KR102152348B1 - 세포 운명 조절용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 운명 조절 인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물 및 이를 다양한 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법에 대한 것으로서, 세포 운명 조절 인자를 안정적인 타겟 수용체에의 전달하고, 전달 대상 세포에의 독성을 감소시키며, 서방적이고 99중량% 이상의 방출을 통해 효과적으로 대상세포의 운명을 조절할 수 있다.

Description

세포 운명 조절용 조성물 {Composition for modulating cell fate}
본 발명은 세포 운명 조절용 조성물 및 세포 운명 조절방법에 관한 것이다.
레티노산(Retinoic acid, RA) 매개 신경 분화 방법은 마우스 배아 줄기세포(mES)에 작은 분자가 결합하며 이루어지는 것으로 잘 알려진 세포 전환 방법 중 하나이다. RA가 세포질에 투여될 때, RA는 핵막에 위치한 RA 수용체(RAR) 헤테로다이머에 결합하고, 그 복합체는 신경 발생 및 축삭 성장을 유도하는 신호 전달 경로를 활성화시킨다. mES 세포로부터 신경 분화를 발생하기 위해 몇 가지 전략이 도입되었는데, 가장 일반적인 방법 중 하나는 -4/+4 RA 방법으로서, 4일 동안의 세포들을 분화 단계로 활성화시키기 위한 배아체(EB) 형성 후 4일 동안의 RA 처리를 통한 신경 유도를 포함한다. 광범위한 적용은 상기 방법에 대한 다양한 수정을 통해 이루어졌으나, 제한된 EB 체적, 실행 불가능한 배지 교환 및 복잡한 과정과 같은 EB의 형성을 유도하기 위한 hanging drop 배양 공정의 관점에서 몇가지 단점이 존재한다. 다른 RA 기반 방법은 또한 mES 세포의 단층 배양물에 RA의 지속적 첨가로서 성공적으로 부착성 mES 세포 콜로니와 신경 분화를 유도했으나, RA의 지속적 첨가는 비활성화 된 mES 세포의 신경 유도를 위해 RAR과 상호작용하는 RA의 충분한 양을 지속적으로 공급해야한다는 점과 같은 몇 가지 한계점이 여전히 존재한다.
RA가 신경 분화를 위한 핵심 요소 중 하나로서 작용하지만, 수용액 내 용해도가 낮고, 세포 대사에 의한 급속한 분해와 같은 몇 가지 단점을 극복해야 한다. 또한, 원하는 세포 전환을 위해 RA 농도를 미세하게 조절해야 한다. 뉴런에서부터 심근 세포 분화에 이르기까지 RA에 의해 매개되는 유도된 세포의 운명은 RA의 농도에 크게 의존한다는 보고가 있다. 또한, RA는 확산을 통해 세포막에 통합되기 때문에, RA-RAR 상호작용과 관련된 확률론적인 동력학은 농도 의존적이다. 그러나, 신경 분화 과정에서 약물 농도(>10μm)보다 높은 RA을 첨가하면 세포 생존률이 현저히 떨어질 수 있으므로, 처리하는 RA의 양을 무한히 증가시킬 수 없다. 따라서, 성공적인 신경 분화를 위해서는 RA의 손실을 최소화하면서, 세포 내 전달을 향상시키며, 유도 과정의 필요를 충족시키기 위해 지속적이고 충분한 보조제를 통해 매개해야 한다.
한국등록특허 1057116호
본 발명은 세포 운명 조절인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물을 제공함으로써, 우수한 효율로서 조절인자를 담지하고, 담지된 조절인자를 서방적으로 방출하며, 입자의 생분해성 특성에 의해 담지된 조절인자를 99중량% 이상 방출하여 대상 세포의 운명을 효과적으로 조절할 수 있도록 하는 것에 그 목적이 있다.
1. 표면 또는 기공 내부에 세포 운명 조절 인자를 담지하고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 다공성 실리카 입자를 포함하고,
상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 세포 운명 조절용 조성물:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
2. 위 1에 있어서, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부에 실록산기를 갖는 것인 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, FGFs, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 코딩하는 유전자인 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-β Inhibitor, FSK, DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조성물.
8. 위 1에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조성물.
9. 위 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조성물.
10. 위 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조성물.
11. 위 1 또는 2의 조성물을 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 배양 배지에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법.
12. 위 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin, FGFs, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 코딩하는 유전자인 조절방법.
13. 위 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-β Inhibitor, FSK, DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조절방법.
14. 위 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조절방법.
15. 위 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조절방법.
16. 위 11에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조절방법.
17. 위 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조절방법.
18. 위 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조절방법.
본 발명의 조성물은 세포 운명 조절인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하여, 우수한 효율로서 조절인자를 담지하고, 담지된 조절인자를 서방적으로 방출하며, 입자의 생분해성 특성에 의해 담지된 조절인자를 99% 이상 방출하여 대상 세포의 운명을 효과적으로 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 2nm의 직경, 19nm의 직경을 갖는 일반 다공성 실리카 입자(DDV)와, 화학 작용기가 개질된 다공성 실리카 입자(mDDV)의 현미경 사진이다.
DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 7은 RA의 농도에 따른 UV 흡광도 스펙트럼(a)과 이의 peak 값에 대한 standard curve(b)를 나타낸 것이다.
도 8은 기공 평균 직경 및 아미노기로의 화학적 개질여부에 따른 RA의 담지량을 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 생분해성을 확인할 수 있는 현미경 사진이다.
도 10은 일 예시에 따른 원통형 투과막을 구비한 튜브이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 입경별 흡광도 감소 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 기공 직경별 흡광도 감소 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 환경의 pH별 흡광도 감소 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 16은 다공성 실리카 입자의 세포독성을 HepG2 세포를 대상으로 테스트한 결과이다.
도 17은 다공성 실리카 입자의 세포독성을 mES 세포를 대상으로 테스트한 결과이다.
도 18은 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달성을 확인한 것이다.
도 19는 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달성을 fluorescence correlation analysis를 통해 확인한 것이다.
도 20은 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달성을 TEM 이미지로 확인한 것이다.
도 21은 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달이 endocytosis에 의해 endosome을 형성하며 세포 내 전달되고, 이 후 endosome을 탈출하여 핵 주변에서 입자 내부에 담지된 세포 운명 조절 인자를 방출함을 확인한 것이다.
도 22는 다공성 실리카 입자의 인간 섬유아세포, HepG2 세포, HeLa 세포에의 전달성을 확인한 결과이다.
도 23은 다공성 실리카 입자의 림프구, 골수세포에의 전달성을 확인한 결과이다.
도 24는 다공성 실리카 입자의 인간 배아 줄기 세포, 신경 전구 세포에의 전달성을 확인한 결과이다.
도 25는 in vivo 상에서 Rat의 spinal cord에 주사기로 직접 FITC로 형광표지된 다공성 실리카 입자를 전달한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 incubation 시간에 따른 각 다공성 실리카 입자의 담지된 RA 방출량을 나타낸 것이다.
도 27은 incubation 시간에 따른 각 다공성 실리카 입자의 담지된 RA 방출량을 중량%화 하여 나타낸 것이다.
도 28은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, 아무것도 처리하지 않은 군, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 신경 분화 정도를 나타낸 것이다.
도 29는 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, 아무것도 처리하지 않은 군, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 OCT4, Tuj1 마커 유전자의 mRNA 발현량을 확인한 것이다.
도 30은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 OCT4, Tuj1 마커 유전자의 상대적 발현량을 확인한 것이다.
도 31은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군에 대한 면역 세포 화학 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 총 세포 대비 Tuj-1 양성 세포들의 수를 %로 나타낸 것이다.
도 33은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 축삭의 길이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명 조성물을 이용하여 배아줄기세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명 조성물을 이용하여 배아줄기세포를 심근 세포로 분화시키는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명 조성물을 이용하여 섬유아세포 또는 혈구세포를 유도만능줄기세포로 역분화하는 과정에서 사용되는 pDNA design을 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명 조성물을 이용하여 섬유아세포 또는 혈구세포를 유도만능줄기세포로 역분화하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명 조성물을 이용한 세포 운명 조절 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면 또는 기공 내부에 세포 운명 조절 인자를 담지하고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 다공성 실리카 입자를 포함하고, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 세포 운명 조절용 조성물을 제공한다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며, At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
본 발명의 조성물에 있어서, 세포 운명 조절 인자란 다공성 실리카 입자에 담지되어 세포에 전달되어 미분화 상태의 세포를 분화 상태로 유도하거나, 분화 단계를 조절하거나, 분화 상태의 세포를 미분화 상태의 세포로 역분화를 유도하거나, 특정 분화 세포를 다른 특정 분화 세포로의 직접 분화 유도 등의 활성을 나타낼 수 있는 물질을 포함한다.
상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK(Forskolin), IDE1, IDE2, DAPT, CYC(cyclopamine-KAAD), PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021 및 valproic acid로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 저분자 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
상기 세포 운명 조절 인자는 또한 Dkk1(Dickkopf Like Acrosomal Protein 1), Lefty A(left-right determination factors), activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, FGF9 및 interleukin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 생체분자일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
상기 세포 운명 조절 인자는 또한 상술한 생체분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 plasmid DNA 또는 linear DNA와 이들의 전사물인 mRNA, miRNA (miR-124, miR-9, miR9*, miR-302, miR-367, miR-21, etc.), siRNA 및 이들의 변형산물로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 다공성 실리카 입자란 수 나노에서 수 마이크로 크기의 세공(finepore)를 가지는　실리카　나노구조체로서, 기공배열의 규칙성이 잘　정의되어 있으며 사용환경에 맞도록 물질 특성(기공크기, 비표면적, 표면특성)을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는(MSN 또는 DDV) 실록산기(Si-O-Si)를 갖는 것일 수 있고, 이는 실리카 입자 표면 또는 기공 내부의 실라놀기(Si-OH) 간 탈수반응으로 인해 형성된 것일 수 있다. 이러한 경우, 실라놀기만을 갖는 입자에 비해 실록산기를 갖는 입자는 입자의 구조적 수축으로 입자 자체의 구조적 치밀함을 얻을 수 있고, 입자 자체의 분해 속도를 느리게 할 수 있으며, 담지된 세포 운명 조절 인자의 서방적이고 지속적인 방출 효과를 달성할 수 있다. 상기 실록산기는 후술하는 하소 과정에 의해 형성된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 표면 및/또는 기공 내부가 개질된 것일 수 있고, 이는 상기 개질은 실리카 입자가 갖는 실라놀기(Si-OH)의 -OH 작용기를 타 작용기로 치환하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 상기 개질되는 작용기의 종류 및 개질되는 정도에 따라 담지에 적합한 전술한 세포 운명 조절 인자의 종류가 달라질 수 있고, 세포 운명 조절 인자의 방출 환경에 대한 다공성 실리카 입자의 상호 작용이 조절되어 입자 자체의 분해 속도가 조절되어 세포 운명 조절 인자의 방출 속도가 조절될 수 있고, 세포 운명 조절 인자의 다공성 실리카 입자에 대한 결합력이 조절되어 입자로부터의 확산에 의한 인자의 방출이 조절될 수 있다.
상기 개질의 방법에 있어 화학적 또는 생물학적 개질방법을 택할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고 당업계의 주지된 방법에 의해 수행될 수 있으나, 실리카 입자와의 공유결합을 통한 작용기의 치환을 고려할 때 바람직하게는 화학적 개질방법을 택할 수 있다. 또한, 상기 입자의 표면과 기공의 내부는 동일하게 개질될 수 있고, 서로 다르게 개질될 수도 있다.
상기 개질은 도입하고자 하는 친수성, 소수성, 양이온성, 음이온성 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 세포 운명 조절 인자의 담지, 세포 운명 조절 인자의 표적 세포로의 이동, 그 외 기타 목적을 위한 물질의 담지 또는 그 외 추가 치환기의 결합 등을 위한 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있으며, 상기 치환기는 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 압타머 등을 더 포함하는 형태일 수 있다.
상기 화합물은 예를 들면 C1 내지 C10 알콕시기를 갖는 알콕시실란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알콕시실란은 상기 알콕시기를 1개 이상 갖는 것으로서, 예를 들면 1 내지 3개 가질 수 있고, 알콕시기가 결합되지 않은 부위에 도입하고자 하는 치환기가 있거나 이로 치환된 치환기가 있을 수 있다.
상기 알콕시실란을 다공성 실리카 입자와 반응시키면 실리콘 원자와 산소 원자간 공유 결합이 형성되어 알콕시실란이 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부와 결합될 수 있고, 상기 알콕시실란은 도입하고자 하는 치환기를 가지고 있는 바, 해당 치환기가 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부에 도입될 수 있다.
상기 반응은 용매에 분산시킨 다공성 실리카 입자를 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있으며, 상기 용매는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 톨루엔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 가열 하에 수행될 수 있고, 상기 가열은 예를 들면 80℃ 내지 180℃, 예를 들어 상기 범위 내에서 80℃ 내지 160℃, 80℃ 내지 150℃, 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 150℃, 110℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 4시간 내지 20시간, 예를 들어 상기 범위 내에서 4시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 16시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 14시간 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 양이온성 치환기로의 개질은 입자를 양전하로 대전시키거나 음전하성 세포 운명 조절 인자 담지를 위한 것일 수 있고, 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 음이온성 치환기로의 개질은 입자를 음전하고 대전시키거나 양전하성 세포 운명 조절 인자 담지를 위한 것일 수 있고, 예를 들면 카르복시기, 술폰산기, 티올기 등의 산성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 친수성 치환기로의 개질은 본 발명 조성물의 사용 및 제형화의 용이성 등의 측면의 유리함을 갖는데, 예를 들면 카르복시기, 아미노기, 카르보닐기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 티올기, 암모늄기, 에스터기, 이미드기, 티오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 폴리에틸렌글리콜기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 소수성 치환기로의 개질은 난용성(소수성) 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증진되는 장점을 갖는데, 예를 들면 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C30의 헤테로아릴기, 할로겐기, C1 내지 C30의 에스테르기, 할로겐 함유기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, Trimethoxy(octadecyl)silane, Trimethoxy-n-octylsilane, Trimethoxy(propyl)silane, Isobutyl(trimethoxy)silane, Trimethoxy(7-octen-1-yl)silane, Trimethoxy(3,3,3-trifluoropropyl)silane, Trimethoxy(2-phenylethyl)silane, Vinyltrimethoxysilane, Cyanomethyl, 3-(trimethoxysilyl)propyl] trithiocarbonate, (3-Bromopropyl)trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질은 복합적으로 수행될 수도 있는데, 예를 들어, 외부 표면 또는 기공 내부에 2회 이상의 표면 개질이 수행될 수도 있다. 보다 구체적인 예로써, 아미노기가 도입된 실리카 입자에 카르복실기를 포함하는 화합물을 아미드 결합으로 결합시켜 양전하로 대전된 입자를 다른 표면특성을 가지게 변화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어서, 반응 온도, 시간, 그리고 개질에 사용되는 화합물의 양 등은 개질하고자 하는 정도에 따라 선택될 수 있는 것으로서, 세포 운명 조절 인자의 친수성, 소수성, 전하 정도에 따라 반응 조건을 달리하여 다공성 실리카 입자의 친수성, 소수성, 전하 정도를 조절함으로써, 세포 운명 조절 인자의 방출 속도를 조절할 수 있다. 예를 들면, 세포 운명 조절 인자가 중성의 pH에서 강한 음전하를 띠는 경우에는 다공성 실리카 입자가 강한 양전하를 띠도록 하기 위해, 반응 온도를 높이거나 반응 시간을 길게 할 수 있으며, 화합물 처리량을 늘릴 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 생분해성 입자로서, 세포 운명 조절 인자를 담지하여 체내에 투여되었을 때 체내에서 생분해되면서 세포 운명 조절 인자를 방출할 수 있어, 상기 입자는 체내에서 서서히 분해되어 담지된 세포 운명 조절 인자가 서방성을 갖도록 할 수 있다. 예를 들면, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며, 상기 현탁액의 pH는 7.4이고, At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
상기 수학식 1은 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 상기 흡광도 A0, At는 예를 들면 원통형 투과막에 다공성 실리카 입자 및 현탁액을 넣고, 투과막 외부에도 동일한 현탁액을 넣고 측정된 것일 수 있다.
상기 현탁액은 완충용액일 수 있고, 구체적인 예를 들면, PBS(phosphate buffered saline) 및 SBF(simulated body fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PBS일 수 있다.
상기 입자는 생분해성으로서, 현탁액 내에서 서서히 분해될 수 있고, 직경 50kDa는 약 5nm에 해당하는 것으로서 생분해된 입자는 직경 50kDa의 투과막을 통과할 수 있고, 원통형 투과막은 60rpm 수평 교반 하에 있으므로 현탁액이 고루 섞일 수 있으며 분해된 입자는 투과막 외부로 나올 수 있다.
상기 수학식 1에서의 흡광도는 예를 들어 투과막 외부의 현탁액이 새로운 현탁액으로 교체되는 환경 하에 측정된 것일 수 있다. 현탁액은 지속적으로 교체되는 것일 수 있고, 일정 기간마다 교체되는 것일 수 있으며, 상기 일정 기간은 정기 또는 비정기적인 기간일 수 있다. 예를 들어 1시간 내지 1주일의 범위 내에서, 1시간 간격, 2시간 간격, 3시간 간격, 6시간 간격, 12시간 간격, 24시간 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 7일 간격 등으로 교체될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다
상기 흡광도의 비가 1/2가 된다는 것은 t시간 후에 흡광도가 초기 흡광도의 절반이 된다는 것인 바, 이는 다공성 실리카 입자의 대략 절반이 분해되었다는 의미이다.
상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상, 또는 24 이상으로, 예를 들면 t는 20 내지 120일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 20 내지 96, 20 내지 72, 30 내지 70, 40 내지 70, 50 내지 65 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/5가 되는 t가 예를 들면 70 내지 140일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 110, 70 내지 140, 70 내지 120, 70 내지 110 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/20가 되는 t가 예를 들면 130 내지 220일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 130 내지 200, 140 내지 200, 140 내지 180, 150 내지 180 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 측정되는 흡광도가 0.01 이하가 되는 t가 예를 들면 250 이상, 예를 들어, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상 등일 수 있으며, 그 상한은 2000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비와 t는 높은 양의 상관 관계를 갖는 것으로서, 예를 들면 피어슨 상관 계수가 0.8 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.9 이상, 0.95 이상일 수 있다.
상기 수학식 1의 t는 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있다.
보다 구체적으로, 입자의 표면적을 증가시켜 t를 감소시키거나, 표면적을 감소시켜 t를 증가시킬 수 있다. 표면적은 입자의 직경, 기공의 직경을 조절함으로써 조절될 수 있다. 또한, 표면 및/또는 기공 내부에 치환기를 위치시켜 다공성 실리카 입자가 환경(용매 등)에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 다공성 실리카 입자에 세포 운명 조절 인자를 담지시키고 세포 운명 조절 인자와 다공성 실리카 입자 간의 친화도를 증가시켜, 다공성 실리카 실리카 입자가 환경에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 입자의 제조시에 표면을 보다 치밀하게 제조하여 t를 증가시킬 수도 있다. 상기에는 수학식 1의 t를 조절할 수 있는 다양한 예시를 서술하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 실리카(SiO2) 소재의 입자이며, 수 나노미터에서 수 마이크로미터 사이즈의 직경을 갖는다.
상기 입자의 평균 직경은 예를 들면 100nm 내지 1000nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 100nm 내지 800nm, 100nm 내지 500nm, 100nm 내지 400nm, 100nm 내지 300nm, 100nm 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 다공성의 입자로서, 나노사이즈의 기공을 가져 기공 내부 또는 입자 표면에 전술한 세포 운명 조절 인자를 담지할 수 있다.
상기 입자의 평균 기공 직경은 예를 들면 1nm 내지 100nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 5nm 내지 100nm, 7nm 내지 100nm, 7nm 내지 50nm, 10nm 내지 50nm, 10nm 내지 30nm, 7nm 내지 30nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 담지하고자 하는 세포 운명 조절 인자의 양과 크기를 고려하여 바람직하게 선택될 수 있고, 조절될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자의 형태는 특정 형태로 특별히 제한되는 것은 아니나, 조절 대상 세포들과의 상호작용의 원활성 등의 측면을 고려할 때, 구형임이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 BET 표면적이 예를 들면 200m2/g 내지 700m2/g일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 200m2/g 내지 700m2/g, 200m2/g 내지 650m2/g, 250m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 700m2/g, 300m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 600m2/g, 300m2/g 내지 550m2/g, 300m2/g 내지 500m2/g, 300m2/g 내지 450m2/g 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 g당 부피가 예를 들면 0.7ml 내지 2.2ml일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 0.7ml 내지 2.0ml, 0.8ml 내지 2.2ml, 0,8 ml 내지 2.0ml, 0.9 ml 내지 2.0ml, 1.0 ml 내지 2.0ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. g당 부피가 과도하게 작아지면 분해 속도가 너무 빨라질 수 있고, 과도하게 큰 입자는 제조가 어렵거나, 온전한 형상을 가질 수 없을 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 표면전하를 갖는 것으로서, 즉, 제타 포텐셜이 0mV가 아닌 입자이다. 이는 동일한 방법으로 개질된 입자 간 전자적 반발력으로 인해 입자가 응집하는 현상을 억제하고, 표적 세포에 효과적으로 담지한 세포 운명 조절 인자를 전달할 수 있게 한다.
상기 입자의 표면전하의 값, 즉, 제타 포텐셜의 값은, 예를 들어, 양전하로 대전된 경우, +1 내지 +150 mV 또는 +2 내지 130 mV 일 수 있고, +3 내지 +100 mV 일 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 음전하로 대전된 경우, -150 내지 -1 mV 또는 -130 내지 -10 mV 일 수 있고, -100 내지 -18 mV 일 수 있으나 이에 제한되지 아니하며, 제타 포텐셜의 값은 상기 입자에 담지하고자 하는 세포 운명 조절 인자의 종류와 양 또는 방출 속도의 제어 등의 측면을 고려하여 목적에 맞게 조절할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 표면 및/또는 기공 내부에 전술한 세포 운명 조절 인자를 담지할 수 있다.
상기 입자에의 세포 운명 조절 인자의 담지는 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자를 혼합하여 수행될 수 있고, 상기 용매로는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 PBS(phosphate buffered saline solution), SBF(Simulated Body Fluid), Borate-buffered saline, Tris-buffered saline 등을 사용할 수도 있다.
상기 다공성 실리카 입자와 상기 세포 운명 조절 인자의 비율은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 중량비가 1: 0.05 내지 0.8, 예를 들어 상기 범위 내에서 1: 0.05 내지 0.7, 1:0.05 내지 0.6, 1: 0.1 내지 0.8, 1: 0.1 내지 0.6, 1: 0.2 내지 0.8, 1: 0.2 내지 0.6 등일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자를 긴 시간에 걸쳐 점진적으로 방출할 수 있다.
상기 입자에 담지된 세포 운명 조절 인자는 입자가 생분해되면서 방출될 수 있는데, 상기 입자는 서서히 분해되어 담지된 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출되도록 할 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 입자에 담지된 세포 운명 조절 인자는 다공성 실리카 입자로부터 이탈되어 확산되면서도 방출될 수 있고, 이는 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자, 세포 운명 조절 인자의 방출 환경과의 관계에 영향을 받는 것인 바, 이를 조절하여 세포 운명 조절 인자의 방출을 조절할 수 있다. 예를 들면 표면개질에 의해 다공성 실리카 입자의 세포 운명 조절 인자와의 결합력을 강화 또는 약화시킴으로써 조절할 수 있다.
보다 구체적인 예를 들자면, 상기 담지된 세포 운명 조절 인자가 난용성(소수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 소수성 치환기를 가져 상기 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 상기 입자가 소수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "난용성"은 (물에 대해) 불용성(insoluble), 실질적으로 불용성(practically insoluble) 또는 극히 약간의 가용성(only slightly soluble)인 것을 포함하는 의미로서 이는 "Pharmaceutical Science" 18th Edition(U.S.P., Remington, Mack Publishing Company 발행)에 정의되어 있는 용어이다.
상기 난용성 세포 운명 조절 인자는 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 미만, 구체적으로 5g/L 미만, 보다 구체적으로 1g/L 미만일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 담지된 세포 운명 조절 인자가 수용성(친수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 친수성 치환기를 가져 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 친수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 수용성 세포 운명 조절 인자는 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 담지된 세포 운명 조절 인자가 전하를 띠는 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 그와 반대 전하로 대전되어 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 산성기 또는 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
구체적으로, 세포 운명 조절 인자가 중성의 pH에서 양전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 중성의 pH에서 음전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가되어 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 카르복시기(-COOH), 술폰산기(-SO3H) 등의 산성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
또한, 세포 운명 조절 인자가 중성의 pH에서 음전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 양전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가되어 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 아미노기, 그 외 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 담지된 세포 운명 조절 인자는 방출 환경, 사용되는 다공성 실리카 입자에 의존하여 예를 들면 7일 내지 1년 또는 그 이상의 기간 동안 방출될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 생분해성으로서 100% 분해될 수 있으므로, 이에 담지된 세포 운명 조절 인자는 100% 방출될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면, 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정을 거쳐 제조된 것일 수 있고, 필요에 따라 하소(calcination) 공정, 표면 개질 공정 등을 더 거쳐 제조된 것일 수 있다. 하소 및 표면 개질 공정을 모두 거친 경우는 하소 이후에 표면 개질 된 것일 수 있다.
상기 소기공의 입자는 예를 들면 평균 기공 직경이 1nm 내지 5nm인 입자일 수 있고, 이는 용매에 계면활성제와 실리카 전구물질을 넣고 교반 및 균질화시켜 얻어질 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 메탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매로서 물과 유기 용매의 혼합 용매 사용시 그 비율은 예를 들면 물과 유기용매를 1: 0.7 내지 1.5의 부피비, 예를 들어, 1: 0.8 내지 1.3의 부피비로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 예를 들면 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), TMACl(tetramethylammonium chloride) 등일 수 있고, 구체적으로는 CTAB를 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 예를 들면 용매 1리터당 1g 내지 10g, 예를 들어 상기 범위 내에서 1g 내지 8g, 2g 내지 8g, 3g 내지 8g 등의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질은 용매에 계면활성제를 첨가하여 교반한 후에 첨가될 수 있다. 실리카 전구물질은 예를 들면 TMOS(Tetramethyl orthosilicate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반은 예를 들면 10분 내지 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구물질은 예를 들면 용매 1리터당 0.5ml 내지 5ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 4ml, 0.5ml 내지 3ml, 0.5ml 내지 2ml, 1ml 내지 2ml 등으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 필요에 따라 촉매로서 수산화나트륨을 더 사용할 수 있으며, 이는 용매에 계면활성제를 첨가한 후 실리카 전구물질의 첨가 전에 교반하면서 첨가될 수 있다.
상기 수산화나트륨은 예를 들면 1M 수산화나트륨 수용액 기준으로 용매 1리터당 0.5ml 내지 8ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 5ml, 0.5ml 내지 4ml, 1ml 내지 4ml, 1ml 내지 3ml 2ml 내지 3ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질의 첨가 후에 용액을 교반하며 반응시킬 수 있다. 교반은 예를 들면 2시간 내지 15시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 13시간, 5시간 내지 12시간, 6 시간 내지 12시간, 6시간 내지 10시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 시간(반응 시간)이 너무 짧은 경우에는 결정핵 생성(nucleation)이 부족할 수 있다.
상기 교반 이후에는 용액을 숙성(aging)시킬 수 있다. 숙성은 예를 들면 8시간 내지 24시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 8시간 내지 20시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 16시간, 10시간 내지 14시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 반응산물을 세척 및 건조시켜 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있으며, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후 상기 얻어진 다공성 실리카 입자의 기공을 확장하고, 이는 기공 팽창제를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 트리헥실벤젠, 톨루엔, 벤젠 등을 사용할 수 있고, 구체적으로, 트리메틸벤젠을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 기공 팽창제는 예를 들면 N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine,DMHA)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자를 기공 팽창제와 혼합하고, 가열하여 반응시켜 수행될 수 있는데, 상기 용매는 예를 들면 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면 용매 1리터당 10g 내지 200g, 예를 들어 상기 범위 내에서 10g 내지 150g, 10g 내지 100g, 30g 내지 100g, 40g 내지 100g, 50g 내지 100g, 50g 내지 80g, 60g 내지 80g 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 용매 중에 고르게 분산되어 있는 것일 수 있고, 예를 들면 용매에 다공성 실리카 입자를 첨가하고 초음파 분산시킨 것일 수 있다. 혼합용매를 사용하는 경우에는 제1 용매에 다공성 실리카 입자를 분산시킨 후에 제2 용매를 첨가한 것일 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 용매 100부피부에 대하여 10 내지 200부피부, 상기 범위 내에서, 10 내지 150부피부, 10 내지 100부피부, 10 내지 80부피부, 30 내지 80부피부, 30 내지 70부피부 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 120℃ 내지 180℃로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 120℃ 내지 170℃, 120℃ 내지 160℃, 120℃ 내지 150℃, 130℃ 내지 180℃, 130℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 160℃, 130℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 24시간 내지 96시간 수행 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 80시간, 30시간 내지 72시간, 24시간 내지 80시간, 24시간 내지 72시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 80시간, 36시간 내지 72시간, 36시간 내지 66시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 88시간, 48시간 내지 80시간, 48시간 내지 72시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 예시한 범위 내에서 시간 및 온도를 조절하여 반응이 과다하지 않으면서 충분히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 늘리거나, 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 짧게하는 등에 의할 수 있다. 반응이 충분하지 않으면 기공의 확장이 충분하지 못할 수 있고, 반응이 과다하게 진행되면 기공의 과다 확장에 의해 입자가 붕괴될 수 있다.
상기 반응은 예를 들면 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있다. 구체적으로, 상온에서 상기 온도까지 0.5℃/분 내지 15℃/분의 속도로 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 이후에는 반응액을 서서히 냉각시킬 수 있으며, 예를 들면 단계적으로 감온하여 냉각시킬 수 있다. 구체적으로 상기 온도에서 상온까지 0.5℃/분 내지 20℃/분의 속도로 단계적으로 감온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 냉각 이후에 반응 산물을 세척 및 건조시켜 기공이 확장된 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류 ; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후, 얻어진 입자는 하소될 수 있는데, 하소는 입자를 가열하여 그 표면 및 내부를 좀 더 치밀한 구조를 갖게 하고, 기공을 채우는 유기물들을 제거하는 공정이다.
보다 구체적으로, 하소 과정을 거치는 입자의 경우 표면에 존재하는 실라놀기(Si-OH)들 간 서로 결합하여 탈수가 일어나고, 실라놀기 대신 실록산기(Si-O-Si)가 형성됨에 따라 입자의 구조적 수축(shrinkage)이 일어난다. 이러한 경우, 입자 자체의 구조적 치밀함을 가질 수 있고, 표면에 실라놀기가 적어 입자 자체의 분해가 느리게 이루어지며, 본 발명 조성물의 우수한 효과인 서방적이고 지속적인 세포 운명 조절 인자 방출 효과를 달성할 수 있게 한다.
하소 과정은 예를 들면, 400℃ 내지 700℃에서 3시간 내지 8시간, 구체적으로 500℃ 내지 600℃에서 4시간 내지 5시간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 얻어진 다공성 실리카 입자는 전술한 방법대로 표면 및/또는 기공 내부가 개질될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 또한 예를 들면, 소기공의 입자 제조, 기공 확장, 표면 개질, 기공 내부 개질 공정을 거쳐 제조된 것일 수도 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정은 전술한 바의 공정에 의할 수 있으며, 이 후 세척 및 건조 공정을 수행할 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소기공의 입자 제조 이후의 세척은 앞서 예시한 범위 내의 방법/조건으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장 이후의 세척은 앞서 예시보다는 보다 완화된 조건으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 세척을 3회 이내 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자의 표면 및/또는 기공 내부 개질은 전술한 방법에 의할 수 있으며, 표면 개질과 기공 내부 개질의 순서로 공정이 수행될 수 있고, 상기 두 공정 사이에 입자의 세척 공정이 추가로 수행될 수 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 이후에 세척을 보다 완화된 조건으로 수행하는 경우 기공 내부에 입자 제조, 기공 확장에 사용된 계면활성제 등의 반응액이 채워져 있어 표면 개질시에 기공 내부는 개질되지 않고 표면만 개질될 수 있다. 그러고 나서 입자를 세척하면 기공 내부의 반응액이 제거될 수 있다.
상기 표면 개질과 기공 내부 개질 공정 사이의 입자 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 운명 조절의 대상이 되는 세포로는 모든 세포 및 모든 줄기세포가 그 대상이 될 수 있고, 예를 들면, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 어떠한 세포 운명 조절 인자를 담지하고 있는지, 또는 세포의 운명을 어떠한 목적으로 어떠한 단계로 조절하고자 하는지 등의 다양한 요인들에 따라 자유로이 대상으로 할 수 있으며, 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물의 용도는 대상 세포의 운명을 조절하는 것으로서, 세포 운명 조절 인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물을 상기 언급한 다양한 세포들을 배양하는 배지에 처리함으로써, 미분화 단계의 세포를 분화 중의 세포로 분화시키거나 완전 분화 세포로 분화시킬 수 있고, 분화 중의 세포나 완전 분화 세포를 미분화 단계의 세포로 역분화시키거나, 특정 분화 세포를 다른 특정 분화 세포로 직접 분화시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 세포 운명 조절은 매우 효율적이고 성공률 또한 매우 높은 수준이다. 예를 들어, 정분화의 경우 5 내지 80%, 5 내지 75%, 5 내지 70%, 5 내지 65%, 5 내지 60%, 5 내지 55%, 5 내지 50%일 수 있고, 역분화의 경우 0.0001 내지 10%, 0.0001 내지 9%, 0.0001 내지 8%, 0.0001 내지 7%, 0.0001 내지 6%, 0.0001 내지 5%, 0.0001 내지 4%, 0.0001 내지 3%, 0.0001 내지 2%일 수 있으며, 직분화의 경우 5 내지 90%, 5 내지 85%, 5 내지 80%, 5 내지 75%, 5 내지 70%, 5 내지 65%, 5 내지 60%일 수 있다.
이러한 용도 및 효과는 상기 언급한 본 발명의 다공성 실리카 입자의 높은 세포 운명 조절 인자 담지율 및 안정적인 대상 세포 내 전달, 담지된 세포 운명 조절 인자의 서방적이고 지속적인 방출 및 100%에 가까운 방출에 기반한 것이고, 이는 종래의 세포 운명 조절 인자를 이용한 세포의 운명 조절 방법의 단점들을 극복함으로써 우수한 세포 운명 조절 효과를 거둘 수 있게끔 한다.
본 발명은 또한 상술한 조성물을 운명 조절 대상 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법을 제공한다.
상기 조절방법에 있어, 상기 조성물이 포함하는 세포 운명 조절 인자, 다공성 실리카 입자, 대상 세포 등에 관련한 사항은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
하기 실시예에 있어서, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 DDV 또는 MSN, 표면개질된 다공성 실리카 입자는 ADDV 또는 mDDV, 아미노기로 표면개질된 다공성 실리카 입자는 ADDV 또는 AMSN로 각각 명명될 수 있다.
실시예 1. 다공성 실리카 입자의 제조
(1) 입자 1의 제조
1) 소기공 입자의 제조
2 L 둥근바닥플라스크에 증류수 (DW) 960 mL 과 MeOH 810 mL을 넣었다. 상기 플라스크에 CTAB 7.88 g을 넣은 후 교반하면서 1M NaOH 4.52 mL를 빠르게 넣었다. 10분 동안 교반시켜 균일한 혼합액을 넣은 후 TMOS 2.6 mL를 넣었다. 6시간 동안 교반하여 균일하게 혼합한 후, 24시간 동안 숙성시켰다.
이후 상기 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 1.5g의 분말형의 소기공 다공성 실리카 입자(기공 평균 직경 2nm, 입경 200nm)를 얻었다.
2) 기공 확장
1.5g의 소기공 다공성 실리카 입자 분말을 에탄올 10ml에 첨가하여 초음파 분산시키고, 물 10ml, TMB (trimethyl benzene) 10ml를 첨가하여 초음파 분산시켰다.
이후 상기 분산액을 오토클레이브에 넣고 160℃, 48시간 반응시켰다.
반응은 25℃에서 시작하여 10℃/분의 속도로 승온시켜 수행하였고, 이후 오토클레이브 내에서 1~10℃/분의 속도로 서서히 냉각시켰다.
냉각된 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 하소
상기 2)에서 제조된 다공성 실리카 입자를 유리 vial에 담아 550℃에서 5시간 동안 가열하고, 반응 종료 후 상온으로 서서히 식혀 입자를 제조하였다.
(2) 입자 2의 제조
기공 확장시의 반응 조건을 140℃, 72시간으로 변경한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(3) 입자 3의 제조 (10L 스케일)
5배 큰 용기를 사용하고, 각 물질을 모두 5배 용량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(4) 입자 4의 제조 (입경 300nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 920ml, 메탄올 850ml를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(5) 입자 5의 제조 (입경 500nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 800ml, 메탄올 1010ml, CTAB 10.6g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(6) 입자 6의 제조 (입경 1000nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 620ml, 메탄올 1380ml, CTAB 7.88g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(7) 입자 7의 제조 (기공 직경 4nm)
기공 확장시에 TMB를 2.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(8) 입자 8의 제조 (기공 직경 7nm)
기공 확장시에 TMB를 4.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(9) 입자 9의 제조 (기공 직경 10nm)
기공 확장시에 TMB를 6.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(10) 입자 10의 제조 (기공 직경 17nm)
기공 확장시에 TMB를 11mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(11) 입자 11의 제조 (기공 직경 19nm)
기공 확장시에 TMB를 11.8mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(12) 입자 12의 제조 (기공 직경 23nm)
기공 확장시에 TMB를 12.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(13) 입자 13의 제조 (이중개질)
1) 소기공 입자의 제조
실시예 1-(1)-1)과 동일한 방법으로 소기공 입자를 제조하였다.
2) 기공 확장
실시예 1-(1)-2)와 동일한 방법으로 소기공 입자를 TMB와 반응시키고 냉각시키고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 실시예 1-(1)-2)와 동일 조건으로 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 3회 세척하고, 이후 실시예 1-(1)-2)와 동일 조건으로 건조하여 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 표면 개질
기공이 확장된 다공성 실리카 입자 0.8g 내지 1g을 50mL의 톨루엔에 분산시킨 후, (3-aminopropyl)triethoxysilane를 5mL 넣어주어 120 ℃로 환류한 채로 12시간 가열하였다. 해당 과정은 상기 서술된 세척과정 및 건조 과정을 거친 뒤 1mL의 트레에틸렌글리콜(PEG3, 2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]acetic acid)와 100mg의 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 200mg의 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 30mL의 PBS에 분산시켜서 상온에서 교반한 채로 12시간 동안 반응을 보낸다. 이후 생성물은 상기의 세척 및 건조과정을 거친다.
기공 내부에 이전 단계의 반응액이 남아 있어, 기공 내부는 개질 되지 않는다.
4) 기공 내부 세척
표면개질된 입자 분말 800mg을 2M HCl/에탄올 40ml에 녹이고, 12시간 강하게 교반 하에 환류시켰다.
이후 냉각된 반응액을 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
5) 기공 내부 개질
① 후술하는 실시예 2-(2)-1)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 프로필기를 도입하였다.
② 후술하는 실시예 2-(2)-2)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 옥틸기를 도입하였다.
실시예 2. 다공성 실리카 입자의 표면 개질
(1) 양전하로의 대전
1) 아미노기 - 입경 300nm의 입자
실시예 1-(4)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 톨루엔에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 1 mL의 APTES를 첨가하고 400 rpm으로 교반하며 130℃에서 교반하며 12시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 표면 및 기공 내부에 아미노기를 갖는 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
2) 아미노기 - 입경 200nm의 입자
① 실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, APTES를 0.4ml 첨가하고, 반응 시간을 3시간으로 한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 1-(7)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 1-(8)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
④ 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
⑤ 실시예 1-(10)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
⑥ 실시예 1-(11)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
⑦ 실시예 1-(12)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 아미노기 - 입자간 표면개질 정도의 차이
① 실시예 1-(1)-1) 이후 실시예 1-(1)-3) 의 과정을 거친 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 반응 시간을 24시간으로 한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
4) 알데하이드기
실시예 2-(1)-3)-②의 다공성 실리카 입자를 glutaraldehyde(GA)와 반응 시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 증류수에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 10 mL의 GA를 첨가하고 상온에서 400 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 증류수로 5회 세척하였다.
(2) 소수성기의 도입
1) 프로필기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy(propyl)silane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy(propyl)silane를 0.35ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
2) 옥틸기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy-n-octylsilane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy-n-octylsilane를 0.5ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
(3) 음전하로의 대전
1) 카르복실기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 succinic anhydride와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 톨루엔 대신에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하고, APTES 대신에 80 mg의 succinic anhydride를 첨가하여 24시간 동안 상온에서 교반하며 반응시키고, 세척 시에 증류수 대신에 DMSO를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
2) 티올기
APTES 대신에 MPTES 1.1 mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 술폰산기
실시예 2-(3)-2)의 다공성 실리카 입자 100mg를 1M 황산수용액을 1mL와 30% 과산화수소수 20mL에 분산하여 상온에서 교반하여 산화반응을 유도하여 티올기를 술폰산기로 산화시켰다. 이후 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
4) 메틸포스포네이트기
① 실시예 1-(1)-1) 이후 실시예 1-(1)-3) 의 과정을 거친 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 증류수에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 3 mL의 THMP와 1.5 mL의 1M HCl 수용액을 첨가하고 130℃에서 400 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 증류수로 5회 세척하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 ①의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 1-(10)의 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 ①의 방법과 동일하게 개질하였다.
(4) 친수성기의 도입 - PEG
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자 100 mg을 50μg/ml 농도의 N,N'-Disuccinimidyl carbonate (DSC) 용액 20 ml에 분산하여 상온에서 교반하여 다공성 실리카 입자 표면에 DSC를 결합시킨다. 이 입자를 증류수 10 ml를 이용하여 3회 세척하고 끝이 아미노기로 되어있는 분자량 4kDa, PEG (HO-PEG-NH2) 10 mg을 위의 용액 10 ml에 분산하여 상온에서 교반하여 다공성 실리카 입자 표면에 PEG가 연결될 수 있도록 한다. 이후 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
실시예 3. 세포 운명 조절 인자의 담지
(1) 레티노산 (Retinoic acid)
증류수 1ml 하에서 실시예 1-(1),(11), 실시예 2-(1)-2)-①,⑥의 다공성 실리카 입자 100μg에 레티노산 용액(50mM 에탄올) 1ml를 첨가하고 실온에서 4시간 정치하여 로딩하였다.
(2) CYC (cyclopamine-KAAD)
증류수 1ml 하에서 실시예 2-(2)-2)의 다공성 실리카 입자 100μg에 CYC 용액(1mM dimethyl sulfoxide(DMSO)) 0.5ml를 첨가하고 실온에서 2시간 정치하여 로딩하였다.
(3) activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Nanog
실시예 2-(3)-1), 3), 4)의 다공성 실리카 입자 100μg과 activin A, BMP-4, KGF, bFGF, FgF, Wnt, Nanog 또는 Noggin 10μg을 1xPBS 0.2 ml 내에 혼합한 후, 4oC에서 4시간 정치하여 로딩하였다.
(4) plasmid DNA, linear DNA, mRNA
PBS 1ml 하에서 실시예 2-(1)-2)-⑦ 의 다공성 실리카 입자 12.5μg에 Oct4(서열번호 5), Sox2(서열번호 6, 서열번호 7), Klf4(서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10), c-Myc(서열번호 11), Nanog(서열번호 12, 서열번호 13) 또는 hTERT(서열번호 14)의 plasmid DNA, linear DNA 또는 mRNA 0.25μg를 섞은 후, 실온에서 30분간 정치하여 로딩하였다.
(5) miR-21 (miRNA family)
실시예 2-(1)-2)-⑤,⑥의 다공성 실리카 입자 10 ㎍와 50 pmol의 miR-21(서열번호 15)를 1xPBS 조건에서 섞은 후 상온에서 30분간 두고 적재가 되도록 하였다.
실험예 1. 다공성 실리카 입자 형성 및 기공 확장 확인
실시예 1-(1) 내지 (3)의 입자의 소기공 입자, 제조된 다공성 실리카 입자를 현미경으로 관찰하여, 소기공 입자가 균일하게 생성되었는지, 기공이 충분히 확장되어 다공성 실리카 입자가 균일하게 형성되었는지를 확인하였다(도 1 내지 4).
도 1은 실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 사진, 도 2는 실시예 1-(2)의 다공성 실리카 입자의 사진으로 기공이 충분히 확장된 구형의 다공성 실리카 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있고,
도 3은 실시예 1-(1)의 소기공 입자의 사진이고, 도 4는 실시예 1-(1)과 실시예 1-(3)의 소기공 입자의 비교 사진으로, 구형의 소기공 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 다공성 실리카 입자의 기공 평균 직경 , BET 표면적, 기공 부피 및 제타 포텐셜의 측정
(1) 측정방법
실시예 1-(1)의 소기공 입자, 실시예 1-(1),(7),(8),(9),(11), 실시예 2-(1)-2)-①②③④⑥의 다공성 실리카 입자의 표면적과 기공 부피를 계산하였다. 표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 크기 및 부피는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다.
또한, 100μg의 상기 다공성 실리카 입자들을 1ml의 PBS(pH 7.4)에 분산시킨 후, disposable folded capillary cell (DTS1070)에 옮겨 담아 제타전위 측정 장치에 장착 후 제타 포텐셜을 측정하였다.
(2) 측정결과
상기 각 입자들의 현미경 사진은 도 5 및 도 6에 나타내었고, 계산 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
기공 평균 직경
(nm)		 BET 표면적
(m2/g)		 기공 부피
(ml/g)		 제타 포텐셜
(mV)
DDV2 2 1305 내지 1420 0.5 내지 0.7 -10 내지 -50
mDDV2 2 1150 내지 1390 0.48 내지 0.69 +5 내지 +50
DDV4 4 598 내지 950 0.6 내지 0.8 -10 내지 -50
mDDV4 4 550 내지 940 0.59 내지 0.78 +5 내지 +50
DDV7 7 490 내지 585 0.65 내지 0.9 -10 내지 -50
mDDV7 7 488 내지 575 0.61 내지 0.87 +5 내지 +50
DDV10 10 460 내지 487 0.68 내지 0.95 -10 내지 -50
mDDV10 10 440 내지 480 0.65 내지 0.92 +5 내지 +50
DDV19 19 430 내지 480 0.7 내지 1.52 -10 내지 -50
mDDV19 19 400 내지 470 0.69 내지 1.50 +5 내지 +50
DDV23 23 300 내지 460 0.8 내지 1.7 -10 내지 -50
mDDV23 23 250 내지 450 0.78 내지 1.69 +5 내지 +50
실험예 3. 다공성 실리카 입자의 세포 운명 조절 인자 담지율
(1) 실험방법
1) 레티노산 외 다른 세포 운명 조절 인자
실시예 3-(2) 내지 (5)와 동일한 방법으로 다양한 세포 운명 조절 인자들을 각각 다공성 실리카 입자에 로딩한 뒤 상층액의 흡광도를 측정하거나, 상층액을 염료로 염색한 후 흡광도를 측정하거나, 상층액의 형광세기를 분석하여 담지된 세포 운명 조절 인자의 양을 구하고 담지율을 계산하였다.
구체적으로, 중성 pH에서 양전하를 띠는 인자는 음전하로 개질된 다공성 실리카 입자를, 중성 pH에서 음전하를 띠는 인자는 양전하로 개질된 다공성 실리카 입자를 사용하였고, 각 인자에 따른 적재조건하에서 로딩한 후에, 상층액의 흡광이나 형광을 측정하여 적재되지 않고 상층액에 남아있는 세포 운명 조절 인자의 양을 측정하였고, 담지된 세포 운명 조절 인자의 양을 계산(세포 운명 조절 인자의 양 = 처음 넣어준 세포 운명 조절 인자의 양 - 상층액에 남아있는 세포 운명 조절 인자의 양)하여 담지율을 확인한다(담지율=세포 운명 조절 인자/다공성실리카입자, w/w%)
2) 레티노산
실시예 1-(1),(11), 실시예 2-(1)-2)-①,⑥의 다공성 실리카 입자에 레티노산을 로딩한 뒤 상층액의 흡광도를 측정하여 담지된 레티노산의 양을 구하고 담지율을 계산한다.
구체적으로, 증류수 1ml 하에서 다공성 실리카 입자 100μg에 레티노산 용액(50mM 에탄올) 1ml를 첨가하여 실온에서 4시간 정치하여 로딩하고, λab = 350nm 에서 흡광도를 측정하여 적재되지 않고 상층액에 남아있는 레티노산의 양을 측정하였고, 담지된 레티노산의 양을 계산(레티노산의 양 = 처음 넣어준 레티노산의 양 - 상층액에 남아있는 레티노산의 양)하여 담지율을 확인한다(담지율=레티노산/다공성실리카입자, w/w%)(도 7).
(2) 실험결과
1) 레티노산 외 다른 세포 운명 조절 인자
하기 표 2를 참조하면, 상기 실험방법에 따른 다양한 세포 운명 조절 인자들의 다공성 실리카 입자에의 담지율(세포 운명 조절 인자/다공성 실리카 입자), w/w%)을 확인할 수 있다.
그룹 세포 운명 조절 인자의 특성 세포 운명 조절 인자 다공성 실리카 입자의 제타 포텐셜
(mV)		 담지율
(w/w%)
저분자 중성 pH에서 양전하를 띰 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR99021, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, etc. -10 내지 -50 5 내지 45
중성 pH에서 음전하를 띰 IWP2, IWP4, KY02111, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK(Forskolin), IDE1, IDE2, DAPT, CYC(cyclopamine-KAAD), PDBu, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, etc. +5 내지 +48 5 내지 45
생체분자 중성 pH에서 양전하를 띰 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMP4, IGF1, HGF, WNT, FGF10, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-ß, SOX2, Noggin, etc. -10 내지 -50 5 내지 60
중성 pH에서 음전하를 띰 nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOX9, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, c-Myc, insulin, FGF9, Interleukins, etc. +5 내지 +45 5 내지 60
핵산 중성 pH에서 음전하를 띰 plasmid DNA, linear DNA, miRNA (miR-124, miR-9, miR9*, miR-302, miR-367, miR-21, etc.), siRNA, modified RNA, noncoding RNA, mRNA, etc. +5 내지 +45 5 내지 40
2) 레티노산
도 8을 참조하면, 기공의 평균 직경이 2nm인 경우보다 기공의 평균 직경이 19nm인 경우에 레티노산의 담지율이 더 높고, 다공성 실리카 입자의 표면 또는 기공 내부가 아미노기로 개질된 경우가 그러하지 않은 경우보다 레티노산의 담지율이 더 높은 것을 확인할 수 있다. 이에, 본 발명 조성물이 포함하는 다공성 실리카 입자의 기공크기와 표면의 개질여부가 레티노산을 포함하는 세포 운명 조절 인자의 담지율에 영향을 미치는 요소임을 확인할 수 있다.
실험예 4. 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인을 위해 37℃, SBF(pH 7.4)에서의 생분해 정도를 0시간, 120시간, 360시간에 현미경으로 관찰하였고, 이는 도 9에 나타내었다. 이를 참조하면 다공성 실리카 입자가 생분해되어 360시간 경과 후에는 거의 다 분해된 것을 확인할 수 있다.
실험예 5. 다공성 실리카 입자의 흡광도비 측정
시간별 하기 수학식 1에 따른 흡광도비를 측정하였다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며, At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
구체적으로, 다공성 실리카 입자 분말 5mg을 SBF (pH 7.4) 5ml에 녹였다. 이후 5ml의 다공성 실리카 입자 용액을 도 10에 도시된 직경 50 kDa의 기공을 갖는 투과막에 넣었다. 외부막에 15ml의 SBF를 첨가하고, 외부막의 SBF는 12시간마다 교체하였다. 다공성 실리카 입자의 분해는 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다. 이 후 UV-vis spectroscopy에 의해 흡광도를 측정하였고, λ = 640 nm에서 분석되었다.
(1) 흡광도 비 측정
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도 비를 상기 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 11에 나타내었다. 이를 참조하면 흡광도 비가 1/2가 되는 t가 약 58시간으로 굉장히 천천히 분해되는 것을 확인할 수 있다.
(2) 입경별 측정
실시예 1-(1),(5),(6)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용). 이를 참조하면, 입경의 증가에 따라 t가 감소함을 알 수 있다.
(2) 기공 평균 직경별 측정
실시예 1-(9),(10)의 다공성 실리카 입자, 그리고 컨트롤로서 실시예 1-(1)의 소기공 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 13에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용). 이를 참조하면, 실시예의 다공성 실리카 입자는 컨트롤에 비해 t가 상당히 큰 것을 확인할 수 있다.
(3) pH별 측정
실시예 1-(4)의 다공성 실리카 입자의 pH별 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 SBF에서, 그리고 pH 2,5,7.4의 Tris에서 측정하였고, 그 결과는 도 14에 나타내었다. 이를 참조하면, pH 별 t의 차이는 있으나, 모두 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
(4) 대전된 경우의 측정
실시예 2-(1)-1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 15에 나타내었다(현탁액과 용매로는 Tris(pH 7.4)를 사용). 이를 참조하면, 양전하로 대전된 입자도 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
실험예 6. 다공성 실리카 입자의 세포독성 테스트
96웰 플레이트에 HepG2 세포를 각 웰 당 10,000개씩 깔아두고 24시간 후에 각 웰에 실시예 2-(3)-4) 입자를 저농도부터 고농도까지 순차적으로 분산시키고 24시간 둔 후 cell counting kit (CCK)를 이용하여 HepG2세포의 생존률을 확인하였고(도 16), 실시예 2-(1)-2)-⑥ 입자를 같은 방법 mES(마우스 줄기세포)에 48시간 동안 둔 후 그 생존률을 확인하였다(도 17).
도 16 및 도 17을 참조하면, 본 발명 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물은 농도에 무관하게 HepG2 세포주 및 mES 세포주의 생존율에 미치는 영향이 미미한 것으로 보아, 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. 다공성 실리카 입자의 세포 내 전달
(1) 실험방법
1) mES(마우스 줄기세포)
mES 세포를 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 접종하고 통상적인 mES 배양 배지로 24시간 동안 배양하였다. 세포 내 전달 실험에는 TAMRA 염료(TAMSN19)로 표지된 AMSN19(실시예 2-(1)-2)-⑥)을 사용하였다. TAMSN19는 사전 최적화된 방법으로 제조되었고, mES 세포에 처리되어 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 48시간 동안 배양되었다. 시료 채취 전, 핵 염색을 위해 Hoechst 33342로 세포를 처리하고 15분 후에 배지를 제거하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 각 배지는 Deltavision(GE healthcare)에서 관찰되어 배지 내에서 TAMSN19의 세포 내 전달을 확인했다. 이미지는 z축에 수직인 다양한 평면에서 반복적으로 얻었다. 형광 상관 분석은 z-단면 이미지#3의 line 프로파일링에 의해 수행되었으며, 이는 배지 구조 내의 핵 및 다공성 실리카 입자의 가장 선명한 이미지를 나타낸다.
2) Fully-differentiated cell(완전 분화 세포) 및 기타 세포
인간 섬유아세포, HepG2 세포, HeLa 세포, 림프구, 골수세포, 인간 배아 줄기세포, 인간 신경 전구 세포를 세포배양플레이트에 접종하고, 각 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배양액을 처리하여 배양하였다. 세포 내 전달 실험에는 실시예 3의 세포 운명 조절 인자들이 담지된 TAMRA 염료 또는 FITC로 표지된 입자를 사용하였다. 사전 최적화된 방법으로 제조된 입자는 세포에 처리되어 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양되었다. 시료 채취 전, 핵 염색을 위해 Hoechst 33342로 세포를 처리하고 15분 후에 배지를 제거하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 각 배지는 Deltavision(GE healthcare)에서 관찰되어 TAMRA 또는 FITC에 해당되는 형광신호를 confocal microscope으로 관찰하였다.
(2) 실험결과
1) mES(마우스 줄기세포)
AMSN19가 표적 세포에 효율적으로 도달하는지를 관찰(도 18)하기 위해, 편의상 5-carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA) 염료가 결합된 AMSN19(TAMSN19)를 제조하였다. 입자의 처리 전체, mES 세포는 배양 플레이트 표면의 젤라틴 코팅에 의해 보조된 feeder-free 시스템 하에서 배양되어, 적절한 미분화 성장 조건의 유지를 용이하게 하였다. 세포의 미분화 상태는 콜로니 유사 특징의 형성 및 유지에 의해 확인되었다. 세포를 20μg/mL의 TAMSN19로 처리하고, 줄기세포 검증 혈청과 함께 배양하였다. 이러한 조건 하에서, 세포는 그들의 콜로니 형성을 명확하게 유지하였고, TAMSN19의 위치는 콜로니 내에서 관찰되었다. RA/MSN 복합체의 세포 내 intake는 형광 세포 이미지를 기반으로 한 형광 상관 분석에 의해 밝혀졌으며, 이는 DeltavisionTM 영상 장비를 이용한 z-sectioned imaging 기술로 가능했다(도 19). 동일 평면에서 콜로니 내의 z-sectioned 이미지를 참조하면, 입자(빨간색)는 세포질(파란색)에서 주로 관찰되었다. 단일 mES 세포 내에서 입자의 성공적인 internalization은 TEM 이미지에 의해 확인되었고, 입자가 세표 표면에 엉겨붙지 아니하고 세포질 영역에 성공적으로 위치하여 핵 주변(검은색, 빨간색 화살표로 표시된 빈 점)에 접근함을 알 수 있다(도 20). 또한, 입자를 줄기세포에 전달한 후에 TEM(투과전자현미경) 촬영한 결과. Endocytosis에 의해 endosome을 형성하며 줄기세포 내로 전달되고 이 후 endosome을 탈출하여 핵 주변에서 DDV 내부에 담지된 세포 운명 조절 인자를 방출함을 구체적으로 확인할 수 있다(도 21). 이러한 데이터는 입자가 콜로니화 된 세포들에 담지된 세포 운명 조절 인자를 효과적으로 전달할 수 있는 높은 잠재력을 가짐을 확인할 수 있다.
2) Fully-differentiated cell(완전 분화 세포) 및 기타 세포
5-carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA) 염료 또는 FITC로 표지한 입자를 제조하였고, 상기 실험예 7-(1)-2)의 방법대로 인간 섬유아세포(도 22a), HepG2 세포(도 22b), HeLa 세포(도 22c), 림프구(도 23a), 골수세포(도 23b), 인간 배아 줄기세포(도 24a), 인간 신경 전구 세포(도 24b)에 in vitro 상에서 처리하였고, 척수 조직에 in vivo 상에서 처리한 결과, 입자가 다양한 세포들에 성공적으로 internalize 되어 담지된 세포 운명 조절 인자를 효과적으로 전달하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8. 담지된 세포 운명 조절 인자(RA)의 방출
(1) 실험방법
RA 방출 동역학 조사를 위해, RA 용액에서 4시간 동안 인큐베이션하여 생성된 각 RA/MSN 복합체를 PBS 5% 에탄올 용액에 현탁시키고, 37℃ 조건에서 최대 10일 동안 배양하였다. 복합체로부터 방출된 RA의 계산된 값은 각 샘플의 RA 용액 상등액의 350nm에서의 UV 흡수 값의 변화를 분석함으로써 도출되었다. UV 흡수 피크치를 격일로 측정하고, 계산된 RA의 양을 이전 데이터 각각에 합산하였다.
(2) 실험결과
RA loading test에 따라 각 입자의 담지된 RA의 방출 속도가 분석되었다(도 26, 도 27). 그 결과, 작은 기공을 갖는 입자(MSN2, AMSN2)와 비교하여 큰 기공을 갖는 입자(MSN19, AMSN19)는 상대적으로 지속된 방출(sustained release) 속도 프로파일을 보여 10일 이내에 거의 100% 방출되었다. 이러한 데이터는 입자의 큰 기공과 아민 작용기의 조합이 RA의 세포 내 전달을 위한 가장 적합한 입자를 선택하는 요소로서, 높은 담지율 및 지속적 방출 특성을 부여하는 것임을 확인할 수 있다.
실험예 9. 대상 세포 운명의 조절
(1) 실험방법
1) 줄기세포의 신경 세포로의 분화
mES 세포의 신경 유도는 RA 또는 RA/AMSN19 복합체를 첨가하여 수행하였다. 특히, 10-6M RA 또는 25μg RA/AMSN19 (RA 포함 3 x 10-6M에 해당)는 완전한 mES 배지가 있는 mES 세포로 2일 동안 처리하였다. 유도가 없는 군은 음성 대조군으로 배양하였다. 2일 후, 배지를 신경 세포 배양 배지 N2B27로 교체하였다. 배지는 격일로 교체되었다.
2) 줄기세포의 췌장 내배엽으로의 분화
배아줄기세포를 activin A(ActA) 100 ng/ml 그리고 Wnt3a 25 ng/ml 를 포함하는 RPMI 배양액에서 하루 동안 배양했다. 다음 날, 0.2% FBS와 ActA 100 ng/ml 를 포함하는 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양했다. 그 다음, 세포를 PBS에 씻겨주고 2% FBS와 25 ~ 50 ng/ml KGF를 포함하는 RPMI 배양액에서 3일 동안 배양했다. 3일 후, 1% B27 첨가제, KAAD-cyclopamine (CYC) 0.25 μM, retinoic acid (RA) 2 μM과 Noggin(Nog) 50 ng/ml을 포함하는 DMEM 배지로 교환한 후 3일 동안 배양했다. 이후, 1% B27 첨가제를 포함하는 DMEM 배지로 교환 했다. 상기 단계들은 순차적으로 배지 자체를 교환해주는 것으로 시행되었다. 상기 단계에서 첨가되는 분화유도물질들(ActA, Wnt, KGF, RA, Cyc, Nog)은 각 단계에 맞는 조합대로 DDV 내부에 담지하여 처리하였으며, 10일 후에 췌장 내배엽 분화 마커유전자인 HNF6와 PDX1의 발현정도로 분화 유도효율을 측정하였다(도 34).
3) 줄기세포의 심근세포로의 분화
배아줄기세포를 Matrigel-coated plates에 1 x 105 cells/cm2 밀도로 심은 후 bFGF/FGF 8 ng/ml을 포함하는 MEF-CM 배지에서 6일 동안 배양한다. 그 후, RPMI-B27을 포함한 MEF-CM 배지에서 activin A (ActA) 100 ng/ml을 1일 동안 처리한 후에 BMP4 10 ng/ml를 4일 동안 처리하였다. 그 다음, 2주 내지 3주 동안 2일 내지 3일 마다 새로운 RPMI-B27 배양액으로 교체하였다. 상기 단계에서 첨가되는 분화유도물질들을 각 단계에 적정한 조합으로 DDV 내부에 담지하여 세포에 처리하였고, 14일 후 심근세포 특이 단백질인 cardiac troponin T (cTnT)의 발현정도로 심근세포 분화 유도효율을 측정하였다(도 35).
4) 섬유아세포 또는 혈구세포의 유도만능줄기세포로의 역분화
① DNA template 준비
pcDNA3 (Life technologies) plasmid backbone에 각각 실시예 3의 인간의 Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, c-myc, TERT를 PCR로 증폭시킨후, 적정한 제한효소로 절단후, ligase를 이용하여 결합함으로써 제작하였다(도 36).
② 2000bp 이하의 mRNA 준비
1-5 ng plasmid, 2 unit Platinum Taq polymerase (Life Technologies), 1x PCR buffer w/o MgCl2, 2.8 mM MgCl2, 0.5 μM sense primer, 0.5 μM antisense primer, 200 μm dNTPs를 총 25 μl PCR reactions volume으로 제작한 후, 95 ℃ for 3 min, 35 cycles at 95 ℃ for 30 s, 60 ℃ for 30s, 72 ℃ for 60s per 1 kb, 마지막으로 72 ℃ for 3 min 의 조건에서 PCR을 수행하였다.
③ 2000bp 이상의 mRNA 준비
10 ng plasmid, 5 unit LongAmp Taq DNA polymerase (New England Biolabs), 1x LongAmp Taq reaction buffer, 2 μM sense primer, 2 μM antisense primer, 300 μm dNTPs를 총 50 μl PCR reactions volume으로 제작한 후, 95 ℃ for 3 min, 35 cycles at 94 ℃ for 10 s, 60 ℃ for 60s, 65 ℃ for 50s per 1 kb, 마지막으로 65 ℃ for 3 min 의 조건에서 PCR을 수행하였다.
④ mRNA IVT, transfection 및 reprogramming
1 μg의 선형 plasmid나 0.5 μg의 PCR product를 template을 하여 T7mScript Standard mRNA production System (Epicentre Biotechnologies)을 이용하여 IVT-RNA(In vitro transcription-RNA)를 합성하였다. 합성된 RNA에 V.virus-derived capping enzyme과 2'-O-methyltrasferase를 이용하여 Cap 1 구조를 붙이고, poly A tail을 mScript?? polymerase enzyme kit (Epicentre Biotechnologies)를 이용하여 붙였다. 합성된 RNA GeneJet RNA purification kit (Thermo Fisher)를 이용해서 정제하였다. 정제된 mRNA (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, hTERT)는 각각 동일한 양을 혼합한 mRNA 혼합물 또는 GFP mRNA를 DDV에 담지된 형태(실시예 3)로 세포에 처리하였다. Fibroblast (human foreskin fibroblast)는 well당 2 x 106개씩 0.1% gelatin이 코팅된 6-well plate에 seeding 하였다. 세포는 transfection 이전에 5% O2 조건에서 24시간 동안 배양되었다. Transfection 이전에 세포 배지는 OPTI-MEM basal media (Life Technologies)로 교체하였다. 혼합된 mRNA 또는 GFP mRNA는 150 mM의 NaCl 용액 (PolyPlus)에 희석하였고, DDV 또한 150 mM의 NaCl 용액에 희석시킨 뒤, 두 용액을 섞어 실온에서 5~10 min간 방치하였다. 이후, 세포에 해당 용액을 처리하여 transfection을 시키고, 4시간 뒤에 해당 용액을 fibroblast 배지로 교체하였다. Transfection 과정은 48시간 간격으로 2주 동안 수행되었다. 이후 mRNA-IPS 콜로니 수를 확인하여 역분화 유도 효율을 측정하였다(도 37).
5) 골수성세포와 섬유아세포간 직분화
mouse peripheral blood로부터 monocyte를 분리한 뒤, hMCSF와 polymixin B를 사용하여 macrophage로 먼저 분화시켰다. 이 macrophage 에 LPS(1microgram/ml)와 IFN-gamma (20ng/ml)을 처리하여 M1 타입 macrophage로 polarize시켰다. 이렇게 준비된 macrophage를 배양접시에서 안정화시킨 후에, miR-21 RNA를 DDV 내부에 담지하여 배양하던 세포의 배양액에 처리하였다. 이후, 세포를 4% 파라 포름 알데히드로 고정시킨 후, PBS 10% (v/v) FBS 및 0.01% (v/v) Tween-20을 30분간 처리하여 세포를 블로킹한 후, 1차 항체 (anti-FSP1 antibody 1:400)와 함께 4℃로 밤새 배양하였다. PBS로 2회 세정한 후, 각 항체에 대응하는 2차 항체(Anti-Rat IgG, 1:1000 / Anti-rabbit IgG, 1:1000)를 도포하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 샘플을 PBS로 2회 세정하고 각 커버 유리를 배양 플레이트로부터 제거하고 DAPI를 함유하는 Vectashield?? mounting solution으로 mounting 하였다. 준비된 세포를 confocal microscope으로 형광신호를 분석하여 직분화 효율을 측정하였다.
6) RT-PCR
TRIZOL 시약으로 각 샘플로부터 RNA를 단리하고, 지시 설명서에 따라 Superscripttm 역전사 효소에 의해 cDNA 합성을 보조하였다. 표적 유전자의 증폭을 위하여, 각 프라이머는 GC 함량이 50% 미만이고, 표적 유전자의 두 개의 엑손 사이에 중첩되어 있음을 고려하여 설계되었다. 프라이머의 서열은 하기 표 3과 같다.
OCT4 순방향(서열번호 1) 5'-GCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGC-3'
역방향(서열번호 2) 5'-GCCTCATACTCTTCTCGTTGGGA-3'
Tuj1 순방향(서열번호 3) 5'-TCAGCGATGAGCACGGCATA-3'
역방향(서열번호 4) 5'-CACTCTTTCCGCACGACATC-3'
7) 면역 세포 화학(Immunocytochemistry)
면역 세포 화학법의 경우, mES 세포를 젤라틴 코팅된 커버 글래스에 플레이팅하고, RA 또는 RA/MSN으로 처리한 후 전술한 신경 분화 과정을 수행하였다. 4% 파라 포름 알데히드로 고정시킨 후, PBS 10% (v/v) FBS 및 0.01% (v/v) Tween-20을 30분간 처리하여 세포를 블로킹한 후, 1차 항체(Tuj1: Rat anti-Tuj1, 1:200 / OCT4: Rabbit anti-OCT4, 1:100)와 함께 4℃로 밤새 배양하였다. PBS로 2회 세정한 후, 각 항체에 대응하는 2차 항체(Anti-Rat IgG, 1:1000 / Anti-rabbit IgG, 1:1000)를 도포하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 샘플을 PBS로 2회 세정하고 각 커버 유리를 배양 플레이트로부터 제거하고 DAPI를 함유하는 Vectashield?? mounting solution으로 mounting 하였다.
8) 정량분석
정량 분석을 위해, 대표적인 5개의 형광 이미지를 각각의 면역 염색 샘플로부터 수득하였다. 이미지는 ImageJ 프로그램에 의해 분석되었다. Tuj1-양성 세포의 분석을 위해, 각 이미지에서 임계치를 초과하는 Tuj1을 나타내는 형광 세포의 수를 측정하고, 전체 핵의 수에 대해 비율을 계산하였다. 축삭의 길이를 측정하기 위해, 50개의 세포에서 축삭 돌기를 각각의 샘플에 대해 line 측정 도구로 분석하였다. 100개의 대표적인 축삭을 고려하여 평균값을 계산하였다.
(2) 실험결과
1) 줄기세포의 신경 세포로의 분화
도 28을 참조하면, 배양 배지를 N2B27로 바꾼 경우, RA 또는 RA/AMSN19로 처리된 세포의 대부분이 죽었으며 살아남은 세포는 세포질 부분이 증가함에 따라 특이한 형태학적 변화를 보였다. 구체적으로, RA/AMSN19로 처리된 세포는 RA로 처리된 세포의 것보다 섬유질 구조에 대한 뚜렷한 형태학적 변화로서 세포질 부분에서보다 신속하고 활발한 증가를 보였다. RA만으로 처리한 세포의 전체 형태는 2일간의 RA 단독 분화 유도가 중요한 신경 분화를 유도하기에 충분하지 않다는 것을 나타낸다는 점에서 mES 세포 콜로니와 유사하다. 대조적으로, mES 세포가 RA 처리없이 신경 세포 배양 조건에 노출되었을 때, 세포는 생존하지 않았다.
도 29, 도 30을 참조하면, 성공적으로 신경 세포를 생성 하는지를 평가하기 위해 각 시료에서 총 RNA를 분리하고 OCT4(다능성 마커)와 ß-Ⅲ tubulin(Tuj1, 신경 특이성 마커)의 유전자 발현을 RT-PCR 방법으로 분석한 결과를 확인할 수 있는데, 상대적인 유전자 발현 수준 분석에 의하면 OCT4 발현 수준은 RA 및 RA/AMSN19 샘플 모두에서 감소하는 반면, Tuj1 샘플에서는 감소했다. 구체적으로, RA/AMSN19로 2일간 처리한 샘플은 RA 단독으로 약 2.5 배 처리한 샘플보다 Tuj1 발현이 훨씬 더 증가하였다.
도 31을 참조하면, 단백질 수준에서 상기 마커들의 발현을 분석하기 위해 OCT4 또는 Tuj1에 특이적인 항체를 사용하여 면역 염색 분석을 수행한 결과를 확인할 수 있는데, 면역 세포 화학법에 의해 밝혀진 상대 마커 단백질 발현은 mRNA 발현 분석 결과와 잘 관련되어 있었고, 특히, RA/AMSN19로 처리된 세포는 OCT4의 발현이 극히 낮았으며, Tuj1의 발현은 섬유상 망상 구조로 높은 것으로 관찰되었다. 대조적으로, RA만으로 유도된 세포는 콜로니 구조를 유지하고 OCT4의 발현을 유지했다. Tuj1의 발현은 콜로니 및 부분적으로 콜로니로부터 분리된 독립적인 단일 세포 모두에서 관찰되었다. RA/AMSN19 투여군과 달리 Tuj1 발현은 세포질의 짧은 섬유상 구조의 핵 영역으로 제한되어 있었으며 형태는 덜 연신되었다.
도 32를 참조하면, 신경 유도 후 살아남은 전체 세포 중 Tuj1 양성 세포의 비율을 분석하여 결정된 세포 변환 효율 그래프를 확인할 수 있는데, RA/AMSN19로 유도된 세포는 거의 90%의 세포 전환 효율을 보였으나, RA 단독 투여군에서는 약 30 %의 세포 전환 효율을 보였다.
도 33을 참조하면, RA/AMSN19로 처리한 군이 대조군에 비해 축삭의 길이가 약 4배 긴 axonal elongation 분석 결과를 확인할 수 있다.
상기 데이터는 RA의 단독 첨가만이 신경 분화 과정을 활성화 시키는데 필요한 RA 농도 임계값을 충족시키기에 충분하지 않음을 나타내며, AMSN19의 도움으로 세포 내 RA 공급량이 보다 효과적으로 신경 전환의 개시에 필요한 RA 농도의 특정 임계값을 쉽게 만족시킬 수 있음을 나타낸다.
2) 줄기세포의 췌장 내배엽으로의 분화
보다 구체적으로, 분화유도가 완료된 췌장 내배엽 세포의 배양액을 제거하고 200ul PBS(1x)로 세척하였다. 이때 세포가 완전 건조되지 않도록 주의하였다. 200ul의 paraformaldehyde(PFA) fixation buffer로 상온에서 20분간 고정하였고, PBS로 3회 내지 5회 세척하였다. 200 ul의 permeabilization buffer를 첨가하여 상온에서 20분간 세포막의 투과도를 높여주었다. Buffer를 제거하고 PBS를 넣어 5분간 정치하여 세척하였고, 이과정을 총 3회 반복하였다. 4% BSA blocking buffer를 첨가하여 45분간 정치하였고, 그다음 HNF6와 PDX1 primary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 1차염색을 수행하였고, 이후 형광표지된 secondary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 2차 염색을 하였다. Confocal microscopy를 이용하여 HNF6와 PDX1에 양성을 보이는 세포의 수를 세어 분화율을 측정하였다.
상기 방법에 의해 분화율을 측정한 결과인 표 5를 참조하면, 높은 분화율을 보임을 확인할 수 있다.
3) 줄기세포의 심근세포로의 분화
보다 구체적으로, 분화유도가 완료된 췌장 내배엽 세포의 배양액을 제거하고 200ul PBS(1x)로 세척하였다. 이때 세포가 완전 건조되지 않도록 주의하였다. 200ul의 paraformaldehyde(PFA) fixation buffer로 상온에서 20분간 고정하였고, PBS로 3회 내지 5회 세척하였다. 200 ul의 permeabilization buffer를 첨가하여 상온에서 20분간 세포막의 투과도를 높여주었다. Buffer를 제거하고 PBS를 넣어 5분간 정치하여 세척하였고, 이과정을 총 3회 반복하였다. 4% BSA blocking buffer를 첨가하여 45분간 정치하였고, 그다음 cTnT primary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 1차염색을 수행하였고, 이후 형광표지된 secondary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 2차 염색을 하였다. Confocal microscopy를 이용하여 cTnT에 양성을 보이는 세포의 수를 세어 분화율을 측정하였다.
상기 방법에 의해 분화율을 측정한 결과인 표 5를 참조하면 높은 분화율을 보임을 확인할 수 있다.
4) 섬유아세포 또는 혈구세포의 유도만능줄기세포로의 역분화
하기 표 4를 참조하면, DDV에 Oct4, Klf4, Sox2, Nanog 또는 Tert의 DNA 또는 mRNA를 담지하여 섬유아세포 또는 혈구세포와 같은 성체세포에 전달한 경우, DNA와 mRNA의 bp 길이를 불문하고 높은 역분화율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 포함하는 다공성 실리카 입자를 통한 상기 인자들의 안정화 및 서방적이고 지속적인 방출에 기인한 것으로 판단된다.
길이(bp) Transfection rate(%) 세포 내 발현율(%) 분화유도율(%) 역분화유도율(%)
DDV+mRNA(Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, TERT, c-myc) 1-1500 70-90 65-85 60-80 1-10
1501-2500 50-75 40-65 35-60 1-10
2501-4000 15-30 5-20 5-15 0.0001-2
DDV+linear DNA(Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, TERT, c-myc) 1-1500 70-90 65-85 60-80 1-10
1501-2500 50-75 40-65 35-60 1-10
2501-4000 15-30 5-20 5-15 0.0001-3
DDV+pDNA(Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, TERT, c-myc) 1-4500 70-90 65-85 60-80 1-10
4501-9000 70-90 65-85 60-80 1-10
9001-15000 15-30 5-20 5-15 0.0001-2
5) 골수성세포와 섬유아세포간 정분화, 역분화 및 직분화
하기 표 5를 참조하면, DDV에 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, 616452(TGF-β Inhibitor), FSK, DZNep, VEGF, TGFbeta-1, Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC, miRNA-21을 담지하여 신경성세포 또는 섬유아세포에 전달한 경우, 높은 정분화율과 역분화율 및 직분화율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 포함하는 다공성 실리카 입자를 통한 상기 인자들의 안정화 및 서방적이고 지속적인 방출에 기인한 것으로 판단된다.
세포 운명 조절 인자 Transfection rate(%) 정분화율(%) 역분화율(%)
저분자 화합물 5-azacytidine 50-95 5-30 N/D
Kortogenin, retinoic acid, Cyclopamine-KAAD (CYC) 70-95 5-20 N/D
CHIR, 616452, FSK, DZNep, 30-75 N/D 0.0001-2
생체분자 VEGF, KGF, FGF, bFGF, Noggin(Nog) 50-95 40-80 N/D
TGFbeta-1,
Activin A, Wnt, BMPs		 50-95 30-70 N/D
Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 20-80 N/D 0.0001-2
miRNA-21 40-90 5-60 (직분화율)
<110> LEMONEX INC. 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aggtgtgggg gattccccca 240 tgccccccgc cgtatgagtt ctgtgggggg atggcgtact gtgggcccca ggttggagtg 300 gggctagtgc cccaaggcgg cttggagacc tctcagcctg agggcgaagc aggagtcggg 360 gtggagagca actccgatgg ggcctccccg gagccctgca ccgtcacccc tggtgccgtg 420 aagctggaga aggagaagct ggagcaaaac ccggaggagt cccaggacat caaagctctg 480 cagaaagaac tcgagcaatt tgccaagctc ctgaagcaga agaggatcac cctgggatat 540 acacaggccg atgtggggct caccctgggg gttctatttg ggaaggtatt cagccaaacg 600 accatctgcc gctttgaggc tctgcagctt agcttcaaga acatgtgtaa gctgcggccc 660 ttgctgcaga agtgggtgga ggaagctgac aacaatgaaa atcttcagga gatatgcaaa 720 gcagaaaccc tcgtgcaggc ccgaaagaga aagcgaacca gtatcgagaa ccgagtgaga 780 ggcaacctgg agaatttgtt cctgcagtgc ccgaaaccca cactgcagca gatcagccac 840 atcgcccagc agcttgggct cgagaaggat gtggtccgag tgtggttctg taaccggcgc 900 cagaagggca agcgatcaag cagcgactat gcacaacgag aggattttga ggctgctggg 960 tctcctttct cagggggacc agtgtccttt cctctggccc cagggcccca ttttggtacc 1020 ccaggctatg ggagccctca cttcactgca ctgtactcct cggtcccttt ccctgagggg 1080 gaagcctttc cccctgtctc tgtcaccact ctgggctctc ccatgcattc aaactgaggt 1140 gcctgccctt ctaggaatgg gggacagggg gaggggagga gctagggaa 1189 <210> 6 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 gene sequence <400> 6 gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60 ttggcatgta caacatgatg gagacggagc tgaagccgcc gggcccgcag caaacttcgg 120 ggggcggcgg cggcaactcc accgcggcgg cggccggcgg caaccagaaa aacagcccgg 180 accgcgtcaa gcggcccatg aatgccttca tggtgtggtc ccgcgggcag cggcgcaaga 240 tggcccagga gaaccccaag atgcacaact cggagatcag caagcgcctg ggcgccgagt 300 ggaaactttt gtcggagacg gagaagcggc cgttcatcga cgaggctaag cggctgcgag 360 cgctgcacat gaaggagcac ccggattata aataccggcc ccggcggaaa accaagacgc 420 tcatgaagaa ggataagtac acgctgcccg gcgggctgct ggcccccggc ggcaatagca 480 tggcgagcgg ggtcggggtg ggcgccggcc tgggcgcggg cgtgaaccag cgcatggaca 540 gttacgcgca catgaacggc tggagcaacg gcagctacag catgatgcag gaccagctgg 600 gctacccgca gcacccgggc ctcaatgcgc acggcgcagc gcagatgcag 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cagctccagc ccccctgtgg 1200 ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca 1260 gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt 1320 cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct 1380 cacacatgtg agggccggac agcgaactgg aggggggaga aattttcaaa gaaaaacgag 1440 ggaaatggga ggggtgcaaa agaggagagt aagaaacagc atggagaaaa cccggtacgc 1500 tcaaaaagaa aaaggaaaaa aaaaaatccc atcacccaca gcaaatgaca gctgcaaaag 1560 agaacaccaa tcccatccac actcacgcaa aaaccgcgat gccgacaaga aaacttttat 1620 gagagagatc ctggacttct ttttggggga ctatttttgt acagagaaaa cctggggagg 1680 gtggggaggg cgggggaatg gaccttgtat agatctggag gaaagaaagc tacgaaaaac 1740 tttttaaaag ttctagtggt acggtaggag ctttgcagga agtttgcaaa agtctttacc 1800 aataatattt agagctagtc tccaagcgac gaaaaaaatg ttttaatatt tgcaagcaac 1860 ttttgtacag tatttatcga gataaacatg gcaatcaaaa tgtccattgt ttataagctg 1920 agaatttgcc aatatttttc aaggagaggc ttcttgctga attttgattc tgcagctgaa 1980 atttaggaca gttgcaaacg tgaaaagaag aaaattattc 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240 cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccaggtg tcctgcctga aggagctggt 300 ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg ccttcggctt 360 cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca gcgtgcgcag 420 ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg ggctgctgct 480 gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc tctttgtgct 540 ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc tcggcgctgc 600 cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg gatgcgaacg 660 ggcctggaac catagcgtca gggaggccgg ggtccccctg ggcctgccag ccccgggtgc 720 gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc ccaggcgtgg 780 cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc acccgggcag 840 gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac ccgccgaaga 900 agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat ccgtgggccg 960 ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg acacgccttg 1020 tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca aggagcagct 1080 gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc ggaggctcgt 1140 ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca ggttgccccg 1200 cctgccccag cgctactggc aaatgcggcc cctgtttctg gagctgcttg ggaaccacgc 1260 gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg cggtcacccc 1320 agcagccggt gtctgtgccc gggagaagcc ccagggctct gtggcggccc ccgaggagga 1380 ggacacagac ccccgtcgcc tggtgcagct gctccgccag cacagcagcc cctggcaggt 1440 gtacggcttc gtgcgggcct gcctgcgccg gctggtgccc ccaggcctct ggggctccag 1500 gcacaacgaa cgccgcttcc tcaggaacac caagaagttc atctccctgg ggaagcatgc 1560 caagctctcg ctgcaggagc tgacgtggaa gatgagcgtg cgggactgcg cttggctgcg 1620 caggagccca ggggttggct gtgttccggc cgcagagcac cgtctgcgtg aggagatcct 1680 ggccaagttc ctgcactggc tgatgagtgt gtacgtcgtc gagctgctca ggtctttctt 1740 ttatgtcacg gagaccacgt ttcaaaagaa caggctcttt ttctaccgga agagtgtctg 1800 gagcaagttg caaagcattg gaatcagaca gcacttgaag agggtgcagc tgcgggagct 1860 gtcggaagca gaggtcaggc agcatcggga agccaggccc gccctgctga cgtccagact 1920 ccgcttcatc cccaagcctg acgggctgcg gccgattgtg aacatggact acgtcgtggg 1980 agccagaacg ttccgcagag aaaagagggc cgagcgtctc acctcgaggg tgaaggcact 2040 gttcagcgtg ctcaactacg agcgggcgcg gcgccccggc ctcctgggcg cctctgtgct 2100 gggcctggac gatatccaca gggcctggcg caccttcgtg ctgcgtgtgc gggcccagga 2160 cccgccgcct gagctgtact ttgtcaaggt ggatgtgacg ggcgcgtacg acaccatccc 2220 ccaggacagg ctcacggagg tcatcgccag catcatcaaa ccccagaaca cgtactgcgt 2280 gcgtcggtat gccgtggtcc agaaggccgc ccatgggcac gtccgcaagg ccttcaagag 2340 ccacgtctct accttgacag acctccagcc gtacatgcga cagttcgtgg ctcacctgca 2400 ggagaccagc ccgctgaggg atgccgtcgt catcgagcag agctcctccc tgaatgaggc 2460 cagcagtggc ctcttcgacg tcttcctacg cttcatgtgc caccacgccg tgcgcatcag 2520 gggcaagtcc tacgtccagt gccaggggat cccgcagggc tccatcctct ccacgctgct 2580 ctgcagcctg tgctacggcg acatggagaa caagctgttt gcggggattc ggcgggacgg 2640 gctgctcctg cgtttggtgg atgatttctt gttggtgaca cctcacctca cccacgcgaa 2700 aaccttcctc aggaccctgg tccgaggtgt ccctgagtat ggctgcgtgg tgaacttgcg 2760 gaagacagtg gtgaacttcc ctgtagaaga cgaggccctg ggtggcacgg cttttgttca 2820 gatgccggcc cacggcctat tcccctggtg cggcctgctg ctggataccc ggaccctgga 2880 ggtgcagagc gactactcca gctatgcccg gacctccatc agagccagtc tcaccttcaa 2940 ccgcggcttc aaggctggga ggaacatgcg tcgcaaactc tttggggtct tgcggctgaa 3000 gtgtcacagc ctgtttctgg atttgcaggt gaacagcctc cagacggtgt gcaccaacat 3060 ctacaagatc ctcctgctgc aggcgtacag gtttcacgca tgtgtgctgc agctcccatt 3120 tcatcagcaa gtttggaaga accccacatt tttcctgcgc gtcatctctg acacggcctc 3180 cctctgctac tccatcctga aagccaagaa cgcagggatg tcgctggggg ccaagggcgc 3240 cgccggccct ctgccctccg aggccgtgca gtggctgtgc caccaagcat tcctgctcaa 3300 gctgactcga caccgtgtca cctacgtgcc actcctgggg tcactcagga cagcccagac 3360 gcagctgagt cggaagctcc cggggacgac gctgactgcc ctggaggccg cagccaaccc 3420 ggcactgccc tcagacttca agaccatcct ggactgatgg ccacccgccc acagccaggc 3480 cgagagcaga caccagcagc cctgtcacgc cgggctctac gtcccaggga gggaggggcg 3540 gcccacaccc aggcccgcac cgctgggagt ctgaggcctg agtgagtgtt tggccgaggc 3600 ctgcatgtcc ggctgaaggc tgagtgtccg gctgaggcct gagcgagtgt ccagccaagg 3660 gctgagtgtc cagcacacct gccgtcttca cttccccaca ggctggcgct cggctccacc 3720 ccagggccag cttttcctca ccaggagccc ggcttccact ccccacatag gaatagtcca 3780 tccccagatt cgccattgtt cacccctcgc cctgccctcc tttgccttcc acccccacca 3840 tccaggtgga gaccctgaga aggaccctgg gagctctggg aatttggagt gaccaaaggt 3900 gtgccctgta cacaggcgag gaccctgcac ctggatgggg gtccctgtgg gtcaaattgg 3960 ggggaggtgc tgtgggagta aaatactgaa tatatgagtt tttcagtttt gaaaaaaa 4018 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 gene sequence <400> 15 uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims (18)

  1. 표면 또는 기공 내부에 세포 운명 조절 인자를 담지하고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 다공성 실리카 입자를 포함하고,
    상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 세포 운명 조절용 조성물:
    [수학식 1]
    At/A0
    (식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
    상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
    At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부에 실록산기를 갖는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN-193189, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, thiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK(Forskolin), IDE1, IDE2, DAPT, CYC(Cyclopamine-KAAD), PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofuginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF(Fibroblast growth factor), KGF, Klf4, CRX(Cone-rod homeobox), RAX(Retinal homeobox protein Rx), OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Thymosin beta4, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나의 인자이거나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Thymosin beta4, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 인자를 코딩하는 유전자인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC(Cyclopamine-KAAD), activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kartogenin, CHIR99021, TGF-β Inhibitor, FSK(Forskolin), DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조성물.
  11. 청구항 1 또는 2의 조성물을 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 배양 배지에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN-193189, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, thiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK(Forskolin), IDE1, IDE2, DAPT, CYC(Cyclopamine-KAAD), PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofuginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF(Fibroblast growth factor), KGF, Klf4, CRX(Cone-rod homeobox), RAX(Retinal homeobox protein Rx), OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Thymosin beta4, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나의 인자이거나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Thymosin beta4, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 인자를 코딩하는 유전자인 조절방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC(Cyclopamine-KAAD), activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kartogenin, CHIR99021, TGF-β Inhibitor, FSK(Forskolin), DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조절방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조절방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조절방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조절방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조절방법.
  18. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조절방법.
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