KR20040093699A - 다능성 결정 인자 및 그 용도 - Google Patents

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KR20040093699A
KR20040093699A KR10-2004-7011810A KR20047011810A KR20040093699A KR 20040093699 A KR20040093699 A KR 20040093699A KR 20047011810 A KR20047011810 A KR 20047011810A KR 20040093699 A KR20040093699 A KR 20040093699A
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챔버스이안
스미스오스틴제라드
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더 유니버시티 오브 에든버러
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Abstract

인간 줄기세포에 다능성을 유지하거나 부여하고, 마우스 ES 세포에 다능성을 유지하거나 부여하고, 복제를 허여하지 않는 계통의 마우스로부터의 줄기세포에 다능성을 유지하거나 부여하는, 세포 내에서 작용하고 gp130 활성의 부존재 하에서 다능성 세포를 다능성 상태로 유지하는 다능성 결정 인자가 기재되어 있다. 그 인자 및 그 인자를 암호화하거나 활성화하는 인자를 사용하여, 특히 인간을 포함한 고등 포유류의 다능성 세포를 유지하고 유도한다.

Description

다능성 결정 인자 및 그 용도{Pluripotency determining factors and uses thereof}
소정 계통의 마우스로부터의 배아줄기(ES) 세포를 LIF-수용체/gp130 복합체를 통한 시그날링을 활성화하는 사이토카인을 제공함으로써 배양 시 다능성 상태를 유도하고 유지할 수 있다. 그러나, 이러한 접근방법은 마우스에 한정되며 인간 다능성 세포의 증식에 충분하지 않다.
세포외 활성 ESRF의 발견(Dain 등, 1998)은 ES 세포의 본질을 유지하기 위한 LIF-수용체/gp 130-의존 경로에 대한 증거를 제공하였다. 그러나, ESRF는 불완전하게 규명되었으며, gp130 사이토카인 이외의 세포외 조절자(regulator)의 분자 특성은 알려져 있지 않다.
또한, 다능성의 전사 결정(transcription determination)은 충분히 알려져 있지 않다. 중요한 역할이 gp130 타겟 STAT3 및 POU 인자 Oct-4에 부여되었으며, 이것들은 어느 것도 단독으로 ES 세포의 본질을 특정하는데 충분하지 않다.
WO 02/097090에는 뉴클레오티드 서열 데이터베이스에서 알아본 다음 설치류 및 인간 ECAT 유전자 발현 패턴을 분석함으로써 ECAT(ES 세포 관련 전사) 유전자를 규명하는 것이 기재되어 있다. WO 02/097090에는 또한 ES 세포를 규명하는 프로브의 용도 및 ECAT 유전자를 이용한 ES 세포의 선택적 분리가 기재되어 있다. Oct-4는 비록 난모세포, 난할 배아(cleavage embryo), 및 에그 실린더 단계(egg cylinder stage)에서도 발현된다고 하더라도 ECAT 유전자이며 다능성 세포에 특이적인 마커이다.
WO 01/66697에는 동물 혈청이 없고 섬유아세포 성장 인자가 존재하는 배지에서 ES 세포를 배양하는 것이 기재되어 있다. 바람직하게는, ES 세포는 섬유아세포 피더층(feeder layer)의 존재 하에서 증식된다.
본 출원인이 출원한 WO 97/30151에는 ES 세포의 분화를 억제할 수 있는 사이토카인인 ESRF가 개시되어 있다.
WO 96/22693은 자가 재생 조혈 줄기세포의 유지에 관한 것이다. 구체적으로 WO 96/22693에는 조혈 줄기세포를 미분화 상태로 유지하고 미분화된 조혈줄기게포의 증식을 지지할 수 있는 "F 인자"가 기재되어 있다.
Berger C.N. 및 Sturm K.S., Growth Factors 1997, 14권, 145-159쪽에는 외인성 LIF 및 피더 세포의 부존재 하에서 ES 세포의 자가 재생에 대해서 기재되어 있다. 그러나, Berger 및 Strum은 이러한 조건 하에서 ES 세포의 자가 재생을 촉진시킬 수 있는 어떠한 인자의 분리에 대해서도 기재하지 않고 있다.
Genbank Accession Numbers AK010332, 2001 및 AK022643, 2000은 호메오박스도메인 함유 단백질에 대한 마우스 및 인간의 cDNA 서열을 제공한다. 이러한 분자에 어떠한 기능이 있는 것으로 기재되어 있지 않다.
인간 배아 줄기세포 및 배아 생식세포의 다능성은 이종성 세포이 피더층(Amit 등, Dev. Biol. 2000) 또는 그 추출물(Xu 등, Nat. Biotech 2001)과 함께 공배양함으로써 유지된다. 그러나, 피더 세포의 의존성은 수많은 문제를 일으킨다. 피더 세포 및 다능성 세포의 공배양은 절충된 배양 조건을 가릴 수 있다. 공배양은 다능성 배양물/그로부터 유도된 분화된 산물의 오염의 위험이 있다. 피더 세포를 사용하는 대안에 해당하는 피더 세포 추출물을 제조하기 위하여, 분리된 피더 세포 집단을 유지하고 처리하고 보관하여야 한다. 추출물은 특징지어지지 않았기 때문에, 생성물의 또 다른 오염원을 나타낸다. 다능성 세포 분화의 분석 및 조작은 피더 세포 또는 정의되지지지 않은 추출물의 존재에 의해 절충된다.
많은 다른 종, 특히 돼지, 소, 및 랫트와 관련하여, 배양 시 다능성 ES 세포를 유도하고 안정하게 유지하는 것이 아직 불가능하다.
본 발명은 다능성 결정 인자 및 그 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 마우스, 인간, 및 다른 종의 다능성 세포의 배양을 유지하고 유도하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 다음 첨부도면으로 예시되는 특정 실시예들에서 더욱 상세히 기술된다.
도 1은 에피좀 ES 세포 벡터인 플라스미드 pPyCAGIP를 도시한다.
도 2는 loxP 측접된 다능성 결정인자 전달유전자의 통합 및 후속 제거를 도시한다.
도 3은 PDF cDNA의 서열분석을 도시하는데, 여기서 (A)는 가장 밀접하게 연관된 대표적인 여러 서로다른 클래스의 호메오도메인 단백질과 PDF 호메오도메인의 정렬을 보여준다.
(B)는 마우스(Mm) PDF 및 인간(Hs) 오소로그(가정상 단백질 FLJ12581)의 한쌍(pairwise) 비교를 보여준다. 동일 잔기는 박스로 되어 있다.
(C)는 마우스 PDF cDNA의 3'UTR이 B2 반복을 함유한다는 것을 보여준다. 번호매김은 PDF cDNA와 B2 서열 기탁번호 K00132에 따랐다. B2의 분할 RNA 폴리머라제 III 프로모터가 박스로 되어 있다. 별표는 본 명세서의 PDF cDNA와 RIKEN cDNA AK010332사이에 다른 염기를 가리킨다.
(D)는 마우스 ES 세포에서 PDF의 인간 오소로그의 활성을 나타낸다. LRK1을 pPyCAGIP(삽입체 무) 또는 hPDF ORF 삽입체를 갖는 유도체로 형질감염시켰다. 주위의 분화된 세포가 없는 알칼라인 포스파타제 양성 콜로니의 개수만을 세고 IL6/sIL6R의 존재하에 형성된 개수와 비교하여 사이토카인의 부재하에 형성된 백분율로 표현하였다.
도 4는 시험관내 발현이 다능성 세포에 한정된다는 것을 보여주는데, 여기서 (A)는 라이브러리 구축에 사용된 MEF의 RNA와 MEF/ES 세포 공-배양의 RNA의 상대적 혼성화를 보여준다. 1㎍ pA+RNA를 레인당 로딩하고 PDF cDNA(좌), GAPDH(우) 및 PDF ORF(중간)의 프로브와 혼성화하였다. 지시 크기(kb)의 RNA 마커의 이동 위치는 좌측에 보여진다.
(B)는 MEF/ES 세포 공-배양(좌) 및 E14Tg2a 배양에서 분화 세포에 둘러싸인 미분화 세포 콜로니(우)의 인시츄(in situ) 혼성화에 의해 검출된 PDF 전사체를 보여준다; 바는 50㎛이다.
(C)는 세포주에서 발현이 ES, EC 및 EG 세포에 한정된다는 것을 보여준다. 사용된 RNA는 PSMB, PC13.5, F9, PSA4, P19, EC 세포; CGR8, EX 세포; PE, 체강벽 내배엽; PYS, 체강벽 난황 낭, NIH3T3, 섬유아세포; BAFB03, 프로-B 세포; MEL, 에리스로류케미아; B9, 플라즈마사이토마.
(D)는 ES 세포 분화시 PDF 발현이 억제되는 것을 보여준다. RNA는 표시 날짜동안 RA 또는 MBA의 적용에 의해 분화 유도된 E14Tg2a 세포로부터 얻었다.
(E)는 성인 조직에서 PDF의 검출가능한 발현의 상실을 보여준다. 사용된RNA는 1. 에피다이디미스(epidydimis); 2. 고환, 3. CGR8; 4. 지방; 5. 신장; 6. 간;7. 심장; 8. 비장; 9; 뇌; 10. 골수; 11. 혀; 12. 눈; 13. 난관; 14. 흉선; 15. 골격근; 16. 피부; 17. 난소; 18. 수정낭; 19. 폐.
(F)는 EC 세포에서 인간 PDF RNA가 발현된다는 것을 보여준다. 사용된 RNA는 배아 암종(GCT27C4) 및 림포이드 (Jurkat) 세포로부터 얻었다. 노던 블롯 분석은 PDF, GAPDH 및 Oct4 (C,D), PDF 및 GAPDH (E) 및 hPDF 및 GAPDH (F)의 프로브를 사용하여 순차적인 혼성화에 의해 수행하였다.
도 5는 ORF 프로브를 사용한 인시츄(in situ) 혼성화에 의해 PDF mRNA가 가시화되는 생체내(in vivo) PDF의 발현을 보여주는데, 여기서 (A)는 이식전 배아를 보여준다. 상단 시리즈는 1, 2, 6 및 8 세포 및 후기 상실배(morula)의 배아를 보여준다. 하단 시리즈는 초기, 팽창, 부화 및 이식 단계에서 포배(blastocysts)를 보여준다. 모든 패널은 동일 확대로 보여진다.
(B)는 암컷(상단) 및 수컷(하단) 배아로부터의 생식 융기(genital ridges)를 보여준다.
도 6은 gp130 비의존성 자가-재생의 본원성(reversibility)를 나타내는데, 여기서, (A)는 구조체의 다이아그램을 제공한다. CAG 카세트는 PDF-IRES-pacpA 전사체의 발현을 지시한다. 이것은 전사 종결 서열(STOP; SPA C2 MAZ) 및 egfppA 카세트로 이어진다. loxP 부위는 CAG 카세트의 두 번째 엑손에 위치하며, 종결서열과 egfp사이에 위치하여 다음의 Cre 매개 재조합 CAG가 egfp의 발현을 지시하도록 한다.
(B)는 (PEF-IRES-pac, pac 프로브) 전 및 (gfp) Cre 절제 후의 전달 유전자전사체의 노던 블롯 분석을 보여준다. 블롯은 표시된 프로브들, E, E14Tg2a; EF1, Floxed 전달유전자를 갖는 E14Tg2a 서브클론; EF1C1, Cre-매개 절제후의 EF1 서브클론으로 순차적으로 혼성화되었다.
(C)는 PDF의 발현의 복원이 LIF 의존성 자가-재생을 회복하는 것을 보여준다. ES 세포(ZIN40), Floxed PDF 전달유전자를 발현하는 ES 세포 및 그들의 Cre-절제된 유도체 주들을 지시된 배양 조건(0, 첨가 무; LIF, 100u.ml LIF; hLIF-05, 10유니트/ml LIF를 차단하기에 충분한 LIF 길항제)하에 클론 밀도로 플레이트한 후 분석하였다. 6일 배양후에 인식가능한 분화 세포를 결여하는 알칼라인 포스파타제 양성 콜로니의 백분율을 정량하였다.
(D)는 사이토카인의 부재 (0), 100u/ml LIF (LIF) 또는 10유니트/ml LIF를 차단하기에 충분한 LIF 길항제의 존재 (hLIF-05)하에 PDF 발현 세포와 Cre-절제된 유도체의 형태학을 보여준다. 세포는 클론 밀도로 플레이트하였고 4일 배양후 시험하였다.
(E)는 RA 또는 MBA에 노출후 0, 1, 2, 3 또는 4일째에 제조되고 Oct4에 혼성화된 floxed 전달유전자를 발현하는 E14Tg2a 유도체 (EF4) 또는 Cre 절제된 서브클론 (EF4C3)의 배양물로부터의 RNA의 노던 블론 분석을 보여준다.
도 7은 헤130 비의존성 ES 세포 밀도의 복원성을 보여주는데, 여기서 (A)는 응집(aggregation)에 의한 분화를 보여준다. floxed 전달유전자를 발현하는 E14Tg2a 유도체 (EF4) 또는 Cre 절제된 서브클론 (EF4C3)을 48웰 디쉬의 웰에 각 배아체를 놓고 박동(beating) 세포의 존재를 매일 측정함으로써 심장 분화를 평가하였다.
(B)는 레틴산의 존재하에 응집에 의한 분화를 보여준다. floxed 전달유전자를 발현하는 E14Tg2a 유도체 (EF4) 또는 Cre 절제된 서브클론 (EF4C3)을 TuJ 면역조직화학법에 의해 신경발달(neurogenesis)을 평가하였다.
(C)는 Cre 제거된 세포의 임신중기 배아에의 기여를 보여준다. EF1C1 세포를 MF1 포배내로 주입하고, 대리모에 전달후 녹색 형광을 E9.5에서 시험하였다.
도 8은 자가-재생의 기타 알려진 매개인자에 대한 PDF의 관련성을 보여주는데, 여기서 (A)는 사이토카인 비의존성 콜로니의 비율이 에피좀 PDF 발현의 레벨과 연관된다는 것을 보여준다. LRK1 세포를 PDF의 발현 레벨 증가를 지시하는 에피좀 벡터들(pPyPPGK < pPyPCAG < pPyCAGIP)로 형질감염하였다. 선택 12일후, 사이토카인 부재하 자가-재생 콜로니의 비율을 IL6/sIL6R의 존재하의 개수와 비교하여 표현하였다. 데이터는 두개 독립적 실험의 평균이다.
(B)는 PDF가 STAT3 표적이 아니라는 것을 보여준다. 모든 4개의 STAT3 결합 부위가 타이로신 코돈의 페닐알라닌으로의 돌연변이에 의해 폐지된 (Y126-275F) 또는 음성 조절 타이로신이 유사하게 돌연변이된 (Y118F) 키메라 GCSFR-gp130 변이체 분자들을 발현하는 ES 세포를 RNA 제조전에 지시된 시간(분)동안 LIF(L) 또는 GCSF(G)로 자극하였다. 노던 블롯 분석은 PDF, GAPDH 또는 STAT3 표적 유전자 SOCS3에 대한 프로브로 순차적으로 혼성화하여 수행하였다.
(C)는 PDF가 자가-재생에서 Oct4를 대신할 수 없다는 것을 보여준다. 독시사이클린 반응성 Oct4 전달유전자가 자가-재생을 유지하는 ES 세포(ZHBTc4.1)를 무삽입체(MT), Oct4(Oct) 또는 PDF(PDF)를 갖는 선형화 pPyCAGIP 유도체들로 형질감염시키고, 전달유전자가 발현되거나(0) 꺼져있는(Dox) 조건하에 LIF의 존재하에 배양하였다. 푸로마이신 선택후에, 플레이트를 염색하고 미분화 콜로니의 백분율을 결정하였다.
도 9는 조건배지에서 다능성 GCT 27X-1 hEC 세포의 유지를 도시하는데, 여기서 (A)는 유사분열 불활성화된 STO 세포의 피더 층상에 일상적으로 유지된 GCT 27X-1 다능성 hEC 세포주를 보여준다.
(B)는 피더 세포의 부재하에 유지되나 일상적 배양 배지중 25% v/v로 난황 낭 암종 세포주 hEC 44로부터 유래된 조건배지가 첨가될 수 있는, 일상 밀도로 보여지는 다능성 배양을 도시한다.
(C)는 클론 밀도로 보여지는 무-피더 GCT 27X-1 세포 배양으로부터 조건배지의 회수가 세포 분화의 개시와 다능성 표현형의 상실을 초래한다는 것을 보여준다. 위상차 광학, 10x(A,B), 4x(C)로 사직찍었다.
도 10은 GCT 27X-1 hEC 세포에서 내생적 hPDF 발현의 노던 블롯 분석을 보여주는데, 여기서 STO 피더 세포상에서 배양된(27X-1 +STO); 피더세포는 없으나 조건배지가 첨가된(27X-1 -STO +CM) GCT 27X-1 세포로부터 제조된 폴리 A+ mRNA (3-3.5㎍)를 변성 젤상에서 분리하고, 후보 인간 PDF 서열에 특이적인 cDNA 프로브(~900bp)와 노던 블롯 혼성화로 분석하였다. STO 세포 배양(STO) 및 E14Tg2a 마우스 ES 세포 배양(E14Tg2a)로부터 제조된 폴리 A+ mRNA를 혼성화의 대조군으로 포함시켰다. ~2.4kb의 주요 전사체 및 ~5.6kb의 덜 혼성화된 전사체가 둘다의 GCT 27X-1 배양에서 검출되었는데, 이는 다능성 hEC 세포배양에서 hPDF 유전자의 내생적 발현을 확인시켜준다. 마우스 ES 세포주에서 검출된 매우 약한 ~2.2 kb의 혼성화 밴드는 마우스 다능성 세포의 상동성 전사체의 지시자이다. 예상된대로 STO 세포 mRNA에서는 혼성화 신호가 검출되지 않았다. 자동방사선촬영 노출이 강화 스크린으로 -70℃에서 8시간동안 보여진다.
도 11은 hPDF cDNA를 발현하는 인간 다능성 세포주에서 자가-재생을 유지를 보여주는 실험전략의 흐름도이다. (CM=조건배지)
도 12는 floxed hPDF 및 GFP 대조군 벡터 구조체를 도시하는데, 여기서 (A)는 인간 사이토메갈로바이러스 최전 인핸서 (CMV IE) 및 인간 액틴 프로모터의 조절하에 있고 푸로마이신 내성 유전자의 IRES-매개 발현을 제공하는 바이시스트론 리포터 카세트의 상류에 있는 hPDF cDNA의 오픈 리딩 프레임(~900bp)를 함유하는 8.8kb Floxed hPDF 구조체를 도시한다. 향상된 GFP(eGFP) 리포터 유전자가 loxP 부위의 하류에 위치하여, Cre-매개된 재조합이 일어났을때 형광 가시화가 제공된다.
(B)는 (A)의 hPDF 서열이 IRES-푸로마이신 리포터 카세트의 상류에 있는 eGFP 서열로 치환된 유사 구조체인 pPyCAGegfplP("GFP 대조군")을 보여주며, 대조군 "비 hPDF"-발현 형질감염체를 제공하는데 사용되었다.
도 13은 형질감염체 GCT 27X-1 콜로니의 형태학적 평가를 도시한다. 안정한 형질감염체 Floxed hPDF 및 GFP 대조군 콜로니는 조건배지의 존재 및 부재하에 STO 피더세포 없이 푸로마이신 선택 배양에서 10-15일후 확립되었다. Leishman's 염색 콜로니 형태학 후에 견고한 다능성 hEC 표현형을 유지하는 것들을 (A)"견고(Tight)", 분화 개시하지만 약간 hEC 표현형을 유지하는 콜로니들을 (B) "중간(Medium)", 완전히 느슨해져 분화되는 콜로니들을 (C) "느슨(Loose)"으로 점수매겼다. 위상차 광학, 4x로 사진촬영하였다.
도 14는 클론 어세이에서 hPDF-발현 hEC 세포의 형태학을 도시하는데, 여기서 a-d는 형질감염으로부터 조건배지의 존재(hPDF D7) 및 부재(hPDF E7)하에 연속적으로 팽창된 hPDF-발현 hEC 클론 주들을 보여주고, 그들은 조건배지 있이(+CM) 및 없이(-CM) 12-14 일간 클론 밀도로 배양되었다. e-h는 동일조건하에 배양된 형질감염된 GFP 대조군 클론(GFP C15) 및 야생형 hEC 세포(27X-1)를 보여준다. 조건배지의 부재하에, 오직 hPDF-발현 hEC 세포만이 다능성 hEC 표현형을 유지할 수 있는 반면, GFP 대조군과 야생형 hEC 세포는 분화가 유도되었다. 위상차 광학, 10x로 사진촬영하였다.
도 15는 클론 어세이에서 hPDF-발현 hEC 세포의 자가-재생을 보여준다. hPDF-발현 hEC 클론주(hPDF D7 및 E7), 형질감염된 GFP 대조군 클론(GFP C15) 및 야생형 hEC 세포(27X-1)를 조건배지의 존재(+CM, a-h) 및 부재(-CM, i-p)하에 12-14일간 클론 밀도로 배양하였다. 콜로니내의 다능성 hEC 세포를 CD30 마커에 대한 간접 면역형광 염색법으로 동정하였는데(b,d,f,h,j,l,n,p), 여기서는 동일 콜로니내에 모든 세포에 대해 상대적 Hoechst UV 형광으로 나타냈다(a,c,e,g,i,k,m,o). 조건배지의 부재하에, 오직 hPDF-발현 hEC 콜로니만이 다능성 표현형을 유지할 수 있는 반면, 형질감염 대조군 및 야생형 hEC 세포는 조건배지에서 유지되지 않으면 분화가 유도되었다. hPDF E7 콜로니는 조건배지의 부재하에 hPDF D7 세포와 비교시일반적으로 더 견고한 형태학 및 더 강한 CD30 마커의 검출을 나타내었다. 콜로니는 20x 확대로 535/50 nm(CD30) 및 UV 330-380 nm(Hoechst) 필터를 사용하여 가시화하였다.
도 16은 일상 배양에서 hPDF-발현 hEC 세포의 자가-재생을 도시한다. hPDF-발현 hEC 세포주 E7은 형질감염이후 STO 피더세포 및 조건배지 둘다의 연속적 부재하에 팽창되었다. 여기서 일상적 계대후에 보여진 클론 세포주는 이들 조건하에 배양 8주 이상후에도 hEC 세포의 자가-재생을 계속 나타내었다. 위상차 광학, 10x하에 사진촬영하였다.
본 발명의 목적은 마우스 및 인간의 다능성 세포의 향상된 배양방법을 제공하는 것이며, 본 발명의 특정 구현예의 목적은 다능성 세포 배양에서의 피더 세포 의존성을 제거하는 것이다. 또 다른 목적은 다른 종으로부터 다능성 세포를 유도하고 유지하는 것을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 포유류 세포에서 다능성을 유지하는 인자에 의해 제 1 구현예에서 예시된, 포유류의 다능성 결정 인자를 제공한다.
ES 세포의 배양에서, 상기 인자는 그러한 세포의 다능성을 부여하기 에 충분한 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따르면, 그 인자는 자가-재생 다능성 표현형을 유지하는 수준으로 다능성 세포에서 유지될 수 있다. 그 인자는 내인성-내인성 유전자의 활성에 의해 유지되는 세포 수준의 인자-일 수도 있으며, 또는 세포의 다능성 표현형의 안정한 유지를 가능하도록 하기 위해 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 특정 인자는 세포 내에서 작용하고, 세포를 다능성 상태로 유지하며, 세포 내에서 구조적으로 활성이 있다. 이러한 맥락에서, 세포 내에서의 작용을 참조할 때 작용 부위가 세포 내에 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, 그 인자는 예를 들어 LIF 및 다른 사이토카인의 경우와 같이 세포 표면 수용체에 대한 리간드가 아니며, gp130 수용체로부터의 신호에 독립적으로 작용할 수 있다.
또한 본 발명의 다능성 결정 인자는 gp130 활성인자가 없는 ES 세포 배지에서 배양되는 다능성 세포를 다능성 상태로 유지한다. 따라서, 그 인자는 포유류 세포를 gp130 활성화가 없이 다능성 상태로 유지할 수 있으며gp130-수용체 복합체를 활성화하는 사이토카인이 없는 배양 배지에서 다능성의 유지를 촉진시킬 수 있다. 하기 실시예에서, 본 발명자는 본 발명의 바람직한 세포 발현 인자가 gp130의 필요성이 없어졌으며, 레틴산, 3-메톡시벤즈아미드 및 응집(aggregation)에 반응하여 분화가 감소되거나 사라지는 것을 나타내어 분화가 이러한 자극에 반응하여 억제된다는 것을 입증하였다. 특정 예의 인자는 또한 gp130의 다운스트림 전사 타겟이 아니다. 본 발명의 인자는 유리되었으며, 마우스, 인간, 영장류, 양, 랫트, 돼지, 소, 및 그 이외의 동물을 포함한 동물의 다능성 세포의 유지에 적절하다. 본 발명의 한 인자는 인간 ES, EC, 또는 인간 EG 세포 또는 그 이외의 인간의 다능성 세포의 다능성을 유지한다. 본 발명의 또 다른 인자는 복제가 허용되지 않는 계통의 마우스 유래의 다능성 세포의 배양에서 계속적인 증식을 가능하게 한다.
본 발명의 장점은 다능성 세포를 배양 시 다능성 세포를 안정하게 증식시키는 능력에 있다. 본 발명의 인자는 인간 및/또는 마우스 세포를 증식, 다능성 상태로 유지하기 위해 배양에 사용될 수 있다. 본 발명은 지금까지는 불가능했던, 인간 및 마우스 이외의 종으로부터 ES 세포를 분리하고 유지하는 것의 가능성을 제공한다.
특정 구현예의 인자는 전사 인자이다. 그것은 핵 내에서 작용하여, ES 세포의 자가-재생을 일으킬 수 있다. 하기 실시예에 기재되고 이용된 바람직한 인자는 호메오도메인을 함유한다.
본 발명의 한 인자의 사용에서, 그 인자는 피더층 또는 피더 세포 추출물이 존재하지 않는 상태에서, 그리고 gp130 사이토카인이 존재하지 않는 상태에서 세포를 다능성 상태로 유지한다. 따라서, 그 인자의 제공은 세포를 배양 시 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하다. 그 인자는 표준 ES 세포 배양 배지 부가되거나, 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 미량주입(microinjection)에 의해 세포에 직접 도입되거나, 여기에 개시한 다양한 방법에 의해 세포에서 생산될 수 있다. 하기 보다 상세하게 나타낸 본 발명의 특정 구현예에서, 그 인자를 발현하는 벡터는 세포의 에피좀 형질감염을 경유하여 또는 세포로의 염색체 통합에 의해 사이토카인에 독립적인 ES 세포 증식을 지탱시킨다; 구체적으로 예시되지 않은 또 다른 방법은 ES 세포 자가 재생이 가능하도록 그 인자를 암호화하는 내인성 서열의 발현을 유도하거나 증가시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 그 인자는 LIF 비반응성 세포를 다능성 상태로 유지하는 특성에 의해 확인 가능하다.
그 인자는 적절하게 200 내지 400 개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 구체적으로는, 본 발명의 마우스 다능성 결정 인자는 SEQ ID NO 2, 인간 다능성 결정 인자는 SEQ ID NO 4, 랫트 다능성 결정 인자는 SEQ ID NO 6, 그리고 짧은 꼬리 원숭이 다능성 결정 인자는 SEQ ID NO 8로 표현된다.
본 발명의 제 2 측면은 세포를 다능성 상태로 유지하고, 세포 내에서 작용하며, 호모도메인, 특히 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 또는 8 유래의 호모도메인과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 호모도메인을 포함하는 인자 또는, 주어진 종의 세포에 대한 인자와 관련하여 동일한 종의 다능성 결정 인자의 호모도메인과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것에 있다. 일반적으로, 호모도메인은 약 60 개의 아미노산 길이를 가지며, 본 발명의 인자는 임의의 20 개의 아미노산 프래그먼트가 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 또는 8의 호모도메인과 35% 이상의 서열 동일성을 갖는 호모도메인을 포함한다. 바람직하게, 그 인자는 LIF-비반응성 세포를 다능성 상태로 유지한다.
또 다른 구현예의 인자는 복제가 허용되지 않는 계통의 마우스로부터의 배양된 내배엽 세포를 피더 세포의 부존재 및 피더 세포 추출물의 부존재 하에서 다능성 상태로 유지하는 것이다. 제 2의 그러한 인자는 인간 배아-유래 세포(ES 및 EG세포 포함)를 피더 세포의 부존재 및 피더 세포 추출물의 부존재 하에서 다능성 상태로 유지하는 것이다.
피더 세포 또는 피더 세포 추출물을 사용하지 않는 것은 배양물이 원치않는 세포로 오염되는 것을 감소시키는 장점을 갖는다. 마우스 세포는 인간 다능성 세포 배양의 피더 세포로서 이용되어 왔으므로, 본 발명은 인간 다능성 세포가 비인간 세포로 오염될 위험을 현저히 감소시키고 제거할 수 있다. ES 세포 유래 생성물을 이식 치료에 사용하고자 할 경우, 비인간 세포가 확실한 존재하지 않는다는 보장은 세포의 초기 유리 및 이후의 증식에 있어서 또한 필수적이다.
본 발명은 또한 상기 인자의 또 다른 기능적 도메인과의 접합체(conjugate)를 제공한다. 제 1의 그러한 접합체는 본 발명의 인자를 포함하는 제 1 도메인 및 제 1 도메인이 세포로 섭취되는 것을 촉진시키는 제 2 도메인(예: 안테나페디아의 단백질 형질도입 도메인, HIV-1 TAT 단백질 또는 HSV-1 VP22(Schwarze 등, 2000)을 포함한다. 따라서, 그 접합체는 배양물 배지 구성성분으로 사용될 수 있다. 선택적으로 상기 제 2 도메인은 세포로의 섭취 후에 인자를 핵으로 트래픽킹(trafficking) 하는 것을 보조하는 핵 위치화 서열(nuclear localization sequence)를 포함한다.
사용 시 제 2 도메인으로부터 제 1 도메인의 방출을 가능하도록 하기 위해, 바람직한 접합체의 제 1 도메인은 세포 내의 제 2 도메인으로부터 분리될 수 있다. 제 1 도메인은 제 2 도메인에 디-설파이드 브릿지에 의해 연결될 수 있으며, 그러한 디-설파이드 결합은 세포의 환원 조건 하에서 제 1 도메인의 방출을 가능하게한다. 제 1 도메인은 제 2 도메인에 공유결합으로 연결될 수 있으며, 그 연결은 세포 내에 존재하는 프로테아제에 의해 분리될 수 있다. 선택적으로, 제 2 도메인은 인자의 활성 조절을 가능하게 하는 서열(예: 스테로이드 호르몬 수용체)를 포함할 수 있다(Picard, 2000).
본 발명의 더욱 유리된 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 또는 8과 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자; (b) (a)의 천연적으로 발생하는 변이체; (c) (a) 또는 (b)의 오소로그(orthologue); 및 (d) 생물학적으로 활성이 있고, 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 프래그먼트, 유사체, 및 그 유도체를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드이다.
본 발명의 폴리펩티드를 일컫는 용어 "프래그먼트", "유도체", 및 "유사체"는 그러한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 필수적으로 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 유도체 또는 유사체인 프래그먼트는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환된 것, 그리고 그러한 치환된 아미노산 잔기는 유전적 코드로 암호화 되거나 암호화되지 않을 수도 있는 것이거나, (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것이거나, (ⅲ) 성숙한 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예: 폴리에틸렌글리콜)과 같은 또 다른 화합물로 융합된 것이거나, (ⅳ) 예를 들어 성숙한 폴리펩티드의 정제를 촉진시키기 위해 추가의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드로 융합된 것일 수 있다. 그러한 프래그먼트, 유도체, 및 유사체는 여기에 개시되어 있는 것으로부터 당해 기술분야에서 통상의 영역 내에 있는 것이라고 보여진다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 다능성 결정 인자 에피토프(epitopes), 펩티드, 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 본 명세서에 통합되어 있는 Harlow 및 Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; 및 Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1982 참조). 폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스, 및 랫트와 같은 다양한 동물로부터 생성될 수 있다.
다능성 결정 인자 폴리펩티드의 면역원성은 알럼(alum, 수산화알루미늄) 또는 Freund 완전 또는 불완전 아주반트와 같은 아주반트의 사용을 통해 증가시킬 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한, 면역 글로불린 폴리펩티드 또는 말토오스 결합 단백질과 함께 다능성 결정인자 또는 그 일부의 융합과 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전장 분자 또는 그 일부일 수 있다. 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사" 물질일 경우, 그러한 부분은 유리하게 거대분자 담체(예: KLH(keyhole limpet hemocyanin), BSA(소혈청 알부민), 또는 파상풍 톡소이드)에 결합되거나 연결될 수 있다.
여기에 사용된 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 친화력-정제 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 및 F(ab')2와 Fab 단백질분해 프래그먼트 같은 항원-결합 프래그먼트를 포함한다. 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드 뿐만 아니라, 키메릭 항체, Fv 프래그먼트, 단일 체인 항체 등과 같은 유전적으로 조작된 온전한 항체 또는 프래그먼트를 또한 포함한다. 비인간 항체는 단지 비인간 CDRs를 인간 프레임워크(framework) 및 일정한 부위에 이식시키거나, 전체의 비인간 다양한 도메인을 통합시킴으로써(선택적으로는 노출된 잔기를 치환함으로써 그것을 인간-유사 표면으로 "덥음(cloaking)"으로써 그 결과 "감춰진" 항체가 되는), 인간화될 수 있다. 어떤 경우에는, 인간화된 항체가 비인간 잔기를 인간의 다양한 부위 프레임워크 도메인 내에 보유시켜 적절한 결합 특성을 증가시킬 수 있다. 항체를 인간화 함으로써, 생물학적 반감기가 증가할 수 있으며, 인간에게 투여 시 면역반응의 부작용의 잠재성이 감소한다. 여기에서 유용한 항체를 생성시키거나 선택하는 또 다른 방법은 림프구를 다능성 결정 인자 단백질 또는 펩티드에 in vitro 노출시키고, 파지 또는 유사한 벡터에서의 항체 디스플레이 라이브러리를 선택하는 것(예를 들어, 고정되고 라벨링된 다능성 결정 항체 단백질 또는 펩티드를 통해서)을 포함한다.
항체는 그것이 다능성 결정 인자 폴리펩티드에 결합할 경우 결합 친화도(ka)가 106M-1이상, 바람직하게는 107M-1이상, 보다 바람직하게는 108M-1이상, 그리고 가장 바람직하게는 109M-1이상의 결합 친화도(Ka)로 특이적으로 결합하는 것으로 정의된다. 항체의 결합 친화도는 공지의 기술(예: Scatchard 분석)에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다양한 어세이는 다능성 결정 인자 단백질 또는 펩티드에 특징적으로 결합하는 항체를 검출하는데 이용될 수 있다. 항체를 이용한 예시적 어세이가 A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 상세하게 기재되어 있다. 그러한 어세이의 대표적인 실시예로는 동시발생 면역전기영동, 방사면역측정법, 방사면역-침전법, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 도트 블랏 또는 웨스턴 블랏 어세이, 억제 또는 경쟁 어세이, 및 샌드위치 어세이를 포함한다. 또한, 와일드 타입 vs. 돌연변이체 다능성 결정 인자 단백질 또는 펩티드에 대한 항체의 결합을 대해 스크린 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 및 8의 폴리펩티드와 50% 이상의 유사성(바람직하게는 50% 이상의 동일성)을 포함하고, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 및 8의 폴리펩티드와 90% 이상의 유사성(보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성), 그리고 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 및 8의 폴리펩티드와 95% 유사성(더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성)을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 및 8의 폴리펩티드를 포함하며, 또한 일반적으로 30 개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50 개 이상의 아미노산을 함유하는 그러한 폴리펩티드 부분을 갖는 그러한 폴리펩티드를 포함한다. 두 개의 폴리펩티드 간의 "유사성"은 아미노산 서열을 제 2 폴리펩티드의 서열에 대한 하나의 폴리펩티드의 보존된 아미노산 치환체를 비교함으로써 결정된다. 서열 유사성 및 동일성의 계산에 대한 다양한 서로 다른 접근법이 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 계산을 수행하는 적절한 방법은 데이터베이스 서치를 Smith-Waterman, BLAST 또는 FANSTA와 같은 프로그램을 이용하여 작동시키고, 하나 또는 바람직하게는 두 개 또는 세 개 이상의 유사 표(similarity table)를 이용하는 것이다. Blosum 및 PAM(Point Accepted Mutation) 매트릭스는 데이터베이스 서치 및 서열 배열에 대해 적절한 아미노산 유사성 매트릭스이다. Smith-Waterman 또는 Fanstark를 사용하고 개방 갭 페널티(open gap penalty)가 충분히 큰지를 확인하는 것과 관련이 있으며, 그 초기 작동이 임의의 동일한 서열을 드러내지 않는다면, 서로 다른 알고리즘을 시도하는 것이 적절할 수 있으며, 이것은 특히 발견된(heuristic) 알고리즘, BLAST 또는 FASTA로 시작한다면 특히 그러하다.
본 발명의 또 다른 측면은 그 인자 또는 접합체를 함유하는 조성물에 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 상기 인자 또는 접합체를 포함하는 약제학적 조성물; 및 상기 인자 또는 접합체를 포함하는 세포 배양 배지를 포함한다.
본 발명의 인자 및/또는 접합체를 함유하는 세포 배양 배지는 또한 GMEM, 혈청, 혈청 대체물, 필수 아미노산, β-머캅토에탄올, 피루베이트, 및 글루타민으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 구성성분을 함유할 수 있다.
상기 배양 배지는 선택적으로 gp130의 활성화제를 더 포함하며, 적절한 활성화제는 LIF 수요체로서서 작용하는 사이토카인을 포함한다(예: LIF, 및 가용성 IL-6 수용체와 결합된 IL-6). 상기 배양 배지는 다능성 ES 세포, 특히 ES, EC, 및 EG세포의 유지 및 다능성 세포, 특히 ES, EC, 및 EG 세포의 자가-재생을 위해 사용될 수 있다. 상기 배지는 또한 체세포, 특히 체줄기세포(somatic stem cell)의 유지에 사용될 수 있으며, 본 발명의 특정 구현예에서는 세포를 배지의 존재 하에서 배양하고, 바람직하게는 배지에서 세포를 증식시키는 것을 포함하는 체세포의 자가-재생 방법을 제공한다. 배양 배지의 또 다른 용도는 다능성 세포로부터 유래된 세포의 유지 및/또는 증식을 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 적용은 세포 집단의 팽창, 예를 들어 체세포의 팽창에 있다. 본 발명을 이용하여 수행할 수 있는 생체 외(ex vivo) 치료는 환자로부터 세포 집단을 제거하는 단계, 그 세포 집단을 팽창시키기 위해 본 발명의 배양 배지에서 그 세포를 배양하는 단계, 및 그 후 그 세포를 환자에게 이식하거나 재도입시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 배양 방법은 본 발명의 인자와 Oct-4의 발현 및/또는 Oct-4의 활성화의 조합을 이용하여 세포를 유지 및/또는 증식시키는 것을 포함한다. 그 인자는 그 인자 자체로서 도입되거나 여기 기재된 바와 같은 접합체를 경유하여, 또는 벡터를 이용하여 도입될 수 있다. Oct-4 발현은 내인성 Oct-4 유전자의 발현을 상향조절함으로써 또는 Oct-4를 포함하는 발현 벡터를 세포에 도입함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 인자 및 Oct-4의 조합은 세포를 유지 및/또는 자가-재생 및/또는 증식시키는데 사용될 수 있다. 특히, 이러한 조합은 다능성 세포 자가-재생의 증가 및/또는 다능성의 유지 증가를 제공하는데 사용될 수 있다. 그 조합은 또한 다능성 세포 집단을 유도하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정구현예에서, 인자 및 Oct-4의 조합은 다능성 세포의 자가-재생을 향상시키며 이러한 향상은 새로운 다능성 세포주, 특히 랫트 및 마우스와 같은 설치류; 원숭이, 특히 짧은 꼬리 원숭이와 같은 영장류; 돼지; 양; 및 소 다능성 세포를 포함한, 다른 동물뿐만 아니라 인간세포를 유도하는데 사용된다고 밝혀졌다.
다능성 세포, 특히 ES 세포는 플레이팅 하기 전에 또는 플레이팅 할 때, 예를 들어 피더세포를 편리하게 사용할 때 또는 내부 세포괴(inner cell mass, ICM)을 플레이트에 깔을 때, 포배 세포(blastocyte cell)를 형질감염 함으로써 적절히 유래된다. 형질감염될 세포와 피더 세포간의 임의의 접촉을 피하는 것에 있어서 이점이 있다고 할 지라도, 형질감염은 피더층 상의 세포와 함게 수행될 수 있으며, 피더층 상에서 수행할 수 없다. 이식 전 배아를 포함한 다능성 세포의 유전자도입법(transgenesis)은 이 단계에서 수행할 수 있으며, 따라서 본 발명의 인자가 발현되도록 형질감염이 안정한 다능성의 세포 집단을 유도하는데 사용된다는 것이 알려져 있다.
여기에 기재된 기술의 또 다른 용도는 세포 및 핵의 재프로그래밍에 있으며, 따라서 본 발명은 또한, 세포를 본 발명의 인자와 접촉시키고 세포에서의 gp130 시그날링을 활성화하는 것을 포함하거나, 세포를 본 발명의 인자와 접촉시키고 Oct-4를 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 체세포의 핵을 재프로그래밍 하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 재프로그래밍은 세포를 본 발명의 인자를 암호화하는 뉴크레오티드 서열을 함유하는 제 1 벡터, 및 LIF 수용체 리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 Oct-4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 2벡터로 형질감염 함으로써 수행된다.
본 발명은 또한 본 발명의 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 인자의 사용 시, 배양 시 또는 그 이외에서 세포의 다능성을 촉진시키기 위해 인자의 발현을 조절하거나 지시하기 위한 수많은 서로 다른 방법이 제안될 수 있다. 따라서, 선택적으로, 인자의 발현을 조절하는 서열을 폴리뉴클레오티드 중에 포함한다. 이 서열은 프로모터일 수 있으며, 또한 활성이 조절되는 프로모터일 수 있다. 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오티드는 상기 접합체를 암호화한다.
주어진 세포에서 인자의 수준을 조절하기 위해, 인자를 암호화하고 세포에 존재하는 유전자는 활성화될 수 있다. 내인성 및 이종의 프로모터 모두 및 그 이외의 조절 요소(element) 모두 뿐만 아니라, 이러한 조절 요소에 작용하는 인자가 이용될 수 있다. 하나의 접근방법은 조절 서열을 세포의 게놈에 삽입하기 위해 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것이며, 그 조절 서열은 삽입될 때 그 인자를 암호화하는 유전자의 발현을 조절한다. 이러한 방법으로, 내인성 유전자가 작동되거나 그 발현이 유지될 수 있다. 조절 서열은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 인자를 암호화하는 내재하는 유전자로 삽입될 수 있다. 조절 서열은 조절되는 프로모터일 수 있으며, 예를 들어 유도 가능한 프로모터는 배양 배지가 유도 물질을 함유할 때 인자가 발현되도록 사용될 수 있으며; 유도물질이 인자의 발현 감소 및 다능성 표현형의 손실을 유발하는 것을 제거한다. 인자의 발현을 더욱 조절하는 것이 가능하도록, 프로모터의 제거 또는 불활성화를 가능하게 하는 서열이 또한 포함될 수 있다.
세포에서 인자의 수준을 조절하는 또 다른 방법은, 예를 들어 파지 디스플레이(phage display)를 이용함으로써(Isalan 및 Choo, 2001 Methods in Enzymology 340 p 593-609), 내인성 PDF 유전자의 프로모터에서 서열을 인지하는 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드 도메인을 디자인하거나 선택하는 것이다. 그러한 서열 특이적 DNA 결합 도메인은 전사 활성화 도메인에 융합함으로써 내인성 PDF 유전자의 전사를 활성화하거나 유지하는데 이용될 수 있다. 또는, 그러한 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드 도메인의 사일랜서 도메인(silencer domain)으로의 융합은 PDF 발현을 감소시키는데 이용될 수 있다. 또한, 이러한 융합은 융합 단백질의 세포로의 섭취를 촉진하는 다른 도메인에 연결될 수 있다. 이러한 방법으로, 그 자체가 내인성 PDF 유전자에 작용하는 분자를 세포에 투여하거나 세포에서 발현되도록 할 수 할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있으며, 그 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있으며, 단일 가닥은 암호화 가닥 또는 비암호화(안티센스) 가닥일 수 있다. 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 또는 7에 나타낸 암호화 서열과 동일할 수도 있으며, 유전적 코드의 반복 또는 후퇴의 결과로서 암호화 서열이 그 DNA와 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 서로 다른 암호화 서열일 수 있다.
본 발명의 유리된 폴리뉴클레오티드는 (a) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 또는 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자; (b) (a)의 천연 변이체; (c) (a) 또는 (b)의 오소로그; 및 (d) 생물학적으로 활성이 있으며 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 프래그먼트, 그 유사체, 및 그 유도체를 암호화 할 수 있다.
이러한 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드는 추가의 암호화 서열, 및/또는 성숙한 폴리펩티드의 암호화 서열의 5' 및/또는 3' 에 인트론 또는 비암호화 서열과 같은 비암호화 서열을 포함할 수 있다. 따라서, "폴리뉴클레오티드"의 참조는 추가의 암호화 및/또는 비암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 폴리펩티드의 유일한 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대한 참조를 포함한다.
본 발명은 또한 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 프래그먼트, 유사체, 및 유도체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 발생 변이체 또는 비천연 발생 변이체일 수 있다.
따라서, 본 발명은 인자의 프래그먼트, 유도체, 또는 유사체를 암호화하는, 그러한 폴리뉴클레오티드의 변이체 뿐만 아니라 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 또는 7에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 뉴클레오티드 변이체는 손실 변이체, 치환 변이체, 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO 1, 3, 5, 또는 7에 나타낸 암호화 서열의 천연 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 서열의 대체 형태는 실질적으로 암호화되는 포리펩티드의 기능을 변화시키지 않는, 치환, 손실, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가를 가질 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열 중 하나 이상에 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상기 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에서 혼성화 되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 여기에서 사용된 용어 "엄격한 조건"은 서열 간의 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상일 경우에 혼성화가 일어나는 조건을 말한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 또는 7의 cDNAs가 암호화하는 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
또는, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고 상기한 바와 같이 그와 동일성을 갖는 20 개 이상의 염기, 바람직하게는 30 개 이상의 염기, 및 보다 바람직하게는 50 개 이상의 염기를 가질 수 있으며, 그것은 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 예를 들어, 그러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 발견 또는 진단 프로브로서, 또는 PCR 프라이머로서 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 또는 7의 폴리뉴클레오티드의 프로브로서 이용될 수 있다.
본 발명은 본 발명이 인자를 발현하는데 사용하기 위한 벡터를 제공한다. 제 1 벡터는 상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하기에보다 상세하게 나타낸 본 발명의 실시예에 기재되어 있고 이용되는 벡터는, 인자가 세포에서 발현되고 형질감염된 세포를 다능성 상태로 유지할 수 있도록 세포의 형질감염을 위해 디자인된다. 일반적으로 그러한 벡터는 다음과 같은 작동 연결 요소: 전사 프로모터; 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 DNA 단편; 및 폴리아데닐화 신호을 포함한다. 선택적으로, 그 벡터는 그 벡터를 섭취하고 발현하는 세포를 확인하기 위해 사용되는 부가적으로 선택 가능한 마커를 암호화한다. 예를 들어, 그 벡터는 항생제를 배지에 부가하여 성공적으로 형질감염된 것을 확인하는데 사용하기 위해 항생제 저항성을 암호화할 수 있다. 세포를 형질감염한 다음, 벡터는 염색체상에 통합되거나 염색체 외에 유지될 수도 있으며, 인자의 수준이 세포를 다능성 상태로 하는데 충분하게 유지되도록 벡터 상의 암호화 서열이 발현될 수 있다. 폴리오마 거대 T 항원을 발현하거나 함유하는 세포의 형질감염을 위해 특정 벡터가 디자인된다. 그러한 벡터는 폴리오마 거대 T 항원이 존재할 때 벡터가 세포에 안정적으로 유지되도록 복제의 폴리오마 오리진을 가질 수 있다.
또 다른 조절 및 유동성은 활성이 조절될 수 있는 벡터 상의 프로모터를 이용하여 시스템에 부여할 수 있다. 따라서, 형질감염 후에 프로모터는 비반응성 상태일 수 있으며, 예를 들어 유도 가능한 프로모터를 이용하여 유도물질을 배양 배지에 부가함으로써, 사용자가 언제 프로모터를 활성화할 지를 선택할 수 있도록 한다. 또 다른 방법으로서, 프로모터는 초기에는 활성이 있을 수 있으나, 그 활성은 배양 배지에 리프레서(repressor)를 부가함으로써 감소시키거나 소멸시킬 수 있으며, 이는 사용자가 세포를 다능성 상태로 유지하는 기간 후에 벡터로부터 다능성결정 인자의 발현을 중지시켜 세포가 분화하고 이후에 모든 남아있는 세포의 배양을 실질적으로 제거하는 것을 결정하는 것을 가능하게 한다. 분화된 자손을 제조할 때, 미분화된 세포를 제거할 필요가 있으며, 따라서 본 발명의 이러한 요소는 이러한 능력을 제공한다. 적절한 시스템은 tet 조절 시스템이다(Baron & Bujard, 2000). 벡터는 부가적으로 부위 특이적 재조합에 의해 그 이후의 제거, 또는 그 인자를 암호화하는 서열의 제거를 가능하게 하는 것과 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예의 벡터는, 조절 인자가 본 발명의 인자를 암호화하는 유전자를 조절하는, 조절 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 조절 인자는 유전자로부터의 발현을 활성화하거나, 작동시키거나, 증가시키는데 사용될 수 있으며, 그것은 내인성 유전자이거나 염색체 외에 존재할 수 있다. 이러한 특정 벡터는 수많은 용도를 갖는다. 동물의 유전자 도입 라인은 다능성 결정 인자를 암호화하는 유전자의 작동을 실질적으로 멈추도록 제조될 수 있다. 그런 다음, 유전자 도입 동물을 이용하여, 그로부터 외식(explantation)되고, 벡터의 조절 인자가 다능성 결정 인자의 발현을 작동시켜 다능성 세포의 배양 유지를 가능하게 하는 벡터로 형질감염된 배아 및 다능성 세포를 생성시킬 수 있다. 또는, 조절 인자의 벡터 및 다능성 결정 인자에 대한 조절 가능한 유전자 모두를 함유하는 쌍의 유전자 도입 동물을 생성시킬 수 있다. 그런 다음, 후자를 in vivo로 유도하여 줄기세포를 유동화할 수 있다.
직접적으로 또는 그 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해, 그 인자의 주된 용도는 세포를 다능성 상태로 유지하는 것이다. 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 서열 내인성일 수 있으며, 예를 들어, 원래의 서열은 다능성을 유지하기 위해 활성화되거나, 세포로 도입된 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다. 도입된 서열은 또한 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 인자를 암호화 하는 뉴클레오티드는 또한 안정적으로 통합된 이식 유전자일 수 있다.
본 발명은 따라서 세포 집단에 본 발명의 인자를 투여하는 것을 포함하는 다능성 세포 집단을 유지하는 방법을 제공한다. 또 다른 배양방법은 본 발명의 인자를 암호화 하는 세포 중의 유전자를 활성화 함으로써 세포를 다능성 상태로 유지하는 것이다. 세포를 다능성 상태로 유지하는 또 다른 배양 방법은 본 발명에 따른 인자를 암호화하는 세포 중의 유전자의 발현을 유지하거나 증가시키는 것을 포함한다.
본 발명의 다능성 결정 인자는 체세포 또는 비다능성 세포의 잠재력을 증가시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포를 다능성 결정 인자에 노출시킴으로써 세포의 잠재력을 증가시키는 것을 포함하며, 이러한 노출은 선택적으로 그 인자를 세포에 도입함으로써 또는 그 인자를 암호화 하는 뉴클레오티드 서열을 세포에서 발현시킴으로써 수행될 수 있다. 세포의 잠재력의 증가는 세포의 핵을 재프로그래밍 하는 것과 같은 것일 수 있으며, 이는 체세포 또는 비다능성 세포를 다능성 줄기세포로 전환시키는다. 또는, 본 발명의 인자의 세포에 대한 효과는 세포에 다능성을 부여하는 한 그 잠재력을 증가시키는 것이 아니라, 그 잠재력을 증가시키는 것일 수 있다. 일단 세포가 잠재력이 증가되면, 그 세포는 그런 다음 서로 다른 계통으로 분화가 이루어질 수 있으며, 따라서 본 발명의 인자는 주어진 세포의 계통을 분리시키는데 있어서 유용할 수 있다.
본 발명의 인자는 추구하고자 하는 다능성 세포를 획득하기 위한 서로 다른 수많은 전략을 가능하게 한다. 그러한 전략 중 하나에서는, 본 발명의 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 조절되는 프로모터의 조절 하에서 존재하는 구조물을 함유하는 유전자도입 동물을 생성시킴으로써, 다능성 비인간 세포를 유리한다. 그런 다음, 유전자 도입 배아를 유전자 도입 동물로부터 획득하고, 내배엽 세포 또는 원시 생식 세포와 같은 세포는 그 배아로부터 획득한다. 프로모터의 활성화에 의해 인자가 세포에서 발현되며, 그 결과 다능성 세포가 분리될 수 있다. 그러므로 이러한 접근법에서 유전자 도입 동물은 첫 단계로서 제조되며, 유전자 도입 동물의 생성을 위해 존재하는 이러한 접근법은 특히 적절하다. 유전자 도입 동물을 제조하는 것이 불가능하거나 기술적으로 더 많은 것이 요구되는 종에서 예를 들어 수용할 수 있는 또 다른 접근법에서는, 본 발명의 인자를 암호화 하는 뉴클레오티드를 신선하게 분리된 세포 집단에 도입시킨 다음, 다능성 세포를 분리한다. 후자의 방법에서는, 신선하게 유리된 세포 집단으로부터의 세포를, 인자가 그 세포에서 발현되도록 하나 이상의 세포를 형질감염 시키기 전에 그 세포들이 분화되도록 하는데 충분한 시간동안 배양을 유지하지 않을 정도로 신속하게 형질감염 시킨다. 언급한 바와 같이, 이러한 접근법은 유전자 도입 동물을 만드는 것이 불가능한 포유류 또는 그 이외의 동물로부터 다능성 세포를 유도하고 유지하는데 있어 특별한 유용성을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 방법으로 획득 가능한 유전자 도입 동물 및 조절 가능한 프로모터의 조절 하에서 본 발명에 따른 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 유전자 도입 동물 또한 본 발명 내에 포함된다.
다능성을 유지하는 것을 촉진하는데 인자 및 기능적 유사체, 변이체, 프래그먼트, 및 유도체가 사용되는 방법이 여기에 기재되어 있다. 본 발명의 또 다른 이점 및 다능성 결정인자의 확인은 본 발명자들이 다능성 결정 인자의 활성을 억제하거나 그러한 인자에 대한 길항제로서 작용할 수 있는, 다능성 결정인자에 대한 길항제를 고안하는 기회를 갖는 것이다. 그 인자에 대한 길항제는 다능성 세포의 분화를 촉진하는데 사용될 수 있으며, 이것은 예를 들어 다능성 세포를 배양 또는 in vivo 상태에서 제거하는 것이 바람직한 상황에서 유용성을 갖는다. 본 발명은 또한 인자를 암호화하는 유전자의 우세한 음성 변이체 또는 그 이외의 우세한 음성 돌연변이체를 함유하는 동물과 같은, 인자에 대해 음성이 우세한 동물의 생산을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 본 발명의 인자의 길항제를 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 길항제는 세포치료와 같은 경우에, 환자에게 다능성 세포 유래 자손을 도입하기 전에 다능성 세포를 효과적으로 제거하여, 다능성 세포에 의해 이식된 물질의 오염으로 인한 예를 들어 기형종 및/또는 그 이외의 종양을 피하는데 이용될 수 있다. 이것은 in vivo 또는 in vitro에서 적용할 수 있다. 길항제의 또한 피임약으로서 사용된다. 본 발명의 길항제의 또 다른 용도는 일반적으로 종양의 치료, 특히 본 발명의 인자의 부적절한 발현과 관련된 종양의 치료를 위한 것이다.
본 발명은 본 발명의 인자의 발현 또는 활성이 조작된 세포를 제공한다. 이러한 세포는 다능성 상태를 유지할 수 있다. 본 발명의 제 1 세포는 2 주 이상동안 본 발명의 인자를 발현한다. 본 발명의 또 다른 세포는 (1) 본 발명이 벡터를 포함하는 세포, (2) 피더 세포가 없는 상태에서 그리고 피더 세포 추출물이 없는 상태에서 다능성 상태를 유지하는 다능성 인간 세포, 및 (3) 본 발명에 따른 인자를 암호화하는 유전자를 포함하고 그 유전자가 활성화된 세포이다.
본 발명의 세포는 또한 본 발명의 인자의 기능을 방해하는 분자를 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 하나의 그러한 스크린은 예를 들어 세포 배양 배지에 인자를 제공함으로써 또는 인자를 세포에서 발현시킴으로써 본 발명의 인자의 존재 하에서 다능성 세포를 배양하는 단계, 그 세포를 시험 물질의 존재 하에서 배양하는 단계, 및 세포의 다능성 표현형에 어떠한 변화가 존재하는지 여부를 관찰하는 단계를 포함한다. 이러한 어세이는 인자의 길항제를 선택하거나 그 인자의 활성을 방해하는 그 이외의 분자를 선택하는데 이용될 수 있다. 상기 스크린은 또한 시험 물질이 세포의 분화를 유발시키는 기능을 갖는지 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 세포는 또한 약물 발견을 위한 어세이에 이용될 수 있다. 본 발명의 세포는 또한 세포 치료에 이용될 수 있으며, 따라서 본 발명의 방법은 다능성 세포를 유도하고/거나 유지하기 위해 본 발명의 인자를 이용하는 단계, 그로부터 세포 치료를 위한 세포를 유도하는 단계, 및 그러한 세포를 세포 치료에 사용하는 단계를 포함한다.
cDNA 라이브러리를 스크리닝 하기 위한, 본 발명의 스크리닝 방법은 다능성 세포에서 스크린을 수행하는 단계, 및 자가-재생 표현형을 선택하는 단계를 포함한다. 스크린은 사이토카인 비반응성인 다능성 세포를 이용할 수 있으며, 그럼으로써 외래 인자 및 고유 인자가 확인될 수 있다는 이점이 있다.
본 발명은 또한, 다능성 세포에서 상보성 시험(complementation assay)를 수행하는 것을 포함하는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 자가-재생 표현형을 부여하는 cDNA를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한
세포가 안정하게 다능성 상태로 유지되고 인자의 발현이 조절될 수 있는, 본 발명의 다능성 결정 인자를 발현하는 다능성 세포를 제공하는 단계;
상기 세포의 조작을 수행하는 단계;
다능성 결정 인자의 발현을 감소시키는 단계; 및
다능성 상태로 유지되는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 다능성 세포를 다능성 상태로 유지하는 인자를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
조작은 왜래 인자, 세포 표면 수용체, cDNA 또는 그 이외의 인자의 스크리닝을 위해 고안될 수 있으며, 적절한 조작은 세포의 유전적 조작 및 세포가 배양되는 배양 배지 또는 배양 조건의 조작을 포함한다. 그럼으로써 상기 스크린은 본 발명의 다능성 결정 인자 또는 세포를 다능성 상태로 유지하는 또 다른 인자를 암호화하는 내인성 유전자의 발현을 조절하는 인자를 확인하는데 적절할 수 있다. 바람직하게는, 상기 인자의 발현은 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 결합된 조절 가능한 프로모터를 조절함으로써 조절되어, 세포가 배양되는 배지에 리프레서(repressor)를 부가함으로써 다능성 결정 인자의 활성을 제거하기 위해 인자의 발현을 감소시킬 수 있다. 그런 다음, 다능성을 유지하는 세포를 유리하고, 다능성 결정 인자를 대신하는 인자의 정체를 결정하기 위해 특성화 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 스크린은 내인성 유전자의 조절을 확인하는 것이며, 본 발명은 또한
(1) 전사 인자 결합 부위의 존재에 대해 내인성 유전자를 측접하는 게놈의 부위를 분석하는 단계; 및
(2) 그 부위의 프래그먼트를 ES로부터의 추출물로 스크리닝하여 프래그먼트에 결합하는 추출물의 성분을 확인하는 단계를 포함하는, 본 발명의 다능성 결정 인자를 암호화하는 내인성 유전자의 발현을 조절하는 인자를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
스크린이 다능성 결정 인자의 추정적인 전사 인자인 ES 세포 추출물에서 하나 이상의 구성성분을 인식할 수 있도록 하기 위해, 내인성 유전자에 측접하고 인자의 다능성 세포 제한 발현을 지시하는 게놈의 부위를 리포터 구조물의 형질감염에 의해 적절하게 바람직하게 동정한다. 그 스크린의 결과의 더 이상의 분석은, 세포외 물질을 경유하는 것과 같은 추정 전사 인자의 조절이 이미 동정되었는지 여부 조사하는 것을 포함한다. 그리하여 동정된 조절 인자는 다능성 포유류 세포를 유도하고/거나 유지하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "오소로그"는 다른 종으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 대응부에 해당하는 하나의 종으로부터 획득된 폴리펩티드 또는 단백질을 가리킨다. 오소로그의 서열의 차이는 종분화의 결과이다.
용어 "대립유전자 변이체(allelic variant)"는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 임의의 대체 형태를 가리킨다. 대립유전자 변형은 돌연변이를 통해서 자연적으로 일어나며, 집단 내에서 표현형 다형을 일으킬 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할 수도 있거나(암호화된 폴리펩티드의 변화가 없는 것), 변화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 전사를 제공하는 부가적인 단편에 작동적으로 연결된, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 단편을 포함하는 선형 또는 환형의 DNA 분자를 가리킨다. 그러한 부가적인 단편은 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 복제 오리진(origin), 하나 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 두 개의 요소 모두를 함유할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 분자에 적용될 때, 용어 "유리된"은 폴리뉴클레오티드가 천연 유전적 환경으로부터 제거되어 다른 외래의 또는 원치 않는 암호화 서열이 없는 것을 가리키며, 유전적으로 조작된 단백질 생성 시스템 내에서의 사용을 위해 적절한 형태이다. 그러한 유리된 분자는 천연 환경으로부터 분리된 것이며 cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 유리된 DNA 분자는 통상적으로 관련되어 있는 다른 유전자가 일반적으로 없지만, 프로모터, 인핸서, 및 터미네이터와 같은 조절 요소를 함유하는 천연적으로 나타나는 5' 및 3' 측접 부위를 포함할 수 있다. 관련 부위의 확인은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확할 것이다(예를 들어, Dynan 및 Tijan, Nature 316: 774-78, 1985 참조). 단백질에 적용될때, 용어 "유리된"은 혈액 또는 동물 조직에서 분리된 것과 같은, 단백질이 천연 환경 이외의 조건에서 발견되는 것을 가리킨다. 바람직한 형태에서, 유리된 단백질은 실질적으로 다른 단백질이, 특히 다른 동물 기원의 단백질이 없다. 단백질을 매우 정제된 형태, 즉 95% 초과, 보다 바람직하게는 99% 초과의 순도로 제공하는 것이 바람직하다.
DNA 단편을 일컬을 때, 용어 "작동적으로 연결된"은 프로모터에서 단편이 의도했던 목적, 예를 들어 프로모터에서 전사가 개시되고 암호화 단편을 통해 폴리아데닐화 부위로 진행되는 것과 같은 목적을 위해 결합하여 작용하도록 배열하는 것을 가리킨다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'으로부터 3' 말단까지 읽혀지는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥 폴리머를 가리킨다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 원료로부터 분리될 수 있고, in vitro에서 합성되거나 천연 및 합성 분자의 결합으로부터 제조될 수 있다.
폴리뉴클레오티드와 관련한 용어 "상보(complement)"는 참조 서열에 대하여 상보적 염기 서열 및 역방향을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 가리킨다. 예를 들어, 서열 5'ATGCACGGG3'은 5'CCCGTCCAT3'에 상보적이다.
용어 "변질(degenerate) 뉴클레오티드 서열"는 (폴리펩티드를 암호화하는 참조 폴리뉴클레오티드 분자에 비해) 하나 이상의 변질 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 변질 코돈은 다른 뉴클레오티드 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기(즉, GAU 및 GAC 트리플렛 각각은 Asp를 암호화한다).
용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하는 유전자 부분을 가리킨다. 프로모터 서열은 통상적으로 유전자의 5' 비암호화 부위에서 발견되지만 항상 그러한 것은 아니다.
실시예 1: 다능성 결정인자
스크린의 디자인
cDNA 라이브러리의 기능적 스크린은 2가지 기준을 만족하도록 디자인되었다. 첫째, cDNA가 세포에 도입되고 스크린 동안 유지될 수 있는 빈도는 실제 105-106독립적 cDNA의 복합 라이브러리의 스크링이 가능할 수 있을 정도로 충분히 높아야 한다. 이것은 폴리오마 거대(large) T 항원을 발현하는 LRK1 세포 (하기)와 폴리오마 오리진 함유 벡터 pPyCAGIP (도 1)을 조합하여 사용함으로써 충족된다. 우리가 시험한 에피좀 벡터중에서, 이 벡터가 가장 높은 레벨의 cDNA 발현을 보여주었다(데이타 미도시). 더욱이, 블라스티시딘 S, 하이그로마이신 B 및 제오신에 의한 선택에 비하여, 푸로마이신 선택은 비형질감염된 ES 세포의 가장 신속한 제거를 허용하여, 95% 비형질감염된 세포가 하루만에 사멸된다(데이타 미도시). 따라서, 혼동을 주는 생물학적 활성들의 잠재적 근원을 배양으로부터 신속히 제거한다. 둘째, 스크린의 대상 성질이 스크린이 방해적인 높은 백그라운드 없이 진행될 수 있을 정도로 충분히 낮은 레벨로 형질감염되는 세포에 존재하여야 한다. 이상적으로는, 이 성질이 숙주 세포주에서 발현가능하나 없어야 한다. LRK1 세포는 이 임계적 기준을 만족한다. 시험관내 분화 동안, LIF 좌(locus)로부터의 발현이 증가하고(Rathjen et al. 1990), 다수의 ES 콜로니가 분화된 세포 단층으로부터 출연하는 것을 볼 수 있다(Dani et al. 1998). 이들 재출연 콜로니들의 대부분은 LIF의 작용에 의해 나타난다(Dani et al. 1998). LIF에 반응성을 유지하는 E14/T 세포는 이러한 분화후 백그라운드 자가-재생(self-renewal)을 나타낸다. 이와 대조적으로, LIFR을 통해 작용하는 사이토카인에 대한 반응성을 상실한 LRK1 세포는 IL6 및 sIL6R의 회수(withdrawal) 후에 훨씬 적은 수의 콜로니를 생성한다. 이러한 백그라운드 자가-재생의 감소는 이들 세포를 사용하여 라이브러리 스크린을 수행할 수 있을 정도로 충분하다.
LRK1 세포의 제조
cDNA 라이브러리 스크린을 고효율로 진행할 수 있도록 하기 위해, 폴리오마 오리진 함유 벡터로 고 빈도로 슈퍼형질감염(supertransfect)될 수 있는 세포가 필요하다. 플라스미드 pMGD20n대 (Gassmann et al. 1995)로 형질감염된 E14Tg2a 세포의 유도체인 세포주 E14/T가 이 세포주로 선택되었으며, LIF의 회수시 효율적으로분화하는 능력을 지녔다. 이 세포주에 대해 LIFR 좌를 겨냥한 유전자 타게팅을 2회 수행하였다. 사용된 타케팅 벡터는 전기된(Li, Sendtner & Smith, 1995) 것과 동일한 상동 아암(arms)을 사용하였으나, 선택성 마커 카세트는 유전자 타케팅의 1, 2회에 각각 IRESBSD게A 및 IREShphpA 카세트로 대체되었다. 결과의 세포주 (LRK1)는 높은 슈퍼형질감염 효율을 가졌으며, LIF 또는 LIFR의 자극을 통해 ES 세포의 자가-재생을 지시할 수 있는 기타 사이토카인들에 더 이상 반응성을 보이지 않았다. LRK1 세포는 IL6 및 sIL6R의 존재하에 일상적으로 유지되었고, 이것은 gp130 (Yoshida et al., 1994)을 통해 ES 세포의 자가-재생의 자극을 허용하였다.
라이브러리 구축
γ-조사된 1차 마우스 배아 섬유아세포와 EX 세포의 공-배양 (ZHTc6 cells; Niwa et al. 2000)을 개시하여 사이토카인이 결여된 표준 ES 세포 배지에 유지하였다. 공-배양에서의 세포수는 MEFs가 콘풀루언트 단층을 형성할 정도였고, ES 세포는 그들이 성장 3일 후 MEFs를 초과할 정도로 파종(seed)되었다. 알칼라인 포스파타제 (ES 세포의 마커)에 대한 대표적 플레이트의 염색은 세포 용해시 존재하는 ES 세포 수를 추정케 하였다. 이는 12:1의 ES RNA/MEF RNA 비를 보여주었다. RNA는 20F180 플라스크의 세포로부터 제조되어, 폴리아네틸화된 RNA가 제조되었다. RNA 정량이 LIFR 전사체의 노던 블롯 실험에 의해 모니터되었는데, 검출가능한 분해가 없고 예리한 11kb 밴드를 생성하는 RNA만을 이후 연구에 사용하였다. cDNA는 cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 Superscript 플라스미드 시스템 (LifeTechnologies)에서 제공되는 시약을 사용하여 올리고 d(T) 프라이밍에 의해 폴리아데닐화된 RNA로부터 합성되었다. cDNA를 폴리아크릴아마이드 젤상에서 분획화하고, 전기용출(electroelution)에 의해 cDNA > 1kb를 수거한 후 cDNA를 XhoI/NotI 분해된 pPyCAGIPso에 리이게이션하였다. E.coli 균주 DH10B의 전기천공(electroporation)후에 7.4 x 1051차 재조합체의 라이브러리가 생성되었다. 각각 5 x 104-105콜로니로 파종된 15cm 직경 페트리 디쉬 상에 하룻밤 배양후에 박테리아로부터 DNA를 제조하였다.
라이브러리 스크린
라이브러리 또는 빈(empty) 벡터로부터 DNA(25㎍)를 전기천공에 의해 LRK1 세포(6x106)내로 도입하였고, 세포를 106/9cm 디쉬 또는 5x104/9cm 디쉬에 파종하여 IL6/sIL6R에서 배양하였다. 2일 후, 배지를 푸로마이신을 포함하도록 바꾸고, 사이토카인을 고밀도 플레이트로부터 회수하였다. 사이토카인을 저밀도 플레이트상에서 유지시켜 형질감염 효율을 모니터하였다. 형질감염후 9일째까지 배지를 매 2일마다 갈아주었다. 이 시점에서, 모조(mock) 형질감염된 플레이트상에 살아남은 세포가 전혀 없었고, 빈 벡터만으로 형질감염된 플레이트는 오직 분화된 세포만을 함유하였다. 이와 대조적으로, 라이브러리 DNA로 형질감염된 몇몇 플레이트는 형태학적으로 미분화 세포를 닮은 콜로니를 함유하였다. 따라서, 이들 플레이트상의 세포로부터 염색체외(extrachromosomal) DNA를 제조하여, E.coli DH10B에 전달하였다. DNA를 104박테리아 콜로니의 푸울(pools)로부터 제조하였으며, 이를 LRK1 세포내로 재도입하였고, 상기와 같은 선택공정을 반복하였다. 10 푸울중에 2개의 외관상 양성(positive)을 스크린하였고, 염새체외 DNA를 혈질감염후 14일째 이들로부터 제조하였다. 이들 푸울중 하나로부터의 DNA를 하기와 같이 계속 시험하였다. E.coli DH10B로의 전달후에, 약 250 콜로니의 푸울로부터 DNA를 제조하여, LRK1 세포내로 재도입하고, 선택공정을 반복하였다. DNA는 형질감염후 14 또는 19일째의 세포로부터 제조하였다. 이들을 E.coli DH10B에 전달하였고, 형질감염후 14일째에 수거된 DNA로부터 12 미니프렙 DNAs를 제조하였고, 형질감염후 19일째에 수거된 DNA로부터 9 미니프렙 DNAs를 제조하였다. 이들 DNA는 5' 클로닝 부위의 상류에 위치한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 시퀀싱하였다.
결과의 확인
형질감염후 19일째에 제조된 9 DNAs의 서열 분석은 이들 플라스미드중 하나가 부분 cDNA를 함유하였고, 하나가 해석불가능한 서열을 주었고, 두 개가 Genbank 데이터베이스의 한 전장 서열과 매치하는 동일 서열을 주었다는 것을 보여주었다. 나머지 5 플라스미드중 4개는 cDNA 삽입체가 결여되고 IRES의 상호 2 염기쌍내에 결실을 가졌다. 마지막 플라스미드는 cDNA 삽입체가 결여되고 IRES로부터 275 염기쌍 더 제거되는 결실을 가졌다. 이들 플라스미드중 일부가 자가-재생 활성을 가지는지 확인하기 위해, 모든 9 플라스미드의 동량을 함유하는 푸울을 제조하여 LRK1세포에 형질감염하고 상기 선택공정을 실시하였다. 빈 벡터 대조군으로 병행 형질감염된 세포가 모두 분화되는 것과 대조적으로, 9 플라스미드 DNA의 푸울로 형질감염된 세포는 미분화된 형태학을 보여주었다. 9 플라스미드중에 어떤 것이 자가-재생 활성을 갖는지를 결정하기 위해, 각 플라스미드를 LRK1 세포에 형질감염시키고 상기 선택공정을 반복하였다. 부분 cDNA를 함유하거나, 해석불가능한 서열을 갖거나 IRES 내 2 클래스중 하나의 결실을 갖는 플라스미드는 자가-재생 활성을 부여하지 못하였다. 이와 대조적으로, Genbank 데이터베이스의 전장 서열과 매치하는 2 플라스미드 둘다는 자가-재생 표현형을 재복종(re-capitulate)하였다. 이것은 형태학적으로 그리고 10일간 마커 알칼라인 포스파타제의 지속적 발현에 의해 판단되었다.
형질감염후 14일째 제조된 12 DNAs의 서열분석은 이들중 4개가 상기 2 플라스미드와 동일 서열이 매치되었는 것을 보여주었다. 이들중 하나를 LRK1 세포내로 형질감염하였을 때 사이토카인-비의존성 자가-재생을 부여하는 능력을 가졌는데, 이는 미분화된 콜로니 형태학의 유지와 적어도 14일간 알칼라인 포스파타제의 지속적 발현 그리고 적어도 8일간 지속적 Oct4 발현에 의해 판단되었다. 더욱이, cDNA 서열이 오픈 리딩 프레임에 제한되는 유사한 플라스미드와 PDF cDNA의 형질감염 비교는 PDF 활성이 ORF 내에 위치한다는 것을 보여주었다.
실시예 2: 리버서블 (Reversible) 다능성 결정인자( PDF ) 전달유전자( transgene )
ES 세포에서 PDF의 발현에 의해 유발된 사이토카인 비의존성 다능성 표현형의 획득이 리버서블한지 증명하기 위해, PDF를 코딩하는 전사단위가 부위-특이적 재조합에 의해 절제(excise)될 수 있는 전달유전자를 제조하였다.
시작점으로, 초기 라이브러리 스크린에서 동정된 PDF 코딩 플라스미드를 변형시켜 PDF의 프로모터와 번역 개시 코돈사이에 한 loxP 부위를 놓고, 두 번째 loxP 부위를 폴리아데닐화 신호후에 놓았다. loxP 부위의 하류는 GFP 지시 유전자의 코딩 서열과 폴리아데닐화 신호가 뒤따라왔다. 이로 인해, 절제된 loxP 측접된(flanked) PDF 유전자를 갖는 세포들이 그들의 변화된 형광 색깔에 의해 동정될 수 있다(도 2 참조)
PDF 코딩 플라스미드를 벡터 백본에 선형화하고, 초기배-계(germ-line) 컴피턴트 E14Tg2a 세포에 형질감염시켰다. gp130 자극 사이토카인가 결핍된 배지에서 성장하는 세포를 선택하였다. 각 클론을 녹색 형광에 대해 조사하고, 비형광 클론을 2주간 사이토카인 부재하에 팽창시켰다. 죽타크라인(juxtacrine) LIF 패밀리 멤버의 자가-재생 효과를 제거하기 위해, LIF 길항제 hLIF-05를 이 시기동안 배지에 첨가하였다. 그후에 배양을 두 개로 나누었다. 이들 배양의 하나는 상기된 대로 유지하였고, 다른 것은 LIF에 유지시키고 Cre 코딩 프라스미드(pCAGGCreGS)로 형질감염시켰다. 2일후, 세포를 저밀도로 플레이팅하고, 각 콜로니를 현미경으로 관찰하였다. 녹색 형광 콜로니들이 팽창하였고, 그들의 게놈 DNA가 분석되어 전달유전자 PDF 서열의 절제를 확인하였다.
다음 플록스된(floxed) PDF 유전자 또는 절제된 전달유전자 둘다를 수반하는세포를 포배(blastocysts)에 별개로 주입하였고, 수용(recipient) 포배를 수양모(foster mothers)에 전달시켰다. 그후 여러시간에, 배(embryo)를 해부하여 분석하였다. 형광 현미경은 절제된 전달유전자를 수반하는 세포의 모든 3 초기배(germ) 층의 태아 조직에 대한 공헌을 결정할 수 있도록 하였다. 일부 키메라가 태어나고 후속적으로 짝짖기를 시켜서 상기 조작된 ES 세포로부터의 초기배계 전달을 증명하였다.
실시예 3: 다능성 세포에서 PDF mRNA 의 발현 분석
노던 블롯 분석은 PDF mRNA가 EC 및 ES 세포에서 발현되고, NIH3T3 섬유아세포 및 B9 미엘로이드 세포와 같은 다능성이 아닌 세포주에서는 발현되지 않는 것을 증명하였다. 더욱이, PDF 발현은 ES 세포가 배양물에 레틴산을 첨가하여 분화를 유발하였을 때 감소하였다. 인시츄(in situ) 혼성화 실험은 PDF mRNA가 발달 3.5일째 배아의 내세포괴(inner cell mass)에 존재하지만, 후기 포배 또는 에그 실린더 단계 배아에는 존재하지 않는다는 것을 가리킨다. 따라서, 발현은 스스로 확립된 다능성 줄기세포주 또는 줄기세포가 확립될 수 있는 배아 다능성 세포와 상관되었다.
따라서, 노던 블로팅 분석은 PDF mRNA가 cDNA 라이브러리가 합성된 ES 세포/MEF 공-배양에서 발현된다는 것을 확인시켰다(도 4A). 이 분석은 또한 PDF cDNA가 작은 B2 전사체에 혼성화한다는 것을 확인시켰다. PDF ORF에 제한된 프로브가 사용되었을 때 B2 혼성화가 제거되었다. 따라서, 후속 노던 및 인시츄 분석은 ORF 프로브를 이용하였다. 발현은 MEFs 단독에서는 검출되지 않았고, ES 세포와 공-배양된섬유아세포에서 PDF 발현 유도의 증거도 없었다(도 4B). 이는 공-배양에서 ES 세포가 PDF cDNA의 소스라는 것을 가리킨다. 여러 세포주의 분석은 PDF 발현이 매우 제한되어, 체강벽 내배엽(parietal endoderm), 난황 낭(yolk sac), 섬유아세포 및 조혈(hematopoietic) 세포에서는 검출불가능하다는 것을 가리켰다(도 4C). 발현은 ES 세포, EG 세포 그리고 LIF 의존성 (PSA4) 및 LIF 비의존성 배아 암세포주 둘다에서 검출되었다.
PDF의 인간 오소로그(orthologue)의 시험은 대응 mRNA가 배아 암세포주에서 발현되나 림포이드 세포주에서는 발현되지 않는다는 것을 보여주었다(도 4E). 여러 성인 마우스 조직을 PDF mRNA에 대해 조사하였으나, 총 RNA의 노던 혼성화에 의해 어떤 발현도 검출되지 않았다(도 4F). 다음 ES 세포 분화동안 PDF mRNA의 발현을 분석하였다. 레틴산 또는 3-메톡시-벤즈아미드 처리에 의해 유발된 분화를 통해, PDF mRNA의 레벨이 신속히 감소되었다(도 4D). 분화되고 미분화된 세포의 혼합물을 갖는 콜로니의 형성을 허용하기 위해 LIF 레벨이 감소된 ES 세포 배양물의 인시츄 혼성화 시험은 PDF 발현이 미분화된 세포에 제한된다는 것을 보여주었다(도 4B).
Pdf mRNA는 다능성 ES 및 EG 세포, 그리고 마우스 및 인간 EC 세포 둘다에서도 발견되었지만, 다른 타입의 세포주에는 없는 것을 보여진다(도 4, 데이터 미도시). Pdf 발현은 ES 세포 분화 초기에 하향-조절되는데, 이는 다능성 줄기세포 동정(identity)과 밀접한 관계가 있다.
실시예 4: 피더 / 피더 추출물의 부재하에 다능성 인간 배아 줄기세포의 유지
인간 ES 세포를 100 유니트/ml LIF, 1mM 글루타민, 0.1 mM 2머캅토-에탄올, 1% 비필수 아미노산, 4ng/ml 베이직 섬유아세포 성장인자 및 20% 녹아웃 SR (무혈철 조제)로 보충된 80% DMEM 배지 (GIBCO-BRL)에서 γ-조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 피더(feeder)층상에 배양하였다.
도 1에 도시된 플라스미드(마우스 PDF 서열이 인간 PDF 서열로 치환된 유사 플라스미드뿐만 아니라)를 벡터 백본에 선형화시키고 인간 ES 세포에 형질감염시켰다. 형질감염은 프로토콜이 107인간 ES 세포를 사용하도록 스케일업한 것을 제외하고, Eiges et al.에 개시된 ExGen 500 방법을 사용하였다. 형질감염 다음날에, 세포를 트립신처리하고 두 개로 나누었다. 한 반쪽의 세포들을 104/cm2의 밀도로 푸로마이신 저항성 MEFs의 층상에 플레이트하고, 다른 반쪽의 세포들을 104/cm2의 밀도로 푸로마이신 민감성 MEFs의 층상에 플레이트하였다. 푸로마이신은 매 3-4일마다 치환되는 배양물과 배지에 첨가된다. 약 14일째, 피더상에 성장하는 여러 푸로마이신 저항성 인간 ES 세포 콜로니들을 트립신 처리와 젤라틴 피복된 플레이트상에 직접 플레이팅하여 피더 층의 부재하에 성장하는 능력에 대해 시험하였다.
푸로마이신 저항성 ES 세포주는 6주에 걸쳐 피더 층의 부재하에 연속적으로 계대되고 서브클로닝되는 능력에 대해 평가하였다.
다음 상기와 같이 플로스된(floxed) PDF 발현 카세트의 절제에 따른 이들 세포의 분화능을 시험하였다(Eiges et al. 2001).
실시예 5: PDF cDNA 의 특성화(characterization)
SMART (http://smart.embl-heidelberg.de (Letunic at al., 2002; Schultz et al., 1998))를 이용한 PDF 서열에서의 인식가능한 도메인을 서치한 결과 아미노산 잔기 96 및 155 사이에 호메오도메인의 존재를 나타냈을뿐, 다른 종래 특성화된 단백질과 명백한 관련성을 발견할 수 없었다. 또한 BLAST에 의한 분석은 PDF가 NK2 패밀리의 여러 맴버와 가장 근접하게 관련된다는 것을 보여주었다. 그러나, 어느 경우에도 동일성(identity)이 50%를 초과하는 경우는 없었다(도 3). 따라서, PDF는 신규 호메오도메인 패밀리의 일원이거나 특유한 변종 호메오도메인일 것이다(Shashikant et al., 1991).
PDF와 가장 근접하게 연관된 인간 서열의 비교는 전체적으로 60%의 동일성을 나타내었다. 서열보존은 호메오도메인 부위가 가장 두드러져 두 서열의 동일성이 87%이었다(도 3B). 이것은 PDF 호메오도메인과 다른 마우스 단백질사이의 보여지는 동일성 레벨을 훨씬 초과하는 것으로서, 이것이 PDF의 인간 오소로그라는 것을 가리킨다. 8 비-동일성 아미노산중에서 6개가 DNA 타겟과 좀 덜 연관된다고 간주되는 호메오도메인의 영역인 a-헬릭스 1 주변의 N-말단 아암에 위치된다. 호메오도메인바깥에 4개 이상의 아미노산 잔기들의 연속 스트레치가 보존된 4개의 영역이 있다. 이들 보존 영역들중, 오직 한 개, 세린 리치 모티프가 호메오도메인의 N-말단이고, 나머지는 호메오도메인의 C-말단에 놓여있다. 인간 서열은 이들 C-말단 동일성 모티프의 첫 번째와 두 번째사이에 7개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 마우스 서열에서, 호메오도메인과 C-말단 보존 서열사이에 46 아미노산 스트레치가 있고, 여기서 매 8번째 잔기는 트립토판이다. 또한, 이 서열내에 첫 번째 31 아미노산들은 서열 WnsQTWTNPTW(n=G,S,N 및 s=S,N)의 단순 반복을 나타낸다. 인간에서 서열의 보존은 덜 두드러져서 마우스 서열에 비해 짧은 결실을 포함한다. 여기도 16번째 잔기를 제외하고 매 8번째 잔기가 트립토판이다.
PDF mRNA의 3'UTR에, PDF에 반대 전사 방향으로 지향된 B2 반복요소가 있다(도 3C). 이 서열이 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되는지는 불명확하나, 분할된 프로모터의 서열은 그것일수 있다는 것을 제시한다(Galli et al., 1981). B2 요소가 배아 세포에서 고 레벨로 발현되기 때문에(Ryskov et al., 1983), PDF mRNA의 3'UTR내의 B2의 존재가 직접 전사 방해를 통하거나 더 간접적인 방법에 의해 PDF 유전자 발현의 조절에 기여할 가능성이 있다.
실시예 6: 마우스 ES 세포에서 hPDF 기능의 분석
인간 PDF 오소로그의 마우스 PDF 활성의 복제 능력을 시험하기 위해, pPyCAGIP 벡터에 인간 ORF를 집어넣고 마우스 ES 세포를 형질감염시켰다. 이것은 인간 서열이 마우스 ES 세포의 사이토카인 비의존성 자가-재생을 지시할 수 있다는 것을 보여준다(도 3). 이 활성은 마우스 PDF에 비해 감소되었는데, 이는 아마도 상당한 서열 상이 때문일 것이다. PDF의 효과의 특이성을 PDF와 가장 근접하게 연관된 마우스 호메오박스 유전자중 하나(Nkx2.5)의 ORF를 ES 세포에서 발현시키는 유사한 실험에 의해 시험하였다. 이 경우 사이토카인 비의존성 자가-재생이 전혀 발견되지 않았고, 사실 결과의 세포는 LIF의 존재하에도 형태학적으로 분화된 나타내었다. 이것은 사이토카인 비의존성이 PDF에 의해 특이적으로 부여되며, 호메오도메인 단백질의 공통 특징이 아님을 가리킨다.
실시예 7: mPDF 의 생체내 (in vivo) 발현
우리는 PDF mRNA의 분포를 생체내에서 시험하였다(도 5). 초기 분할 단계에서는 발현이 관찰되지 않았다. PDF mRNA 발현의 첫 번째 신호는 컴팩트된 상실배(compacted morulae)에서 관찰되었다. 혼성화 신호가 미래 내세포괴(inner cell mass)인 인테리어(interior) 세포에 위치된다는 것은 놀라운 일이다. E3.5 포배에서, 발현은 내세포괴의 세포에 한정되고 트로펙토덤(trophectoderm)에는 존재하지 않았다. 후기 포배에서, PDF mRNA는 외배엽(epiblast)에 더욱 한정되고 원시 내배엽(endoderm)에서 배제된다. PDF 전사체는 후기 상실배(morulae) 및 중기 포배사이에 최고 레벨로 주기적 파동을 나타낸다. 이식직전 포배에서, PDF mRNA 레벨은 가시화 레벨미만으로 떨어졌다. 그러나, 중요하게 전사체는 디아포즈(diapause)에서 포배의 외배엽에서 검출가능하게 유지되었다. 우리는 또한 시원(primordial) 생식세포에서도 PDF 발현을 시험하였는데, 그들이 다능성 EG 세포로 바뀔 수 있기 때문이다(Matsui et al. 1992)). 발현은 E8.5에서 이동성 생식세포에서 명백하지 않으나, PDF mRNA는 시원 생식세포에 위치화를 가리키는 패턴으로 E11.5 배아의 생식 융기(ridges)에서 쉽게 검출가능하다(도 5B).
실시예 8: 다능성의 기타 알려진 매개인자들과 PDF 의 관련성
증가하는 레벨의 PDF에 대한 ES 세포의 투여량(dose) 응답은 LRK1 세포에서 에피좀 발현에 의해 평가되었다. 이것은 cDNA 발현의 서로다른 레벨을 지시하는 에피좀 구조체의 형질감염에 의해 성취되었다(도 8A). 사이토카인 부재하에 자가-재생할 수 있는 결과 콜로니의 비율은 gfp 발현 레벨을 측정하는 유사 연구(데이타 미도시)에 기초된 에피좀의 예상되는 발현 레벨과 연관되었다. 더욱이, 통합된 PDF 전달 유전자를 운반하는 세포에 대해 관찰하였을 때, PDF 에피좀 운반 세포의 배양물에 LIF의 첨가는 형성된 자가-재생 콜로니의 개수 및 콜로니 형태학으로 평가시 자가-재생을 증가시킨다. 본질적으로 동일한 결과가 CCE 유래 폴리오마 대(large) T 발현 세포주 MG1.19내로 동일 DNA를 형질감염에 의해 얻어졌다(Gassmann et al., 1995). 우리는 gp130 신호와 PDF 과도발현의 협동 효과가 STAT3의 전사 표적인 PDF 유전자에 기인한 것인지를 조사하였다. gp130의 세포내 부분이 GCSF-R의 세포외 부분과 연결된 키메라 리셉터를 사용하여, ES 세포에서 STAT3 표적을 조사하는 것이 가능하다. 모두 잠재적 STAT 표적인 8개의 알려진 SOCS 패밀리 맴버들의 분석은 ES 세포에서 LIF에 의해 오직 SOCS3만이 심각하게 자극된다는 것을 가리켰다(도 8B 및 데이터 미도시). 이 자극은 타이로신을 페닐알라닌으로 돌연변이시켜 리셉터에서 4개의 STAT 결합 부위가 STAT3 결합으로부터 방해되었을 때 발생하지 않는다(도 8B). 이와 대조적으로, 네가티브 조절 타이로신이 유사하게 돌연변이되었을때 SOCS3 유도는 향상되고 유지되는데, 이 결과는 이들 세포에 지속적인 STAT3 활성화가 관찰된 것과 일치한다(Burdon et al., 1999). SOCS3로 자극과 대조적으로, PDF 발현의 유도가 LIF 자극시 또는 키메릭 리셉터 발현 세포의 G-CSF 자극시 명백하지않았다(도 8B).
실시예 9: Oct 4와 PDF 의 관련성
ES 세포의 자가-재생에서 Oct4를 대체하는 PDF의 능력을 ZHBTc4.1 세포를 사용하여 시험하였다. 이들 세포는 Oct4의 두 개의 무효(null) 대립유전자을 운반하나, 이들 자가-재생은 옥시사이클린 반응성 Oct4 전달유전자의 존재에 의해 유지될 수 있다(Niwa et al., 2000). Oct4 전달유전자의 발현이 독시사이클린의 투여에 의해 억제될 때, 세포는 분화한다. ZHBTc4.1 세포는 어떤 삽입체, Oct4 또는 PDF도 갖지 않는 선형화된 pPyCAGIP 서열로 형질감염되었다. 상기와 같이, 이 Oct4 플라스미드는 Oct4 전달유전자의 독시사이클린 유도된 억제에 의해 유발된 분화를 저해한다(Niwa et al., 2002). 그러나, PDF 발현 벡터는 그럴 수 없었다(도 8c). 따라서, 비록 PDF가 gp130-매개된 gp130 자극의 부재하에 ES 세포 표현형을 유지할 수 있더라도, 그것은 Oct4의 부재하에서는 그렇게 할 수 없다.
실시예 10: ES 세포 동일성이 PDF 발현에 의해 충실하게 유지된다
우리는 폴리오마 LT를 함유하지 않는 ES 세포에서 PDF 형질감염의 결과를 조사하였다. loxP 함유 구조체를 사용하여 PDF cDNA가 Cre 재조합효소에 의해 후속적으로 절제될 수 있도록 하였다. 안정한 통합체(integrants)의 분리후에, 부위 특이적 재조합이 사용되어 PDF ORF를 제거하고 동시에 GFP를 CAG 프로모터 대조군하에 놓을 수 있다(도 6A). PDF 전달유전자의 절제는 임시 전달유전자 발현에 의해 유발된 세포의 어떤 유전적 또는 유전외적 변화도 평가할 수 있도록 해준다. 이들 실험에서, 우리는 PDF 과대발현 세포의 gp130 시그날링의 부재하에 클론성으로 번식하는 능력을 시험하는 것을 목적으로 했다. 우리는 두 이슈를 시험하길 원했는데, 첫 번째는 보강된 PDF 발현이 다양한 환경에서 분화를 방해하는지 이고, 두 번째는 다능성 및 배아 콜로니형성 능력이 gp130 시그날링의 부재하에 유지될 수 있는지이다.
클론성 형질감염체는 푸로마이신에서 선택에 의해 분리되었고, PDF 전달 유전자 mRNA의 발현은 노던 분석에 의해 확인하였다(도 6B). 세포를 저밀도로 파종하고, 적어도 7일간 2 계대에 걸쳐 LIF 길항제인 hLIF-05(Vernallis et al., 1997)의 존재하에 팽창시켰다. hLIF-05는 모든 알려진 LIF-R 리간드가 LIF-R/gp130 복합체에 연결하는 능력을 차단한다. 병행 처리된 부모(parental) 세포는 오직 팽창을 못하는 분화 세포만을 생성하였다. 이와 대조적으로, 플록스된 PDF-IRES-pac 카세트를 함유하는 세포주는 미분화 형태학을 유지하였고, 계속 증식하였다. 후속적으로, LIF가 첨가되고 세포가 일시적으로 Cre로 형질감염되었다. PDF 발현 카세트가 제거된 콜로니는 GFP 발현과 푸로마이신 감수성의 회복에 의해 동정되었다. 이 절차는 두가지 독립적 ES 세포주 E14Tg2a 및 ZIN40을 사용하여 수행하였다. 염색체 분포는 여러 결과 클론에 대해 시험하였는데, 모든 경우에서 우세하게 40XY로 밝혀졌다.
콜로니 형성 시험이 PDF 형질감염체 및 Cre-처리된 유도체의 표현성의 엄격한 평가로서 실시되었다. 세포를 LIF로 보충되거나 LIF가 없는 또는 LIF 길항제 hLIF-05로 보충된 배지에서 클론성 밀도로 플레이트하였다. 6일 배양후에, 플레이트를 알칼라인 포스파타제 활성에 대해 염색하고, 오직 미분화 세포로만 구성된 콜로니의 비율을 정량하였다(도 6C). 부모 또는 GFP 발현 세포도 LIF의 부재하에 또는 LIF 길항제의 존재하에 어떤 완전 미분화된 콜로니들도 형성하지 않았다. 그러나, PDF 형질감염체는 상당수의 그러한 순수 줄기세포 콜로니들을 발생시켰다. LIF의 첨가시 이 비율은 >80%의 콜로니까지 증가하였다. 전달유전자의 Cre 매개된 절제후에, 이러한 LIF의 향상된 응답도 상실되었다.
LIF의 존재 또는 부재하에 완전 미분화된 콜로니를 형성하는 PDF 전달 유전자를 발현하는 세포의 비율의 차이가 콜로니의 형태학의 변화를 동반하였다(도 6D). 둘다 경우에 콜로니들은 빈약한(scant) 세포질과 풍부한(prominent) 인을 갖는 작은 미분화 세포로 구성된다. LIF 없이, PDF 발현자는 단층으로 성장하였고, LIF 존재하에 배양된 부모 또는 Cre-처리된 유도체 ES 세포로부터 본질적으로 구별불가능하다. 그러나, LIF 플러스 PDF 발현의 조합은 콜로니가 매우 빽빽한 형태학을 채용하도록 유발하였고, 여기서 세포는 기층(substratum)위에 성장해나가기 보다는 서로에 우선적으로 부착하였다. 이것은 피더 층상에 배양된 ES 세포의 "전형적인(classical)" 외양과 유사하다.
PDF의 강요된 발현은 ES 세포가 gp130 자극의 부재하에 자가-재생하도록 허용하였고, 그 배양 조건에서 부모 세포가 분화한다. 우리는 다음 PDF 발현자 세포가 통상 분화를 유발하는 시약에 노출시 자가-재생 또는 분화되는지를 결정하였다. 3-메톡시벤즈아미드(MBA) 또는 모든-트랜스 레틴산(RA)에 노출후 4일간 배양시 PDF 발현 세포는 미분화된 외양을 유지하는 반면, GFP 유도체 및 부모세포의 배양물은형태학적 분화를 겪었다(데이타 미도시). 이들 형태학적 특징은 Cre-유도체에서 급격한 하향-조절과 비교하여 PDF 발현자에 의한 Oct4의 계속적 발현에서 분자 레벨로 반영되었다(도 6E). 이들 데이터는 PDF 형질감염체가 단층 배양에서 통상 분화를 지시하는 자극에는 저항성이나 전달유전자 절제후에 분화 능력이 회복된다는 것을 확인하였다.
다음 PDF 발현 세포가 분화 유도 세포간 상호작용에 응답하는 능력이 현탁 배양물에서의 응집에 의해 조사되었는데, 그 조건은 부모 ES 세포로부터 다중분화된 배양체(embryoid body)의 형성을 유도한다(Doetschman et al., 1985). 응집 배양에서 8일후에, 배양체를 48 웰 디쉬의 웰당 단독 플레이팅하고, 이어서 심근세포(cardiomyocyte) 분화의 지시자인 자발적 수축에 대해 매일 측정하였다. 도 7A는 심장생성(cardiogenesis)의 발생율이 그들의 Cre 유도체에 비해 PDF 발현자에서 약 50%정도 감소된다는 것을 보여준다. 더욱이, PDF 발현자로부터 심근(cardiac) 세포의 출현도 그들의 Cre 유도체에 비해 지체된다. 사실 도 7의 그래프는 두 개 클래스사이의 차이를 과소평가하고 있는데, 왜냐하면 플로스된 전달유전자를 발현하는 세포에서 유래된 웰이 오직 작은 박동(beating) 면적을 함유하는데 반해, Cre 유도체 세포로부터 유래된 웰은 광범위한 박동 면적, 몇몇 경우 전체 파생물을 커버하는 면적을 가지기 때문이다. 배양체를 또한 응집 배양의 마지막 4일간 레틴산에 노출시키고 뉴론(neuronal) 분화를 선호하는 조건하(Bain et al., 1995; Li et al., 1998)에 플레이트하였다. E14Tg2a 세포는 뉴론-특이적 타입 III b-튜불린 (TuJ)을 발현하는 다수의 뉴론 형태학의 세포를 형성하였다(도 7B). LIF의 계속적 존재는TuJ 양성 세포의 분화를 저해하였다. TuJ 양성 세포의 출현은 또한 플로스된 전달유전자를 발현하는 ES 세포에서 유래된 배양에서 차단되었으나, 그들의 Cre 유도체에서 회복되었다. 그러나, E14Tg2a(+LIF) 및 EF4 배양물로부터의 웰에 잔류하는 세포의 외양은 동일하지 않았다. 전자가 ES 세포의 형태학을 갖는 세포를 많이 함유하는 반면, PDF 발현자는 더욱 분산된 외양을 가졌는데, 이는 그들이 부분적으로 분화될 수 있음을 제시한다. 이들 관찰은 PDF 발현 ES 세포가 다중세포 응집체에서 효율적으로 분화를 진행하지 않지만, 어느 정도의 분화는 여전히 유도된다는 것을 가리킨다. 가장 중요하게는, Cre 유도체 세포주가 그들이 모든 시험 조건하에 분화에 대해 정상 ES 세포에 대한 비교가능한 잠재능을 가지는 것으로 보아 향상된 PDF 발현에 의해 유발된 클론성 팽창의 시기에 의해 영향받지 않는 것으로 나타난다.
마지막으로, 우리는 PDF의 강요된 발현이 배아 콜로니화 성질의 유지에서 LIF-R/gp130 매개된 시그날링의 필요성을 회피할 수 있는지를 조사하였다. 외생적 PDF 서열이 Cre 매개된 절제에 의해 제거된 PDF 형질감염체(LIF 부재하에 분리한 다음 1주 동안 LIF 길항제의 존재하에 배양된)를 마우스 포배에 주입하였다. 최근까지 우리는 PDF 형질감염체중 하나로부터 Cre 유도체 세포주를 평가하였다. 임신 중기 결과 키메라의 시험은 GFP 발현으로 관찰시 발달중 배아 조직으로의 세포의 폭넓은 기여를 증명하였다(도 7D). 유사하게 주입된 배아는 끝까지 가서 살아있는 키메라의 생성을 초래하였다(표 1).
이들 결과는 다음 사실을 확립하였다: (i) PDF 전달유전자를 발현하는 세포는 사이토카인 비의존성 방식으로 자가-재생한다; (ii) LIF는 PDF 전달유전자와 협동으로 작용하여 향상된 자가-재생 능력을 제공한다; 및 (iii) PDF 전달유전자 발현의 효과는 전달유전자 절제후에 완전히 복원가능(reversible)하다.
[표 1]
PDF 형질감염체의 Cre 유도체로부터 수득된 살아서 태어난 키메라.
라인 태어난 마우스 키메라
EF1C1 7 3
EF1C3 21 10
EF1C5 11 11
실시예 11: 인간 다능성 세포주에서 PDF cDNA 의 발현
본 연구에서, 우리는 인간 다능성 EC 세포주에서 다능성 결정인자(hPDF)에 대한 인간 cDNA의 발현후에 다능성의 인자-의존성 유지를 증명하였다. 모나쉬 재생 및 발생 연구소(MIRD)(Melbourne, Australia)마틴 페라 교수로부터 제공받은 클론성 유래 세포주, Germ Cell Tumour 27X-1(GCT27X-1)은 예전부터 난황 낭(yolk sac), 트로포블라스트, 피부, 연골, 선 상피(glandular epithelium), 뉴렉토덤(neurectoderm) 및 이종이식에서 3가지 원시 초기배 층의 대표적인 기타 조직들을 유발하는 것으로 알려져 왔다. 동일 세포주가 또한 체세포 및 배아외(extraembryonic) 세포 유형으로의 자발적 분화를 보여준다(Pera et al., 1998). GCT 27X-1 세포주는 유사분열 불활성화된 마우스 STO 피더 세포의 층 상에(도 9a) 또는 인간 난황 낭 암종-유래된 세포주, GCT 44(Martin Pera, MIRD, Melbourne, Australia로부터 제공됨)의 무-피더 배양에서 분비된 불특성화된 인자의 첨가로 피더세포의 부재하에(도 9b) 일상적으로 유지된다. 낮은 클론성 밀도 GCT 27X-1 세포배양물로부터 이 조건 배지의 회수는 그들의 완전 분화를 초래하였다(도 9c).
hPDF 전사 인자는 다능성 GCT 27X-1 hEC 세포에서 내생적으로 발현되고(도 10), 따라서 이러한 그리고 기타 인간 다능성 세포주에서 자가-재생의 유지에서 일정한 역할을 할 것이라고 가정된다.
여기서 우리는 난황 낭 암종세포-유래된 조건 배지의 회수에 응답하여 GCT 27X-1 무-피더 세포 배양에서 다능성의 상실과 외생적 hPDF가 발현시 클론성 레벨로 다능성의 유지를 증명하였다.
이들 발견은 hPDF 전사인자가 인간 ES 세포를 위한 강건한 배양 시스템의 기초를 제공한다는 것을 보여준다.
실험 전략
hPDF 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 인간 cDNA 서열을 함유하는 구조체를 리포펙틴과 전기천공 기술 둘다에 의해 GCT 27X-1 세포내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염 콜로니가 hEC 세포 성장 및 유지를 뒷받침하기 위해 필요한 GCT 44-유래된 조건 배지의 첨가 유무에 상관없이 피더 세포의 부재하에 확립하였다. 안정한 콜로니가 푸로마이신 항생제의 존재하에 선택되었고, 견고한(tight) hEC 표현형(형태학적으로 판단시)의 유지를 보여주는 것들을 피킹하여 양 조건으로부터 팽창하였다. 이어서 이들 클론성 hPDF-발현 세포주를 대조군으로 야생형 GCT 27X-1 세포 및 hPDF 서열을 결여하나 유사한 구조체로 형질감염된 GCT 27X-1 세포와 함께, 조건 배지의 부재하에 다능성 표현형을 유지하는 그들의 능력에 대하여일상적 및 클론성 밀도에서 시험하였다.
PDF-발현 세포에서 확정적 미분화 hEC 세포 표현형은 종양 괴사 인자 리셉터 슈퍼페밀리의 일원인 마커 Cluster Designation 30 (CD30)에 대해 간접 면역형광 염색에 의해 확인하였다. CD30은 인간 EC 세포의 특이적 마커로서 시험관내 분화동안 하향조절된다(Latza et al., 1995; Pera et al., 1997). 마우스 EC 또는 마우스 ES 세포상에서는 CD30의 존재에 대한 증거가 아직까지 없다.
이들 실험 전략을 흐름도 형태로 요약하였다(도 11)
재료 및 방법
벡터 구조체
Floxed hPDF (도 12a)로 명명된 8.8kb 구조체는 인간 사이토메갈로바이러스 최전 인핸서(CMV IE) 및 인간 액틴 프로모터의 조절하에 있고 푸로마이신 내성 유전자의 IRES-매개 발현을 제공하는 바이시스트론(bicistronic) 리포터 카세트의 상류에 있는 hPDF cDNA의 오픈 리딩 프레임(~900 bp)을 함유하며, 이들 모두는 loxP 재조합 부위사이에 포함된다. 더욱이, 그 벡터는 loxP 부위의 하류에 향상된 GFP 리포터 유전자를 함유하여, Cre-매개 재조합이 일어나면 형광에 의해 가시화될 수 있다.
유사한 비-플록스된(non-floxed) 구조체 pPyCAGegfplP ("GFP 대조군" 벡터), (도 12b)는 Floxed hPDF 벡터에서 hPDF 서열이 IRES-푸로마이신 리포터 카세트의 상류의 향상된 GFP 리포터 유전자로 치환되었으며, 각 실험에서 "non hPDF"-발현형질감염된 hEC 세포를 제공하는 대조군으로 사용되었다.
hEC 세포 배양
GCT 27X-1 세포는 2 mM L-글루타민(Invitrogen), 2.7 g/L 소디움 바이카르보네이트(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 및 10% FCS(Commonwealth Serum Laboratories, CSL, Melbourne, Australia)로 보충된 1:1 v/v αMEM/Ham's F-12 배지(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)에서 유사분열 불활성화된 마우스 SPO 세포의 피더 층상에서 일상적으로 배양되었으며, 5% CO2로 37℃에서 유지되었다. 세포를 상기 배지에 준비된 5 mg/ml 디스파제 용액(Sigma)으로의 분해를 이용하여 각 7일간 계대하였으며, 수확(harvest)의 1/10 이상의 밀도로 반복하였다.
형질감염 실험 및 클론 어세이를 위해, GCT 27X-1 세포를 STO 피더 세포는 없으나 상기 보충된 αMEM/Ham's F-12 배지에 25% v/v로 인간 난황 낭 암종-유래 세포주 CGT 44(Martin Pera, MIRD, Melbourne, Australia로부터 제공된 세포)의 무-피더 배양물에서 얻은 조건 배지를 첨가하여 배양하였다. 단일 세포 현탁액을 PBS 버퍼에 제조된 0.025% 트립신(Invitrogen)/1mM EDTA(Sigma)/1% 닭 혈청(Invitrogen) 용액으로 트립신 분해에 의해 제조하였다. 클론 밀도 세포 배양은 200-300 세포/cm2로 파종하고, 저밀도 배양은 5000 세포/cm2로 파종하였다.
GCT 44 세포주를 2mM L-글루타민(Invitrogen), 3.7 g/L 소디움 바이카르보네이트(Sigma) 및 10% FCS(CSL)로 보충된 고 글루코스 DMEM 배지 (Invitrogen)에서유사분열 불활성화된 마우스 STO 피더 세포상에 일상적으로 유지시키고, 5% CO2로 37℃에서 유지시키나, PBS 버퍼에서 제조된 0.25% 트립신(Invitrogen)/1mM EDTA(Sigma) 용액으로 분해에 의해 계대하였다. 조건 배지는 무-피더 배양후 7, 10 및 14일째에 수거하여 여과 멸균하고 2개월까지 4℃에서 저장하였다. 각 배치의 조건 배지를 상기와 같이 GCT 27X-1 hEC 세포의 무-피더 클론 배양을 유지하는 능력에 대해 시험하였다 (데이타 미도시).
마우스 STO 피더 세포(Martin Pera, MIRD, Melbourne, Australia로부터 제공된 세포)를 상기 GCT 44 배양과 같이 보충된 고 글루코스 DMEM 배지 (Invitrogen)에서 일상적으로 유지시켰다. 일상적인 STO 배양은 PBS 버퍼에서 제조된 0.25% 트립신(Invitrogen)/1mM EDTA(Sigma)용액으로 분해하여 매주 2회 계대하였다. STO 세포의 유사분열 불활성화는 일상적 배양물을 보충된 DMEM 배지(상기)에 제조된 16 ㎍/ml 미토마이신-C 용액(Sigma)에 2-3시간동안 배양하고 트립신 처리전에 PBS로 2회 세척함으로써 성취하였다.
hEC 세포의 일상적 형태학적 시험을 위해, 배양물을 상기한 바와 같이(O'Brien, 2001) 고정시키고 Leishman's로 염색하였다.
세포 배양물을 Leica DMIL (Leica Microscopy Systems, Wetzlar, Germany) 또는 Nikon Diaphot 300 (Nikon Inc., Melville, NY, USA) 현미경을 사용하여 위상차 현미경법으로 일상적으로 관찰하였다. 형광 대조군 GFP 세포 배양물은 470/40 nm Nikon 필터를 사용하여 Nikon Diaphot 300 현미경으로 시험하였다. 형광 데이터를 Leica DFC300 F 이미징 시스템으로 캡처하였다. 모든 세포 배양은 Falcon(Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA) 또는 Nunc(Roskilde, Denmark)에서 제공된 조직배양용 플라스틱용기를 사용하여 수행하였다.
hEC 세포의 안정한 통합적(integrative) 형질감염
플록스된 hPDF 및 GFP 대조군 벡터를 각각 표준 Pvu I 제한 효소 분해로 선형화하고 전기천공 및 리포펙션 방법으로 GCT 27X-1 세포에 형질감염하였다.
전기천공(Electroporation): 20-30 x 106hEC 세포의 단일세포 현탁액을 트립신 분해로 제조하고, BTX ECM830 사각파(square wave) 전기천공기(BTX, San Die해, CA, USA)를 사용하여 40 ㎍의 선형 DNA를 형질감염시켰음, 상기 전기천공기는 0.8 kV의 전기 방전 및 0.1 ms(3 uF 정전용량)의 타임 콘스탄트를 전달하도록 세팅되었다.
리포펙션(Lipofection): 2 x 106hEC 세포를 혈질감염 하루전에 78.5 cm2배양접시에 파종하였다. 리포펙션은 제조사의 지시서에 따라 60 ㎍(1㎍/㎕ 용액)의 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen) 및 20 ㎍의 선형 DNA를 갖는 무혈청 배지에서 6시간동안 세포를 배양함으로써 수행하였다. 세포를 리포펙션후 48시간에 트립신처리하고 전기천공 세포와 동일 밀도로 플레이트하였다.
형질감염된 세포 및 대조군 비형질감염된 세포를 78.5 cm2디쉬에 2 x 106세포 밀도(~25,500 세포/cm2)로 플레이트하고, 조건 배지 있거나 없이 둘다 15일까지 배양하고, 매 3-4일에 배지를 갈아주었다. 푸로마이신 선택은 형질감염후 2-3일에 수행하였는데, 초기에 0.4㎍/ml로 한 다음 안정한 통합체(integrants)의 효과적 선택을 위해 형질감염후 10-15일부터 1.0㎍/ml로 하였다. 푸로마이신 내성 hEC 콜로니를 2.0 cm2웰에 피킹한 후 더 분석을 위해 후속 동결을 위해 팽창시켰다. 자가-재생 GFP 대조군 hEC 세포주의 유지를 위하여, 조건 배지 플레이트로부터의 코로니만을 피킹하여 팽창시켰다. hEC 세포의 안정한 통합(integrative) 형질감염을 성취하기 위한 절차는 본질적으로 마우스 ES 세포에 대해 종래 실시된 것(O'Brien, 2001)과 같았다.
CD30 면역염색
PBS 버퍼로 2회 세척하고, 빙상에서 10분간 에탄올에서 고정시키고, -20℃에서 저장하여, 마우스 항-인간 CD30 단클론 항체(Dako, Glostrup, Denmark)로 간접 면역형광 염색을 위해 hEC 세포 배양을 준비하였다. 염색은 PBS 버퍼에 제조된 0.1% Triton X-100 (Sigma)/2% 염소 혈청(Invitrogen)/13.3% v/v BSA(Invitrogen) 염색 희석액중의 1:20 1차 항체 희석을 이용하여 수행하였다. CyTM3-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Westgrove, USA)를 상기 희석 버퍼중 1:200 희석으로 사용하였다. CD30 양성 세포를 535/50 nm Nikon 필터와 UV 330-380 nm Nikon 필터로 비교 Hoechst(Sigma) 염색을 사용하여 가시화하였다. 형광 데이터를 Leica DFC300 F 이미징 시스템상에서 캡처하였다. 면역형광 염색의 모든 절차는 SCS Ltd Laboratory 프로토콜에 기재된 대로 실시하였다.
노던 블롯 분석
폴리 A+ mRNA를 STO 피더 세포상에서 그리고 피더 세포는 없으나 상기와 같이 조건 배지의 존재하에 배양된 GCT 27X-1 세포의 서브콘플루언트 배양으로부터 제조하였다. 또한, 폴리 A+ mRNA는 후속 혼성화의 대조군으로서 STO 세포와 E14Tg2a 마우스 ES 세포의 일상적 배양으로부터 제조하였다. RNA 용해물을 세포 배양물로부터 직접 제조하였고, 상기와 같이(O'Brien, 2001) 올리고(dT) 셀룰로스(New England Biolabs, Geverly, MA, USA)상의 친화성 크로마토그라피에 의해 분리하였다.
추출된 mRNA 시료(3-3.5 ㎍)를 1 x MOPS 버퍼에서 1% w/v 아가로스/0.66 M 포름알데히드 변성 겔 런상에서 전기영동시켰다. RNA를 Hybond N+ 부하된 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, UK)에 전달하고, pPyCAGhPDFIP 벡터(Ian Chambers, ISCR, Edinburgh, UK로부터 제공)로부터 Eco RI 제한효소 분해에 의해 분리된32P-라벨된 (Ambersham Pharmacia Biotech) 960 bp hPDF cDNA 단편과 혼성화하였다. Gapdh 코딩 서열의 800 bp HindIII/EcoRI 단편을 사용하여 약간의 멤브레인을 재-혼성화하여 mRNA 시료에 대한 로딩 대조군을 제공하였다(Kate Loveland, MIRD, Melbourne, Australia). 멤브레인을 24시간까지 -70℃에서 강화 스크린사이에 Biomax MS(Kodak, Cedex, France) 및 Hyperfilm MP(Amersham Pharmacia Biotech) X-ray 필름에 노출시켰다. 블로팅, 혼성화 및 일상적 분자기법은 Sambrook et al., (1989)에 기재된대로 실시하였다.
결과
GCT 27X-1 세포의 자가-재생 및 분화
GCT 27X-1 hEC 세포의 일상적 배양을 방법론적으로 상기한 대로 확립하였다. 다능성 표현형의 유지는 형태학적으로 판단하여 증명하였는데, 배양은 STO 피더 세포 층상에서(도 9a) 또는 STO 피더 세포는 없으나 GCT 44- 유래 조건 배지의 존재하에서 일상적(도 9b) 및 클론 밀도(도 14b)로 실시하였다. hEC 세포의 무-피더 배양으로부터 조건 배지의 회수는 저 밀도 및 클론 밀도 배양에서 세포 분화의 개시와 다능성의 완전 상실을 증명하였다(도 9c). 또한, 무-피더 hEC 배양이 25% (v/v) 미만의 조건 배지를 함유하는 배양에서 다능성 형태학을 유지하지 못하는 반면, 일상적 배양 배지를 75% 이상 조건배지로 치환하면 배양의 생존과 성장을 완전히 담보할 수 없다는 것이 증명되었다(데이타 미도시).
hEC 세포에서 hPDF의 내생적 발현
다능성 GCT 27X-1 세포에서 hPDF 유전자의 내생적 발현을 확인하기 위해, 폴리 A+ mRNA 노던 블롯을 준비하고, Floxed hPDF 벡터에 함유된 ~900bp 의 hPDFcDNA 서열에 해당하는 방사선표지된 프로브와 혼성화하였다. 도 10의 결과는 hPDF 프로브가 피더 세포상에서 그리고 피더 세포는 없으나 조건 배지의 존재하에서 성장된 GCT 27X-1 세포에서 ~2.4 kb의 혼성화 밴드를 강하게 검출한다는 것을 보여준다. ~5.6kb 크기의 두 번째로 미약한 혼성화 전사체도 또한 둘다의 배양에서 검출되었고, 서로다른 RNA 제조상의 반복 실험에서 확인되었다(데이타 미도시). 일상적 STO 세포-단독 배양으로부터 제조된 mRNA로 부터는 어떠한 혼성화 밴드로 검출되지 않았다. ~2.2 kb의 약한 혼성화 밴드가 마우스 E14Tg2a ES 세포 mRNA에서 검출되었는데, 이는 마우스 다능성 세포에서 발현되는 상동성 PDF 전사체의 표시자가 된다. 서로다른 젤 레인에서 폴리 A+ mRNA의 상대적 량은 하우스키핑 유전자 Gapdh로 멤브레인의 재-혼성화에 의해 결정하였다. 이는 마우스 PDF 전사체가 hEC 세포에서 검출된 전사체에 비교하여(데이타 미도시) 매우 적은 레벨로 검출된다는 것을 가리킨다.
GCT 27X-1 hEC 세포 mRNA에서 검출된 ~2.4 kb 전사체는 동일 부모주로부터 유래된 다능성 hECT 세포주 GCT 27C4에서 이미 관찰된 것과 일치한다.
hPDF와 대조군 GFP 벡터의 형질감염
GFP 대조군 벡터로의 시험 형질감염 실험에서, 전기천공 및 리포펙션 방법 둘다는 GCT 27X-1 세포에서 비교가능한 결과를 나타내었다(데이타 미도시). Floxed hPDF 벡터로의 GCT 27X-1 hEC 세포의 형질감염은 전기천공 및 리포펙션 둘다에 의해 수행되었고, 비교 GFP 대조군 벡터 형질감염은 리포펙션 단독으로 수행하였따 (표 2)
Floxed hPDF 벡터를 함유하는 안정한 통합(integrative) 콜로니는 조건 배지의 존재 및 부재하에 둘다 무-피더 배양으로서 확립하였다. GFP 대조군 벡터를 함유하는 안정한 통합 콜로니는 동일 개수의 플레이트된 세포에 대해 동일 조건하에 확립되었다. 안정한, 중간 크기의 콜로니는 양 벡터에 대해 10-15 일에 확립되었는데, 이 시기이후 비형질감염된 세포의 본질적 성장 제거를 위해 푸로마이신 대조군 플레이트를 하였다.
표 2의 결과는 Floxed hPDF 벡터에 대해 전기천공보다 리포펙션에 의해 GCT 27X-1 세포의 약간 높은 형질감염 효율을 가리키나, GFP 대조군 형질감염체와 비교하여 조건 배지 없이 한것에 대해 조건 배지 존재하에 확립된 안정한 hPDF 통합 콜로니의 개수에 아무런 차이를 보이지 않는다. 조건 배지 없는 형질감염된 세포의 배양이 콜로니가 확립되는 능력을 방해하는 것으로 나타나지 않는 반면, 그들의 형태학은 다음 섹션에서 설명되듯이(표 3 참조) Floxed hPDF 및 GFP 대조군 형질감염체에 대해 다르다.
모두 견고한(tight) 다능성 hEC 표현형을 나타내는 등가수의 1차 콜로니를 피킹하고 hPDF 형질감염체를 위한 둘다의 조건으로부터 팽창시켰다. GFP 대조군 콜로니가 안정한 콜로니의 형태학적 관찰(도 3 참조)를 위한 조건 배지 없이 확립되었지만, 그들은 이 시간 프레임 동안 그들 콜로니에서 예상된 분화 개시로 인해 피킹하지 않았다.
형질감염된 hPDF 세포가 조건 배지의 존재 똔느 부재하에 콜로니를 확립하는데 동일한 양의 시간이 걸리는 것으로 나타나지만, 피킹 후에 조건 배지 부재하의 그들의 성장은 조건 배지에서 배양된 것들보다 느린 속도로 팽창한다는 것에 주목하였다. 이것은 LIF의 존재 및 부재하의 배양에서 확립된 PDF-발현 마우스 ES 세포에 관찰된 것(실시예 8 참조)과 유사하였다. 조건배지에서 팽창된 GFP 대조군 콜로니가 그들의 hPDF 상대에 비해 약간 빠른 성장 속도를 나타냈다는 것도 중요하다.
hPDF와 GFP 대조군 형질감염체에 대한 형태학적 관찰
Floxed hPDF 및 GFP 대조군 벡터로 형질감염후 확립되고 조건배지의 존재 및 부재하에 배양된 안정한 형질감염체 콜로니를 Leishman's 염색 후에 형태학적으로 비교하였다(표 3). 견고한(tight) 다능성 표현형을 유지하는 푸로마이신 내성 콜로니들, 분화를 개시하지만 약간 hEC 표현형을 유지하는 것들, 완전히 느슨하고 분화되는 것들을 각각 표시하기 위해 (도 13a-c) "견고(tight)", "중간(medium)" 또는 느슨(loose)"으로 점수를 매겼다.
표 3에 보여진 대로, 1차 형질감염체에 대한 콜로니 형태학의 시험은 GFP 대조군 형질감염체와 비교하여 hPDF 형질감염체가 조건배지에서 더 높은 정도의 견고한 hEC 형태학을 나타내는 반면, 증가가 느슨하고 분화 표현형이 관찰되는 GFP 대조군 콜로니와 비교하여 hPDF 형질감염체가 조건배지없이 다능성 표현형을 유지하는 능력이 증가한다는 것을 가리킨다.
각 벡터에서 결과되는 형질감염체에 대한 형태학의 변화가 게놈내 DNA 통합 부위에 의해 영향을 받을 수 있지만, floxed hPDF 형질감염에서 결과된 것들은 정상적으로 분화를 개시하고 콜로니에서 다능성의 상실을 유발하는 조건하에서도 다능성 표현형을 확립하고 유지하는 능력이 증가함을 보여주었다.
일반적으로, 조건배지 없이 배양된 hPDF 형질감염 플레이트에서 관찰된 콜로니들은 비록 다수가 견고한 다능성 표현형을 나타내긴 하지만, 조건 배지에서 성장한 것들보다 크기가 더 작았다. 외생적 hPDF를 발현하는 hEC 세포가 조건배지의 존재하에 배양될 경우 시너지 효과가 일어날 가능성도 남아 있다.
hPDF-발현 형질감염체에서 다능성의 유지
정상적으로 GCT 27X-1 세포 분화를 개시하는 조건하에 분명하게 다능성 표현형을 유지하는 hPDF-발현 안정성 형질감염주의 능력을 다능성 hEC 세포에 특이적으로 분화 세포 타입에서는 발현되지 않는 CD30 마커의 간접 면역형광 염색에 의해 확인하였다.
형질감염시부터 조건배지없이 확립되고 배양된 것을 포함하는 6개의 hPDF-발현 세포주를 조건배지의 존재 및 부재하에 클론 밀도로 배양하였다. 비형질감염된 GCT 27X-1 hEC 세포(형질감염실험시부터 피더 세포없는 조건배지에서 유지된)뿐만 아니라, GFP 대조군 hEC 형질감염 세포주중 4개(자가-재생용 조건 배지에서 유지된)를 hPDF 주와 동일한 조건하에 클론 밀도로 병행 배양하였다. 조건배지없이 배양된 GFP 대조군 및 GCT 27X-1 세포가 콜로니의 완전하거나 상당한 분화를 나타내었을때 형태학적 분석 및 CD30 간접 면역형광 염색을 실시하였다. 비형질감염된 GCT 27X-1 세포가 GFP 대조군 및 hPDF 세포주보다 더 빠른 속도로 팽창된 콜로니를확립하는 것을 알아냈다.
hPDF cDNA를 발현하는 세포주는 조건 배지의 존재 및 부재하에 클론 밀도로 다능성 표현형을 유지하는 반면, GFP 대조군 세포 및 GCT 27X-1 세포는 조건 배지가 배양에 존재할 경우에만 다능성을 유지할 수 있었다.
도 14의 결과는 조건배지의 연속 존재(hPDF 클론 D7) 또는 연속 부재(hPDF 클론 E7)하에 형질감염 플레이트에서 팽창되고 조건배지 존재 및 부재하에(도 14 a-d) 클론 밀도로 배양된 두개의 hPDF 클론의 형태학을 보여준다. hPDF D7 및 E7 클론 둘다는 둘다의 조건하에 다능성 세포 표현형을 나타내는 hEC 콜로니를 확립하고 유지하는 능력을 증명하였다. GFP 대조군 클론, C15 및 비형질감염된 GCT 27X-1 세포의 병행 클론 배양은 이들 세포가 조건배지의 연속 존재하에서만 다능성 hEC 콜로니를 확립하고 유지하는 능력을 확인시켰다. 조건배지의 부재하에, C15 및 GCT 27X-1 세포는 분화가 유도되어 느슨하게 형성되 콜로니에 남아있는 hEC 세포가 거의 없었다(도 14e-h).
도 15의 결과는 hPDF D7, hPDF E7, GFP C15 및 GCT 27X-1 세포주에서 확립되고 조건배지의 존재 및 부재하에 배양된 각각의 콜로니의 상대적 CD 30 및 Hoechst 면역형광 염색에 의해 상기 형태학적 관찰을 확인시켰다. 모든 세포주는 피더 세포의 부재와 조건배지의 존재하에 배양시 자가-재생 CD30-양성 콜로니를 유지하는 능력을 나타내었다(도 15a-h). GCT 27X-1 세포가 형질감염된 세포보다 더 빠르게 크게 팽창된 콜로니를 확립하였기 때문에, 그들중 다수는 과도성장시 예상되듯이 그들의 주변(periphery)에서 분화하기 시작하였다(도 15g-h). 피더 세포 및 조건배지둘다의 부재하에, 오직 hPDF-발현 hEC 세포만이 CD30-양성 콜로니를 유지할 수 있는 반면, GFP 대조군 및 GCT 27X-1 hEC 세포는 자가-재생 콜로니를 유지할 수 없었다(도 15i-p). 다시 GCT 27X-1 콜로니에서 관찰된 어떤 잔류 CD30-양성 세포도 더 빠른 팽창 및 그들 콜로니의 과도성장으로 특성지울 수 있었다(도 15o-p)
hPDF E7 세포주는 hPDF D7 세포와 비교시 일반적으로 더 견고한 hEC 콜로니 형태학(도 14a-d; 도 15a,c,i,k)과 더 강한 CD30 마커의 검출(도 15b,d,j,l)을 나타내는 것이 관찰되었는데, 이는 각 클론에서 게놈내에 무작위 DNA 통합 부위를 반영할 수 있다. hPDF E7 세포주는 형질감염후에 STO 피더 세포 및 조건배지 둘다의 부재하에 초기 확립되었다. 이들 배양 조건하에 8주이상 연속 팽창시킨 후에, hPDF E7 hEC 세포주는 자가-재생 hEC 세포의 표현형을 계속 나타내었다(도 16).
이것은 인간 다능성 세포주에서 인간 PDF cDNA의 외생적 발현이 정상적으로 이들 세포의 분화 및 자가-재생 능력의 상실을 유도하는 조건하에 다능성 표현형의 유지를 초래한다는 것을 증명한다.
참고문헌
hPDF 벡터로 GCT 27X-1 세포의 안정한 통합 형질감염
Floxed hPDF 벡터 GFP 대조군 벡터
전기천공 리포펙션 리포펙션
형질감염된hEC 세포 # 23 x 106 2 x 10624시간전에 파종 2 x 10624시간전에 파종
78.5cm2플레이트당 파종된 형질감염 세포 # 2 x 106 23 x 106t/f후 48시간에플레이트 2 x 106t/f후 48시간에플레이트
+CM에서 확립된 안정한 통합체 1:5102 (0.020%)392 1:3597 (0.028%)556 1:3425 (0.029%)584
-CM에서 확립된 안정한 통합체 1:4902 (0.020%)408 1:3125 (0.032%)640 1:2809 (0.036%)712
+CM 배양에서 피킹된1차 콜로니# 24 24 24
-CM 배양에서 피킹된1차 콜로니 # 24 24 0
다능성 GCT 27X-1 세포를 전기천공 및 리포펙션 방법 둘다에 의해 Floxed hPDF 벡터로 형질감염시켰으며, 푸로마이신 선택하에 조건배지의 존재 및 부재하에(+/-CM) STO 피더세포 없이 안정한 형질감염 콜로니를 확립하였다. 대조군 세포주를 제공하기 위해, GFP 대조군 벡터로 리포펙션에 의해 형질감염된 GCT 27X-1 세포를 동일 조건하에 확립하였다. 등가 개수의 콜로니를 피킹하여 모든 조건에서 팽창시켰으나, hEC 콜로니를 유지하는 조건배지 플레이트로부터만 피킹된 GFP 대조군을 제외하였다.
서로다른 배양 조건에서 안정한 통합 hPDF 및 대조군 GFP 형질감염체 GCT 27X-1 세포의 형태학
콜로니형태학 Floxed hPDF+CM Floxed hPDF-CM GFP 대조군+CM GFP 대조군-CM
견고 49 58 23 20
중간 33 27 44 43
느슨 18 15 33 37
총개수 100 100 100 100
형질감염된 세포를 ~25,500 세포/cm2의 밀도로 파종하였고, 조건배지의 존재 및 부재하에(+/-CM) 10-15일간 푸로마이신 선택하에 콜로니를 확립하였다. Leishman's 염색후에 다능성에 대한 견고, 중간 또는 느슨한 표현형에 대해 콜로니를 점수매겼다. Floxed hPDF 콜로니 점수는 전기천공 형질감염 플레이트에서 얻어진 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Edinburgh Smith, Austin G Chambers, Ian <120> Pluripotency determining factors and uses thereof <130> GWS/ARC/24222 <150> GB0202149.1 <151> 2002-01-30 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2185 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gagataggct gatttggttg gtgtcttgct ctttctgtgg gaaggctgcg gctcacttcc 60 ttctgacttc ttgataattt tgcattagac atttaactct tctttctatg atctttcctt 120 ctagacactg agttttttgg ttgttgccta aaaccttttc agaaatccct tccctcgcca 180 tcacactgac atgagtgtgg gtcttcctgg tccccacagt ttgcctagtt ctgaggaagc 240 atcgaattct gggaacgcct catcaatgcc tgcagttttt catcccgaga actattcttg 300 cttacaaggg tctgctactg agatgctctg cacagaggct gcctctcctc gcccttcctc 360 tgaagacctg cctcttcaag gcagccctga ttcttctacc agtcccaaac aaaagctctc 420 aagtcctgag gctgacaagg gccctgagga ggaggagaac aaggtccttg ccaggaagca 480 gaagatgcgg actgtgttct ctcaggccca gctgtgtgca ctcaaggaca ggtttcagaa 540 gcagaagtac ctcagcctcc agcagatgca agaactctcc tccattctga acctgagcta 600 taagcaggtt aagacctggt 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Asn Ala Ser Ser Met Pro Ala Val Phe His Pro 20 25 30 Glu Asn Tyr Ser Cys Leu Gln Gly Ser Ala Thr Glu Met Leu Cys Thr 35 40 45 Glu Ala Ala Ser Pro Arg Pro Ser Ser Glu Asp Leu Pro Leu Gln Gly 50 55 60 Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gln Lys Leu Ser Ser Pro Glu 65 70 75 80 Ala Asp Lys Gly Pro Glu Glu Glu Glu Asn Lys Val Leu Ala Arg Lys 85 90 95 Gln Lys Met Arg Thr Val Phe Ser Gln Ala Gln Leu Cys Ala Leu Lys 100 105 110 Asp Arg Phe Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe 130 135 140 Gln Asn Gln Arg Met Lys Cys Lys Arg Trp Gln Lys Asn Gln Trp Leu 145 150 155 160 Lys Thr Ser Asn Gly Leu Ile Gln Lys Gly Ser Ala Pro Val Glu Tyr 165 170 175 Pro Ser Ile His Cys Ser Tyr Pro Gln Gly Tyr Leu Val Asn Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Leu Ser Met Trp Gly Ser Gln Thr Trp Thr Asn Pro Thr Trp 195 200 205 Ser Ser Gln Thr Trp Thr Asn Pro Thr Trp Asn Asn Gln Thr Trp Thr 210 215 220 Asn Pro Thr Trp Ser Ser Gln Ala Trp Thr Ala Gln Ser Trp Asn Gly 225 230 235 240 Gln Pro Trp Asn Ala Ala Pro Leu His Asn Phe Gly Glu Asp Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Tyr Val Gln Leu Gln Gln Asn Phe Ser Ala Ser Asp Leu Glu 260 265 270 Val Asn Leu Glu Ala Thr Arg Glu Ser His Ala His Phe Ser Thr Pro 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Val Thr Pro Pro Gly Glu 290 295 300 Ile 305 <210> 3 <211> 2114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 attataaatc tagagactcc aggattttaa cgttctgctg gactgagctg gttgcctcat 60 gttattatgc aggcaactca ctttatccca atttcttgat acttttcctt ctggaggtcc 120 tatttctcta acatcttcca gaaaagtctt aaagctgcct taaccttttt tccagtccac 180 ctcttaaatt ttttcctcct cttcctctat actaacatga gtgtggatcc agcttgtccc 240 caaagcttgc cttgctttga agcatccgac tgtaaagaat cttcacctat gcctgtgatt 300 tgtgggcctg aagaaaacta tccatccttg caaatgtctt ctgctgagat gcctcacacg 360 gagactgtct ctcctcttcc ctcctccatg gatctgctta ttcaggacag ccctgattct 420 tccaccagtc ccaaaggcaa acaacccact tctgcagaga atagtgtcgc aaaaaaggaa 480 gacaaggtcc cagtcaagaa acagaagacc agaactgtgt tctcttccac ccagctgtgt 540 gtactcaatg atagatttca gagacagaaa tacctcagcc tccagcagat gcaagaactc 600 tccaacatcc tgaacctcag ctacaaacag gtgaagacct ggttccagaa ccagagaatg 660 aaatctaaga ggtggcagaa aaacaactgg ccgaagaata gcaatggtgt gacgcagaag 720 gcctcagcac ctacctaccc cagcctctac tcttcctacc accagggatg cctggtgaac 780 ccgactggga accttccaat gtggagcaac cagacctgga acaattcaac ctggagcaac 840 cagacccaga acatccagtc ctggagcaac cactcctgga acactcagac ctggtgcacc 900 caatcctgga acaatcaggc ctggaacagt cccttctata actgtggaga ggaatctctg 960 cagtcctgca tgcagttcca gccaaattct cctgccagtg acttggaggc tgctttggaa 1020 gctgctgggg aaggccttaa tgtaatacag cagaccacta ggtattttag tactccacaa 1080 accatggatt tattcctaaa ctactccatg aacatgcaac ctgaagacgt gtgaagatga 1140 gtgaaactga tattactcaa tttcagtctg gacactggct gaatccttcc tctcccctcc 1200 tcccatccct cataggattt ttcttgtttg gaaaccacgt gttctggttt ccatgatgcc 1260 tatccagtca atctcatgga gggtggagta tggttggagc ctaatcagcg aggtttcttt 1320 tttttttttt cctattggat cttcctggag aaaatacttt 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Pro Cys Phe Glu Ala 1 5 10 15 Ser Asp Cys Lys Glu Ser Ser Pro Met Pro Val Ile Cys Gly Pro Glu 20 25 30 Glu Asn Tyr Pro Ser Leu Gln Met Ser Ser Ala Glu Met Pro His Thr 35 40 45 Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp 50 55 60 Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gly Lys Gln Pro Thr Ser Ala 65 70 75 80 Glu Asn Ser Val Ala Lys Lys Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln 85 90 95 Lys Thr Arg Thr Val Phe Ser Ser Thr Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp 100 105 110 Arg Phe Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu 115 120 125 Ser Asn Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln 130 135 140 Asn Gln Arg Met Lys Ser Lys Arg Trp Gln Lys Asn Asn Trp Pro Lys 145 150 155 160 Asn Ser Asn Gly Val Thr Gln Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser 165 170 175 Leu Tyr Ser Ser Tyr His Gln Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn 180 185 190 Leu Pro Met Trp Ser Asn Gln Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Ser Asn 195 200 205 Gln Thr Gln Asn Ile Gln Ser Trp Ser Asn His Ser Trp Asn Thr Gln 210 215 220 Thr Trp Cys Thr Gln Ser Trp Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe 225 230 235 240 Tyr Asn Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gln Ser Cys Met Gln Phe Gln Pro 245 250 255 Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu 260 265 270 Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln 275 280 285 Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Met Asn Met Gln Pro Glu Asp 290 295 300 Val 305 <210> 5 <211> 720 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 atgagcgtgg atctttctgg tccccacagt ctgcctagtt gtgaggaagc atcgaactct 60 ggggattcct cgccgatgcc tgccgttcat cttcctgagg aaaattattc ttgcttacaa 120 gtgtctgcta ctgagatgct ctgcacagag actgcctctc ctccgccttc ctctggggac 180 ctacctcttc aagatagccc tgattcttct agcaatccca agctaaagct gtctggtccc 240 gaggctgacg agggccctga gaagaaagaa gagaacaagg tcctcaccaa gaagcagaag 300 atgcggactg tgttctctca ggcccagttg tgtgcactca aggataggtt tcagaggcaa 360 aggtacctca gcctccagca gatgcaagat ctctctacca ttctgaacct gagctataag 420 caggtgaaga cctggttcca aaaccaaaga atgaagtgca agaggtggca gaaaaaccaa 480 tggttgaaga ctagcaacgg cctgactcag gcctggaaca gccagacttg gaacgctgct 540 ccgctccata acttcgggga ggactccctg cagccttatg tgccgttgca gcaaaacttc 600 tccgccagtg atttggaggc gaatttggaa gccactaggg aaagccaggc gcattttagt 660 accccgcaag ccttggaatt gttcctgaac tactccgtga attctccagg cgaaatatga 720 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Ser Val Asp Leu Ser Gly Pro His Ser Leu Pro Ser Cys Glu Glu 1 5 10 15 Ala Ser Asn Ser Gly Asp Ser Ser Pro Met Pro Ala Val His Leu Pro 20 25 30 Glu Glu Asn Tyr Ser Cys Leu Gln Val Ser Ala Thr Glu Met Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Thr Ala Ser Pro Pro Pro Ser Ser Gly Asp Leu Pro Leu Gln 50 55 60 Asp Ser Pro Asp Ser Ser Ser Asn Pro Lys Leu Lys Leu Ser Gly Pro 65 70 75 80 Glu Ala Asp Glu Gly Pro Glu Lys Lys Glu Glu Asn Lys Val Leu Thr 85 90 95 Lys Lys Gln Lys Met Arg Thr Val Phe Ser Gln Ala Gln Leu Cys Ala 100 105 110 Leu Lys Asp Arg Phe Gln Arg Gln Arg Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met 115 120 125 Gln Asp Leu Ser Thr Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr 130 135 140 Trp Phe Gln Asn Gln Arg Met Lys Cys Lys Arg Trp Gln Lys Asn Gln 145 150 155 160 Trp Leu Lys Thr Ser Asn Gly Leu Thr Gln Ala Trp Asn Ser Gln Thr 165 170 175 Trp Asn Ala Ala Pro Leu His Asn Phe Gly Glu Asp Ser Leu Gln Pro 180 185 190 Tyr Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Ser Ala Ser Asp Leu Glu Ala Asn 195 200 205 Leu Glu Ala Thr Arg Glu Ser Gln Ala His Phe Ser Thr Pro Gln Ala 210 215 220 Leu Glu Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Val Asn Ser Pro Gly Glu Ile 225 230 235 <210> 7 <211> 3108 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 7 cttgggtttg ccacagtctc ttcacttacc tccttgttcc gtttatctcc ttcaccagca 60 gcacatctcc atgaatgctg ccagggtcat ctttatgccc tattttatca tgactattaa 120 ctctgactaa tatttcttta aagttggttg tagatgttta ctacaaatat ttctctgtga 180 cattaacaga tgtggtaagg tcgttgtcga cattgtattc ccagtaattt aggatttttt 240 tctatctctg ataatgaaga aataatgata gagtaggtaa attccaacat taacaacaac 300 aagaaaataa tgaactagat tttgatatac taacacagaa tgttcttcca gctatattgt 360 taagccaaca aagtatacat aacgtacaag tatatgaatg taaatgcact aaaagaaaat 420 atttgaaagt gtatacacca aataaacaga ctttacctct cggaagaaaa tagtgtggta 480 ggcgaaagca taaagaggga actttagttt ttactttcca tagtttagta ttatttactt 540 tttaaaaaaa ccacaggcac gtatttgtat tttattcttt aatttaagaa acctaaaggg 600 tttccttggc gaagaatgtg aaacacacac acacacacac acaagatggg cacggagtag 660 tcttgaaaga catgacaata tcaccagacc tgagaagaag ctaaagagcc agagggaaaa 720 agtcagaagt cgactacctg ggaggaggga tagacaagag accaaactaa aggaaactaa 780 gtgtggatcc agcttgtccc caaagcttgc cttgcttcaa agcatcagat ggtaaagaat 840 cttcacctgt gcctgtgatt tgtgggcctg aagaaaacta tccatccttg caaatgtctt 900 ctactgagat gcctcacacg gagactgtct ctcctcttcc ttcctccatg gatctgctta 960 ttcaggacag ccccgattct tccaccagtc ccaaaggcag acaacctact gctgcagaga 1020 atagtgccac aaaaaaggaa gacaaggtcc cggtcaagaa acagaaggcc agaactgtgt 1080 tctcttccgc ccagctgtgt gtactcaatg atagatttca gagacagaga tacctcagcc 1140 tccagcagat gcaagaactt tccaacatcc tgaacctccg ctacaaacag gtgaagacct 1200 ggttccagaa ccagagaatg aaatccaaga ggtggctgaa aaacaactgg ccaaagaata 1260 ccaatggtgt gactcagaag gcttcagcgc ctacctaccc cagccactac tcttcctact 1320 accagggatg cctggtgaac ccgactggga atcttccgat gtggaggaac cagacctgga 1380 acaattcatc ctggagcaac cagagccaga acgtcccacc ctggagcagc cactcctgga 1440 acgctcagac ctggtgcacc cagttctgga acaatcaggc ctggaacagt cccttctatg 1500 actatgaagg ggaatctcta cagtcctgct tgcagttcca gccaaattct cctgccagtg 1560 acttggaggc tgccttggaa gctgctgggg aaggccttaa tgtaatacag cagacgacta 1620 ggtattttag tactccacaa accatggatt tattcctaaa ctactccacg aacgtgcaac 1680 ctgaagatat gtaaagatga gtaaaattga tattactcaa tttcagtctg ggcactggct 1740 gaaccttcct ctcccctcct cccctcccta taggattttt cttgtttgga aaccacgtgt 1800 tctggtttcc attatgtcta tccagtcaat ttgatggagg gtggagtatg gttggagcct 1860 aatcagagag gtttcttttt ttcctattgg atcttcctgg agaaaagaca ttttaataac 1920 tttggctgct aaggacaaca tgataaaagc tgtctctggc tatagataag tagatctaat 1980 actagtttgg atatctttag tgtttagaat ctaacctcaa gaataagaaa tacaagtaca 2040 aattggtgtt atgaagatac tcctattgtt tgggattttg aggctttgct tattttttaa 2100 aaactattga ggtaaacggt taattgattt cctcaccctt tttggctcag ttttactata 2160 tcccctaatt tgttggttat gctaatcttt gtagaaagag gtcttatatt tgctgcatca 2220 taatgatgtt agtactactt tagtcaattt aagtacaaat gaatcaaaca actatttttc 2280 ctttagttga ttttaccctt attttaccta gtgtttcaaa tatacagctt aaacattaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaagaa agaaagaaag aaacctaaag gaagtttgct tttttgagat 2400 taaaatgtat ttaggcatgt aggtttttgc agaatagcaa gtcaccaacc aagggccctt 2460 tatttccaca tagaaaggta agaacatcaa gctatgtgaa gagtgaacaa tatcaatcat 2520 tgcaacttct aatattaagg gtagatttgc atgtaaattt ggttacttct aatgatatag 2580 gttgtcaaac acttaataaa aatgaactat tttgttaatg gcataaattc cctcatcgtt 2640 ggatataagc tttatcttaa atattatgta gaaacttaca aatgctagtc agtttcttag 2700 cctttttttg aaaaaaattt aaagtggttt agtaaatggt aaatgcaggt tggcattaat 2760 gatgtaataa ttcttaaagt gactgtctta aaaaatgtaa aagtagaccg ggcatggtgg 2820 ctcatgtctg taatcccagc agtttgggag gctgaggtgg gcacgtcacc tgaggtcagg 2880 agtttgagac cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctacaaaaat acaaaaatta 2940 gccaggcatg atggcaggtg cctgtaatcc cagctactcg ggaggttgag gcaggagaat 3000 tgcttgaatc caggaggcag aggttgcagt gagccgagat tgcaccattg cactccagcc 3060 tgggtgacag agcgagactc cagcttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3108 <210> 8 <211> 266 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 8 Met Ser Ser Thr Glu Met Pro His Thr Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro 1 5 10 15 Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser 20 25 30 Pro Lys Gly Arg Gln Pro Thr Ala Ala Glu Asn Ser Ala Thr Lys Lys 35 40 45 Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln Lys Ala Arg Thr Val Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp Arg Phe Gln Arg Gln Arg Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu Ser Asn Ile Leu Asn Leu Arg 85 90 95 Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln Asn Gln Arg Met Lys Ser Lys 100 105 110 Arg Trp Leu Lys Asn Asn Trp Pro Lys Asn Thr Asn Gly Val Thr Gln 115 120 125 Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser His Tyr Ser Ser Tyr Tyr Gln 130 135 140 Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn Leu Pro Met Trp Arg Asn Gln 145 150 155 160 Thr Trp Asn Asn Ser Ser Trp Ser Asn Gln Ser Gln Asn Val Pro Pro 165 170 175 Trp Ser Ser His Ser Trp Asn Ala Gln Thr Trp Cys Thr Gln Phe Trp 180 185 190 Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe Tyr Asp Tyr Glu Gly Glu Ser 195 200 205 Leu Gln Ser Cys Leu Gln Phe Gln Pro Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu 210 215 220 Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln 225 230 235 240 Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn 245 250 255 Tyr Ser Thr Asn Val Gln Pro Glu Asp Met 260 265

Claims (92)

  1. 세포 내에서 작용하고, gp130 활성화의 부존재 하에서 세포를 다능성 상태로 유지하는 인자.
  2. 인간 줄기 세포의 다능성을 유지하거나 부여하는 인자.
  3. 마우스 ES 세포에 다능성을 유지하거나 부여하고 gp130 활성화의 부존재 하에서 세포 내에서 작용하는 인자.
  4. 복제가 허용되지 않는 계통의 마우스 유래의 줄기세포에 다능성을 유지하거나 부여하는 인자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사인자인 것을 특징으로 하는 인자.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 호메오도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 인자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 배아 줄기세포 및/또는 마우스 배아 생식세포를 다능성 상태로 유지하는 것을 특징으로 하는 인자.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 배아 줄기세포 및/또는 다른 인간 다능성 세포를 다능성 상태로 유지하는 것을 특징으로 하는 인자.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, LIF 비반응성 세포를 다능성 상태로 유지하는 것을 특징으로 하는 인자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 200 내지 400 개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 인자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO 4의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인자.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO 2, 6, 또는 8의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인자.
  13. 세포 내에서 작용하고, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 또는 8의 호메오도메인의 일부 또는 전부와 50% 이상의 서열 동일성을 갖는, 세포를 다능성 상태로 유지하는 인자.
  14. 제 13 항에 있어서, LIF 비반응성 세포를 다능성 상태로 유지하는 것을 특징으로 하는 인자.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 인간 ES 세포 및/또는 복제가 허용되지 않는 계통의 마우스 유래의 ES 세포를 피더 세포의 부존재 하에서 그리고 피더 세포 추출물의 부존재 하에서 다능성 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는 인자.
  16. 복제가 허용되지 않는 계통의 마우스 유래의 세포를 피더 세포의 부존재 및 피더 세포 추출물의 부존재 하에서 다능성 상태로 유도하고 유지하는 것을 지지하는 인자.
  17. 인간의 ES 세포를 피더 세포의 부존재 및 피더 세포 추출물의 부존재 하에서 다능성 유지하는 인자.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 전사를 조절하는 것을 특징으로 하는 인자.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 호메오도메인을 함유하는 것을 특징으로 하는 인자.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 200 내지 400 개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 인자.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, LIF 비반응성 세포에 활성이 있는 것을 특징으로 하는 인자.
  22. 제 1 도메인은 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 포함하고, 제 2 도메인은 제 1 도메인의 세포로의 섭취를 촉진하는 것을 특징으로 하는 제 1 도메인 및 제 2 도메인을 포함하는 접합체.
  23. 제 22 항에 있어서, 제 1 도메인은 세포 내에서 제 2 도메인으로부터 절단되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  24. 제 23 항에 있어서, 제 1 도메인은 제 2 도메인에 디설파이드 브릿지에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  25. 제 23 항에 있어서, 제 1 도메인은 제 2 도메인에 공유결합으로 연결되고, 상기 연결은 세포 내에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  26. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 도메인은 인자의 조절을 허여하는 서열, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  27. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자 또는 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자 또는 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 포함하는 세포 배양 배지.
  29. 제 28 항에 있어서, gp130의 활성화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  30. 제 29 항에 있어서, LIF 수용체 리간드, 예를 들어 LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  31. 제 29 항에 있어서, IL-6 및 가용성 IL-6 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  32. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
  33. 제 32 항에 있어서, 인자의 발현을 지시하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  34. 제 33 항에 있어서, 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  35. 제 34 항에 있어서, 프로모터는 조절되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  36. 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
  37. 삽입 시 cDNA 구조물 또는 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 cDNA 구조물 또는 유전자의 발현을 조절하는 조절서열을 세포의 게놈에 삽입하기 위한 DNA 구조물.
  38. 제 37 항에 있어서, 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 조절 서열의 삽입을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 조절 서열을 조절되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
  40. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터의 제거 또는 불활성화를 가능하게 하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
  41. 제 32 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  42. 제 41 항에 있어서, 형질감염된 세포가 다능성 상태를 유지하도록 하는 세포의 형질감염을 위한 것을 특징으로 하는 벡터.
  43. 제 41 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마 거대 T 항원을 발현하거나 함유하는 세포의 형질감염을 위한 것을 특징으로 하는 벡터.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  45. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 유전자를 조절하는 조절 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 유전자는 벡터에 의해 감염된 세포의 내인성 유전자인 것을 특징으로 하는 벡터.
  47. 제 45 항에 있어서, 상기 유전자는 염색체상으로 통합된 전달 유전자인 것을 특징으로 하는 벡터.
  48. 제 45 항에 있어서, 상기 유전자는 제 44 항의 벡터에 의해 형질감염된 세포의 염색체외 벡터에 함유되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  49. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 세포 집단에 투여하는 것을 포함하는, 다능성 세포 집단을 유지하는 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 세포 중의 유전자를 활성화하는 것을 포함하는, 세포를 다능성 상태로 유지하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 유전자는 내인성 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 유전자는 에피좀 플라스미드 상에 위치하거나 안정하게 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 선택적으로 제 41 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 이용하여, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 세포 중의 유전자의 발현을 유지하거나 증가시키는 것을 포함하는, 세포를 다능성 상태로 유지하는 방법.
  54. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자의 발현 또는 활성이 조작된 세포.
  55. 제 41 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  56. 피더 세포의 부존재 하에서 그리고 피더 세포 추출물의 부존재 하에서 다능성 상태로 유지되는 다능성 인간 세포.
  57. 유전자가 활성성화 된, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포.
  58. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자, 제 32 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제 41 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 세포를 다능성 상태로 유지하기 위해 사용하는 방법.
  59. ES 세포에서 스크린을 수행하는 단계 및 자가-재생 표현형을 선택하는 단계를 포함하는, cDNA 라이브러리를 스크리닝 하는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 ES 세포는 LIF 수용체를 통해 작용하는 LIF 및 LIF 관련 사이토카인에 비반응성인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. ES 세포에서 기능적 어세이를 수행하는 것을 포함하는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 자가-재생 표현형을 부여하는 cDNA를 확인하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 체세포 내에서 발현하는 것을 포함하는, 비다능성 체세포에 다능성을 부여하는 방법.
  64. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 체세포에 도입하는 것을 포함하는, 비다능성 체세포에 다능성을 부여하는 방법.
  65. 제 63 항 또는 제 64 항에 있어서, 체세포에서 gp130을 활성화하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, LIF 수용체의 리간드, 예를 들어 LIF의 존재 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 65 항에 있어서, IL-6 및 가용성 IL-수용체의 존재 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 63 항 또는 제 64 항에 있어서, 체세포에서 Oct-4를 활성화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 내인성 Oct-4 유전자의 발현을 상향조절하거나, Oct-4를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 뉴클레오티드를 신선하게 유리된 세포 집단의 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 다능성 세포를 유리하는 방법.
  71. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 뉴클레오티드가 조절되는 프로모터의 조절 하에 존재하는 구조물을 포함하는 유전자 도입 동물을 생성시키는 단계;
    상기 유전자 도입 동물로부터 유전자 도입 배아를 획득하는 단계;
    상기 유전자 도입 배아 또는 동물로부터 세포를 획득하는 단계; 및
    인자를 세포에서 발현하도록 하기 위해 프로모터를 활성화하는 단계를 포함하는, 다능성 비인간 세포를 유리하는 방법.
  72. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 세포에서 발현시키거나 제공함으로써 다능성 세포의 배양물을 획득하는 단계;
    하나 이상의 세포의 유전적 조작을 수행하는 단계;
    세포 중에 인자의 발현을 실질적으로 소멸시키거나, 세포로부터 인자를 제거하는 단계; 및
    세포로부터 유전자 도입 동물을 획득하는 단계를 포함하는, 유전자 도입 비인간 동물을 생성시키는 방법.
  73. 제 72 항의 방법에 따라 획득 가능한 유전자 도입 동물.
  74. 조절 가능한 프로모터의 제어 하에 존재하는, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 뉴클레티드 서열을 함유하는 유전자 도입 동물.
  75. 다능성 상태로 안정하게 유지되고 인자의 발현이 조절될 수 있는, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 발현하는 다능성 세포를 제공하는 단계;
    상기 세포의 조작을 수행하는 단계;
    상기 인자의 발현을 감소시키는 단계; 및
    다능성 상태로 유지되는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 다능성 세포를 다능성 상태로 유지하는 인자를 스크리닝 하는 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 조작은
    제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 내인성 유전자의 발현을 조절하는 인자를 스크린이 확인하는데 적절하도록 하는, 세포의 유전적 조작; 및
    세포가 배양되는 배양 배지 또는 배양 조건의 조작으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 75 항 또는 제 76 항에 있어서, 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 결합된 조절 가능한 프로모터를 조절함으로써 인자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 세포가 배양되는 배지에 리프레서(repressor)를 부가함으로써 인자의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. (1) 전사 인자 결합 부위의 내인성 유전자에 측접하는 게놈의 부위를 분석하는 단계, 및
    (2) 상기 부위의 프래그먼트를 ES 세포로부터의 추출물로 스크리닝 하여 상기 프래그먼트에 결합하는 추출물의 구성성분을 확인하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 인자를 암호화하는 내인성 유전자의 발현을 조절하는 인자를 스크리닝 하는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 내인성 유전자에 측접하고 인자의 다능성 세포 제한 발현을 지시하는 게놈의 부위를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 인자의 발현을 지시하는 부위를 리포터(reporter) 구조물의 형질감염에 의해 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 75 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되는 인자.
  83. 세포를 본 발명의 인자와 접촉하는 단계; 및
    세포 중에서 gp130 시그날링을 활성화하거나 세포 중에서 Oct-4 발현을 활성화하는 단계를 포함하는, 체세포의 핵을 재프로그래밍하는 방법.
  84. 본 발명의 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 1 벡터로 세포를 형질감염 시키는 단계; 및
    LIF 수용체 리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 Oct-4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 2 벡터로 세포를 형질감염 시키는 단계를 포함하는, 체세포의 핵을 재프로그래밍하는 방법.
  85. 본 발명의 인자의 길항제와 함께 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  86. 제 49 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 획득된 다능성 세포.
  87. 제 63 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 획득된 다능성 세포.
  88. 제 86 항 또는 제 87 항에 따른 세포의 자손 또는 유도체인 세포.
  89. 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지의 존재 중에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 체세포를 자가-재생하는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 체세포를 증식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 89 항 또는 제 90 항의 방법에 따라 획득되는 세포.
  92. 제 91 항에 따른 세포의 자손 또는 유도체인 세포.
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