否该细胞的多能性表型有所变化。该分析可被用于选择该因子的拮抗剂或者其它干扰其活性的分子。该筛选还可被用于对具有诱导该细胞的分化功能的测试物质进行鉴定。

本发明的细胞还可以被用于药物发现的分析。本发明的细胞还可被用于细胞治疗，并且因此本发明的一种方法包括使用本发明的因子进行多能细胞的产生和/或维持，从中产生用于细胞治疗的细胞并且在细胞治疗中使用这些细胞。

本发明用于筛选cDNA文库的一种筛选方法包括，在多能细胞中进行该筛选，以及对一种自体更新表型进行选择。该筛选可以使用多能细胞，这些细胞对细胞因子无反应性，并且该方法因为对外在和内在因子均可由此而进行鉴定而具有优势。

本发明进一步提供了一种筛选cDNA文库的方法，该方法包括在多能细胞内进行一种互补分析。该方法可被用于对赋予自体更新表型的cDNA进行鉴定。

本发明还进一步提供了一种方法，该方法用于筛选将多能细胞维持于多能状态的因子，该方法包括：

提供一种多能细胞，该细胞表达本发明的一种多能性决定因子，该细胞被稳定地维持于一种多能状态，并且在其中该因子的表达可被控制；

对该细胞进行操作处理；

降低该多能性决定因子的表达；以及

对被维持于多能状态的细胞进行选择。

可以设计一些操作处理从而导致对外生因子、细胞表面受体、cDNA或者其它因子的筛选，并且合适的操作处理包括该细胞的遗传操作以及对培养细胞的培养基或者培养条件的操作处理。由此可产生适用于对一种因子的鉴定的筛选，该因子控制了编码本发明的一种多能性决定因子的内源基因的表达，或者该筛选适用于鉴定另一种因子，该因子将该细胞维持于一种多能状态。在优选的情况下，通过调控一种与编码该因子的核苷酸序列可操作地组合的受控启动子而控制该因子的表达，使该因子的表达降低，从而消除了该多能性决定因子的活性，该控制通过向培养该细胞的培养基中加入一种阻抑物而进行。随后可对保持多能的细胞进行分离，并且进行鉴定以测定替代多能性决定因子的因子的特征。

本发明的一种进一步筛选用于鉴定该内源基因的调控，并且本发明进一步提供了一种方法，该方法用于筛选一种因子，该因子调控了编码本发明的一种多能性决定因子的内源基因的表达，该方法包括：

(1)对侧生于该内源基因的基因组区域进行转录因子结合位点的分析；以及

(2)使用一种来自ES细胞的提取物对这些区域的片段进行筛选，从而鉴定该提取物中结合该片段的组分。

该基因组侧生于该内源基因并且引导该因子的多能细胞限制性表达的区域被优选地鉴定，该鉴定适当地通过报道构建体的转染而进行，从而使该筛选可在ES细胞提取物中鉴定一种或者多种组分，该组分据推定为多能性决定因子的转录因子。对该筛选结果的进一步分析可包括，研究该推定转录因子通过诸如细胞外物质而进行的控制是否已被鉴定。由此而鉴定的控制因子可被用于产生和/或维持多能哺乳细胞。

术语“定向进化同源物”表示获自某个物种的多肽或者蛋白质，该多肽或者蛋白质是来自一个不同物种的多肽或者蛋白质的功能对应物。这些定向进化同源物的序列差异是物种形成(speciation)的结果。

术语“等位基因变体”指的是一种基因的两种或者多种变化形式的任何一种，它们占据相同染色体位置。等位基因变体在天然情况下通过突变而产生，并且可导致种群中的表型多态。基因突变可为沉默突变(所编码的多肽中无变化)或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。

术语“表达载体”指的是一种线状或者环状DNA分子，该DNA含有一种编码目的多肽的片段，该片段与可使其转录的额外片段可操作地连接。这样的额外片段可包括启动子和终止子序列，并且可任选地包括一个或者多个复制起点、一个或者多种选择标记、一种增强子、一种多腺苷酸化信号等等。表达载体通常来自质粒或者病毒DNA，或者同时含有两种元件。

术语“被分离的”在被用于多核苷酸分子时指的是该多核苷酸已从其天然的遗传环境中被取出，由此而无其它外源的或者多余的编码序列，并且其所处形式适于基因工程蛋白生产系统中的应用。这样的被分离分子被分离自其天然环境并且包括cDNA和基因组克隆。本发明的被分离DNA分子通常无其所通常关联的其它基因，但可包括天然的5’和3’侧生区域，这些区域含有调控元件，例如启动子、增强子和终止子。关联区域的鉴定对于该领域的技术人员来说是明了的(例见，Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。当用于蛋白质时，术语“被分离的”表明的是该蛋白质处于不同于其天然环境的状态下，例如与血液和动物组织相分离。在一种优选的形式中，该被分离的蛋白基本上无其它的蛋白，特别是其它动物来源的蛋白。提供高纯度形式的蛋白是优选的，即，高于95％纯净，更优选的情况下高于99％纯净。

术语“可操作地连接”在用于DNA片段之时指的是这些片段经排列而使它们经组合而发挥主观所需的功能，例如，转录物起始于启动子并且延伸经过该编码片段至多腺苷酸化位点。

术语“多核苷酸”指的是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的一种单链或者双链聚合体，该链从5’读起至3’结束。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可从天然来源中分离、进行体外合成或者通过天然和合成分子的组合而制备。

有关多核苷酸分子的术语“互补物”指的是一些多核苷酸分子，这些分子与对照序列相比具有互补碱基序列并且方向相反。例如，序列5′ATGCACGGG3′互补于5′CCCGTGCAT3′。

术语“简并核苷酸序列”指的是一种核苷酸序列，该序列包括一个或者多个简并密码子(与编码某种多肽的对照多核苷酸序列相比)。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但是编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。

术语“启动子”指的是一种基因的一部分，该基因含有提供RNA聚合酶的结合并且起始转录的DNA序列。启动子序列通常可见于基因的5’非编码区域，但非总是如此。

在此本发明在下面的具体实施方案中进行描述，通过附图进行阐明，这些图中：

图1所示为质粒pPyCAGIP。

图2所示为侧生于多能性决定因子转基因的loxP的整合以及随后的除去。

图3所示为PDF cDNA的序列分析，其中：

(A)显示了该PDF同源域与多种不同类型同源域蛋白的关联性最近的代表的排列比较。该排列比较使用Clustal W而产生，使用MacBoxshade依PDF而进行，用阴影显示：深灰，所有序列一致；中灰，与PDF相一致；浅灰，与PDF类似。与PDF同源域的一致性百分比见右侧。

(B)所示为小鼠(Mm)PDF和人类(Hs)定向进化同源物(假想蛋白FLJ12581)的配对比较。一致的残基被加框。

(C)显示小鼠PDF cDNA的3’UTR含有一个B2重复。根据PDFcDNA和B2序列获取号K00132进行编号。B2的断裂RNA聚合酶III-启动子被加框。星号所示为本文所述的PDF cDNA与RIKEN cDNAAK010332之间有差别的碱基。

(D)显示了PDF的人类定向进化同源物在小鼠ES细胞中的活性。使用pPyCAGIP(无插入物)或者携带hPDF ORF插入物的衍生物对LRK1细胞进行了转染。对周边无分化细胞的碱性磷酸酶阳性细胞群体的数量进行计数，并且以无细胞因子的情况下所形成的数量与存在IL6/sIL6R的情况下所形成的数量之间的百分比进行表示。

图4显示体外的表达被限制于多能细胞，其中：

(A)所示为来自用于文库构建的MEF和来自MEF/ES细胞共培养物的RNA的比较杂交。各泳道中以1μg的pA+RNA上样，杂交使用PDF cDNA的探针(左)、GAPDH的探针(右)以及PDF ORF的探针(中)进行。所示大小(kb)的RNA标记迁移的位置示于左侧。

(B)所示为通过MEF/ES细胞共培养物(左)和E14Tg2a培养物中由分化细胞所包围的细胞的未分化细胞群体(右)的原位杂交所检测到的PDF转录物；条柱为50μm。

(C)显示细胞系中的表达限于ES、EC和EG细胞。所使用的RNA为PSMB，PC13.5，F9，PSA4，P19，EC细胞；CGR8，ES细胞；PE，体壁内胚层(parietal endoderm)细胞；PYS，体壁卵黄囊(parietal yolk sac)；NIH3T3，成纤维细胞；BAFB03，前B细胞；MEL，红白血癌细胞(erythroleukaemia)；B9，浆细胞瘤。

(D)显示PDF表达在ES分化之时受到抑制。RNA来自通过使用RA或者MBA进行所示天数的诱导而引起分化的E14Tg2a细胞。

(E)所示为成体组织中PDF可检测表达的缺乏。所使用的RNA为，1，副睾；2，睾丸；3，CGR8；4，脂肪细胞；5，肾脏；6，肝脏；7，心脏；8，脾脏；9，脑；10，骨髓；11，舌头；12，眼；13，输卵管；14，胸腺；15，骨骼肌；16，皮肤；17，卵巢；18，精囊(seminiferousvesicle)；19，肺脏。

(F)显示人类PDF RNA在EC中被表达。所使用的RNA来自胚胎癌细胞(GCT27C4)以及淋巴样(Jurkat)细胞。使用PDF、GADPH和Oct4(C，D)、PDF和GAPDH(E)以及hPDF和GAPDH(F)的探针进行连续杂交而进行Northern印迹分析。

图5显示了PDF的体内表达，其中PDF mDNA通过使用ORF探针进行的原位杂交而进行观察，并且：

(A)所示为移植前的胚胎。顶部一系列为单细胞、2细胞、6细胞和8细胞胚以及晚期桑椹胚。底部一系列为早期、延伸期、孵化期(hatched stage)和植入期(implanting stage)的胚泡。各组均以相同的放大倍数显示。

(B)所示为来自雌体(顶部)和雄体(底部)胚胎的E11.5生殖嵴。

图6显示了不依赖gp130的自体更新的可逆性，其中：

(A)提供了构建体的示意图。CAG框引导了PDF-IRES-pacpA转录物的表达。其随后继以转录终止子序列(STOP；SPA C2 MAZ)以及一个egfppA框。loxP位点位于该CAG框的第二个外显子中并且介于该终止子序列和egfp之间，从而在Cre介导的重组后，CAG引导了egfp的表达。

(B)显示了Cre切除之前(PDF-IRES-pac，pac探针)和之后(gfp)对转基因转录物的Northern印迹分析。该印迹连续地使用所示的探针进行杂交。E，E14Tg2a；EF1，携带Floxed转基因的E14Tg2a亚克隆；EF1C1，进行Cre介导的切除之后的EF1亚克隆。

(C)显示PDF表达的逆转恢复了依赖于LIF的自体更新。对ES细胞(ZIN40)、表达该Floxed PDF转基因的ES细胞以及它们经Cre切割的衍生细胞系进行分析，分析之前将其在所示的培养条件下以克隆密度进行铺平板：0，无添加；LIF，100u/ml LIF；hLIF-05，足以阻断10单位/ml LIF的LIF拮抗剂。六天培养之后对缺乏可分辨的分化细胞的碱性磷酸酶阳性细胞群体的百分比进行定量。

(D)所示为表达PDF的细胞以及它们经Cre切割的衍生物在缺乏细胞因子(0)、100u/ml LIF(LIF)或者存在足以阻断10单位/ml LIF的LIF拮抗剂(hLIF-05)的情况下的形态。这些细胞以克隆密度进行铺平板并且在4天培养后进行检测。

(E)所示为来自表达floxed转基因的E14Tg2a衍生物(EF4)或者经Cre切割的亚克隆(EF4C3)培养物的RNA的Northern印迹分析，这些RNA在暴露于RA或者MBA后第0、1、2、3或4天进行制备并且与Oct-4进行杂交。

图7所示为不依赖于gp130的ES细胞特征的可逆性，其中：

(A)通过聚集显示了分化。表达floxed转基因的E14Tg2a衍生物(EF4)或者经Cre切割的亚克隆(EF4C3)进行了心分化估测，该估测通过将单一胚体置于48孔板的一个孔中并且每天根据搏动细胞的存在对各孔进行评分而进行。

(B)所示为在存在视黄酸的情况下通过聚集的分化。通过TuJ免疫组织化学而对表达floxed转基因的E14Tg2a以及衍生物(EF4)或者经Cre切割的亚克隆(EF4C3)进行神经发生的估测。

(C)显示了经Cre缺失的细胞对于妊娠中期胚胎的参与效果。将EF1C1细胞注射进入MF1胚泡并且在转入代母后在E9.5下检测绿色荧光。

图8所示为PDF与其它已知的自体更新介质之间的关系，其中：

(A)显示不依赖于细胞因子的细胞群体的比例与附加型PDF表达水平相关。使用直接提高PDF表达水平的附加型载体(pPyPPGK＜pPyPCAG＜pPyCAGIP)转染LRK1细胞。进行12天的选择后，缺乏细胞因子情况下的自体更新细胞群体的比例通过相对于存在IL6/sIL6R情况下的数量来表示。数据为两次独立实验之平均。

(B)显示PDF并非STAT3的靶点。在RNA制备之前，使用LIF(L)或者GCSF(G)持续所示时间(分钟)对表达杂合GCSFR-gp130变体分子的ES细胞进行刺激，在该杂合分子中所有四个STAT3结合位点均通过从酪氨酸密码子向苯丙氨酸(Y126-275F)的突变而被消除或者其中阴性调控酪氨酸被类似地突变(Y118F)。通过使用针对PDF、GAPDH或者STAT3靶基因SOCS3的探针进行的连续杂交而实施Northern印迹分析。

(C)显示PDF在自体更新中不能代替Oct4。ES细胞使用线性化的pPyCAGIP衍生物进行转染并且在存在LIF的情况下进行培养，在该ES细胞中强力霉素反应性Oct4转基因维持了自体更新(ZHBTc4.1)，培养的条件使该转基因维持表达(0)或者被关闭(Dox)，在该ES细胞中强力霉素易感性Oct4转基因维持了自体更新(ZHBTc4.1)，该pPyCAGIP衍生物不携带插入物(MT)、携带Oct4(Oct)或者携带PDF(PDF)。在经过嘌呤霉素选择之后对平板进行染色并且测定未分化细胞群体的百分比。

图9显示了多能GCT 27X-1 hEC细胞在条件培养基中的维持，其中：

(A)显示了GCT 27X-1多能hEC细胞系，该细胞系通过常规手段在线粒体失活(mitotically inactivated)的STO细胞饲养层上维持。

(B)阐示了多能培养物，在常规密度下显示，这些培养物还可以在缺乏饲养细胞但通过将44到25％v/v的来自卵黄囊癌细胞系hEC的条件培养基添加到常规培养基中进行维持。

(C)在一个克隆密度下显示，该条件培养基从无饲养的GCT27X-1细胞培养物中的撤除导致了细胞分化的开始以及多能性表型的丧失。在相差光镜下进行拍照，10×(A、B)，4×(C)。

图10显示了对GCT27X-1 hEC细胞中内源hPDF表达的Northern印迹分析，其中在变性凝胶上分离了从GCT 27X-1细胞制备的聚腺苷酸化mRNA(3-3.5μg)，并且通过与对候选的人类PDF序列特异性的cDNA探针(～900bp)的Northern印迹杂交进行分析，该GCT 27X-1细胞在STO饲养细胞(27X-1+STO)上培养，或在无饲养细胞但添加条件培养基(27X-1-STO+CM)上培养。从STO细胞培养物(STO)以及E14Tg2a小鼠ES细胞培养物(E14Tg2a)中制备的PolyA+mRNA被包括入作为杂交对照。在两种GCT 27X-1培养物中均检测出一个～2.4kb的主要转录物以及～5.6kb的较少杂交转录物，证实了该hPDF基因在多能hEC细胞培养物中的内源表达。在小鼠ES细胞中检测到的一个非常微弱的～2.2kb的杂交带是该小鼠多能细胞中的同源转录物的指示。正如所料，STO细胞mRNA未检测到杂交信号。放射自显影曝光使用增光屏在-70℃下持续8小时进行显示。

图11提供了描述用于显示自体更新在表达hPDF cDNA人类多能细胞系中的维持的实验策略的流程图。(CM＝条件培养基)

图12阐示了该floxed hPDF以及GFP对照载体构建体，其中：

(A)所示为8.8kb的floxed hPDF构建体，该构建体含有hPDFcDNA(～900bp)的可读框，该hPDF cDNA的可读框在人类巨细胞病毒(cytomegalovirus)即早期增强子(CMV IE)和人类肌动蛋白启动子下进行操控，位于一个提供了IRES介导的嘌呤霉素抗性基因的表达的双顺反子报道框的上游。被增强的GFP(eGFP)报道基因位于floxP位点的下游，通过发生在Cre介导的重组时的荧光提供了可视化。

(B)显示了pPyCAGegfplP(“GFP对照”)载体，该载体为一种类似构建体，其中(A)中的hPDF序列被位于该IRES-嘌呤霉素报道框的上游的eGFP序列替代并且被用于提供对照的“无hPDF”-表达转染子。

图13所示为转染子GCT 27X-1细胞群体的形态学评估。稳定转染子Floxed hPDF和GFP对照细胞群体通过进行10-15天嘌呤霉素选择培养后而建立，该培养在无STO饲养细胞并且存在或者不存在条件培养基的情况下进行。在经Leishman’s染色后细胞群体的形态学被评分为(A)“紧固”：维持了紧固的多能hEC表型的细胞群体，(B)“中等”：维持了一定的多能hEC表型的细胞群体以及(C)“松散”：完全松散并且分化的细胞群体。照像在相差光镜下进行，4×。

图14所示为在克隆分析中表达hPDF的hEC细胞的形态学，其中a-d显示了表达hPDF的hEC克隆系，这些细胞从转染开始在存在(hPDF D7)和不存在(hPDF E7)条件培养基连续地扩增，这些细胞在克隆密度下在含有(+CM)和不含(-CM)条件培养基的情况下培养12-14天；并且e-h显示了经转染的GFP对照克隆(GFP C15)和野生型hEC细胞(27X-1)，这些细胞在相同的条件下培养。在缺乏条件培养基的情况下，仅仅表达hPDF的hEC细胞能够维持多能hEC表型，而GFP对照和野生型hEC被诱导发生分化。照像在相差光镜下进行，10×。

图15所示为在克隆分析中表达hPDF的hEC细胞的自体更新。将表达hPDF的hEC克隆系(hPDF D7和E7)、经转染的GFP对照克隆(GFP C15)以及野生型hEC细胞(27X-1)在克隆密度下在含有(+CM，a-h)和不含(-CM，i-p)条件培养基的情况下培养12-14天。克隆内的多能性hEC细胞通过对CD30标记(b、d、f、h、j、l、n、p)的间接免疫荧光染色而进行鉴定，此处通过相同克隆内对所有细胞的比照Hoechst UV荧光进行显示(a、c、e、g、i、k、m、o)。在缺乏条件培养基的情况下，仅仅表达hPDF的hEC细胞群体能够维持多能表型，而转染的对照和野生型hEC细胞被诱导发生分化，除非在条件培养基中才能维持。在缺乏条件培养基的情况下，该hPDF E7克隆一般表现出紧固形态并且较之hPDF D7细胞具有CD30标记的较强检测。使用535/50nm(CD30)和UV330-380nm(Hoechst)滤光片在20×放大下对这些克隆进行观测。

图16所示为表达hPDF的hEC细胞在常规培养中的自体更新。表达hPDF的hEC细胞系E7自转染起已在连续缺乏STO饲养细胞以及条件培养基的情况下进行了扩增。在这些条件下培养超过8周后，这些在常规传代后显示的克隆细胞系连续地表现出hEC细胞的自体更新。照像在相差光镜下进行，10×。

实施例1

多能性决定因子

筛选设计

一种cDNA文库的功能性筛选被设计以达到两个标准。首先，cDNA被引入细胞并且维持于筛选期间的频率应高得足以使对105-106个独立cDNA的复合文库的筛选是可行的。这一要求可通过将表达多瘤病毒大T抗原的LRK1细胞(下文描述)和含有多瘤病毒起点的载体pPyCAGIP(图1)组合使用而实现。在我们所测试的附加型载体中，这种质粒给出了最高水平的cDNA表达(数据未出示)。进一步，与使用杀稻瘟素S、潮霉素B和Zeocin进行的选择相比，嘌呤霉素选择实现了对未转染ES细胞最迅速的消除，其中95％的未转染ES细胞在1天内被杀灭(数据未出示)。由此，混扰性生物活性的潜在来源被迅速地从培养物中除去。其次，被筛选的特征在被转染细胞系中存在的水平应低得足以使该筛选的进行无抑制性高背景。在理想的情况下该特征应在该宿主细胞系内并不存在但可被表达。LRK1细胞满足该主要标准。在体外分化期间，LIF基因座的表达有所提高(Rathjen et al.1990)并且可见到大量的ES克隆从分化的细胞单层中出现(Dani et al.1998)。这些重新出现的克隆中的多个由于LIF的作用而出现(Dani et al.1998)。维持了对LIF的反应性的E14/T细胞在分化后表现出这种背景自体更新。与之对比，丧失了对通过LIFR进行作用的细胞因子的反应性的细胞LRK1细胞在撤除IL6和sIL6R之后产生了远为更少的克隆。这一背景自体更新的降低足以使文库筛选通过这些细胞进行。

LRK1细胞的制备

为使cDNA文库筛选高效进行，需要一种能在高频度下使用含有多瘤病毒起点的载体进行超级转染的细胞。细胞系E14/T是E14Tg2a细胞的一种衍生物，它已经使用质粒pMGD20neo(Gassmann et al.1995)进行了转染并且支持超级转染型质粒的复制，该细胞系被选作为这种在撤除LIF下维持有效分化能力的细胞系。对该细胞系进行两个回合的瞄准LIFR基因座的基因靶向。所使用的靶向载体使用了与前人描述相同的同源臂(Li，Sendtner & Smith，1995)，但对于第一和第二回合的基因靶向，选择标记框分别被IRESBSDrpA和IREShphpA所代替。所产生的细胞系(LRK1)维持了高超级转染效率并且对LIF或者其它可通过LIFR的刺激引导ES细胞的自体更新的细胞因子不再具有反应性。LRK1细胞通过常规方法在存在IL6和sIL6R的情况下维持，该因子允许了通过gp130对ES细胞自体更新的刺激(Yoshida et al.，1994)。

文库构建

γ照射的原代小鼠胚胎成纤维细胞和ES细胞(ZHTc6细胞；Niwaet al 2000)的共培养在缺乏细胞因子的标准的ES培养基中起始和维持。共培养的细胞数量使得该MEF形成融合的单层并且ES细胞经接种以使这些细胞在生长3天后超过MEF。对代表性的平板进行的碱性磷酸酶(ES细胞的标记)染色使得能够在进行细胞裂解时对存在的ES细胞数进行估计。这给出了12∶1的ES RNA/MEF RNA比例。从20个F180瓶的细胞中制备RNA并且制备多腺苷酸化RNA。通过检测LIFR转录物的Northern印迹而监测RNA质量；仅仅产生明显的11kb条带而无可探测的降解的RNA被进一步使用。使用用于cDNA合成和质粒克隆的Superscript质粒系统(Life Technologies)所提供的试剂，通过寡聚d(T)引发从多腺苷酸化RNA中合成cDNA。在聚丙烯酰胺凝胶上对cDNA进行分级，在通过电洗脱进行的大于1kb的cDNA回收之后将cDNA连接进入经过XhoI/NotI消化的pPyCAGIP。在对大肠杆菌(E.coli)菌株DH10B进行电穿孔后产生了7.4×10⁵原代重组体的文库。在15cm皮氏培养皿上进行过夜培养后从细菌中制备DNA，各培养皿接种5×10⁴～10⁵个菌落。

文库筛选

通过电转化将来自各个文库的DNA(25μg)或者空载体引入LRK1细胞(6×10⁶)并且将这些细胞以10⁶/9cm培养皿或者5×10⁴/9cm培养皿进行接种并且在IL6/sIL6R中培养。两天之后，调换培养基以包括入嘌呤霉素并且从高密度平板中撤去细胞因子。在低密度平板中维持细胞因子以监测转染效率。每隔一天换一次培养基直至转染后第9天。此时在模拟转染平板中无细胞存活并且以空载体单独进行转染的平板仅含有分化的细胞。与之对比，使用文库DNA进行转染的平板中含有表现出形态上类似未转化细胞的克隆。因此从这些平板的细胞中制备染色体外DNA并且转入大肠杆菌DH10B。从10⁴个细菌菌落组中制备DNA并且将之重新引入LRK1细胞并重复上述选择过程。10个被筛选组中有2组表现出阳性并且在转染后14天从其中制备染色体外DNA。来自其中一组的DNA如下文进行进一步检测。在转入大肠杆菌DH10B后，从一个约250菌落组中制备DNA，将其重新引入LRK1细胞并且重复该选择过程。在转染后14或者19天从这些细胞中制备DNA。将这些DNA转入大肠杆菌DH10B，并且从转染后14天所收集的DNA中制备12个小量制备(miniprep)DNA，从转染后19天所收集的DNA中制备9个小量制备DNA。使用位于5’克隆位点上游的寡核苷酸对这些DNA进行测序。

结果的证实

对转染后19天制备的这9个DNA进行的序列分析显示，这些质粒中的一个含有一个部分cDNA，一个给出了无法解释的序列，并且两个给出了相同的序列，该序列与Genbank数据库的一个全长序列匹配。其余的5个质粒中的四个缺乏cDNA插入物并且在IRES内各自含有2个碱基对的缺失。最后的质粒缺乏cDNA插入物并且具有一个缺失，该缺失从该IRES中除去了进一步的275个碱基对。为证实这些质粒有些可赋予自体更新活性，一个含有等量的所有9个质粒的组被制备并且转入LRK1细胞并进行上述的选择过程。与使用空载体对照进行平行转染的细胞发生了分化相对比，使用9质粒DNA组进行转染的细胞表现出未分化的形态。为测定这9个质粒中哪一个赋予自体更新活性，单个质粒被转染进入LRK1细胞并且重复进行上述选择过程。携带部分cDNA的质粒、携带无法解释序列的质粒以及两类IRES内突变的代表的质粒均不能产生自体更新活性。与之对比，匹配该Genbank数据库中的全长序列的两个质粒均再现了该自体更新表型。这在形态学上并且通过标记碱性磷酸酶维持10天的表达进行判断。

对转染后14天制备的12个DNA进行的序列分析显示，其中4个匹配了上述两个质粒所匹配的相同序列。这些DNA的其中之一被转染进入LRK1细胞并且具有赋予不依赖于细胞因子的自体更新的能力，这是通过未分化克隆形态学的维持、碱性磷酸酶至少14天的持续表达以及Oct4至少8天的持续表达而判定的。进一步，PDF cDNA的转染与类似的所具有的cDNA序列被限制于开放读码框架的质粒进行的转染之间的比较显示PDF活性位于该ORF之中。

实施例2

多能性决定因子(PDF)转基因的可逆表达

为证明由PDF在ES细胞中的表达所导致的不依赖于细胞因子的多能表型是可逆的而制备了一种转基因，该转基因中编码PDF的转录单位可被位点特异性重组所切除。

作为起点，编码在初始的文库筛选中所鉴定的PDF的质粒通过而将一个loxP位点置于PDF启动子和翻译起始密码子之间并且将第二个loxP位点置于该多腺苷酸化信号之后而进行修饰。下游loxP位点之后为一个GFP指示基因的编码序列以及一个多腺苷酸化信号。通过该方法，具有经切割的侧生有loxP的PDF基因的细胞可通过其荧光颜色的变化而被鉴定(见图2)。

编码PDF的质粒在该载体的主链上被线性化并且转染进入种系(germ-line)感受态E14Tg2a细胞。在缺乏gp130刺激性细胞因子的培养基中对细胞进行生长的选择。对独立的克隆进行绿色荧光的检查并且将无荧光的克隆在缺乏细胞因子的情况下进行2周的扩增。为消除旁分泌(juxtacrine)的LIF家族成员的自体更新效应，在该期将向该培养基中加入LIF拮抗剂hLIF-05。此后将该培养物一分为二。这些培养物的第一批维持如前，而另一批维持于LIF中并且使用编码Cre(pCAGGCreGS)的质粒进行转染。两天之后，将这些细胞以低密度铺平板并且对单个克隆进行显微检查。绿色荧光克隆被扩增并且对它们的基因组DNA进行分析以证实转基因PDF序列的切除。

携带floxed PDF基因或者经切除的转基因的细胞被分别注射进入胚泡并且将该受体胚泡转入代母。在此后的多个时间点对胚胎进行解剖和分析。荧光显微技术允许测定携带经切除转基因的细胞占所有三个胚层的胎组织的比例。使一些嵌合体出生并且随后进行交配以证实种系从经处理的ES细胞中的传递。

实施例3

PDF mRNA在多能细胞中表达的分析

Northern印迹分析显示PDF mRNA在EC和ES中被表达，但在非多能的细胞系中无表达，例如NIH3T3成纤维细胞和B9髓样细胞。进一步，当ES细胞通过向培养物中添加视黄酸被诱导而分化时，PDF表达有所降低。原位杂交实验显示PDF mRNA在发育的第3.5天存在于内细胞团中，但不存在与晚期的胚泡或者卵圆柱期胚中。因此，其表达与本身是已经确立的多能干细胞系或者是产生干细胞的胚胎多能细胞系的细胞相关。

因此，通过Northern印迹的分析证明PDF mRNA在ES细胞/MEF共培养物中有所表达，cDNA文库从该培养物中被合成(图4A)。该分析还证明了PDF cDNA对小B2转录物的杂交。该B2杂交在使用限制于该PDF ORF的探针时消失。因此，随后的Northern和原位分析利用了该ORF探针。单独在MEF中未检测出表达，PDF表达在成纤维细胞与ES细胞共培养物中的诱导亦无证据(图4B)。这显示在共培养物中的ES细胞是PDF cDNA的来源。多个细胞系的分析显示该PDF表达被高度地限制，在体壁内胚层(parietal endoderm)、卵黄囊、成纤维细胞和造血细胞中未能检测到(图4C)。表达在ES细胞、EG细胞以及依赖于LIF(PSA4)和不依赖于LIF的胚胎瘤性细胞系中均有检测到。

PDF的人类定向进化同源物的检测表明对应的mRNA在胚胎瘤性细胞系中被表达但在淋巴样细胞系中无表达(图4E)。对多种成体小鼠组织进行了PDF mRNA的探测但通过对总RNA的Northern杂交未检测出表达(图4F)。紧接着对PDF mRNA在ES细胞分化期间的表达进行了分析。无论通过视黄酸还是3-甲氧基-苯甲酰胺处理所诱导的分化，PDF mRNA的水平均迅速地降低(图4D)。通过ES细胞培养物原位杂交的检查表明PDF的表达被限制于未分化细胞(图4B)，在该ES细胞培养物中LIF水平被降低以形成含有分化和未分化细胞的混合物的克隆。

Pdf mRNA在多能ES和EG细胞中被发现并且在小鼠和人类EC细胞中均被发现，但在其它类型的细胞系中未被发现(图4以及未出示数据)。Pdf表达在ES分化早期被下调，这符合其与多能干细胞特征的密切相关性。

实施例4

多能人类胚胎干细胞在缺乏饲养者/饲养者提取物的条件下的维持

在一种经γ照射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层上对人类ES细胞进行培养，培养在80％的DMEM培养基中进行，该培养基补充了100单位/ml LIF、1mM谷氨酰胺、0.1mM 2-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸、4ng/ml基础成纤维细胞生长因子以及20％的KnockOut SR(一种无血清制剂)(GIBCO-BRL)。

图1中所示的质粒(以及用人类PDF序列置换了小鼠PDF序列的类似质粒)在载体主链上被线性化并且转染进入人类ES细胞。该转染利用了Eiges等人描述的ExGen 500方法，只是该方案被扩大到使用了107人类ES细胞。转染后一日将细胞进行胰酶水解并且一分为二。一半细胞在嘌呤霉素抗性MEF层上以10⁴/cm²的密度铺平板；另一半在嘌呤霉素敏感的MEF层上以10⁴/cm²的密度铺平板。重铺平板两天之后，对嘌呤霉素敏感型MEF上的细胞进行胰酶水解并且以10⁴/cm²的密度铺于明胶处理的塑料平板上。向两组培养物中加入嘌呤霉素并且每3-4天换一次培养基。约14天后，检测生长于饲养上的多个嘌呤霉素抗性人类ES克隆在缺乏饲养层的条件下生长的能力，检测通过胰酶水解并且直接铺于明胶包埋的平板之上而进行。

在超过6周的期间对嘌呤霉素抗性的ES细胞系在缺乏饲养层的条件下连续传代和亚克隆的能力进行检测。

根据描述在切割floxed PDF表达框后，随后测试了这些细胞的分化能力(Eiges et al.2001)。

实施例5

PDF cDNA的特征鉴定

使用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de(Letunic et al.，2002；Schultz et al.，1998))对PDF序列中的可识别区域的搜索显示了在氨基酸残基96到155之间存在一种同源域，与已经鉴定的蛋白无其它的显著关联。通过BLAST进行的进一步分析显示PDF与NK2家族的多个成员的关联最为接近。但是，这一一致性从未高于50％(图3)。因此，PDF或是一种新的同源域家族的创始成员或是一种独特的变体同源域(Shashikant et al.，1991)。

PDF与关系最近的人类序列的比较显示了60％的整体一致性。序列保守性在该同源域上最为明显，其中两个序列为87％的一致(图3B)。这远远超过了PDF和其它小鼠蛋白的同源域之间的一致性水平，表明这是PDF的人类定向进化同源物。8个不一致氨基酸之中有6个位于围绕着α-螺旋1的N-末端臂上，该同源域的这些区域被认为与DNA靶的结合较为松散。该同源域之外有四个区域中超过4个氨基酸的连续片段是保守的。这些保守的区域中只有一个位于该同源域的N-末端，这是一种富含丝氨酸的基元，其余的位于该同源域的C-末端。该人类序列在这些C-末端一致基元的第一个和第二个之间含有一种7氨基酸的插入物。在小鼠序列中，该同源域与该C-末端保守序列之间有连成一片的46个氨基酸，其中每隔四个残基有一个色氨酸。进一步，在这些序列之中前31个氨基酸为序列WnsQTWTNPTW(n＝G、S、N并且s＝S、N)的简单重复。这些序列在人类中的保守性较为不引人注意，并且相对于小鼠序列含有一个短缺失。除了第16个残基外，每隔四个仍有一个色氨酸。

PDF mRNA的3′UTR中有一个B2重复元件，该元件定向于PDF转录的反方向(图3C)。是否该序列被RNA多聚酶III所转录尚不清楚，尽管该被断裂启动子(split promoter)的序列提示可能如此(Galliet al.，1981)。由于B2元件在胚胎细胞中高水平表达(Ryskov et al.，1983)，该B2在PDF mRNA的3′UTR中的存在可能直接通过转录干扰或者更为间接的途径参与了PDF基因表达的调控。

实施例6

hPDF在小鼠ES细胞中的功能的分析

通过将该人类ORF置于pPyCAGIP载体中并且对小鼠ES细胞进行转染而对该人类PDF定向进化类似物对小鼠PDF活性的再现进行了测试。这显示该人类序列能够引导不依赖于细胞因子的小鼠ES细胞的自体更新(图3)。该活性与小鼠PDF相比有所降低，估计是由于显著的序列趋异所导致。PDF效应的特异性通过类似的实验进行了测试，在该实验中与PDF关系最近的一种小鼠同源框基因的ORF(Nkx2.5)在ES细胞中被表达。在该情况下无显著的不依赖于细胞因子的自体更新；实际上所产生的细胞甚至在存在LIF的条件下在形态学上仍呈现分化。这提示细胞因子的不依赖性是特异地为由PDF赋予且并非同源域蛋白的共性。

实施例7

mPDF的体内表达

我们鉴定了PDF mRNA在体内的参与(图5)。在分裂的早期未见表达。PDF mRNA表达的第一个信号位于致密的桑椹胚中。引人注意的是该杂交信号位于内部细胞中，这是未来的内细胞团。在E3.5胚泡中表达被限于该内细胞团的细胞中并且在滋养外胚层中不存在。在随后的胚泡中PDF mRNA被进一步限制于外胚层并且排除于原内胚层之外。PDF转录物显现出时间波形，其最高水平在晚期桑椹胚和中期胚泡之间。在将要植入的胚泡中PDF mRNA水平下降到观察水平之下。但是，在间歇期的胚泡的外胚层中这些转录物明显保持可检测到。我们还检测了在原生殖细胞中的PDF表达，因为这些细胞可转变成为多能EG细胞(Matsui et al.，1991)。在E8.5，迁移的生殖细胞中表达并不明显，但是PDF mRNA在E11.5胚的生殖嵴中很容易被检测，其表达模式显示了原生殖细胞的定位(图5B)。

实施例8

PDF与其它已知的多能性介质之间的关系

ES细胞对于PDF水平提高的剂量反应通过在LRK1细胞的附加型表达进行了估测。这通过附加型构建体的转染而进行，这些构建体引导了不同水平的cDNA表达(图8A)。所产生的在缺乏细胞因子的条件下可自体更新的克隆的比例与预期的来自附加体的表达水平相关，该预期水平基于测量gfp表达水平的相似分析(数据未出示)。进一步，根据对携带整合PDF转基因的细胞的观察，向携带PDF的附加体的细胞培养物中添加LIF提高了自体更新，这是根据所形成的自体更新的克隆数量以及克隆形态学而进行估测的。通过将相同DNA转染进入表达CCE衍生的多瘤病毒大T抗原的细胞系MG1.19基本上获得了相同的结果(Gassmann et al.，1995)。

我们对gp130信号和PDF过表达的协同作用是否由于PDF基因为STAT3的转录靶所导致进行了研究。使用将gp130的胞内部分与GCSF-R的胞外部分相连而得的杂合受体，可以对ES细胞内的STAT3靶进行探索。对八种已知的SOCS家族成员的分析显示仅仅SOCS3在ES细胞中能够被LIF显著地刺激(图8B和未出示数据)，这些SOCS成员均为潜在的STAT靶。当通过将酪氨酸突变成为苯丙氨酸而使该受体的四个STAT结合位点受阻不能结合STAT3时，并不发生这种刺激(图8B)。与之对比，当负调控的酪氨酸被类似地突变时，SOCS3的诱导被增强并且维持，该结果与在这些细胞中能够所观察到的STAT3的维持激活相一致(Burdon et al.，1999)。与SOCS3的情况相反，表达杂合受体的细胞在LIF刺激或者G-CSF刺激之下无PDF表达的诱导(图8B)。

实施例9

PDF与Oct4的关系

随后使用ZHBTc4.1细胞检测了PDF在ES细胞的自体更新中替代Oct4的能力。这些细胞携带Oct的两种无效等位基因，但是它们的自体更形由于强力霉素反应性Oct4转基因的存在可被维持(Niwa etal.，2000)。当Oct4转基因的表达通过强力霉素的施用而被抑制时，细胞进行分化。使用不携带插入物、携带Oct4或者携带PDF的线性化pPyCAGIP序列对ZHBTc4.1细胞进行转染。如前所报道，强力霉素所诱导的Oct4转基因抑制所导致的分化受到了该Oct4质粒的阻止(Niwa et al.，2002)。但是，该PDF表达载体不能(图8C)。因此，尽管PDF在缺乏gp130所介导的gp130刺激的条件下可维持ES细胞的表型，但它在缺乏Oct4的情况下不能。

实施例10

ES细胞特征被PDF表达所可靠地维持

我们在ES细胞中检测了PDF转染的结果，该细胞不含多瘤病毒LT。使用了一种含有loxP的构建体以使该PDF cDNA可随后被Cre重组酶所切除。在对稳定整合子进行分离之后，可随后使用位点特异性重组以除去PDF ORF并且同时将GFP带入CAG启动子控制之下(图6A)。该PDF转基因的切除允许估测短期转基因表达所导致的细胞的遗传或者遗传外变化。在这些实验中我们致力于测试过表达PDF的细胞在缺乏gp130信号转导的情况下被克隆扩增的能力。我们希望检测两点；首先，是否增强的PDF表达在一定范围的环境内阻止了分化，以及其次，多能性和胚胎定殖(colonisation)能力在缺乏gp130信号转导的条件下是否被维持。

克隆转染子通过嘌呤霉素的选择进行分离并且通过Northern分析对PDF转基因mRNA的表达进行了证实(图6B)。细胞在低密度下进行接种并且在存在LIF拮抗物hLIF-05(Vernallis et al.，1997)的情况下通过两次传代扩增至少7天。hLIF-05阻断了所有已知的LIF-R配基参与LIF-R/gp130复合物的能力。平行处理的亲代细胞仅仅产生了不能扩增的分化细胞。与之对比，含有floxed的PDF-IRE-pac框的细胞系维持了未分化的形态并且持续扩增。随后加入LIF并且使用Cre对细胞进行瞬时转染。已被消除了PDF表达框的克隆通过GFP的表达以及嘌呤霉素敏感性的恢复而进行鉴定。使用两种独立的ES细胞系E14Tg2a和ZIN40实施这一方法。对多种所产生的克隆进行染色体扩展(chromosomal spread)的检测并且在所有情况下发现染色体扩增主要为40XY。

以PDF转染子及其Cre处理衍生物的表型的严格估测的形成进行克隆形成分析。在克隆密度下将细胞在培养基中铺平板，该培养基中被补以LIF、不含LIF或者补以LIF拮抗物hLIF-05。在培养6天后，对平板进行碱性磷酸酶活性的染色并且对仅仅由来分化细胞所组成的克隆的比例进行定量(图6C)。亲代或者表达GFP的细胞在缺乏LIF或者存在LIF拮抗物的情况下均不形成任何未分化的克隆。然而，PDF转染子产生了数量可观的这样的纯干细胞群体。添加LIF后这一比例上升至细胞群体的超过80％。在Cre介导的转基因的切除后，对LIF这一增强的反应也丧失了。

在存在和缺乏LIF的情况下表达PDF转基因的细胞形成完全未分化克隆的比例中的差异伴随着这些细胞群体形态学的变化(图6D)。在两种情况下这些群体均由小的未分化细胞组成，这些细胞具有较少的细胞质以及显著的核仁。没有LIF，该PDF表达子生长成为单层并且基本上同在存在LIF的情况下培养的亲代或者经Cre处理的衍生ES细胞不能区分。然而，LIF加PDF表达的组合导致这些细胞群体成为紧密压缩的细胞形态，其中这些细胞偏向于互相粘附而非在基层上生长出去。这与在饲养层上培养的ES细胞的“经典的”外表很相似。

PDF的受迫表达允许ES细胞在缺乏gp130刺激的情况下在使亲代细胞分化的培养条件下进行自体更新。我们进一步测定了PDF表达子细胞在暴露于在正常情况下导致分化的药剂之时是否可自体更新或者分化。当在暴露于3-甲氧基苯甲酰胺(MBA)或者全反视黄酸(RA)后进行四天的培养之时，表达PDF的细胞保持了一种未分化的外表，而GFP衍生物和亲代细胞的培养物均经受了形态学上的分化(数据未出示)。这些形态学特征在分子水平上反映于PDF表达子对Oct4的连续表达，与之相比较Cre衍生物显著地下调(图6E)。这些数据说明PDF转化子对于通常在单层培养物中引起分化的cue不起反应但是随着转基因的切除分化能力被恢复。

随后通过悬浮培养中的聚集研究了表达PDF的细胞对诱导分化的细胞相互作用进行反应的能力，该聚集是导致了多分化的胚样体从亲代ES细胞中形成的条件(Doetschman et al.，1985)。聚集培养8天后，胚样体被单独地铺于48孔碟的各个孔中并且随后每天对于自发的收缩进行计分，该收缩为心肌细胞分化的指标。图7A显示，PDF表达子中的心肌生成的发生率相对于其Cre衍生物降低了约50％。进一步，心肌细胞从PDF表达子中的出现相对于其Cre衍生物有所延迟。实际上在图7的图对于两类之间的差异有所低估，这是因为来自表达floxed的转基因的细胞的孔仅仅含小的搏动范围而来自Cre衍生细胞的孔中具有扩大的搏动范围，在某些情况下覆盖了整个结果(outgrowth)。胚样体还在聚集培养的最后四天期间被暴露于视黄酸并且在有利于神经元分化的条件下铺开(Bain et al.，1995；Li et al.，1998)。E14Tg2a细胞形成了大量神经元形态的细胞，这些细胞表达神经元特异型III b-微管蛋白(TuJ)(图7B)。LIF的连续存在抑制了TuJ阳性细胞的分化。TuJ阳性细胞的出现在来自表达floxed的转基因的ES细胞的培养物中也被阻断，但在其Cre衍生物中被恢复。然而，来自E14Tg2a(+LIF)和EF4培养物的孔中存留的细胞的外表并不一致。前者含有许多具有ES细胞形态的细胞，而PDF表达子具有更为松散的外表，这提示它们已经部分地分化。这些观察结果表明表达PDF的ES细胞在多细胞聚集环境下并未经受有效地分化，但是仍然诱导了某种程度的分化。最为显著的是，Cre衍生细胞系表现得未受到它们的克隆扩增期间的影响，该克隆扩增被增强的PDF表达所引导，这是因为在所有测试的条件下它们与正常的ES细胞相比具有可比较的分化潜能。

最后，我们研究了PDF的受迫表达是否在胚胎定殖特性的维持中规避了对于LIF-R/gp130介导的信号转导的需求。已经通过Cre介导的切除而除去了外源PDF序列的PDF转染子(在缺乏LIF的条件下被分离并且在存在LIF拮抗物的条件下培养超过一周)被注射进入小鼠胚泡。到目前为止我们已经估测了来自一个PDF转染子的Cre衍生细胞系。在妊娠中期对所产生的嵌合体的检测显示该细胞广泛分布于发育中的胚胎组织，该分布通过GFP的表达而揭示(图7D)。经类似注射的胚胎被分娩并且导致了活嵌合体的产生(表1)。

这些结果证实：(i)表达该PDF转基因的细胞以一种不依赖于细胞因子的方式进行自体更新；(ii)LIF与PDF转基因协同地发挥作用以产生增强的自体更新能力；并且(iii)PDF转基因表达的效果可随着转基因的切除被完全逆转。

细胞系	出生的小鼠	嵌合体
细胞系	出生的小鼠	嵌合体	EF1C1EF1C3EF1C5	72111	31011

表1获自PDF转染子的Cre衍生物的活体出生嵌合体

实施例11

PDF cDNA在人类多能细胞系中的表达

在本研究中，我们已经证明了多能性决定因子(hPDF)的人类cDNA在人类多能EC细胞系中表达之后所产生的依赖于因子的多能性维持。Monash Institute for Reproduction and Development(MIRD)Melbourne，Australia的Martin Pera副教授友情提供的这一克隆衍生的细胞系，生殖细胞瘤27X-1(GCT 27X-1)，此前已被证明产生了卵黄囊、滋养层、皮肤、软骨、腺上皮、神经外胚层以及异种移植物中的三个原胚层的其它组织。相同的细胞系还在体外表现出自发分化成为体细胞类型和胚外细胞类型(Pera et al.，1998)。该GCT 27X-1细胞系被常规地维持于丝裂失活的小鼠STO饲养细胞层(图9a)或者被维持于缺乏饲养细胞而加入了未鉴定的因子的条件之下(图9b)，该因子由人类卵黄囊瘤衍生的细胞系GCT44(MIRD，Melbourne，Australia的Martin Pera友情提供)的无饲养者培养物中分泌。这一条件培养基从低密度和克隆密度的GCT 27X-1细胞培养物中的撤除导致了它们完全分化(图9c)。

hPDF转录因子在多能GCT 27X-1 hEC细胞中被内源表达(图10)并且因此被推断在这种或者其它的人类多能细胞系的自体更新的维持中起着一定作用。

在此我们展示了GCT 27X-1无饲养细胞培养物中响应卵黄囊瘤衍生的培养基的撤除而产生的多能性丧失，以及在外源hPDF被表达的情况下的克隆水平的多能性的维持。

这些发现显示该hPDF转录因子提供了用于人类ES细胞的强力培养系统的基础。

实验策略

通过脂转染和电穿孔技术将一种含有人类cDNA序列的构建体转染进入该GCT 27X-1细胞，该人类cDNA含有hPDF基因的开放读码框架。缺乏饲养细胞的情况下，稳定的转染子克隆在添加或者不加入GCT-44衍生的条件培养基中确立，该培养基为支持hEC细胞的生长和维持所需。在存在嘌呤霉素抗生素的条件下对稳定的克隆进行选择，并且将表现出维持紧固的hEC表型(根据形态学进行判断)的群体捡出并且从两种条件中进行扩增。这些表达hPDF的克隆细胞系随后在常规密度和克隆密度下对其在缺乏条件培养基的条件下维持多能性表型的能力进行测试，使用野生型GCT 27X-1细胞和使用缺乏hPDF基因的类似构建体转染的GCT 27X-1细胞作为对照。

通过对标记物Cluster Designation 30(CD30)的间接的免疫荧光染色证实了表达PDF的细胞中的最终未分化的hEC细胞表型，该标记物为肿瘤坏死因子受体超家族的一个成员。CD30是人类EC细胞的一个特异性标记物并且在体外分化期间被下调(Latza et al.，1995；Pera et al.，1997)。在小鼠EC或者小鼠ES细胞上没有存在CD30的证据。

该实验策略被概括于流程表中(图11)。

材料和方法学

载体构建体

一个名为Floxed hPDF的8.8kb的构建体(图12a)含有hPDF cDNA的开放读码框架(～900bp)，该框架在一个人类巨细胞病毒即早期增强子(CEM IE)以及人类肌动蛋白启动子之下操作，在双顺反子报道框的上游，该框提供了IRES介导的嘌呤霉素抗性基因的表达，所有这些均包括在loxP重组位点之内。另外，该载体在loxP位点下游含有被增强的GFP报道基因，在发生Cre介导的重组的情况下通过荧光提供了可视效果。

类似的非floxed的构建体pPyCAGefplP(“GFP对照”载体)，(图12b)，被用作对照以向各个实验提供“非hPDF”表达性转染的hEC细胞，该构建体中Floxed的hPDF载体中的hPDF序列被IRES-嘌呤霉素报道框上游的GFP报道基因所替代。

hEC细胞培养

在丝裂失活的小鼠STO细胞饲养层上对GCT 27X-1细胞进行常规培养，培养在1∶1v/v的αMEM/Ham’s F-12培养基(Invitrogen，Groningen，荷兰)中进行，该培养基中补充了2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、2.7g/L碳酸氢钠(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO，USA)以及10％FCS(Commonwealth Serum Laboratories，CSL，Melbourne，澳大利亚)，并且在5％CO₂中维持于37℃下。细胞每7天进行传代并且在低于收集物的1/10的密度之下重铺平板，传代使用5mg/ml的分散酶(dispase)溶液(Sigma)进行消化，该溶液在上述培养基中制备。

为进行转染实验和克隆分析，GCT 27X-1细胞在不含STO饲养细胞但添加条件培养基的情况下进行培养，该培养基获自人类卵黄囊瘤衍生的细胞系CGT44(MIRD，Melbourne，Australia的Martin Pera友情提供的细胞)的无饲养者培养物，该培养基在如上所述添加的αMEM/Ham’s F-12培养基中占25％v/v。单细胞悬浮物通过胰酶消化而进行制备，该消化使用PBS缓冲液中制备的0.025％的胰酶(Invitrogen)/1mM EDTA(Sigma)/1％鸡血清(Invitrogen)溶液而进行。克隆密度的细胞培养物在200-300细胞/cm²下进行接种，低密度培养在5000细胞/cm²下进行接种。

GCT44细胞系在丝裂失活的小鼠STO细胞饲养层上进行常规培养，该培养在高葡萄糖DMEM培养基(Invitrogen)中进行，该培养基补充以2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、3.7g/L碳酸氢钠(Sigma)以及10％FCS(CSL)，并且在5％CO₂中维持于37℃下，但是传代通过使用制备于PBS缓冲液中的0.025％的胰酶(Invitrogen)/1mMEDTA(Sigma)溶液而进行消化。从无饲养者培养物中在第7、10和14天收集条件培养基，过滤灭菌并且在4℃下贮存最多2个月。如上所述对各批次的条件培养基维持GCT 27X-1 hEC细胞的无饲养克隆培养的能力(数据未出示)。

小鼠STO饲养细胞(MIRD，Melbourne，Australia的Martin Pera友情提供)在高葡萄糖DMEM培养基(Invitrogen)中进行常规培养，该培养基与GCT44培养一样进行补充。常规的STO培养通过使用制备于PBS缓冲液中的0.025％的胰酶(Invitrogen)/1mM EDTA(Sigma)溶液的消化而进行每周两次的传代。丝裂失活的STO细胞通过将常规培养物在16μg/ml的丝裂霉素C溶液(Sigma)进行2-3小时的保温并且在胰酶处理之前使用PBS进行两次洗涤而获得，该丝裂霉素C溶液在DMEM补充培养基(如上文)中制备。

为进行hEC细胞的常规形态学检测，培养物被固定并且如前所述使用Leishman’s进行染色(O’Brien，2001)。

细胞培养物通过使用Leica DMIL(Leica Microscopy Systems，Wetzlar，Germany)或者Nikon Diaphot 300(Nikon Inc.，Melville，NY，USA)进行的相差显微进行常规检测。在一台Nikon Diaphot 300显微镜上使用470/40nm的Nikon滤镜检测荧光对照GFP细胞培养物。在一台Leica DFC300 F成像系统捕获荧光数据。所有的细胞培养均使用Falcon(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ，USA)或者Nunc(Roskilde，Denmark)所提供的组织培养级塑料制品而进行。

hEC细胞的稳定整合转染

floxed hPDF和GFP对照载体通过标准的Pvu I限制性酶消化而各自被线性化并且通过电穿孔和脂转染策略被转染进入GCT 27X-1细胞。

电穿孔：通过胰酶消化制备20-30×10⁶个hEC细胞的一个单细胞悬浮物并且使用一台BTX ECM830方波电穿孔仪(BTX，San Diego，CA，USA)以40μg的线性化DNA对其转染，该仪器经设置以递送一个0.8kV的放电以及0.1ms的时间常数(3μF电容)。

脂转染：在转染之前将2×10⁶个hEC细胞在一个78.5cm²的培养皿中培养一天。根据制造商的指导，脂转染通过将细胞在无血清培养基中与60μg(1μg/ml)的Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)以及20μg线性化DNA一起保温6小时而进行。脂转染后48小时将这些细胞进行胰酶处理并且在与电冲孔的细胞相同的密度下铺平板。

转染的细胞以及对照的未转染细胞在2×10⁶细胞的密度下铺于78.5cm²皿中(～25,500细胞/cm²)并且在含和不含条件培养基的情况下培养直到15天，每3-4天更新培养基。在转染后2-3天以0.4μg/ml嘌呤霉素开始进行选择，然后于转染后10-15天开始以1.0μg/ml进行稳定整合子的有效选择。嘌呤霉素抗性的hEC克隆被挑取入2.0cm²的孔中并且进行扩增以用于随后的冷冻和进一步分析。为确保自体更新的GFP对照hEC细胞系的维持，仅仅来自条件培养基平板的克隆被挑取并且扩增。用于获得hEC细胞的稳定整合转染的所有方法基本上根据前文对于小鼠ES细胞的描述(O’Brien，2001)进行。

CD30免疫染色

制备用于间接免疫荧光染色的hEC细胞培养物，该染色使用小鼠抗人类CD30单克隆抗体(Dako，Glostrup，Denmark)进行，通过以PBS缓冲液洗涤两次、于冰上在乙醇中固定10分钟并且保存于-20℃下进行该制备。使用在0.1％Triton X-100(Sigma)/2％山羊血清(Invitrogen)/13.3％v/v BSA(Invitrogen)的染色稀释液中进行1∶20稀释的一抗进行染色，该染色稀释液制备于PBS缓冲液中。在以上的稀释缓冲液中以1∶200的稀释度使用一种CyTM3-偶联的山羊抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，Westgrove，USA)。使用535/50nm的Nikon滤镜观察CD30阳性细胞并且使用UV 330-380nm的Nikon滤镜进行比较Hoechst(Sigma)染色。在一台Leica DFC300 F成像系统上捕获荧光数据。用于免疫荧光染色的所有方法根据SCS Ltd的实验室方案的描述而进行。

Northern印迹分析

从GCT 27X-1细胞的分会合培养物(subconfluent culture)中制备PolyA+mRNA，该细胞的培养在STO饲养细胞上行和在不含饲养细胞但存在上述的条件培养基的情况下进行。另外从STO细胞和E14Tg2a小鼠ES细胞的常规培养物中制备PolyA+mRNA作为随后进行的杂交的对照。如前描述(O’Brien，2001)，RNA裂解物从细胞培养物中直接制备，PolyA+mRNA通过在寡聚(dT)纤维素(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，USA)上进行的亲和层析而分离。

在1×MOPS缓冲液中将所提取的mRNA样品(3-3.5μg)在1％w/v的琼脂糖/0.66M甲醛变性凝胶中进行电泳。将RNA转移至Hybond N+带电膜(Amersham Pharmacia Biotech，Amersham，Buckinghamshire，UK)并且与35P-标记的(Amersham Pharmacia Biotech)960 bp hPDFcDNA片段进行杂交，该片段通过EcoRI限制性酶消化从pPYCAGhPDFIP载体(载体由Ian Chambers，ISCR，Edingburgh，UK提供)中分离。Gapdh编码序列的一个800bp的HindIII/EcoRI片段被用于与一些膜进行再杂交以提供mRNA样品的上样对照(质粒由Kate Loveland提供，MIRD，Melbourne，Australia)。在-70℃下将膜在增光屏之间对Biomax MS(Kodak，Cedex，France)和HyperfilmMP(Amersham Pharmacia Biotech)X射线胶片进行达到24小时的曝光。印迹、杂交和常规的分子方法根据Sambrook等人的描述(1989)而进行。

结果

GCT 27X-1细胞的自体更新和分化

根据方法学中的描述建立GCT 27X-1 hEC细胞的常规培养。当在STO饲养细胞上培养时(图9a)或者在缺乏STO饲养细胞但是存在来自GCT 44的条件培养基时，在常规密度(图9b)和克隆密度下(图14g)均根据形态学的判断而证实了多能表型的维持。在低密度和克隆密度培养中，条件培养基从hEC细胞的无饲养者培养中的撤除显示了细胞分化的起始以及多能性的完全丧失(图9c)。进一步表明，尽管无饲养的hEC培养不能在含有低于25％(v/v)的条件培养基的培养物中维持多能性表型，以超过75％(v/v)的条件培养基替代常规培养基不能够完全地支持该培养物的存活和生长(数据未出示)。

hPDF在hEC细胞中的内源表达

为证实该hPDF基因在多能GCT 27X-1细胞中的内源表达，准备了一种PolyA+mRNA Northern印迹并且与一种放射标记的探针进行杂交，该探针对应于该floxed的hPDF载体中所含的～900bp的hPDFcDNA。图10中的结果显示，在饲养细胞上生长和在缺乏饲养细胞但是存在条件培养基的条件下生长的GCT 27X-1细胞中，该hPDF探针强烈地检测到了一条～2.4kb的杂交带。对于两种培养物均还检测到了第二条较少的～5.6kb大小的杂交转录物并且该转录物在不同RNA制备物的重复实验中被证实(数据未出示)。从常规的仅含STO细胞的培养物制备的RNA中未检测到杂交带。在小鼠E14Tg2a ES细胞的mRNA中检测到了微弱的～2.2kb杂交带，这显示在小鼠多能细胞中表达了一种同源的PDF转录物。不同凝胶泳道中的polyA+mRNA的相对量通过将膜与持家基因Gapdh进行再杂交而测定。这表明，与hEC细胞中所检测到的转录物相比，该小鼠PDF转录物在更为低的水平上被检测到(数据未给出)。

在GCT 27X-1 hEC细胞mRNA中所检测到的～2.4kb转录物对应于先前对于来自相同亲本细胞系的无潜能hEC细胞系GCT 27C4所观察到的转录物。

hPDF和对照GFP载体的转染

在使用GFP对照载体进行的试错转染实验中，电穿孔和脂转染策略均在GCT 27X-1细胞中给出了可比较的结果(数据未出示)。使用floxed的hPDF载体对GCT 27X-1 hEC细胞进行的转染通过电穿孔和脂转染两种方法进行实施，对比性的GFP对照载体转染仅仅通过脂转染方法进行(表2)。

在存在和不存在条件培养基的情况下，带有floxed的hPDF载体的稳定整合克隆均作为无饲养者培养物而被建立。在相同的条件下，对于同样数量的铺板细胞建立带有GFP对照载体的稳定整合克隆。对于两种载体，在10-15天建立了稳定的，体积适中的克隆，在该时间后未转染细胞的嘌呤霉素对照平板基本上生长被清除。

表2中的结果显示，对于floxed的hPDF载体，通过脂转染进行的GCT 27X-1细胞转染效率比起电穿孔有轻微的提高，但与应用GFP对照转染子相比，在存在条件培养基的情况下与无条件培养基的情况下，所建立的稳定的hPDF整合克隆的数量表现不出差异。尽管无条件培养基的被转染细胞的培养物并未表现出妨碍建立克隆的能力，但是，这些培养物的形态与floxed的hPDF和GFP对照转染子有所不同，讨论见以下部分(见表3)。

对于hPDF转染子，从两种条件下挑取表现出紧固的多能hEC表型的数量相当的原代克隆并且进行扩增。尽管GFP对照克隆在无条件培养基的情况下被建立以用于稳定群体中的形态学观察(见表3)，这些群体并未检出，这是由于在该时间框架期间在这些克隆中预期的分化启动。

转染的hPDF细胞被发现在存在或者不存在条件培养基的情况下建立克隆用了相同的时间，但是，在进行拣选之后在无条件培养基的情况下生长的群体所扩增的速度低于在条件培养基生长的群体。该观察类似于建立于含和不含LIF的培养物中的表达PDF的小鼠ES细胞的结果(见实施例8)。同样值得注意的是，在条件培养基上扩增的GFP对照群体与其hPDF对应物相比表现出略微更快的生长速度。

hPDF和GFP对照转染子的形态学观察

使用floxed hPDF和GFP对照载体进行的转染后建立并且在存在或者不存在条件培养基的情况下培养的稳定转染子群体在Leishman’s染色之后进行了形态学比较(表3)。这些克隆被评分为“紧固”、“中等”或者“松散”以分别描述维持紧固的多能性表型的嘌呤霉素抗性群体、开始分化同时维持一定的hEC表型的克隆以及完全松散和分化的克隆(图13a-c)。

如表3所示，对原代转化子进行的克隆形态学检测显示，尽管在条件培养基中hPDF转化子与GFP对照转化子相比表现出较高程度的稳固hEC形态，但hPDF转化子在无条件培养基的情况下保持多能表型的能力与GFP对照群体相比有提高——在该GFP对照群体中观察到了松散分化表型的增加。

尽管各个载体导致的转染子在形态学上的变化可能受到DNA在基因组中整合位点的影响，但floxed hPDF转染所产生的转染子表现出建立和维持多能表型的较高能力，一些正常情况下在克隆中启动分化和多能性丧失的条件之下甚至更为如此。

通常情况下，在无条件培养基的情况下培养的hPDF转染平板上所观察到的克隆在体积上小于在条件培养基中生长的克隆，尽管其中很多克隆表现出紧固的多能表型。当表达外源hPDF的hEC细胞在存在条件培养基的情况下进行培养时，发生协同效应的可能性仍然存在。

表达hPDF的转染子中多能性的维持

在某些通常启动GCT 27X-1细胞分化的条件下，表达hPDF的稳定转染子细胞系最终维持多能表型的能力通过间接的免疫荧光染色而被证实，该染色使用CD30标记物进行，该CD30标记物特异于多能hEC细胞并且不在分化细胞类型中表达。

在存在和不存在条件培养基的情况下，对六个表达hPDF的细胞系在克隆密度下进行培养，这些细胞系包括从转染开始便在无条件培养基的情况下建立和培养的一种细胞系。在与hPDF细胞系相同的条件下，GFP对照hPDF转染子细胞系(维持于条件培养基中以进行自体更新)中的四个以及未转染的GCT 27X-1 hEC细胞(同样自转染实验开始便维持于条件培养基中，无饲养细胞)在克隆密度下受到平行培养。在无条件培养基的情况下培养的GFP对照和GCT 27X-1细胞表现出克隆完全或明显的分化之时，进行形态学分析和CD30间接免疫荧光染色。被建立的未转染GCT 27X-1细胞被发现扩增克隆的速度快于GFP对照和hPDF细胞系。

表达hPDF cDNA的细胞系被证明在克隆密度下有无条件培养基均维持了多能表型，而GFP对照细胞和GCT 27X-1细胞仅仅在存在条件培养基的情况下维持多能性。

图14中的结果显示了两个hPDF克隆在连续存在(hPDF克隆D7)或者连续不存在(hPDF克隆E7)条件培养基的情况下从转染平板中扩增并且在克隆密度下进行有无条件培养基培养的两个hPDF克隆的形态学(图14a-d)。在两种条件下hPDF D7和E7克隆均显示出建立和维持表现多能细胞表型的hEC克隆的能力。GFP对照的平行克隆培养物C15以及未转染GCT 27X-1细胞的平行克隆培养物证实了这些细胞仅仅在连续存在条件培养基的情况下才能建立和维持多能hEC克隆的能力。在缺乏条件培养基的情况下，该C15和GCT27X-1细胞被诱导分化，没有或者仅有少量hEC细胞维持在松散形成的群体状态下(图14e-h)。

图15中的结果以个体克隆的相对CD30和Hoechst免疫荧光染色证实了上述形态学观察结果，这些群体来自hPDF D7、hPDF E7、GFPC15和GCT 27X-1细胞系，在存在和不存在条件培养基的情况下进行培养。所有的细胞系均在无饲养细胞并且存在条件培养基的情况下表现出维持自体更新的CD30阳性群体的能力(图15a-h)。由于GCT27X-1细胞建立大的扩增群体比转染细胞更为迅速，所以许多这些群体在周边开始分化，正如由过度生长(overgrowth)所预期的(图15g-h)。在同时缺乏饲养细胞和条件培养基的情况下，仅仅表达hPDF的hEC细胞能维持CD30阳性群体，而GFP对照和GCT 27X-1 hEC细胞不能维持自体更新的克隆(图15i-p)。同样，在GCT 27X-1克隆中所观察到的任何残余CD30阳性细胞可被归结为这些克隆更为迅速的扩增和过度生长(图15o-p)。

据观察，与hPDF D7细胞相比较，hPDF E7细胞系表现出通常较为紧固的hEC克隆形态(图14a-d；图15a、c、i、k)以及CD30标记物的较强检测(图15b、d、j、l)，并且可能反映了在各个克隆中DNA向基因组中的随机整合位点。hPDF E7细胞系最初建立在转染后同时缺乏STO饲养和条件培养基的情况下。在这些培养条件下进行超过8周的连续扩增之后，hPDF E7细胞系继续表现出自体更新的hEC细胞表型(图16)。

这表明，人类PDF cDNA在人类多能细胞系中的外源表达导致了多能表型在某些条件下的维持，这些条件在正常情况下导致这些细胞分化并且丧失自体更新的能力。

参考文献

Amit M.，Carpenter M.K.，Inokuma M.S.，Chiu C.P.，Harris C.P.，Waknitz M.A.，Itskovitz-Eldor J.and Thomson J.A.(2000)Dev.Biol.227，271-8.

Bain，G.，Kitchens，D.，Yao，M.，Huettner，J.E.，and Gottlieb，D.I.(1995).体外胚胎干细胞表达的神经特性.Dev Biol 168，342-357.

Baron，U.and Bujard(2000)，Meth.Enz.327，401-421.

Burdon，T.，Stracey，C.，Chambers，I.，Nichols，J.，and Smith，A.(1999).SHP-2和ERK信号传导的抑制促进小鼠胚胎干细胞的自我更新，DevBiol 210，30-43.

Dani，C，Chambers，I.，Johnstone，S.，Robertson，M.，Ebrahimi，B.，Saito，M.，Taga，T.，Li，M.，Burdon，T.，Nichols，J.，and Smith，A.(1998).LIF缺陷型细胞对干细胞的副分泌(paracrine)诱导：一种新的ES细胞调控途径，Dev Biol 203，149-162.

Doetschman，T.C.，Eistetter，H.，Katz，M.，Schmidt，W.，and Kemler，R.(1985).来源于胚泡的胚胎干细胞系的体外发育：内脏卵黄囊、血岛和肌钙的形成，J Embryol Exp Morphol87，27-45.

Dynan and Tijan(1985)Nature 316，774-78.

Eiges et al(2001)Current Biology，11：514-518

Galli，G.，Hofstetter，H.，and Birnstiel，M.L.(1981).真核tRNA基因中两个保守序列嵌段是主要启动子元件，Nature 294，626-631.

Gassmann，M.，Donoho，G.，and Berg，P.(1995).染色体外质粒载体在小鼠胚胎干细胞中的维持，Proc Natl Acad Sci USA 92，1292-1296.

Isalan and Choo(2001)Methods in Enzymology 340 593-609.

Latza，U.，Foss，H.D.，Durkop，H.，et al.(1995).胚胎癌中的CD30抗原以及可溶分子的胚胎发生和释放，Am.J.Pathol.146，463-471.

Letunic，I.，Goodstadt，L.，Dickens，N.J.，Doerks，T.，Schultz，J.，Mott，R.，Ciccarelli，F.，Copley，R.R.，Ponting，C.P.，and Bork，P.(2002).基于SMART结构域序列annotation resource的进展，Nucleic Acids Res30，242-244.

Li，M.，Sendtner，M.，and Smith，A.(1995).LIF受体在运动神经元中的主要功能，Nature 378，724-727.

Li，M.，Pevny，L.，Lovell-Badge，R.，and Smith，A.(1998).通过种系筛选从胚胎干细胞中产生纯化的神经前体，Curr Biol 8，971-974.

Matsui，Y.，Zsebo，K.，and Hogan，B.L.(1992).从培养的鼠原胚细胞产生多能胚胎干细胞，Cell 70，841-847.

Niwa，H.，Miyazaki，J.，and Smith，A.G.(2000).Oct-3/4的定量表达定义了ES细胞的分化、去分化或自我更新，Nat Genet 24，372-376.

Niwa，H.，Masui，S.，Chambers，I.，Smith，A.G.，and Miyazaki，J.(2002b).同源性POU结构域的表型补偿建立要求和Oct-3/4在胚胎干细胞中的一般反式激活功能，Mol Cell Biol 22，1526-1536.

O′Brien，C.M.(2001).胚胎干细胞特异性基因的鉴定和克隆，PhDthesis submission，Monash University，Australia.

Pera，M.F.，Bennett，W.，Cerretti，D.P.(1997).CD30和CD30配体在来自人胚细胞瘤培养细胞系中的表达，Lab Invest.76，497-504.

Pera，M.F.，and Herszfeld，D.，(1998)Reprod.Fertil.Develop.10551-555.

Pera，M.F.(1999).Biology of human testicular germ cell tumours.Repro.Med Rev.7，141-154.

Picard，D.(2000)，Meth.Enz.327，385-410.

Rathjen，P.D.，Nichols，J.，Toth，S.，Edwards，D.R.，Heath，J.K.，and Smith，A.G.(1990)，分化抑制活性的发育性程序化诱导和干细胞增殖的控制，Genes Dev 4，2308-2318.

Ryskov，A.P.，Ivanov，P.L.，Kramerov，D.A.，and Georgiev，G.P.(1983).小鼠遍在B2在多体和胞质poly(A)+RNAs中重复：单向和3’末端定位，Nucleic Acids Res 11，6541-6558.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989).分子克隆，CSHLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA.

Schultz，J.，Milpetz，F.，Bork，P.，and Ponting，C.P.(1998).SMART，一种简单的组件构建工具：信号结构域的鉴定，Proc Natl Acad Sci U SA 95，5857-5864.

Schwarze RS，Hruska KA & Dowdy SF，(2000)Trends Cell Biology，10：290-295.

Shashikant，C.S.，Utset，M.F.，Violette，S.M.，Wise，T.L.，Einat，P.，Einat，M.，Pendleton，J.W.，Schughart，K.，and Ruddle，F.H.(1991).小鼠发育中的homeobox基因，Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1，207-245.

Vernallis，A.B.，Hudson，K.R.，and Heath，J.K.(1997).白血病抑制因子受体拮抗剂抑制白血病抑制因子cardiotrophin-1，睫状神经营养因子和oncostatin M.JBC 272，26947-26952.

Xu C.，Inokuma M.S.et al.(2001)Nat.Biotech.19，971-974.

Yoshida，K.，Chambers，I.，Nichols，J.，Smith，A.，Saito，M.，Yasukawa，K.，Shoyab，M.，Taga，T.，and Kishimoto，T.(1994).通过直接激活gp130信号传导途径维持胚胎干细胞的多能表型，Mech Dev 45，163-171.

	Floxed hPDF载体		GFP对照载体
	Floxed hPDF载体		GFP对照载体		电穿孔	脂转染	脂转染
#被转染的hEC细胞	23×10⁶	24小时之前接种2×10⁶	24小时之前接种2×10⁶		电穿孔	脂转染	脂转染
#被转染的hEC细胞	23×10⁶	24小时之前接种2×10⁶	24小时之前接种2×10⁶	#每78.5cm²板上接种的被转染的hEC细胞	2×10⁶	t/f之后48小时铺平板2×10⁶	t/f之后48小时铺平板2×10⁶
在+CM中建立的稳定整合子	1∶5102(0.020％)392	1∶3597(0.028％)556	1∶3425(0.029％)584	#每78.5cm²板上接种的被转染的hEC细胞	2×10⁶	t/f之后48小时铺平板2×10⁶	t/f之后48小时铺平板2×10⁶
在+CM中建立的稳定整合子	1∶5102(0.020％)392	1∶3597(0.028％)556	1∶3425(0.029％)584	在-CM中建立的稳定整合子	1∶4902(0.020％)408	1∶3125(0.032％)640	1∶2809(0.036％)712
#挑取的原代克隆：+CM培养物	24	24	24	在-CM中建立的稳定整合子	1∶4902(0.020％)408	1∶3125(0.032％)640	1∶2809(0.036％)712
#挑取的原代克隆：+CM培养物	24	24	24	#挑取的原代克隆：-CM培养物	24	24	0

表2：使用hPDF载体对GCT27X-1细胞进行的稳定整合转染。使用Floxed hPDF载体通过电穿孔和脂转染策略对多能GCT 24X-1细胞进行转染并且，在嘌呤霉素选择之下，在无STO饲养细胞的情况下将稳定的转染子克隆建立于存在和不存在条件培养基(+/-CM)的条件之下。为提供对照细胞系，在相同的条件下建立使用GFP对照载体进行脂转染的GCT 27X-1细胞。除GFP对照仅从条件培养基平板中进行挑取以维持hEC群体之外，在所有条件下挑取出数量相当的克隆并且进行扩增。

克隆形态学	FloxedhPDF+CM	FloxedhPDF-CM	FloxedhPDF+CM	FloxedhPDF-CM
克隆形态学	FloxedhPDF+CM	FloxedhPDF-CM	FloxedhPDF+CM	FloxedhPDF-CM	紧固	49	58	53	20
中等	33	27	44	43	紧固	49	58	53	20
中等	33	27	44	43	松散	18	15	33	37
总量	100	100	100	100	松散	18	15	33	37

表3：稳定整合的hPDF和对照GFP转染子GCT 27X-1细胞在不同培养条件下的形态学。在存在和不存在条件培养基(+/-CM)的情况下，被转染的细胞在～25,500细胞/cm²的密度下进行接种并且在10-15天的嘌呤霉素选择之下建立克隆。通过Leishman’s染色，这些克隆根据多能性被评分为紧固、中等或者松散的表型。所示的FloxedhPDF克隆评分来自电穿孔转化的平板。

序列表

<110>University of Edinburgh

Smith.Austin G

Chambers.Ian

<120>多能性决定因子及其应用

<130>GWS/ARC/24222

<150>GB0202149.1

<151>2002-01-30

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2185

<212>DNA

<213>小鼠

<400>1

gagataggct gatttggttg gtgtcttgct ctttctgtgg gaaggctgcg gctcacttcc 60

ttctgacttc ttgataattt tgcattagac atttaactct tctttctatg atctttcctt 120

ctagacactg agttttttgg ttgttgccta aaaccttttc agaaatccct tccctcgcca 180

tcacactgac atgagtgtgg gtcttcctgg tccccacagt ttgcctagtt ctgaggaagc 240

atcgaattct gggaacgcct catcaatgcc tgcagttttt catcccgaga actattcttg 300

cttacaaggg tctgctactg agatgctctg cacagaggct gcctctcctc gcccttcctc 360

tgaagacctg cctcttcaag gcagccctga ttcttctacc agtcccaaac aaaagctctc 420

aagtcctgag gctgacaagg gccctgagga ggaggagaac aaggtccttg ccaggaagca 480

gaagatgcgg actgtgttct ctcaggccca gctgtgtgca ctcaaggaca ggtttcagaa 540

gcagaagtac ctcagcctcc agcagatgca agaactctcc tccattctga acctgagcta 600

taagcaggtt aagacctggt ttcaaaacca aaggatgaag tgcaagcggt ggcagaaaaa 660

ccagtggttg aagactagca atggtctgat tcagaagggc tcagcaccag tggagtatcc 720

cagcatccat tgcagctatc cccagggcta tctggtgaac gcatctggaa gcctttccat 780

gtggggcagc cagacttgga ccaacccaac ttggagcagc cagacctgga ccaacccaac 840

ttggaacaac cagacctgga ccaacccaac ttggagcagc caggcctgga ccgctcagtc 900

ctggaacggc cagccttgga atgctgctcc gctccataac ttcggggagg actttctgca 960

gccttacgta cagttgcagc aaaacttctc tgccagtgat ttggaggtga atttggaagc 1020

cactagggaa agccatgcgc attttagcac cccacaagcc ttggaattat tcctgaacta 1080

ctctgtgact ccaccaggtg aaatatgaga cttacgcaac atctgggctt aaagtcaggg 1140

caaagccagg ttcctttctt tttccaaata ttttcatatt ttttttaaag atttatttat 1200

tcattatatg taagtaccct gtagctgtct tcatacactc caaaaaaggg cgtcagatct 1260

tgttacgtat ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggat ttgaactcct gaccttcgga 1320

agagcagtcg ggtgctctta tccactgagc catctcacca gcccctggtt tattttttta 1380

attattattt gctttttgtt tatcgagaca gggtttctct gcatagctct aattgtcttt 1440

gaactagctc tgcagaccag cctggccttg aactcagaga tctgcccact tatctttgcc 1500

tcctgaatgc tgggaccaaa ggtggcatac caccacacct ggcatatata ttgtttattt 1560

ctatttctat ttttattggt gccagagcaa acctaggact tagaacatgc tgggcaccaa 1620

ctcaacttct gagctctatt tacaacttgg tgtgttagtg tatttgtctt agttctgaat 1680

ttgtcctttt tttagtgtta actctaggct ttggagacag tgaggtgcat atactctctc 1740

cttcccaaga ataagtgctt gaacaccctt acccacgccc acccacccat gctagtcttt 1800

tttcttagaa gcgtgggtct tggtatacac tgtgtcattt tgaggggtga ggtttaaaag 1860

tatatacaaa gtataacgat atggtggcta ctctcgagga tgagacagaa ggaccaggag 1920

tttgagggta gctcagatat gcaataagtt caaggccaac ctgtactatg tttaaatagt 1980

aagacagcat ctcgataaaa taataaaact aaagtctcaa caaaataaaa gctttcacct 2040

attaaggtgc ttgcttgtcc ttggagtccc ccaagagtaa ctgctatgtt aatatctgta 2100

gaaagatgtt tatatttgac tgtaccatga tgaaccgatg ccagctggac tagtttaaac 2160

aaaataaaac actaatttta ccttt 2185

<210>2

<211>305

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Met Ser Val Gly Leu Pro Gly Pro His Ser Leu Pro Ser Ser Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ser Asn Ser Gly Asn Ala Ser Ser Met Pro Ala Val Phe His Pro

20 25 30

Glu Asn Tyr Ser Cys Leu Gln Gly Ser Ala Thr Glu Met Leu Cys Thr

35 40 45

Glu Ala Ala Ser Pro Arg Pro Ser Ser Glu Asp Leu Pro Leu Gln Gly

50 55 60

Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gln Lys Leu Ser Ser Pro Glu

65 70 75 80

Ala Asp Lys Gly Pro Glu Glu Glu Glu Asn Lys Val Leu Ala Arg Lys

85 90 95

Gln Lys Met Arg Thr Val Phe Ser Gln Ala Gln Leu Cys Ala Leu Lys

100 105 110

Asp Arg Phe Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu

115 120 125

Leu Ser Ser Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe

130 135 140

Gln Asn Gln Arg Met Lys Cys Lys Arg Trp Gln Lys Asn Gln Trp Leu

145 150 155 160

Lys Thr Ser Asn Gly Leu Ile Gln Lys Gly Ser Ala Pro Val Glu Tyr

165 170 175

Pro Ser Ile His Cys Ser Tyr Pro Gln Gly Tyr Leu Val Asn Ala Ser

180 185 190

Gly Ser Leu Ser Met Trp Gly Ser Gln Thr Trp Thr Asn Pro Thr Trp

195 200 205

Ser Ser Gln Thr Trp Thr Asn Pro Thr Trp Asn Asn Gln Thr Trp Thr

210 215 220

Asn Pro Thr Trp Ser Ser Gln Ala Trp Thr Ala Gln Ser Trp Asn Gly

225 230 235 240

Gln Pro Trp Asn Ala Ala Pro Leu His Asn Phe Gly Glu Asp Phe Leu

245 250 255

Gln Pro Tyr Val Gln Leu Gln Gln Asn Phe Ser Ala Ser Asp Leu Glu

260 265 270

Val Asn Leu Glu Ala Thr Arg Glu Ser His Ala His Phe Ser Thr Pro

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Val Thr Pro Pro Gly Glu

290 295 300

Ile

305

<210>3

<211>2114

<212>DNA

<213>人

<400>3

attataaatc tagagactcc aggattttaa cgttctgctg gactgagctg gttgcctcat 60

gttattatgc aggcaactca ctttatccca atttcttgat acttttcctt ctggaggtcc 120

tatttctcta acatcttcca gaaaagtctt aaagctgcct taaccttttt tccagtccac 180

ctcttaaatt ttttcctcct cttcctctat actaacatga gtgtggatcc agcttgtccc 240

caaagcttgc cttgctttga agcatccgac tgtaaagaat cttcacctat gcctgtgatt 300

tgtgggcctg aagaaaacta tccatccttg caaatgtctt ctgctgagat gcctcacacg 360

gagactgtct ctcctcttcc ctcctccatg gatctgctta ttcaggacag ccctgattct 420

tccaccagtc ccaaaggcaa acaacccact tctgcagaga atagtgtcgc aaaaaaggaa 480

gacaaggtcc cagtcaagaa acagaagacc agaactgtgt tctcttccac ccagctgtgt 540

gtactcaatg atagatttca gagacagaaa tacctcagcc tccagcagat gcaagaactc 600

tccaacatcc tgaacctcag ctacaaacag gtgaagacct ggttccagaa ccagagaatg 660

aaatctaaga ggtggcagaa aaacaactgg ccgaagaata gcaatggtgt gacgcagaag 720

gcctcagcac ctacctaccc cagcctctac tcttcctacc accagggatg cctggtgaac 780

ccgactggga accttccaat gtggagcaac cagacctgga acaattcaac ctggagcaac 840

cagacccaga acatccagtc ctggagcaac cactcctgga acactcagac ctggtgcacc 900

caatcctgga acaatcaggc ctggaacagt cccttctata actgtggaga ggaatctctg 960

cagtcctgca tgcagttcca gccaaattct cctgccagtg acttggaggc tgctttggaa 1020

gctgctgggg aaggccttaa tgtaatacag cagaccacta ggtattttag tactccacaa 1080

accatggatt tattcctaaa ctactccatg aacatgcaac ctgaagacgt gtgaagatga 1140

gtgaaactga tattactcaa tttcagtctg gacactggct gaatccttcc tctcccctcc 1200

tcccatccct cataggattt ttcttgtttg gaaaccacgt gttctggttt ccatgatgcc 1260

tatccagtca atctcatgga gggtggagta tggttggagc ctaatcagcg aggtttcttt 1320

tttttttttt cctattggat cttcctggag aaaatacttt tttttttttt tttgagacgg 1380

agtcttgctc tgtcgcccag gctggagtgc agtggcgcgg tcttggctca ctgcaagctc 1440

cgcctcccgg gttcacgcca ttctcctgcc tcagcctccc gagcagctgg gactacaggc 1500

gcccgccacc tcgcccggct aatattttgt atttttagta gagacagggt ttcactgtgt 1560

tagccaggat ggtctcgatc tcctgacctt gtgatccgcc cgcctcggcc tccctaacag 1620

ctgggattac aggcgtgagc caccgcgccc tgcctagaaa agacatttta ataaccttgg 1680

ctgctaagga caacattgat agaagccgtc tctggctata gataagtaga tctaatacta 1740

gtttggatat ctttagggtt tagaatctaa cctcaagaat aagaaataca agtacgaatt 1800

ggtgatgaag atgtattcgt attgtttggg attgggaggc tttgcttatt tttttaaaac 1860

tattgaggta aagggttaag ctgtaacata cttaattgat ttcttaccgt ttttggctct 1920

gttttgctat atcccctaat ttgttggttg tgctaatctt tgtagaaaga ggtcttgtat 1980

ttgctgcatc gtaatgacat gagtactact ttagttggtt taagttcaaa tgaatgaaac 2040

aaatattttt cctttagttg attttaccct gatttcaccg agtgtttcga tgagtaaata 2100

tacagcttaa acat 2114

<210>4

<211>305

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Ser Val Asp Pro Ala Cys Pro Gln Ser Leu Pro Cys Phe Glu Ala

1 5 10 15

Ser Asp Cys Lys Glu Ser Ser Pro Met Pro Val Ile Cys Gly Pro Glu

20 25 30

Glu Asn Tyr Pro Ser Leu Gln Met Ser Ser Ala Glu Met Pro His Thr

35 40 45

Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp

50 55 60

Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gly Lys Gln Pro Thr Ser Ala

65 70 75 80

Glu Asn Ser Val Ala Lys Lys Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln

85 90 95

Lys Thr Arg Thr Val Phe Ser Ser Thr Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp

100 105 110

Arg Phe Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu

115 120 125

Ser Asn Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln

130 135 140

Asn Gln Arg Met Lys Ser Lys Arg Trp Gln Lys Asn Asn Trp Pro Lys

145 150 155 160

Asn Ser Asn Gly Val Thr Gln Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser

165 170 175

Leu Tyr Ser Ser Tyr His Gln Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn

180 185 190

Leu Pro Met Trp Ser Asn Gln Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Ser Asn

195 200 205

Gln Thr Gln Asn Ile Gln Ser Trp Ser Asn His Ser Trp Asn Thr Gln

210 215 220

Thr Trp Cys Thr Gln Ser Trp Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe

225 230 235 240

Tyr Asn Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gln Ser Cys Met Gln Phe Gln Pro

245 250 255

Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu

260 265 270

Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln

275 280 285

Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Met Asn Met Gln Pro Glu Asp

290 295 300

Val

305

<210>5

<211>720

<212>DNA

<213>大鼠

<400>5

atgagcgtgg atctttctgg tccccacagt ctgcctagtt gtgaggaagc atcgaactct 60

ggggattcct cgccgatgcc tgccgttcat cttcctgagg aaaattattc ttgcttacaa 120

gtgtctgcta ctgagatgct ctgcacagag actgcctctc ctccgccttc ctctggggac 180

ctacctcttc aagatagccc tgattcttct agcaatccca agctaaagct gtctggtccc 240

gaggctgacg agggccctga gaagaaagaa gagaacaagg tcctcaccaa gaagcagaag 300

atgcggactg tgttctctca ggcccagttg tgtgcactca aggataggtt tcagaggcaa 360

aggtacctca gcctccagca gatgcaagat ctctctacca ttctgaacct gagctataag 420

caggtgaaga cctggttcca aaaccaaaga atgaagtgca agaggtggca gaaaaaccaa 480

tggttgaaga ctagcaacgg cctgactcag gcctggaaca gccagacttg gaacgctgct 540

ccgctccata acttcgggga ggactccctg cagccttatg tgccgttgca gcaaaacttc 600

tccgccagtg atttggaggc gaatttggaa gccactaggg aaagccaggc gcattttagt 660

accccgcaag ccttggaatt gttcctgaac tactccgtga attctccagg cgaaatatga 720

<210>6

<211>239

<212>PRT

<213>大鼠

<400>6

Met Ser Val Asp Leu Ser Gly Pro His Ser Leu Pro Ser Cys Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ser Asn Ser Gly Asp Ser Ser Pro Met Pro Ala Val His Leu Pro

20 25 30

Glu Glu Asn Tyr Ser Cys Leu Gln Val Ser Ala Thr Glu Met Leu Cys

35 40 45

Thr Glu Thr Ala Ser Pro Pro Pro Ser Ser Gly Asp Leu Pro Leu Gln

50 55 60

Asp Ser Pro Asp Ser Ser Ser Asn Pro Lys Leu Lys Leu Ser Gly Pro

65 70 75 80

Glu Ala Asp Glu Gly Pro Glu Lys Lys Glu Glu Asn Lys Val Leu Thr

85 90 95

Lys Lys Gln Lys Met Arg Thr Val Phe Ser Gln Ala Gln Leu Cys Ala

100 105 110

Leu Lys Asp Arg Phe Gln Arg Gln Arg Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met

115 120 125

Gln Asp Leu Ser Thr Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr

130 135 140

Trp Phe Gln Asn Gln Arg Met Lys Cys Lys Arg Trp Gln Lys Asn Gln

145 150 155 160

Trp Leu Lys Thr Ser Asn Gly Leu Thr Gln Ala Trp Asn Ser Gln Thr

165 170 175

Trp Asn Ala Ala Pro Leu His Asn Phe Gly Glu Asp Ser Leu Gln Pro

180 185 190

Tyr Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Ser Ala Ser Asp Leu Glu Ala Asn

195 200 205

Leu Glu Ala Thr Arg Glu Ser Gln Ala His Phe Ser Thr Pro Gln Ala

210 215 220

Leu Glu Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Val Asn Ser Pro Gly Glu Ile

225 230 235

<210>7

<211>3108

<212>DNA

<213>食蟹猴

<400>7

cttgggtttg ccacagtctc ttcacttacc tccttgttcc gtttatctcc ttcaccagca 60

gcacatctcc atgaatgctg ccagggtcat ctttatgccc tattttatca tgactattaa 120

ctctgactaa tatttcttta aagttggttg tagatgttta ctacaaatat ttctctgtga 180

cattaacaga tgtggtaagg tcgttgtcga cattgtattc ccagtaattt aggatttttt 240

tctatctctg ataatgaaga aataatgata gagtaggtaa attccaacat taacaacaac 300

aagaaaataa tgaactagat tttgatatac taacacagaa tgttcttcca gctatattgt 360

taagccaaca aagtatacat aacgtacaag tatatgaatg taaatgcact aaaagaaaat 420

atttgaaagt gtatacacca aataaacaga ctttacctct cggaagaaaa tagtgtggta 480

ggcgaaagca taaagaggga actttagttt ttactttcca tagtttagta ttatttactt 540

tttaaaaaaa ccacaggcac gtatttgtat tttattcttt aatttaagaa acctaaaggg 600

tttccttggc gaagaatgtg aaacacacac acacacacac acaagatggg cacggagtag 660

tcttgaaaga catgacaata tcaccagacc tgagaagaag ctaaagagcc agagggaaaa 720

agtcagaagt cgactacctg ggaggaggga tagacaagag accaaactaa aggaaactaa 780

gtgtggatcc agcttgtccc caaagcttgc cttgcttcaa agcatcagat ggtaaagaat 840

cttcacctgt gcctgtgatt tgtgggcctg aagaaaacta tccatccttg caaatgtctt 900

ctactgagat gcctcacacg gagactgtct ctcctcttcc ttcctccatg gatctgctta 960

ttcaggacag ccccgattct tccaccagtc ccaaaggcag acaacctact gctgcagaga 1020

atagtgccac aaaaaaggaa gacaaggtcc cggtcaagaa acagaaggcc agaactgtgt 1080

tctcttccgc ccagctgtgt gtactcaatg atagatttca gagacagaga tacctcagcc 1140

tccagcagat gcaagaactt tccaacatcc tgaacctccg ctacaaacag gtgaagacct 1200

ggttccagaa ccagagaatg aaatccaaga ggtggctgaa aaacaactgg ccaaagaata 1260

ccaatggtgt gactcagaag gcttcagcgc ctacctaccc cagccactac tcttcctact 1320

accagggatg cctggtgaac ccgactggga atcttccgat gtggaggaac cagacctgga 1380

acaattcatc ctggagcaac cagagccaga acgtcccacc ctggagcagc cactcctgga 1440

acgctcagac ctggtgcacc cagttctgga acaatcaggc ctggaacagt cccttctatg 1500

actatgaagg ggaatctcta cagtcctgct tgcagttcca gccaaattct cctgccagtg 1560

acttggaggc tgccttggaa gctgctgggg aaggccttaa tgtaatacag cagacgacta 1620

ggtattttag tactccacaa accatggatt tattcctaaa ctactccacg aacgtgcaac 1680

ctgaagatat gtaaagatga gtaaaattga tattactcaa tttcagtctg ggcactggct 1740

gaaccttcct ctcccctcct cccctcccta taggattttt cttgtttgga aaccacgtgt 1800

tctggtttcc attatgtcta tccagtcaat ttgatggagg gtggagtatg gttggagcct 1860

aatcagagag gtttcttttt ttcctattgg atcttcctgg agaaaagaca ttttaataac 1920

tttggctgct aaggacaaca tgataaaagc tgtctctggc tatagataag tagatctaat 1980

actagtttgg atatctttag tgtttagaat ctaacctcaa gaataagaaa tacaagtaca 2040

aattggtgtt atgaagatac tcctattgtt tgggattttg aggctttgct tattttttaa 2100

aaactattga ggtaaacggt taattgattt cctcaccctt tttggctcag ttttactata 2160

tcccctaatt tgttggttat gctaatcttt gtagaaagag gtcttatatt tgctgcatca 2220

taatgatgtt agtactactt tagtcaattt aagtacaaat gaatcaaaca actatttttc 2280

ctttagttga ttttaccctt attttaccta gtgtttcaaa tatacagctt aaacattaaa 2340

aaaaaaaaaa aaaaaaagaa agaaagaaag aaacctaaag gaagtttgct tttttgagat 2400

taaaatgtat ttaggcatgt aggtttttgc agaatagcaa gtcaccaacc aagggccctt 2460

tatttccaca tagaaaggta agaacatcaa gctatgtgaa gagtgaacaa tatcaatcat 2520

tgcaacttct aatattaagg gtagatttgc atgtaaattt ggttacttct aatgatatag 2580

gttgtcaaac acttaataaa aatgaactat tttgttaatg gcataaattc cctcatcgtt 2640

ggatataagc tttatcttaa atattatgta gaaacttaca aatgctagtc agtttcttag 2700

cctttttttg aaaaaaattt aaagtggttt agtaaatggt aaatgcaggt tggcattaat 2760

gatgtaataa ttcttaaagt gactgtctta aaaaatgtaa aagtagaccg ggcatggtgg 2820

ctcatgtctg taatcccagc agtttgggag gctgaggtgg gcacgtcacc tgaggtcagg 2880

agtttgagac cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctacaaaaat acaaaaatta 2940

gccaggcatg atggcaggtg cctgtaatcc cagctactcg ggaggttgag gcaggagaat 3000

tgcttgaatc caggaggcag aggttgcagt gagccgagat tgcaccattg cactccagcc 3060

tgggtgacag agcgagactc cagcttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3108

<210>8

<211>266

<212>PRT

<213>食蟹猴

<400>8

Met Ser Ser Thr Glu Met Pro His Thr Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro

1 5 10 15

Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser

20 25 30

Pro Lys Gly Arg Gln Pro Thr Ala Ala Glu Asn Ser Ala Thr Lys Lys

35 40 45

Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln Lys Ala Arg Thr Val Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp Arg Phe Gln Arg Gln Arg Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu Ser Asn Ile Leu Asn Leu Arg

85 90 95

Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln Asn Gln Arg Met Lys Ser Lys

100 105 110

Arg Trp Leu Lys Asn Asn Trp Pro Lys Asn Thr Asn Gly Val Thr Gln

115 120 125

Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser His Tyr Ser Ser Tyr Tyr Gln

130 135 140

Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn Leu Pro Met Trp Arg Asn Gln

145 150 155 160

Thr Trp Asn Asn Ser Ser Trp Ser Asn Gln Ser Gln Asn Val Pro Pro

165 170 175

Trp Ser Ser His Ser Trp Asn Ala Gln Thr Trp Cys Thr Gln Phe Trp

180 185 190

Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe Tyr Asp Tyr Glu Gly Glu Ser

195 200 205

Leu Gln Ser Cys Leu Gln Phe Gln Pro Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu

210 215 220

Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln

225 230 235 240

Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn

245 250 255

Tyr Ser Thr Asn Val Gln Pro Glu Asp Met

260 265

Claims

1.一种因子，该因子在缺乏gp130激活的情况下在细胞内发挥作用并且将细胞维持于多能状态。

2.一种因子，该因子维持或者赋予人类干细胞的多能性。

3.一种因子，该因子在缺乏gp130激活的情况下维持或者赋予小鼠ES细胞多能性并且在细胞内发挥作用。

4.一种因子，该因子维持或赋予来自于非容许性小鼠品系的多能细胞多能性。

5.权利要求1-4任一项的因子，该因子为转录因子。

6.权利要求1-5任一项的因子，该因子含有同源域。

7.权利要求1-6任一项的因子，该因子将小鼠胚胎干细胞和/或小鼠胚胎生殖细胞维持于多能状态下。

8.权利要求1-6任一项的因子，该因子将人类胚胎干细胞和/或其它人类多能细胞维持于多能状态下。

9.权利要求1-8任一项的因子，该因子将LIF非反应性细胞维持于多能状态下。

10.权利要求1-9任一项的因子，该因子为具有200到400个氨基酸的多肽。

11.权利要求1-10任一项的因子，该因子具有SEQ ID NO 4的序列。

12.权利要求1-10任一项的因子，该因子具有SEQ ID NO 2、6或者8的序列。

13.一种因子，该因子将细胞维持于一种多能状态、在细胞内发挥作用并且与来自SEQ ID NO 2、4、6或者8的同源域的全部或者部分具有50％或者更高的序列一致性。

14.权利要求13的因子，该因子将LIF非反应性细胞维持于多能状态下。

15.权利要求13或14的因子，该因子在缺乏饲养细胞和缺乏饲养细胞提取物的情况下将人类ES细胞和/或来自于非容许性小鼠品系的ES细胞维持于多能状态下。

16.一种因子，该因子在缺乏饲养细胞和缺乏饲养细胞提取物的情况下支持来自于非容许性小鼠品系的细胞衍生化和维持于多能状态。

17.一种因子，该因子在缺乏饲养细胞和缺乏饲养细胞提取物的情况下将人类ES细胞维持于多能状态。

18.权利要求16或17的因子，该因子调控转录。

19.权利要求16-18任一项的因子，该因子含有同源域。

20.权利要求16-19任一项的因子，该因子为具有200到400个氨基酸的多肽。

21.权利要求16-20任一项的因子，该因子在LIF非反应性细胞中具有活性。

22.一种含有第一和第二结构域的偶联物，其中该第一结构域含有权利要求1-21任一项的因子，并且该第二结构域促进了该第二结构域向细胞内的摄取。

23.权利要求22的偶联物，其中第一结构域在该细胞内与第二结构域被切开。

24.权利要求23的偶联物，其中第一结构域通过二硫键与第二结构域相连接。

25.权利要求23的一种偶联物，其中第一结构域与第二结构域共价相连，并且其中该连接通过存在于该细胞中的蛋白酶切除。

26.权利要求22-25任一项的偶联物，其中第二结构域含有允许该因子的调控的序列，例如，甾类激素受体。

27.一种药物组合物，该组合物含有权利要求1-21任一项的因子或者权利要求22-26任一项的偶联物，该因子或偶联物与一种药学可接受载体一起存在。

28.一种细胞培养基，该培养基含有权利要求1-21任一项的因子或者权利要求22-26任一项的偶联物。

29.权利要求28的细胞培养基，该培养基进一步含有gp130的一种激活剂。

30.权利要求29的细胞培养基，该培养基含有一种LIF受体配基，例如LIF。

31.权利要求29的细胞培养基，该培养基含有IL-6和可溶性IL-6受体。

32.一种核苷酸序列，该序列编码权利要求1-21任一项的因子。

33.权利要求32的核苷酸序列，该序列含有引导该因子表达的序列。

34.权利要求33的核苷酸序列，该序列含有启动子序列。

35.权利要求34的核苷酸序列，其中该启动子为受控启动子。

36.一种核苷酸序列，该序列编码权利要求22-26任一项的偶联物。

37.一种DNA构建体，该构建体用于将一个调控序列插入一种细胞的基因组之中，其中该调控序列在被插入时调控了一种cDNA构建体或者一种基因的表达，该构建体或者基因编码了权利要求1-21任一项的因子。

38.权利要求37的DNA构建体，该构建体使该调控系列通过同源重组进行插入。

39.权利要求37或38的DNA构建体，其中该调控序列为受控启动子。

40.权利要求37-39任一项的DNA构建体，该构建体含有使该启动子被清除或者失活的序列。

41.一种载体，该载体含有权利要求32-40任一项的核苷酸序列。

42.权利要求41的一种载体，该载体用于一种细胞的转染以使该转染细胞可被维持于多能状态。

43.权利要求41或42的载体，该载体用于一种细胞的转染，该细胞表达或者含有多瘤病毒大T抗原。

44.权利要求41-43任一项的载体，该载体含有受控的启动子。

45.一种载体，该载体含有一种核苷酸序列，该序列编码一种调控因子，其中该调控因子调控一种基因，该基因编码权利要求1-21任一项的因子。

46.权利要求45的载体，其中所述基因为被载体转染的细胞的内源基因。

47.权利要求45的载体，其中所述基因为整合于染色体中的转基因。

48.权利要求45的载体，其中所述基因被包含于被权利要求44的载体转染的细胞的染色体外载体中。

49.一种维持多能细胞群体的方法，该方法包括给该细胞群体施用权利要求1-21任一项的因子。

50.一种将细胞维持于多能状态的方法，该方法包括在该细胞中激活一种基因，该基因编码权利要求1-21任一项的因子。

51.权利要求50的方法，其中所述基因为内源基因。

52.权利要求50的方法，其中所述基因位于附加型质粒上或者被稳定地整合。

53.一种将细胞维持于多能状态的方法，该方法包括在细胞中维持或者提高一种基因的表达，该基因编码权利要求1-21任一项的因子，任选地可使用权利要求41-48任一项的载体。

54.一种细胞，权利要求1-21任一项的因子的表达或者活性在该细胞中已经受到操控。

55.一种细胞，该细胞含有权利要求41-48任一项的载体。

56.一种多能人类细胞，该细胞在缺乏饲养细胞和缺乏饲养细胞提取物的情况下维持于多能状态。

57.一种细胞，该细胞含有一种基因，该基因编码权利要求1-21任一项的因子，其中该基因已被激活。

58.权利要求1-21任一项的因子或者权利要求22-27任一项的偶联物或者权利要求32-40任一项的核苷酸或者权利要求41-48任一项的载体在将细胞维持于多能状态中的应用。

59.一种筛选cDNA文库的方法，该方法包括在ES细胞中实施该筛选，并且针对自体更新表型进行选择。

60.权利要求59的方法，其中该ES细胞对于LIF和通过LIF受体作用的LIF相关细胞因子无反应性。

61.一种筛选cDNA文库的方法，该方法包括在ES细胞中进行功能性分析。

62.权利要求61的方法，该方法用于鉴定一种cDNA，该cDNA赋予自体更新表型。

63.一种赋予非多能性体细胞多能性的方法，该方法包括在该体细胞中表达权利要求1-21任一项的因子。

64.一种赋予非多能性体细胞多能性的方法，该方法包括向该体细胞中引入权利要求1-21中任何一个的因子。

65.权利要求63或者64的方法，该方法进一步包括在该体细胞中激活gp130。

66.权利要求65的方法，该方法包括在存在LIF受体的一种配基的情况下培养该细胞，该配基的例子如LIF。

67.权利要求65的方法，该方法包括在存在IL-6和可溶性IL-6受体的情况下培养该细胞。

68.权利要求63或者64的方法，该方法进一步包括在该体细胞中激活Oct-4。

69.权利要求68的方法，该方法包括对内源Oct-4基因的表达进行上调或者向该细胞中引入一种表达载体，该表达载体含有编码Oct-4的基因序列。

70.一种分离多能细胞的方法，该方法包括：

向处于新鲜分离的细胞群体之中的细胞中引入一种核苷酸，该核苷酸编码权利要求1-21任一项的因子。

71.一种分离多能非人类细胞的方法，该方法包括：

产生一种转基因动物，其中该转基因动物含有一种构建体，该构建体上有一种编码权利要求1-21任一项的因子的核苷酸处于一种受控启动子的控制之下，

从该转基因动物中获得转基因胚胎，

从该转基因胚胎或者动物中获得细胞，以及

激活该启动子从而在该细胞中表达该因子。

72.一种产生转基因非人类动物的方法，该方法包括：

在细胞中表达或者提供权利要求1-21任一项的因子，由此获得多能细胞的培养物；

对这些细胞中的一个或者多个进行遗传操作；

在该细胞中基本上消除该因子的表达或者从该细胞中除去该因子；以及

从该细胞获得转基因动物。

73.一种转基因动物，该动物可根据权利要求72的方法获得。

74.一种转基因动物，该动物含有一种处于可调控启动子控制之下的核苷酸序列，该序列编码权利要求1-21任一项的因子。

75.一种对因子进行筛选的方法，该因子将多能细胞维持于多能状态，该方法包括：

提供一种多能细胞，该细胞表达权利要求1-21任一项的因子，该细胞被稳定地维持于一种多能状态并且在该细胞中该因子的表达可被控制；

对该细胞进行一种操作处理；

降低该因子的表达；并且

对维持于多能状态的细胞进行选择。

76.权利要求75的一种方法，其中该操作处理选自：

对该细胞的一种遗传操作，通过该操作该筛选适用于对一种因子进行鉴定，该因子控制了一种内源基因的表达，该内源基因编码权利要求1-21任一项的因子，或者适用于对另外一种将该细胞维持于多能状态的因子进行鉴定；以及

一种对培养基或者培养条件进行的操作处理，该细胞在该培养基或者培养条件下进行培养。

77.权利要求75或者76的一种方法，其中该因子的表达通过对一种可调控启动子进行调控而进行控制，该可调控启动子与编码该因子的核苷酸序列操作性地组合。

78.权利要求77的方法，该方法包括通过向培养该细胞的培养基中添加一种阻抑物来降低该因子的表达。

79.一种用于筛选因子的方法，该因子调控了一种内源基因的表达，该内源基因编码权利要求1-21任一项的因子，该方法包括：

(1)对该基因组的区域进行转录因子结合位点的分析，该区域侧生于该内源基因；以及

(2)以来自ES细胞的提取物对这些区域的片段进行筛选从而鉴定该提取物中的组分，该组分与所述片段相结合。

80.权利要求79的方法，该方法进一步包括对该基因组的一些区域进行鉴定，这些区域侧生于该内源基因并且引导该因子的多能细胞限制性表达。

81.权利要求80的方法，其中引导了该因子的表达的区域通过报道构建体的转染而进行鉴定。

82.一种因子，该因子通过权利要求75到81任一项的方法进行鉴定。

83.一种对体细胞的细胞核进行再编程的方法，该方法包括将该细胞与本发明的因子进行接触并且在该细胞中激活gp130信号转导或者在该细胞中激活Oct-4表达。

84.一种对体细胞的细胞核进行再编程的方法，该方法包括以第一种载体和第二种载体转染该细胞，该第一种载体含有一种编码本发明的因子的核苷酸序列，该第二种载体含有编码一种LIF受体配基的一种核苷酸序列或者编码Oct-4的一种核苷酸序列。

85.一种组合物，该组合物含有药学可接受的载体和本发明的因子的拮抗剂。

86.一种多能细胞，该细胞通过权利要求49到53任一项的方法获得。

87.一种多能细胞，该细胞通过权利要求63到71任一项的方法获得。

88.一种细胞，该细胞是权利要求86或者87的细胞的后代或者衍生物。

89.一种对体细胞进行自体更新的方法，该方法包括将该细胞在存在权利要求28到31任一项的培养基的情况下进行培养。

90.权利要求89的方法，该方法包括将这些体细胞进行增殖。

91.一种细胞，该细胞根据权利要求89或90的方法而获得。

92.一种细胞，该细胞为权利要求91的细胞的后代或者衍生物。