WO2019050283A1 - 세포 운명 조절용 조성물 - Google Patents

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WO2019050283A1
WO2019050283A1 PCT/KR2018/010388 KR2018010388W WO2019050283A1 WO 2019050283 A1 WO2019050283 A1 WO 2019050283A1 KR 2018010388 W KR2018010388 W KR 2018010388W WO 2019050283 A1 WO2019050283 A1 WO 2019050283A1
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WO
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cells
group
particles
porous silica
silica particles
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Application number
PCT/KR2018/010388
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English (en)
French (fr)
Inventor
민달희
원철희
박세진
김성찬
Original Assignee
주식회사 레모넥스
서울대학교산학협력단
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier

Definitions

  • the present invention relates to a composition for regulating cell fate and a method for regulating cell fate.
  • Retinoic acid (RA) mediated neural differentiation is one of the well known cell transduction methods in which small molecules bind to mouse embryonic stem cells (mES).
  • mES mouse embryonic stem cells
  • RAR RA receptor
  • Several strategies have been introduced to generate neural differentiation from mES cells.
  • One of the most common methods is the -4 / + 4 RA method, which involves the formation of embryoid bodies (EBs) to activate the cells for 4 days to differentiation stage And 4 days of RA treatment.
  • RA-based methods have also successfully induced adherent mES cell colonies and neural differentiation as a continuous addition of RA to monolayer cultures of mES cells, but the continuous addition of RA has been shown to interact with RARs for neurotransmission of inactivated mES cells There are still some limitations, such as the need to continually supply a sufficient amount of RA.
  • RA acts as one of the key elements for neural differentiation, it has a low solubility in aqueous solution and needs to overcome some disadvantages such as rapid degradation by cell metabolism.
  • the RA concentration must be finely adjusted for the desired cell transformation. It has been reported that the fate of the induced cells mediated by RA from neurons to myocardial cell differentiation is highly dependent on RA concentration.
  • stochastic kinetics associated with RA-RAR interaction is concentration-dependent, since RA is integrated into the cell membrane through diffusion.
  • the addition of RA above the drug concentration (> 10 ⁇ m) in the neural differentiation process can not significantly increase the amount of RA to be treated, as cell viability can be significantly reduced.
  • successful neurogenesis requires mediating with sustained and sufficient adjuvants to improve the intracellular delivery while minimizing the loss of RA, and to meet the needs of the induction process.
  • the present invention provides a composition comprising porous silica particles carrying a cell fate regulator, thereby providing a composition containing a modulating factor with excellent efficiency, releasing the modulated factor in a sustained manner, sustaining the biodegradable property of the particle
  • the present invention aims at controlling the fate of a target cell by effectively releasing at least 99% by weight of a regulatory factor.
  • a porous silica particle comprising a porous silica particle carrying a cell fate regulator on its surface or pore and having a ratio of absorbance of 1/2 of the following formula (1)
  • the particle is chemically modified on the surface or inside of the pore:
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the 1 mg / ml suspension of the porous silica particles in a cylindrical permeable membrane having pores having a diameter of 50 kDa,
  • a t is the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • composition of claim 1 wherein the particles have siloxane groups within the surface or pores.
  • the cell fate regulator is selected from the group consisting of 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, diphtherin-alpha, FSH, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, BFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, FGF2, HGF, WNT, FGF
  • the cell fate regulator is selected from the group consisting of retinoic acid, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, , 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-beta Inhibitor, FSK, DZNep and TGFbeta-1.
  • the cell is selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, skin cells, lymphocytes, bone marrow cells, neural progenitor cells, spinal cord cells, adipocytes, , Blood cells, myeloid cells, fibroblasts, endothelial cells, nerve cells, muscle cells, immune cells, myocardial cells, brain cells, bone cells, oral cells, periodontal cells, hair follicle cells, mucosal cells, epithelial cells,
  • the composition is at least one selected from the group consisting of stem cells, placental cells, cord blood cells, hematopoietic stem cells, gastrointestinal tract cells, amniotic membrane cells, retinal cells, chondrocytes, pancreatic cells, pancreatic beta cells, vascular cells and lung cells.
  • the particles have an average particle size of at least 10 nm in the surface or inside of the pores, wherein the aldehyde group, keto group, carbamate group, sulfate group, sulfonate group, amino group, amine group, aminoalkyl group, silyl group, carboxyl group, A sulfonyl group, a methylphosphonate group, a polyethylene glycol group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, At least one selected from the group consisting of a C 1 to C 30 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 to C 30 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C 6 to C 30 aryl group, and
  • the particles are selected from the group consisting of an amino group, an amine group, a PEG group, a propyl group, an octyl group, a carboxyl group, a thiol group, a sulfonic acid group, a methylphosphonate group and an aldehyde group Lt;
  • RTI ID 0.0 > 1 < / RTI &
  • composition of claim 1 wherein the particles have an average pore diameter of 1 to 25 nm, a pore volume of 0.3 to 2 ml / g, and a BET surface area of 200 to 1500 m 2 / g.
  • composition of claim 1 wherein the particles have an average pore diameter of 7 to 23 nm, a pore volume of 0.59 to 1.69 ml / g, and a BET surface area of 250 to 950 m 2 / g.
  • composition of claim 1 or 2 wherein the composition is selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, skin cells, lymphocytes, bone marrow cells, neural progenitor cells, spinal cord cells, adipocytes,
  • the present invention relates to a method for treating a bone marrow, a bone marrow cell, a bone marrow cell, a bone marrow cell, a periodontal cell, a hair follicle cell, a mucosal cell, an epithelial cell, a mesenchymal cell, Treating at least one culture medium selected from the group consisting of cells, placental cells, umbilical cord blood cells, hematopoietic stem cells, gastrointestinal tract cells, amniotic membrane cells, retinal cells, chondrocytes, pancreatic cells, pancreatic beta cells, vascular cells and lung cells Including the cell fate control method.
  • the cell fate regulator is selected from the group consisting of 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, diphtherin-alpha, FSH, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, BFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, FGF2, HGF, WNT, FGF
  • the cell death regulator is selected from the group consisting of retinoic acid, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, , 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-beta Inhibitor, FSK, DZNep and TGFbeta-1.
  • the particle has an aldehyde group, a keto group, a carbamate group, a sulfate group, a sulfonate group, an amino group, an amine group, an aminoalkyl group, a silyl group, a carboxyl group, A sulfonyl group, a methylphosphonate group, a polyethylene glycol group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aryl group, At least one selected from the group consisting of a C 1 to C 30 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 to C 30 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C 6 to C 30 aryl group, and a C 1 to C 30
  • composition of claim 11 wherein the particles are selected from the group consisting of an amino group, an amine group, a PEG group, a propyl group, an octyl group, a carboxyl group, a thiol group, a sulfonic acid group, a methylphosphonate group and an aldehyde group
  • the at least one of the first and second regions has at least one.
  • the particles have an average pore diameter of 1 to 25 nm, a pore volume of 0.3 to 2 ml / g, and a BET surface area of 200 to 1500 m 2 / g.
  • the particles have an average pore diameter of 7 to 23 nm, a pore volume of 0.59 to 1.69 ml / g, and a BET surface area of 250 to 950 m 2 / g.
  • composition of the present invention comprises a porous silica particle carrying a cell fate regulating factor to support a regulatory factor with excellent efficiency and to release sustained regulatory factor slowly and to control the regulatory factor supported by the biodegradable property of the particle To 99% or more, so that the fate of the target cell can be effectively controlled.
  • FIG. 1 is a photomicrograph of a porous silica particle according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of a porous silica particle according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a microphotograph of a small pore particle during a process for producing porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a micrograph of a small pore particle according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a micrograph of the pore diameter of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a photomicrograph of a microporous silica particle (DDV) having a diameter of 2 nm, a diameter of 19 nm, and a porous silica particle (mDDV) modified with a chemical functional group according to an embodiment of the present invention.
  • DDV microporous silica particle
  • mDDV porous silica particle
  • the DDV (Degradable Delivery Vehicle) is a particle in the examples. Numbers in parentheses denote particle diameters, and subscripts indicate pore diameters.
  • DDV (200) 10 means a particle of an embodiment having a particle diameter of 200 nm and a pore diameter of 10 nm.
  • Figure 7 shows the UV absorbance spectrum (a) and the standard curve (b) for its peak value according to RA concentration.
  • FIG. 8 is a graph comparing the amount of RA carried by the pore average diameter and the chemical modification to the amino group.
  • FIG. 9 is a photomicrograph showing the biodegradability of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • 10 is a tube with a cylindrical permeable membrane according to an example.
  • FIG. 11 is a graph showing a result of absorbance reduction with time of porous silica particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing a result of absorbance reduction of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention with time.
  • FIG. 13 is a graph showing a result of absorbance reduction of the porous silica particles according to an embodiment of the present invention with respect to the pore diameter over time.
  • FIG. 14 is a graph showing a result of absorbance reduction of pH of the environment of porous silica particles according to an embodiment of the present invention over time.
  • Fig. 15 shows the results of absorbance reduction of porous silica particles according to an embodiment of the present invention with time.
  • FIG. 18 shows that the porous silica particles attain mES cell transfer.
  • FIG. 19 shows the fluorescence correlation analysis of the mS cell transfer of porous silica particles.
  • Fig. 20 shows TEM images of mES intracellular transfer of porous silica particles.
  • FIG. 21 shows that the mS-intracellular delivery of the porous silica particles forms an endosome by endocytosis and is delivered intracellularly, and then exits the endosome and releases the cell fate regulatory factors carried in the particles around the nucleus.
  • 25 shows the results of transferring fluorescently labeled porous silica particles directly to the spinal cord of Rat in vivo with a syringe with FITC.
  • 26 shows the amount of the supported RA of each porous silica particle according to the incubation time.
  • FIG. 27 shows the weighted percentages of the loaded RA of the respective porous silica particles according to the incubation time.
  • FIG. 28 shows the degree of neural differentiation in the group treated with nothing, the group treated with RA alone, and the group treated with RA / AMSN 19 in the differentiation of mES into neural cells.
  • FIG. 29 shows the mRNA expression levels of OCT4 and Tuj1 marker genes in the group treated with nothing, the group treated with RA alone, and the group treated with RA / AMSN 19 in the differentiation of mES into neurons.
  • FIG. 30 shows the relative expression levels of OCs4 and Tuj1 marker genes in RA alone group and RA / AMSN 19 treatment group in the differentiation of mES into neurons.
  • FIG. 31 shows the results of immunocytochemical analysis for the RA-AMSN 19- treated group and the RA-treated group in the differentiation of mES into neuronal cells.
  • FIG. 32 shows the number of Tuj-1 positive cells in total cells in the RA-treated group and the RA / AMSN- 19- treated group in% in the differentiation of mES into neurons.
  • FIG. 33 shows the axon lengths of the RA alone group and the RA / AMSN 19 treatment group in the differentiation of mES into neurons.
  • FIG. 34 schematically shows a process of differentiating embryonic stem cells into pancreatic endoderm cells using the composition of the present invention.
  • FIG. 35 schematically shows a process of differentiating embryonic stem cells into myocardial cells using the composition of the present invention.
  • FIG. 36 shows the pDNA design used in the process of dediffering fibroblasts or hematocytes into induced pluripotent stem cells using the composition of the present invention.
  • FIG. 37 schematically shows a process of reprogramming fibroblasts or hemocytes into induced pluripotent stem cells using the composition of the present invention.
  • Fig. 38 schematically shows a method of controlling cell fate using the composition of the present invention.
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the 1 mg / ml suspension of the porous silica particles in a cylindrical permeable membrane having pores of 50 kDa in diameter, contacting the permeable membrane outside the permeable membrane, And the inside and outside of the permeation membrane were stirred horizontally at 60 rpm at 37 ° C and A- t is the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • the cell fate regulator is carried on porous silica particles and is transferred to cells to induce the undifferentiated cells to differentiate, to control the differentiation stage, or to convert the differentiated cells into undifferentiated cells Induce differentiation, induce direct differentiation of a specific differentiated cell into another specific differentiated cell, and the like.
  • the cell fate regulators include but are not limited to 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, cyclophamine-KAAD, PDBu, retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, And valproic acid.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the cell fate regulator may also be selected from the group consisting of Dkkk1 like Dickkopf Like Acrosomal Protein 1, Lefty A (left-right determination factors), activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, TGF- ⁇ , SOX2, Noggin, Nodal, Brn2, Myt1I, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, But is not limited to, at least one biomolecule selected from the group consisting of EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, FGF9 and interleukin.
  • Dkkk1 like Dickkopf Like Acrosomal Protein 1, Lefty A (left-right determination factors), activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, TGF
  • the plasmid DNA or linear DNA comprising the gene coding for the biomolecule described above and mRNA and miRNAs (miR-124, miR-9, miR9 *, miR-302 and miR-367 , miR-21, etc.), siRNA, and modified products thereof, but are not limited to these oligonucleotides.
  • the porous silica particles are silica nanostructures having fine pores of several nanometers to several nanometers in size.
  • the regularity of the pore arrangement is well defined, and the material properties (pore size, Specific surface area, surface property) can be controlled.
  • the porous silica particles may be one having a (MSN or DDV) siloxane group (Si-O-Si), which is a dehydration reaction between silanol groups (Si-OH) . ≪ / RTI >
  • Si-O-Si siloxane group
  • the particles having a siloxane group in comparison with the particles having silanol groups alone can obtain the structural denseness of the particles themselves due to the structural shrinkage of the particles, slow the decomposition rate of the particles themselves, And continuous emission effect can be achieved.
  • the siloxane group may be formed by a calcination process described below, but is not particularly limited thereto.
  • the porous silica particles may be modified on the surface and / or inside of the pores, and the modification may be performed by replacing the -OH functional group of the silanol group (Si-OH) It can mean something.
  • the kind of the cell fate regulating factor suitable for carrying can be changed depending on the kind of the functional group to be modified and the degree of modification, and the interaction of the porous silica particles with the release environment of the cell fate regulator is controlled, The rate can be controlled to control the release rate of the cell fate regulator and the binding of the cell fate regulator to the porous silica particles can be controlled to control the release of the factor by diffusion from the particles.
  • a chemical or biological modification method can be adopted, but the method can be carried out by a well-known method in the art.
  • Chemical modification method can be adopted.
  • the surface of the particles and the interior of the pores may be modified in the same manner or may be modified differently.
  • the modification may be carried out by reacting a compound having a hydrophilic, hydrophobic, cationic, or anionic substituent to be introduced with a particle, but is not limited thereto.
  • the modification may be carried out by supporting a cell fate regulator, , A substance carrying a substance for other purposes or the like, or a combination of other substituents, and the like.
  • the substituent may be selected from the group consisting of an antibody, a ligand, a cell permeable peptide, Lt; / RTI >
  • the compound may be, for example, an alkoxysilane having a C 1 to C 10 alkoxy group, but is not limited thereto.
  • the alkoxysilane is one having at least one of the above-mentioned alkoxy groups and may have, for example, 1 to 3 substituents, and may have a substituent to be introduced or a substituted substituent at a site where an alkoxy group is not bonded.
  • an alkoxysilane When the alkoxysilane is reacted with the porous silica particles, an alkoxysilane can be bonded to the surface and / or pores of the porous silicon particles by forming a covalent bond between the silicon atom and the oxygen atom, and the alkoxysilane has a substituent to be introduced The substituent may be introduced into the surface and / or pores of the porous silicon particles.
  • the reaction may be carried out by reacting the porous silica particles dispersed in a solvent with alkoxysilane.
  • the solvent may be water and / or an organic solvent, and the organic solvent may be an ether such as 1,4-dioxane (Especially cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Acetone, methyl isobutyl ketone,?
  • the reaction of the particles with the alkoxysilane can be carried out, for example, under heating, and the heating can be carried out at a temperature of, for example, 80 to 180 DEG C, for example 80 to 160 DEG C, 80 to 150 DEG C, 100 ° C to 160 ° C, 100 ° C to 150 ° C, 110 ° C to 150 ° C, and the like.
  • reaction of the particles with the alkoxysilane can be carried out, for example, for 4 to 20 hours, for example 4 to 18 hours, 4 to 16 hours, 6 to 18 hours, 6 to 16 hours , 8 hours to 18 hours, 8 hours to 16 hours, 8 hours to 14 hours, 10 hours to 14 hours, and the like.
  • the modification to the cationic substituent may be for positively charging the particles or for supporting the negatively chargeable cell fate regulating factor, for example, an alkoxysilane having a basic group such as an amino group, And the like.
  • an alkoxysilane having a basic group such as an amino group
  • Specific examples thereof include N- [3- (Trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine, N1- (3-Trimethoxysilylpropyl) diethylenetriamine, (3-Aminopropyl) trimethoxysilane, N- [3- propyl] silane, 3- (2-Aminoethylamino) propyldimethoxymethylsilane, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the modification to the anionic substituent may be for negatively charging the particles or for supporting the positively charged cell fate regulating factor, for example, an alkoxysilane having an acidic group such as a carboxyl group, a sulfonic acid group or a thiol group, And the reaction can be carried out.
  • an alkoxysilane having an acidic group such as a carboxyl group, a sulfonic acid group or a thiol group
  • the reaction can be carried out.
  • (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane can be used, but is not limited thereto.
  • the modification with a hydrophilic substituent has advantages in terms of ease of use and formulation of the composition of the present invention.
  • examples thereof include a carboxyl group, an amino group, a carbonyl group, a sulfhydryl group, a phosphate group, a thiol group, , An ester group, an imide group, a thioimide group, a keto group, an ether group, an indene group, a sulfonyl group, a polyethylene glycol group, or the like.
  • the modification to the hydrophobic substituent has an advantage of enhancing the binding force with the insoluble (hydrophobic) cell fate regulating factor, for example, a substituted or unsubstituted C 1 to C 30 alkyl group, a substituted or unsubstituted a C 3 to an ester group of the C 30 of the cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C 6 to C 30 aryl group, a substituted or unsubstituted C 2 to C 30 heteroaryl group, a halogen group, C 1 to C 30 of , A halogen-containing group, or the like.
  • trimethoxy (octadecyl) silane trimethoxy n-octylsilane, trimethoxy propyl silane
  • isobutyl trimethoxy silane trimethoxy (7-octen- silane, trimethoxy (2-phenylethyl) silane, vinyltrimethoxysilane, cyanomethyl, 3- (trimethoxysilyl) propyl] trithiocarbonate and (3-Bromopropyl) trimethoxysilane.
  • the modification may be carried out in combination, for example, two or more surface modification may be performed on the outer surface or inside the pores.
  • a compound containing a carboxyl group may be bonded to an amide group-introduced silica particle with an amide bond to change positively charged particles to have different surface characteristics, but the present invention is not limited thereto.
  • the reaction temperature, time, and the amount of the compound used in the modification may be selected depending on the degree of modification, and the reaction conditions may vary depending on the hydrophilicity, hydrophobicity, By controlling the hydrophilicity, hydrophobicity, and charge density of the porous silica particles, the release rate of the cell fate regulator can be controlled. For example, if the cell fate regulator has a strong negative charge at neutral pH, the reaction temperature can be increased or the reaction time can be extended to allow the porous silica particles to have a strong positive charge, But is not limited thereto.
  • the porous silica particles are biodegradable particles, and when they are administered into the body by supporting a cell fate controlling factor, they can release cell fate control factors while being biodegraded in the body, So that the supported fate of the cell factor can be released.
  • t at which the ratio of the absorbance of the following formula (1) is 1/2 is 20 or more:
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the 1 mg / ml suspension of the porous silica particles in a cylindrical permeable membrane having pores of 50 kDa in diameter, contacting the permeable membrane outside the permeable membrane, And the inside and the outside of the permeation membrane were stirred horizontally at 60 rpm at 37 ° C and the pH of the suspension was 7.4 and A t was the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • the above equation (1) means that the porous silica particles are decomposed at a certain rate in an environment similar to the body, and the absorbances A 0 and A t are obtained by, for example, putting the porous silica particles and suspension into a cylindrical permeable membrane, The same suspension may also be placed on the outside of the membrane.
  • the suspension may be a buffer solution, and may be at least one selected from the group consisting of, for example, PBS (phosphate buffered saline) and SBF (simulated body fluid), and more specifically, PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SBF simulated body fluid
  • the particles are biodegradable and can be slowly degraded in the suspension.
  • the diameter of 50 kDa corresponds to about 5 nm.
  • the biodegradable particles can pass through a permeation membrane having a diameter of 50 kDa and the cylindrical permeation membrane is under a horizontal stirring of 60 rpm. And the disintegrated particles can come out of the permeable membrane.
  • the absorbance in Equation (1) may be measured under an environment in which, for example, the suspension outside the permeable membrane is replaced with a new suspension.
  • the suspension may be constantly being replaced, replaced at regular intervals, and the period may be a periodic or irregular period. For example, in the range of 1 hour to 1 week, an interval of 1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days, 3 days, 4 days, 7 Day interval, etc., but is not limited thereto
  • the absorbance becomes half of the initial absorbance after t time, meaning that about half of the porous silica particles are decomposed.
  • T may be 20 or more, or 24 or more, for example, t is 20 to 120, for example, in which the ratio of the absorbance of the formula (1) is 1/2, and for example, 20 to 96, 20 to 72, 30 to 70, 40 to 70, 50 to 65, and the like.
  • the particle may have a ratio t of 1/5 of the absorbance of the formula (1), for example, 70 to 140, and for example, 80 to 140, 80 to 120, 80 to 110, 70 to 140 , 70 to 120, 70 to 110, and the like.
  • the particle may have a ratio of the absorbance of the formula 1 to 1/20, for example, 130 to 220, and may be within the range of, for example, 130 to 200, 140 to 200, 140 to 180, 150 to 180 And the like, but is not limited thereto.
  • the particle may have a t of, for example, not less than 250, such as not less than 300, not less than 350, not less than 400, not less than 500, not less than 1000, and the like, where the absorbance to be measured is 0.01 or less, But is not limited to.
  • the particle may have a Pearson correlation coefficient of 0.8 or more, for example, 0.9 or more, and 0.95 or more, for example, where the ratio of the absorbance of Equation 1 and t have a high positive correlation.
  • T represents the degree of decomposition of the porous silica particles at a certain rate in an environment similar to that of the body. This means that the surface area, the particle size, the pore diameter, the surface of the porous silica particles, and / The substituent, the degree of compactness of the surface, and the like.
  • the surface area of the particles can be increased to decrease t, or the surface area can be decreased to increase t.
  • the surface area can be controlled by controlling the diameter of the particles and the diameter of the pores. It is also possible to increase the t by placing substituents in the surface and / or pores to reduce the direct exposure of the porous silica particles to the environment (solvent, etc.). In addition, it is possible to increase t by reducing the direct exposure of the porous silica silica particles to the environment by supporting the cell fate regulator on the porous silica particles and increasing the affinity between the cell fate regulator and the porous silica particles. It is also possible to increase the t by fabricating the surface more densely during the production of the particles. While various examples have been described above for adjusting t in Equation 1, the present invention is not limited thereto.
  • the porous silica particles are particles of silica (SiO 2 ) and have a diameter of several nanometers to several micrometers in size.
  • the average diameter of the particles may be, for example, 100 nm to 1000 nm, and may be, for example, 100 nm to 800 nm, 100 nm to 500 nm, 100 nm to 400 nm, 100 nm to 300 nm, 100 nm to 200 nm, But is not limited to.
  • the porous silica particles are porous particles having nano-sized pores so that the above-described cell fate control factors can be carried in the pores or on the particle surfaces.
  • the average pore diameter of the particles may be, for example, from 1 nm to 100 nm. For example, within the above range, for example, 5 nm to 100 nm, 7 nm to 100 nm, 7 nm to 50 nm, 10 nm to 50 nm, 10 nm to 30 nm, But it is not limited thereto, and it can be preferably selected and adjusted in consideration of the amount and size of the cell fate control factor to be carried.
  • the form of the porous silica particles is not particularly limited to a specific form, but is preferably spherical in view of the original activity of interaction with the cells to be controlled.
  • the porous silica particles may have a BET surface area of, for example, 200 m 2 / g to 700 m 2 / g.
  • a BET surface area of, for example, 200 m 2 / g to 700m 2 / g.
  • 200m 2 / g to 650m 2 / g 250m 2 / g to 650m 2 / g
  • 300m 2 / g to 700m 2 / g 300m 2 / g to 650 m 2 / g
  • 300 m 2 / g to 550 m 2 / g 300 m 2 / g to 500 m 2 / g, 300 m 2 / g to 450 m 2 /
  • the volume of the porous silica particles per g may be, for example, 0.7 ml to 2.2 ml.
  • it may be within the range of 0.7 ml to 2.0 ml, 0.8 ml to 2.2 ml, 0.8 ml to 2.0 ml, 0.9 ml to 2.0 ml, 1.0 ml to 2.0 ml, and the like. If the volume per gram is too small, the rate of decomposition may become too high, and excessively large particles may be difficult to manufacture or may not have a perfect shape.
  • the porous silica particles are those having a surface charge, that is, particles whose zeta potential is not 0 mV. This inhibits the aggregation of particles due to the repulsive force between the particles modified by the same method, and enables the delivery of the cell fate control factors effectively supported on the target cells.
  • the value of the surface charge of the particle that is, the value of the zeta potential may be, for example, +1 to +150 mV or +2 to 130 mV when positively charged, and may be +3 to +100 mV But may be -150 to -1 mV or -130 to -10 mV when negatively charged, and may be -100 to -18 mV, but the value of the zeta potential is not limited to the particle And controlling the amount and the release rate of the cell fate regulator to be carried on the cell surface.
  • the porous silica particles may carry the above-described cell fate control factors on the surface and / or pores.
  • the support of the cell fate regulator on the particle can be carried out, for example, by mixing the porous silica particles in the solvent with the cell fate regulator, and the solvent can be water and / or an organic solvent, Ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; Carbon-based aromatic compounds such as benzene, toluene and xylene; Alkyl amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dibutylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; Alcohol
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • SBF Simulated Body Fluid
  • borate-buffered saline borate-buffered saline
  • Tris-buffered saline Tris-buffered saline, etc. may be used as the solvent.
  • the ratio of the porous silica particles to the cell fate controlling agent is not particularly limited and may be, for example, a weight ratio of 1: 0.05 to 0.8, such as 1: 0.05 to 0.7, 1: 0.05 to 0.6, 1: 0.1 to 0.8, 1: 0.1 to 0.6, 1: 0.2 to 0.8, 1: 0.2 to 0.6, and the like.
  • the porous silica particles can gradually release the cell fate control factors carried over a long period of time.
  • the cell fate control factors carried on the particles can be released by biodegradation of the particles, which can be slowly degraded to release sustained release of the cell fate control factors. This can be controlled, for example, by controlling the surface area, particle size, pore diameter, surface area and / or porosity of the porous silica particles, the degree of compactness of the surface, and the like.
  • the cell-destabilizing factor carried on the particle can be released while diffusing from the porous silica particle, which is affected by the relationship between the porous silica particle and the release environment of the cell fate regulator and the cell fate regulator , Which can regulate the release of cell fate regulators. For example, by enhancing or weakening the binding ability of the porous silica particles to the cell fate regulator by surface modification.
  • the surface and / or pore interior of the particle may have a hydrophobic substituent to increase the binding force between the particle and the cell fate regulator , Whereby the cell fate regulator may be released slowly.
  • the particle is surface-modified with an alkoxysilane having a hydrophobic substituent.
  • “poorly soluble” is a meant to include (for water) in that the insoluble (insoluble), substantially insoluble (practically insoluble) or very slightly soluble (only slightly soluble) This "Pharmaceutical Science,” 18 th Edition ( USP, Remington, published by Mack Publishing Company).
  • the water-insoluble cell fate controlling factor may be, for example, 1 g / L, specifically 5 g / L or less, more specifically less than 1 g / L at 25 ° C, but is not limited thereto.
  • the surface and / or pore interior of the particle may have a hydrophilic substituent to increase the binding force between the porous silica particle and the cell fate controlling factor, Regulatory factors can be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having a hydrophilic substituent.
  • the water soluble cell fate controlling factor may be, for example, 1 g / L or higher at 25 ° C at 1 atm, but is not limited thereto.
  • the surface and / or pore of the particle may be charged with the opposite charge to increase the binding force between the porous silica particle and the cell fate controlling factor, Cell fate regulators can be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having an acidic group or a basic group.
  • the cell fate regulator is positively charged at neutral pH, it may be that the surface and / or pore interior of the particle is negatively charged at a neutral pH, whereby the porous silica particles and the cell fate regulator The binding force is increased and the cell fate regulator may be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having an acidic group such as a carboxyl group (-COOH) or a sulfonic acid group (-SO 3 H).
  • the cell fate regulator is negatively charged at neutral pH, it may be positively charged on the surface and / or pores of the particle, thereby increasing the binding force between the porous silica particles and the cell fate regulator, Fate regulators can be released slowly.
  • the porous silica particles may be surface-modified with an alkoxysilane having a basic group such as an amino group or other nitrogen-containing groups.
  • the supported cell fate regulator may be released for a period of, for example, 7 days to 1 year or more depending on the release environment, the porous silica particles used.
  • the porous silica particles can be decomposed 100% as biodegradable, so that the cell fate regulating factor carried thereon can be 100% released.
  • the porous silica particles may be prepared by, for example, preparing particles of small pores and expanding the pores. If necessary, the porous silica particles may be subjected to a calcination process or a surface modification process . When both the calcination and the surface modification process are performed, the surface modification may be performed after the calcination.
  • the small pore particles may be, for example, particles having an average pore diameter of 1 nm to 5 nm, which can be obtained by adding a surfactant and a silica precursor to a solvent and stirring and homogenizing.
  • the solvent may be water and / or an organic solvent.
  • organic solvent include ethers (especially, cyclic ethers) such as 1,4-dioxane; Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Acetone, methyl isobutyl ketone,?
  • water and an organic solvent may be used in a volume ratio of 1: 0.7 to 1.5, for example, in a volume ratio of 1: 0.8 to 1.3, no.
  • the surfactant may be, for example, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), hexadecyltrimethylammonium bromide (TMABr), hexadecyltrimethylpyridinium chloride (TMPrCl), tetramethylammonium chloride (TMACl), and the like.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • TMABr hexadecyltrimethylammonium bromide
  • TMPrCl hexadecyltrimethylpyridinium chloride
  • TMACl tetramethylammonium chloride
  • the surfactant may be added in an amount of, for example, 1 g to 10 g per liter of solvent, for example, in the range of 1 g to 8 g, 2 g to 8 g, 3 g to 8 g, and the like.
  • the silica precursor may be added after stirring and adding a surfactant to the solvent.
  • the silica precursor may be, for example, TMOS (Tetramethyl orthosilicate), but is not limited thereto.
  • the stirring may be carried out, for example, for 10 minutes to 30 minutes, but is not limited thereto.
  • the silica precursor may be added, for example, in an amount of 0.5 ml to 5 ml per liter of solvent, for example, 0.5 ml to 4 ml, 0.5 ml to 3 ml, 0.5 ml to 2 ml, 1 ml to 2 ml, But may be further added with sodium hydroxide as a catalyst as needed, which may be added with stirring before addition of the surfactant to the solvent, followed by addition of the silica precursor.
  • the sodium hydroxide may be, for example, 0.5 ml to 8 ml per liter of solvent, for example 1 ml of sodium hydroxide solution, 0.5 ml to 5 ml, 0.5 ml to 4 ml, 1 ml to 4 ml, 1 ml to 3 ml, But is not limited thereto.
  • the solution can be reacted with stirring.
  • the stirring may be carried out for example for 2 hours to 15 hours, for example, within the above range for 3 hours to 15 hours, 4 hours to 15 hours, 4 hours to 13 hours, 5 hours to 12 hours, 6 hours to 12 hours , 6 hours to 10 hours, and the like, but is not limited thereto. If the stirring time (reaction time) is too short, nucleation may be insufficient.
  • the solution may be aged.
  • the aging can be carried out, for example, for 8 hours to 24 hours, for example within the above range, 8 to 20 hours, 8 to 18 hours, 8 to 16 hours, 8 to 14 hours, 10 to 16 hours , 10 hours to 14 hours, and the like, but is not limited thereto.
  • reaction product may be washed and dried to obtain porous silica particles, and if necessary, separation of the unreacted material may be preceded by washing, for example, by separating the supernatant liquid by centrifugation.
  • the centrifugation can be performed at, for example, 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example, 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 5 minutes To 30 minutes, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed using water and / or an organic solvent. Specifically, since the materials soluble in each solvent are different, water and an organic solvent may be used once or several times alternately. Alternatively, water or an organic solvent may be used once or several times It can be washed several times. The number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, for example, 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more or 6 or less, and the like.
  • the organic solvent includes, for example, ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Acetone, methyl isobutyl ketone,?
  • ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers)
  • Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane
  • Acetone methyl isobutyl ketone
  • the washing may be carried out under centrifugation, for example, at a speed of 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example 3 minutes to 30 minutes, Min to 30 min, 5 min to 30 min, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed by filtering the particles with a filter without centrifugation.
  • the filter may have pores smaller than the diameter of the porous silica particles.
  • the water and the organic solvent may be used once or several times at the time of the washing, and the water or the organic solvent may be washed once or several times.
  • the number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, for example, 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more or 6 or less, and the like.
  • the drying may be performed at, for example, 20 ° C to 100 ° C, but is not limited thereto, and may be performed in a vacuum state.
  • the pores of the obtained porous silica particles are expanded, which can be carried out using a pore-expanding agent.
  • pore-expanding agent for example, trimethylbenzene, triethylbenzene, tripropylbenzene, tributylbenzene, tripentylbenzene, trihexylbenzene, toluene, benzene and the like can be used. Specifically, trimethylbenzene can be used. But is not limited to.
  • the pore-expanding agent may be, for example, N, N-dimethylhexadecylamine (DMHA), but is not limited thereto.
  • DMHA N, N-dimethylhexadecylamine
  • the pore expansion can be performed, for example, by mixing porous silica particles in a solvent with a pore-expanding agent, and heating and reacting, for example, water and / or an organic solvent, Ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; Carbon-based aromatic compounds such as benzene, toluene and xylene; Alkyl amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dibutylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidon
  • the porous silica particles may be present in an amount of from 10 g to 200 g per liter of solvent, for example from 10 g to 150 g, 10 g to 100 g, 30 g to 100 g, 40 g to 100 g, 50 g to 100 g, 50 g to 80 g, But the present invention is not limited thereto.
  • the porous silica particles may be uniformly dispersed in a solvent, for example, the porous silica particles may be added to a solvent and ultrasonically dispersed.
  • the second solvent may be added after dispersing the porous silica particles in the first solvent.
  • the pore-expanding agent may be, for example, 10 to 200 parts of skin to 100 parts of skin, 10 to 150 parts of skin, 10 to 100 parts of skin, 10 to 80 parts of skin, 30 to 80 parts of skin, 70 parts skin, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the reaction can be carried out, for example, at 120 ° C to 180 ° C.
  • 120 ° C to 180 ° C For example, within the above-mentioned range, it is possible to use a temperature of 120 to 170 ° C, 120 to 160 ° C, 120 to 150 ° C, 130 to 180 ° C, 130 to 170 ° C, 130 to 160 ° C, 130 to 150 ° C, But is not limited thereto.
  • the reaction can be carried out, for example, for 24 hours to 96 hours.
  • 24 hours to 96 hours For example, within the above range from 30 hours to 96 hours, 30 hours to 96 hours, 30 hours to 80 hours, 30 hours to 72 hours, 24 hours to 80 hours, 24 hours to 72 hours, 36 hours to 96 hours, 36 48 hours to 48 hours, 48 hours to 80 hours, 48 hours to 72 hours, and the like, for example, from 1 hour to 80 hours, 36 hours to 72 hours, 36 hours to 66 hours, 36 hours to 60 hours, But is not limited thereto.
  • the reaction time may be increased when the reaction temperature is lowered, or the reaction time may be shortened when the reaction temperature is lowered. If the reaction is insufficient, the expansion of the pores may not be sufficient, and if the reaction proceeds excessively, the particles may collapse due to over-expansion of the pores.
  • the reaction can be carried out, for example, by raising the temperature stepwise. Specifically, it can be performed by raising the temperature from room temperature to the temperature stepwise at a rate of 0.5 ° C / min to 15 ° C / min, for example, within a range of 1 ° C / min to 15 ° C / Min to 15 ° C / min, 3 ° C / min to 12 ° C / min, 3 ° C / min to 10 ° C / min, and the like.
  • the reaction solution may be gradually cooled, for example, it may be cooled stepwise. Specifically, it may be performed by gradually warming the temperature to room temperature at a rate of 0.5 ° C / minute to 20 ° C / minute.
  • the temperature may be 1 ° C / minute to 20 ° C / 20 ° C / min, 3 ° C / min to 12 ° C / min, 3 ° C / min to 10 ° C / min, and the like.
  • reaction product is washed and dried to obtain pore-expanded porous silica particles.
  • the separation of the unreacted material may be preceded by washing before washing, for example, by separating the supernatant by centrifugation.
  • the centrifugation can be performed at, for example, 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example, 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 5 minutes To 30 minutes, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed using water and / or an organic solvent.
  • water and an organic solvent may be used once or several times alternately.
  • water or an organic solvent may be used once or several times It can be washed several times.
  • the number of times may be, for example, two times or more and ten times or less, for example, three times, four times, five times, six times, seven times, eight times, and the like.
  • the organic solvent includes, for example, ethers such as 1,4-dioxane (particularly, cyclic ethers); Halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, dichloroethylene, trichlorethylene, perchlorethylene, dichloropropane, amyl chloride and 1,2-dibromoethane; Ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, and cyclohexanone; Carbon-based aromatic compounds such as benzene, toluene and xylene; Alkyl amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dibutylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; Alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; Etc., and specifically ethanol, more specifically ethanol, may be used, but the present invention
  • the washing may be carried out under centrifugation, for example, at a speed of 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 minutes to 60 minutes, for example 3 minutes to 30 minutes, Min to 30 min, 5 min to 30 min, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed by filtering the particles with a filter without centrifugation.
  • the filter may have pores smaller than the diameter of the porous silica particles.
  • the water and the organic solvent may be used once or several times at the time of the washing, and the water or the organic solvent may be washed once or several times.
  • the number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, for example, 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more or 6 or less, and the like.
  • the drying may be performed at, for example, 20 ° C to 100 ° C, but is not limited thereto, and may be performed in a vacuum state.
  • the resulting particles can then be calcined, which is a process in which the particles are heated to have a more dense structure on the surface and inside thereof, and to remove organic materials that fill the pores.
  • the calcination process can be performed, for example, at 400 ° C to 700 ° C for 3 hours to 8 hours, specifically at 500 ° C to 600 ° C for 4 hours to 5 hours, but is not limited thereto.
  • porous silica particles can be modified in the surface and / or inside of the pores in the manner described above.
  • the porous silica particles may also be prepared by, for example, preparing particles of small pores, expanding pores, modifying the surface, or modifying pores inside.
  • the particle preparation and the pore expansion of the small pores may be performed by the processes described above, and then the cleaning and drying processes may be performed.
  • the separation of the unreacted material may be preceded by washing before washing, for example, by separating the supernatant by centrifugation.
  • the centrifugation may be performed at, for example, 6,000 to 10,000 rpm, for example, 3 minutes to 60 minutes, specifically 3 minutes to 30 minutes, 3 minutes to 30 minutes, 5 minutes To 30 minutes, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the cleaning after the particle preparation of the small pores may be carried out by any method / condition within the range exemplified above, but is not limited thereto.
  • the purging after the pore expansion can be performed under more relaxed conditions than in the previous examples. For example, washing may be performed within 3 times, but is not limited thereto.
  • the surface and / or pore interior modification of the particles can be performed by the method described above, and the process can be performed in the order of surface modification and pore interior modification, and a cleaning process of the particles is further performed between the two processes .
  • the inside of the pores are filled with the reaction liquid such as the particles used for the preparation of the particles and the pore expansion, Only the surface can be modified. The particles may then be washed to remove the reaction liquid inside the pores.
  • the washing of the particles between the surface modification and the pore interior modification process may be performed using water and / or an organic solvent. Specifically, since the materials soluble in each solvent are different, water and an organic solvent may be used once or several times, Water or an organic solvent can be washed once or several times. The number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, specifically 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more, 6 or less, and the like.
  • the washing may be carried out under centrifugation, for example, at 6,000 to 10,000 rpm, for example, for 3 to 60 minutes, specifically for 3 to 30 minutes, Min to 30 min, 5 min to 30 min, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the washing may be performed by filtering the particles with a filter without centrifugation.
  • the filter may have pores smaller than the diameter of the porous silica particles.
  • the water and the organic solvent may be used once or several times at the time of the washing, and the water or the organic solvent may be washed once or several times.
  • the number of times may be, for example, 2 or more, 10 or less, specifically 3 or more and 10 or less, 4 or more or 8 or less, 4 or more, 6 or less, and the like.
  • the drying may be performed at, for example, 20 ° C to 100 ° C, but is not limited thereto, and may be performed in a vacuum state.
  • the cells to be subjected to fate control may be all cells and all stem cells.
  • embryonic stem cells, adult stem cells, pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells A cell, a skin cell, a lymphocyte, a bone marrow cell, a neural progenitor cell, a spinal cord cell, an adipocyte, a hepatocyte, a skin cell, a blood cell, a myeloblast, a fibroblast, an endothelial cell, a neuron, a muscle cell, Cells, bone cells, oral cells, periodontal cells, hair follicle cells, mucosal cells, epithelial cells, mesenchymal cells, mesenchymal cells, placental cells, cord blood cells, hematopoietic stem cells, gastrointestinal cells, amniotic cells, retinal cells, Cells, vascular cells, and lung cells, but it is possible to control at what stage the cell fate control factor is carried or the fate of the
  • composition of the present invention is intended to regulate the fate of a subject cell.
  • the composition comprising the porous silica particles carrying the cell fate control factor is treated with a culture medium for culturing the above-mentioned various cells to differentiate Or differentiated into fully differentiated cells, and the cells in differentiation or fully differentiated cells can be differentiated into cells in the undifferentiated stage, or the specific differentiated cells can be directly differentiated into other specific differentiated cells.
  • the cell fate control of the compositions of the present invention is highly efficient and the success rate is also very high.
  • 5 to 80%, 5 to 75%, 5 to 70%, 5 to 65%, 5 to 60%, 5 to 55%, 5 to 50% in the case of positive differentiation May be 0.0001 to 10%, 0.0001 to 9%, 0.0001 to 8%, 0.0001 to 7%, 0.0001 to 6%, 0.0001 to 5%, 0.0001 to 4%, 0.0001 to 3%, 0.0001 to 2% 5 to 90%, 5 to 85%, 5 to 80%, 5 to 75%, 5 to 70%, 5 to 65%, 5 to 60%.
  • the present invention also provides a method for regulating cell fate, comprising the step of treating the above-mentioned composition with cells subject to fate control.
  • the porous silica particles of the present invention may be named DDV or MSN
  • the surface-modified porous silica particles may be named ADDV or mDDV
  • the porous silica particles surface-modified with amino group may be named ADDV or AMSN, respectively.
  • reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C, and washed five times with ethanol and distilled water alternately.
  • microporous porous silica particles 1.5 g were added to 10 ml of ethanol and ultrasonically dispersed. 10 ml of water and 10 ml of trimethyl benzene (TMB) were added and ultrasonically dispersed.
  • TMB trimethyl benzene
  • the reaction was carried out by starting at 25 ° C and heating at a rate of 10 ° C / min and then slowly cooling down at a rate of 1 to 10 ° C / min in an autoclave.
  • the cooled reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C to remove supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C, and washed five times with ethanol and distilled water alternately.
  • the porous silica particles prepared in 2) were placed in a glass vial and heated at 550 ° C for 5 hours. After completion of the reaction, the particles were gradually cooled to room temperature to prepare particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that the reaction conditions at the time of pore expansion were changed to 140 ⁇ and 72 hours.
  • porous silica particles were prepared in the same manner as in item (1) of Example 1-9, except that a 5-fold vessel was used and all the materials were used in a 5-fold volume.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that 920 ml of distilled water and 850 ml of methanol were used in the preparation of the small pore particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that 800 ml of distilled water, 1010 ml of methanol and 10.6 g of CTAB were used in the preparation of small pore particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1), except that 620 ml of distilled water, 1380 ml of methanol and 7.88 g of CTAB were used in the preparation of the small pore particles.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 2.5 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 4.5 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 6.5 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in Example 1- (1) except that 11 mL of TMB was used at the time of pore expansion.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in item (1) of Example 1-9, except that TMB was used in the pore expansion of 11.8 mL.
  • Porous silica particles were prepared in the same manner as in item (1) of Example 1-9 except that TMB was used at 12.5 mL at the time of pore expansion.
  • Example 1- (1) -2 The small pore particles were reacted with TMB in the same manner as in Example 1- (1) -2), cooled, and centrifuged to remove the supernatant. Thereafter, the mixture was centrifuged under the same conditions as in Example 1- (1) -2), washed three times with ethanol and distilled water alternately, and then dried under the same conditions as in Example 1- (1) -2) Silica particles (pore diameter 10 to 15 nm, particle diameter 200 nm) were obtained.
  • the reaction solution in the previous step remains in the pores, and the inside of the pores are not modified.
  • the cooled reaction solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 DEG C, and washed five times with ethanol and distilled water alternately.
  • Example 1- (4) The porous silica particles of Example 1- (4) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to positively charge.
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • porous silica particles were dispersed in 10 mL of toluene in a 100 mL round bottom flask with a bath sonicator. Then, 1 mL of APTES was added, and the mixture was stirred at 400 rpm and stirred at 130 DEG C for 12 hours.
  • the mixture was slowly cooled to room temperature, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 ° C, and washed 5 times with ethanol and distilled water.
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and charged positively. 0.4 ml of APTES was added and the reaction time was changed to 3 hours Was modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 3-(8) The porous silica particles of Example 1- (8) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and charged positively, and were modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 1- (9) The porous silica particles of Example 1- (9) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to positively charge and were modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 1- The porous silica particles of Example 1- (10) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and charged positively, and were modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 1- (11) The porous silica particles of Example 1- (11) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to charge positively, and were modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 1- (12) The porous silica particles of Example 1- (12) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and charged positively, and were modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • Example 1- (1) -1) Porous silica particles subjected to the procedure of Example 1- (1) -1) and then subjected to the procedure of Example 1- (1) -3) were reacted with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) The method was modified in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane
  • the porous silica particles of Example 2- (1) -3) -2 were charged and positively charged by reacting with glutaraldehyde (GA).
  • porous silica particles were dispersed in 10 mL of distilled water in a 100 mL round bottom flask with a bath sonicator. Then, 10 mL of GA was added, and the mixture was stirred at 400 rpm at room temperature for 24 hours.
  • the supernatant was removed by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 ° C, and washed 5 times with distilled water.
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with trimethoxy (propyl) silane to introduce a propyl group into the surface and pores, except that 0.35 ml of trimethoxy (propyl) silane was added instead of APTES and reacted for 12 hours , The modification was carried out in the same manner as in Example 2- (1).
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with trimethoxy-n-octylsilane to introduce a propyl group into the surface and pores, except that 0.5 ml of trimethoxy-n-octylsilane was added instead of APTES and the reaction was carried out for 12 hours , The modification was carried out in the same manner as in Example 2- (1).
  • Example 1- (1) The porous silica particles of Example 1- (1) were reacted with succinic anhydride to negatively charge.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 80 mg of succinic anhydride was added instead of APTES, (1) -1), except that DMSO was used instead of distilled water at the time of washing.
  • Example 2- (3) -2 100 mg of the porous silica particles of Example 2- (3) -2) was dispersed in 1 mL of 1 M aqueous sulfuric acid solution and 20 mL of 30% aqueous hydrogen peroxide, stirred at room temperature to induce oxidation reaction, and the thiol group was oxidized with a sulfonic acid group. Thereafter, it was washed and dried in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • porous silica particles were dispersed in 10 mL of distilled water in a 100 mL round bottom flask with a bath sonicator. Then, 3 mL of THMP and 1.5 mL of 1 M HCl aqueous solution were added and stirred at 400 rpm at 130 ° C for 24 hours.
  • the mixture was slowly cooled to room temperature, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 25 ° C, and washed 5 times with distilled water.
  • Example 1- (1) 100 mg of the porous silica particles of Example 1- (1) were dispersed in 20 ml of N, N'-disuccinimidyl carbonate (DSC) solution having a concentration of 50 ⁇ g / ml and stirred at room temperature to bind the surface of the porous silica particles with DSC.
  • the particles were washed three times with 10 ml of distilled water, and 10 mg of PEG (HO-PEG-NH 2 ) having a molecular weight of 4 kDa and an amino group at the end were dispersed in 10 ml of the above solution.
  • the mixture was stirred at room temperature to obtain a porous silica particle surface So that the PEG can be connected. Thereafter, it was washed and dried in the same manner as in Example 2- (1) -1).
  • a CYC solution (1 mM dimethyl sulfoxide (DMSO)) was added to 100 ⁇ g of the porous silica particles of Example 2- (2) -2) in 1 ml of distilled water, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours and then loaded.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • BMP-4, KGF, bFGF, FgF, Wnt, Nanog, or Noggin (10 ⁇ g) were mixed in 1 ml of 1 ⁇ PBS at the same concentration as that in Example 2- (3) And then loaded at 4 ° C for 4 hours.
  • SEQ ID NO: 5 Sox2 (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7), Klf4 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 9) were added to 12.5 mu g of the porous silica particles of Example 2- (SEQ ID No. 10), Nanog (SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13) or hTERT (SEQ ID No. 14), 0.25 ⁇ g of linear DNA or mRNA, Lt; / RTI >
  • miRNA family miRNA family
  • FIG. 1 is a photograph of the porous silica particles of Example 1- (1)
  • FIG. 2 is a photograph of the porous silica particles of Example 1- (2) to confirm that spherical porous silica particles sufficiently expanded in pore size Can,
  • Fig. 3 is a photograph of small pore particles of Example 1- (1)
  • Fig. 4 is a photograph of small pore particles of Example 1- (1) and Example 1- (3) Is generated evenly.
  • Example 1- (1) Porosity of small pore particles of Example 1- (1), Examples 1- (1), (7), (8), (9), (11), Example 2- (1) -2)
  • BET Brunauer-Emmett-Teller
  • BJH Barrett-Joyner-Halenda
  • porous silica particles were dispersed in 1 ml of PBS (pH 7.4), transferred to a disposable folded capillary cell (DTS1070), and the zeta potential was measured after mounting on a zeta potential measuring apparatus.
  • Example 3- (2) to (5) After loading various porous silica particles with various cell fate control factors in the same manner as in Example 3- (2) to (5), the absorbance of the supernatant was measured, the supernatant was dyed with a dye, The fluorescence intensity of the supernatant was analyzed to determine the amount of the cell fate regulator and the supporting ratio was calculated.
  • the retinoic acid was loaded on the porous silica particles of Example 1- (1), (11), and Example 2- (1) -2) -1 and 6 and the absorbance of the supernatant was measured to determine the amount of retinoic acid And calculate the coverage ratio.
  • retinoic acid solution 50 mM ethanol
  • retinoic acid solution 50 mM ethanol
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for 4 hours to be loaded.
  • Absorbance was measured at?
  • Ab 350 nm to determine retinoic acid
  • Amount of retinoic acid amount of first retinoic acid - amount of retinoic acid remaining in the supernatant
  • the various cell fate regulators according to the above experimental method have a supporting ratio (cell fate regulator / porous silica particles) in the porous silica particles, w / w%).
  • Cell fate regulator The zeta potential of porous silica particles (mV) (W / w%) Low molecule Positive charge at neutral pH 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR99021, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, etc.
  • Negative charge at neutral pH nodal Brn2, Mytll, NeuroDl, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOX9, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, c-Myc, insulin, FGF9, Interleukins, etc. +5 to +45 5 to 60
  • Nucleic acid Negative charge at neutral pH plasmid DNA linear DNA, miRNA (miR-124, miR-9, miR9 *, miR-302, miR-367, miR-21, etc.) +5 to +45 5 to 40
  • retinoic acid 8 With respect to retinoic acid 8, when retinoic acid support ratio is higher when the average diameter of the pores is 19 nm than when the average diameter of the pores is 2 nm, and when the surface or pore interior of the porous silica particles is modified with an amino group The retention ratio of retinoic acid is higher than that of the retinoic acid.
  • the pore size and surface modification of the porous silica particles included in the composition of the present invention are factors affecting the retention of cell fate control factors including retinoic acid.
  • a 0 is the absorbance of the porous silica particles measured by placing 5 ml of the 1 mg / ml suspension of the porous silica particles in a cylindrical permeable membrane having pores of 50 kDa in diameter, contacting the permeable membrane outside the permeable membrane, And the inside and outside of the permeation membrane is stirred horizontally at 60 rpm at 37 ⁇ and A t is the absorbance of the porous silica particles measured after passage of time t from the measurement of A 0 ).
  • porous silica particle powder 5 mg was dissolved in 5 ml of SBF (pH 7.4). Thereafter, 5 ml of the porous silica particle solution was placed in the permeable membrane having the pore diameter of 50 kDa shown in Fig. 15 ml of SBF was added to the outer membrane, and SBF of the outer membrane was replaced every 12 hours.
  • the absorbance of the porous silica particles of Example 1- (4) was measured by pH. Absorbance was measured in SBF and in Tris at pH 2,5, 7.4, and the results are shown in FIG. As a result, there was a difference of t by pH, but all samples had a t of 20 or more, in which the ratio of the absorbance was 1/2.
  • the absorbance of the porous silica particles of Example 2- (1) -1) was measured, and the results are shown in FIG. 15 (using Tris (pH 7.4) as a suspension and a solvent). Referring to this, the positively charged particles had a t value of 20 or more, in which the ratio of the absorbance was 1/2.
  • HepG2 cells were plated on a 96-well plate at a rate of 10,000 cells / well. After 24 hours, the cells of Example 2- (3) -4) were sequentially dispersed from low to high concentration for 24 hours. Cell counting kit (CCK) , Survival rate of HepG2 cells was confirmed (Fig. 16), and the survival rate of the Example 2- (1) -2) -6 particles was observed in the same method mES (mouse stem cells) for 48 hours 17).
  • CCK Cell counting kit
  • the composition containing the porous silica particles of the present invention had little effect on the survival rate of the HepG2 cell line and the mES cell line regardless of the concentration, and thus it can be confirmed that there is no cytotoxicity.
  • TAMSN 19 was prepared in a pre-optimized manner and treated with mES cells and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 for 48 hours. Prior to sampling, the cells were treated with Hoechst 33342 for nuclear staining and after 15 minutes the medium was removed. The cells were then washed twice with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde. Each medium was observed in Deltavision (GE healthcare) and confirmed intracellular delivery of TAMSN 19 in the medium. The image was obtained repeatedly in various planes perpendicular to the z-axis. Fluorescence correlation analysis was performed by line profiling of z-plane image # 3, which represents the clearest image of nuclei and porous silica particles in the media structure.
  • Human fibroblasts, HepG2 cells, HeLa cells, lymphocytes, bone marrow cells, human embryonic stem cells, and human neural progenitor cells were inoculated on a cell culture plate and cultured in a culture medium commonly used for each cell culture.
  • TAMRA dye or FITC-labeled particles carrying the cell fate control factors of Example 3 were used.
  • the particles prepared by the pre-optimized method were treated with the cells and cultured at 37 ° C under 5% carbon dioxide for 24 hours. Prior to sampling, the cells were treated with Hoechst 33342 for nuclear staining and after 15 minutes the medium was removed. The cells were then washed twice with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde. Each medium was observed in Deltavision (GE healthcare), and fluorescence signals corresponding to TAMRA or FITC were observed with a confocal microscope.
  • TAMRA dye or FITC-labeled particles carrying the cell fate control factors of Example 3 were used.
  • AMSN 19 is to (18) observing whether efficiently reach the target cells, were prepared for the convenience 5-carboxytetramethylrhodamine (5-TAMRA) AMSN 19 (TAMSN 19)
  • 5-TAMRA 5-carboxytetramethylrhodamine
  • TAMSN 19 5-carboxytetramethylrhodamine
  • the dye is combined. All of the treatment of the particles, mES cells were cultured under a feeder-free system assisted by a gelatin coating on the surface of the culture plate to facilitate maintenance of the appropriate undifferentiated growth conditions. The undifferentiated state of the cells was confirmed by the formation and maintenance of colony-like features. Cells were treated with 20 ⁇ g / mL of TAMSN 19 and incubated with stem cell assay serum. Under these conditions, the cells clearly maintained their colony formation, and the location of TAMSN 19 was observed in the colonies.
  • 5-TAMRA 5-carboxytetramethylrhodamine
  • the intracellular intake of RA / MSN complexes was revealed by fluorescence correlation analysis based on fluorescent cell images, which was possible with z-sectioned imaging technique using Deltavision TM imaging equipment (Fig. 19).
  • the particle (red) was mainly observed in cytoplasm (blue).
  • Successful internalization of the particles in a single mES cell was confirmed by TEM imaging and confirmed that the particle was successfully located in the cytoplasmic region without clinging to the surface of the cell and approaching the nucleus (an empty spot indicated by a black, red arrow) (Fig. 20).
  • TEM Transmission Electron Microscope
  • 5-carboxytetramethylrhodamine (5-TAMRA) dye or FITC-labeled particles were prepared, and human fibroblasts (Figure 22A), HepG2 cells (Figure 22B), HeLa cells (Fig. 22C), lymphocytes (Fig. 23A), bone marrow cells (Fig. 23B), human embryonic stem cells (Fig. 24A) and human neural progenitor cells
  • TAMRA 5-carboxytetramethylrhodamine
  • each RA / MSN complex produced by incubation in RA solution for 4 hours was suspended in 5% ethanol in PBS and incubated at 37 ° C for up to 10 days.
  • the calculated values of RA released from the complex were derived by analyzing the change in UV absorbance at 350 nm of the RA solution supernatant of each sample. The UV absorption peak was measured every second and the calculated amount of RA was added to each of the previous data.
  • Neural induction of mES cells was performed by addition of RA or RA / AMSN 19 complex.
  • 10 -6 M RA or 25 ⁇ g RA / AMSN 19 (corresponding to 3 ⁇ 10 -6 M with RA) were treated with mES cells with complete mES medium for 2 days. Groups without induction were cultured as negative control. Two days later, the medium was replaced with neuronal cell culture medium N2B27. The badge was replaced every other day.
  • Embryonic stem cells were cultured in RPMI medium containing 100 ng / ml activin A (ActA) and 25 ng / ml Wnt3a for one day. The next day, the cells were exchanged with a medium containing 0.2% FBS and ActA 100 ng / ml, followed by culturing for two days. Cells were then washed in PBS and cultured for 3 days in RPMI medium containing 2% FBS and 25-50 ng / ml KGF.
  • the cells were exchanged with DMEM medium containing 1% B27 additive, KAAD-cyclopamine (CYC) 0.25 ⁇ M, retinoic acid (RA) 2 ⁇ M and Noggin (Nog) 50 ng / ml and cultured for 3 days. Then, the cells were exchanged with DMEM medium containing 1% B27 additive. The above steps were performed by sequentially replacing the medium itself.
  • the differentiation inducing substances ActA, Wnt, KGF, RA, Cyc, Nog
  • Embryonic stem cells are seeded on Matrigel-coated plates at a density of 1 x 10 5 cells / cm 2 and cultured for 6 days in MEF-CM medium containing 8 ng / ml bFGF / FGF. Subsequently, 100 ng / ml of activin A (ActA) was treated for 1 day in MEF-CM medium containing RPMI-B27, and 10 ng / ml of BMP4 was treated for 4 days. Then, every 2 to 3 days for 2 to 3 weeks were replaced with fresh RPMI-B27 medium. The differentiation inducing substances added in the above step were carried in the appropriate combination of DDV in each step and treated with the cells. After 14 days, the induction efficiency of myocardial cell differentiation was measured by the expression of cardiac troponin T (cTnT) (Fig. 35).
  • cTnT cardiac troponin T
  • DNAs were prepared by amplifying human Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, c-myc, and TERT of Example 3 into pcDNA3 (Life technologies) plasmid backbone by PCR followed by digestion with appropriate restriction enzymes and ligase binding (Fig. 36).
  • PCR was performed under conditions of 3 min, 35 cycles at 94 ° C for 10 s, 60 ° C for 60 s, 65 ° C for 50 s per kb, and finally 65 ° C for 3 min.
  • IVT-RNA in vitro transcription-RNA
  • IVT-RNA in vitro transcription-RNA
  • V. virion-derived capping enzyme and 2'-O-methyltrasferase was attached using the mScript ⁇ polymerase enzyme kit (Epicenter Biotechnologies).
  • the purified RNA was purified using GeneJet RNA purification kit (Thermo Fisher).
  • the purified mRNAs (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog and hTERT) were treated with the same amount of mRNA mixture or GFP mRNA in DDV-loaded form (Example 3).
  • Fibroblast human foreskin fibroblast
  • Cells were cultured for 24 h at 5% O 2 prior to transfection. Prior to transfection, the cell culture medium was replaced with OPTI-MEM basal media (Life Technologies).
  • hMCSF and polymixin B were used to differentiate into macrophages.
  • This macrophage was treated with LPS (1 microgram / ml) and IFN-gamma (20 ng / ml) and polarized with M1 type macrophages.
  • miR-21 RNA was loaded on the inside of DDV and treated in culture medium. After cells were fixed with 4% paraformaldehyde, cells were blocked with 10% (v / v) FBS and 0.01% (v / v) Tween-20 in PBS for 30 minutes, -FSP1 antibody 1: 400) at 4 < 0 > C overnight.
  • a secondary antibody (Anti-Rat IgG, 1: 1000 / Anti-rabbit IgG, 1: 1000) corresponding to each antibody was applied. After incubation for 2 hours at room temperature, the samples were washed twice with PBS and each cover glass was removed from the culture plate and mounted with a Vectashield mounting solution containing DAPI. The prepared cells were analyzed for fluorescence signal using a confocal microscope to determine the efficiency of direct sequencing.
  • each primer was designed considering that the GC content was less than 50% and overlapped between the two exons of the target gene. The sequence of the primers is shown in Table 3 below.
  • OCT4 Forward (SEQ ID NO: 1) 5'-GCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGC-3 ' Reverse (SEQ ID NO: 2) 5'-GCCTCATACTCTTCTCGTTGGGA-3 ' Tuj1 Forward (SEQ ID NO: 3) 5'-TCAGCGATGAGCACGGCATA-3 ' Reverse (SEQ ID NO: 4) 5'-CACTCTTTCCGCACGACATC-3 '
  • mES cells were plated on gelatin coated cover glass and treated with RA or RA / MSN to perform the neural differentiation described above. After blocking with 4% paraformaldehyde, the cells were blocked with 10% (v / v) FBS and 0.01% (v / v) Tween-20 for 30 minutes. Then, primary antibodies (Tuj1: Rat anti- Tuj1, 1: 200 / OCT4: Rabbit anti-OCT4, 1: 100) overnight at 4 ° C. After washing twice with PBS, a secondary antibody (Anti-Rat IgG, 1: 1000 / Anti-rabbit IgG, 1: 1000) corresponding to each antibody was applied. After incubation for 2 hours at room temperature, the samples were washed twice with PBS and each cover glass was removed from the culture plate and mounted with a Vectashield mounting solution containing DAPI.
  • OCT4 pluripotency marker
  • ß-III tubulin Tuj1, neuronal specific marker
  • Relative gene expression level analysis showed that OCT4 expression levels decreased in both RA and RA / AMSN 19 samples, but decreased in Tujl samples. Specifically, the sample treated with RA / AMSN 19 for 2 days showed a much greater increase in Tuj1 expression than the sample treated with RA alone at about 2.5 times.
  • RA / AMSN 19 -induced cells showed almost 90% cell conversion efficiency , And about 30% cell conversion efficiency in RA alone group.
  • the axonal elongation analysis results of the group treated with RA / AMSN 19 which is about 4 times longer than that of the control group, can be confirmed.
  • pancreatic endoderm cells that had undergone differentiation induction was removed and washed with 200ul PBS (1x). At this time, care was taken not to completely dry the cells.
  • 200 ⁇ l of permeabilization buffer was added to increase the permeability of the membrane at room temperature for 20 minutes. Buffer was removed, PBS was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes and washed. This procedure was repeated three times in total.
  • PBS containing HNF6 and PDX1 primary antibodies was added for primary staining. Secondary staining was performed with PBS containing fluorescently labeled secondary antibodies. Respectively. Confocal microscopy was used to count the number of cells positive for HNF6 and PDX1.
  • pancreatic endoderm cells that had undergone differentiation induction was removed and washed with 200ul PBS (1x). At this time, care was taken not to completely dry the cells. Fixed with 200ul paraformaldehyde (PFA) fixation buffer for 20 minutes at room temperature and washed three to five times with PBS. 200 ⁇ l of permeabilization buffer was added to increase the permeability of the membrane at room temperature for 20 minutes. Buffer was removed, PBS was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes and washed. This procedure was repeated three times in total. 4% BSA blocking buffer was added and incubated for 45 min.
  • PFA paraformaldehyde
  • PBS containing cTnT primary antibodies was added for primary staining, followed by secondary staining with PBS containing fluorescent labeled secondary antibodies. Confocal microscopy was used to count the number of cells that were positive for cTnT.
  • Table 4 shows that when DNA or mRNA of Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, or Tert is carried on DDV and transferred to adult cells such as fibroblasts or hemocytes, a high inversion rate of DNA and mRNA regardless of bp length As shown in FIG. This is believed to be due to stabilization and sustained and sustained release of the factors through the porous silica particles which the composition of the present invention contains.

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Abstract

본 발명은 세포 운명 조절 인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물 및 이를 다양한 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법에 대한 것으로서, 세포 운명 조절 인자를 안정적인 타겟 수용체에의 전달하고, 전달 대상 세포에의 독성을 감소시키며, 서방적이고 99중량% 이상의 방출을 통해 효과적으로 대상세포의 운명을 조절할 수 있다.

Description

세포 운명 조절용 조성물
본 발명은 세포 운명 조절용 조성물 및 세포 운명 조절방법에 관한 것이다.
레티노산(Retinoic acid, RA) 매개 신경 분화 방법은 마우스 배아 줄기세포(mES)에 작은 분자가 결합하며 이루어지는 것으로 잘 알려진 세포 전환 방법 중 하나이다. RA가 세포질에 투여될 때, RA는 핵막에 위치한 RA 수용체(RAR) 헤테로다이머에 결합하고, 그 복합체는 신경 발생 및 축삭 성장을 유도하는 신호 전달 경로를 활성화시킨다. mES 세포로부터 신경 분화를 발생하기 위해 몇 가지 전략이 도입되었는데, 가장 일반적인 방법 중 하나는 -4/+4 RA 방법으로서, 4일 동안의 세포들을 분화 단계로 활성화시키기 위한 배아체(EB) 형성 후 4일 동안의 RA 처리를 통한 신경 유도를 포함한다. 광범위한 적용은 상기 방법에 대한 다양한 수정을 통해 이루어졌으나, 제한된 EB 체적, 실행 불가능한 배지 교환 및 복잡한 과정과 같은 EB의 형성을 유도하기 위한 hanging drop 배양 공정의 관점에서 몇가지 단점이 존재한다. 다른 RA 기반 방법은 또한 mES 세포의 단층 배양물에 RA의 지속적 첨가로서 성공적으로 부착성 mES 세포 콜로니와 신경 분화를 유도했으나, RA의 지속적 첨가는 비활성화 된 mES 세포의 신경 유도를 위해 RAR과 상호작용하는 RA의 충분한 양을 지속적으로 공급해야한다는 점과 같은 몇 가지 한계점이 여전히 존재한다.
RA가 신경 분화를 위한 핵심 요소 중 하나로서 작용하지만, 수용액 내 용해도가 낮고, 세포 대사에 의한 급속한 분해와 같은 몇 가지 단점을 극복해야 한다. 또한, 원하는 세포 전환을 위해 RA 농도를 미세하게 조절해야 한다. 뉴런에서부터 심근 세포 분화에 이르기까지 RA에 의해 매개되는 유도된 세포의 운명은 RA의 농도에 크게 의존한다는 보고가 있다. 또한, RA는 확산을 통해 세포막에 통합되기 때문에, RA-RAR 상호작용과 관련된 확률론적인 동력학은 농도 의존적이다. 그러나, 신경 분화 과정에서 약물 농도(>10μm)보다 높은 RA을 첨가하면 세포 생존률이 현저히 떨어질 수 있으므로, 처리하는 RA의 양을 무한히 증가시킬 수 없다. 따라서, 성공적인 신경 분화를 위해서는 RA의 손실을 최소화하면서, 세포 내 전달을 향상시키며, 유도 과정의 필요를 충족시키기 위해 지속적이고 충분한 보조제를 통해 매개해야 한다.
본 발명은 세포 운명 조절인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물을 제공함으로써, 우수한 효율로서 조절인자를 담지하고, 담지된 조절인자를 서방적으로 방출하며, 입자의 생분해성 특성에 의해 담지된 조절인자를 99중량% 이상 방출하여 대상 세포의 운명을 효과적으로 조절할 수 있도록 하는 것에 그 목적이 있다.
1. 표면 또는 기공 내부에 세포 운명 조절 인자를 담지하고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 다공성 실리카 입자를 포함하고,
상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 세포 운명 조절용 조성물:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
A-t는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
2. 위 1에 있어서, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부에 실록산기를 갖는 것인 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, FGFs, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 코딩하는 유전자인 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-β Inhibitor, FSK, DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조성물.
8. 위 1에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조성물.
9. 위 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조성물.
10. 위 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조성물.
11. 위 1 또는 2의 조성물을 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 배양 배지에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법.
12. 위 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin, FGFs, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 코딩하는 유전자인 조절방법.
13. 위 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-β Inhibitor, FSK, DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조절방법.
14. 위 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조절방법.
15. 위 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조절방법.
16. 위 11에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조절방법.
17. 위 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조절방법.
18. 위 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조절방법.
본 발명의 조성물은 세포 운명 조절인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하여, 우수한 효율로서 조절인자를 담지하고, 담지된 조절인자를 서방적으로 방출하며, 입자의 생분해성 특성에 의해 담지된 조절인자를 99% 이상 방출하여 대상 세포의 운명을 효과적으로 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 2nm의 직경, 19nm의 직경을 갖는 일반 다공성 실리카 입자(DDV)와, 화학 작용기가 개질된 다공성 실리카 입자(mDDV)의 현미경 사진이다.
DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 7은 RA의 농도에 따른 UV 흡광도 스펙트럼(a)과 이의 peak 값에 대한 standard curve(b)를 나타낸 것이다.
도 8은 기공 평균 직경 및 아미노기로의 화학적 개질여부에 따른 RA의 담지량을 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 생분해성을 확인할 수 있는 현미경 사진이다.
도 10은 일 예시에 따른 원통형 투과막을 구비한 튜브이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 입경별 흡광도 감소 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 기공 직경별 흡광도 감소 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 환경의 pH별 흡광도 감소 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 16은 다공성 실리카 입자의 세포독성을 HepG2 세포를 대상으로 테스트한 결과이다.
도 17은 다공성 실리카 입자의 세포독성을 mES 세포를 대상으로 테스트한 결과이다.
도 18은 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달성을 확인한 것이다.
도 19는 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달성을 fluorescence correlation analysis를 통해 확인한 것이다.
도 20은 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달성을 TEM 이미지로 확인한 것이다.
도 21은 다공성 실리카 입자의 mES 세포 내 전달이 endocytosis에 의해 endosome을 형성하며 세포 내 전달되고, 이 후 endosome을 탈출하여 핵 주변에서 입자 내부에 담지된 세포 운명 조절 인자를 방출함을 확인한 것이다.
도 22는 다공성 실리카 입자의 인간 섬유아세포, HepG2 세포, HeLa 세포에의 전달성을 확인한 결과이다.
도 23은 다공성 실리카 입자의 림프구, 골수세포에의 전달성을 확인한 결과이다.
도 24는 다공성 실리카 입자의 인간 배아 줄기 세포, 신경 전구 세포에의 전달성을 확인한 결과이다.
도 25는 in vivo 상에서 Rat의 spinal cord에 주사기로 직접 FITC로 형광표지된 다공성 실리카 입자를 전달한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 incubation 시간에 따른 각 다공성 실리카 입자의 담지된 RA 방출량을 나타낸 것이다.
도 27은 incubation 시간에 따른 각 다공성 실리카 입자의 담지된 RA 방출량을 중량%화 하여 나타낸 것이다.
도 28은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, 아무것도 처리하지 않은 군, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 신경 분화 정도를 나타낸 것이다.
도 29는 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, 아무것도 처리하지 않은 군, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 OCT4, Tuj1 마커 유전자의 mRNA 발현량을 확인한 것이다.
도 30은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 OCT4, Tuj1 마커 유전자의 상대적 발현량을 확인한 것이다.
도 31은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군에 대한 면역 세포 화학 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 총 세포 대비 Tuj-1 양성 세포들의 수를 %로 나타낸 것이다.
도 33은 mES의 신경 세포로의 분화에 있어, RA 단독 처리군, RA/AMSN19 처리군의 축삭의 길이를 비교하여 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명 조성물을 이용하여 배아줄기세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명 조성물을 이용하여 배아줄기세포를 심근 세포로 분화시키는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명 조성물을 이용하여 섬유아세포 또는 혈구세포를 유도만능줄기세포로 역분화하는 과정에서 사용되는 pDNA design을 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명 조성물을 이용하여 섬유아세포 또는 혈구세포를 유도만능줄기세포로 역분화하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명 조성물을 이용한 세포 운명 조절 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면 또는 기공 내부에 세포 운명 조절 인자를 담지하고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 다공성 실리카 입자를 포함하고, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 세포 운명 조절용 조성물을 제공한다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며, A-t는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
본 발명의 조성물에 있어서, 세포 운명 조절 인자란 다공성 실리카 입자에 담지되어 세포에 전달되어 미분화 상태의 세포를 분화 상태로 유도하거나, 분화 단계를 조절하거나, 분화 상태의 세포를 미분화 상태의 세포로 역분화를 유도하거나, 특정 분화 세포를 다른 특정 분화 세포로의 직접 분화 유도 등의 활성을 나타낼 수 있는 물질을 포함한다.
상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK(Forskolin), IDE1, IDE2, DAPT, CYC(cyclopamine-KAAD), PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021 및 valproic acid로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 저분자 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
상기 세포 운명 조절 인자는 또한 Dkk1(Dickkopf Like Acrosomal Protein 1), Lefty A(left-right determination factors), activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, FGF9 및 interleukin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 생체분자일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
상기 세포 운명 조절 인자는 또한 상술한 생체분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 plasmid DNA 또는 linear DNA와 이들의 전사물인 mRNA, miRNA (miR-124, miR-9, miR9*, miR-302, miR-367, miR-21, etc.), siRNA 및 이들의 변형산물로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 다공성 실리카 입자란 수 나노에서 수 마이크로 크기의 세공(finepore)를 가지는　실리카　나노구조체로서, 기공배열의 규칙성이 잘　정의되어 있으며 사용환경에 맞도록 물질 특성(기공크기, 비표면적, 표면특성)을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는(MSN 또는 DDV) 실록산기(Si-O-Si)를 갖는 것일 수 있고, 이는 실리카 입자 표면 또는 기공 내부의 실라놀기(Si-OH) 간 탈수반응으로 인해 형성된 것일 수 있다. 이러한 경우, 실라놀기만을 갖는 입자에 비해 실록산기를 갖는 입자는 입자의 구조적 수축으로 입자 자체의 구조적 치밀함을 얻을 수 있고, 입자 자체의 분해 속도를 느리게 할 수 있으며, 담지된 세포 운명 조절 인자의 서방적이고 지속적인 방출 효과를 달성할 수 있다. 상기 실록산기는 후술하는 하소 과정에 의해 형성된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 표면 및/또는 기공 내부가 개질된 것일 수 있고, 이는 상기 개질은 실리카 입자가 갖는 실라놀기(Si-OH)의 -OH 작용기를 타 작용기로 치환하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 상기 개질되는 작용기의 종류 및 개질되는 정도에 따라 담지에 적합한 전술한 세포 운명 조절 인자의 종류가 달라질 수 있고, 세포 운명 조절 인자의 방출 환경에 대한 다공성 실리카 입자의 상호 작용이 조절되어 입자 자체의 분해 속도가 조절되어 세포 운명 조절 인자의 방출 속도가 조절될 수 있고, 세포 운명 조절 인자의 다공성 실리카 입자에 대한 결합력이 조절되어 입자로부터의 확산에 의한 인자의 방출이 조절될 수 있다.
상기 개질의 방법에 있어 화학적 또는 생물학적 개질방법을 택할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고 당업계의 주지된 방법에 의해 수행될 수 있으나, 실리카 입자와의 공유결합을 통한 작용기의 치환을 고려할 때 바람직하게는 화학적 개질방법을 택할 수 있다. 또한, 상기 입자의 표면과 기공의 내부는 동일하게 개질될 수 있고, 서로 다르게 개질될 수도 있다.
상기 개질은 도입하고자 하는 친수성, 소수성, 양이온성, 음이온성 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 세포 운명 조절 인자의 담지, 세포 운명 조절 인자의 표적 세포로의 이동, 그 외 기타 목적을 위한 물질의 담지 또는 그 외 추가 치환기의 결합 등을 위한 치환기를 갖는 화합물을 입자와 반응시켜 수행할 수 있으며, 상기 치환기는 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 압타머 등을 더 포함하는 형태일 수 있다.
상기 화합물은 예를 들면 C1 내지 C10 알콕시기를 갖는 알콕시실란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알콕시실란은 상기 알콕시기를 1개 이상 갖는 것으로서, 예를 들면 1 내지 3개 가질 수 있고, 알콕시기가 결합되지 않은 부위에 도입하고자 하는 치환기가 있거나 이로 치환된 치환기가 있을 수 있다.
상기 알콕시실란을 다공성 실리카 입자와 반응시키면 실리콘 원자와 산소 원자간 공유 결합이 형성되어 알콕시실란이 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부와 결합될 수 있고, 상기 알콕시실란은 도입하고자 하는 치환기를 가지고 있는 바, 해당 치환기가 다공성 실리콘 입자의 표면 및/또는 기공 내부에 도입될 수 있다.
상기 반응은 용매에 분산시킨 다공성 실리카 입자를 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있으며, 상기 용매는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 톨루엔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 가열 하에 수행될 수 있고, 상기 가열은 예를 들면 80℃ 내지 180℃, 예를 들어 상기 범위 내에서 80℃ 내지 160℃, 80℃ 내지 150℃, 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 150℃, 110℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 입자의 알콕시실란과의 반응은 예를 들면 4시간 내지 20시간, 예를 들어 상기 범위 내에서 4시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 16시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 14시간 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 양이온성 치환기로의 개질은 입자를 양전하로 대전시키거나 음전하성 세포 운명 조절 인자 담지를 위한 것일 수 있고, 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 음이온성 치환기로의 개질은 입자를 음전하고 대전시키거나 양전하성 세포 운명 조절 인자 담지를 위한 것일 수 있고, 예를 들면 카르복시기, 술폰산기, 티올기 등의 산성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 친수성 치환기로의 개질은 본 발명 조성물의 사용 및 제형화의 용이성 등의 측면의 유리함을 갖는데, 예를 들면 카르복시기, 아미노기, 카르보닐기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 티올기, 암모늄기, 에스터기, 이미드기, 티오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 폴리에틸렌글리콜기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어, 소수성 치환기로의 개질은 난용성(소수성) 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증진되는 장점을 갖는데, 예를 들면 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C30의 헤테로아릴기, 할로겐기, C1 내지 C30의 에스테르기, 할로겐 함유기 등을 갖는 알콕시실란과 반응시켜 갖도록 할 수 있다. 구체적으로는, Trimethoxy(octadecyl)silane, Trimethoxy-n-octylsilane, Trimethoxy(propyl)silane, Isobutyl(trimethoxy)silane, Trimethoxy(7-octen-1-yl)silane, Trimethoxy(3,3,3-trifluoropropyl)silane, Trimethoxy(2-phenylethyl)silane, Vinyltrimethoxysilane, Cyanomethyl, 3-(trimethoxysilyl)propyl] trithiocarbonate, (3-Bromopropyl)trimethoxysilane 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질은 복합적으로 수행될 수도 있는데, 예를 들어, 외부 표면 또는 기공 내부에 2회 이상의 표면 개질이 수행될 수도 있다. 보다 구체적인 예로써, 아미노기가 도입된 실리카 입자에 카르복실기를 포함하는 화합물을 아미드 결합으로 결합시켜 양전하로 대전된 입자를 다른 표면특성을 가지게 변화시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개질에 있어서, 반응 온도, 시간, 그리고 개질에 사용되는 화합물의 양 등은 개질하고자 하는 정도에 따라 선택될 수 있는 것으로서, 세포 운명 조절 인자의 친수성, 소수성, 전하 정도에 따라 반응 조건을 달리하여 다공성 실리카 입자의 친수성, 소수성, 전하 정도를 조절함으로써, 세포 운명 조절 인자의 방출 속도를 조절할 수 있다. 예를 들면, 세포 운명 조절 인자가 중성의 pH에서 강한 음전하를 띠는 경우에는 다공성 실리카 입자가 강한 양전하를 띠도록 하기 위해, 반응 온도를 높이거나 반응 시간을 길게 할 수 있으며, 화합물 처리량을 늘릴 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 생분해성 입자로서, 세포 운명 조절 인자를 담지하여 체내에 투여되었을 때 체내에서 생분해되면서 세포 운명 조절 인자를 방출할 수 있어, 상기 입자는 체내에서 서서히 분해되어 담지된 세포 운명 조절 인자가 서방성을 갖도록 할 수 있다. 예를 들면, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며, 상기 현탁액의 pH는 7.4이고, At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
상기 수학식 1은 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 상기 흡광도 A0, At는 예를 들면 원통형 투과막에 다공성 실리카 입자 및 현탁액을 넣고, 투과막 외부에도 동일한 현탁액을 넣고 측정된 것일 수 있다.
상기 현탁액은 완충용액일 수 있고, 구체적인 예를 들면, PBS(phosphate buffered saline) 및 SBF(simulated body fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PBS일 수 있다.
상기 입자는 생분해성으로서, 현탁액 내에서 서서히 분해될 수 있고, 직경 50kDa는 약 5nm에 해당하는 것으로서 생분해된 입자는 직경 50kDa의 투과막을 통과할 수 있고, 원통형 투과막은 60rpm 수평 교반 하에 있으므로 현탁액이 고루 섞일 수 있으며 분해된 입자는 투과막 외부로 나올 수 있다.
상기 수학식 1에서의 흡광도는 예를 들어 투과막 외부의 현탁액이 새로운 현탁액으로 교체되는 환경 하에 측정된 것일 수 있다. 현탁액은 지속적으로 교체되는 것일 수 있고, 일정 기간마다 교체되는 것일 수 있으며, 상기 일정 기간은 정기 또는 비정기적인 기간일 수 있다. 예를 들어 1시간 내지 1주일의 범위 내에서, 1시간 간격, 2시간 간격, 3시간 간격, 6시간 간격, 12시간 간격, 24시간 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 7일 간격 등으로 교체될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다
상기 흡광도의 비가 1/2가 된다는 것은 t시간 후에 흡광도가 초기 흡광도의 절반이 된다는 것인 바, 이는 다공성 실리카 입자의 대략 절반이 분해되었다는 의미이다.
상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상, 또는 24 이상으로, 예를 들면 t는 20 내지 120일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 20 내지 96, 20 내지 72, 30 내지 70, 40 내지 70, 50 내지 65 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/5가 되는 t가 예를 들면 70 내지 140일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 110, 70 내지 140, 70 내지 120, 70 내지 110 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/20가 되는 t가 예를 들면 130 내지 220일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 130 내지 200, 140 내지 200, 140 내지 180, 150 내지 180 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 측정되는 흡광도가 0.01 이하가 되는 t가 예를 들면 250 이상, 예를 들어, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상 등일 수 있으며, 그 상한은 2000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비와 t는 높은 양의 상관 관계를 갖는 것으로서, 예를 들면 피어슨 상관 계수가 0.8 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.9 이상, 0.95 이상일 수 있다.
상기 수학식 1의 t는 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있다.
보다 구체적으로, 입자의 표면적을 증가시켜 t를 감소시키거나, 표면적을 감소시켜 t를 증가시킬 수 있다. 표면적은 입자의 직경, 기공의 직경을 조절함으로써 조절될 수 있다. 또한, 표면 및/또는 기공 내부에 치환기를 위치시켜 다공성 실리카 입자가 환경(용매 등)에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 다공성 실리카 입자에 세포 운명 조절 인자를 담지시키고 세포 운명 조절 인자와 다공성 실리카 입자 간의 친화도를 증가시켜, 다공성 실리카 실리카 입자가 환경에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 입자의 제조시에 표면을 보다 치밀하게 제조하여 t를 증가시킬 수도 있다. 상기에는 수학식 1의 t를 조절할 수 있는 다양한 예시를 서술하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 실리카(SiO2) 소재의 입자이며, 수 나노미터에서 수 마이크로미터 사이즈의 직경을 갖는다.
상기 입자의 평균 직경은 예를 들면 100nm 내지 1000nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 100nm 내지 800nm, 100nm 내지 500nm, 100nm 내지 400nm, 100nm 내지 300nm, 100nm 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 다공성의 입자로서, 나노사이즈의 기공을 가져 기공 내부 또는 입자 표면에 전술한 세포 운명 조절 인자를 담지할 수 있다.
상기 입자의 평균 기공 직경은 예를 들면 1nm 내지 100nm일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 예를 들면 5nm 내지 100nm, 7nm 내지 100nm, 7nm 내지 50nm, 10nm 내지 50nm, 10nm 내지 30nm, 7nm 내지 30nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 담지하고자 하는 세포 운명 조절 인자의 양과 크기를 고려하여 바람직하게 선택될 수 있고, 조절될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자의 형태는 특정 형태로 특별히 제한되는 것은 아니나, 조절 대상 세포들과의 상호작용의 원활성 등의 측면을 고려할 때, 구형임이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 BET 표면적이 예를 들면 200m2/g 내지 700m2/g일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 200m2/g 내지 700m2/g, 200m2/g 내지 650m2/g, 250m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 700m2/g, 300m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 600m2/g, 300m2/g 내지 550m2/g, 300m2/g 내지 500m2/g, 300m2/g 내지 450m2/g 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 g당 부피가 예를 들면 0.7ml 내지 2.2ml일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 0.7ml 내지 2.0ml, 0.8ml 내지 2.2ml, 0,8 ml 내지 2.0ml, 0.9 ml 내지 2.0ml, 1.0 ml 내지 2.0ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. g당 부피가 과도하게 작아지면 분해 속도가 너무 빨라질 수 있고, 과도하게 큰 입자는 제조가 어렵거나, 온전한 형상을 가질 수 없을 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 표면전하를 갖는 것으로서, 즉, 제타 포텐셜이 0mV가 아닌 입자이다. 이는 동일한 방법으로 개질된 입자 간 전자적 반발력으로 인해 입자가 응집하는 현상을 억제하고, 표적 세포에 효과적으로 담지한 세포 운명 조절 인자를 전달할 수 있게 한다.
상기 입자의 표면전하의 값, 즉, 제타 포텐셜의 값은, 예를 들어, 양전하로 대전된 경우, +1 내지 +150 mV 또는 +2 내지 130 mV 일 수 있고, +3 내지 +100 mV 일 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 음전하로 대전된 경우, -150 내지 -1 mV 또는 -130 내지 -10 mV 일 수 있고, -100 내지 -18 mV 일 수 있으나 이에 제한되지 아니하며, 제타 포텐셜의 값은 상기 입자에 담지하고자 하는 세포 운명 조절 인자의 종류와 양 또는 방출 속도의 제어 등의 측면을 고려하여 목적에 맞게 조절할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 표면 및/또는 기공 내부에 전술한 세포 운명 조절 인자를 담지할 수 있다.
상기 입자에의 세포 운명 조절 인자의 담지는 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자를 혼합하여 수행될 수 있고, 상기 용매로는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 PBS(phosphate buffered saline solution), SBF(Simulated Body Fluid), Borate-buffered saline, Tris-buffered saline 등을 사용할 수도 있다.
상기 다공성 실리카 입자와 상기 세포 운명 조절 인자의 비율은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 중량비가 1: 0.05 내지 0.8, 예를 들어 상기 범위 내에서 1: 0.05 내지 0.7, 1:0.05 내지 0.6, 1: 0.1 내지 0.8, 1: 0.1 내지 0.6, 1: 0.2 내지 0.8, 1: 0.2 내지 0.6 등일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자를 긴 시간에 걸쳐 점진적으로 방출할 수 있다.
상기 입자에 담지된 세포 운명 조절 인자는 입자가 생분해되면서 방출될 수 있는데, 상기 입자는 서서히 분해되어 담지된 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출되도록 할 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 입자에 담지된 세포 운명 조절 인자는 다공성 실리카 입자로부터 이탈되어 확산되면서도 방출될 수 있고, 이는 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자, 세포 운명 조절 인자의 방출 환경과의 관계에 영향을 받는 것인 바, 이를 조절하여 세포 운명 조절 인자의 방출을 조절할 수 있다. 예를 들면 표면개질에 의해 다공성 실리카 입자의 세포 운명 조절 인자와의 결합력을 강화 또는 약화시킴으로써 조절할 수 있다.
보다 구체적인 예를 들자면, 상기 담지된 세포 운명 조절 인자가 난용성(소수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 소수성 치환기를 가져 상기 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 상기 입자가 소수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "난용성"은 (물에 대해) 불용성(insoluble), 실질적으로 불용성(practically insoluble) 또는 극히 약간의 가용성(only slightly soluble)인 것을 포함하는 의미로서 이는 "Pharmaceutical Science" 18th Edition(U.S.P., Remington, Mack Publishing Company 발행)에 정의되어 있는 용어이다.
상기 난용성 세포 운명 조절 인자는 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 미만, 구체적으로 5g/L 미만, 보다 구체적으로 1g/L 미만일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 담지된 세포 운명 조절 인자가 수용성(친수성)인 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 친수성 치환기를 가져 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 친수성 치환기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 수용성 세포 운명 조절 인자는 예를 들면 1기압, 25℃에서 수용해도가 10g/L 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 담지된 세포 운명 조절 인자가 전하를 띠는 경우에는 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 그와 반대 전하로 대전되어 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가된 것일 수 있고, 이에 의해 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 산성기 또는 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
구체적으로, 세포 운명 조절 인자가 중성의 pH에서 양전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 중성의 pH에서 음전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가되어 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 카르복시기(-COOH), 술폰산기(-SO3H) 등의 산성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
또한, 세포 운명 조절 인자가 중성의 pH에서 음전하를 띠는 것이라면 입자의 표면 및/또는 기공 내부가 양전하로 대전되는 것일 수 있고, 이에 의해 다공성 실리카 입자와 세포 운명 조절 인자와의 결합력이 증가되어 세포 운명 조절 인자가 서방적으로 방출될 수 있다. 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자가 아미노기, 그 외 질소함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란으로 표면개질된 것일 수 있다.
상기 담지된 세포 운명 조절 인자는 방출 환경, 사용되는 다공성 실리카 입자에 의존하여 예를 들면 7일 내지 1년 또는 그 이상의 기간 동안 방출될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 생분해성으로서 100% 분해될 수 있으므로, 이에 담지된 세포 운명 조절 인자는 100% 방출될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면, 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정을 거쳐 제조된 것일 수 있고, 필요에 따라 하소(calcination) 공정, 표면 개질 공정 등을 더 거쳐 제조된 것일 수 있다. 하소 및 표면 개질 공정을 모두 거친 경우는 하소 이후에 표면 개질 된 것일 수 있다.
상기 소기공의 입자는 예를 들면 평균 기공 직경이 1nm 내지 5nm인 입자일 수 있고, 이는 용매에 계면활성제와 실리카 전구물질을 넣고 교반 및 균질화시켜 얻어질 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 메탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매로서 물과 유기 용매의 혼합 용매 사용시 그 비율은 예를 들면 물과 유기용매를 1: 0.7 내지 1.5의 부피비, 예를 들어, 1: 0.8 내지 1.3의 부피비로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 예를 들면 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), TMACl(tetramethylammonium chloride) 등일 수 있고, 구체적으로는 CTAB를 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 예를 들면 용매 1리터당 1g 내지 10g, 예를 들어 상기 범위 내에서 1g 내지 8g, 2g 내지 8g, 3g 내지 8g 등의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질은 용매에 계면활성제를 첨가하여 교반한 후에 첨가될 수 있다. 실리카 전구물질은 예를 들면 TMOS(Tetramethyl orthosilicate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반은 예를 들면 10분 내지 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구물질은 예를 들면 용매 1리터당 0.5ml 내지 5ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 4ml, 0.5ml 내지 3ml, 0.5ml 내지 2ml, 1ml 내지 2ml 등으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 필요에 따라 촉매로서 수산화나트륨을 더 사용할 수 있으며, 이는 용매에 계면활성제를 첨가한 후 실리카 전구물질의 첨가 전에 교반하면서 첨가될 수 있다.
상기 수산화나트륨은 예를 들면 1M 수산화나트륨 수용액 기준으로 용매 1리터당 0.5ml 내지 8ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 5ml, 0.5ml 내지 4ml, 1ml 내지 4ml, 1ml 내지 3ml 2ml 내지 3ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질의 첨가 후에 용액을 교반하며 반응시킬 수 있다. 교반은 예를 들면 2시간 내지 15시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 13시간, 5시간 내지 12시간, 6 시간 내지 12시간, 6시간 내지 10시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 시간(반응 시간)이 너무 짧은 경우에는 결정핵 생성(nucleation)이 부족할 수 있다.
상기 교반 이후에는 용액을 숙성(aging)시킬 수 있다. 숙성은 예를 들면 8시간 내지 24시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 8시간 내지 20시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 16시간, 10시간 내지 14시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 반응산물을 세척 및 건조시켜 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있으며, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후 상기 얻어진 다공성 실리카 입자의 기공을 확장하고, 이는 기공 팽창제를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 트리헥실벤젠, 톨루엔, 벤젠 등을 사용할 수 있고, 구체적으로, 트리메틸벤젠을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 기공 팽창제는 예를 들면 N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine,DMHA)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자를 기공 팽창제와 혼합하고, 가열하여 반응시켜 수행될 수 있는데, 상기 용매는 예를 들면 물 및/또는 유기용매를 사용할 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면 용매 1리터당 10g 내지 200g, 예를 들어 상기 범위 내에서 10g 내지 150g, 10g 내지 100g, 30g 내지 100g, 40g 내지 100g, 50g 내지 100g, 50g 내지 80g, 60g 내지 80g 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 용매 중에 고르게 분산되어 있는 것일 수 있고, 예를 들면 용매에 다공성 실리카 입자를 첨가하고 초음파 분산시킨 것일 수 있다. 혼합용매를 사용하는 경우에는 제1 용매에 다공성 실리카 입자를 분산시킨 후에 제2 용매를 첨가한 것일 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 용매 100부피부에 대하여 10 내지 200부피부, 상기 범위 내에서, 10 내지 150부피부, 10 내지 100부피부, 10 내지 80부피부, 30 내지 80부피부, 30 내지 70부피부 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 120℃ 내지 180℃로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 120℃ 내지 170℃, 120℃ 내지 160℃, 120℃ 내지 150℃, 130℃ 내지 180℃, 130℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 160℃, 130℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 24시간 내지 96시간 수행 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 80시간, 30시간 내지 72시간, 24시간 내지 80시간, 24시간 내지 72시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 80시간, 36시간 내지 72시간, 36시간 내지 66시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 88시간, 48시간 내지 80시간, 48시간 내지 72시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 예시한 범위 내에서 시간 및 온도를 조절하여 반응이 과다하지 않으면서 충분히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 늘리거나, 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 짧게하는 등에 의할 수 있다. 반응이 충분하지 않으면 기공의 확장이 충분하지 못할 수 있고, 반응이 과다하게 진행되면 기공의 과다 확장에 의해 입자가 붕괴될 수 있다.
상기 반응은 예를 들면 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있다. 구체적으로, 상온에서 상기 온도까지 0.5℃/분 내지 15℃/분의 속도로 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 이후에는 반응액을 서서히 냉각시킬 수 있으며, 예를 들면 단계적으로 감온하여 냉각시킬 수 있다. 구체적으로 상기 온도에서 상온까지 0.5℃/분 내지 20℃/분의 속도로 단계적으로 감온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 냉각 이후에 반응 산물을 세척 및 건조시켜 기공이 확장된 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류 ; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후, 얻어진 입자는 하소될 수 있는데, 하소는 입자를 가열하여 그 표면 및 내부를 좀 더 치밀한 구조를 갖게 하고, 기공을 채우는 유기물들을 제거하는 공정이다.
보다 구체적으로, 하소 과정을 거치는 입자의 경우 표면에 존재하는 실라놀기(Si-OH)들 간 서로 결합하여 탈수가 일어나고, 실라놀기 대신 실록산기(Si-O-Si)가 형성됨에 따라 입자의 구조적 수축(shrinkage)이 일어난다. 이러한 경우, 입자 자체의 구조적 치밀함을 가질 수 있고, 표면에 실라놀기가 적어 입자 자체의 분해가 느리게 이루어지며, 본 발명 조성물의 우수한 효과인 서방적이고 지속적인 세포 운명 조절 인자 방출 효과를 달성할 수 있게 한다.
하소 과정은 예를 들면, 400℃ 내지 700℃에서 3시간 내지 8시간, 구체적으로 500℃ 내지 600℃에서 4시간 내지 5시간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 얻어진 다공성 실리카 입자는 전술한 방법대로 표면 및/또는 기공 내부가 개질될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 또한 예를 들면, 소기공의 입자 제조, 기공 확장, 표면 개질, 기공 내부 개질 공정을 거쳐 제조된 것일 수도 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정은 전술한 바의 공정에 의할 수 있으며, 이 후 세척 및 건조 공정을 수행할 수 있다.
필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있고, 이는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있다.
상기 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소기공의 입자 제조 이후의 세척은 앞서 예시한 범위 내의 방법/조건으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장 이후의 세척은 앞서 예시보다는 보다 완화된 조건으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 세척을 3회 이내 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 입자의 표면 및/또는 기공 내부 개질은 전술한 방법에 의할 수 있으며, 표면 개질과 기공 내부 개질의 순서로 공정이 수행될 수 있고, 상기 두 공정 사이에 입자의 세척 공정이 추가로 수행될 수 있다.
상기 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 이후에 세척을 보다 완화된 조건으로 수행하는 경우 기공 내부에 입자 제조, 기공 확장에 사용된 계면활성제 등의 반응액이 채워져 있어 표면 개질시에 기공 내부는 개질되지 않고 표면만 개질될 수 있다. 그러고 나서 입자를 세척하면 기공 내부의 반응액이 제거될 수 있다.
상기 표면 개질과 기공 내부 개질 공정 사이의 입자 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 구체적으로, 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 구체적으로, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 운명 조절의 대상이 되는 세포로는 모든 세포 및 모든 줄기세포가 그 대상이 될 수 있고, 예를 들면, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 어떠한 세포 운명 조절 인자를 담지하고 있는지, 또는 세포의 운명을 어떠한 목적으로 어떠한 단계로 조절하고자 하는지 등의 다양한 요인들에 따라 자유로이 대상으로 할 수 있으며, 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물의 용도는 대상 세포의 운명을 조절하는 것으로서, 세포 운명 조절 인자를 담지한 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물을 상기 언급한 다양한 세포들을 배양하는 배지에 처리함으로써, 미분화 단계의 세포를 분화 중의 세포로 분화시키거나 완전 분화 세포로 분화시킬 수 있고, 분화 중의 세포나 완전 분화 세포를 미분화 단계의 세포로 역분화시키거나, 특정 분화 세포를 다른 특정 분화 세포로 직접 분화시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 세포 운명 조절은 매우 효율적이고 성공률 또한 매우 높은 수준이다. 예를 들어, 정분화의 경우 5 내지 80%, 5 내지 75%, 5 내지 70%, 5 내지 65%, 5 내지 60%, 5 내지 55%, 5 내지 50%일 수 있고, 역분화의 경우 0.0001 내지 10%, 0.0001 내지 9%, 0.0001 내지 8%, 0.0001 내지 7%, 0.0001 내지 6%, 0.0001 내지 5%, 0.0001 내지 4%, 0.0001 내지 3%, 0.0001 내지 2%일 수 있으며, 직분화의 경우 5 내지 90%, 5 내지 85%, 5 내지 80%, 5 내지 75%, 5 내지 70%, 5 내지 65%, 5 내지 60%일 수 있다.
이러한 용도 및 효과는 상기 언급한 본 발명의 다공성 실리카 입자의 높은 세포 운명 조절 인자 담지율 및 안정적인 대상 세포 내 전달, 담지된 세포 운명 조절 인자의 서방적이고 지속적인 방출 및 100%에 가까운 방출에 기반한 것이고, 이는 종래의 세포 운명 조절 인자를 이용한 세포의 운명 조절 방법의 단점들을 극복함으로써 우수한 세포 운명 조절 효과를 거둘 수 있게끔 한다.
본 발명은 또한 상술한 조성물을 운명 조절 대상 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법을 제공한다.
상기 조절방법에 있어, 상기 조성물이 포함하는 세포 운명 조절 인자, 다공성 실리카 입자, 대상 세포 등에 관련한 사항은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
하기 실시예에 있어서, 본 발명의 다공성 실리카 입자는 DDV 또는 MSN, 표면개질된 다공성 실리카 입자는 ADDV 또는 mDDV, 아미노기로 표면개질된 다공성 실리카 입자는 ADDV 또는 AMSN로 각각 명명될 수 있다.
실시예 1. 다공성 실리카 입자의 제조
(1) 입자 1의 제조
1) 소기공 입자의 제조
2 L 둥근바닥플라스크에 증류수 (DW) 960 mL 과 MeOH 810 mL을 넣었다. 상기 플라스크에 CTAB 7.88 g을 넣은 후 교반하면서 1M NaOH 4.52 mL를 빠르게 넣었다. 10분 동안 교반시켜 균일한 혼합액을 넣은 후 TMOS 2.6 mL를 넣었다. 6시간 동안 교반하여 균일하게 혼합한 후, 24시간 동안 숙성시켰다.
이후 상기 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 1.5g의 분말형의 소기공 다공성 실리카 입자(기공 평균 직경 2nm, 입경 200nm)를 얻었다.
2) 기공 확장
1.5g의 소기공 다공성 실리카 입자 분말을 에탄올 10ml에 첨가하여 초음파 분산시키고, 물 10ml, TMB (trimethyl benzene) 10ml를 첨가하여 초음파 분산시켰다.
이후 상기 분산액을 오토클레이브에 넣고 160℃, 48시간 반응시켰다.
반응은 25℃에서 시작하여 10℃/분의 속도로 승온시켜 수행하였고, 이후 오토클레이브 내에서 1~10℃/분의 속도로 서서히 냉각시켰다.
냉각된 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 하소
상기 2)에서 제조된 다공성 실리카 입자를 유리 vial에 담아 550℃에서 5시간 동안 가열하고, 반응 종료 후 상온으로 서서히 식혀 입자를 제조하였다.
(2) 입자 2의 제조
기공 확장시의 반응 조건을 140℃, 72시간으로 변경한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(3) 입자 3의 제조 (10L 스케일)
5배 큰 용기를 사용하고, 각 물질을 모두 5배 용량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(4) 입자 4의 제조 (입경 300nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 920ml, 메탄올 850ml를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(5) 입자 5의 제조 (입경 500nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 800ml, 메탄올 1010ml, CTAB 10.6g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(6) 입자 6의 제조 (입경 1000nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 620ml, 메탄올 1380ml, CTAB 7.88g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(7) 입자 7의 제조 (기공 직경 4nm)
기공 확장시에 TMB를 2.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(8) 입자 8의 제조 (기공 직경 7nm)
기공 확장시에 TMB를 4.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(9) 입자 9의 제조 (기공 직경 10nm)
기공 확장시에 TMB를 6.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(10) 입자 10의 제조 (기공 직경 17nm)
기공 확장시에 TMB를 11mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(11) 입자 11의 제조 (기공 직경 19nm)
기공 확장시에 TMB를 11.8mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(12) 입자 12의 제조 (기공 직경 23nm)
기공 확장시에 TMB를 12.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(13) 입자 13의 제조 (이중개질)
1) 소기공 입자의 제조
실시예 1-(1)-1)과 동일한 방법으로 소기공 입자를 제조하였다.
2) 기공 확장
실시예 1-(1)-2)와 동일한 방법으로 소기공 입자를 TMB와 반응시키고 냉각시키고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 실시예 1-(1)-2)와 동일 조건으로 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 3회 세척하고, 이후 실시예 1-(1)-2)와 동일 조건으로 건조하여 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10~15nm, 입경 200nm)를 얻었다.
3) 표면 개질
기공이 확장된 다공성 실리카 입자 0.8g 내지 1g을 50mL의 톨루엔에 분산시킨 후, (3-aminopropyl)triethoxysilane를 5mL 넣어주어 120 ℃로 환류한 채로 12시간 가열하였다. 해당 과정은 상기 서술된 세척과정 및 건조 과정을 거친 뒤 1mL의 트레에틸렌글리콜(PEG3, 2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]acetic acid)와 100mg의 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 200mg의 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 30mL의 PBS에 분산시켜서 상온에서 교반한 채로 12시간 동안 반응을 보낸다. 이후 생성물은 상기의 세척 및 건조과정을 거친다.
기공 내부에 이전 단계의 반응액이 남아 있어, 기공 내부는 개질 되지 않는다.
4) 기공 내부 세척
표면개질된 입자 분말 800mg을 2M HCl/에탄올 40ml에 녹이고, 12시간 강하게 교반 하에 환류시켰다.
이후 냉각된 반응액을 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
5) 기공 내부 개질
① 후술하는 실시예 2-(2)-1)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 프로필기를 도입하였다.
② 후술하는 실시예 2-(2)-2)의 방법과 동일한 방법으로 기공 내부에 옥틸기를 도입하였다.
실시예 2. 다공성 실리카 입자의 표면 개질
(1) 양전하로의 대전
1) 아미노기 - 입경 300nm의 입자
실시예 1-(4)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 톨루엔에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 1 mL의 APTES를 첨가하고 400 rpm으로 교반하며 130℃에서 교반하며 12시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 표면 및 기공 내부에 아미노기를 갖는 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
2) 아미노기 - 입경 200nm의 입자
① 실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, APTES를 0.4ml 첨가하고, 반응 시간을 3시간으로 한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 1-(7)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 1-(8)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
④ 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
⑤ 실시예 1-(10)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
⑥ 실시예 1-(11)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
⑦ 실시예 1-(12)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 아미노기 - 입자간 표면개질 정도의 차이
① 실시예 1-(1)-1) 이후 실시예 1-(1)-3) 의 과정을 거친 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰으며, 반응 시간을 24시간으로 한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
4) 알데하이드기
실시예 2-(1)-3)-②의 다공성 실리카 입자를 glutaraldehyde(GA)와 반응 시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 증류수에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 10 mL의 GA를 첨가하고 상온에서 400 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 증류수로 5회 세척하였다.
(2) 소수성기의 도입
1) 프로필기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy(propyl)silane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy(propyl)silane를 0.35ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
2) 옥틸기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 Trimethoxy-n-octylsilane와 반응시켜 표면 및 기공 내부에 프로필기를 도입하였으며, APTES 대신에 Trimethoxy-n-octylsilane를 0.5ml 첨가하고, 12시간 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2-(1)과 동일한 방법으로 개질을 수행하였다.
(3) 음전하로의 대전
1) 카르복실기
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자를 succinic anhydride와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 톨루엔 대신에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하고, APTES 대신에 80 mg의 succinic anhydride를 첨가하여 24시간 동안 상온에서 교반하며 반응시키고, 세척 시에 증류수 대신에 DMSO를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
2) 티올기
APTES 대신에 MPTES 1.1 mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 개질하였다.
3) 술폰산기
실시예 2-(3)-2)의 다공성 실리카 입자 100mg를 1M 황산수용액을 1mL와 30% 과산화수소수 20mL에 분산하여 상온에서 교반하여 산화반응을 유도하여 티올기를 술폰산기로 산화시켰다. 이후 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
4) 메틸포스포네이트기
① 실시예 1-(1)-1) 이후 실시예 1-(1)-3) 의 과정을 거친 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근바닥플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 증류수에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 3 mL의 THMP와 1.5 mL의 1M HCl 수용액을 첨가하고 130℃에서 400 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 증류수로 5회 세척하였다.
② 실시예 1-(9)의 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 ①의 방법과 동일하게 개질하였다.
③ 실시예 1-(10)의 다공성 실리카 입자를 3-(Trihydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THMP)와 반응시켜 음전하로 대전시켰으며, 그 외 방법은 상기 ①의 방법과 동일하게 개질하였다.
(4) 친수성기의 도입 - PEG
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자 100 mg을 50μg/ml 농도의 N,N'-Disuccinimidyl carbonate (DSC) 용액 20 ml에 분산하여 상온에서 교반하여 다공성 실리카 입자 표면에 DSC를 결합시킨다. 이 입자를 증류수 10 ml를 이용하여 3회 세척하고 끝이 아미노기로 되어있는 분자량 4kDa, PEG (HO-PEG-NH2) 10 mg을 위의 용액 10 ml에 분산하여 상온에서 교반하여 다공성 실리카 입자 표면에 PEG가 연결될 수 있도록 한다. 이후 실시예 2-(1)-1)의 방법과 동일하게 세척 및 건조시켰다.
실시예 3. 세포 운명 조절 인자의 담지
(1) 레티노산 (Retinoic acid)
증류수 1ml 하에서 실시예 1-(1),(11), 실시예 2-(1)-2)-①,⑥의 다공성 실리카 입자 100μg에 레티노산 용액(50mM 에탄올) 1ml를 첨가하고 실온에서 4시간 정치하여 로딩하였다.
(2) CYC (cyclopamine-KAAD)
증류수 1ml 하에서 실시예 2-(2)-2)의 다공성 실리카 입자 100μg에 CYC 용액(1mM dimethyl sulfoxide(DMSO)) 0.5ml를 첨가하고 실온에서 2시간 정치하여 로딩하였다.
(3) activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Nanog
실시예 2-(3)-1), 3), 4)의 다공성 실리카 입자 100μg과 activin A, BMP-4, KGF, bFGF, FgF, Wnt, Nanog 또는 Noggin 10μg을 1xPBS 0.2 ml 내에 혼합한 후, 4oC에서 4시간 정치하여 로딩하였다.
(4) plasmid DNA, linear DNA, mRNA
PBS 1ml 하에서 실시예 2-(1)-2)-⑦ 의 다공성 실리카 입자 12.5μg에 Oct4(서열번호 5), Sox2(서열번호 6, 서열번호 7), Klf4(서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10), c-Myc(서열번호 11), Nanog(서열번호 12, 서열번호 13) 또는 hTERT(서열번호 14)의 plasmid DNA, linear DNA 또는 mRNA 0.25μg를 섞은 후, 실온에서 30분간 정치하여 로딩하였다.
(5) miR-21 (miRNA family)
실시예 2-(1)-2)-⑤,⑥의 다공성 실리카 입자 10 ㎍와 50 pmol의 miR-21(서열번호 15)를 1xPBS 조건에서 섞은 후 상온에서 30분간 두고 적재가 되도록 하였다.
실험예 1. 다공성 실리카 입자 형성 및 기공 확장 확인
실시예 1-(1) 내지 (3)의 입자의 소기공 입자, 제조된 다공성 실리카 입자를 현미경으로 관찰하여, 소기공 입자가 균일하게 생성되었는지, 기공이 충분히 확장되어 다공성 실리카 입자가 균일하게 형성되었는지를 확인하였다(도 1 내지 4).
도 1은 실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 사진, 도 2는 실시예 1-(2)의 다공성 실리카 입자의 사진으로 기공이 충분히 확장된 구형의 다공성 실리카 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있고,
도 3은 실시예 1-(1)의 소기공 입자의 사진이고, 도 4는 실시예 1-(1)과 실시예 1-(3)의 소기공 입자의 비교 사진으로, 구형의 소기공 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 다공성 실리카 입자의 기공 평균 직경 , BET 표면적, 기공 부피 및 제타 포텐셜의 측정
(1) 측정방법
실시예 1-(1)의 소기공 입자, 실시예 1-(1),(7),(8),(9),(11), 실시예 2-(1)-2)-①②③④⑥의 다공성 실리카 입자의 표면적과 기공 부피를 계산하였다. 표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 크기 및 부피는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다.
또한, 100μg의 상기 다공성 실리카 입자들을 1ml의 PBS(pH 7.4)에 분산시킨 후, disposable folded capillary cell (DTS1070)에 옮겨 담아 제타전위 측정 장치에 장착 후 제타 포텐셜을 측정하였다.
(2) 측정결과
상기 각 입자들의 현미경 사진은 도 5 및 도 6에 나타내었고, 계산 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
기공 평균 직경(nm) BET 표면적(m2/g) 기공 부피(ml/g) 제타 포텐셜(mV)
DDV2 2 1305 내지 1420 0.5 내지 0.7 -10 내지 -50
mDDV2 2 1150 내지 1390 0.48 내지 0.69 +5 내지 +50
DDV4 4 598 내지 950 0.6 내지 0.8 -10 내지 -50
mDDV4 4 550 내지 940 0.59 내지 0.78 +5 내지 +50
DDV7 7 490 내지 585 0.65 내지 0.9 -10 내지 -50
mDDV7 7 488 내지 575 0.61 내지 0.87 +5 내지 +50
DDV10 10 460 내지 487 0.68 내지 0.95 -10 내지 -50
mDDV10 10 440 내지 480 0.65 내지 0.92 +5 내지 +50
DDV19 19 430 내지 480 0.7 내지 1.52 -10 내지 -50
mDDV19 19 400 내지 470 0.69 내지 1.50 +5 내지 +50
DDV23 23 300 내지 460 0.8 내지 1.7 -10 내지 -50
mDDV23 23 250 내지 450 0.78 내지 1.69 +5 내지 +50
실험예 3. 다공성 실리카 입자의 세포 운명 조절 인자 담지율
(1) 실험방법
1) 레티노산 외 다른 세포 운명 조절 인자
실시예 3-(2) 내지 (5)와 동일한 방법으로 다양한 세포 운명 조절 인자들을 각각 다공성 실리카 입자에 로딩한 뒤 상층액의 흡광도를 측정하거나, 상층액을 염료로 염색한 후 흡광도를 측정하거나, 상층액의 형광세기를 분석하여 담지된 세포 운명 조절 인자의 양을 구하고 담지율을 계산하였다.
구체적으로, 중성 pH에서 양전하를 띠는 인자는 음전하로 개질된 다공성 실리카 입자를, 중성 pH에서 음전하를 띠는 인자는 양전하로 개질된 다공성 실리카 입자를 사용하였고, 각 인자에 따른 적재조건하에서 로딩한 후에, 상층액의 흡광이나 형광을 측정하여 적재되지 않고 상층액에 남아있는 세포 운명 조절 인자의 양을 측정하였고, 담지된 세포 운명 조절 인자의 양을 계산(세포 운명 조절 인자의 양 = 처음 넣어준 세포 운명 조절 인자의 양 - 상층액에 남아있는 세포 운명 조절 인자의 양)하여 담지율을 확인한다(담지율=세포 운명 조절 인자/다공성실리카입자, w/w%)
2) 레티노산
실시예 1-(1),(11), 실시예 2-(1)-2)-①,⑥의 다공성 실리카 입자에 레티노산을 로딩한 뒤 상층액의 흡광도를 측정하여 담지된 레티노산의 양을 구하고 담지율을 계산한다.
구체적으로, 증류수 1ml 하에서 다공성 실리카 입자 100μg에 레티노산 용액(50mM 에탄올) 1ml를 첨가하여 실온에서 4시간 정치하여 로딩하고, λab = 350nm 에서 흡광도를 측정하여 적재되지 않고 상층액에 남아있는 레티노산의 양을 측정하였고, 담지된 레티노산의 양을 계산(레티노산의 양 = 처음 넣어준 레티노산의 양 - 상층액에 남아있는 레티노산의 양)하여 담지율을 확인한다(담지율=레티노산/다공성실리카입자, w/w%)(도 7).
(2) 실험결과
1) 레티노산 외 다른 세포 운명 조절 인자
하기 표 2를 참조하면, 상기 실험방법에 따른 다양한 세포 운명 조절 인자들의 다공성 실리카 입자에의 담지율(세포 운명 조절 인자/다공성 실리카 입자), w/w%)을 확인할 수 있다.
그룹 세포 운명 조절 인자의 특성 세포 운명 조절 인자 다공성 실리카 입자의 제타 포텐셜(mV) 담지율(w/w%)
저분자 중성 pH에서 양전하를 띰 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR99021, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, etc. -10 내지 -50 5 내지 45
중성 pH에서 음전하를 띰 IWP2, IWP4, KY02111, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK(Forskolin), IDE1, IDE2, DAPT, CYC(cyclopamine-KAAD), PDBu, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, etc. +5 내지 +48 5 내지 45
생체분자 중성 pH에서 양전하를 띰 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMP4, IGF1, HGF, WNT, FGF10, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-ß, SOX2, Noggin, etc. -10 내지 -50 5 내지 60
중성 pH에서 음전하를 띰 nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOX9, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, c-Myc, insulin, FGF9, Interleukins, etc. +5 내지 +45 5 내지 60
핵산 중성 pH에서 음전하를 띰 plasmid DNA, linear DNA, miRNA (miR-124, miR-9, miR9*, miR-302, miR-367, miR-21, etc.), siRNA, modified RNA, noncoding RNA, mRNA, etc. +5 내지 +45 5 내지 40
2) 레티노산도 8을 참조하면, 기공의 평균 직경이 2nm인 경우보다 기공의 평균 직경이 19nm인 경우에 레티노산의 담지율이 더 높고, 다공성 실리카 입자의 표면 또는 기공 내부가 아미노기로 개질된 경우가 그러하지 않은 경우보다 레티노산의 담지율이 더 높은 것을 확인할 수 있다. 이에, 본 발명 조성물이 포함하는 다공성 실리카 입자의 기공크기와 표면의 개질여부가 레티노산을 포함하는 세포 운명 조절 인자의 담지율에 영향을 미치는 요소임을 확인할 수 있다.
실험예 4. 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인을 위해 37℃, SBF(pH 7.4)에서의 생분해 정도를 0시간, 120시간, 360시간에 현미경으로 관찰하였고, 이는 도 9에 나타내었다. 이를 참조하면 다공성 실리카 입자가 생분해되어 360시간 경과 후에는 거의 다 분해된 것을 확인할 수 있다.
실험예 5. 다공성 실리카 입자의 흡광도비 측정
시간별 하기 수학식 1에 따른 흡광도비를 측정하였다:
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며, At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
구체적으로, 다공성 실리카 입자 분말 5mg을 SBF (pH 7.4) 5ml에 녹였다. 이후 5ml의 다공성 실리카 입자 용액을 도 10에 도시된 직경 50 kDa의 기공을 갖는 투과막에 넣었다. 외부막에 15ml의 SBF를 첨가하고, 외부막의 SBF는 12시간마다 교체하였다. 다공성 실리카 입자의 분해는 37℃에서 60rpm 수평 교반하며 수행되었다. 이 후 UV-vis spectroscopy에 의해 흡광도를 측정하였고, λ = 640 nm에서 분석되었다.
(1) 흡광도 비 측정
실시예 1-(1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도 비를 상기 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 11에 나타내었다. 이를 참조하면 흡광도 비가 1/2가 되는 t가 약 58시간으로 굉장히 천천히 분해되는 것을 확인할 수 있다.
(2) 입경별 측정
실시예 1-(1),(5),(6)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용). 이를 참조하면, 입경의 증가에 따라 t가 감소함을 알 수 있다.
(2) 기공 평균 직경별 측정
실시예 1-(9),(10)의 다공성 실리카 입자, 그리고 컨트롤로서 실시예 1-(1)의 소기공 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 13에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용). 이를 참조하면, 실시예의 다공성 실리카 입자는 컨트롤에 비해 t가 상당히 큰 것을 확인할 수 있다.
(3) pH별 측정
실시예 1-(4)의 다공성 실리카 입자의 pH별 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 SBF에서, 그리고 pH 2,5,7.4의 Tris에서 측정하였고, 그 결과는 도 14에 나타내었다. 이를 참조하면, pH 별 t의 차이는 있으나, 모두 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
(4) 대전된 경우의 측정
실시예 2-(1)-1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 15에 나타내었다(현탁액과 용매로는 Tris(pH 7.4)를 사용). 이를 참조하면, 양전하로 대전된 입자도 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
실험예 6. 다공성 실리카 입자의 세포독성 테스트
96웰 플레이트에 HepG2 세포를 각 웰 당 10,000개씩 깔아두고 24시간 후에 각 웰에 실시예 2-(3)-4) 입자를 저농도부터 고농도까지 순차적으로 분산시키고 24시간 둔 후 cell counting kit (CCK)를 이용하여 HepG2세포의 생존률을 확인하였고(도 16), 실시예 2-(1)-2)-⑥ 입자를 같은 방법 mES(마우스 줄기세포)에 48시간 동안 둔 후 그 생존률을 확인하였다(도 17).
도 16 및 도 17을 참조하면, 본 발명 다공성 실리카 입자를 포함하는 조성물은 농도에 무관하게 HepG2 세포주 및 mES 세포주의 생존율에 미치는 영향이 미미한 것으로 보아, 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. 다공성 실리카 입자의 세포 내 전달
(1) 실험방법
1) mES(마우스 줄기세포)
mES 세포를 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 접종하고 통상적인 mES 배양 배지로 24시간 동안 배양하였다. 세포 내 전달 실험에는 TAMRA 염료(TAMSN19)로 표지된 AMSN19(실시예 2-(1)-2)-⑥)을 사용하였다. TAMSN19는 사전 최적화된 방법으로 제조되었고, mES 세포에 처리되어 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 48시간 동안 배양되었다. 시료 채취 전, 핵 염색을 위해 Hoechst 33342로 세포를 처리하고 15분 후에 배지를 제거하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 각 배지는 Deltavision(GE healthcare)에서 관찰되어 배지 내에서 TAMSN19의 세포 내 전달을 확인했다. 이미지는 z축에 수직인 다양한 평면에서 반복적으로 얻었다. 형광 상관 분석은 z-단면 이미지#3의 line 프로파일링에 의해 수행되었으며, 이는 배지 구조 내의 핵 및 다공성 실리카 입자의 가장 선명한 이미지를 나타낸다.
2) Fully-differentiated cell(완전 분화 세포) 및 기타 세포
인간 섬유아세포, HepG2 세포, HeLa 세포, 림프구, 골수세포, 인간 배아 줄기세포, 인간 신경 전구 세포를 세포배양플레이트에 접종하고, 각 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배양액을 처리하여 배양하였다. 세포 내 전달 실험에는 실시예 3의 세포 운명 조절 인자들이 담지된 TAMRA 염료 또는 FITC로 표지된 입자를 사용하였다. 사전 최적화된 방법으로 제조된 입자는 세포에 처리되어 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양되었다. 시료 채취 전, 핵 염색을 위해 Hoechst 33342로 세포를 처리하고 15분 후에 배지를 제거하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 각 배지는 Deltavision(GE healthcare)에서 관찰되어 TAMRA 또는 FITC에 해당되는 형광신호를 confocal microscope으로 관찰하였다.
(2) 실험결과
1) mES(마우스 줄기세포)
AMSN19가 표적 세포에 효율적으로 도달하는지를 관찰(도 18)하기 위해, 편의상 5-carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA) 염료가 결합된 AMSN19(TAMSN19)를 제조하였다. 입자의 처리 전체, mES 세포는 배양 플레이트 표면의 젤라틴 코팅에 의해 보조된 feeder-free 시스템 하에서 배양되어, 적절한 미분화 성장 조건의 유지를 용이하게 하였다. 세포의 미분화 상태는 콜로니 유사 특징의 형성 및 유지에 의해 확인되었다. 세포를 20μg/mL의 TAMSN19로 처리하고, 줄기세포 검증 혈청과 함께 배양하였다. 이러한 조건 하에서, 세포는 그들의 콜로니 형성을 명확하게 유지하였고, TAMSN19의 위치는 콜로니 내에서 관찰되었다. RA/MSN 복합체의 세포 내 intake는 형광 세포 이미지를 기반으로 한 형광 상관 분석에 의해 밝혀졌으며, 이는 DeltavisionTM 영상 장비를 이용한 z-sectioned imaging 기술로 가능했다(도 19). 동일 평면에서 콜로니 내의 z-sectioned 이미지를 참조하면, 입자(빨간색)는 세포질(파란색)에서 주로 관찰되었다. 단일 mES 세포 내에서 입자의 성공적인 internalization은 TEM 이미지에 의해 확인되었고, 입자가 세표 표면에 엉겨붙지 아니하고 세포질 영역에 성공적으로 위치하여 핵 주변(검은색, 빨간색 화살표로 표시된 빈 점)에 접근함을 알 수 있다(도 20). 또한, 입자를 줄기세포에 전달한 후에 TEM(투과전자현미경) 촬영한 결과. Endocytosis에 의해 endosome을 형성하며 줄기세포 내로 전달되고 이 후 endosome을 탈출하여 핵 주변에서 DDV 내부에 담지된 세포 운명 조절 인자를 방출함을 구체적으로 확인할 수 있다(도 21). 이러한 데이터는 입자가 콜로니화 된 세포들에 담지된 세포 운명 조절 인자를 효과적으로 전달할 수 있는 높은 잠재력을 가짐을 확인할 수 있다.
2) Fully-differentiated cell(완전 분화 세포) 및 기타 세포
5-carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA) 염료 또는 FITC로 표지한 입자를 제조하였고, 상기 실험예 7-(1)-2)의 방법대로 인간 섬유아세포(도 22a), HepG2 세포(도 22b), HeLa 세포(도 22c), 림프구(도 23a), 골수세포(도 23b), 인간 배아 줄기세포(도 24a), 인간 신경 전구 세포(도 24b)에 in vitro 상에서 처리하였고, 척수 조직에 in vivo 상에서 처리한 결과, 입자가 다양한 세포들에 성공적으로 internalize 되어 담지된 세포 운명 조절 인자를 효과적으로 전달하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8. 담지된 세포 운명 조절 인자(RA)의 방출
(1) 실험방법
RA 방출 동역학 조사를 위해, RA 용액에서 4시간 동안 인큐베이션하여 생성된 각 RA/MSN 복합체를 PBS 5% 에탄올 용액에 현탁시키고, 37℃ 조건에서 최대 10일 동안 배양하였다. 복합체로부터 방출된 RA의 계산된 값은 각 샘플의 RA 용액 상등액의 350nm에서의 UV 흡수 값의 변화를 분석함으로써 도출되었다. UV 흡수 피크치를 격일로 측정하고, 계산된 RA의 양을 이전 데이터 각각에 합산하였다.
(2) 실험결과
RA loading test에 따라 각 입자의 담지된 RA의 방출 속도가 분석되었다(도 26, 도 27). 그 결과, 작은 기공을 갖는 입자(MSN2, AMSN2)와 비교하여 큰 기공을 갖는 입자(MSN19, AMSN19)는 상대적으로 지속된 방출(sustained release) 속도 프로파일을 보여 10일 이내에 거의 100% 방출되었다. 이러한 데이터는 입자의 큰 기공과 아민 작용기의 조합이 RA의 세포 내 전달을 위한 가장 적합한 입자를 선택하는 요소로서, 높은 담지율 및 지속적 방출 특성을 부여하는 것임을 확인할 수 있다.
실험예 9. 대상 세포 운명의 조절
(1) 실험방법
1) 줄기세포의 신경 세포로의 분화
mES 세포의 신경 유도는 RA 또는 RA/AMSN19 복합체를 첨가하여 수행하였다. 특히, 10-6M RA 또는 25μg RA/AMSN19 (RA 포함 3 x 10-6M에 해당)는 완전한 mES 배지가 있는 mES 세포로 2일 동안 처리하였다. 유도가 없는 군은 음성 대조군으로 배양하였다. 2일 후, 배지를 신경 세포 배양 배지 N2B27로 교체하였다. 배지는 격일로 교체되었다.
2) 줄기세포의 췌장 내배엽으로의 분화
배아줄기세포를 activin A(ActA) 100 ng/ml 그리고 Wnt3a 25 ng/ml 를 포함하는 RPMI 배양액에서 하루 동안 배양했다. 다음 날, 0.2% FBS와 ActA 100 ng/ml 를 포함하는 배지로 교환한 후 이틀 동안 배양했다. 그 다음, 세포를 PBS에 씻겨주고 2% FBS와 25 ~ 50 ng/ml KGF를 포함하는 RPMI 배양액에서 3일 동안 배양했다. 3일 후, 1% B27 첨가제, KAAD-cyclopamine (CYC) 0.25 μM, retinoic acid (RA) 2 μM과 Noggin(Nog) 50 ng/ml을 포함하는 DMEM 배지로 교환한 후 3일 동안 배양했다. 이후, 1% B27 첨가제를 포함하는 DMEM 배지로 교환 했다. 상기 단계들은 순차적으로 배지 자체를 교환해주는 것으로 시행되었다. 상기 단계에서 첨가되는 분화유도물질들(ActA, Wnt, KGF, RA, Cyc, Nog)은 각 단계에 맞는 조합대로 DDV 내부에 담지하여 처리하였으며, 10일 후에 췌장 내배엽 분화 마커유전자인 HNF6와 PDX1의 발현정도로 분화 유도효율을 측정하였다(도 34).
3) 줄기세포의 심근세포로의 분화
배아줄기세포를 Matrigel-coated plates에 1 x 105 cells/cm2 밀도로 심은 후 bFGF/FGF 8 ng/ml을 포함하는 MEF-CM 배지에서 6일 동안 배양한다. 그 후, RPMI-B27을 포함한 MEF-CM 배지에서 activin A (ActA) 100 ng/ml을 1일 동안 처리한 후에 BMP4 10 ng/ml를 4일 동안 처리하였다. 그 다음, 2주 내지 3주 동안 2일 내지 3일 마다 새로운 RPMI-B27 배양액으로 교체하였다. 상기 단계에서 첨가되는 분화유도물질들을 각 단계에 적정한 조합으로 DDV 내부에 담지하여 세포에 처리하였고, 14일 후 심근세포 특이 단백질인 cardiac troponin T (cTnT)의 발현정도로 심근세포 분화 유도효율을 측정하였다(도 35).
4) 섬유아세포 또는 혈구세포의 유도만능줄기세포로의 역분화
① DNA template 준비
pcDNA3 (Life technologies) plasmid backbone에 각각 실시예 3의 인간의 Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, c-myc, TERT를 PCR로 증폭시킨후, 적정한 제한효소로 절단후, ligase를 이용하여 결합함으로써 제작하였다(도 36).
② 2000bp 이하의 mRNA 준비
1-5 ng plasmid, 2 unit Platinum Taq polymerase (Life Technologies), 1x PCR buffer w/o MgCl2, 2.8 mM MgCl2, 0.5 μM sense primer, 0.5 μM antisense primer, 200 μm dNTPs를 총 25 μl PCR reactions volume으로 제작한 후, 95 ℃ for 3 min, 35 cycles at 95 ℃ for 30 s, 60 ℃ for 30s, 72 ℃ for 60s per 1 kb, 마지막으로 72 ℃ for 3 min 의 조건에서 PCR을 수행하였다.
③ 2000bp 이상의 mRNA 준비
10 ng plasmid, 5 unit LongAmp Taq DNA polymerase (New England Biolabs), 1x LongAmp Taq reaction buffer, 2 μM sense primer, 2 μM antisense primer, 300 μm dNTPs를 총 50 μl PCR reactions volume으로 제작한 후, 95 ℃ for 3 min, 35 cycles at 94 ℃ for 10 s, 60 ℃ for 60s, 65 ℃ for 50s per 1 kb, 마지막으로 65 ℃ for 3 min 의 조건에서 PCR을 수행하였다.
④ mRNA IVT, transfection 및 reprogramming
1 μg의 선형 plasmid나 0.5 μg의 PCR product를 template을 하여 T7mScript Standard mRNA production System (Epicentre Biotechnologies)을 이용하여 IVT-RNA(In vitro transcription-RNA)를 합성하였다. 합성된 RNA에 V.virus-derived capping enzyme과 2'-O-methyltrasferase를 이용하여 Cap 1 구조를 붙이고, poly A tail을 mScript쪠 polymerase enzyme kit (Epicentre Biotechnologies)를 이용하여 붙였다. 합성된 RNA GeneJet RNA purification kit (Thermo Fisher)를 이용해서 정제하였다. 정제된 mRNA (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, hTERT)는 각각 동일한 양을 혼합한 mRNA 혼합물 또는 GFP mRNA를 DDV에 담지된 형태(실시예 3)로 세포에 처리하였다. Fibroblast (human foreskin fibroblast)는 well당 2 x 106개씩 0.1% gelatin이 코팅된 6-well plate에 seeding 하였다. 세포는 transfection 이전에 5% O2 조건에서 24시간 동안 배양되었다. Transfection 이전에 세포 배지는 OPTI-MEM basal media (Life Technologies)로 교체하였다. 혼합된 mRNA 또는 GFP mRNA는 150 mM의 NaCl 용액 (PolyPlus)에 희석하였고, DDV 또한 150 mM의 NaCl 용액에 희석시킨 뒤, 두 용액을 섞어 실온에서 5~10 min간 방치하였다. 이후, 세포에 해당 용액을 처리하여 transfection을 시키고, 4시간 뒤에 해당 용액을 fibroblast 배지로 교체하였다. Transfection 과정은 48시간 간격으로 2주 동안 수행되었다. 이후 mRNA-IPS 콜로니 수를 확인하여 역분화 유도 효율을 측정하였다(도 37).
5) 골수성세포와 섬유아세포간 직분화
mouse peripheral blood로부터 monocyte를 분리한 뒤, hMCSF와 polymixin B를 사용하여 macrophage로 먼저 분화시켰다. 이 macrophage 에 LPS(1microgram/ml)와 IFN-gamma (20ng/ml)을 처리하여 M1 타입 macrophage로 polarize시켰다. 이렇게 준비된 macrophage를 배양접시에서 안정화시킨 후에, miR-21 RNA를 DDV 내부에 담지하여 배양하던 세포의 배양액에 처리하였다. 이후, 세포를 4% 파라 포름 알데히드로 고정시킨 후, PBS 10% (v/v) FBS 및 0.01% (v/v) Tween-20을 30분간 처리하여 세포를 블로킹한 후, 1차 항체 (anti-FSP1 antibody 1:400)와 함께 4℃로 밤새 배양하였다. PBS로 2회 세정한 후, 각 항체에 대응하는 2차 항체(Anti-Rat IgG, 1:1000 / Anti-rabbit IgG, 1:1000)를 도포하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 샘플을 PBS로 2회 세정하고 각 커버 유리를 배양 플레이트로부터 제거하고 DAPI를 함유하는 Vectashield쪠 mounting solution으로 mounting 하였다. 준비된 세포를 confocal microscope으로 형광신호를 분석하여 직분화 효율을 측정하였다.
6) RT-PCR
TRIZOL 시약으로 각 샘플로부터 RNA를 단리하고, 지시 설명서에 따라 Superscripttm 역전사 효소에 의해 cDNA 합성을 보조하였다. 표적 유전자의 증폭을 위하여, 각 프라이머는 GC 함량이 50% 미만이고, 표적 유전자의 두 개의 엑손 사이에 중첩되어 있음을 고려하여 설계되었다. 프라이머의 서열은 하기 표 3과 같다.
OCT4 순방향(서열번호 1) 5'-GCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGC-3'
역방향(서열번호 2) 5'-GCCTCATACTCTTCTCGTTGGGA-3'
Tuj1 순방향(서열번호 3) 5'-TCAGCGATGAGCACGGCATA-3'
역방향(서열번호 4) 5'-CACTCTTTCCGCACGACATC-3'
7) 면역 세포 화학(Immunocytochemistry)면역 세포 화학법의 경우, mES 세포를 젤라틴 코팅된 커버 글래스에 플레이팅하고, RA 또는 RA/MSN으로 처리한 후 전술한 신경 분화 과정을 수행하였다. 4% 파라 포름 알데히드로 고정시킨 후, PBS 10% (v/v) FBS 및 0.01% (v/v) Tween-20을 30분간 처리하여 세포를 블로킹한 후, 1차 항체(Tuj1: Rat anti-Tuj1, 1:200 / OCT4: Rabbit anti-OCT4, 1:100)와 함께 4℃로 밤새 배양하였다. PBS로 2회 세정한 후, 각 항체에 대응하는 2차 항체(Anti-Rat IgG, 1:1000 / Anti-rabbit IgG, 1:1000)를 도포하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 샘플을 PBS로 2회 세정하고 각 커버 유리를 배양 플레이트로부터 제거하고 DAPI를 함유하는 Vectashield쪠 mounting solution으로 mounting 하였다.
8) 정량분석
정량 분석을 위해, 대표적인 5개의 형광 이미지를 각각의 면역 염색 샘플로부터 수득하였다. 이미지는 ImageJ 프로그램에 의해 분석되었다. Tuj1-양성 세포의 분석을 위해, 각 이미지에서 임계치를 초과하는 Tuj1을 나타내는 형광 세포의 수를 측정하고, 전체 핵의 수에 대해 비율을 계산하였다. 축삭의 길이를 측정하기 위해, 50개의 세포에서 축삭 돌기를 각각의 샘플에 대해 line 측정 도구로 분석하였다. 100개의 대표적인 축삭을 고려하여 평균값을 계산하였다.
(2) 실험결과
1) 줄기세포의 신경 세포로의 분화
도 28을 참조하면, 배양 배지를 N2B27로 바꾼 경우, RA 또는 RA/AMSN19로 처리된 세포의 대부분이 죽었으며 살아남은 세포는 세포질 부분이 증가함에 따라 특이한 형태학적 변화를 보였다. 구체적으로, RA/AMSN19로 처리된 세포는 RA로 처리된 세포의 것보다 섬유질 구조에 대한 뚜렷한 형태학적 변화로서 세포질 부분에서보다 신속하고 활발한 증가를 보였다. RA만으로 처리한 세포의 전체 형태는 2일간의 RA 단독 분화 유도가 중요한 신경 분화를 유도하기에 충분하지 않다는 것을 나타낸다는 점에서 mES 세포 콜로니와 유사하다. 대조적으로, mES 세포가 RA 처리없이 신경 세포 배양 조건에 노출되었을 때, 세포는 생존하지 않았다.
도 29, 도 30을 참조하면, 성공적으로 신경 세포를 생성 하는지를 평가하기 위해 각 시료에서 총 RNA를 분리하고 OCT4(다능성 마커)와 ß-Ⅲ tubulin(Tuj1, 신경 특이성 마커)의 유전자 발현을 RT-PCR 방법으로 분석한 결과를 확인할 수 있는데, 상대적인 유전자 발현 수준 분석에 의하면 OCT4 발현 수준은 RA 및 RA/AMSN19 샘플 모두에서 감소하는 반면, Tuj1 샘플에서는 감소했다. 구체적으로, RA/AMSN19로 2일간 처리한 샘플은 RA 단독으로 약 2.5 배 처리한 샘플보다 Tuj1 발현이 훨씬 더 증가하였다.
도 31을 참조하면, 단백질 수준에서 상기 마커들의 발현을 분석하기 위해 OCT4 또는 Tuj1에 특이적인 항체를 사용하여 면역 염색 분석을 수행한 결과를 확인할 수 있는데, 면역 세포 화학법에 의해 밝혀진 상대 마커 단백질 발현은 mRNA 발현 분석 결과와 잘 관련되어 있었고, 특히, RA/AMSN19로 처리된 세포는 OCT4의 발현이 극히 낮았으며, Tuj1의 발현은 섬유상 망상 구조로 높은 것으로 관찰되었다. 대조적으로, RA만으로 유도된 세포는 콜로니 구조를 유지하고 OCT4의 발현을 유지했다. Tuj1의 발현은 콜로니 및 부분적으로 콜로니로부터 분리된 독립적인 단일 세포 모두에서 관찰되었다. RA/AMSN19 투여군과 달리 Tuj1 발현은 세포질의 짧은 섬유상 구조의 핵 영역으로 제한되어 있었으며 형태는 덜 연신되었다.
도 32를 참조하면, 신경 유도 후 살아남은 전체 세포 중 Tuj1 양성 세포의 비율을 분석하여 결정된 세포 변환 효율 그래프를 확인할 수 있는데, RA/AMSN19로 유도된 세포는 거의 90%의 세포 전환 효율을 보였으나, RA 단독 투여군에서는 약 30 %의 세포 전환 효율을 보였다.
도 33을 참조하면, RA/AMSN19로 처리한 군이 대조군에 비해 축삭의 길이가 약 4배 긴 axonal elongation 분석 결과를 확인할 수 있다.
상기 데이터는 RA의 단독 첨가만이 신경 분화 과정을 활성화 시키는데 필요한 RA 농도 임계값을 충족시키기에 충분하지 않음을 나타내며, AMSN19의 도움으로 세포 내 RA 공급량이 보다 효과적으로 신경 전환의 개시에 필요한 RA 농도의 특정 임계값을 쉽게 만족시킬 수 있음을 나타낸다.
2) 줄기세포의 췌장 내배엽으로의 분화
보다 구체적으로, 분화유도가 완료된 췌장 내배엽 세포의 배양액을 제거하고 200ul PBS(1x)로 세척하였다. 이때 세포가 완전 건조되지 않도록 주의하였다. 200ul의 paraformaldehyde(PFA) fixation buffer로 상온에서 20분간 고정하였고, PBS로 3회 내지 5회 세척하였다. 200 ul의 permeabilization buffer를 첨가하여 상온에서 20분간 세포막의 투과도를 높여주었다. Buffer를 제거하고 PBS를 넣어 5분간 정치하여 세척하였고, 이과정을 총 3회 반복하였다. 4% BSA blocking buffer를 첨가하여 45분간 정치하였고, 그다음 HNF6와 PDX1 primary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 1차염색을 수행하였고, 이후 형광표지된 secondary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 2차 염색을 하였다. Confocal microscopy를 이용하여 HNF6와 PDX1에 양성을 보이는 세포의 수를 세어 분화율을 측정하였다.
상기 방법에 의해 분화율을 측정한 결과인 표 5를 참조하면 높은 분화율을 보임을 확인할 수 있다.
3) 줄기세포의 심근세포로의 분화
보다 구체적으로, 분화유도가 완료된 췌장 내배엽 세포의 배양액을 제거하고 200ul PBS(1x)로 세척하였다. 이때 세포가 완전 건조되지 않도록 주의하였다. 200ul의 paraformaldehyde(PFA) fixation buffer로 상온에서 20분간 고정하였고, PBS로 3회 내지 5회 세척하였다. 200 ul의 permeabilization buffer를 첨가하여 상온에서 20분간 세포막의 투과도를 높여주었다. Buffer를 제거하고 PBS를 넣어 5분간 정치하여 세척하였고, 이과정을 총 3회 반복하였다. 4% BSA blocking buffer를 첨가하여 45분간 정치하였고, 그다음 cTnT primary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 1차염색을 수행하였고, 이후 형광표지된 secondary antibodies가 포함된 PBS를 첨가하여 2차 염색을 하였다. Confocal microscopy를 이용하여 cTnT에 양성을 보이는 세포의 수를 세어 분화율을 측정하였다.
상기 방법에 의해 분화율을 측정한 결과인 표 5를 참조하면 높은 분화율을 보임을 확인할 수 있다.
4) 섬유아세포 또는 혈구세포의 유도만능줄기세포로의 역분화
하기 표 4를 참조하면, DDV에 Oct4, Klf4, Sox2, Nanog 또는 Tert의 DNA 또는 mRNA를 담지하여 섬유아세포 또는 혈구세포와 같은 성체세포에 전달한 경우, DNA와 mRNA의 bp 길이를 불문하고 높은 역분화율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 포함하는 다공성 실리카 입자를 통한 상기 인자들의 안정화 및 서방적이고 지속적인 방출에 기인한 것으로 판단된다.
길이(bp) Transfection rate(%) 세포 내 발현율(%) 분화유도율(%) 역분화유도율(%)
DDV+mRNA(Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, TERT, c-myc) 1-1500 70-90 65-85 60-80 1-10
1501-2500 50-75 40-65 35-60 1-10
2501-4000 15-30 5-20 5-15 0.0001-2
DDV+linear DNA(Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, TERT, c-myc) 1-1500 70-90 65-85 60-80 1-10
1501-2500 50-75 40-65 35-60 1-10
2501-4000 15-30 5-20 5-15 0.0001-3
DDV+pDNA(Oct4, Klf4, Sox2, Nanog, TERT, c-myc) 1-4500 70-90 65-85 60-80 1-10
4501-9000 70-90 65-85 60-80 1-10
9001-15000 15-30 5-20 5-15 0.0001-2
5) 골수성세포와 섬유아세포간 정분화, 역분화 및 직분화하기 표 5를 참조하면, DDV에 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, 616452(TGF-β Inhibitor), FSK, DZNep, VEGF, TGFbeta-1, Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC, miRNA-21을 담지하여 신경성세포 또는 섬유아세포에 전달한 경우, 높은 정분화율과 역분화율 및 직분화율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 포함하는 다공성 실리카 입자를 통한 상기 인자들의 안정화 및 서방적이고 지속적인 방출에 기인한 것으로 판단된다.
세포 운명 조절 인자 Transfection rate(%) 정분화율(%) 역분화율(%)
저분자 화합물 5-azacytidine 50-95 5-30 N/D
Kortogenin, retinoic acid, Cyclopamine-KAAD (CYC) 70-95 5-20 N/D
CHIR, 616452, FSK, DZNep, 30-75 N/D 0.0001-2
생체분자 VEGF, KGF, FGF, bFGF, Noggin(Nog) 50-95 40-80 N/D
TGFbeta-1, Activin A, Wnt, BMPs 50-95 30-70 N/D
Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 20-80 N/D 0.0001-2
miRNA-21 40-90 5-60 (직분화율)

Claims (18)

  1. 표면 또는 기공 내부에 세포 운명 조절 인자를 담지하고, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상인 다공성 실리카 입자를 포함하고,
    상기 입자는 표면 또는 기공 내부가 화학적 개질된 것인 세포 운명 조절용 조성물:
    [수학식 1]
    At/A0
    (식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1mg/ml 현탁액 5ml를 직경 50kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
    상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15ml가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37℃에서 60rpm 수평 교반되며,
    At는 상기 A0의 측정시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 표면 또는 기공 내부에 실록산기를 갖는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin, FGFs, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 코딩하는 유전자인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-β Inhibitor, FSK, DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조성물.
  11. 청구항 1 또는 2의 조성물을 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 중간엽줄기세포, 피부아세포, 림프구, 골수세포, 신경 전구세포, 척수세포, 지방세포, 간세포, 피부세포, 혈액세포, 골수모세포, 섬유아세포, 내피세포, 신경세포, 근육세포, 면역세포, 심근세포, 뇌세포, 골세포, 구강세포, 치주세포, 모낭세포, 점막세포, 상피세포, 간엽세포, 중간엽세포, 태반세포, 제대혈세포, 조혈모세포, 위장관세포, 양막세포, 망막세포, 연골세포, 췌장세포, 췌장베타세포, 혈관세포 및 폐세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 배양 배지에 처리하는 단계를 포함하는 세포 운명 조절방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 3-isobutyl-1-methylxanthine, CHIR, KY02111, DZNep, tranylcypromine, LDN, digoxin, nicotinamide, IWP2, IWP4, XAV939, TTNPB, PD0325901, A83-01, hiazovivin, DMH1, rosiglitazone, SB-431542, pifithrin-alpha, FSK, IDE1, IDE2, DAPT, CYC, PDBu, Retinoic acid, ascorbic acid, dexamethasone, 5-azacytidine, taurine, Kartogenin, ursolic acid, SR1555, halofunginone, CHIR99021, valproic acid, Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin, FGFs, interleukins, miR-124 family, miR-9 family, miR-155 family, miR-302 family, miR-367 family 및 miR-21 family 중 적어도 하나; 또는 Dkk1, Lefty A, activin A, GATA4, Foxa1, Foxa2, Mef2c, BMPs, IGF, HGF, WNT, FGF, KGF, bFGF, Klf4, CRX, RAX, OTX2, Ascl1, NFIA, NFIB, Fezf2, Hmga2, VEGF, LIF, TGF-β, SOX2, Noggin, nodal, Brn2, Myt1l, NeuroD1, Hnf1a, Foxa3, Tbx5, Tymosin beta4, Tbx5, EGF, SOXs, Bestrophin1, Ctip2, NeuroG2, Atf5, Prox1, Hnf4a, OCT4, TERT, c-Myc, insulin 및 interleukins로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 코딩하는 유전자인 조절방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 세포 운명 조절 인자는 레티노산, CYC, activin A, BMP-4, KGF, bFGF, Noggin, Wnt, Oct4, Sox2, Klf4, c-myc, Nanog, TERT, miR-21, 5-azacytidine, Kortogenin, CHIR, TGF-β Inhibitor, FSK, DZNep 및 TGFbeta-1으로 이루어진 군에서 적어도 하나인 조절방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 알데하이드기, 케토기, 카바메이트기, 설페이트기, 설포네이트기, 아미노기, 아민기, 아미노알킬기, 실릴기, 카르복실기, 술폰산기, 티올기, 암모늄기, 설프히드릴기, 포스페이트기, 에스터기, 이미드기, 싸이오이미드기, 케토기, 에터기, 인덴기, 설포닐기, 메틸포스포네이트기, 폴리에틸렌글리콜기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기 및 C1 내지 C30의 에스테르기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것인 조절방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 상기 표면 또는 기공 내부에 아미노기, 아민기, PEG기, 프로필기, 옥틸기, 카르복실기, 티올기, 술폰산기, 메틸포스포네이트기 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 갖는 것인 조절방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 담지한 세포 운명 조절 인자의 최대 방출량이 99중량% 이상인 것인 조절방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 1 내지 25nm 이고, 기공 부피가 0.3 내지 2ml/g 이며, BET 표면적이 200 내지 1500m2/g 인 것인 조절방법.
  18. 청구항 11에 있어서, 상기 입자는 기공의 평균 직경이 7 내지 23nm이고, 기공 부피가 0.59 내지 1.69ml/g이며, BET 표면적이 250 내지 950m2/g인 것인 조절방법.
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