KR20090131007A - 포유류에서의 분화 조절제 및 분화 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유류 배아의 발생 시기에 세포 증식 종료와 분화 개시를 조절하는 메커니즘과 여기에 참여하는 단백질을 밝힌 것으로, 포유류의 분화 조절제, 분화 조절 방법, 상기 분화 조절제의 발현이 손상된 형질전환 동물 및 상기 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

포유류에서의 분화 조절제 및 분화 조절 방법{Agent and method for regulating differentiation in mammals}

본 발명은 포유류 배아의 발생 시기에 세포 증식 종료와 분화 개시를 조절하는 메커니즘과 여기에 참여하는 단백질을 밝힌 것으로, 포유류의 분화 조절제, 분화 조절 방법, 상기 분화 조절제의 발현이 손상된 형질전환 동물 및 상기 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다.

피부와 장과 같은 재생성 상피 조직의 항상성은 증식과 말단 분화의 고도로 균형 잡힌 프로세스를 통하여 유지된다. 정상적인 상피 발생 동안에, 증식하는 전구세포는 일과성 증식세포 (transiently amplifying (TA) cells) 라고도 불리며, 세포 주기 종료 및 유사분열 후 세포 (postmitotic cells)로의 말단 분화를 거치기 전에 제한된 횟수로 분열한다 (Blanpain et al., 2007). 암은 부분적 또는 완전한 분화를 수반하지 않고 전구세포가 부적당하게 증식한 결과로 발생할 수 있다 (Reya et al., 2001). 따라서, 상피 조직에서 세포주기 종료 및 말단 분화를 조절하는 신호화 네트워크 (signaling network)는 종양발생의 기본이 되는 메커니즘에 대한 단서를 제공할 수 있을 것이다.

Drosophila에서 'Hippo 경로'로 알려진 신호화 네트워크는 Drosophila에서의 적절한 기관 발생을 위한 증식 및 세포 사멸(apoptosis)의 조절에 있어서의 중요한 발생 프로그램인 것으로 보인다 (Edgar et al., 2006; Harvey and Tapon et al., 2007; Pan et al., 2007; Saucedo and Edgar et al., 2007). Ste-20 패밀리 카이네이즈 'Hippo' (Harvey et al., 2003; Jia et al., 2003; Pantalacci et al., 2003; Udan et al., 2003; Wu et al., 2003), WW 어댑터 단백질 'Salvador' (Kango-Singh et al., 2002; Tapon et al., 2002) 및 NDR 카이네이즈 'Warts' (Justice et al., 1995; Xu et al., 1995)는 사이클린 E와 Diap1의 발현을 조절함으로써 세포 증식을 제한하고 세포 사멸을 증진시키는 Hippo 경로의 중요 성분이다. Hippo 카이네이즈는 Warts 카이네이즈를 인산화시키고 활성화시키며, 이러한 공정은 스캐폴딩 단백질 Salvador 또는 Mats에 의하여 촉진된다 (Wu et al., 2003; Wei et al., 2007). Warts는 Mats와 함께 전사 공동 조절자 (coactivator) Yorkie를 인산화시키고 억제한다 (Huang et al., 2005; Lai et al., 2005). Merlin과 Fat은 모두 원형질막에 위치하는 것들로 Hippo 경로의 상류 (upstream)에 작용한다 (Bennett and Harvey, 2006; Cho et al., 2006; Hamaratoglu et al., 2006; Silva et al., 2006; Willecke et al., 2006). 이들 인자들의 돌연변이는 세포 증식을 증진시키고 세포 사멸을 감소시키는 결과를 야기할 것이다

한편, MST1/2 카이네이즈 (인간의 Hippo 호모로그)는 caspase-3-매개 단백질 분해 활성화와 함께 세포 사멸에 수반되는 것으로 보고되어 있다. LATS1/2 (인간의 Warts 호모로그)는 세포 주기 진행, 세포 사멸 (Tao et al., 1999; Xia et al., 2002; Li et al., 2003), 유사분열 종료 (mitotic exit) 및 세포질 분열 (cytokinesis) (McPherson et al., 2004; Yang et al., 2004; Bothos et al., 2005)의 조절에 관련되어 있다. YAP (인간의 Yorkie 호모로그)는 p73 (Mattallansa et al., 2007)과 상호작용함으로써 세포 사멸에 수반되는 것으로 보고 되었다. 포유류에서의 WW45의 기능적 중요성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 지금까지, MST1/2에 의한 LATS1/2의 인산화, WW45의 MST1/2 및 LATS1/2와의 연합(associations), LATS1의 MOB1 (MATS 호모로그)에의 결합, 및 RASSF1A, MST2, WW45 및 LATS1를 포함하는 복합체의 형성 등과 같은 제한된 생화학적 상호작용만이 알려져 있다 (Chan et al., 2005; Hergovich et al., 2006; Guo et al., 2007).

Hippo 경로는 또한 포유류의 종양발생 (tumorigenesis)과 관련되어 있다. LATS1가 결실된 마우스는 종양을 발생시키며, hWW45와 Mats는 몇몇 암 세포주에서 돌연변이 되어있다 (St John et al., 1999; Tapon et al., 2002; Lai et al., 2005). 인간의 Merlin 오르토로그인 NF2는 종양-억제 유전자이며, 이의 돌연변이는 신경섬유종증 (neurofibromatosis)을 유발한다 (McClatchey and Giovannini, 2005). YAP는 포유류 암에서 과발현되고, YAP을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 간 크기가 커지고 장에서 확장된 미분화된 전구세포가 나타나는 형성이상 (dysplasia)을 나타낸다 (Zender et al., 2006; Dong et al., 2007; Camargo et al., 2007). Hippo 경로 단백질 중에서, LATS1-, LATS2-, NF2-, 및 YAP-녹아웃 마우스만이 제작되었으나, 이들 마우스는 초기 배아 시기에 치사하거나 각각의 Drosophila 돌연변이체에서 보여지는 결함을 재현하지 못하였다 (McClatchey et al., 1997; St John et al., 1999; McPherson et al., 2004, Morin-kensicki et al., 2006). 따라서, Drosophila와 비교하여, 포유류 상피 발생에 있어서의 Hippo 경로의 생리학적 기능은 거의 알려진 바가 없다. 더욱이, 포유류에서, 발생 동안에 상기 경로를 조절하는 분자 메커니즘도 전혀 규명 되어지지 않았다.

이에, 본 발명자들은 고유한 Sav 호모로그인 WW45가 결여된 마우스를 제작하여, 포유류에서의 Hippo 경로의 역할을 조사하였다. 이와 같이 WW45가 결여되도록 변이된 배아는 상피 세포의 말단 분화에서의 결함과 세포 증식이 억제되지 않는 특성을 나타낸다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 MST1 신호화를 시공간적으로 조절하는 분자 메커니즘이 상피 세포에서의 말단 분화를 활성화시키고 세포주기를 종료시키는 것을 가능하게 한다는 것을 밝혔다.

이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 포유류 배아의 발생 시기에 세포 증식 종료와 분화 개시를 조절하는 메커니즘과 여기에 참여하는 단백질을 밝힌 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 포유류의 분화 조절제, 상기 분화 조절제의 발현이 손상된 형질전환 동물 및 상기 형질전환 동물의 제조 방법을 제공한다.

우선, 본 발명은 포유류의 배아 발생 단계에서 세포 증식 종료 및 말단 분화 과정을 밝히고 여기에 관여하는 WW45 단백질의 새로운 용도를 밝힌 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 WW45 단백질, WW45 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 세포질에 존재하는 인산화된 YAP (Yes-associated protein) 및 상기 YAP의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 포유류의 분화 조절제를 제공한다.

본 발명에서는 WW45 단백질의 세포 증식 종료 및 분화 개시에 있어서의 역할은 WW45 유전자를 결여시킨 마우스에서 세포 증식이 계속 일어나고 분화가 개시되지 못하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 포함하여 본 발명에서 얻어진 결과에 기초하면, 세포 증식이 종료되고 분화가 개시되는 과정은 다음과 같다: 즉, WW45 단백질은 세포 증식 중에는 세포질에 존재하고 있으며 분화 조건이 주어지면 세포질에 존재하는 MST1/2와 복합체를 형성하여 핵으로 이동한다. 핵으로 이동한 MST1/2-WW45 복합체는 핵에 존재하는 LATS1/2를 자극하여 핵에 존재하는 YAP을 인산화시킨다. 인산화된 YAP은 핵에서 세포질로 이동하여 14-3-3 단백질과 결합하고, 이에 의하여 세포 증식이 종료되고 분화가 개시된다. 상기와 같은 일련의 과정을 도 16f에 모식적으로 나타내었다.

상기 WW45 단백질은 모든 포유류에 존재하는 것을 포함하며, 예컨대 인간 WW45 단백질 (SEQ ID NO: 1, NCBI 등재 번호: NP_068590.1), 및 마우스 (Mus musculus) WW45 단백질 (SEQ ID NO: 2, NCBI 등재 번호: NP_071311), 래트 (Rattus norvegicus) WW45 (SEQ ID NO: 3, NCBI 등재 번호: NP_001091050) 등의 설치류 WW45 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 복합체는 세포질에서 MST1/2와 복합체를 형성하여 핵으로 이동하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 인산화된 YAP이 핵에서 세포질로 이동하여야 세포 증식이 종료되고 분화가 개시됨을 확인하여 인산화된 YAP의 세포질로의 이동이 세포 분화 개시에 중요한 역할을 함을 밝혔다. 상기 YAP은 모든 포유류에 존재하는 것을 포함하며, 예컨대, 인간 YAP (SEQ ID NO: 4, NCBI 등재 번호: NP_006097.1), 및 마우스(Mus musculus) YAP (SEQ ID NO: 5, NCBI 등재 번호: NP_033560.1), 래트 (Rattus norvegicus) YAP ((SEQ ID NO: 6, NCBI 등재 번호: NP_001029174) 등의 설치류 YAP 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. MST1/2-WW45 단백질 복합체에 의하여 자극된 LATS1/2에 의하여 인산화되는 YAP의 인산화 부위는 다른 여러 인산화 부위 중에서도 127번째 아미노산인 세린 (이하 '세린 127')일 수 있으며, 세린 127이 인산화된 YAP은 세포질로 이동하여 14-3-3 단백질과 결합하여, 세포가 증식을 종료하고 분화를 개시하도록 한다.

본 발명에서, '분화 조절제'는 세포가 증식을 종료하고 분화를 개시하는 일련의 단계를 조절 (촉진 또는 억제)하는 물질을 의미하는 것으로 사용된다. 본 발명에 따른 분화 조절제의 적용 가능 대상은 인간을 포함하는 모든 포유류의 세포, 조직 또는 기관일 수 있으며, 바람직하게는 상기 포유류는 인간, 설치류로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 상기 세포, 조직 및 기관은 장 또는 피부의 상피 세포 또는 조직일 수 있으며, 예컨대, 장의 상피, 폐 상피, 신장 상피, 가슴샘 상피, 췌장 상피세포 및/또는 피부의 표피, 구체적으로 각질 형성 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 분화 조절제의 작용 시기는 세포 증식이 종료되고 분화가 개시되는 시점으로, 적용 대상 세포, 조직 또는 기관에 따라서 달라질 수 있으며, 대략 E14.5 내지 P1 사이의 기간일 수 있다. 본 발명의 분화 조절제는 상피전구세포로부터 상피세포로의 분화를 조절하는 것일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 WW45 단백질의 발현이 억제되거나 기능이 손상된 형질전환 동물을 제공한다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 예컨대 기탁번호 KCTC11343BP인 것일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 WW45 단백질 발현이 억제되거나 기능이 상실된 형질전환 동물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은

1) WW45 단백질 코딩 유전자 일부 또는 전체가 결실 또는 치환된 재조합 유전자, 또는 상기 재조합 유전자 및 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터 (유전자 적중 벡터)를 제작하는 단계.

2) 상기 제작된 유전자 적중 벡터를 이용하여 배아 줄기세포 (ES cell) 를 이용한 유전자 적중 마우스의 제작 단계.

3) 상기 형질 전환 동물 또는 상기 동물의 조직 또는 기관을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 유전자 적중 마우스 제작 단계는 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 모든 배아줄기세포를 이용한 형질전환 동물 제작 방법에 의할 수 있으며, 예컨대, 다음과 같은 방법으로 수행할 수 있다. 즉, 배아줄기세포에 유전자 적중 벡터를 선택적으로 주입하고, 이 과정에서 나온 배아줄기세포를 배반포 (E3.5, blastocyst)에 주입하여 다시 대리모를 통한 키메라 마우스를 제작한 후, 상기 키메라 마우스를 다른 정상 마우스와 교배하여 유전자가 한 Copy만 제거된 마우스를 확보하고, 이러한 헤테로마우스(heteromice)를 교배하여 유전자가 두 copy 모두 제거된 형질 전환 동물을 구축할 수 있다.

본 발명에 따른 형질 전환 동물은 WW45 단백질이 발현되지 않거나, 기능이 손상된 상태로 발현되도록 조작되어 세포 사멸 (apoptosis)이 억제되고 세포 증식이 종료되지 못하며, 세포 분화가 일어나지 못하여, 종양이 유발되어 있는 동물 모델로서 유용하다.

본 발명에서 '동물모델 (animal model)'은 사람의 질병과 유사한 특정 질환을 가지고 있어서 병인을 규명하고, 병태를 확인할 수 있는 연구 대상이 될 수 있는 모델이 되는 동물을 의미한다. 동물 모델로서 사용하기 위한 동물은, 인간에서와 같은 효과를 예측할 수 있으며, 쉽게 만들 수 있고, 재현성이 있어야 한다. 또한, 인간질병의 병인과 같거나 유사하게 진행되어야 한다. 따라서, 인간과 같은 포유류 동물이면서, 장기 등의 체내 구조, 면역체계, 체온 등이 유사하고, 고혈압, 암, 면역결핍 등의 질환을 앓는 동물이 동물 모델로서 적합하다. 이러한 관점에서, 상기 형질 전환 동물은 인간을 제외한 모든 포유류 동물일 수 있으며, 예컨대, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 또는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류 등일 수 있고, 이 중에서 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류가 특히 바람직할 수 있다. 특히, 마우스는 소형동물로 번식력이 우세하고, 사양 관리가 쉽고, 질병에 강하며, 유전적으로 균일하며, 다양한 종류가 개발되었고, 사람에서 발생하는 질병과 같거나 유사한 증상을 보이는 동물의 생산이 가능하여, 인간의 질병을 연구하는데 가장 많이 이용되고 있다.

본 발명의 형질전환 동물에서 종양 유발은 피부 또는 장 등의 상피, 신장의 상피, 폐의 상피, 가슴샘 상피, 췌장 상피세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 의 조직 또는 기관에서 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형질전환 동물은 간암, 폐암, 혈액 종양, 피부암, 위암, 대장암, 소장암, 및 신장암 등으로 이루어진 군에서 선택된 암이 유발된 동물 모델로서 유용하다.

본 발명에 있어서, WW45 단백질의 발현 억제 또는 기능 손상은 관련 분야에 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 WW45 단백질 코딩 유전자의 일부 또는 전부를 결실 또는 치환시킨 재조합 유전자 또는 상기 재조합 유전자를 적절한 발현벡터에 삽입하여 얻어진 재조합 발현 벡터를 사용하는 모든 형질전환 방법에 의하여 수행 가능하다. 본 발명에 사용되는 WW45 단백질 코딩 유전자는 인간을 포함하는 포유류의 WW45 단백질 코딩 유전자일 수 있으며, 예컨대, 인간 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 7 (NCBI 등재 번호: NM_021818.2) 중 339-1490 부위), 마우스 (Mus musculus) WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 8 (NCBI 등재 번호: NM_022028.2) 중 236-1396 부위), 래트 (Rattus norvegicus) WW45 단백질 코딩 부위 (SEQ ID NO: 9 (NCBI 등재 번호: NM_001097581)의 172-1335) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 WW45 단백질 코딩 유전자의 일부 결실 또는 치환은 발현된 WW 단백질이 MST1/2와 복합체를 형성하는 기능을 상실하여 핵 내로 이동하지 못하도록 조작된 것을 의미하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 WW45 단백질 코딩 유전자의 일부 결실은 최소한 MST1과의 상호작용을 담당하는 SARAH 도메인의 결실을 의미하는 것일 수 있다.

WW45의 SARAH 도메인의 서열 상동 분석은 다음과 같다.

Human: ilkwelfql adldtyqgml kllfmkeleq ivkmyeayrq alltelenr (SEQ ID NO: 1의 321-368 아미노산 부위, SEQ ID NO: 10),

Mus musculus: ilkwelfql adldtyqgml kllfmkeleq ivklyeayrq alltelenr (SEQ ID NO: 2의 322-369 아미노산 부위, SEQ ID NO: 11),

Rattus norvegicus: ilkwelfql adldtyqgml kllfmkeleq ivklyeayrq alvtelenr (SEQ ID NO: 3의 323-370 아미노산 부위, SEQ ID NO: 12).

본 발명에 사용되는 형질전환 방법에는 제한이 없으며, 배아 세포 이용법 등을 사용할 수 있다. 배아 세포 이용법은 배반포기 배아로부터 분리한 배아간세포(embryonic stem cell; ES cell)를 이용하는 기술이다. ES 세포는 미분화 세포로서 영속적인 분열능력과 다양한 조직으로의 분화능력을 가지고 있는 것으로, 이러한 ES 세포에 특정 유전자를 도입하고 유전자가 도입하여 특정 유전자가 제거된 ES 세포를 배반포기 배아의 포배강에 주입하는 기술을 이용하여 형질전환 (Chimera) 동물을 생산할 수 있다. 한편 배반포기 배아로부터 분리한 배아간 (ES) 세포는 EC 세포에 비해 chimera 동물 및 형질전환 동물의 생산효율이 높으며, 도입된 외래 유전자가 염색체상의 특정위치에 상동으로 삽입된 세포만을 선별하여 형질전환 동물의 생산에 이용하면 특정 유전형질을 획득한 형질전환 동물뿐만 아니라 특정 형질이 소실된 형질전환 동물의 생산도 가능하다. 최근에는 ES 세포와 마찬가지로 발생초기의 태아에서 회수한 원시생식세포(primordial germ cell; PGC)를 이용 형질전환 동물 기술에 대한 연구도 진행되고 있다

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같이 종양이 유발된 형질전환 동 물을 이용하여 항종양제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항종양제 스크리닝 방법은 WW45 단백질 발현 결여되거나 기능이 손상되어 종양이 유발된 형질전환 동물 또는 상기 형질전환 동물로부터 분리된 종양 세포를 준비하는 단계, 상기 동물 또는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계, 및 상기 후보 물질 처리된 동물 또는 세포의 종양 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 종양 정도는 종양 세포의 수, 종양의 부피, 또는 세포 사멸 여부를 측정하여 확인할 수 있고, 후보 물질 처리 후 종양 세포 수가 감소하거나, 종양 부피가 감소하거나, 세포 자멸사가 유도된 경우 상기 후보물질을 항종양제로 결정할 수 있다. 본 발명의 항종양제는 간암, 폐암, 혈액 종양, 피부암, 위암, 대장암, 소장암, 및 신장암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 종양에 대한 것일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 WW45 단백질을 표적으로 하는 분화 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 분화 조절제는 분화 촉진제와 분화 억제제를 모두 포함하는 개념이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 분화 조절제 스크리닝 방법은 시료 세포에 후보 물질을 처리하는 단계, 세포 내 WW45 단백질 발현 수준을 측정, MST1/2 활성화, LATS1/2의 인산화 측정, YAP의 인산화등 을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료 세포는 인간을 포함하는 포유류로부터 얻어진 모든 세포일 수 있으며, 예컨대, 피부, 장 등의 상피 세포, 보다 구체적으로 표피 세포, 각질 형성 세포, 장샘 세포 등일 수 있다. 상기 WW45 단백질 발현 수준, MST1/2 활성화, LATS1/2의 인산화 측정, YAP의 인산화 수준은 관련 분야에 알려진 모든 단 백질 정량방법에 의할 수 있다.

본 발명의 분화 조절제 스크리닝 방법은 상기 후보 물질 처리 후의 WW45 단백질의 발현 수준과 MST1/2 활성화, LATS1/2의 인산화 측정, YAP의 인산화 수준이 증가하는 경우 상기 후보 물질을 분화 촉진제로 결정하는 것을 특징으로 하는 분화 촉진제 스크리닝 방법일 수 있다. 또한, 본 발명의 분화 조절제 스크리닝 방법은 상기 후보 물질 처리 후의 WW45 단백질의 발현 수준, MST1/2 활성화, LATS1/2의 인산화 측정, YAP의 인산화 수준이 증가하는 감소하는 경우 상기 후보 물질을 분화 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는 분화 억제제 스크리닝 방법일 수 있다.

하기의 본 발명의 여러가지 실험들은 포유류 상피 조직 발생에 있어서의 WW45의 역할에 대한 새로운 결과를 제시하는 것이다. WW45는 발생중인 상피 조직에서의 말단 분화와 세포주기 종료를 촉진하는 MST1 신호화 경로의 중요한 조절자이다. WW45의 제거는 피부와 장의 상피 세포의 미숙한 분화를 동반하는 과증식을 유발하고 (도 3 및 4), 이러한 표현형은 고유의 증식 촉진에 기인하는 것이라고 보다는 분화중인 세포가 세포 주기로 재진입 하는 것에 기인함을 확인하였다 (도 8). 이러한 결론은 WW45가 결여된 초기 각질 형성 세포가 Ca^{2 +}, TGF-β 또는 LiCl와 같은 분화 신호에 반응하여 세포 주기의 종료를 효과적으로 유도할 수 없고, 상피에서의 말단 분화 징후인 증식률 증가가 발생하는 E15.5 이후에 관찰된다는 실험 결과에 근거하여, 이 사실이 강력하게 뒷받침된다 (도 8, 도 17 및 도 18). Drosophila에서, Hippo 경로는 상피 세포에서의 세포자멸사의 촉진 및 증식 제한과 관련 있다고 알려져 있지만, 이 경로가 의 말단 분화에 수반된다는 증거는 거의 없었다. 흥미롭게, 마우스 MST1 신호화 경로가 발생하는 상피 조직에서의 말단 분화에 중요한 역할을 갖는 것으로 나타났다.

지금까지의 Drosophila에서의 연구 결과는 Hippo 경로에서의 몇 가지 유전자와 이들의 상호작용을 동정하였다 (Edgar et al., 2006; Harvey and Tapon et al., 2007; Pan et al., 2007). 그러나, 상피 분화 동안의 시공간적 조절의 세포간 신호화는 밝혀지지 않고 있었다. 본 발명은 MST1 신호화 경로의 성분이 포유류에서 상피 분화를 위한 세포 주기 종료를 시공간적으로 조절하는 기본적인 메커니즘을 규명한 것이다. 본 발명에서는 이전까지 밝혀지지 않았던 분화 신호가 MST1 카이네이즈를 특이적으로 활성화시키고, 동적으로 핵에 위치하고 LATS1/2를 활성화시킨다는 것과, 정상형 (wild-type) WW45가 이 과정에 필요하다는 것을 밝혔다. 이와 같이 활성화된 LATS1/2는 YAP의 세린 127을 인산화시키고 이와 같이 인산화된 YAP은 세포질로 이동하며, 여기서 불활성화된다 (도 16d). 최근에, YAP의 127 세린이 Hippo 경로의 주된 인산화 부위이며 이 부위의 인산화가 세포질 이동을 유발한다는 것과 (Dong et al., 2007), 마우스에서의 YAP의 과발현이 피부와 장의 다기능성 미분화된 전구 세포의 확장을 동반하는 심각한 형성 이상을 유발한다는 것이 보고되어 있다 (Camargo et al., 2007). 이러한 표현형들은 WW45-null 배아에서 관찰되는 것들과 매우 유사한 것이다. 이에, 본 발명자들은 MST 신호화에서 LATS1/2에 의한 YAP의 세린 127의 인산화가 상피 분화 동안에 일어난다는 것을 입증하였다. YAP 형질전환 마우스와 WW45-null 마우스 간의 표현형 유사성과 본 발명의 시험 결 과에 기초하여, 포유류에서의 성숙한 상피 조직의 형성 동안에, MST1 경로가 분화 신호에 의하여 활성화되고 전구체 세포가 분열을 종료하고 말단 분화하는 시기를 결정하고, WW45가 이 과정의 중심적 역할을 한다는 가설을 제안한다 (도 16f). 흥미롭게도, 간에서 YAP S127A를 과발현하는 형질전환 마우스가 거대화된 간을 나타내었는데 (Dong et al., 2007; Camargo et al., 2007), 이는 Hippo 신호화가 포유류의 가관 크기를 조절한다는 가설을 뒷받침하는 것이다. 그러나, WW45^-/- 배아에서는 크기가 증가된 기관이 관찰되지 않았으며, 이는 태반 결함 또는 또 다른 유전적 보상에 기인하는 것일 수 있다. 따라서, 포유류에서의 기관 크기 조절에 있어서의 MST1 경로의 역할을 보다 명확하게 규명하기 위하여, 마우스에서의 조직 특이적 또는 조건부 녹아웃 (knockout) 실험이 필요하다.

Drosophila에서의 최근 연구 결과는 사이클린 E와 함께 Diap1와 bantam이 Yorkie의 추가적인 표적일 수 있음을 보여주었다 (Nolo et al., 2006; Thompson and Cohen et al., 2006). 그러나, Drosophila에서와 달리, MST1 경로에서는 직접적인 표적 유전자가 동정되지 않았다. 정량적 RT-PCR에 의하여, WW45^-/- 세포에서 cyclin E, cIAP, XIAP 및 survivin의 발현 수준이, 약간 증가하기는 하였지만, 유의적으로 증가하지 않았음을 확인하였고, 이는 YAP의 다른 표적들이 포유류에서의 발생 항상성을 조절한다는 것을 의미하는 것이다 (도 19). YAP DN이 WW45^-/- 세포에서 분화 및 세포주기 종료를 원조하는데 충분하다는 본 실험 결과에 기초하여, YAP의 하류 표적 또는 매개자 (mediators)를 동정하는 것이 YAP이 세포주기 종료와 말단 분화 모두를 조절하는 방법에 대한 중요한 조사 결과를 제공할 수 있을 것이다.

본 발명에서는 또한, LATS2 및 NF2의 손상에서 보여지는 바와 같이, WW45 결손이 증식의 접촉 억제 (contact inhibition)의 파괴를 유발한다는 것을 밝혔다. WW45는 또한 접촉 억제 신호화 경로에 참여할 가능성이 있다. 접촉 억제의 손상이 WW45^-/- 배아의 상피 조직에서 관찰되는 과다형성과 관련 있을 수 있다. 최근, Hippo 경로에서의 YAP의 불활성화가 접촉 억제와 조직 증식에 기여하는 것으로 나타났다 (Zhao et al., 2007). 따라서, WW45^-/- 세포에서의 접촉 억제의 결함이 YAP 불활성화의 실패에 기인하는 것인지 여부를 조사하기 위한 추가적 연구가 요구된다.

MST1 신호화의 교란 (perturbation)이 세포 분획의 부적당한 증식과 확장을 유발하고, 이는 다시 암 관련 돌연변이의 위험성 증가를 유발한다. 몇 가지 연구 결과는 포유류 종양 발생에서의 Hippo 경로의 중요성을 뒷받침한다. LATS1 및 LATS2의 발현 손상과, hWW45 및 Mats의 변이가 암 세포주에서 보고되었다 (Tapon et al., 2002; Lai et al., 2005; Takahashi et al., 2005; Jiang et al., 2006). LATS1 또는 NF2에서의 변이를 갖는 마우스가 종양을 발생시키고, 마우스 종양 모델에서 YAP 전사가 증가된다 (St John et al., 1999; McClatchey and Giovannini et al 2005; Zender et al., 2006). 또한, YAP의 과발현은 in vitro 배양조건에서 포유류 상피 세포를 무한 증식 세포로 변환시킬 수 있으며, YAP을 과발현 하는 형질 전환 마우스는 분화된 세포 유형의 손상을 갖는 장 형성이상 또는 간암을 발달시킨다 (Overholtzer et al., 2006; Dong et al., 2007; Camargo et al., 2007). 이들 보고에 더하여, 본 발명에서는 단일 유전자 WW45의 기능 이상이 발생중인 상피 조직에 영향을 미치고, 전암 상태 (precancerous state)의 특징, 즉, 비제어 증식, 상피 극성의 부분적 손상 및 말단분화의 차단을 유도한다는 것을 명확하게 밝혔다. 그러나, 이러한 표현형들은 LATS1, LATS2 및 NF2를 결여한 마우스에서 보고된 바가 전혀 없었다. 파리의 Hippo 경로의 다중 호모로그가 포유류에 존재하며, 따라서 이들 단백질의 기능적 중복성이 있을 수 있다. 그러나, WW45는 단지 Hippo 경로에서의 Sav 스캐폴드 단백질의 포유류 호모로그이며, WW45의 손실은 많은 상피 조직에서의 현저한 표현형 변화를 유발한다. 중요하게, 본 발명에서는, 14 개월 관찰 기간 동안에, WW45 이종접합체 마우스 중 22%가 골육종 (osteosarcoma) 및 간암 (hepatoma)을 유도하는 몇몇 종류의 종양을 발달시킨다는 것을 확인하였다. 따라서, WW45의 이종접합 상태가 종양 발생을 개시하는 방법과 이들 마우스에서 발생된 종양의 분자적 특징을 조사하기 위한 추가적 연구가 요구된다. 결론적으로, 본 발명의 WW45-녹아웃 배아 또는 WW45-이종접합 마우스는 MST1 경로의 종양 발생 연구를 위한 모델로서 적합한 것일 수 있다.

본 발명은 WW45 단백질의 세포 증식 종료 및 분화 개시에 있어서의 새로운 용도를 밝힌 것으로, 분화 조절제의 탐색과 WW45-녹아웃 또는 WW45-이종접합 형질전환 동물 모델의 제작을 통한 다양한 연구에 기여하는 바가 클 것으로 기대된다.

실시예 1: WW45 Null 마우스의 제작

WW45 유전자 적중 벡터 (WW45 targeting vector)를 ES 세포에 전기적 충격 (electroporation) 으로 주입하여, WW45가 제거된 ES clones을 Southern blotting으로 확인하였다. WW45 제거된 표적화 ES 세포 클론을 포배 (blastocyst)에 주입하여 키메라 마우스(chimeric mouse)를 제작하였다.

보다 구체적으로, 표준 ES 세포 (R1) 동종 재조합 및 배반포 (blastocyst) 주입 기술을 사용하여 WW45^-/- 마우스를 제작하였다 (Lim et al., 1996; Lee et al., 2006). WW45 유전자 적중 벡터(WW45 targeting vector)는 한국생명공학연구소에서 입수한 129SvJ mouse BAC clone을 이용하여 left arm(exon1을 포함한 6338bp를 New England Biolabs(NEB)에서 입수한 EcoRⅠ 제한효소를 사용하여 얻음)과 right arm(3443bp를 BamHⅠ 제한효소(NEB)를 사용하여 얻음)을 pBluscriptⅡ KS(+) vector(Stratagene)를 backbone으로 하는 pGK-Puro vector에 subcloning 하였다 (도 1a). 보다 구체적으로, left arm과 right arm 사이에 exon2 대신 positive selection marker인 puromycin resistance gene을 클로닝하고, negative selection marker인 diphtheria toxin-A(DT-A)를 NotⅠ site에 클로닝함으로써 pGK-Puro-WW45 유전자 적중 벡터를 만들었다. 이와 같이 제작된 WW45 유전자 적중 벡터를 2008년 6월 12일자로 대전광역시 유성구 어은동에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원 센터 (KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC11342BP를 부여받았다.

BayGenomics에서 입수한 마우스 ES 세포에 상기에서 얻어진 WW45 유전자 적중 벡터를 전기적 충격 (electroporation)으로 주입하여 표적화된 ES 세포 클론을 제작하고, 상기 제작된 ES 세포 클론을 C57BL/6 포배 (E3.5, Jackson Lab 에서 구입) 내로 주입하여 배선 전달 (germ-line-transmitting) 키메라 마우스를 제작하였다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 에세이에 의하여 마우스와 ES 세포의 유전자형을 분석하였다. 상기 PCR에 사용된 프라이머와 조건은 다음과 같다.

WW45-L: 5'- TGACCATGTGTCCAGCCTTA -3' (SEQ ID NO: 13),

WW45-R: 5'- CGAATGGATGCTGCATATTG -3' (SEQ ID NO: 14),

pGK-3: 5'- GCACGAGACTAGTGAGACGTGCTAC -3' (SEQ ID NO: 15).

조건: denature 94°C 30초, annealing 60°C 45초, elongation 72°C 1분, 30cycle. Applied biosystems Geneamp PCR system 2700 PCR 기계를 사용.

실시예 2: 조직학적 분석 방법

상기 실시예 1에서 제작된 키메라 마우스를 정상 마우스 (C57BL/06, Jackson Lab 에서 구입)와 교배하여 WW45 유전자가 한 copy만 제거된 마우스 (WW45 Hetero 마우스)를 제작하였다. 이와 같이 제작된 WW45 Hetero 마우스를 교배하여 얻어진 배아가 WW45가 제거된 돌연변이 배아임을 PCR로 확인하였다. 이와 같이 제작된 형질전환동물 배아를 2008년 6월 12일자로 대전광역시 유성구 어은동에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC11343BP를 부여받 았다.

상기 배아를 4℃의 4% 파라포름알데하이드에서 하룻밤동안 고정시키고, 파라핀에 매몰시켰다. 이를 절편화하고 (4 μm), 상기 절편을 hematoxylin과 eosin (H&E, Sigma) 으로 염색하거나, 면역조직화학적 분석 (Immunohistochemical analysis)을 수행하였다. 면역조직화학적 분석을 laminin (Abcam), BrdU (Sigma), E-cadherin (BD), β-catenin (BD), Ki67 (Novocastra), anti-filaggrin (Covance), loricrin (Covance), K10 (Covance), K14 (Covance), K1 (Covance), iFABP (gift from Dr J.I. Gordon), chromogranin A (Immunostar), YAP (Cell Signaling, Santa Cruz), p-YAP (Cell Signaling) 및 PECAM-1 (BD) 에 대한 항체를 사용하여 표준 프로토콜 (Koo et al., 2007)에 의하여 수행하였다. EnVision

+ Dual Link System-HRP(DAB+) (DakoCytomation)을 사용하여 퍼옥시다아제 수준을 측정하였다. 배아 장 배상 세포 (intestinal goblet cells)를 Alcian blue로 염색하여 뮤신을 검출하였다. 시판되는 염색 키트 (Roche)를 사용하여 세포사멸을 측정하는 TUNEL 에세이 (koo et al., 2005)를 수행하였다. BrdU (Sigma)를 100 μg/g (체중)의 농도로 임신중인 WW45 hetero 암컷에 복막 내 주입하여 BrdU 편입 (incorporation) 실험을 수행하였다. 주입 1시간, 2시간 또는 24시간 후, 면역조직화학 분석을 위하여 배아를 절개하고 고정하였다.

실시예 3: 장벽 기능 (Barrier function) 에세이 방법

E17.5에, 상기 배아를 인산완충 용액 (PBS)에 헹구고, 산성 X-gal mix (pH4.3의 100 mM 인산완충액, 3 mM K₃Fe(CN)₆, 3 mM K₄Fe(CN)₆, 2 mM MgCl₂, 1 mg/mL X-gal)에 침지시킨 후, 암조건의 37℃에서 8시간 동안 배양하였다 (Hardman et al., 1998).

실시예 4: 전자 현미경 분석

상기에서 얻은 조직 샘플들을 3% 글루타르알데하이드로 2시간 동안 고정한 후, 0.1 % CaCl₂를 포함하는 0.1 M cacodylate buffer로 세척하였다. 상기 샘플들을 0.1 % CaCl₂를 포함하는 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.2)에 용해된 1% OsO₄ 용액으로 4℃에서 2시간동안 후고정시켰다. 다단계 알코올 농도에서 탈수 후, 상기 세포들을 Spurr's 에폭시 수지에 매몰시켰다. 70℃에서 36 시간 동안 수지 중합 후, 연속 절편들을 절단하고, formvar-코팅된 슬롯 그리드 위에 마운팅시켰다. 상기 절편들을 4% uranyl acetate로 10분간, lead citrate로 7분간 염색하였다. Tecnai G2 Spirit Twin 투과 전자 현미경 (FEI Company, USA)과 JEM ARM 1300S 고전압 전자 현미경 (JEOL, Japan)을 사용하였다.

실시예 5: 정량적 실시간 PCR

Trizol (Gibco)을 사용하여 상기 조직 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. SS II RT 키트 (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 제작하였다. 유전자의 발현은 실시간 qRT-PCR (Bio-rad iQ5 multicolor real-time PCR detection system)에 의하 여 측정하였으며, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 발현 수준으로 정상화하였다.

실시예 6: 플라스미드 구축

WW45, MST1, LATS1/2 및 YAP에 대한 인간 cDNA (WW45 (NCBI 등재 번호: NP_068590.1), MST1 (NCBI 등재 번호: NP_006273.1), LATS1 (NCBI 등재 번호: NP_004681.1), LATS2 (NCBI 등재 번호: NP_055387.2), YAP (NCBI 등재 번호: NP_006097.1))를 pcDNA3.1 또는 pcDNA3 (Invitrogen)로부터 각각 변형된 pDK-Flag2 또는 pCMV-HA (상기 pcDNA3.1 또는 pcDNA3 (Invitrogen)를 backbone으로 이용하여 Flag과 HA 태깅을 삽입하여 사용)로 클로닝하였다. 부위 특이적 (Site-directed) PCR 돌연변이유발에 의하여 미스센스 변이 S61A, S109A, S127A, T328A 및 S347A를 YAP 서열에 도입하였다. YAP의 C-말단 TAs의 결실을 갖는 S127A-핵 위치화 형태를 제작하여 YAP-DN 변이형으로 사용하였다. YAP에 대한 cDNAs와 세린이 알라닌으로 치환된 변이체 (SA)를 pET-15b (Novagen) 내로 클로닝하여 재조합 헥사히스티딘 (His6)-태깅된 YAP 및 SA 단백질을 각각 제작하였다.

실시예 7: 항체의 생성

정제된 재조합 헥사히스티딘 (His6)-태깅된 MST1 (K59R, KAIST)를 항원으로 사용하여 MST1에 대한 래빗 폴리클로날 항체를 제작한 후, 친화성 정제하고 면역염색에 사용하였다. 마우스 WW45의 14개의 C-말단 아미노산 (RKQRQQWYAQQHGK; SEQ ID NO: 16)에 해당하는 keyhole-limpet-hemocyanin-콘쥬게이티드 펩타이드를 래빗에 주입하여 WW45에 대한 래빗 폴리클로날 항체 (Rb Ctr#1)를 생성시켰다. 특이적 항체를 적절한 항원 (RKQRQQWYAQQHGK)을 사용하여 친화성 정제하였다.

실시예 8: 초기 각질 형성 세포 배양

E17.5에서 배아 (WW45 hetero 마우스끼리의 교배로 얻은 임신한 마우스 17.5일째에서 제왕절개 수술을 하여 자궁을 들어낸 후 배아를 꺼낸다. 이 후 각각의 배아에서 태반과 양막을 제거, 양막으로 유전자형을 확인한 후, 각각의 유전자형에 대한 배아를 선택적으로 골라 사용)로부터 분리된 각질 형성 세포를 PCT 표피 각질 형성 세포 배지 (Chemicon)에서 배양하였다. 상기 배양 배지에 CaCl₂를 1.2 mM까지의 농도로, TGF-β(R&D)를 1 ng/ml 농도로, LiCl를 10 mM까지의 농도로 첨가하여 분화를 유도하였다. BrdU (Sigma) 를 배지에 첨가하고 (10 μM), 세포를 1시간 배양한 후, 면역염색을 위하여 고정 (4℃의 4% 파라포름알데하이드에서 하룻밤 동안 고정)하고 면역염색을 하였다. 성장 곡선 분석을 위하여, 2 세대의 3x10⁵개의 세포를 6-well 플레이트에 플레이팅하고 세포의 총 수를 매일 측정하였다. Effectene 시약 (Qiagen) 또는 폴리에틸렌이민 (Sigma)을 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 표준 프로토콜에 따라서 레트로바이러스 감염을 수행하였다 (Song et al., 2004).

실시예 9: 면역침강 , 세포하부 분획화 , 웨스턴 - 블랏 분석 및 면역형광

배아로부터 추출하여 초기 배양한 초기 각질 형성 세포 (상기 E17.5 배아 피부에서 상피를 추출하고, 배아 피부에서 dispase를 하룻밤 동안 처리, 상피세포층을 분리한 후, 이 조직을 단일 세포로 분리하여 얻음)를 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 0.2% TritonX-100, 0.3% NP-40, 프로테아제 억제제 (Roche Protease inhibitor cocktails) 및 포스파타아제 억제제 (NaF, sodium fluoride)에서 용해시켰다. 상기 얻어진 세포 용해물을 LATS1/2 항체, 제작된 MST1 항체 (LATS1/2: Bethyl Laboratories, INC; MST1: 상기 실시예 7에서 제작)와 함께 4℃에서 2시간 동안 배양하고, 단백질 A/G 첨가 아가로오스 비드 (Calbiochem)와 함께 배양하여 면역침강 시켰다. 상기 얻어진 면역침강물에 대하여 웨스턴 블랏 분석 또는 면역 침강 (IP)-카이네이즈 에세이를 수행하였다. NE-PER

Nuclear (PIERCE)와 세포질 추출 시약 (Cytoplasmic Extraction Reagents, PIERCE)를 사용하여 핵과 세포질 추출물을 분리하였다. YAP (Cell Signaling), p-YAP (Cell Signaling), MST1 (Cell Signaling), p-MST1 (Cell Signaling), LATS1 (Bethyl Laboratories, INC), LATS2 (Bethyl Laboratories, INC), hemagglutinin (HA, Covance), filaggrin (Covance), laminin B (Santa Cruz), α-tubulin (Chemicon), Flag (Sigma) 및 WW45 (실시예 7)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블 랏 분석을 수행하였다. 면역염색 분석을 위하여, 각질 형성 세포를 -20℃의 무수 메탄올에서 10분동안 고정한 후, 일차 및 이차 항체에 연속적으로 노출시켰다. 슬라이드를 4',6-디아미디노 -2-페닐인돌 (DAPI)과 함께 마운팅하고 영상화하였다.

실시예 10: In-vitro 카이네이즈 에세이

면역침강된 HA-LATS1/2-WT 또는 -KD를 10 μM 아데노신 5'트리포스페이트 (ATP)와 d 2 μCi [γ-³²P]ATP가 보충된 카이네이즈 버퍼 (25 mM HEPES pH 7.4, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCl₂, 5 mM β-glycerophosphate 및 1 mM dithiothreitol)에서 정제된 His-YAP-WT 또는 His-YAP-SA와 함께 30℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 반응 혼합물을 SDS-PAGE 및 오토래디오그래피에 의하여 분석하여, ³²P-표지된 YAP를 검출하였다.

실험예 1: WW45 -결손 마우스의 성장 지연 및 출산전후 치사율 측정

생체 내에서의 WW45의 역할을 밝히기 위하여, 배아간세포 (embryonic-stem (ES)-cell) 기술을 이용하여 WW45 돌연변이 마우스를 제작하였다 (실시예 1). 상기 실시예의 표적 돌연변이는 마우스 WW45 엑손 2를 포함하는 2.4-kb 게놈 부위 (SEQ ID NO: 8 (NCBI 등재번호: NM_ 022028) 중 330-773 위치: atctcatgcc ttcattcatt cggcacggtc caacaattcc cagacggact gacctctgtcttccagattc aagtgctact gctttctcag cttctggaga tggtgtagtt tcaagaaaccagagtttcct gagaactgca attcaaagga cacctcatga agtaatgaga agagaaagccacagactgtc tgccccttct taccttgtca ggagcctagc agatgtccct cgagagtgtggctcatcaca gtcatttttg acagaagtta actttgctgt tgagaatgga gactctggctcccgatactt cttctcagat aacttttttg atggacagag aaggcggcca cttggagatcgtgcacaaga agattacaga tattatgaat acaaccatga tctcttccag aggatgccacagagtcaggg gaggcacact tcag)가 퓨로마이신 카세트 (puromycin cassette, Lim et al., 1996; Lee et al., 2006)로 치환되어, WW45에서의 이른 종료가 일어나도록 된 것이다. 전기천공, 퓨로마이신 양성 선별, 디프테리아톡신 음성 선별 (Lim et al., 1996; Lee et al., 2006) 및 하고, 5'외부 측면 프로브 (5' external flanking probe, Sp-l과 Sp-r 두 프라이머를 사용, 지노믹 DNA에서 상기 프라이머로 PCR을 하여 프로브를 제작하였다

프로브 서열은 다음과 같다.

Sp-l: 5'- CCT AGA CCC TTT CAA CAA GCA -3' (SEQ ID NO: 17)

Sp-r: 5'- TGC TAT CAC TCA TCG GGA TT -3' (SEQ ID NO: 18)

이와 같이 제작된 프로브를 사용하는 서던 블랏 분석 (Combi H12, FinePCR)에 의한 스크리닝 후, 표적화된 클론을 동정하고, 키메라 마우스를 C57BL/6 마우스 (Jackson Lab에서 구입한 후 자체 동물실에서 키움)와 교배한 후의 생식 세포를 통하여 유전시켰다 (도 1a).

도 1은 동종 재조합에 의한 WW45 유전자의 표적화된 파괴를 보여주는 것으로, 도 1a는 WW45 표적화 전략을 보여주는 모식도로서, 마우스 WW45 게놈 좌위, 표적화 벡터 및 표적화된 좌위 (locus)를 보여준다. WW45 엑손 2는 퓨로마이신 카세 트로 치환되고, 디프테리아 독소 A (Lee et al., 2006)를 사용하여 음성 선별하였다. 5 개의 엑손을 검정 박스로 표시하였다. 또한, 게놈 DNA의 서던 혼성화를 위한 상기 5'-external 프로브, 제한 부위와 혼성화하는 단편의 예측 크기, 및 PCR을 위한 프라이머 쌍이 표시되어 있다. 화살표 머리는 WT (1 및 2) 또는 MT (1 및 3) 대립유전자의 유전자형 분류에 사용된 프라이머 (상기 실시예 1 참조)를 나타낸 것이고, Bg는 BglII 제한 부위를 나타낸 것이다.

WW45 단백질의 부재는 돌연변이 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs)에서 에서 얻는 단백질 액상을 전기영동으로 분획한 후에 Western Blotting으로 확인하였으며 (도 1b, 이는 돌연변이 마우스 내의 null allele를 나타낸다. 도 1b 는 5'-external 프로브, 및 배아의 PCR 유전자형 분류 분석 (실시예 1의 프라이머 참조)을 사용하여 제한효소 BglII에 의하여 분해된 게놈 DNA의 서던 블랏 분석결과를 보여주는 것이다. 웨스턴 블랏 분석 (WB)은 배양된 초기 섬유 아세포에 WW45가 존재함을 보여준다. 화살표는 WW45 밴드를 나타낸다.

도 1b에 나타난 서던 블라팅은 배아줄기세포와 유전자 변형 마우스에서 Genomic DNA를 추출하여 제한효소로 자른 후 0.9% 아가로오스젤로 전기영동하고, 나일론 멤브레인 에 옮겨 붙인다. DNA가 붙은 나일론 멤브레인 을 P³²-CTP-labeled된 5'-external 프로브로 혼성화시키고 이 멤브레인을 세척한 후 밴드를 영상화하였다. 본 도면의 웨스턴 블라팅은 유전자가 제거된 배아와 MEF 세포에서 추출한 단백질을 아크릴-아마이드 젤로 전기영동을 거처, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 단 백질을 부착하였다. 부착된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 항체로 반응한 후, 특정 단백질 밴드를 영상화하였다.

이형접합 마우스가 건강한 가임 상태로 태어났으며, 정상적으로 발생하였다. 그러나, 이형접합 잡종으로부터 태어난 954마리의 한 배 새끼 (littermates) 중에서 3마리의 왜성 (dwarf) 동형접합체가 발견되었으며, 이는 대부분의 null 마우스가 배아 시기에 치사하였음을 의미하는 것이다. 생존 가능한 WW45^-/- 배아가 embryonic days 17.5 (E17.5) 및 E18.5에서 관찰되었다. 상기 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

[표 1] WW45 이종접합체 (heterozygous intercrosses)의 자손의 유전자형

E11.5까지의 WW45^-/- 배아는 이들의 대조군 한 배 새끼들과 비교하여 형태학적으로 구별되는 점이 없었다. 그러나, 약 E13.5 이후부터는, WW45^-/- 배아들은 대조군보다 약간 작았으며, 이는 체중 증가가 천천히 나타남을 의미한다 (도 1c). 도 1c의 상단은 E17.5에서의 야생형과 변이체 배아의 현미경상 모습을 보여주는 것 이고, 하단은 배아시기에 따른 야생형 (+/+) 및 변이체 (-/-) WW45 배아의 성장 곡선을 보여주는 것으로, 변이체 (-/-) WW45 배아의 성장 지연을 보여준다. 성장 지연은 있었지만, 변이체들의 배아 치사를 유발하지는 않았다. 이러한 결과에 자극 받아, 변이체 및 이들의 한 배 새끼로부터 얻은 태반을 조사하였다. 정상형 태반에서, 혈관 침습 (Vascular invasion)은 labyrinth layer 발생의 증가를 정상적으로 수행하였다. 반면, 변이체 태반은 labyrinth layer의 증식 및 혈관화에 지연을 나타내었다 (도 1d). 도1d는 E17.5 야생형 및 변이체 배아에서 분리된 절편을 Hematoxylin과 eosin (H&E)로 염색한 모습을 보여주는 것이다 (실시예 2 참조). 변이체 태반에서 대부분의 층은 혈관화의 감소 및 장애를 갖는 성숙 결핍을 보이는 것으로 나타났다 (de: decidua; sp: spongiotrophoblast layer; la: labyrinth layer. Scale bar: 500 μm). 우측 패널은 박스로 표시된 부분의 고배율 이미지를 보여주는 것이다.

한편, 실시예 2에 기재된 바에 따라서, 항 PECAM-1 및 항-laminin으로 염색하여 태아와 모체의 혈관의 불완전한 혼합을 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 E17.5에서의 WW45^-/- 태반의 혈관형성 결함을 보여주는 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이, PECAM-1 및 laminin에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학적 분석을 수행함으로써 배아외 (Extra-embryonic) 혈관 결함을 확인하였다. Scale bar: 100 μm.

따라서, 기능 이상 labyrinth layer은 WW45^-/- 배아의 생장 및 생존율에 영향 을 미칠 수 있다.

실험예 2: WW45 결손 배아에서의 상피 세포 과다형성 및 미성숙 분화

지금까지의 Drosophila 연구는 SAV1의 상피 조직에서의 증식 및 세포자멸사의 조절에 있어서의 중요한 역할을 제안하여 왔다. 이에, 본 발명자들은 다양한 배아 시기에서 WW45^-/- 배아를 생리학적으로 분석하였다. 흥미롭게도, 상피 세포의 과증식이 E17.5의 WW45^-/- 배아의 피부와 장 (도 3 및 4), 및 다른 기관 (도 5) 에서 명확하게 관찰되었다. 본 실험은 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따랐다.

본 발명자들은 우선 이들 WW45^-/- 마우스에서의 피부 발생 특징을 밝혔다. 도 3은 E17.5에서 WW45^-/- 표피의 과증식 및 미성숙한 분화를 보여주는 것이다. 각질형성 세포의 분열은 정상적으로 정상형 표피의 기저층에 제한되고, 세포가 세포주기를 벗어나면서 이들 각질형성 세포는 바깥쪽으로 이동하고 분화되어 피부 표면에 가시층 (spinous layers), 과립층 (granular layers) 및 죽은 제핵 각질층 (stratum corneum layers) 을 형성한다 (도 3a-a). 반면, null 배아의 표피는 보다 촘촘한 기저층을 가지며, 확장된 기저층 위층(suprabasal)은 덜 분화되어 있으며, 발생중인 과립 세포는 핵제거 및 밀집이 덜 일어나 있다 (도 3-a'). 모낭의 발달은 거의 관찰되지 않았으며, 미숙한 모낭들만이 이 시기의 null 배아에서 관찰되었다. E-카드헤린 (cadherin)과 Ki67에 대한 Co-면역염색에 의하여 변이체 배아 의 피부는 정상형 배아와 비교하여 증가된 수의 증식성 상피 세포를 포함한다는 것을 확인하였다 (도 3a-b, b'). 변이체 표피에서 대부분의 기저세포와 몇몇 기저층 위층 세포는 Ki67를 발현한 반면, 정상형 표피에서는 기저세포에서만 제한적으로 증식이 일어났다. 도 3a는 hematoxylin & eosin (H&E)-염색된 야생형 표피 절편 (a)과 변이체 표피 절편 (a')의 조직학적 분석 결과를 보여주는 사진이다. 세포 증식은 항-Ki67과 항-E-cadherin 항체 (각각 b 및 b')를 사용하여 공-면역조직화학적 분석을 수행하여 측정하였다. 다중 세포층을 포함하여, Ki67-양성 세포 수의 증가가 변이체 표피에서 관찰되었다. 1-mm² 면적당 증식 세포 퍼센티지를 변이체 상피와 대조군 상피에서 3번씩 독립적으로 정량화하였다 (±SD). 박스로 표시된 부위를 각 유전자형의 우측 패널에 고 배율 이미지로 나타내었다. wt, 야생형; mt, 변이체.

TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick-end labeling)-양성 세포들 또한 정상형 배아의 표피에서 관찰되었으나, null 배아의 표피에서는 관찰되지 않았다 (도 3b-e, e'). 도 3b는 야생형 배아 피부 또는 변이체 배아 피부에서의 분화 마커 발현을 보여주는 것이다. 세포자멸사 분석을 위한 TUNEL 염색에 더하여, K14, K10, loricrin 및 filaggrin에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)-염색된 핵이 파란색으로 나타난다. 변이체 표피에서 층화(stratification)와 분화의 결여 및 전구세포 수의 증가가 관찰되었다. 따라서, 기저층 위층에서의 증식 증가와 말 단 분화된 각질형성 세포의 세포자멸사 감소가 변이체 배아의 표피에서의 과다형성에 기여한다는 것을 확인 할 수 있다.

WW45^-/- 배아의 상피는 과증식하지만 정상적인 분화를 거치지 않는 것으로 보인다. 따라서, 분화의 정해진 시기에서 발현되는 단백질에 대한 항체 패널을 사용하여 변이체 상피에서 상피 분화 지연 및/또는 불완전한지 여부를 조사하였다. Keratin 14은 정상형 배아에서 1 또는 2 층의 기저 세포에서 정상적으로 발현한 반면, WW45^-/- 배아에서는 다층 기저 세포에서 강하게 발현하였다 (도 3b-a, a').

도 4는 E17.5에서의 WW45^-/- 장 상피의 과다형성과 미성숙 분화를 보여주는 것으로, 도 4a는 야생형 장 (a)과 변이체 장 (a')의 H&E-염색된 절편 모습을 보여주는 것이다. 항-Ki67과 항-E-cadherin으로 면역조직화학적 분석을 수행한 결과를 나타내었다 (각각, b, b'). 변이체 상피에서, 다중 세포층을 포함하여, Ki67-양성 세포의 수 증가가 관찰되었다. 1-mm² 면적당 증식 세포 퍼센티지를 변이체 상피와 대조군 상피에서 3번씩 독립적으로 정량화하였다 (±SD). 박스로 표시된 부위를 각 유전자형의 우측 패널에 고 배율 이미지로 나타내었다 (wt, 야생형; mt, 변이체). 도 4b는 야생형 배아 피부 또는 변이체 배아 피부에서의 분화 마커 발현을 보여주는 것이다. Alcian-blue 염색에 더하여, iFABP와 chromogranin A에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 야생형 한 배 새끼와 비교하여, 변이체에서의 장내분비 세포, 배상세포 및 말단 분화중인 세포 수준의 현저한 감소가 관찰되었다. 도 4c는 야생형 장 (위쪽 패널)과 변이체 장 (아래쪽 패널)의 전자 현미경 분석 결과를 보여주는 것이다. 야생형 장세포의 촘촘하고 균일하게 분포하는 미세융모와 비교하여, 변이체 장세포의 경우에는 브러시 가장자리 미세융모의 밀도가 감소된 것이 관찰되었다.

도 5는 E17.5의 WW45^-/- 상피 조직에서의 과다형성을 보여준다. 야생형 (a-d) 또는 변이체 (a'-d')의 상피 조직의 hematoxylin & eosin (H&E)-염색 절편의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것으로, 대장 (a, a'), 폐 (b, b'), 망막 (c, c') 및 혀 (d, d')를 보여준다. 각각의 오른쪽 패널은 검은 색 박스 부분을 확대하여 보여주는 것이다. 변이체 배아에서 상피 조직의 밀도가 높고 붕괴되어 있는 것을 확인할 수 있다. Scale bar: 100 μm.

정상형 배아와 비교하여 WW45^-/- 표피의 기저층 위층에서 keratin-10을 발현하는 세포 수가 증가되었다 (도 4b-b'). 후기 각질형성 세포 분화의 표지인 loricrin와 filaggrin의 발현 수준이 변이체 표피에서 상당한 수준으로 감소하였으며(downregulated), 이는 분화 후기에 결함이 있음을 의미하는 것이다 (도 4b-c'-d'). 말단 분화된 층이 존재하지 않는다는 것은 또한 X-gal 염색을 사용하여 피부 장벽 (skin-barrier) 발생을 분석함으로써 확인할 수 있었다 (Hardman et al., 1998). E17.5에 대조군 배아에서의 색소 배제 (Dye exclusion)가 확립된 반면, WW45^-/- 배아에서는 용액에 침전시 진한 청색으로 바뀌었다 (도 6). 도 6은 E17.5에서 변이체 배아의 피부 장벽 기능 이상을 보여준다. 피부 장벽 기능은 X-gal 염 색에 의하여 측정하였다. 푸른색으로 염색된 것은 변이체 배아에서의 표피 장벽의 형성이 이들의 야생형 한 배 새끼와 비교하여 붕괴되어 있음을 나타낸다.

전자 현미경 분석에 의하여 WW45-null 배아의 표피가 정상형의 표피보다 두꺼운 것을 확인하였다. 더욱이, 과립 및 각화층은 유핵 세포들이 표피 표면까지 퍼져있는 변이체 표피에서의 이상성숙 (dysmaturation)을 나타낸다 (도 3c). 도 3c는 야생형 표피 (위쪽 패널)와 변이체 표피 (아래쪽 패널)의 전자 현미경 분석 결과를 보여주는 것이다. 변이체 피부에서의 평평화된 과립층과 각화층의 손상뿐 아니라 파괴된 기저 하부 세포와 기저 세포에서의 원주 형태의 손상이 관찰되었다.

이러한 데이터는 기저층 위층의 변이체 각질형성 세포는 증식 종료와 말단 분화를 하지 못한다는 것을 보여주는 것이다.

본 발명에서는 또한 변이체 배아에서의 장 발생을 시험하였다. 정상형 장상피는 장샘 (crypts)으로 되는 단층의 극성 상피 세포로 이루어져 있다. 반면, WW45^-/- 변이체 상피는 다층화되어 있으며, 위중층화되고 (pseudostratified) 확대된 핵을 갖는 세포과다 (hypercellularity)를 나타내고, 배상 세포(goblet cells)가 손실되어 있는 분화 동요를 보이고, 유사분열 세포의 수가 증가되어 있다 (도 4a-a' 및 도 5-a, a'). 더욱이, Ki67 염색은 소장에서 융모 상피에 걸친 광범한 증식이 일어나지만, 대조군 상피에서는 증식성 세포가 장샘 기부에 제한됨을 보여주었다 (도 3a-b-b').

실제로, 변이체 결장의 모든 상피 세포는 Ki67-양성이었으며, 이는 형성이상 을 의미하는 것이다 (도 7a). 도 7은 E17.5의 WW45^-/- 상피 조직에서의 과다증식을 보여주는 것으로, 도 7a는 항-Ki67와 항-β catenin을 사용하는 공동 면역조직화학적 분석에 의하여 야생형과 변이체의 결장 상피에서의 세포 증식을 측정한 결과를 보여주는 것이다. 대조군 상피와 비교하여 변이체 상피에서 다중 세포층에 위치하는 것들을 포함하여, Ki67-양성 세포의 수가 증가되었으며, 대조군 상피에서는 Ki67-양성 세포가 주로 제한된 증식 부위에 존재하였다. Scale bar: 100 μm. 이러한 결과에 부합하여, 브로모데옥시우리딘 (bromodeoxyuridine, BrdU) 펄스 실험에 의하여 많은 기관의 변이 상피에서 분열하는 세포 수가 상당히 증가한다는 것을 확인하였다 (도 7b). 도 7b는 BrdU 주입 후 2시간째에 상피 면적 1.0-mm² 당 BrdU-양성 세포 비율을 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 3번씩 독립적 시험한 결과는 나타낸 것이다 (±SD).

그리고 나서, 다양한 장 상피 세포 계통의 분화를 시험하였다. 주요한 상피 세포 종류 중 하나인 장세포의 분화 동안에, FABP 단백질이 정상형 배아의 융모에서는 정상 수준으로 탐지되었으나, 변이체 배아에서는 현저하게 감소된 수준으로 탐지되었다 (도 4b-a, a'). 이와 유사하게, 장내 분비 계열을 따라서 분화를 탐지하는 크로모그라닌 표지 (chromogranin labeling)에 있어서도 변이체 배아에서는 거의 탐지가 되지 않았다 (도 4b-b, b'). 배상 세포에 대한 표지인 알시안 블루 (Alcian blue)로 염색하여 모든 변이체 장관에서 점액 분비 배상 세포가 전혀 존재하지 않음을 확인하였다 (도 4b-c, c'). 초미세구조 분석 (Ultrastructural analysis)에 의해서 또한 융모 장세포의 꼭대기 표면 상에 미세융모 브러시 가장자리가 거의 발달하지 않는다는 것을 확인하였으며, 이는 소장의 변이된 상피에서의 장세포 분화 결손을 의미하는 것이다 (도 4c). 흥미롭게도, 이러한 변이 세포는 꼭대기 부분에 가깝게 위치하는 확장된 핵을 가졌으며, 이는 꼭대기와 기저의 극성이 손상되었음을 의미하는 것이다.

변이체의 피부 및 장의 미성숙 분화에 더하여, 변이체 배아의 폐에서도 미성숙 분화가 관찰되었다 (Lee and Lim, personal observation). 이들 결과를 종합하면, WW45 결손이 상피 조직에서의 과다형성 및 미성숙 분화를 유발한다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3: WW45 의 분화 동안의 상피 전구세포에서의 세포주기 종료 조절 시험

본 실시 예에서는 변이체 세포의 과다 증식이 말단 분화를 위한 세포 주기 종료 실패 또는 증식률 증가에 기인하는 것인지 여부를 시험하였다 (실시예 2에 따름). 우선, BrdU 주입 1 시간 후 S기에서 사이클링 세포 (Ki67⁺)의 비율을 분석하여 상피 전구세포에서의 세포 주기 지속 기간을 측정하였다 (Schmahl et al., 1983). BrdU-표지된 세포의 퍼센티지가 변이체 배아에서 증가하였지만, BrdU⁺Ki67⁺/Ki67⁺ 표지 지수는 정상형과 변이체 배아에서 거의 비슷하였고, 이는 정상형과 변이체 배아의 증식률이 유사하다는 것을 의미하는 것이다 (도 8a). 도 8 은 발생중인 WW45^-/- 상피에서의 세포주기의 수 증가는 비효과적인 증식 중단에서 기인하는 것임을 보여주는 것으로 도 5a는 1 시간 펄스 후 BrdU로 표지된 전구세포 (Ki67⁺)의 비율을 나타낸 그래프이다. 야생형 배아와 변이체 배아 간 세포 주기 길이의 차이가 없었다.

두 번째로, BrdU 주입 24시간 후의 분열하는 세포 (BrdU⁺) 비율을 조사하여 세포주기 재진입 빈도를 측정하였다 (Chenn and Walsh et al., 2002). BrdU 적용 및 분석 사이의 시간 간격 동안에, 세포들은 그대로 남아있거나 (Ki67^-), 세포 주기로 재진입 (Ki67⁺) 할 수 있다. BrdU⁺Ki67⁺/BrdU⁺ 세포의 평균 비율은, 정상형 대조군과 비교하여, 변이체 소장에서는 49%, 변이체 결장에서는 58%의 상당한 정도로 증가하였다 (도 8b). 도 8b는 BrdU 주입 24시간 후 BrdU-양성 세포에서의 Ki67에 대한 면역반응성 분석 결과를 보여주는 것으로, 세포 주기에 재진입 하는 세포 (BrdU⁺Ki67⁺) 의 비율이 변이체 배아에서 현저하게 증가함을 보여준다.

상기 결과들은 WW45가 배아 발생 동안에 상피 전구세포에서의 세포 주기 종료를 촉진한다는 것을 의미한다.

실험예 4: in-vitro 분화 동안의 WW45 ^-/- 각질 형성 세포의 세포 주기 종료 장애

추가적인 상피 세포의 분화와 증식률 분석을 위하여, 배아의 피부에서의 초기 각질 형성 세포를 분리하였다. in- vivo 데이터와 부합하여 (도 8a), WW45^-/- 각질 형성 세포는 정상적인 세포 주기 분포를 나타내었으며 증식률은 대조군 세포와 비교하여 유의적으로 증가하지 않았다 (도 8c). 도 8c는 야생형 상피와 변이체 표피로부터 분리된 초기 각질 형성 세포의 증식 곡선을 나타낸 것으로 유사한 속도를 보이는 것으로 나타났다.

또한, 이는 WW45가 증식률을 조절하지 않을 것이라는 것을 제안한다. 각질 형성 세포의 증식 종료 (및 가능하게는 말단 분화)를 유도하는 것으로 나타난 염화리튬 (LiCl), 변형 성장 인자-β (transforming growth factor-β, TGF-β) 또는 칼슘을 첨가하여, 발생중인 표피 세포의 분화 및 증식 정지를 조절하는 WW45의 작용을 시험하였다 (Hennings et al., 1980; Shipley et al., 1986; Olmeda et al., 2003). Ca^{2 +}, TGF-β 또는 LiCl를 처리한 경우 (실시예 8 참조), 정상형 각질 형성 세포는 효과적인 성장 정지를 나타내었고, BrdU-표지된 세포의 수가 감소하였다. 대조적으로, 변이체 세포는 계속적인 증식을 보였고, Ca^{2 +}, TGF-β 또는 LiCl 처리 후 24시간 후에 BrdU-양성을 나타내었다 (도 8d 및 도 9). 도 8d는 초기 각질 형성 세포에서의 칼슘 촉진 분화의 유도를 보여주는 그래프이다. 칼슘이온의 존재 또는 부재 하에서 배양된 각질 형성 세포에서 표시된 시간에서의 BrdU 편입 수준을 나타낸 그래프이다. 또한 도 9는 WW45^-/- 각질 형성 세포에서의 세포 주기 종료 장애를 보여준다. (A)와 (B)는 변형 성장 인자 (TGF)-β(A) 또는 LiCl (B)를 처리하거나 처리하지 않고 배양된 각질 형성 세포의 BrdU-표지 지수를 나타낸다. TGF-β 또는 LiCl 처리에 반응하여 나타나는 세포 주기 종료가 WW45-결여 각질 형성 세포에서는 나타나지 않았다.

WW45-결여된 배아는 분화 조건하에서 변이체 각질 형성 세포의 불완전한 증식 종료를 나타내었다. 이들 결과와 부합하여, 필라그린 (filaggrin)의 발현은 분화 유도 후의 변이체 각질 형성 세포에서는 관찰되지 않았으나, 정상형 각질 형성 세포에서는 명확히 관찰되었다 (도 10a). 도 10은 분화 동안의 MST1 신호화 경로의 활성화를 보여주는 것으로, 도 10a는 분화 조건 하에서의 MAT1 경로의 성분들의 단백질 상태를 보여주는 것이다. 초기 각질 형성 세포를 Ca^{2 +}를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하고, 표시된 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅하여 분석하였다. 분화조건 하에서, 대조군 각질 형성 세포에서 YAP와 LATS1/2의 이동성 변화 (mobility shift)와 pMST1 블라팅에서 보여지는 바와 같은 MST1 활성화가 관찰되었으나, 변이체 각질 형성 세포에서는 관찰되지 않았다. 각질 형성 세포 분화는 filaggrin 발현의 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

이들 데이터는 WW45^-/- 상피 조직에서의 증식 증가는 증식률의 증가에 기인한다기 보다는 분화 동안의 전구 세포의 성장 정지의 손상에 기인하는 것임을 보여준 다.

실험예 5: in vitro 에서의 각질 형성 세포 분화 동안의 MST 신호화 경로의 활성화

분화 동안의 WW45가 세포주기를 종료시키는 분자 메커니즘의 특징을 보다 더 조사하기 위하여, 분화 동안에 각질 형성 세포에서의 MST, LATS 및 YAP의 위치와 인산화를 조사하였다. 흥미롭게도, 포스포-MST1 웨스턴 블라팅에 의하여 보여지는 바와 같이, MST1의 자가활성화가 분화 시에 유도되었으며, 이는 MST1 활성화를 의미하는 것이다 (도 10a). 반면, 이러한 MST1의 자가인산화는 WW45^-/- 각질 형성 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, WW45는 칼슘 처리에 의한 분화 유도 후의 MST1 활성화에 필요한 것이다. 또한, 칼슘 처리에 의한 분화 유도 후의 LATS1/2와 YAP의 이동 패턴이 상이하다 (도 10a). LATS1/2와 YAP의 인산화가 분화된 정상형 각질 형성 세포에서는 관찰되었으나 분화된 변이체 각질 형성 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, YAP의 인산화는, 포유류의 상피 분화 동안에, MST1 신호화 경로, 특히 LATS1/2에 의존하는 것으로 보인다.

또한, MST1 신호화 경로의 성분 형성이 각질 형성 세포의 분화와 연합되고 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 우선, WW45^-/- 각질 형성 세포를 WW45를 포함하거나 포함하지 않는 LATS1/2, MST1 및 YAP로 형질전환 시킨 후, 면역침강 (immunoprecipitation) 전에 분화를 유도시켰다. WW45-결여된 각질 형성 세포에 있어서, LATS1 및 LATS2가 YAP를 공침전시켰지만 MST1은 공침전시키지 않았다. 반면, 이들 단백질은 WW45의 존재 하에서 안정한 복합체를 형성한다 (도 11). 도 11은 초기 각질 형성 세포에서 MST1/2와 LATS1/2 간의 상호 작용에 WW45가 필요함을 보여준다. 분화 조건 하에서 MST1, LATS1/2, WW45 및 YAP 간의 물리적 결합 (Physical association)이 나타난다. WW45^-/- 초기 각질 형성 세포를 각 패널의 상단에 표시된 플라스미드로 공동 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 24시간 후, 세포를 Ca^{2 +}-함유 배지에 24시간 동안 둔 후 회수하여 항-hemagglutinin (HA)를 사용하는 면역침강 시험에 사용하였다. 얻어진 침전물에 대하여 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 복합체 형성은 WW45가 존재하는 경우에만 관찰되었다.

또한, 내재하는 MST1와 LATS1/2는 WW45 존재 하의 분화 조건 하에서 각질 형성 세포에서 복합체를 형성하였다 (도 10b). 도 10b는 MST1에 대한 항체를 사용하는 면역침강과 웨스턴 블랏 에세이에 의하여 Ca^{2 +}을 첨가하거나 첨가하지 않고 24시간 동안 배양한 야생형 및 변이체 초기 각질 형성 세포를 분석한 결과를 보여주는 것이다. Ca^{2 +} 처리한 대조군 샘플에서만 복합체 형성이 관찰되었다. 또한, YAP은 정상형 WW45로 보충되고 LATS2 정상형 (WT)를 발현하는 각질 형성 세포에서는 완전히 인산화되었지만, 정상형 WW45를 갖고 LATS2 kinase dead (KD) 및 MST1을 발현하는 세포 또는 MST1과의 상호작용을 담당하는 SARAH 도메인이 결여된 WW45를 갖는 세포에서는 인산화되지 않았다 (도 10c). 도 10c는 MST1/WW45를 통하여 활성화된 LATS2에 의한 YAP 인산화를 보여주는 것이다. WW45^-/- 초기 각질 형성 세포를 표시된 플라스미드와 공동 트랜스펙션 시키고 표시된 항체로 조사하였다. 손상되지 않은 WW45와 MST1의 존재 하의 YAP 및 LATS2의 이동성 변화가 관찰되었다.

이러한 결과는 포유류에서 WW45가 MST1 활성화에 필요하고 MST1를 복합체에 보충함으로써 LATS1/2 인산화를 촉진시킨다는 것과, 이와 같이 활성화된 LATS1/2가 YAP을 인산화시킨다는 것을 의미하는 것이다. 놀랍게도, 포유류에서의 MST1 신호화 경로의 활성화는 분화 신호, 적어도 각질 형성 세포 분화에 특이적인 것으로 추측된다.

그리고 나서, LATS1/2에 의하여 인산화되는 YAP 잔기를 동정하였다 (도 12). 인간 YAP와 Drosophila Yki 사이의 주요한 보존된 잔기를 알라닌으로 변이시켰다 (S61A, S109A, S127A, S328A, 및 S347A). 이 중에서, S127A 변이체만이 세포에서 활성화된 LATS2에 의하여 인산화되지 않았다 (도 12b). 실제로, in-vitro 카이네이즈 에세이에 의하여 LATS1/2에 의한 YAP S127A 변이체의 인산화 수준이 현저하게 감소하였음을 입증하였으며, 이는 세린 127이 주된 인산화 부위임을 보여주는 것이다 (도 12c). 이러한 결과는 YAP의 세린 127이 기본적인 Hippo-반응 인산화 부위라는 최근의 연구 결과와 부합하는 것이다 (Dong et al., 2007). 결론적으로, 상기 부위가 각질 형성 세포 분화 동안에 포스포-세린 127 항체를 갖는 내재 YAP의 인산화 부위임을 확인하였다 (도 12d).

도 12는 초기 각질 형성 세포 내의 분화 신호에 의하여 MST1 경로에서 LATS1/2에 의한 YAP 세린 127의 인산화가 유도됨을 보여주는 것이다. 도 12a는 Drosophila Yki 단백질과 YAP의 보존 부위의 부분적 서열을 보여준다. LATS1/2에 의하여 인산화되는 부위의 공통서열을 밑줄로 나타내었다. LATS1/2에 대한 인산화 부위인 YAP 세린 127을 별표시로 나타내었다. 도 12b는 YAP의 인산화 부위를 동정한 결과를 나타낸 것이다. WW45-결손된 초기 각질 형성 세포를 표시된 플라스미드로 공동 트랜스펙션하고 표시된 항체로 프로빙하였다. 도 12c는 면역침강된 HA-tagged LATS1/2 WT 또는 KD와 정제된 His-YAP-WT 또는 His-YAP-SA를 사용하여 in-vitro 카이네이즈 에세이를 수행하고, 얻어진 신호를 오토래디오그래피하여 나타내었다 (상단 두 개 패널). 항-LATS1/2와 항-YAP을 사용하는 웨스턴 블랏 분석을 위하여 투입된 카이네이즈와 기질 또한 나타내었다 (하단 두 개 패널). 도 12d는 24시간 동안 Ca^{2 +} 처리하거나 처리하지 않고 배양한 야생형 및 변이체 초기 각질 형성 세포에서 세린 127 인산화된 YAP (p-YAP)에 특이적인 항체 또는 항-YAP를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 보여준다. 항-filaggrin과 항-WW45를 사용하는 웨스턴 블랏 분석에 의하여 각질 형성 세포의 분화와 WW45 존재 여부를 검정하였다.

실험예 6: 상피 분화 동안의 MST1 및 YAP의 동적 세포 내 위치화

YAP는 원형질막에서 Src 계통 카이네이즈와 연결되고, 세포질에서는 14-3-3 계통 단백질과 연결되고, 핵에서는 전사 인자와 결합하는데, 이는 YAP가 세포 내에서 동적으로 위치함을 제시하는 것이다 (Sudol et al., 1994; Yagi et al., 1999; Vassilev et al., 2001; Mattallansa et al., 2007). 그러나, MST1 경로의 다른 성분들의 위치화는 아직 밝혀지지 않았다. 따라서, 핵-세포질 분획 (nuclear-cytoplasmic fractionation) 시험을 통하여 상피 세포 분화 동안의 MST1 경로 성분의 세포하부 위치화 (subcellular localization)를 시험하였다. 정상형 세포에서, MST1은 주로 미분화 조건하의 세포질 분획에서 검출되었으나, 분화 유도 후에 핵 분획에서 상당량이 검출되었으며, 이는 분화가 MST1의 핵 위치화를 유발한다는 것을 의미하는 것이다. 그러나, 이러한 MST1의 핵 위치화는 변이체 세포에서 심각하게 손상되었다 (도 13a). MST1 위치화에서의 이러한 변화에 더하여, YAP은 미분화 조건 하의 핵 내에 주로 발견되었지만, 분화된 정상형 세포에서는 인산화되고 주로 세포질에서 탐지되는 것으로 나타났다. 그러나, YAP의 인산화와 세포질 위치화는 분화 조건 하의 변이체 세포에서 손상되었다 (도 13a). 이러한 결과는 각질 형성 세포 분화의 유도가 MST1의 핵내 이동을 촉진시킨 후, LATS1/2를 활성화시키고, 상기 활성화된 LATS1/2는 다시 되고 YAP을 인산화시킨다는 것과, WW45가 이러한 과정에 필요하다는 것을 의미한다. 도 13은 분화 동안의 MST1/YAP의 동적 위치화를 보여주는 것으로 도 13a 내지 13c은 분화 자극에 반응하는 MST1와 YAP의 세포 하부 위치화를 보여주는 것이다. 도 13a에서 24시간 동안 Ca^{2 +}을 처리하거나 처리하지 않은 야생형 또는 변이체 배아로부터 얻은 초기 각질 형성 세포에 대하여 분획화 시험을 수행하였다. 분획화된 용해물에 대하여 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. N, nuclear; C, cytoplasmic.

또한, WW45-null 각질 형성 세포에서 YAP 단백질들을 이소적으로 과발현 시킴으로써 YAP의 위치화를 조절하는 MST1/WW45/LATS2의 작용을 추가로 시험하였다. 앞선 결과와 부합되게, YAP은 LATS2에 의하여 인산화되고, 이러한 인산화된 형태는 세포질에서 발견되었으며, 이는 아마도 WW45에 의한 MST1의 핵 이동에 기인하는 것으로 생각된다 (도 13b). 도 13b는 WW45-결여된 각질 형성 세포를 표시된 플라스미드와 함께 공동 트랜스펙션 시킨 결과를 보여주는 것이다. 트랜스펙션 시키고 24시간 후, 세포들을 Ca^{2 +} 배지에 24시간 더 둔 후, 수집하여 분획화 시험에 사용하였다. 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. YAP의 세포질 이동과 MST1의 핵 이동은 손상되지 않은 WW45에서만 검출되었다.

반면, 이러한 MST1와 YAP의 동적 위치화는 SARAH 도메인이 결여된 WW45를 발현하는 세포에서는 발견되지 않았으며, 이는 WW45 SARAH 도메인이 이러한 과정에 필요하다는 것을 보여주는 것이다. 또한, YAP S127A 변이체는 MST1 신호화 활성화와 무관하게 주로 핵에 위치하였으며, 이는 핵에서의 LATS2에 의한 YAP의 세린 127의 인산화가 YAP이 세포질에 위치하는 것을 촉진한다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 분화된 각질 형성 세포에서의 MST1/WW45/LATS/YAP 복합체의 존재에 부합하는 것이다 (도 10b).

또한, 배아 조직 절편뿐만 아니라 분화된 각질 형성 세포에서 면역염색을 수 행함으로써 MST1와 YAP의 독특한 위치화를 시험하였다 (도 13c 및 13d). 도 13c는 야생형 및 변이체 배아로부터 얻은 초기 각질 형성 세포를 Ca^{2 +}를 24시간동안 처리하거나 처리하지 않고 배양한 후, 항-MST1, 항-YAP 및 항-p-YAP으로 면역염색 시킨 결과를 나타낸 것이다. Ca^{2 +}-유도 분화된 대조군 세포에서는 YAP 및 MST1의 phospho-의존적 이동이 일어났지만, 변이체 세포에서는 이동이 일어나지 않았다. 도 13d는 E17.5에서의 야생형 상피 (a-f) 및 변이체 상피 (a'-f')에서 MST1, YAP 및 p-YAP에 대한 면역퍼옥시다아제 염색 시험 결과를 나타낸 것이다. 대부분의 변이체 상피 세포에서 MST1는 세포질에서 검출되고 YAP는 핵에서 우세하게 검출되었으며, 이는 대조군 상피 세포에서 분화 단계에 따라서 동적 분포를 나타내는 것과 대조적이다. 세린 127 phospho-특이적 면역반응성은 대조군의 분화중인 부위에서는 세포질 특이적인 반면, 변이체 세포에서는 이러한 신호가 나타나지 않았다. hematoxylin으로 대조염색(Counterstaining)을 수행하였다. (a-c, a'-c') 피부. (d-f, d'-f') 소장.

MST1 항체의 특이성을 MST1-제거 세포를 이용한 면역블랏과 면역염색에 의하여 검정하였다 (도 14). 도 14는 MST1 항체를 확인한 것을 보여주는 것으로, 도 14a에서는 대조군으로 GFP siRNA 또는 MST1 siRNA 를 코딩하는 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 HeLa 세포의 용해물에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. α-tubulin를 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 14b는 대조군 발현 HeLa 세포와 MST1- siRNA 발현 HeLa 세포를 DAPI와 MST1 항체로 염색한 결과를 보여주는 것이다.

분획화 결과와 부합되게, MST1와 YAP에 대한 염색에 의하여 정상형 각질 형성 세포에서의 분화 동안의 내재 YAP 및 MST1의 동적 위치화를 확인하였으나, 이러한 이동은 변이체 각질 형성 세포의 분화 동안에는 뚜렷하게 나타나지 않았다 (도 13c). 더욱이, 인산화된 YAP은 분화된 정상형 세포의 세포질에서 주로 발견되지만, 변이체 세포에서는 거의 탐지되지 않는다. 정상형 조직 절편에서, Ki67-양성인 증식성 기저 세포에서 YAP가 핵에 위치하고, 분화된 세포에는 YAP가 세포질에 위치하는 것으로 검출되었다 (도 13d 및 도 15). 도 15는 소장의 증식성 전구세포 (progenitor) 분획에서의 YAP의 핵 위치화를 보여준다. 야생형 배아의 연속 절편을 항-YAP과 항- Ki67로 염색하였다. 소장의 장샘 분획의 Ki67-양성 사이클링 세포에서 핵에 위치하는 YAP가 관찰되었다. Scale bar: 100μm. 이러한 결과는 YAP이 소장의 장샘 구획의 핵에서 발현하고 위치화한다는 최근 연구 결과에 부합한다 (Camargo et al., 2007).

그러나, MST1는 정상형의 증식하는 세포의 세포질에서 검출되었지만, 정상형 피부와 장의 분화된 세포의 핵에서는 검출되지 않았다. 반면, 변이체 배아의 많은 증식하는 세포에서는 MST1는 세포질에 위치하고 YAP는 핵에 위치하였다 (도 13d). MST1와 YAP 위치화의 변화에 더하여, 대조군 배아의 분화된 부위의 세포질은 phosphor-YAP에 대하여 양성으로 염색되었으나 염색 정도는 변이체 배아에서 현저하게 감소되었다 (도 13d). 따라서, in-vitro 상피 분화 결과에 부합하여, MST1와 YAP의 동적 위치화 변화는 또한 상피 세포가 in vivo 분화를 진행함에 따라 일어날 수 있고, WW45는 이러한 과정의 주요 단백질일 수 있다.

실험예 7: YAP S127A 를 발현하는 정상 각질 형성 세포의 분화와 증식 종료 장애

YAP의 인산화와 세포질로의 이동이 MST1/WW45에 의하여 작용하는 LATS1/2에 의존한다는 실험 결과에 기초하여, YAP의 세린 127의 인산화가 각질 형성 세포 증식 정지 및 분화를 유도하는데 필요한지 여부를 조사하였다. 따라서, 각질 형성 세포를 YAP WT, non-phospho형태인 YAP S127A 또는 phospho-mimic 형태인 YAP S127D를 발현하는 레트로바이러스로 감염시켰다. 칼슘-유도 분화 신호가 YAP WT 또는 YAP S127D를 발현하는 각질 형성 세포의 증식을 억제하였다. 반면, YAP S127A는 주로 핵에 위치하였고, 정상형 각질 형성 세포에서의 과발현은 증식 정지 및 분화를 유발하지 못하였다 (도 16a 내지 16c). 이러한 결과는 YAP의 인산화되지 않은 형태는 핵에서 위치하고 작용하여 분화 신호의 존재 하에서도 세포가 증식하도록 한다는 것을 의미하는 것이다. 또한, YAP의 불활성화는 WW45 결여 각질 형성 세포에서의 분화 결손을 억제시킨다. 이를 위하여, 내재 YAP 단백질의 기능을 지배적으로 억제하는 YAP의 도미넌트-네가티브 (dominant-negative, DN) 형태를 만들었다 (Zhao et al., 2007). YAP DN은 변이체 세포의 분화를 원조하는데 충분하였다 (도 16d 및 16e). 결론적으로, 이러한 결과들은 인산화된 YAP의 세포질로의 세포 하부 표적화와 불활성화가 세포 주기 종료 및 분화 개시에 필요하다는 것을 보여주는 것이다.

도 16은 YAP 세린 127의 인산화의 상피 분화에 대한 효과를 보여주는 것이다. 도 16a는 분화 조건 하에서 BrdU로 표지된 증식성 세포의 퍼센티지를 나타낸 것이다. 표시된 유전자로 레트로바이러스 감염시키고 Ca^{2 +} 처리하거나 하지 않고 배양한 후 표시된 시간에 초기 각질 형성 세포에서의 BrdU 편입 수준을 측정하였다. WT, wild-type; SA, S127A mutant, SD, S127D mutant. YAP-SA-감염 세포는 Ca²⁺-유도 분화에 반응하여 세포주기를 종료시키지 못하는 것으로 나타났다. 도 16b는 YAP-SA-감염 세포가 분화 자극에 반응하여 분화하지 못하는 것을 보여준다. 상기 (a)에서 얻은 용해물에 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. YAP-SA-감염 세포에서 후기 말단분화 마커인 filaggrin의 프로세싱 형태 없이 YAP 운동성 변화의 억제가 관찰되었다. 도 16c는 분화 자극에 반응하여 나타난 YAP, YAP SA 및 YAP SD의 세포 하부 위치화를 보여주는 것이다. (a)의 분획들에 대하여 표시된 항체로 면역 블라팅 분석을 수행하였다. Ca^{2 +}-유도 분화 조건 하에서 YAP SA의 세포질 이동 결여가 관찰되었다. 도 16d는 분화 조건 하에서 표시된 유전자로 감염된 WW45-결여 각질 형성 세포 내의 BrdU-양성 세포 비율을 나타낸 것이다. WT, wild-type; DN, dominant negative form. YAP-DN으로 감염된 WW45 결여 각질 형성 세포에서 Ca^{2 +} 처리에 반응하는 세포 주기 재진입이 억제되는 것이 관찰되었다. 도 16e는 (d)에서 얻은 용해물에 대하여 표시된 항체를 이용하여 웨스 턴 블랏 분석을 수행하였다. YAP-DN으로 감염된 WW45 결여 각질 형성 세포에서 Ca²⁺ 처리에 반응하여 분화가 rescue 되는 것이 관찰되었다. 도 16f는 발생중인 상피 조직에서의 WW45의 역할에 대한 제안 모델을 모식적으로 나타낸 것이다. 분화 조건하에서, WW45는 MST1/2와 결합하여 핵 위치화 복합체를 형성함으로써 LATS1/2 인산화를 촉진시키고, 이와 같이 활성화된 LATS1/2 는 YAP를 인산화시키고, 이로 인하여 YAP는 세포질로 이동하게 된다. 이러한 YAP의 인산화와 세포질로의 세포하부 표적화는 발생중인 상피 세포에서 증식 종료 및 분화 개시에 필요하다. 결국, 발생 동안, MST1 경로는 증식과 말단 분화 간의 균형을 조절함으로써 적절한 상피 조직 발생을 조절한다.

도 1은 동종 재조합에 의한 WW45 유전자의 표적화된 파괴를 보여주는 것으로, 1a는 WW45 표적화 전략을 보여주는 모식도로서, 마우스 WW45 게놈 좌위, 표적화 벡터 및 표적화된 좌위를 보여주는 것이고, 1b는 5'-프로브, 및 배아의 PCR 유전자형 분류 분석을 사용하여 제한효소 BglII에 의하여 분해된 게놈 DNA의 서던 블랏 분석결과를 보여주는 것이고, 1c의 상단은 E17.5에서의 야생형과 변이체 배아의 현미경상 모습을 보여주는 것이고, 하단은 야생형 (+/+) 및 변이체 (-/-) WW45 배아의 성장 곡선을 보여주는 것이며, 1d는 E17.5 야생형 및 변이체 배아에서 분리된 절편을 Hematoxylin과 eosin (H&E)로 염색한 모습을 보여주는 것이다. 변이체 태반에서 대부분의 층은 혈관 형성의 감소 및 장애를 갖는 성숙 결핍을 보이는 것으로 나타났다. de, decidua; sp, spongiotrophoblast layer; la, labyrinth layer. Scale bar: 500 μm. 우측 패널은 박스로 표시된 부분의 고배율 이미지를 보여주는 것이다.

도 2는 E17.5에서의 WW45^-/- 태반의 혈관형성 결함을 보여주는 사진이다. Scale bar: 100 μm.

도 3은 E17.5에서 WW45^-/- 표피의 과증식 및 미성숙한 분화를 보여주는 것으로, 3a는 hematoxylin & eosin (H&E)-염색된 야생형 표피 절편 (a)과 변이체 표피 절편 (a')의 조직학적 분석 결과를 보여주는 사진이고, 3b는 야생형 배아 피부 또는 변이체 배아 피부에서의 분화 마커 발현을 보여주는 것이고, 3c는 야생형 표피 (위쪽 패널)와 변이체 표피 (아래쪽 패널)의 전자 현미경 분석 결과를 보여주는 것이다. Scale bar: 100 μm in (A) 및 (B), 2 μm in (C).

도 4는 E17.5에서의 WW45^-/- 장 상피의 과다형성과 미성숙 분화를 보여주는 것으로, 4a는 야생형 장 (a)과 변이체 장 (a')의 H&E-염색된 절편 모습을 보여주는 것이고, 4b는 야생형 배아 피부 또는 변이체 배아 피부에서의 분화 마커 발현을 보여주는 것이고, 4c는 야생형 장 (위쪽 패널)과 변이체 장 (아래쪽 패널)의 전자 현미경 분석 결과를 보여주는 것이다. Scale bar: 100 μm in (a) 및 (b), 2 μm in (c).

도 5는 E17.5에서의 야생형 (a-d) 또는 WW45^-/- 변이체 (a'-d')의 상피 조직의 hematoxylin & eosin (H&E)-염색 절편의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. Scale bar: 100 μm.

도 6은 X-gal 염색에 의하여 측정된 E17.5에서 변이체 배아의 피부 장벽 기능 이상을 보여주는 사진이다.

도 7은 E17.5의 WW45^-/- 상피 조직에서의 과다증식을 보여주는 것으로, 7a는 항-Ki67와 항-β catenin을 사용하는 공동 면역조직화학적 분석에 의하여 야생형과 변이체의 결장 상피에서의 세포 증식을 측정한 결과를 보여주는 것이고 (Scale bar: 100 μm), 7b는 BrdU 주입 후 2시간째에 상피 면적 1.0-mm² 당 BrdU-양성 세포 비율을 정량 분석 결과를 보여주는 것이다. 각 데이터는 3번씩 독립적 시험한 결 과를 나타낸 것이다 (±SD).

도 8은 발생중인 WW45^-/- 상피에서의 세포분열의 증가는 비효과적인 증식 중단에서 기인하는 것임을 보여주는 것으로, 8a는 1 시간 펄스 후 BrdU로 표지된 전구세포 (Ki67⁺)의 비율을 나타낸 그래프이고, 2b는 BrdU 주입 24시간 후 BrdU-양성 세포에서의 Ki67에 대한 면역반응성 분석 결과를 보여주는 것이고, 8c는 야생형 상피와 변이체 표피로부터 분리된 초기 각질 형성 세포의 증식 곡선을 나타낸 것이고, 8d는 초기 각질 형성 세포에서의 칼슘 촉진 분화의 유도를 보여주는 그래프이다. (a-d)에서 얻어진 데이터는 각각 3번씩 독립적 실험하여 얻어진 것이다 (±SD).

도 9는 WW45^-/- 각질 형성 세포에서의 세포 주기 종료 장애를 보여주는 것으로, 9a와 9b는 각각 변형 성장 인자 (TGF)-β(a) 또는 LiCl (b)를 처리하거나 처리하지 않고 배양된 각질 형성 세포의 BrdU-표지 지수를 나타낸다.

도 10은 분화 동안의 MST1 신호화 경로의 활성화를 보여주는 것으로, 9a는 분화 조건 하에서의 MAT1 경로의 성분들의 단백질 상태를 보여주는 것이고, 9b는 MST1에 대한 항체를 사용하는 면역침강과 웨스턴 블랏 에세이에 의하여 Ca^{2 +}을 첨가하거나 첨가하지 않고 24시간 동안 배양한 야생형 및 변이체 초기 각질 형성 세포를 분석한 결과를 보여주는 것이고, 9c는 MST1/WW45를 통하여 활성화된 LATS2에 의한 YAP 인산화를 보여주는 것이다.

도 11은 초기 각질 형성세포에서 항-hemagglutinin (HA)를 사용하는 면역침강 시험에서 얻어진 침전물에 대하여 표시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석한 결과를 보여주는 것이다.

도 12a는 Drosophila Yki 단백질과 YAP의 보존 부위의 부분적 서열을 보여주고, 12b는 YAP의 인산화 부위를 동정한 결과를 나타낸 것이고, 12c는 면역 침강된 HA-tagged LATS1/2 WT 또는 KD와 정제된 His-YAP-WT 또는 His-YAP-SA를 사용하여 In-vitro 카이네이즈 에세이를 수행하고, 얻어진 신호를 오토래디오그래피하여 얻은 결과 (상단 두 개 패널)와, 항-LATS1/2와 항-YAP을 사용하는 웨스턴 블랏 분석을 위하여 투입된 카이네이즈와 기질 (하단 두 개 패널)을 나타낸 것이고, 12d는 24시간 동안 Ca^{2 +} 처리하거나 처리하지 않고 배양한 야생형 및 변이체 초기 각질 형성 세포에서 세린 127 인산화된 YAP (p-YAP)에 특이적인 항체 또는 항-YAP를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 보여주는 것이다.

도 13은 분화 동안의 MST1/YAP의 동적 위치화를 보여주는 것으로, 13a 내지 13c는 분화 자극에 반응하는 MST1와 YAP의 세포 하부 위치화를 보여주는 것이고, 13d는 E17.5에서의 야생형 (a-f) 및 변이체 상피 (a'-f')에서 MST1, YAP 및 p-YAP에 대한 면역 퍼옥시다아제 염색 시험 결과를 나타낸 것이다. Scale bar: 10 μm in (c) and 100 μm in (d).

도 14a는 대조군으로 GFP siRNA 또는 MST1 siRNA 를 코딩하는 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 HeLa 세포의 용해물에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과를 보여주는 것이고, 14b는 대조군 발현 HeLa 세포와 MST1-siRNA 발현 HeLa 세포를 DAPI와 MST1 항체로 염색한 결과를 보여주는 것이다

도 15는 소장의 증식성 전구세포 (progenitor) 분획에서의 YAP의 핵 위치화를 보여주는 것이다. Scale bar: 100μm.

도 16은 YAP 세린 127의 인산화의 상피 분화에 대한 효과를 보여주는 것으로, 16a는 분화 조건 하에서 BrdU로 표지된 증식성 세포의 퍼센티지를 나타낸 것이고, 16b는 YAP-SA-감염 세포가 분화 자극에 반응하여 분화하지 못하는 것을 보여주는 것이고, 16c는 분화 자극에 반응하여 나타난 YAP, YAP SA 및 YAP SD의 세포 하부 위치화를 보여주는 것이고, 16d는 분화 조건 하에서 표시된 유전자로 감염된 WW45-결여 각질 형성 세포 내의 BrdU-양성 세포 비율을 나타낸 것이고, 16e는 (d)에서 얻은 용해물에 대하여 표시된 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이고, 16f는 발생중인 상피 조직에서의 WW45의 역할에 대한 제안 모델을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 17은 WW45^-/- 상피에서의 분화된 세포의 손상 및 전구 세포의 발현을 보여주는 것으로, 17a는 표시된 발생 단계에서의 야생형과 변이체 배아로부터 얻은 표피의 H&E 및 항-K1으로 염색된 절편을 보여주는 것이고, 17b는 표시된 발생 단계에서의 야생형과 변이체 배아에서 얻은 장의 H&E-염색 절편을 보여주는 것이다. Scale bar: 100 μm.

도 18은 말단 분화 개시된 WW45^-/- 상피에서의 Ki67-양성 세포 수를 나타낸 것이다. 데이터는 3번씩의 독립된 실험 수행 결과 얻어진 것이다 (±SD).

도 19는 야생형 및 변이체 표피에서 분리된 RNA에 대하여 정량적 RT-PCR에 의한 분석을 수행하여 얻은 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 3번씩의 독립된 실험 수행 결과 얻어진 것이다 (±SD).

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ccttctggta cctgcaaatc catatcatac tgcagaaatt cctgactggc 1260 ttcaggttta cgcacgagcc cctgtgaaat atgaccacat tctgaagtgg gaactcttcc 1320 agctggctga cctggataca taccagggaa tgctaaagtt gctcttcatg aaagaattgg 1380 agcagattgt taaaatgtat gaagcataca gacaagccct tcttacagag ttggaaaacc 1440 gaaagcagag acagcagtgg tatgcccaac aacatggaaa aaatttttga gctgattttt 1500 taaaaattta agttttgtaa gagctttaaa atattttcac agataaaaaa ttgcaaacaa 1560 gtactctggt taataaatgc tgcttccttt gtggaaatta taaaattcta actttacatg 1620 tattttgtta ttagaaattt tcttttattg aatgagaaaa attagtctat cattttaaga 1680 gccaatatgg caaacacttt caaatactgt atattaggaa actgttttgg tattcttgat 1740 ggaaaaaaac gcagcggaaa tgtcattatg aacagatgtt aaataggaaa ttattacttg 1800 ttaacttctt acagcagtag taccttcttt aaaaaaaaaa aagaatctgc ggtatttttt 1860 taaaaaaaaa gtttaccgct gtagtgtgaa atattgtctg gaaagggatg gtttaaatat 1920 taccatgatg tagttgaaat ataaaatagg atttggaacc ttattgtgat aaatatttat 1980 atatgatgta tgtttgtctc ccctctccaa agtaaggaac ccagctgggc gtggtggctc 2040 actcctgtaa tcccagcatt ttgggaggcc gaggtgggtg gaccgcttga gtccacgagt 2100 ttaagaccag cctgggcaac atggtgaagc cccatctcta caaaaaatac aaaaaaatta 2160 gccgggtatg atggtgtgtg cctctagtcc cagctacttg ggaggctgag gtcagaggat 2220 ggcttgagcc caagaggcag aggttgcagg gtcaagatcg caccacttgc actgcagcct 2280 gagagagaga gagccagacc ttgtctcaaa aaataaaaaa taaaaaaata aaaacaaaat 2340 aaggaatcct tttaaagcat gttgagaaag tattttttgg tatgaatggg tgacgggcct 2400 tttaatcttt caggaataca tataagcagg aatacttagc ctgtattggg aaggtgcgtg 2460 aaactcaaag ttgctaacat catcttcctt attttcagcc agtgctgtta ctgcatttag 2520 catggctctg acgaggcagt ggagagttcc tgacagcata gcatactgcc ttctgacaga 2580 ctgggttaag ctaccaaaaa tgacaaccag ggattcaaaa aaaatttttg gtcattaaat 2640 cgaatgtata ttattacttt ttaattttct aagtatttat cacaggactt taacaccata 2700 tatttccctc ccagtttttc tccccttttg gtttaatagt taaaacattt ttcataatta 2760 gtgctgtaca tttgattgca aacaaattgg tgatacttct aaactataac tataaatctc 2820 tagaattctg tgaatttcaa cattatttga agtagttctt cagttatatt tacatgtgtt 2880 gtaaatatgt 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ttgattacag ataaacttat ggaacttcca 2340 gctgtaaatc tagaattctt gagcttcata gctcttcagt tgtgcttaca aatgttgtga 2400 atatgtatat atattagttc ttttcctaag tataagcact ccatgttaga agtgactttg 2460 aattattgat aaaatttcgc atttgatttt atataacaag ttattaaata tatttttgtg 2520 gaaa 2524 <210> 9 <211> 2047 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for rat WW45 protein <400> 9 gtgagcggcg gcgggcgcgc ttagcgccgc caacatgcgg cggagcctgc gggcgggcgc 60 gggcggcgga gacccgaggc gaaggcggcg ccggcccggg aggcggcggc gggcggcggg 120 ctcgcggccc tagcgaggct gctggggcag cggcgggcga cgtccgcgag gatgctgtcc 180 cgcaagaaaa ccaaaaacga ggtgtctaag ccggccgagg ttcagggcaa gtacgtgaag 240 aaggagacgt cgcccctgct gcggaatctc atgccttcat tcattcggca cggtccaaca 300 attccaagac ggactgacct ctgtcttcca gagtcaagcg ctagtgcttt ctcagcttct 360 ggagatggcg tagtttcaag aaaccagagt ttcctgagaa ctccagttca aaggacgcct 420 catgaagtaa tgagaagaga aagcaacaga ctgtccgcac cgtcttctta ccttgtcagg 480 agcctagcgg atgtccctcg ggaatacggc tcatcacagt catttttaac agaagttaat 540 tttgctgttg aaaatggaga ctctggttcc cgatattttt attcagataa cttttttgat 600 ggtcagagaa ggaggccact tggagatcgt gcacaagaag actatagata ttatgaatac 660 aaccatgatc tcttccaaag aatgccacag aatcagggga ggcacacatc aggtattggg 720 agagtcactg ctacatcttt aggaaattta actaaccatg gatctgaaga tttacccctt 780 cctcctggct ggtctgtgga ctggacaatg agagggagaa aatactacat agatcataac 840 acaaacacaa ctcattggag tcatcctctt gaacgagaag gacttcctcc tgggtgggag 900 cgagtggaat catcagaatt tggaacctat tatgtggatc acacaaataa aagggctcag 960 tacaggcacc cctgtgctcc cagtgtgcct cggtatgatc agcctccacc catcacgtat 1020 cagccacagc aaactgaaag aaatcagtct ctcctggtcc ctgcaaaccc ctaccatact 1080 gcagaaattc ctgactggct tcaggtttat gcccgagccc ctgtgaaata cgaccacatt 1140 ctgaagtggg agctcttcca gctggctgac ctggacacgt accagggaat gctgaagctg 1200 ctcttcatga aggagctgga gcagattgtc aagttgtatg aggcctacag acaggctctt 1260 gtcaccgagc tggaaaaccg caagcagagg cagcagtggt atgcccagca ccatggcaag 1320 aagtttttaa gttaactttc cacaagccag gttttgtaag agctttaaaa tattttcaga 1380 taaatgactg caaacaagtt ctttggttaa taaaggcaac ttactatttg gaattacaaa 1440 attctagttt tacatatatt atcaactttt tcttttattg aaccaagaaa gttttatcac 1500 ttaaaaagcc aatatggcat atactaccaa atgctgttag gaaactgctt tggagactgt 1560 ggatggaaag gagtacagga agagactgtc ataaatggca ttaaacagga gtggacacac 1620 ccttcttgtt ccgaaaagga agcggacgag agcacactgt gaacagcggc tccttgtggt 1680 gtcaggtgtt ttctggaatg agatggtgtg accattgcca tgggtatagt tcagaataaa 1740 aacagggcat ggagccttta tggggacaaa cgtgtatatg gtgtgtgtgg tcatctactc 1800 ccacctcctc cctatgtgag ggacaccttt gaaggaggga gataaagcct ttcaggaata 1860 gagtcaggaa tacgggaata taataaatac gggcctcagt tggtgcgaaa ctgttgctaa 1920 tactgcttcc ttccttcctt tgagccagag cacatgagta cagtcagcaa ggctctggtg 1980 agacacagca cgggcttcct gaccacaggg aatactgtct tccatcaggc tgggctacgt 2040 gccaaaa 2047 <210> 10 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARAH domain of human WW46 <400> 10 Ile Leu Lys Trp Glu Leu Phe Gln Leu Ala Asp Leu Asp Thr Tyr Gln 1 5 10 15 Gly Met Leu Lys Leu Leu Phe Met Lys Glu Leu Glu Gln Ile Val Lys 20 25 30 Met Tyr Glu Ala Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Thr Glu Leu Glu Asn Arg 35 40 45 <210> 11 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARAH domain of mouse WW45 protein <400> 11 Ile Leu Lys Trp Glu Leu Phe Gln Leu Ala Asp Leu Asp Thr Tyr Gln 1 5 10 15 Gly Met Leu Lys Leu Leu Phe Met Lys Glu Leu Glu Gln Ile Val Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Ala Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Thr Glu Leu Glu Asn Arg 35 40 45 <210> 12 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARAH domain of rat WW45 protein <400> 12 Ile Leu Lys Trp Glu Leu Phe Gln Leu Ala Asp Leu Asp Thr Tyr Gln 1 5 10 15 Gly Met Leu Lys Leu Leu Phe Met Lys Glu Leu Glu Gln Ile Val Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Ala Tyr Arg Gln Ala Leu Val Thr Glu Leu Glu Asn Arg 35 40 45 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WW45-L primer <400> 13 tgaccatgtg tccagcctta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WW$5-R primer <400> 14 cgaatggatg ctgcatattg 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGK-3 primer <400> 15 gcacgagact agtgagacgt gctac 25 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigen: 14 amino acids at C-terminus of mouse WW45 protein <400> 16 Arg Lys Gln Arg Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln His Gly Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-l probe <400> 17 cctagaccct ttcaacaagc a 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-r probe <400> 18 tgctatcact catcgggatt 20

Claims (19)

1. WW45 단백질, WW45 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 세포질에 존재하는 인산화된 YAP (Yes-associated protein) 및 상기 YAP의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 포유류의 분화 조절제.
2. 제1항에 있어서, 상기 WW45 단백질은 인간 WW45 단백질(SEQ ID NO: 1), 마우스 WW45 단백질(SEQ ID NO: 2), 및 래트 WW45 단백질(SEQ ID NO: 3)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인 분화 조절제.
3. 제1항에 있어서, 상기 YAP은 인간 YAP (SEQ ID NO: 4), 마우스 YAP (SEQ ID NO: 5), 및 래트 YAP (SEQ ID NO: 6)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고, 127번째 아미노산인 세린이 인산화된 것인 분화 조절제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 조절제는 상피전구세포로부터 상피세포로의 분화를 조절하는 것인 분화 조절제.
5. 인간을 제외한 포유류로서 WW45 단백질 코딩 유전자 전부가 결실되거나, SARAH 도메인이 결실되어 종양이 유발된 형질전환 동물.
6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 동물은 마우스, 래트, 기니피그, 및 햄스터로 이루어진 군에서 선택된 설치류인 형질전환 동물.
7. 제5항에 있어서, 상기 WW45 단백질 코딩 유전자는 인간 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 7), 마우스 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 8), 및 래트 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 9)로 이루어진 군에서 선택된 것인 형질전환 동물.
8. 제5항에 있어서, 상기 SARAH 도메인은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군에서 선택된 것인 형질전환 동물.
9. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 동물은 기탁번호 KCTC11343BP인 것인 형질전환 동물.
10. 1) WW45 단백질 코딩 유전자 전부 또는 상기 유전자 내 SARAH 도메인이 결실된 재조합 유전자, 또는 상기 재조합 유전자 및 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;

    2) 상기 제작된 재조합 유전자 또는 재조합 발현 벡터를 이용하여 인간을 제외한 포유류의 수정란 또는 배아를 형질전환시키는 단계; 및

    3) 상기 형질전환된 수정란 또는 배아를 키워서 형질전환 동물 또는 상기 동 물의 조직 또는 기관을 수득하는 단계

    를 포함하는 형질전환 동물의 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유류는 마우스, 래트, 기니피그, 및 햄스터로 이루어진 군에서 선택된 설치류인 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 WW45 단백질 코딩 유전자는 인간 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 7), 마우스 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 8), 및 래트 WW45 단백질 코딩 유전자 (SEQ ID NO: 9)로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 SARAH 도메인은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
14. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 동물 또는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따라 제조된 형질전환 동물 또는 상기 형질전환 동물로부터 분리된 종양 세포를 준비하는 단계;

    상기 동물 또는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계, 및

    상기 후보 물질 처리된 동물 또는 세포의 종양 정도를 측정하는 단계

    를 포함하는 항종양제 스크리닝 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 종양 정도 측정 단계는 종양 세포의 수, 종양의 부피, 또는 세포 사멸 여부를 측정하여 수행되는 것인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 항종양제는 간암, 폐암, 혈액 종양, 피부암, 위암, 대장암, 소장암, 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 종양에 대한 것인 방법.
17. 포유류 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;

    세포 내 WW45 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및

    WW45 단백질 발현 수준을 측정하는 단계

    를 포함하는 분화 조절제의 스크리닝 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 WW45 단백질의 발현 수준이 후보 물질 처리 전과 비교하여 처리 후에 증가하고, 상기 후보 물질을 분화 촉진제로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 WW45 단백질의 발현 수준이 후보 물질 처리 전과 비교하여 처리 후에 감소하고, 상기 후보 물질을 분화 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.

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