WO2014163425A1 - Hmga2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법 - Google Patents

Hmga2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2014163425A1
WO2014163425A1 PCT/KR2014/002918 KR2014002918W WO2014163425A1 WO 2014163425 A1 WO2014163425 A1 WO 2014163425A1 KR 2014002918 W KR2014002918 W KR 2014002918W WO 2014163425 A1 WO2014163425 A1 WO 2014163425A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hmga2
cells
protein
sox2
neuronal
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/002918
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강경선
유경록
Original Assignee
서울대학교산학협력단
주식회사 강스템바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단, 주식회사 강스템바이오텍 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to CN201480032201.8A priority Critical patent/CN105492597B/zh
Priority to AU2014250190A priority patent/AU2014250190B2/en
Priority to JP2016506245A priority patent/JP6316938B2/ja
Priority to RU2015144631A priority patent/RU2646099C2/ru
Priority to EP14779347.5A priority patent/EP2982747B1/en
Priority to US14/782,340 priority patent/US11512285B2/en
Publication of WO2014163425A1 publication Critical patent/WO2014163425A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing induced neuronal stem cells reprogrammed from non-neuronal cells using HMGA2.
  • Stem cells are generally classified as omnipotent or pluripotent. Pluripotent stem cells are fully differentiated: they produce all of the different cell types in the body. Fertilized egg cells are an example of pluripotent stem cells. Pluripotent stem cells produce any cell type in the body derived from the three main germ layers or the embryo itself.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESC) proliferate rapidly while maintaining pluripotency, ie the ability to differentiate into various cell types.
  • Embryonic stem cells are a promising donor source for cell transplantation treatment.
  • pluripotent stem cells have been produced mainly by nuclear transfer and cell fusion (Shinya Yamanaka, Pluripotency and Nuclear Reprogramming, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1500): 2079-2087 (27 June 2008) ).
  • both methods use embryonic stem cells, an ethical dilemma arises for both research and treatment.
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • iPSCs are cells that exhibit properties similar to embryonic stem cells (ESCs). Induced pluripotent stem cells were derived from Takahashi, Y. and S. Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126: 663-676 (2006) and 2007. Yu Junying, et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318: 1917-1920 (2007), Takahashi, K. et al., Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131: 861-872 (2007) for the first time by increasing the expression of defined factors.
  • iPSCs have a limitation in that they cannot develop differentiation into desired cells because of the development of a teratoma cancer, as well as in embryonic stem cells, and poor control of differentiation when transplanted into a living body.
  • iNSCs induced neural stem cells
  • An object of the present invention is to provide a novel method for producing induced neural stem cells or neurons from differentiated cells and induced neural stem cells or neurons produced thereby to solve the problems of the prior art as described above.
  • One object of the present invention is a nucleic acid molecule encoding SOX2 (SRY (sex determining region Y) -box 2) protein or SOX2 protein; And a nucleic acid molecule encoding a high mobility group AT-hook 2 (HMGA2) protein or a HMGA2 protein, thereby providing a kit for inducing reprogramming of non-neuronal cells into neural stem cells (NSCs).
  • SOX2 SRY (sex determining region Y) -box 2
  • HMGA2 high mobility group AT-hook 2
  • Another object of the present invention (a) a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein or SOX2 protein; And delivering the HMGA2 protein or nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to non-neuronal cells; Or, increasing expression of SOX2 protein and HMGA2 protein in non-neuronal cells; And (b) culturing the cells of step (a), to provide a method for producing induced neuronal stem cells reprogrammed from non-neuronal cells or neurons differentiated therefrom.
  • Another object of the present invention the induced neural stem cells produced by the method; Or to provide neurons differentiated from the induced neural stem cells.
  • the induced neural stem cells provides a cell therapeutic agent for neuronal regeneration comprising the neuronal cells differentiated from the induced neural stem cells as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is a nucleic acid molecule encoding SOX2 protein or SOX2 protein; And a nucleic acid molecule encoding HMGA2 protein or HMGA2 protein as an active ingredient, to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neuronal cell disease.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing an isolated non-neuronal cell, comprising: 1) preparing a isolated non-neuronal cell: 2) a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein or SOX2 protein; And a second step of delivering the HMGA2 protein or the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to non-neuronal cells, or increasing the expression of SOX2 protein and HMGA2 protein in non-neuronal cells to induce production of induced neural stem cells; 3) optionally, a third step of forming neurons from the induced neural stem cells generated in the second step; And 4) a fourth step of processing the candidate material after the first step or after the second step, and confirming whether or not the induced neural stem cells or the neurons are produced according to whether the candidate material is processed. Or it provides a method for screening a regeneration promoter or regeneration inhibitor of neurons.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing an isolated non-neuronal cell, comprising: 1) preparing a isolated non-neuronal cell: 2) a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein or SOX2 protein; And a second step of delivering the HMGA2 protein or the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to non-neuronal cells, or increasing the expression of SOX2 protein and HMGA2 protein in non-neuronal cells to induce production of induced neural stem cells; 3) a third step of forming neurons from the induced neural stem cells generated in the second step; And 4) a fourth step of identifying a neuronal therapeutic agent tailored to the individual from which the non-neuronal cell is derived by treating the neuron formed in the third stage with a candidate material.
  • NSC neural stem cells
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for cell proliferation, comprising an HMGA2 protein or a nucleic acid molecule encoding an HMGA2 protein as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting cell aging, comprising a nucleic acid molecule encoding HMGA2 protein or HMGA2 protein as an active ingredient.
  • the method of producing induced neural stem cells according to the present invention can produce induced neural stem cells from non-neuronal cells using only two inducers of SOX2 and HMGA2 as inducers, the existing four factors and five inducers. It is possible to produce more efficient induced neural stem cells than the production method using. In addition, since the induction efficiency and proliferative power are significantly better than when only one SOX2 gene is introduced, it may be more useful for therapeutic purposes.
  • the differentiated cells can be directly reprogrammed into neural stem cells without undergoing reverse differentiation.
  • Induced neural stem cells prepared not only have self-renewal ability and proliferative ability when transplanted into mouse brain tissue, but also can sufficiently differentiate into neuron-related cells such as neurons, astroglia, and oligodendrocytes. It can also be used for therapeutic purposes.
  • FIG. 1A shows the morphology of human neonatal skin fibroblasts (hDFs) as seen through bright-field microscopy.
  • 1B shows iNSC derived from SOX2-transduced hDF as seen through bright-field microscopy.
  • 1C shows bright field images of early neurosphere-like colonies generated by SOX2 transduction.
  • 1D shows the results of immunocytochemical analysis of NSC-specific marker proteins of hDF-iNSC using antibodies against PAX6, NESTIN.
  • 1E shows the results of immunocytochemical analysis of NSC-specific marker proteins of hDF-iNSC using antibodies against VIMENTIN, SOX2.
  • 1F shows a heat map of global miRNA expression profiles in hDF, H9-NSC and hDF-iNSC (SOX2).
  • 1G shows a heat map of neural line-specific miRNAs in hDF, H9-NSC and hDF-iNSC (SOX2).
  • 1H shows quantitative real-time PCR results of miR-124-3p in hDF, H9-NSC and hDF-iNSC (SOX2).
  • 1I shows quantitative real-time PCR results of miR-9-5p / -3p in hDF, H9-NSC and hDF-iNSC (SOX2).
  • FIG. 1J shows the relative expression levels of embryonic stem cell-specific miR-302 / 367 family in hDF, H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) and hESC measured via quantitative real-time PCR.
  • 1K shows the relative expression levels of the let-7 / miR-98 family in hDF, H9-NSC and hDF-iNSC (SOX2) measured via quantitative real-time PCR.
  • 1L shows PAX6 and NESTIN positive colonies measured after transformation of miR-124-3p, miR-9-5p, miR-9-3p, anti-let-7b and let-7b with SOX2-transduced hDF. Indicates the efficiency of formation.
  • 2A shows the results of MTT cell proliferation assays performed in hDF control, SOX2-, SOX2 / CMYC-, SOX2 / LIN28- and SOX2 / HMGA2-transduced hDFs.
  • 2B shows colony production times measured in SOX2-, SOX2 / CMYC-, SOX2 / LIN28- and SOX2 / HMGA2- transduced hDFs.
  • 2C shows the efficiency of PAX6 and NESTIN positive colony formation measured in SOX2-, SOX2 / CMYC-, SOX2 / LIN28- and SOX2 / HMGA2- transduced hDF.
  • FIG. 2D shows NSC cell surface markers (CD44) and positive markers (CD184) of hDF control, SOX2-, SOX2 / CMYC-, SOX2 / LIN28- and SOX2 / HMGA2- transduced hDF 7 days after virus introduction. The flow cytometry results performed are shown.
  • Figure 2e shows the morphology of hDF-iNSCs (SOX2 / HMGA2) and immunocytochemical analysis of PAX6, NESTIN, Ki67 and HMGA2 expression as seen through bright-field microscopy.
  • 2F shows the quantitative real-time-PCR analysis of NSC-specific miRNA expression in H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) and hDF-iNSC (SOX2 / HMGA2) compared to the expression level of hDF.
  • Figure 2g shows the analysis of the methylation pattern of the SOX2 gene promoter by bisulfate treatment of DNA from hDF, H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) and hDF-iNSC (SOX2 / HMGA2).
  • Figure 3a shows hDF after differentiation into three major cell types: neurons ( ⁇ -internexin, TH, DCX, ChAT, NF, MAP2 and TUJ1), astrocytoblasts (GFAP), and oligodendrocytes (OLIG2 and O4).
  • neurons ⁇ -internexin, TH, DCX, ChAT, NF, MAP2 and TUJ1
  • GFAP astrocytoblasts
  • OLIG2 and O4 oligodendrocytes
  • FIG. 3B shows the sodium current and active potential of neurons derived from human induced neural stem cells (hiNSC) recorded by voltage-clamp metering.
  • 3C shows the sodium current and active potential of hiNSC derived neurons recorded by voltage-clamp metering after blocking of sodium current by lidocaine.
  • 3D shows the sodium current and active potential of hiNSC derived neurons recorded by voltage-clamp metering following recovery of sodium current after washout.
  • FIG. 3E shows that hiNSCs differentiate into neurons (TUJ1), astroglia (GFAP) and oligodendrocytes (MBPs) after transplantation of CM-DiI-labeled hiNSCs to hippocampal sites in 4 week old mice. Indicates co-localized.
  • 4A is a diagram illustrating a process for generating iNCS from mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood with SOX2 / HMGA2. Neurospheres-like colonies were produced 7 days after virus introduction, indicating that hiNSCs from hUCB-MSCs were immunostained with PAX6 (red), NESTIN (green) and DAPI (blue).
  • 4B shows the morphology (21 days old) of aged hUCB-MSCs transduced with SOX2, SOX2 / CMYC, SOX2 / LIN28 and SOX2 / HMGA2.
  • Aged hUCB-MSCs were assessed for ⁇ -galactosidase activity and initial iNSC clusters were generated only by transduction of SOX2 / HMGA2.
  • 4C shows the results of quantifying the number of PAX6 and NESTIN positive colonies in control, SOX2-, SOX2 / CMYC-, SOX2 / LIN28 and SOX2 / HMGA2-transduced aged hUCB-MSCs.
  • 4D is an experimental schematic showing a strategy for reprogramming hiNSCs from CD34 + cells derived from hUCB.
  • CD34 + cells by flow cytometry on a dot plot.
  • CD34 + cells isolated from monocytes showed a purity of 84.15%.
  • Figure 4f is a diagram showing the characteristics of hUCB-CD34 + iNSC by immunochemical analysis, cells stained with NSC-specific markers PAX6, NESTIN and SOX2, neuronal marker NF, and glial marker GFAP Indicated.
  • FIG. 6A shows hDF-iNSCs (SOX2) transformed with miR-CTL, 50 nM or 100 nM let-7b for 2.5 hours with BrdU and immunized with BrdU-specific antibody (green) and DAPI (blue) The stained results are shown.
  • FIG. 6B shows the result of quantifying BrdU positive cells in hDF-iNSCs (SOX2) transformed with miR-CTL, 50nM or 100nM let-7b.
  • 6C shows the diameter of neurospheres of cells transformed with miR-CTL, 50 nM or 100 nM let-7b.
  • 6D shows the absolute number of cells transformed with miR-CTL, 50 nM or 100 nM let-7b.
  • 6E shows the proportion of primary neurosperm cells of cells transformed with miR-CTL, 50 nM or 100 nM let-7b.
  • FIG. 7A shows the flow cytometry of NSC negative cell surface markers (CD44) and positive markers (CD184) in hDF-iNSC (SOX2), hDF-iNSC (SOX2 / HMGA2) and H9-NSC.
  • FIG. 7B shows the global dielectric heat map of hDF, H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) and hDF-iNSC (SOX2 / HMGA2).
  • FIG. 7C shows hDF-iNSC (SOX2 / HMGA2) and hDF; And a scatter plot comparing hDF-iNSC (SOX2 / HMGA2) and H9-NSC.
  • 8A shows the results of treatment of BrdU for 2.5 hours with hDF-iNSCs (SOX2) transformed with siCTL or 50 nM siHMGA2 and immunostained with BrdU-specific antibody (green) and DAPI (blue).
  • FIG. 8B shows the result of quantifying BrdU positive cells in hDF-iNSCs (SOX2) transformed with siCTL or 50 nM siHMGA2.
  • 8C shows the diameter of neurospheres of cells transformed with siCTL or 50 nM siHMGA2.
  • 8D shows the absolute number of cells transformed with siCTL or 50 nM siHMGA2.
  • 8E shows the proportion of primary neurosphere cells of cells transformed with siCTL or 50 nM siHMGA2.
  • FIG. 9A shows the immunocytochemical analysis of H9-NSC after differentiation into three major cell types: neurons (ChAT, NF and MAP2), astroglia (GFAP), and oligodendrocytes (O4).
  • 9B shows the sodium current and activation potential of hiNSC derived neurons recorded by voltage-clamp metering.
  • 9C shows the sodium current and active potential of hiNSC derived neurons recorded by voltage-clamp metering after blocking of sodium current by lidocaine (0.1%).
  • 9D shows the sodium current and active potential of hiNSC derived neurons recorded by voltage-clamp metering with recovery of sodium current after washout.
  • 9E shows immunohistochemical results of transplanted CM-DiI-labeled hiNSCs.
  • 10A shows the flow cytometry results of hMSC surface markers (negative markers: CD34, CD45 and HLA-DR, positive markers: CD73 and CD105) in iMSCs derived from hMSCs and hMSCs.
  • 10B shows Western blot analysis of the expression levels of HMGA2 in three different lines of hUCB-MSC and hDF.
  • 10C shows PAX6 and NESTIN positive colony formation efficiencies measured after transduction of SOX2 or SOX2 / HMGA2 into hUCB-MSCs.
  • 10D shows the proliferation rate of H9-NSC, hDF-iNSC and hMSC-iNSC as determined by Cumulative Population Doubling Level Analysis.
  • 10E shows PAX6 and NESTIN positive colony formation efficiencies measured in SOX2- or SOX2 / HMGA2 transduced hUCB-CD34 + cells.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • HMGA 12 shows the results of measuring the transduction efficiency of transforming human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) with HMGA2.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the expression level of HMGA2 in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) of 8 stages or less in HMGA2 transfected early stages by immunocytochemical analysis.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • FIG. 14 shows the results of measuring the expression level of HMGA2 in a microarray in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) of 8 stages or less in HMGA2 transduced early stage.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • HMGA2 shows the results of measuring the expression level of HMGA2 according to passage in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) into which HMGA2 transduction was introduced, according to a PCR method.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • Figure 16 shows the results of measuring the cell morphology according to passage in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) introduced with the HMGA2 transfection by the phase contrast image method.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • FIG. 17 shows the result of measuring the expression level of SA- ⁇ -gal (Senescence associated beta-galactosidase) according to passage in HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) by ⁇ -gal staining.
  • SA- ⁇ -gal Signal associated beta-galactosidase
  • FIG. 18 shows the results of cell proliferation along passage progression in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) into which HMGA2 traits were introduced by MTT assay.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • FIG. 19 shows specific results with IPA (Ingenuity Pathway Anaylsis) software for genes related to HMGA2 overexpression-related signaling pathways and genes related to molecular cell function in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) into which HMGA2 transduction was introduced.
  • IPA Ingenuity Pathway Anaylsis
  • HMGA2 overexpression on PI3K / AKT pathway and mTOR / p70s6K in HMGA2 transduced human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs).
  • FIG. 21 shows the results of measuring cell morphology according to passage in HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) by phase contrast image method and SAb according to passage in order to confirm the degree of aging of HMGA2 inhibited hUCBSCs cells.
  • the expression level of -gal is measured by ⁇ -gal staining.
  • FIG. 22 shows the results of cell proliferation according to passage in HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) by MTT assay method.
  • FIG. 23 shows the results of western blots to evaluate the effect of HMGA2 expression inhibition on PI3K / AKT pathway and mTOR / p70s6K in HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs).
  • HMGA2 human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • HMGA2 overexpressing human cord blood-derived stromal cells shows the results of comparing the gene expression of HMGA2 overexpressing human cord blood-derived stromal cells with the gene expression of HMGA2 inhibited human cord blood-derived stromal cells.
  • FIG. 26 shows the results of PCR of eight selected genes as a result of comparing gene expression of HMGA2 overexpressing human cord blood-derived stromal cells with gene expression of HMGA2 inhibited human cord blood-derived stromal cells.
  • FIG. 27 shows a gene for which HMGA2 is expressed in human umbilical cord blood-derived stromal cells with increased expression upon HMGA2 overexpression and decreased expression upon HMGA2 inhibition, a gene with reduced expression upon HMGA2 overexpression and increased expression upon HMGA2 inhibition, and for the selected gene. The result of PCR was shown.
  • FIG. 28 shows the results of flow cytometry of CD34 + cells isolated from cord blood-derived monocytes.
  • 29 shows the increase and decrease of CD34 + cell numbers according to the days of culture in CD34 + specific medium.
  • Figure 31 shows the expression forms of DAPI, Nestin, HMGA2, SOX2 of CD34 + iNSC via immunostaining.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding SOX2 (SRY (sex determining region Y) -box 2) protein or SOX2 protein; And a nucleic acid molecule encoding a high mobility group AT-hook 2 (HMGA2) protein or a HMGA2 protein, a kit for inducing reprogramming of non-neuronal cells into neural stem cells (NSC).
  • SOX2 SRY (sex determining region Y) -box 2) protein or SOX2 protein
  • HMGA2 high mobility group AT-hook 2
  • NSC neural stem cells
  • the present invention is characterized by producing induced neural stem cells from target cells by increasing the expression of two factors, SOX2 and HMGA2, which are well known as conventional neural differentiation transcription factors, in target cells such as non-neuronal cells. Since the method of producing induced neural stem cells according to the present invention can produce induced neural stem cells from non-neuronal cells using only two inducers of SOX2 and HMGA2 as inducers, the existing four factors and five inducers. More efficient than the production method using the induced neural stem cells can be produced. In addition, the time required for reprogramming is significantly shorter than when only one SOX2 gene is introduced, and the reprogramming efficiency and proliferative power are remarkably excellent, and thus, may be more useful for therapeutic purposes.
  • SOX2 and HMGA2 which are well known as conventional neural differentiation transcription factors
  • SOX2 protein is a protein expressed by the sex determining region Y-box2 (Sox2) gene, which is expressed in the central nerve of the natal period and is known as a gene involved in the self-replication of neural stem cells, but malignant glioma It is known that it is expressed a lot also in.
  • Sox2 sex determining region Y-box2
  • High-mobility group AT-hook 2 (HMGA2) protein is known to be a factor that can bind to DNA and alter chromatin structure, thereby causing a change in gene transcription.
  • the SOX2 protein and the HMGA2 protein, or nucleic acid molecules encoding them include all SOX2 and HMGA2 derived from animals such as humans or mice, and preferably SOX2 and HMGA2 derived from humans.
  • the SOX2 and HMGA2 proteins of the present invention may include not only proteins having amino acid sequences of their wild type, but also variants thereof.
  • Variants of SOX2 and HMGA2 proteins include proteins whose sequences differ from the natural amino acid sequence of SOX2 and HMGA2 and one or more amino acid residues by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • the variant may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein or a variant in which the physical and chemical properties of the protein are modified as necessary, and may be a variant in which the structural stability to the physical and chemical environment is increased or the physiological activity is increased. .
  • nucleic acid molecule encoding the SOX2 or HMGA2 protein is a nucleotide sequence encoding a SOX2 or HMGA2 protein in the wild type of the SOX2 or HMGA2 protein or a variant form as described above, one or more bases are substituted, deleted, inserted, Or a combination thereof, and may be isolated from nature or prepared using chemical synthesis.
  • the nucleic acid molecule encoding the SOX2 protein and the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein of the present invention may each independently have a form contained in the expression vector.
  • the SOX2 protein or HMGA2 protein may be a protein of a form expressed from a cell line in vitro using an expression vector containing a nucleic acid molecule encoding them.
  • the expression vector may be a Baculovirus expression vector, Mammalian expression vector or Bacterial expression vector, the cell line can be used insect cell line, mammalian cell line or bacterial cell line, thereby limiting the expression vector and cell line available in the present invention It doesn't happen.
  • an "expression vector” may be a gene construct comprising an essential regulatory element operably linked to express a gene insert, capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell.
  • the expression vector of the present invention can be used for the purpose of delivering a reprogramming inducer to non-neuronal cells.
  • Expression vectors of the present invention may optionally include a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, start codons, termination codons, polyadenylation signals, enhancers, and various Can be prepared.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, a replication origin.
  • Expression vectors can be self-replicating or integrated into host DNA.
  • the vector may include a plasmid vector, a cosmid vector, an episomal vector, a viral vector, and the like, and preferably a viral vector.
  • Virus vectors include retroviruses such as human immunodeficiency virus (HIV), Murineleukemia virus (MLV), Avian sarcoma / leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), Rousse sarcoma virus (RSV), and Mouse mammary tumor virus (MMTV).
  • Vectors derived from adenoviruses, Adeno-associated virus, herpes simplex virus, Sendai virus, and the like, include, but are not limited to these.
  • the nucleic acid molecule encoding the SOX2 or HMGA2 protein may be messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • reprogramming can be restored or converted from the differentiated cells existing in different aspects, such as non-differentiating cells or cells with partial differentiation ability, to finally have a new type of differentiation potential.
  • the reprogramming mechanism of these cells means establishing a different set of epigenetic marks after the epigenetics in the nucleus (the DNA state associated with causing a genetic change in function without a change in nucleotide sequence) are deleted. While multicellular organisms differentiate and grow, different cells and tissues acquire different gene expression programs. Such distinct gene expression patterns are believed to be substantially regulated by epigenetic modifications such as DNA methylation, histone modifications, and other chromatin binding proteins.
  • each cell type in a multicellular organism is generally fixed and unchanged once the cell differentiates or leaves the cell cycle, but the major epigenetic genetics of some cells during normal development or when certain diseases progress. Programming may also proceed.
  • the present invention provides a method of obtaining a cell having the capacity of undifferentiated cells as a result of reprogramming a subject cell by treating a specific protein with a subject cell already differentiated.
  • the term "reprogramming inducer” refers to a substance that induces finally or partially differentiated cells to be reprogrammed into induced neural stem cells having a new type of differentiation potential, and refers to SOX2 protein or HMGA2 protein or these proteins. It may include a nucleic acid molecule encoding.
  • the reprogramming inducer may be included without limitation so long as it is a substance that induces reprogramming of differentiated cells.
  • the HMGA2 protein or a nucleic acid molecule encoding the same may be a chromatin modulator.
  • Chromatin also known as chromatin, is a nucleosome with the basic structure of a complex of DNA and histone proteins. Modulation of chromatin causes the pattern of expression of the gene to change as the way DNA surrounds the histone changes. Specific examples include acetylation of histones and methylation of DNA.
  • chromatin can be regulated by methylation / demethylation of DNA, and HMGA2 can act as a chromatin regulator by promoting hypomethylation of the promoter region of the SOX2 gene (Example 4-5).
  • non-neuronal cell includes all differentiated or undifferentiated cells which are not neurons, and serve as target cells of the present invention.
  • the non-neuronal cells of the present invention may be cells derived from various animals such as humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, and rabbits, and may preferably be cells derived from humans, This does not limit the cells that can be reprogrammed to induced neural stem cells.
  • the non-neuronal cells may be somatic cells, adult stem cells or pluripotent stem cells.
  • somatic cell is a cell constituting the adult with limited differentiation and self-renewal ability, specifically, the somatic cells may be somatic cells constituting human skin, hair, fat, blood, etc., preferably human fibroblasts Or human umbilical cord blood cells, but is not limited thereto.
  • stem cells in the present invention, stem cells present in bone, fat, myeloid epilepsy, muscle, nerves, etc., preferably may be mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • induced neural stem cells include cells made in a manner of establishing undifferentiated stem cells having similar or identical pluripotency to neural stem cells using reprogramming to differentiated cells. Induced neural stem cells have the same or similar characteristics as neural stem cells, specifically, show similar cell morphology, gene and protein expression patterns are similar, and may have multipotent ability in and out of the body. Therefore, the induced neural stem cells of the present invention may be capable of differentiating into neurons (neurons), astrocytomas, oligodendrocytes, GABA-like neurons or dopaminergic neurons.
  • the kit of the present invention is not particularly limited in kind, and may be used as a kit commonly used in the art.
  • the kit of the present invention comprises a first composition comprising a nucleic acid molecule encoding the SOX2 protein or SOX2 protein; And a second composition comprising the HMGA2 protein or the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein, each may be packaged in a separate container, or in a container divided into one or more compartments.
  • SOX2 and HMGA2 may contribute to the effective reprogramming of cord blood-derived mesenchymal stem cells (hUCB-MSC) and cord blood-derived blood cells into induced neural stem cells, and in particular, the reprogramming efficiency is improved by HMGA2. In addition, it was confirmed that the time required for reprogramming was shortened.
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells are representative examples of adult stem cells
  • cord blood-derived blood cells are representative examples of somatic cells.
  • the present invention provides a method for producing induced neural stem cells or differentiated neurons reprogrammed from non-neuronal cells.
  • the preparation method of the present invention (a) a SOX2 protein or a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein; And delivering the HMGA2 protein or nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to non-neuronal cells; Or, increasing expression of SOX2 protein and HMGA2 protein in non-neuronal cells; And (b) culturing the cells of step (a).
  • the method of the present invention may further comprise the step of (c) isolating neural stem cell-like colonies from the culture obtained from step (b).
  • the method for increasing the expression of SOX2 and HMGA2 in the target cell is to introduce the expression regulators of SOX2 and / or HMGA2 into the target cell expression of SOX2 and HMGA2 in the target cell Both ways of increasing are possible.
  • the method of delivering a reprogramming inducer such as a nucleic acid molecule encoding the SOX2 protein or SOX2 protein in step (a), and a nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein or HMGA2 protein to the cell is commonly used in the art.
  • a method of providing a nucleic acid molecule or protein to a cell to be used may be used without limitation, and preferably, a method of administering a reprogramming inducer to a culture of a non-neuronal cell or a method of directly injecting a reprogramming inducer to a non-neuronal cell
  • the reprogramming inducer used is a virus obtained from a packaging cell transformed with a gene of the corresponding factor, that is, a nucleic acid molecule encoding the SOX2 protein and a nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein, respectively.
  • the method of directly injecting the reprogramming inducer into the differentiated cells may be used by selecting any method known in the art, but is not limited thereto, microinjection, electroporation, particles It may be appropriately selected and applied from a method using a particle bombardment, a direct muscle injection method, an insulator and a transposon.
  • the viral vector may be a vector derived from a retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, Sendai virus, and the like, but is not limited thereto, and preferably, a retroviral vector may be used.
  • the packaging cells can be used to select a variety of cells known in the art depending on the viral vector used.
  • expression regulators of SOX2 and / or HMGA2 may be introduced to increase expression of SOX2 and HMGA2 in target cells.
  • the expression control factor of HMGA2 may be let-7 miRNA cluster inhibitor or PDE4D inhibitor.
  • the Let-7 miRNA cluster is known as a miRNA that targets HMGA2 and reduces its expression.
  • the expression regulator of SOX2 may be a PDE4D inhibitor.
  • the primary cellular mechanism of cAMP activation is known to degrade cAMP by a family of isoenzymes called cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs).
  • PDEs cyclic nucleotide phosphodiesterases
  • the PDE family has twelve known members. It is recognized that inhibition of PDE type IV (PDE4) is particularly effective both in inhibiting inflammatory mediated release and in relaxing airway smooth muscle. Activation of cAMP has been suggested as a promising strategy for neuronal induction after SCI to overcome inhibitory signals.
  • both expression levels of SOX2 and HMGA2 can be increased to significantly increase the efficiency of induction of reprogramming.
  • the reprogramming inducer is in addition to the reprogramming inducers of SOX2 and HMGA2 of the present invention, at least one protein selected from the group consisting of OCT4, KlF4, CMYC, LIN28 and Nanog, or at least one nucleic acid molecule encoding these proteins It may be included as.
  • the protein is a known reprogramming inducer, in particular CMYC, LIN28 is a Let-7 miRNA cluster, so can further increase the reprogramming induction efficiency by increasing the expression.
  • nanoparticles or compounds may be used to introduce the SOX2 protein or the nucleic acid molecule encoding the SOX2 protein, and the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein or HMGA2.
  • step (b) of the present invention may be made according to suitable media and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the cells selected.
  • Step (b) may comprise culturing in neuronal differentiation medium, thereby allowing neurons to be formed from the induced neural stem cells.
  • the present invention provides an induced neural stem cell or a neuron differentiated therefrom prepared by the above method.
  • the induced neural stem cells are as described above.
  • Example 10 it was confirmed that the induced neural stem cells could differentiate into neurons, astrocytic cells and oligodendrocytes, and thus neurons differentiated into the induced neural stem cells could be obtained.
  • the present invention provides a cell therapeutic agent for nerve cell regeneration comprising an induced neural stem cell prepared by the above method or a neuron differentiated therefrom as an active ingredient.
  • the induced neural stem cells according to the present invention correspond to cells capable of differentiating into neuron-related cells, and thus can be used as cell therapeutic agents, which are useful for nerve cell regeneration.
  • the cell therapy agent of the present invention may include 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells, preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 8 cells, more preferably 1.0 ⁇ 10 7 cells per ml. However, it is not limited thereto.
  • the cell therapy of the invention can be used unfrozen or frozen for future use. If frozen, standard cryopreservatives (eg DMSO, glycerol, Epilife cell freezing medium (Cascade Biologics)) can be added to the cell population before freezing.
  • standard cryopreservatives eg DMSO, glycerol, Epilife cell freezing medium (Cascade Biologics)
  • the cell therapy agent may be administered in a unit dosage form suitable for administration in the body of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field, and the agent may be administered in an effective dosage by one or several administrations.
  • Formulations suitable for this purpose include parenteral injectables such as injectable ampoules, injectables such as infusion bags, sprays such as aerosol preparations and the like.
  • the injection ampoule may be mixed with the injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, and Ringer's solution may be used as the injection solution.
  • the infusion bag may also be made of polyvinyl chloride or polyethylene and may be Baxter, Becton Dickinson, Medcep, National Hospital Products or Terumo.
  • the injection bag of the yarn can be illustrated.
  • the cell therapy product includes one or more pharmaceutically acceptable inert carriers, for example, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers in the case of injections, and in the case of preparations for topical administration , Excipients, lubricants or preservatives.
  • pharmaceutically acceptable inert carriers for example, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers in the case of injections, and in the case of preparations for topical administration , Excipients, lubricants or preservatives.
  • the cell therapeutic agent of the present invention thus prepared may be administered in the form of a mixture with such stem cells or with other stem cells used for transplantation and other uses, using administration methods commonly used in the art. It is possible, but not limited to, implanting or injecting directly into the diseased part of the patient in need of treatment, or implanting or injecting directly into the abdominal cavity.
  • the administration can be both non-surgical administration using a catheter and surgical administration methods such as injection or transplantation after dissection of the disease site, but non-surgical administration using a catheter is more preferable.
  • parenteral administration for example, in addition to direct lesions, transplantation by intravascular injection, which is a general method of hematopoietic stem cell transplantation, is also possible according to a conventional method.
  • the daily dose of the cells may be administered 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 10 cells / kg body weight, preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells / kg body weight, once or in several divided doses.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age and gender, and therefore, the dosage may be It does not limit the scope of the present invention in terms of aspects.
  • the present invention provides a method for inhibiting or repairing neuronal damage in a subject, comprising administering the reprogrammed induced neural stem cells or neurons differentiated therefrom to the subject.
  • the nucleic acid molecule encoding the SOX2 protein or SOX2 protein of the present invention delivering a reprogramming inducer comprising a HMGA2 protein or a nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to differentiated cells; And inhibiting or repairing nerve cell damage in a subject by administering induced neuronal stem cells or neurons differentiated therefrom by reprogramming the cells by culturing the cells.
  • subject includes, but is not limited to, mammals including cattle, dogs, pigs, chickens, sheep, horses, and humans.
  • administration of the reprogrammed induced neural stem cells or their cultures may be intraperitoneal or vascular administration, direct administration to the lesion, or administration in the synovial cavity of the joint, and the like.
  • Inhibition or recovery of the nerve cell damage may include preventing or treating neuronal cell damage.
  • the present invention provides a sex determining region Y (SRY) -box 2) protein or a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein; And a high mobility group AT-hook 2 (HMGA2) protein or a nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein as an active ingredient, provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neuronal cell disease.
  • SRY sex determining region Y
  • HMGA2 high mobility group AT-hook 2
  • a SOX2 (sex determining region Y) -box 2) protein or a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein
  • introducing a composition including a high mobility group AT-hook 2 (HMGA2) protein or a nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein into non-neuronal cells to induce reprogramming into neural stem cells, thereby preventing or treating neuronal cell damage diseases. have.
  • the SOX2 and / or HMGA2 gene may be provided in a form further comprising an intracellular gene transporter or transporter known in the art.
  • an intracellular gene transporter or transporter known in the art.
  • it may be a lipoplex, a polyplex, a cell permeable peptide (CPP), a protein transduction domain (PTD), or the like, but is not limited thereto.
  • the PTD may be used without limitation as long as it can enhance the efficiency of introducing SOX2 and / or HMGA2 into cells.
  • SOX2 and / or HMGA2 may be in the form of a fusion protein encoded by a conjugate to which the plasmids SOX2 and / or HMGA2 and a transporter for delivery thereof into the cell are bound.
  • SOX2 and / or HMGA2 and a transporter for delivery thereof into the cell are bound.
  • it may be in the form of a fusion protein in which SOX2 and / or HMGA2 and CPP or PTD are bound, or in the form of a fusion protein in which SOX2 and / or HMGA2 and low molecular weight protamine are bound.
  • neuronal cell damage disease is a disease caused by neuronal transformation, loss, and the like, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease (Huntington's disease), muscular dystrophy ( amyotriophic lateral sclerosis, ischemic brain disease, stroke, demyelinating disease, multiple sclerosis, epilepsy, neurodegenerative disease, spinal cord injury, etc., but are not limited to the above examples.
  • prophylaxis includes all the actions of inhibiting or delaying the onset of neuronal cell damage disease by administration of the composition
  • treatment includes all the symptoms that improve or benefit from the symptoms of neuronal cell disease by administration of the composition. Includes acts.
  • the present invention provides a method for preparing an isolated non-neuronal cell, comprising: 1) preparing a isolated non-neuronal cell: 2) a SOX2 protein or a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein; And a second step of delivering the HMGA2 protein or the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to non-neuronal cells, or increasing the expression of SOX2 protein and HMGA2 protein in non-neuronal cells to induce production of induced neural stem cells; 3) optionally, a third step of forming neurons from the induced neural stem cells generated in the second step; And 4) a fourth step of processing the candidate material after the first step or after the second step, and confirming whether or not the induced neural stem cells or the neurons are produced according to whether the candidate material is processed. Or a method for screening a regenerative promoter or regenerative inhibitor of neurons.
  • whether or not the production of neuronal stem cells or neurons by the reprogramming of the non-neuronal cells is a change in the morphology of non-neuronal cells, whether the expression of neuronal stem cell-specific markers, self-renewal according to before and after contact of the candidate material It can evaluate by observing changes, such as a potency, a proliferative ability, and a differentiation ability to a neuron.
  • the present invention may further include the step of determining the candidate substance as a regeneration promoter of the neural stem cells or neurons when the degree of generation of induced neural stem cells or neurons is increased in the third step.
  • the screening method may be to screen for regenerative promoters or regeneration inhibitors of patient-specific neural stem cells or neurons using non-neuronal cells isolated from the patient.
  • a method of individually investigating the constitution or environment of a patient, and determining a suitable neuronal regeneration accelerator or regeneration inhibitor may be provided. Therefore, by selecting the candidate drug of the neuronal cell regeneration accelerator or regeneration inhibitor by the screening method and treatment to patients with neurological disease, it is possible to select a customized therapeutic agent by identifying, mapping and storing the therapeutic effect. In other words, including both in vitro screening methods and in vivo verification methods, it is possible to more effectively select and verify patient-specific therapeutics for neuronal cell damage-related diseases.
  • HMGA2 protein can be used as a promoter for neuronal regeneration.
  • the present invention provides a method for preparing an isolated non-neuronal cell, comprising: 1) preparing a isolated non-neuronal cell: 2) a SOX2 protein or a nucleic acid molecule encoding a SOX2 protein; And a second step of delivering the HMGA2 protein or the nucleic acid molecule encoding the HMGA2 protein to non-neuronal cells, or increasing the expression of SOX2 protein and HMGA2 protein in non-neuronal cells to induce production of induced neural stem cells; 3) a third step of forming neurons from the induced neural stem cells generated in the second step; And 4) a fourth step of identifying a neuronal therapeutic agent tailored to the individual from which the non-neuronal cell is derived by treating the neuron formed in the third stage with a candidate material. to provide.
  • the candidate substance is treated in the neural stem cells induced in the second stage or the neurons formed in the third stage, and a mechanism related to nerve regeneration.
  • the change in the expression of the protein, and related changes such as, it is possible to confirm and verify whether the non-neuronal cells used to generate the induced neural stem cells can be a tailored neuronal therapeutic agent for the individual derived. .
  • the present invention provides a composition for promoting reprogramming of non-neuronal cells to induced neural stem cells (iNSC), comprising an HMGA2 protein or a nucleic acid molecule encoding an HMGA2 protein as an active ingredient.
  • iNSC induced neural stem cells
  • HMGA2 protein as well as SOX2 factor, which is well known as a conventional neuronal differentiation transcription factor, induction from non-neuronal cells to induced neural stem cells than when reprogramming with conventional SOX2 single factor It was confirmed that the efficiency and proliferation power is remarkably excellent.
  • nucleic acid molecules encoding HMGA2 protein or HMGA2 protein can be used for promoting reprogramming of non-neuronal cells into neural stem cells.
  • the present invention provides a composition for cell proliferation or a composition for inhibiting cell aging, comprising an HMGA2 protein or a nucleic acid molecule encoding an HMGA2 protein as an active ingredient.
  • cell proliferation includes an increase in the number of cells, and thus the cell proliferation is accompanied by an increase in DNA replication, cell division and various cellular components, and the rate of cell proliferation is regulated in vivo.
  • cell aging is a process of deterioration of cell traits and functions, and subsequent cell death or proliferation arrest.
  • the cause of aging is metabolism inhibition by cell metabolites, cell surface changes, collagen, etc. Increased cross-linking between cytoskeleton molecules, accumulation of deteriorated molecules in cells by free radicals, genetic transcription / translational misaccumulation, genetically programmed cell life due to lethal genes, DNA damage and repair capacity in cells This is known.
  • Aging in the present invention encompasses not only cellular senescence but also the meaning of aging of tissues or organisms.
  • the aging of stem cells increases the expression of aging-related ⁇ -galactosidase in stem cells, increases the size of stem cells, decreases the rate of proliferation of stem cells, decreases the proliferation period, It may be accompanied by a decrease in telomerase activity, or a decrease in the differentiation capacity of stem cells.
  • HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells hUCBSCs
  • hUCBSCs human cord blood-derived stromal cells
  • the morphological change was increased, and the cell proliferation was significantly decreased with the increase of SA- ⁇ -gal expression. Therefore, it was confirmed that the overexpression of HMGA2 protein promotes the proliferation of stromal cells and inhibits senescence.
  • the method for controlling the proliferation, maintenance, and senescence of stromal cells according to the present invention regulates HMGA2 protein expression by transforming stromal cells.
  • Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were collected from umbilical cord blood immediately after full-term delivery from mothers in their 2 and 30 years, and the collected blood samples were used for the experiment within 24 hours after delivery.
  • HetaSep solution (Stem Cell Technology, Vancouver, Canada) was mixed with cord blood samples at a ratio of 5: 1 (v / v) and incubated at room temperature until red blood cells were depleted. After incubation, the supernatant was collected, and mononuclear cells were collected by centrifugation at 2,500 rpm for 20 minutes using a Ficoll (GE healthcare life sciences, Pittsburgh, PA) density-gradient centrifuge.
  • Ficoll GE healthcare life sciences, Pittsburgh, PA
  • the obtained mononuclear cells were washed twice with PBS and seeded in a culture dish containing endothelial cell growth medium-2 (Gibco BRL, Grand Island, NY) containing 10% FBS (Gibco BRL).
  • endothelial cell growth medium-2 Gibco BRL, Grand Island, NY
  • FBS FBS
  • hDFs human skin fibroblasts
  • fibroblast growth medium-2 Gibco BRL
  • H9-derived human neural stem cells (H9-hNSCs, NA800-100) were purchased from Gibco, and cultured in KnockOut DMEM / F12 basic medium containing StemPro ® Neural Supplement, basic FGF, and EGF recombinant protein.
  • Human umbilical cord blood-derived stromal cells were isolated and cultured as follows. Specifically, in order to remove red blood cells of cord blood (Seoul National University Hospital) Hetasep solution (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) was mixed with cord blood at a volume ratio of 5: 1 and then incubated at room temperature for 30 minutes. The supernatant was collected carefully and centrifuged for 20 min at 2500 rpm with the addition of Ficoll solution to collect single cells.
  • SOX2 plasmid, HMGA2 plasmid, CMYC plasmid and LIN28 plasmid were transformed into 293T cells with VSV-G and gag / pol plasmids and Fugene 6 transduction reagent (Roche, Indianapolis, IN), respectively.
  • Viruses produced 48 and 72 hours post-transfection were collected and 5 ⁇ g / ml polybrene (Sigma, Ronkonkoma, NY) was added to hDF, hUCB-MSC, and hUCB-CD34 + MNC. It was introduced one by one or in combination of two or more. After transduction, the virus was washed by washing twice with PBS and incubated in growth medium for propagation.
  • the medium was changed to ReNcell NSC maintenance Media (Millipore, Billerica, MA), a medium for inducing neural stem cell containing bFGF (Sigma) and EGF (Sigma).
  • hiNSC was passaged with accutase (Gibco BRL).
  • Retroviral SOX2 was used to convert hDF to SOX2-transduced hiNSC on glass coverslips coated with poly-L-ornithine (PLO) and fibronectin (FN) with STO feeder cells. Within 2 to 3 weeks of conversion, SOX2- NSC-like colonies were generated from the transduced hDFs.
  • PLO poly-L-ornithine
  • FN fibronectin
  • Induced neural stem cell colonies were isolated to stabilize induced neural stem cells through repeated passage culture and neurosphere culture.
  • the cover glass was coated with PLO / FN and 5 ⁇ 10 4 induced neural stem cells were sprayed. After 24 hours, cells were fixed for 20 minutes using 4% paraformaldehyde (PFA) and permeabilized for 10 minutes using 0.3% Triton X-100 PBS. After blocking for 5 hours with 5% normal goat serum, the primary antibody was added 1: 100 and overnight. The next day, the secondary antibody was added 1: 1000 for 1 hour, followed by nuclear staining using DAPI, and dried after mounting.
  • PFA paraformaldehyde
  • H9-NSCs H9-derived NSCs
  • NSC-specific markers such as PAX6, NESTIN, VIMENTIN, and SOX2 (FIGS. 1D).
  • Example 2-2 miRNA expression profile analysis
  • the miRNA profiles of hDF, H9-NSC and SOX2-transduced hiNSC were analyzed by microarray analysis as in Example 2-1.
  • the expression levels of miR-9-5p, miR-9-3p and miR-124 specific for the nervous system known to play a key role in the transformation from fibroblasts to functional neurons are H9-NSC and It was confirmed that it was further up-regulated in SOX2-transduced hiNSC.
  • let-7 which is known to play a role in NSC maintenance and self-renewal regulation
  • the expression levels of all let-7 / miR-98 families show higher levels of H9-NSC and SOX2 than hDF. Confirmed further down-regulation in transduced hiNSCs (FIGS. 1F and 1J).
  • miRNA activity promotes reprogramming from hDF to iNSC, miR-9-5p, miR-9-3p, miR-124, anti-let-7b, let-7b, miR during reprogramming with SOX2 Transformed with -CTL and anti-miR-CTL.
  • hsa-let-7b (Invitrogen, PM11050), miR-124-3p (Invtirogen, PM10691), miR-9-5p (Invtirogen, PM10022), miR-9-3p (Invtirogen, PM13072), anti miRNA was overexpressed with -let-7b (Invtirogen, AM11050) and appropriate pre-miRNA precursor-negative controls (Invitrogen, AM17110) and anti-miRNA inhibitor-negative controls (Invitrogen, AM17010) were used.
  • let-7b overexpression reduced reprogramming efficiency
  • let-7b inhibition increased reprogramming efficiency more than 3.5-fold compared to anti-miR-CTL (FIG. 1L).
  • Example 3-2 hiNSC proliferation regulation by let-7b
  • let-7b was transfected into SOX2-transduced hiNSC and cell proliferation was induced by 5-bromodeoxyuridine (BrdU) labeling of dividing cells. Measured.
  • iNSC was stained with 5-bromo-2-deoyuridine (BrdU; Sigma) to measure the proliferation rate of the cells as follows. 10 ⁇ M BrdU was added to the cell culture medium, incubated for 5 hours at 37 ° C., then washed with PBS and fixed with 4% PFA for 10 minutes at room temperature. Sodium Citrate Buffer was used for 15 minutes at 85 ° C. for permeabilization and incubated with blocking solution (5% NGS). Cells were then incubated overnight at 4 ° C. with BrdU primary antibody diluted in blocking solution (Abcam, Cambridge, MA).
  • PrdU 5-bromo-2-deoyuridine
  • the cells were treated with secondary Alexa-488 antibody for 1 hour, and DAPI was diluted 1: 1000 in PBS and incubated with the cells for 10 minutes to stain the nuclei. Images were taken with a confocal microscope (Eclipse TE200, Nikon, Tokyo, Japan).
  • 2,000 cells were cultured in non-adherent culture dishes to form primary neurospheres.
  • Primary neurospheres were separated into single cells using accutase, and then replated to clonal density in non-adhesive medium to form secondary neurospheres. The number and size of secondary neurospheres were measured after 7 days of culture.
  • let-7b-transformed hiNSC was smaller than miR-CTL-transformed hiNSC, and it was confirmed that even when the concentration of let-7b was increased, almost no secondary neurosphere was generated during subcloning ( 6C-7E).
  • Example 3 it was confirmed that overexpression of let-7b decreased hiNSC reprogramming efficiency.
  • MYC, LIN28 which is known to inhibit the expression of let-7b, and HMGA2 inhibited by let-7b, To determine whether hiNSC reprogramming efficiency can be improved.
  • CMYC, LIN28 and HMGA2 in addition to SOX2 increased cell proliferation compared to overexpression of SOX2 alone, an MTT assay was performed. Specifically, 1 ⁇ 10 4 cells were seeded in 24-well plates. After 48 hours of incubation, 50 ⁇ l of MTT stock solution (5 mg / ml) was added to the medium. After 4 hours of incubation at 37 ° C, the medium containing the MTT solution was removed. DMSO was added to dissolve formazan crystals, and then the solution was transferred to a 96-well plate. Absorbance at a wavelength of 540 nm measured by an EL800 microplate reader (BIO-TEK Instruments, Winooski, VT) was measured.
  • HMGA2 has the smallest proliferative capacity, which is 32% less than CMYC; And 17% less than LIN28 (FIG. 2A).
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • HMGA2 In order to evaluate the reprogramming level of transcriptome by HMGA2, comparative global gene expression data was analyzed by microarray analysis, and quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) was used to evaluate the microarray data. was performed.
  • unmethylated cytosine in CpG islands was converted to uracil through heat-modification and integration of sodium bisulfate with CT-conversion reagents. Due to the recovery of DNA following DNA bisulfite conversion, the converted DNA was desulfonated, which was then washed and eluted. The sulfite-modified DNA was then amplified by PCR and stored at ⁇ 20 ° C. or lower.
  • primers were designed in MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer) and PCR was performed. Primer sequences and annealing temperatures are as follows;
  • Sox2 sense 5'-GGGATATGATTAGTATGTATTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • PCR product was ligated with pGEM T-Easy Vector System I (Promega, Madison, Wis.) And then plasmid DNA was cloned into bacteria (DH5 ⁇ ). Plasmid DNA extracted from bacterial clones was analyzed by sequencing with M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ', SEQ ID NO: 3) using an ABI 3730XL capillary DNA sequencer (Applied Biosystems). As a result, non-methylated CpG showed a white circle, while methylated CpG showed a black circle.
  • let-7b-targeted HMGA2 significantly increases SOX2-induced reprogramming efficiency and time to hiNSC, while SOX2 / HMGA2-transduced hiNSCs exhibit H9- in cell surface markers, transcription levels and methylation patterns, and the like. It suggests similar characteristics with NSC.
  • siRNA siHMGA2 targeting HMGA2 was introduced into hiNSC, and cell proliferation was measured by BrdU labeling of dividing cells. Specifically, siRNA (Dharmacon, ON Target plus SMART pool, Cat # L-013495-00-0005, Lafayette, CO) that inhibits commercially available HMGA2, and non-target siRNA (Dharmacon, ON Target plus SMART pool, Cat) as a control # D-001810-01).
  • HMGA2 dramatically reduced the proportion of BrdU-positive cells (FIGS. 8A, 8B).
  • siHMGA2-transformed hiNSC was found to significantly reduce the neurosphere size, and also to reduce the self-renewal by measuring the number and ratio of cells that produce secondary neurospheres in the primary neurospheres.
  • downregulation of HMGA2 with siRNA against HMGA2 suggests that it inhibits the proliferation and self-renewal of hiNSC.
  • iNSCs For differentiation of iNSCs into the nervous system, iNSCs were seeded at a density of 1,000 on Poly-L-ornithin / Fibronectin coated coverslips, respectively, in 24-well plates containing iNSC maintenance media (ReNcell NSC maintenance Media (Millipore)). After 24 hours, the medium was changed to Neurocult (Stem Cell Technology) for random differentiation. After culturing for one week in Neurocult medium, the medium was changed to medium for inducing three specific lineages (neurons, astroglia, and oligodendrocytes).
  • iNSC maintenance media ReNcell NSC maintenance Media (Millipore)
  • the neuron induction medium is B27 (Gibco BRL), Gmax (Gibco BRL), Retinoic Acid (Sigma), Ascorbic Acid (Sigma), BDNF (Peprotech, Rocky Hill, NJ), GDNF (Peprotech), and Forskolin (Sigma)
  • B27 Gibco BRL
  • Gmax Gibco BRL
  • Retinoic Acid Sigma
  • Ascorbic Acid Sigma
  • BDNF Peprotech, Rocky Hill, NJ
  • GDNF Peprotech
  • Forskolin Sigma
  • SOX2 / HMGA2-transduced hiNSCs were immature neuron markers, neuron specific class III beta-tubulin (TUJ1), doublecortin (DCX), and 10-15 days after neuronal induction.
  • TUJ1 neuron specific class III beta-tubulin
  • DCX doublecortin
  • MAP2 the dopamine agonist and noradrenergic neuron markers, Tyrosine hydroxylase (TH) and choline acetyltransferase (ChAT), a cholinergic neuron marker, compared to H9-NSC To be expressed at similar levels (FIGS. 3A and 9A).
  • Astrocyte-inducing media was DMEM (high glucose) medium containing N2 (Gibco BRL), Gmax, and 1% FBS.
  • astrocyte differentiation of hiNSC was confirmed by confirming that SOX2 / HMGA2-transduced hiNSC produced glial fibrillary acidic protein (GFAP) -positive cells (FIG. 3A).
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • DMEM / F12 medium containing N2, MEM non-essential amino acid solution (MEM NEAA; Gibco BRL), heparin (Sigma), RA, SHH (Peprotech), B27, and then N2, B27, MEM
  • MEM NEAA MEM non-essential amino acid solution
  • RA heparin
  • SHH Peprotech
  • B27 MEM
  • the cells were incubated for 2 weeks in DMEM / F12 containing NEAA, T3, cAMP (Sigma), PDGF (Peprotech), IGF (R & D), and NT3 (Sigma).
  • the current was filtered at 3kHz using a four-pole Bessels filter and digitized at 10kHz.
  • Tyrode solution comprising 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaHPO 4 , 10 mM glucose, and 5 mM (4- (2 hydroethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES); and pH NaOH was adjusted to 7.5
  • Pipette solution containing 150 mM KCl, 1.0 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, 2 mM Mg-ATP, and pH adjusted to 7.2 with NaOH Lidocaine (0.1%) blocked the sodium current It was used to
  • accutase was used to isolate SOX2 / HMGA2-transduced hiNSCs and suspended with PBS.
  • hiNSC was labeled with CM-DiI (Molecular Probes) to confirm traces after injection.
  • hiNSC was incubated with CM-DiI for 15 min in a 37 ° C. bath, followed by an additional 10 min at 4 ° C.
  • Hi-NSC labeled CM-DiI was suspended in PBS at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l.
  • HiNSC labeled CMDil was implanted into the subventricular zone (SVZ) using stereotaxic apparatus and ultra-micropump (World Precision Instruments, Sarasota, FL). After transplantation, sutures were made and a 4 week old mouse model was prepared by allowing the animals to recover from anesthesia.
  • the brains were isolated from the mouse model and soaked in 4% PFA overnight and then transferred to 30% sucrose for 48 hours.
  • the isolated brain was templated with an OCT compound (Sakura Finetek, Tokyo, Japan), kept at -70 ° C. overnight, and subjected to cryosection on cryostat (CM 3050, Leica, Wetzlar, Germany). It was. Specifically, the tissues were incubated for 20 minutes in 0.05% Triton X-100. The tissues were incubated with 5% NGS to prevent nonspecific antibody binding. The primary antibody was then incubated at 4 ° C. overnight at a dilution of 5% NGS. The tissues were incubated with secondary Alexa 488- or Alexa 594-labeled antibody (1: 1000) for 1 hour at room temperature. Nuclei were stained with DAPI for 10 minutes. Images were taken using a confocal microscope (Nikon).
  • transplanted cells were found by immunostaining, and the cells found were also stained simultaneously with markers of three different lines. That is, it was confirmed that the transplanted hiNSCs were positive for TUJ1 (neurons), GFAP (glial cells) and MBP (oligodendrocytes) co-localized with CMDil fluorescence (FIG. 3E, S5E). This suggests that transplanted SOX2 / HMGA2-transduced hiNSCs are capable of differentiation and survival into neurons, astrocytomas and oligodendrocytes in vivo.
  • Example 9-1 iNSC Reprogramming of hUCB-MSCs by HMGA2
  • Human umbilical cord blood cells can be obtained without invasion compared to fibroblasts, and have the advantage of having minimal genetic variation. Therefore, it was evaluated whether human umbilical cord blood cells could be a source of iNSC reprogramming.
  • mesenchymal stem cell (MSC) colonies were isolated from human umbilical cord blood. After transduction of SOX2 / HMGA2 into human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCB-MSC), hiNSC colonies derived from hUCB-MSC were observed 7-12 days after conversion and immunocytochemically with PAX6 and NESTIN It proved to be positively stained iNSC (FIG. 4A).
  • MSCs are known to be positive for CD73, CD105, but are negative for hematopoietic markers CD34, CD45 and HLA-DR.
  • hiNSCs derived from hUCB-MSCs were found to be negative for CD73 and CD105, suggesting that cell surface marker signals changed (FIG. 10A).
  • HMGA2 was significantly higher in hUCB-MSC when compared to hDF (FIG. 10B), and SOX2 / HMGA2-transduced hUCB-MSC was 3 compared to SOX2-transduced hUCB-MSC. ⁇ 4 times more PAX6 / NESTIN positive colonies were generated (FIG. 10C).
  • Example 9-3 Confirmation of Aged hUCB-MSCs Inducible into Neural Stem Cells
  • Galactosidase assays incubated hUCB-MSCs in 6-well plates until population reached 40-50%, then washed twice with PBS and in PBS for 5 minutes at room temperature. Fixed with 0.5% glutaldehyde in Cells were washed with PBS containing 1 mM MgCl 2 (pH 7.2), X-gal solution (1 mg / ml X-gal, 0.12 mM K 3 Fe [CN] 6 (potassium ferricyanide), 0.12 mM K 4 Fe [CN] 6 (potassium ferrocyanide) and 1 mM MgCl 2 , pH 6.0) were incubated at 37 ° C. overnight. The next day, images were taken using a microscope (IX70, Olympus, Japan).
  • SOX2 / CMYC and SOX2 / LIN28 combinations showed morphological changes but failed to produce hiNSC colonies, whereas only SOX2 / HMGA2 overexpression was found to significantly promote the production of hiNSC colonies (FIG. 4B).
  • SOX2 / HMGA2 overexpression produced 2-4 colonies in 1 ⁇ 10 5 aged hUCB-MSCs (0.004-0. 0.00% conversion) after 3 weeks of conversion (FIG. 4C).
  • CD34 + cells were isolated by CD34 microbead sorting system (MACS). Specifically, 50 ⁇ l of CD34 microbeads (# 130-046-703, Miltenyi Biotech) was obtained from umbilical cord blood using a Lymphoprep (ProteoGenix, Portland, OR) density-gradient centrifuge at 2-8 ° C. for 30 minutes. CD34 + cells were magnetically labeled by incubating with 10 8 monocytes and cells. The suspension of monocyte cells was attached to a MACS separator with a magnetic field, and then the MACS ® column was passed through to allow only magnetically labeled CD34 + cells to be retained inside the column.
  • MCS CD34 microbead sorting system
  • CD34 + cells were cultured in Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) medium containing 10% FBS, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml IL-6, 50 ng / ml TPO, 100 ng / ml Flt3.
  • IMDM Iscove's modified Dulbecco's medium
  • CD34 + Purification efficiency of CD34 + was measured by flow cytometry using anti-CD34-FITC antibody (Miltenyi Biotech), and as a result, it was confirmed that CD34 + cells with 84.15% purity were separated and purified (FIG. 4E, 27).
  • hUCB-CD34 + cells were incubated with cytokines (SCF, Flt3L, TPO, and IL-6) for 3 days and then SOX2 / HMGA2 was introduced into retroviruses (FIG. 4D). The cells were plated on the feeder until 10-14 days after introduction and iNSC colonies were observed under NSC conditions. Immunocytochemical staining revealed that hUCB-CD34 + iNSC had positive expression of PAX6, SOX2 and NESTIN. Furthermore, these hUCB-CD34 + iNSCs could develop into neurons or astrocytic cells (FIG. 4F).
  • HUCB-CD34 + cells expressing SOX2 and HMGA2 at the same time increased the production frequency of PAX6 / NESTIN positive colonies by 10-20 fold (FIG. 10E).
  • HMGA2 protein in the differentiation and senescence of human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs), human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) up to 8 passages were transformed with HMGA2.
  • HMGA2 sequence was cloned into the pMX retroviral vector.
  • 293T cells were transfected with HMGA2 plasmid, VSV-G and gag / pol plasmid.
  • the suspended solids were harvested after transfection for 48 hours to 72 hours, and used together with 5 ⁇ g / mL of polybrene to transform human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs). As a result of measuring the transduction efficiency, it was measured as 80% or more.
  • HMGA2 protein was increased in human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) of 8 stages or younger transformed with HMGA2 prepared in Example 11-1. And the result is shown in FIG.
  • HMGA2 protein was increased in early stage human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) of 8 stages or less transformed with HMGA2 prepared in Example 11-1 by microarray. It was.
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • Example 11-4 Determination of HMGA2 Expression According to Progression
  • HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells prepared in Example 11-1, the degree of HMGA2 expression according to passage was confirmed by PCR method.
  • HMGA2 transduced human umbilical cord blood-derived stromal cells prepared in Example 11-1
  • cell morphology according to passage progression was measured by a phase contrast image method and the results are shown in FIG. 16.
  • HMGA2 transduced human cord blood-derived stromal cells prepared in Example 11-1
  • cell proliferation according to passage progression was measured by MTT assay method and the results are shown in FIG. 18.
  • HMGA2 transduced human umbilical cord blood-derived stromal cells hUCBSCs
  • HMGA2 transduced human umbilical cord blood-derived stromal cells prepared in Example 11-1
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • FIG. 19 it can be seen that many elF4 and p70S6K signals related to transcriptional regulation are expressed, and mTOR and PI3K / AKT signal pathways related to elF4 and p70S6K are expressed.
  • HMGA2 inhibits expression of p16 INK4A and p21 CIP1 / WAF1
  • the expression level is restored by LY294002 treatment the PI3K / AKT / mTOR / p70S6K path is appropriate to reduce the p16 INK4A and p21 CIP1 / WAF1 expression Able to know.
  • HMGA2 This overexpression can be seen that activate PI3K / AKT / mTOR / p70S6K path and, inhibit the p16 INK4A and p21 CIP1 / WAF1 expression.
  • HMGA2 protein was used to inhibit HMGA2 expression in early stage human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) up to 8 passages.
  • HMGA2 human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • hUCBSCs human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • FIG. 21 That is, in the case of human cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) inhibited by HMGA2, the cells were flattened and lengthened.
  • HMGA2 human umbilical cord blood-derived stromal cells
  • SA- ⁇ -gal Senescence associated beta-galactosidase
  • SA- ⁇ -gal Green-galactosidase
  • HMGA2 human cord blood-derived stromal cells
  • AKT, mTOR and p70S6K in Figure 23 Phosphorylation was significantly reduced, and to increase the expression level of p16 INK4A and p21 CIP1 / WAF1.
  • This HMGA2 inhibition can be seen that inhibition of the PI3K / AKT / mTOR / p70S6K path and increases the p16 INK4A and p21 CIP1 / WAF1 expression.
  • Example 15-2 Based on the results of Example 15-2 and the above Example, the signal transduction pathway of HMGA2 protein expression in human umbilical cord blood-derived stromal cells is shown in FIG. 24.
  • HMGA2 expression Differentiation into adipose tissue was measured for human umbilical cord blood-derived stromal cells (hUCBSCs) with inhibited HMGA2 expression.
  • HMGA2 overexpressing human cord blood-derived stromal cells hUCBSCs
  • HMGA2 inhibited human cord blood-derived stromal cells hUCBSCs
  • FIG. 26 shows C14orf153 and EID2B which select three Cyclin F, Cyclin E1, and CDC25A as genes that increase expression upon HMGA2 overexpression and decrease expression upon HMGA2 inhibition, and decrease expression when HMGA2 overexpression and increase expression when HMGA2 is overexpressed.
  • Five genes, ZNF394, CDKN2AIPNL and C9orf80 were selected. PCR is performed on the selected 8 genes is shown in FIG. 27.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

본 발명은 분화된 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 유도 신경 줄기세포의 생산 방법은 유도 인자로서 SOX2와 HMGA2의 2개 유도인자만을 이용하여도 비신경 세포로부터 유도 신경줄기세포를 제작할 수 있기 때문에, 기존의 4개의 인자, 5개의 유도인자를 이용한 생산 방법보다 더 효율적인 유도 신경 줄기세포를 제작할 수 있다. 또한 SOX2 유전자 1개만을 도입하였을 때보다 유도 효율 및 증식력이 현저히 우수하므로 치료 목적으로 활용가능성이 더 높아질 수 있다.

Description

HMGA2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법
본 발명은 HMGA2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
줄기세포는 일반적으로 전능 또는 만능으로 분류된다. 전능줄기세포는 전체로 분화능을 갖는다: 이는 신체에서 상이한 세포 유형 모두를 생성시킨다. 수정란 세포는 전능줄기세포의 일례이다. 만능줄기세포는 3개의 주요 배엽 또는 배아 그 자체로부터 유래하는 신체에서 임의의 세포 유형을 생성시킨다.
배아줄기세포(ESC)와 같은 만능줄기세포는 만능성, 즉 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지하면서 신속히 증식한다. 배아줄기세포는 세포 이식 치료에 대한 유망한 공여 공급원이다.
지금까지 만능줄기세포는 주로 핵 이식 및 세포 융합에 의해 생성되었다(Shinya Yamanaka, Pluripotency and Nuclear Reprogramming, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500): 2079-2087(2008년 6월 27일)). 그러나, 상기 두 방법 모두는 배아줄기세포를 사용하기 때문에 연구 및 치료용 모두에 있어서 윤리적 딜레마(ethical dilemma)가 제기된다.
최근 유도 만능줄기세포(induced, pluripotent stem cell, iPSC)를 발견함에 따라 배아줄기세포를 사용함에 따른 이러한 문제점을 극복할 수 있게 되었다. "유도 만능줄기세포(iPSC)"은 배아줄기세포(ESCs)와 비슷한 특성을 나타내는 세포이다. 유도 만능줄기세포는 2006년에 마우스 섬유아세포(Takahashi, Y. 및 S. Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126: 663-676 (2006)) 및 2007년에는 인간 섬유아세포(Yu Junying, 등, Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318: 1917-1920 (2007), Takahashi, K. 등, Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131: 861-872 (2007))로부터 지정 인자(defined factor)들의 발현을 증대시킴으로써 최초로 생성되었다.
이들 연구에서는 성숙한 체세포의 iPSC로의 리프로그래밍을 개시하기 위해 Oct-3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 포함하고(Takahashi, Cell 126: 663-676; Takahashi, Cell 131:861-872); Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 사용하였다(Junying, Cell 318: 1917-1920). 그러나, iPSC는 배아줄기세포에서처럼 테라토마(teratoma)라는 암이 발생함과 동시에 생체에 이식시 분화조절이 잘 되질 않아, 원하는 세포로의 생체 내 전환이 안된다는 한계를 가지고 있다.
따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해 최근에는 직접적인 유도법 또는 직접 리프로그래밍법(Direct Conversion/reprogramming) 을 통해 특정 lineage의 세포로 분화시키는 기술이 주목받고 있다. 해당 기술은 완전히 분화가 끝난 세포, 즉, 섬유아세포에 특정 lineage 특이 유전자 등을 도입하여 전분화능(pluripotent) 상태를 거치지 않고 직접 특정세포를 유도하는 기술로 전분화능 세포의 종양 형성(teratoma) 위험을 배제할 수 있는 기술이다. 특히 한번 손상되면 영구적인 데미지를 받을 수 있는 신경세포의 경우 세계 여러 연구진들이 활발하게 직접유도를 시도하였다. 그 결과 2010년 미국 Marius Wernig 교수팀에 의해 섬유아세포로부터 기능을 할 수 있는 신경세포를 직접 유도하는데 성공했다 [Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sudhof TC, Wernig M (2010) Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463(7284):1035-1041. doi:10.1038/nature08797]. 하지만 자기재생능 없는 유도 신경세포(induced neurons)는 체외에서 일정기간 이상 배양이 어렵고 따라서 충분한 양의 세포를 확보할 수 없기 때문에 직접 리프로그래밍에 관여하는 분자 세포학적 메커니즘을 비롯하여 세포치료에 필요한 충분한 양의 세포를 얻어내는 것이 현실적으로 불가능하다.
그 후 독일의 두 연구팀은 마우스 섬유아세포에 유전자 도입을 통해 유도 신경줄기세포(iNSC; induced neural stem cell)를 생성하는데 성공했다 [Thier M. Worsdorfer P, Lakes YB, Gorris R, Herms S, Opitz T, Seiferling D, Quandel T, Hoffmann P, Nothen MM, Brustle O, Edenhofer F (2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 10(4):473-479. doi:10.1016/j.stem.2012.03.003]. 인간의 경우 섬유아세포에 SOX2 유전자 1개를 도입하여 iNSC 유도를 성공했다는 보고가 있었다 [Thier M, Worsdorfer P, Lakes YB, Gorris R, Herms S, Opitz T, Seiferling D, Quandel T, Hoffmann P, Nothen MM, Brustle O, Edenhofer F (2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 10(4):473-479. doi:10.1016/j.stem.2012.03.003].
그러나, 종래 이러한 인자들을 사용하여 유도 신경줄기세포를 제조하는 경우 유도 효율이 낮고 증식이 어려워 향후 치료 목적으로 사용되기에는 한계가 있다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 분화된 세포로부터 유도 신경줄기세포 또는 신경세포를 생산할 수 있는 신규한 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경줄기세포 또는 신경세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 하나의 목적은, SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2) 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2(High mobility group AT-hook 2) 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 구비하는, 비신경 세포의 신경줄기세포(NSC)로의 리프로그래밍 유도용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, (a) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나; 또는, 비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포; 또는 상기 유도 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 유도 신경줄기세포; 또는 상기 유도 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, 신경세포 재생용 세포 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 신경세포손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 1) 분리된 비신경 세포를 준비하는 제1단계: 2) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나, 또는, 비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시켜 유도 신경줄기세포의 생성을 유도하는 제2단계; 3) 선택적으로, 제2단계에서 생성된 유도 신경줄기세포로부터 신경세포를 형성시키는 제3단계; 및 4) 제1단계 이후 또는 제2단계 이후에 후보물질을 처리하여, 후보물질의 처리 유무에 따라 유도 신경줄기세포 또는 신경세포의 생성 여부 또는 생성 정도를 확인하는 제4단계를 포함하는, 신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제 또는 재생 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 1) 분리된 비신경 세포를 준비하는 제1단계: 2) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나, 또는, 비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시켜 유도 신경줄기세포의 생성을 유도하는 제2단계; 3) 제2단계에서 생성된 유도 신경줄기세포로부터 신경세포를 형성시키는 제3단계; 및 4) 제3단계에서 형성된 신경세포에 후보물질을 처리하여, 상기 비신경 세포가 유래된 개체에 맞춤형인 신경세포 치료제를 확인하는 제4단계를 포함하는, 개인 맞춤형 신경세포 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 비신경 세포의 신경줄기세포(NSC)로의 리프로그래밍 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 세포 증식용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기세포의 생산 방법은 유도 인자로서 SOX2와 HMGA2의 2개 유도인자만을 이용하여도 비신경 세포로부터 유도 신경줄기세포를 제작할 수 있기 때문에, 기존의 4개의 인자, 5개의 유도인자를 이용한 생산 방법보다 더 효율적인 유도 신경 줄기세포를 제작할 수 있다. 또한 SOX2 유전자 1개만을 도입하였을 때보다 유도 효율 및 증식력이 현저히 우수하므로 치료 목적으로 활용가능성이 더 높아질 수 있다.
본 발명은 신경줄기세포로의 리프로그래밍 과정상 리프로그래밍 인자 조합에 Oct4를 사용하지 않았기 때문에, 역분화 과정을 거치지 않고, 분화된 세포를 신경줄기세포로 직접 리프로그래밍시켰다고 볼 수 있다. 제조된 유도 신경줄기세포는 마우스 뇌조직으로 이식하였을 경우에도 자기-재생능과 증식력을 갖추고 있을 뿐만 아니라, 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 등과 같은 신경관련 세포로 충분히 분화가 가능함에 따라, 향후 치료 목적으로도 활용할 수 있다.
도 1a는 명시야 현미경(bright-field microscopy)을 통해 본 인간 신생아 피부 섬유아세포(hDFs)의 모폴로지를 나타낸다.
도 1b는 명시야 현미경(bright-field microscopy)을 통해 본 SOX2-형질도입된 hDF로부터 유도된 iNSC를 나타낸다.
도 1c는 SOX2 형질도입에 의해 생성된 초기 뉴로스피어-유사 콜로니의 명시야 이미지를 나타낸다.
도 1d는 PAX6, NESTIN에 대한 항체를 사용하여 hDF-iNSC의 NSC-특이적 마커 단백질의 면역세포화학적 분석 결과를 나타낸다.
도 1e는 VIMENTIN, SOX2에 대한 항체를 사용하여 hDF-iNSC의 NSC-특이적 마커 단백질의 면역세포화학적 분석 결과를 나타낸다.
도 1f는 hDF, H9-NSC 및 hDF-iNSC(SOX2)에서의 글로벌 miRNA 발현 프로파일의 Heat map을 나타낸다.
도 1g는 hDF, H9-NSC 및 hDF-iNSC(SOX2)에서의 신경계통-특이적 miRNA의 Heat map을 나타낸다.
도 1h는 hDF, H9-NSC 및 hDF-iNSC(SOX2)에서의 miR-124-3p의 정량적 실시간-PCR 결과를 나타낸다.
도 1i는 hDF, H9-NSC 및 hDF-iNSC(SOX2)에서의 miR-9-5p/-3p의 정량적 실시간-PCR 결과를 나타낸다.
도 1j는 정량적 실시간-PCR을 통해 측정한 hDF, H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) 및 hESC에서의 배아줄기세포-특이적 miR-302/367 패밀리의 상대적인 발현 수준을 나타낸다.
도 1k는 정량적 실시간-PCR을 통해 측정한 hDF, H9-NSC 및 hDF-iNSC(SOX2)에서의 let-7/miR-98 패밀리의 상대적인 발현 수준을 나타낸다.
도 1l은 miR-124-3p, miR-9-5p, miR-9-3p, anti-let-7b 및 let-7b의 SOX2-형질도입된 hDF로의 형질전환 이후에 측정한, PAX6 및 NESTIN 양성 콜로니 형성의 효율성을 나타낸다.
도 2a는 hDF 대조군, SOX2-, SOX2/CMYC-, SOX2/LIN28- 및 SOX2/HMGA2-형질도입된 hDF에서 수행한 MTT 세포증식 어세이 결과를 나타낸다.
도 2b는 SOX2-, SOX2/CMYC-, SOX2/LIN28- 및 SOX2/HMGA2- 형질도입된 hDF에서 측정한 콜로니 생성 시간을 나타낸다.
도 2c는 SOX2-, SOX2/CMYC-, SOX2/LIN28- 및 SOX2/HMGA2- 형질도입된 hDF에서 측정한 PAX6 및 NESTIN 양성 콜로니 형성의 효율성을 나타낸다.
도 2d는 바이러스 도입한지 7일 이후에, hDF 대조군, SOX2-, SOX2/CMYC-, SOX2/LIN28- 및 SOX2/HMGA2- 형질도입된 hDF의 NSC 세포 표면 마커(CD44) 및 양성 마커(CD184)로 수행한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 2e는 명시야 현미경(bright-field microscopy)을 통해 본 hDF-iNSCs (SOX2/HMGA2)의 모폴로지 및, PAX6, NESTIN, Ki67 및 HMGA2 발현의 면역세포화학적 분석결과를 나타낸다.
도 2f는 hDF의 발현 수준과 비교한 H9-NSC, hDF-iNSC(SOX2) 및 hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)에서의 NSC-특이적 miRNA 발현의 정량적 실시간-PCR 분석결과를 나타낸다.
도 2g는 hDF, H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) 및 hDF-iNSC (SOX2/HMGA2) 유래의 DNA의 bisulfate 처리에 의한 SOX2 유전자 프로모터의 메틸화 패턴에 대한 분석결과를 나타낸다.
도 3a는 세 가지 주요 세포 유형, 즉 뉴런 (α-internexin, TH, DCX, ChAT, NF, MAP2 and TUJ1), 별아교세포 (GFAP), 및 희소돌기아교세포 (OLIG2 and O4)로의 분화 이후의 hDF-iNSC(SOX2/HMGA2)의 면역세포화학적 분석결과를 나타낸다.
도 3b는 전압-클램프 계량에 의해 기록된 hiNSC(human induced neural stem cell) 유래의 뉴런의 나트륨 전류 및 활성 전위를 나타낸다.
도 3c는 리도카인에 의한 나트륨 전류의 차단 이후의 전압-클램프 계량에 의해 기록된 hiNSC 유래의 뉴런의 나트륨 전류 및 활성 전위를 나타낸다.
도 3d는 세척(washout) 이후 나트륨 전류의 회복에 따른 전압-클램프 계량에 의해 기록된 hiNSC 유래의 뉴런의 나트륨 전류 및 활성 전위를 나타낸다.
도 3e는 4주령 마우스의 해마회 부위로의 CM-DiI-라벨링된 hiNSC의 이식 이후에 hiNSC가 뉴런(TUJ1), 별아교세포(GFAP) 및 희소돌기아교세포(MBP)로 분화되고 CM-DiI와 동시 존재하게 됨(co-localized)을 나타낸다.
도 4a는 SOX2/HMGA2로 인간 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포로부터 iNCS를 생성하는 과정에 관한 도이다. 바이러스 도입 이후 7일이 경과한 때에 뉴로스피어-유사 콜로니가 생성되었으며, hUCB-MSC 유래의 hiNSC가 PAX6 (적색), NESTIN (녹색) 및 DAPI (청색)로 면역염색되었음을 나타낸다.
도 4b는 SOX2, SOX2/CMYC, SOX2/LIN28 및 SOX2/HMGA2가 형질도입된 노화된 hUCB-MSC의 모폴로지(21일 경과)를 나타낸다. 노화된 hUCB-MSC는 β-갈락토시데이즈 활성으로 평가되었고, 초기 iNSC 클러스터는 SOX2/HMGA2의 형질도입에 의해서만 생성되었다.
도 4c는 대조군, SOX2-, SOX2/CMYC-, SOX2/LIN28 및 SOX2/HMGA2- 형질도입된 노화된 hUCB-MSC에서의 PAX6 및 NESTIN 양성 콜로니의 수를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 4d는 hUCB 유래의 CD34+ 세포로부터 hiNSC를 리프로그래밍하는 전략을 나타낸 실험 개요도이다.
도 4e는 유세포 분석에 의한 CD34+ 세포의 순도를 점산포도(dot plot)로 나타낸다. 단핵세포로부터 분리된 CD34+ 세포는 84.15%의 순도를 나타내었다.
도 4f는 면역화학분석법에 의한 hUCB-CD34+ iNSC의 특성을 나타낸 도로서, 세포를 NSC-특이적 마커인 PAX6, NESTIN 및 SOX2과, 뉴런 마커인 NF, 및 별아교세포 마커인 GFAP로 염색한 결과를 나타내었다.
도 5는 PAX6, NESTIN, SOX2, Ki67 및 HMGA2로 면역염색된 H9-NSC를 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 6의 A는 miR-CTL, 50nM 또는 100nM의 let-7b로 형질전환된 hDF-iNSCs (SOX2)에 BrdU를 2.5시간 동안 처리하고, BrdU-특이적 항체(녹색) 및 DAPI(청색)으로 면역염색된 결과를 나타낸다.
도 6의 B는 miR-CTL, 50nM 또는 100nM의 let-7b로 형질전환된 hDF-iNSCs (SOX2)에서 BrdU 양성세포를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 6의 C는 miR-CTL, 50nM 또는 100nM의 let-7b로 형질전환된 세포의 뉴로스피어의 직경을 나타낸다.
도 6의 D는 miR-CTL, 50nM 또는 100nM의 let-7b로 형질전환된 세포의 절대 수를 나타낸다.
도 6의 E는 miR-CTL, 50nM 또는 100nM의 let-7b로 형질전환된 세포의 1차 뉴로스페어 세포의 비율을 나타낸다.
도 7a는 hDF-iNSC (SOX2), hDF-iNSC (SOX2/HMGA2) 및 H9-NSC에서의 NSC의 음성 세포표면 마커(CD44)와, 양성 마커(CD184)의 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 7b는 hDF, H9-NSC, hDF-iNSC (SOX2) 및 hDF-iNSC (SOX2/HMGA2)의 글로벌 유전체 heat map을 나타낸다.
도 7c는 hDF-iNSC (SOX2/HMGA2)과 hDF; 및 hDF-iNSC (SOX2/HMGA2)과 H9-NSC를 비교하는 산포도이다.
도 8의 A는 siCTL 또는 50nM의 siHMGA2로 형질전환된 hDF-iNSCs (SOX2)에 BrdU를 2.5시간 동안 처리하고, BrdU-특이적 항체(녹색) 및 DAPI(청색)으로 면역염색된 결과를 나타낸다.
도 8의 B는 siCTL 또는 50nM의 siHMGA2로 형질전환된 hDF-iNSCs (SOX2)에서 BrdU 양성세포를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 8의 C는 siCTL 또는 50nM의 siHMGA2로 형질전환된 세포의 뉴로스피어의 직경을 나타낸다.
도 8의 D는 siCTL 또는 50nM의 siHMGA2로 형질전환된 세포의 절대 수를 나타낸다.
도 8의 E는 siCTL 또는 50nM의 siHMGA2로 형질전환된 세포의 1차 뉴로스피어 세포의 비율을 나타낸다.
도 9a는 세 가지 주요 세포 유형, 즉 뉴런 (ChAT, NF 및 MAP2), 별아교세포 (GFAP), 및 희소돌기아교세포 (O4)로의 분화 이후의 H9-NSC의 면역세포화학적 분석결과를 나타낸다.
도 9b는 전압-클램프 계량에 의해 기록된 hiNSC 유래의 뉴런의 나트륨 전류 및 활성 전위를 나타낸다.
도 9c는 리도카인(0.1%)에 의한 나트륨 전류의 차단 이후의 전압-클램프 계량에 의해 기록된 hiNSC 유래의 뉴런의 나트륨 전류 및 활성 전위를 나타낸다.
도 9d는 세척(washout) 이후 나트륨 전류의 회복에 따른 전압-클램프 계량에 의해 기록된 hiNSC 유래의 뉴런의 나트륨 전류 및 활성 전위를 나타낸다.
도 9e는 이식된 CM-DiI-라벨링된 hiNSC의 면역조직화학적 결과를 나타낸다.
도 10a는 hMSC 및 hMSC 유래의 iNSC에서의 hMSC 표면 마커(음성 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR, 양성 마커: CD73 및 CD105)의 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 10b는 hUCB-MSC 및 hDF의 3가지 다른 라인에서의 HMGA2의 발현수준에 대한 웨스턴 블랏분석 결과를 나타낸다.
도 10c는 hUCB-MSC에의 SOX2 또는 SOX2/HMGA2의 형질도입 이후에 측정한 PAX6 및 NESTIN 양성 콜로니 형성효율을 나타낸다.
도 10d는 누적 집단 더블링 레벨 분석(Cumulative Population Doubling Level Analysis)에 의해 결정된 H9-NSC, hDF-iNSC 및 hMSC-iNSC의 증식 속도를 나타낸다.
도 10e는 SOX2- 또는 SOX2/HMGA2 형질도입된 hUCB-CD34+ 세포에서 측정된 PAX6 및 NESTIN 양성 콜로니 형성효율을 나타낸다.
도 11은 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)의 분화능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)를 HMGA2로 형질전환시킨 효율(transduction efficiency)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 HMGA2 형질 도입된 8 계대 이하의 early stage 의 인간 제대혈 유래기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 HMGA2의 발현 정도를 면역세포 화학적 방법(immunocytochemical analysis)으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 HMGA2 형질 도입된 8 계대 이하의 early stage 의 인간 제대혈 유래기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 HMGA2의 발현 정도를 마이크로 어레이로 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 HMGA2 형질이 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 HMGA2의 발현 정도를 PCR 방법에 따라 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 HMGA2 형질이 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 모폴로지를 phase contrast image 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 17은 HMGA2 형질이 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 SA-β-gal(Senescence associated beta-galactosidase)의 발현 정도를 β-gal staining 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 HMGA2 형질이 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 증식을 MTT assay 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 19는 HMGA2 형질이 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 과발현 관련 신호 경로와 관련된 유전자와 분자 세포 기능과 관련된 유전자를 IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis) 소프트 웨어로 특정한 결과를 나타낸다.
도 20은 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 과발현이 PI3K/AKT 경로 및 mTOR/p70s6K 에 미치는 영향력을 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다.
도 21은 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 모폴로지를 phase contrast image 방법으로 측정한 결과 및 HMGA2 억제된 hUCBSCs 세포의 노화 정도를 확인하기 위하여 계대 진행에 따른 SAb-gal(Senescence associated beta-galactosidase) 의 발현 정도를 β-gal staining 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 22는 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 증식을 MTT assay 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 23은 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포 (hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 발현 억제가 PI3K/AKT 경로 및 mTOR/p70s6K 에 대해 미치는 영향력을 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타내었다.
도 24는 HMGA2 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 지방 조직으로의 분화능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 25는 HMGA2 과발현 인간 제대혈 유래 기질 세포의 유전자 발현과 HMGA2 억제 인간 제대혈 유래 기질 세포의 유전자 발현을 대비한 결과를 나타낸다.
도 26은 HMGA2 과발현 인간 제대혈 유래 기질 세포의 유전자 발현과 HMGA2 억제 인간 제대혈 유래 기질 세포의 유전자 발현을 대비한 결과 선택된 8개의 유전자에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도 27은 HMGA2 가 인간 제대혈 유래 기질 세포에서 HMGA2 과발현시 발현이 증가하고 HMGA2 억제시 발현이 감소하는 유전자, HMGA2 과발현시 발현이 감소하고 HMGA2 억제시 발현이 증가하는 유전자를 선택하고, 선택된 유전자에 대해 PCR 을 수행한 결과를 나타낸다.
도 28는 제대혈 유래 단핵구세포로부터 분리된 CD34+ 세포의 유세포 분석(flow cytometry)한 결과를 나타낸다.
도 29는 CD34+ 특이적 배지에서의 배양일수에 따른 CD34+ 세포 수의 증감을 나타낸다.
도 30은 CD34+ 세포에서 유도 신경줄기세포로의 형태가 변화되는 과정을 나타낸다.
도 31은 면역염색을 통한 CD34+ iNSC의 DAPI, Nestin, HMGA2, SOX2의 발현형태를 나타낸다.
본 발명은 SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2) 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2(High mobility group AT-hook 2) 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 구비하는, 비신경 세포의 신경줄기세포(NSC)로의 리프로그래밍 유도용 키트를 제공한다.
본 발명은 비신경 세포 등의 표적 세포 내에서 종래 신경 분화 전사인자로 잘 알려진 SOX2 인자와 HMGA2의 2개 인자의 발현을 증가시킴으로써 표적 세포로부터 유도 신경줄기세포를 생산하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 유도 신경 줄기세포의 생산 방법은 유도 인자로서 SOX2와 HMGA2의 2개 유도인자만을 이용하여도 비신경 세포로부터 유도 신경줄기세포를 제작할 수 있기 때문에, 기존의 4개의 인자, 5개의 유도인자를 이용한 생산 방법보다 더 효율적인 유도 신경줄기세포를 제작할 수 있다. 또한 SOX2 유전자 1개만을 도입하였을 때보다 리프로그래밍에 소요되는 기간이 현저히 단축될 뿐만 아니라, 리프로그래밍 유도 효율 및 증식력이 현저히 우수하므로 치료 목적으로 활용가능성이 더 높아질 수 있다.
SOX2 단백질은 성결정부위(Sex determining Region) Y-box2(Sox2) 유전자에 의해 발현되는 단백질로서, 태생기의 중추 신경에 발현하며, 신경줄기세포의 자기복제에 관계하는 유전자로 알려져 있지만, 악성 신경교종에 있어서도 많이 발현되고 있음이 알려져 있다.
HMGA2(High-mobility group AT-hook 2) 단백질은 DNA에 결합하여 크로마틴 구조를 변경시킬 수 있으며 이로 인해 유전자 전사(transcrption)의 변화를 유발할 수 있는 인자로 알려져 있다.
본 발명에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질, 또는 이들을 코딩하는 핵산분자는 인간 또는 쥐 등 동물 유래의 모든 SOX2 및 HMGA2를 포함하며, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 SOX2 및 HMGA2일 수 있다. 또한, 본 발명의 SOX2 및 HMGA2 단백질은 이의 야생형의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 변이체도 포함할 수 있다. SOX2 및 HMGA2 단백질의 변이체란 SOX2 및 HMGA2의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리·화학적 성질이 변형된 변이체로서, 물리·화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
본 발명에서 "SOX2 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자"는 SOX2 또는 HMGA2 단백질의 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 SOX2 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 상기 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자는 각각 독립적으로 발현벡터에 포함된 형태를 가질 수 있다.
구체적으로, 상기 SOX2 단백질 또는 HMGA2 단백질은, 이들을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 시험관 내에서 세포주로부터 발현된 형태의 단백질일 수 있다. 상기 발현벡터는 Baculovirus 발현벡터, Mammalian 발현벡터 또는 Bacterial 발현벡터를 이용할 수 있으며, 상기 세포주는 곤충세포주, 포유동물 세포주 또는 박테리아 세포주를 이용할 수 있으나, 이에 의하여 본 발명에서 이용가능한 발현벡터 및 세포주가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "발현벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물일 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 비신경 세포에 리프로그래밍 유도인자를 전달하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현조절요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더서열을 선택적으로 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 발현벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등의 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스, 센다이 바이러스(Sendai virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SOX2 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자는 messenger RNA(mRNA)일 수 있다.
본 발명에서 "리프로그래밍(reprogramming)"은 분화능이 없는 세포 또는 일정부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화된 세포로부터 최종적으로 새로운 유형의 분화잠재력을 갖는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스이다. 이러한 세포의 리프로그래밍 기작은 핵 내의 후생유전학(뉴클레오타이드 서열에서의 변화없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득한다. 이러한 별개의 유전자 발현 패턴은 후생유전학적 변형, 예컨대 DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 기타 염색질 결합 단백질에 의해 실질적으로 조절되는 것으로 여겨진다. 따라서 다세포 생물 내의 각각의 세포 유형은 일반적으로 일단 세포가 분화되거나 세포 주기를 벗어나게 되면 고정되어 변하지 않게 되지만, 정상적인 발달 과정 중 특정 기간 동안 또는 특정 질환이 진행되는 경우에는 일부 세포에 주요 후생 유전학적 리프로그래밍이 진행되기도 한다. 본 발명에서는 이미 분화된 대상 세포에 특정 단백질을 처리함으로써 대상 세포가 리프로그래밍된 결과, 미분화 세포의 능력을 갖는 세포를 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "리프로그래밍 유도인자"란 최종적으로 또는 일정부분 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 유도 신경줄기세포로 리프로그래밍되도록 유도하는 물질로서, SOX2 단백질 또는 HMGA2 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 분화된 세포의 리프로그래밍를 유도하는 물질이면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 HMGA2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 크로마틴 조절인자(chromatin modulator)일 수 있다. 여기서 크로마틴은 염색질이라고도 하며, DNA와 히스톤 단백질의 복합체의 기본구조를 가진 뉴클레오솜(nucleosome)이다. 크로마틴의 조절(modulation)은 DNA가 히스톤을 감싸는 방식이 변하면서 해당 유전자의 발현의 양상이 변하도록 하며, 구체적인 예로는 히스톤의 아세틸화, DNA의 메틸화 등이 있다. 따라서 DNA의 메틸화/탈메틸화에 의해 크로마틴이 조절될 수 있으며, HMGA2가 SOX2 유전자의 프로모터 부위의 저메틸화를 촉진함으로써 크로마틴 조절인자로서 작용할 수 있다(실시예 4-5).
본 발명에서 "비신경 세포"는 신경세포가 아닌 모든 분화 또는 미분화된 세포를 포함하며, 본 발명의 표적세포 역할을 한다. 본 발명의 비신경 세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐 및 토끼 등의 다양한 동물로부터 유래한 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 세포일 수 있으나, 이에 의하여 유도 신경줄기세포로 리프로그래밍시킬 수 있는 세포가 제한되는 것은 아니다.
상기 비신경세포는 체세포, 성체줄기세포 또는 만능줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 "체세포"는 분화능 및 자가재생능이 제한된 성체를 구성하는 세포로서, 구체적으로는 상기 체세포는 인간의 피부, 모발, 지방, 혈액 등을 구성하는 체세포일 수 있고, 바람직하게는 인간 섬유아세포 또는 인간 제대혈 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "성체줄기세포"는, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등에 존재하는 줄기세포로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "유도 신경줄기세포"는 분화된 세포에 리프로그래밍 기술을 이용하여 신경줄기세포와 유사 또는 동일한 다분화능(pluripotency)을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 세포들을 포함한다. 유도 신경줄기세포는 신경줄기세포와 동일 또는 유사한 특성을 가지고 있는데, 구체적으로는 비슷한 세포형태를 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 유도 신경줄기세포는 신경세포(뉴런), 별아교세포, 희소돌기아교세포, GABA성 신경 세포 또는 도파민성 신경 세포 등으로 분화가능한 것일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 제1 조성물; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 제2 조성물이 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 분화능이 없는 인간 섬유아세포의 유도 신경줄기세포로의 리프로그래밍 유도 과정에서 SOX2 및 HMGA2 단백질의 기여를 확인하기 위하여, 이들 단백질을 과발현시켰고, 지속적으로 세포형태의 변화와 PAX6/NESTIN-양성 콜로니 분석을 통해 리프로그래밍 유도 효율을 검증하였다. 그 결과, SOX2 및 HMGA2의 발현을 동시에 증가시켰을 경우, SOX2 단독으로 발현을 증가시킨 경우에 비하여, 유도 신경줄기세포로의 리프로그래밍 유도 효율을 비롯한, 자가재생능, 증식능 및 신경세포로의 분화능이 확인할 수 있었다. 특히, HMGA2와 함께 리프로그래밍을 유도한 경우 10일 정도 일찍 유도 신경줄기세포 콜로니가 형성됨을 확인하였다.
또한, SOX2 및 HMGA2이 제대혈 유래 중간엽줄기세포(hUCB-MSC) 및 제대혈 유래 혈액세포를 유도 신경줄기세포로 효과적으로 리프로그래밍시키는데 기여할 수 있음을 확인하였으며, 특히, HMGA2에 의하여 리프로그래밍 효율이 보다 향상되고, 리프로그래밍에 요구되는 시간이 단축됨을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 비신경세포로서, 제대혈 유래 중간엽줄기세포는 성체줄기세포의 대표적인 실시예이며, 제대혈 유래 혈액세포는 체세포의 대표적인 실시예인 바, 이러한 결과는 SOX2 및 HMGA2를 리프로그래밍 유도인자로 사용하여 체세포뿐만 아니라, 성체줄기세포 역시 유도 신경줄기세포로 효과적으로 리프로그래밍 시킬 수 있음을 나타낸다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법은 (a) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나; 또는, 비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 (c) 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 신경줄기세포-유사 콜로니(neural stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 유도 신경줄기세포의 생산 방법에 있어서, 표적 세포 내의 SOX2 및 HMGA2의 발현을 증가시키는 방법은 상기 표적세포 내로 SOX2 및/또는 HMGA2 의 발현조절인자를 도입하여 표적세포 내의 SOX2 및 HMGA2의 발현을 증가시키는 방법이 모두 가능하다.
구체적으로, 상기 (a) 단계의 SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자와 같은 리프로그래밍 유도인자를 세포에 전달하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 리프로그래밍 유도인자를 비신경 세포의 배양액에 투여하는 방법 또는 리프로그래밍 유도인자를 비신경 세포에 직접 주입하는 방법을 사용할 수 있으며, 이 때 사용되는 리프로그래밍 유도인자는 해당인자의 유전자, 즉 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 각각 삽입한 바이러스 벡터로 형질전환시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스, 시험관 내 전사(in vitro transcription)에 의해 생산한 메신저 RNA, 또는 다양한 세포주 내에서 생산된 단백질 등의 형태로 사용할 수 있다.
상기 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스바이러스, 센다이 바이러스 등에서 유래한 벡터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 패키징 세포는 사용된 바이러스 벡터에 따라 당업계에 공지된 다양한 세포를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, SOX2 및/또는 HMGA2의 발현조절인자를 도입하여 표적세포 내의 SOX2 및 HMGA2의 발현을 증가시킬 수도 있다.
구체적으로 상기 HMGA2의 발현 조절 인자는 let-7 miRNA 클러스터 억제제 또는 PDE4D 억제제일 수 있다. 상기 Let-7 miRNA 클러스터의 경우 HMGA2를 표적하여 그 발현을 감소시키는 miRNA로 알려져 있다. 본 발명의 경우 상기 Let-7 miRNA 클러스터의 억제제를 도입함으로써 표적 세포 내에서 HMGA2의 발현량을 증가시키는 것이 가능하다.
또한, 상기 SOX2의 발현 조절 인자는 PDE4D 억제제일 수도 있다. cAMP 활성화의 일차적 세포 기전은 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제(PDE)로 불리는 동종효소 계열에 의한 cAMP의 분해로 알려져있다. PDE 계열에는 12개의 알려진 일원이 있다. PDE IV형 (PDE4)의 억제가 염증 매개 방출의 억제 및 기도 평활근의 이완 둘 다에 있어서 특히 효과적이라고 인정된다. cAMP의 활성화는 SCI 후, 억제 신호를 극복하기 위한 신경세포 유도를 위한 유망한 전략으로 제시되었다. PDE4 억제제인 롤리프람(rolipram)에 의한 cAMP 가수분해의 억제는 척수 타박상 후 cAMP 수준의 감소를 방지하여, 신경집세포(Schwann cell) 이식편과 결합하는 경우, 상당한 위척수 및 고유감각 축삭보존 및 수초형성을 촉진함을 밝혀져 있다. PDE IV 활성의 억제제로서 SelCID™을 사용하는 것이 가능하다.
따라서, SOX2 및 HMGA2의 공통된 발현조절인자인 PDE4D 억제제를 사용함으로써 SOX2 및 HMGA2의 발현량을 모두 증가시켜 리프로그래밍의 유도 효율 등을 현저히 증가시킬 수 있다.
상기 리프로그래밍 유도인자는 본 발명의 SOX2 및 HMGA2의 리프로그래밍 유도인자 이외에, OCT4, KlF4, CMYC, LIN28 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질, 또는 이들 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산분자가 추가로 포함될 수 있다. 상기 단백질은 이미 공지된 리프로그래밍 유도인자로서, 특히 이 중 CMYC, LIN28은 Let-7 miRNA 클러스터이므로 추가로 발현을 증가시킴으로써 리프로그래밍 유도 효율을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2를 코딩하는 핵산 분자의 도입하기 위해 기타 나노 입자 또는 화합물 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 (b) 단계에서 상기 세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 세포에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　
단계 (b)는 신경세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 상기 유도 신경줄기세포로부터 신경세포가 형성되게 할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 제공한다.
상기 유도 신경줄기세포에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 유도 신경줄기세포가 뉴런, 별아교세포 및 희소돌기아교세포로 분화할 수 있음을 실시예에서 확인하였는 바, 상기 유도 신경줄기세포로 분화된 신경세포 또한 수득할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, 신경세포 재생용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에 따른 유도 신경줄기세포는 신경관련세포로 분화할 수 있는 세포에 해당하므로, 신경세포 재생에 유용한 바 이를 세포치료제로 사용할 수 있다.
본 발명의 세포치료제는 1㎖ 당 1.0×105개 내지 1.0×109개, 바람직하게는 1.0×106개 내지 1.0×108개, 보다 바람직하게는 1.0×107개의 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포치료제는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 상기 세포치료제는 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 세포치료제에는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 세포의 1일 투여량은 1.0×104 내지 1.0×1010 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 신경세포 손상의 억제 또는 회복방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 전달하는 단계; 및 상기 세포를 배양하는 단계에 의해 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 투여함으로써 피험체의 신경세포 손상을 억제하거나 또는 회복시킬 수 있다.
본 발명에서 "피험체"란 소, 개, 돼지, 닭, 양, 말, 인간을 포함한 포유동물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포 또는 그 배양물의 투여는 복강 또는 혈관 내 투여, 병변으로의 직접 투여 또는 관절의 활강(Synovial cavity) 내 투여 등일 수 있다.
상기 신경세포 손상의 억제 또는 회복은 신경세포 손상질환의 예방 또는 치료하는 것을 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2) 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2(High mobility group AT-hook 2) 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 신경세포손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 설명한 바와 같이, SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2) 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2(High mobility group AT-hook 2) 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함한 조성물을 비신경세포 내로 도입시켜 신경 줄기세포로의 리프로그래밍 유도함으로써 신경세포손상 질환 예방 또는 치료용도로 사용할 수 있다.
또한, 상기 SOX2 및/또는 HMGA2 유전자는, 당업계에 공지된 세포 내 유전자 전달체, 또는 수송체를 추가로 포함한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 리포플렉스(lipoplex), 폴리플렉스(polyplex), CPP(cell permeable peptide) 또는 PTD(protein transduction domain) 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PTD는 SOX2 및/또는 HMGA2의 세포 내 도입 효율을 증진시킬 수 있는 것이라면 종류에 제한없이 사용될 수 있다.
또한, SOX2 및/또는 HMGA2는 플라스미드 SOX2 및/또는 HMGA2와 이를 세포 내로 전달하기 위한 수송체가 결합된 콘쥬게이트가 코딩하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, SOX2 및/또는 HMGA2와, CPP 또는 PTD가 결합된 융합 단백질인 형태, 또는 SOX2 및/또는 HMGA2와 저분자형 프로타민 콘쥬게이트(Low molecular weight protamine)이 결합된 융합 단백질 형태일 수 있다.
본 발명에서 "신경세포 손상질환"은 신경세포의 변형, 손실 등이 원인이 되어 발생하는 질환으로, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환, 척추 손상(spinal cord injury) 등을 포함할 수 있으나, 상기 예에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "예방"은 상기 조성물의 투여로 신경세포 손상질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 포함하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 신경세포 손상 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 포함한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 분리된 비신경 세포를 준비하는 제1단계: 2) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나, 또는, 비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시켜 유도 신경줄기세포의 생성을 유도하는 제2단계; 3) 선택적으로, 제2단계에서 생성된 유도 신경줄기세포로부터 신경세포를 형성시키는 제3단계; 및 4) 제1단계 이후 또는 제2단계 이후에 후보물질을 처리하여, 후보물질의 처리 유무에 따라 유도 신경줄기세포 또는 신경세포의 생성 여부 또는 생성 정도를 확인하는 제4단계를 포함하는, 신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제 또는 재생 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, 비신경세포의 리프로그래밍에 의한 신경줄기세포 또는 신경세포의 생성 여부 또는 생성 정도는 후보물질의 접촉 전후에 따른 비신경세포의 모폴로지의 변화, 신경줄기세포 특이적 마커의 발현 여부, 자가재생능, 증식능 및 신경세포로의 분화능 등의 변화를 관찰함으로써 평가할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제3단계에서 유도 신경줄기세포 또는 신경세포의 생성 정도가 증가되면 상기 후보물질은 신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 스크리닝 방법은 환자로부터 분리된 비신경 세포를 이용하여, 환자 맞춤형 신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제 또는 재생 억제제를 스크리닝하는 것일 수 있다.
구체적으로, 환자 개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 신경세포 재생 촉진제 또는 재생 억제제를 결정하여 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 따라서 상기 스크리닝 방법에 의하여 신경세포 재생 촉진제 또는 재생 억제제의 후보약물을 선정 및 신경질환 환자에 처리하여 치료효과를 확인 및 매핑·저장함으로써 맞춤형 치료제를 선택할 수 있다. 즉, in vitro 스크리닝 방법과 in vivo 검증방법을 모두 포함하여, 신경세포 손상관련 질환의 환자 맞춤형 치료제를 보다 효과적으로 선발하고 검증할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 스크리닝 방법을 통해 SOX2 등의 유전자를 도입하는 경우보다 HMGA2의 유전자를 추가로 도입하는 경우에 유도 신경줄기세포로의 유도 효율이 약 2배 이상 향상되는 것을 확인할 수 있었으며, 따라서 HMGA2 단백질이 신경세포 재생 촉진제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 분리된 비신경 세포를 준비하는 제1단계: 2) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나, 또는, 비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시켜 유도 신경줄기세포의 생성을 유도하는 제2단계; 3) 제2단계에서 생성된 유도 신경줄기세포로부터 신경세포를 형성시키는 제3단계; 및 4) 제3단계에서 형성된 신경세포에 후보물질을 처리하여, 상기 비신경 세포가 유래된 개체에 맞춤형인 신경세포 치료제를 확인하는 제4단계를 포함하는, 개인 맞춤형 신경세포 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 환자 개인의 체질이나 환경에 따른 개인 맞춤형 신경세포 치료제를 선별하기 위하여, 제2단계에서 유도한 신경줄기세포 또는 제3단계에서 형성한 신경세포에 후보물질을 처리하여, 신경재생과 관련된 메커니즘의 변화 및 이와 연관된 단백질 등의 발현변화 등을 확인함으로써, 상기 유도 신경줄기세포를 생성하기 위하여 사용된 비신경 세포가 유래된 개체에 대한 맞춤형 신경세포 치료제가 될 수 있는지 여부를 확인 및 검증할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 비신경 세포의 유도 신경줄기세포(iNSC)로의 리프로그래밍 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 기술적 특징으로서, 종래 신경 분화 전사인자로 잘 알려진 SOX2 인자뿐만 아니라 HMGA2 단백질의 발현을 함께 증가시킴으로써 종래의 SOX2 단일 인자로 리프로그래밍할 경우보다 비신경세포로부터 유도 신경 줄기세포로의 유도 효율 및 증식력이 현저히 우수함을 확인하였다. 따라서, HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자는 비신경 세포의 신경줄기세포로의 리프로그래밍을 촉진하는 용도로 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 세포 증식용 조성물 또는 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "세포 증식"은 세포수의 증가를 포함하며, 따라서 상기 세포증식은 DNA 복제, 세포분열(cell division) 및 각종 세포성분의 증가를 동반하며, 세포증식 속도는 생체 내에서 조절된다.
또한, "세포 노화"는 세포의 형질 및 기능 퇴화와 그것에 이어지는 세포사 혹은 증식 정지가 일어날 때까지의 과정으로서, 노화현상의 원인에 대해서는 세포의 대사산물에 의한 대사저해, 세포표면 변화, 교질원 등의 세포골격분자간 가교결합 증가, 자유라디칼에 의한 세포 내 열화분자 축적, 유전정보 전사·번역 과오축적, 치사유전자에 의해 유전적으로 세포수명이 프로그램화 되어 있는 것, 세포 내 DNA 상해와 수복능 저하 등이 알려져 있다. 본 발명에서의 노화는 세포 노화(cellular senescence) 뿐만 아니라, 조직 또는 생물체의 노화의 의미도 포괄한다. 특히 줄기세포의 노화는 계대 배양 횟수 증가에 따라 줄기세포에서 노화 관련 β-갈락토시다아제 발현이 증가되거나, 줄기세포의 크기가 증가되거나, 줄기세포의 증식률이 감소되거나, 증식기간이 감소되거나, 텔로머라아제 활성 감소, 또는 줄기세포의 분화능이 감소되는 현상이 수반될 수 있다.
본 발명의 실시예 11 내지 20에서는 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)이, 모폴로지 변화가 작아짐은 물론, SA-β-gal 발현 정도의 감소, 세포증식의 유지시킴을 확인하였다. 반면 HMGA2를 억제시킨 경우에는 모폴로지 변화가 커졌으며, SA-β-gal 발현 정도의 증가와 함께 세포증식이 현저하게 감소됨을 확인하였다. 따라서, HMGA2 단백질이 과발현되면 기질 세포의 증식이 촉진되고 노화가 억제되는 것을 확인하였고, 본 발명에 따른 기질 세포의 증식, 유지 및 노화 조절 방법은 기질 세포를 형질 전환하여 HMGA2 단백질 발현을 조절함으로써 기질 세포의 증식을 유도하고 분화능 및 줄기세포능을 유지하여 노화를 방지할 수 있기 때문에 배양시 계대배양을 시행할수록 기질 세포(stromal cells)의 노화가 빠른 속도로 진행되어 세포 분열이 급격히 감소하는 문제점을 해결할 수 있다. 이와 같은 증식 및 노화 조절방법은 줄기 세포에도 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 세포 배양
(1) 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC)는 2, 30대 산모로부터 만삭분만 직후 제대혈을 채취하였고, 채취한 혈액 시료는 분만 후 24시간 이내에 수집된 것만을 실험에 사용하였다. HetaSep solution (Stem Cell Technology, Vancouver, Canada)를 제대혈 시료와 5:1(v/v)의 비율로 혼합하였고, 적혈구가 고갈될 때까지 실온에서 배양하였다. 배양 후, 상층액을 수집하였고, Ficoll (GE healthcare life sciences, Pittsburgh, PA) 밀도-구배 원심분리기를 사용하여 2,500rpm에서 20분간 원심분리시켜 단핵세포를 수집하였다. 상기 수득된 단핵세포를 PBS로 2회 세척하였고, 10% FBS (Gibco BRL)을 포함한 endothelial cell growth medium-2 (Gibco BRL, Grand Island, NY)가 함유된 배양접시에 시딩(seeding)하였다. 본 실험에 사용된 분리 및 조사 프로토콜은 보라매병원 임상시험심사위원회(institutional Review Board (IRB)) 및 서울대학교 임상시험심사위원회((1109/001-006)에 의해 승인 하에 진행되었다.
(2) 한편, 인간 피부 섬유아세포(hDFs, C-013-5C)는 Life thechnologies 사에서 구입하였고, 10% FBS를 함유한 섬유아세포 성장배지-2 (Gibco BRL)에서 배양하였다.
(3) H9 유래의 인간 신경줄기세포(H9-hNSCs, NA800-100)는 Gibco 사에서 구입하였고, StemPro® Neural Supplement, basic FGF, 및 EGF 재조합 단백질을 포함한 KnockOut DMEM/F12 기본배지에서 배양하였다.
(4) 인간 제대혈 유래 기질세포는 다음과 같이 분리 및 배양하였다. 구체적으로, 제대혈(Seoul National University Hospital)의 적혈구를 제거하기 위하여 Hetasep solution(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 제대혈과 5:1의 부피비로 섞은 후 30분 동안 상온에서 배양하였다. 상층액을 주의하여 수집하고, 단일세포를 수집하기 위하여 피콜 용액을 첨가하여 2500 rpm으로 20분 동안 원심 분리하였다. 분리된 세포만을 수득하여 PBS로 두세 번 세척하고 헤파린(heparin), 아스코르빅산(ascorbic acid), 상피세포성장인자(recombinant human epidermalgrowth factor (rhEGF)), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor (VEGF)), 섬유아세포성장인자(recombinant human fibroblast growth factor (rhFGF-B)), 인슐린양 성장인자-1(recombinant long R insulin-like growth factor-1 (R3-IGF-1)), 황산겐타마이신(gentamycin sulfate), 암포테리신 B(amphotericin- B (GA-1000)) 및 10% FBS (Gibco)가 첨가된 EMEM(Gibco) 배양액에 2 × 105 개/㎤ 의 농도로 배양하였다. 배양하고 4일 후, 바닥에 붙지 않은 세포들을 제거하였고, 세포가 80% 합류되었을 때 계대 배양하였다.
제조예 2: 형질도입에 의한 섬유아세포(hDF)로부터 인간 유도 신경줄기세포(hiNSC) 제조
SOX2 플라스미드, HMGA2 플라스미드, CMYC 플라스미드 및 LIN28 플라스미드를 각각, VSV-G 및 gag/pol 플라스미드와 Fugene 6 형질도입 시약 (Roche, Indianapolis, IN)과 함께 293T 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 후 48시간 및 72시간에 생산되는 바이러스를 모아, 5 μg/ml 폴리브렌(polybrene (Sigma, Ronkonkoma, NY))를 첨가함으로써 hDF, hUCB-MSC, 및 hUCB-CD34+MNC에 상기 유전자들을 하나씩 또는 2개 이상의 조합으로 도입시켰다. 형질도입 이후, PBS로 두 번 세척하여 바이러스를 씻어내고, 증식을 위해 증식배지에서 배양하였다.
신경 줄기세포 유도를 위하여, 배지를 bFGF (Sigma) 및 EGF (Sigma)를 함유한 신경 줄기세포 유도용 배지인 ReNcell NSC maintenance Media (Millipore, Billerica, MA)로 갈아주었다. hiNSC는 accutase (Gibco BRL)로 계대배양하였다.
실시예 1: iNSC의 분리와 성상 확인
레트로바이러스 SOX2를 이용해서, STO feeder cell과 함께 폴리-L-오르니틴(PLO) 및 피브로넥틴(FN)이 코팅된 유리 커버슬립(coverslip) 상에서 hDF를 SOX2-형질도입된 hiNSC로 전환시켰다. 전환시킨지 2~3주 내에 SOX2- NSC-유사 콜로니가 형질도입된 hDFs로부터 생성되었다.
유도신경줄기세포 콜로니를 분리하여 반복적인 계대배양 및 뉴로스피어(Neurosphere) 배양을 통해 유도 신경줄기세포를 안정화시켰다. 유도 신경줄기세포의 부착을 위해 커버글라스를 PLO/FN 코팅을 하고 유도 신경줄기세포 5 x 104 개를 뿌려주었다. 24시간 후 4% 파라포름알데히드(PFA)를 이용해 20분간 세포를 고정시키고, 0.3% Triton X-100 PBS를 이용해 10분간 permeabilization시켰다. 이후 5% 정상염소 혈청을 이용해 1시간동안 블로킹시킨 후 1차 항체를 1:100으로 넣어준 후 overnight 시켰다. 다음날 2차 항체를 1:1000으로 1시간 동안 넣어준 후, DAPI를 이용해 핵염색을 실시하고 mounting후 말려주었다.
그 결과, SOX2-형질도입된 iNSC는 H9-유래의 NSC(H9-NSC)와 유사한 모폴로지 특성을 보였고, PAX6, NESTIN, VIMENTIN, 및 SOX2와 같은 NSC-특이적 마커의 발현을 보였다(도 1A 내지 1D).
실시예 2: SOX2-형질도입된 hiNSC에서의 miRNA 발현 프로파일 분석
실시예 2-1: MicroRNA 마이크로어레이 분석
Trizol reagent를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하였고, 형광으로 표지한 miRNA를 생성하기 위하여 100 ng의 총 RNA 시료를 gilent's miRNAs complete labeling and Hyb. kit를 사용하여 라벨링 및 혼성화하였다. 라벨링된 miRNA의 신호를 Agilent microarray scanner를 사용하여 스캔하였다. 원 자료(raw data)는 소프트웨어 (Agilent Feature Extraction Software (v11.0.1.1))를 사용하여 추출하였고, R statistical language v. 2.15.0를 사용하여 분석 및 시각화하였다.
실시예 2-2: miRNA 발현 프로파일 분석결과
상기 실시예 2-1과 같은 마이크로어레이 분석을 통하여 hDF, H9-NSC 및 SOX2-형질도입된 hiNSC의 miRNA 프로파일을 분석하였다.
그 결과, SOX2-형질도입된 hiNSC의 miRNA 발현패턴은 hDF보다 H9-NSC와 더 유사함을 보임을 확인하였다(도 1E).
구체적으로, 섬유아세포에서 기능성 뉴런으로 변화하는데 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 신경계통에 특이적인 miR-9-5p, miR-9-3p 및 miR-124의 발현 수준은 hDF에 비하여 H9-NSC 및 SOX2-형질도입된 hiNSC에서 더욱 상향 조절(up-regulated)되었음을 확인하였다.
또한, NSC 유지 및 자가재생(self-renewal)의 조절의 역할을 담당하고 있는 것으로 알려진 let-7에 대하여도, 모든 let-7/miR-98 패밀리의 발현 수준이 hDF에 비하여 H9-NSC 및 SOX2-형질도입된 hiNSC에서 더욱 하향 조절(down-regulated)되었음을 확인하였다(도 1F 및 1J).
그러나 배아 줄기세포-특이적인 miRNA인 miR-302/367 패밀리의 발현 수준은 hDF, H9-NSC 및 SOX2-형질도입된 hiNSC에서는 큰 차이가 없었고, 인간 배아줄기세포(hESCs)에서만이 발현수준이 높았음을 확인하였다.
실시예 3: Let-7b에 의한 iNSC 리프로그래밍 효율, 증식 및 자가재생(self-renewal) 조절능 분석
실시예 3-1: miRNA 활성에 의한 iNSC 리프로그래밍의 효율 분석
miRNA 활성이 hDF에서 iNSC로의 리프로그래밍을 촉진하는지를 확인하기 위하여, SOX2와 함께 리프로그래밍시키는 동안 miR-9-5p, miR-9-3p, miR-124, anti-let-7b, let-7b, miR-CTL 및 anti-miR-CTL로 형질전환시켰다.
구체적으로, 시판중인 hsa-let-7b(Invitrogen, PM11050), miR-124-3p(Invtirogen, PM10691), miR-9-5p(Invtirogen, PM10022), miR-9-3p(Invtirogen, PM13072), anti-let-7b(Invtirogen, AM11050)으로 miRNA를 과발현시켰고, 적절한 pre-miRNA 전구체-음성 대조군(Invitrogen, AM17110) 및 anti-miRNA 억제자-음성대조군(Invitrogen, AM17010)를 사용하였다.
콜로니 형성 효율 어세이(colony forming efficiency assay)를 위하여, SOX-2 형질도입된 hDF를 형질전환(transfection) 전에 24-웰 플레이트에 2×104 개의 세포를 플레이팅하였다. 50 nM의 hsa-let-7b, miR-124-3p, miR-9-5p, miR-9-3p 및 anti-let-7b를 사용하여 형질전환(transfection)시켰고(day 0), 3일 후에 또 형질전환시켰다(day 3).
그 결과, SOX2-형질도입된 hDF는 NSC-유사 콜로니보다 뉴런-유사세포로 전환되었음을 확인하였다. PAX6/NESTIN 양성 콜로니의 형성효율은 miR-124, miR-9-5p 또는 miR-9-3p 형질전환된 세포에서는 miR-CTL 형질전환된 세포에 비하여 약간 감소하였거나 변화가 없었다.
그러나, let-7b 과발현은 리프로그래밍 효율을 감소시킨 반면, let-7b 억제는 anti-miR-CTL에 비하여 3.5배 이상 리프로그래밍 효율을 증가시켰다(도 1L).
실시예 3-2: let-7b에 의한 hiNSC 증식 조절능
let-7b가 hiNSC 증식을 조절하는지 여부를 결정하기 위하여, let-7b를 SOX2-형질도입된 hiNSC에 형질감염시켰고, 분열하는 세포의 5-브로모데옥시유리딘(BrdU) 라벨링에 의하여 세포 증식을 측정하였다.
구체적으로, 세포의 증식속도를 측정하기 위하여 다음과 같이 iNSC를 5-bromo-2-deoyuridine(BrdU; Sigma)로 염색시켰다. 10 μM BrdU를 세포 배양배지에 첨가하였고, 37℃에서 5시간 동안 배양하였으며, 이후 PBS로 세척하였고 실온에서 10분간 4% PFA로 고정시켰다. permeabilization을 위하여 85℃에서 15분간 Sodium Citrate Buffer를 사용하였고, blocking solution(5% NGS)으로 배양하였다. 이후 세포를 blocking solution(Abcam, Cambridge, MA)에서 희석된 BrdU 일차 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. 상기 세포에 2차 Alexa-488 항체를 1시간동안 처리하였고, 핵을 염색하기 위하여 DAPI를 PBS 내에 1:1000으로 희석시켜 10분간 세포와 함께 배양하였다. confocal microscope (Eclipse TE200, Nikon, Tokyo, Japan)로 이미지를 촬영하였다.
그 결과, BrdU-양성 세포의 비율이 감소함을 확인하였고, 특히 let-7b의 형질감염은 hiNSC의 증식을 용량 의존적으로 감소시킴을 확인하였다(도 6A 및 6B).
실시예 3-3: let-7b에 의한 hiNSC의 자가재생 조절능
let-7b가 SOX2-형질도입된 hiNSC의 자가재생을 조절하는지를 알아보기 위하여, 뉴로스피어(neurosphere)-형성 어세이를 수행하였다.
구체적으로, miRNA의 처리 후에, 1차 뉴로스피어를 형성하기 위하여 2,000개의 세포를 비부착성 배양접시에 배양시켰다. 1차 뉴로스피어 세포를 accutase를 사용하여 단일 세포로 분리하였고, 그 후 2차 뉴로스피어를 형성하기 위하여 비부착성 배지에서 클로날 밀도(clonal density)로 리플레이트(replate)하였다. 2차 뉴로스피어의 수 및 크기는 배양 7일 후에 측정하였다.
그 결과, let-7b 형질전환된 hiNSC는 miR-CTL 형질전환된 hiNSC보다 크기가 작았고, let-7b의 농도를 증가시켜도 서브클로닝(subcloning) 동안 2차 뉴로스피어가 거의 생기지 않았음을 확인하였다(도 6C-7E).
실시예 4: SOX/HMGA2 동시도입에 의한 hiNSC 리프로그래밍의 활성화
상기 실시예 3에서 let-7b의 과발현이 hiNSC 리프로그래밍 효율을 감소시킴을 확인하였는 바, let-7b의 발현을 억제하는 것으로 알려진 MYC, LIN28과, let-7b에 의해 억제되는 HMGA2를 과발현시킴으로써, hiNSC 리프로그래밍 효율을 증진시킬 수 있는지 확인하고자 하였다.
실시예 4-1: HMGA2에 의한 세포 증식 여부 확인
SOX2와 더불어 CMYC, LIN28 및 HMGA2의 과발현이 SOX2 단독의 과발현에 비하여 세포 증식을 증가시키는지 여부를 알아보기 위하여, MTT 어세이를 수행하였다. 구체적으로, 1 x 104 개의 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 48시간의 배양 후, 50 ㎕의 MTT stock solution (5 mg/㎖)을 배지에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 배양한 후, MTT 용액을 포함한 배지를 제거하였다. 포르마잔 결정(formazan crystals)을 용해시키기 위하여 DMSO를 첨가하였고, 그 후 용액을 96-웰 플레이트로 이동시켰다. EL800 microplate reader (BIO-TEK Instruments, Winooski, VT)에 의해 측정된 540 nm의 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 이들 요소 중에서 HMGA2는 가장 작은 증식력을 가짐을 확인하였고, 이는 CMYC보다도 32% 적게; 및 LIN28보다도 17% 적은 수치를 가지는 것이다(도 2A).
실시예 4-2: HMGA2에 의한 iNCS 리프로프래밍 효율 증진 여부 확인
SOX2와 더불어 CMYC, LIN28 및 HMGA2의 과발현이 SOX2 단독의 과발현에 비하여 hiNSC에 대하여 리프로그래밍을 촉진시킬 수 있는지 여부를 알아보기 위하여, 각 경우에 대하여 PAX6/NESTIN 양성 콜로니 생성 효율을 측정하였다.
그 결과, SOX2와 함께 HMGA2의 발현이 hiNSC에 대한 리프로그래밍 효율을 상당히 증가시켰고(도 2C), SOX2/HMGA2 동시 과발현에서 PAX6/NESTIN 양성 콜로니 생성시간을 SOX2 단독 과발현에 의한 17일에서 7.4일로 단축시켰음을 확인하였다(도 2B).
실시예 4-3: HMGA2에 의한 면역표현형의 변화여부 확인
면역표현형의 변화가 리프로그래밍의 초기 단계에서 유도되는지 여부를 확인하기 위하여, FACS(fluorescence activated cell sorting)를 사용하였다.
그 결과, 오직 SOX2/HMGA2-과발현 세포만이 전환 7일 이후에 전체 세포의 약 10%의 세포에서 CD44 양성에서 음성으로 변화된 세포 군집의 변화를 관찰하였고, 이와 동시에 세포 집단의 약 7%는 CD184 음성에서 양성으로 변화하였음을 관찰하였다(도 2D).
hiNSC 및 H9-NSC의 대부분은 CD44 음성 및 CD184 양성의 세포 군집을 보였고(도 7A), SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC 또한 SOX2-형질도입된 hiNSC 및 H9-NSC와 유사한 형태학적 특성 및, PAX6, NESTIN, SOX2, Ki67 및 HMGA2와 같은 NSC-특이적 마커의 발현을 보였음을 확인하였다(도 2E).
실시예 4-4: HMGA2에 의한 전사체(transcriptome)의 리프로그래밍 수준 평가
HMGA2에 의한 전사체(transcriptome)의 리프로그래밍 수준을 평가하기 위하여, 마이크로어레이 분석을 통하여 comparative global gene expression data를 분석하였고, 상기 마이크로어레이 데이터를 평가하기 위하여 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)을 수행하였다.
그 결과, 글로벌 유전체 heat map 및 pairwise 분포도는 hiNSC가 H9-NSC와는 상당히 유사하나, parental hDF와는 상이함을 나타내었고(도 7B, 7C). SOX2, HMGA2, PAX6, NESTIN, OLIG2, MSI1 및 GLAST는 SOX2- 및 SOX2/HMGA2-형질도입된 iNSC 모두에서 유도되었으며, 그들의 발현 수준은 H9-NSC와 유사하였음을 확인하였다(도 2F).
실시예 4-5: SOX2 프로모터의 메틸화 상태 분석
hDF, H9-NSC, 및 SOX2-, SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC에서의 SOX2 DNA 메틸화 상태를 분석하기 위하여, EZ DNA Methylation-Gold kit (Zymo Research, Irvine, CA)를 사용하여 비-메틸화된 티민(thymine)을 사이토신으로 전환시켰다.
구체적으로, CpG 섬 내의 비메틸화된 사이토신을 CT-전환제(CT-conversion reagent)와 함께 열-변성 및 황산수소나트륨(sodium bisulfate)의 통합을 통하여 우라실로 전환시켰다. DNA 중아황산염(bisulfite) 전환에 뒤따르는 DNA의 회복으로 인해, 전환된 DNA는 탈설폰화되었고(desulfonated), 이는 이후 세척하여 용출시켰다. 이후, 아황산염-변형된 DNA는 PCR을 통해 증폭시켰고, -20℃ 이하에서 저장하였다. bisulfite 전환된 DNA의 증식을 위하여, MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer)에서 프라이머를 디자인 하였고, PCR을 수행하였다. 프라이머 서열 및 어닐링 온도는 하기와 같다;
Sox2 sense 5'-GGGATATGATTAGTATGTATTTTTT-3'(서열번호 1),
Sox2 antisense 5'-AATTTTCTCCATACTATTTCTTACTCTCCT-3'(서열번호 2)
생성된 PCR 산물은 pGEM T-Easy Vector System I (Promega, Madison, WI)으로 라이게이션(ligation)시켰고, 이후 박테리아(DH5α)로 플라스미드 DNA를 클로닝하였다. 박테리아 클론으로부터 추출된 플라스미드 DNA는 ABI 3730XL capillary DNA sequencer (Applied Biosystems)를 사용하여 M13 역방향 프라이머(5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3', 서열번호 3)로 시퀀싱하여 분석하였다. 결과적으로, 비-메틸화된 CpG는 흰색 원을 나타낸 반면, 메틸화된 CpG는 검은색 원을 나타내었다.
그 결과, H9-NSC와 유사하게 hiNSC에서 SOX2 프로모터가 저메틸화(hypomethylation)되어있음을 확인하였고, 이는 SOX2가 전사적으로 활성화되었음을 시사하는 것이다(도 2G). 따라서, HMGA2가 SOX2의 프로모터의 저메틸화를 촉진하는 크로마틴 조절인자(chromatin modulator)의 역할을 수행하였음을 알 수 있다.
종합적으로, 상기 실시예는 let-7b 표적인 HMGA2는 hiNSC로의 SOX2-유도 리프로그래밍 효율 및 시간을 상당히 증가시키고, SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC는 세포 표면 마커, 전사 수준 및 메틸화 패턴 등에서 H9-NSC와 유사한 특성을 보임을 시사하는 것이다.
실시예 5: HMGA2의 하향조절을 통한 hiNSC의 증식 및 자가재생을 억제활성 확인
HMGA2가 hiNSC의 증식을 조절하는지 여부를 확인하기 위하여, hiNSC에 HMGA2를 표적으로 하는 siRNA(siHMGA2)를 도입하였고, 분열하는 세포의 BrdU 라벨링에 의하여 세포 증식을 측정하였다. 구체적으로, 시판중인 HMGA2를 억제하는 siRNA(Dharmacon, ON Target plus SMART pool, Cat #L-013495-00-0005, Lafayette, CO)와, 대조군으로 비표적 siRNA(Dharmacon, ON Target plus SMART pool, Cat # D-001810-01)를 사용하여 수행하였다.
세포는 24-웰 플레이트에 1×104 개의 세포를 시딩하였고, 50 nM의 siRNA는 항생제 없이 배양배지에 첨가된 Dharmafect transfection reagent(Dharmacon)에 형질전환되었다.
그 결과, HMGA2의 하향조절(down-regulation)은 BrdU-양성세포의 비율을 급격하게 감소시켰다(도 8A, 8B). 또한, siHMGA2-형질전환된 hiNSC는 뉴로스피어 크기가 상당히 감소하였음을 확인하였고, 1차 뉴로스피어 중에서 2차 뉴로스피어를 생기게 하는 세포의 수 및 비율 측정을 통해 자가 재생 또한 감소시킴을 확인하였다. 종합하면, HMGA2에 대한 siRNA로의 HMGA2의 하향조절은 hiNSC의 증식 및 자가재생을 억제함을 시사한다.
실시예 6: hiNSC의 다분화능 확인
iNSC의 신경계통으로의 분화를 위하여, iNSC를 iNSC 유지배지(ReNcell NSC maintenance Media (Millipore))가 포함된 24-웰 플레이트 내에 각각 Poly-L-ornithin/ Fibronectin coated coverslips 상에 1,000의 밀도로 시딩하였다. 24시간 후, 무작위적 분화를 위하여 배지를 Neurocult (Stem Cell Technology)로 갈아주었다. Neurocult 배지에서 1주일 간 배양한 후, 배지를 3가지 특이 계통(뉴런, 별아교세포, 및 희소돌기아교세포) 유도용 배지로 갈아주었다.
한편, 상기와 같이 분화를 유발도한 이후에는 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 통해 각 계통(lineage)과 관련된 마커로 확인하였다.
실시예 6-1: 뉴런으로의 분화능 확인
상기의 뉴런 유도 배지는 B27 (Gibco BRL), Gmax (Gibco BRL), Retinoic Acid (Sigma), Ascorbic Acid (Sigma), BDNF (Peprotech, Rocky Hill, NJ), GDNF (Peprotech) 및 Forskolin (Sigma)를 함유한 Neurobasal (Gibco BRL)와 DMEM/F12 (Gibco BRL)의 1:1 혼합물을 사용하였다.
분화시킨 결과, SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC를 뉴런 유도(neuronal induction) 후 10-15일 이후에, 미성숙 뉴런 마커, 뉴런 특이적 클래스 Ⅲ 베타-튜불린(TUJ1), doublecortin(DCX), 및 뉴런 중간사, 알파-인터넥신(α-internexin) 및 뉴로필라멘트(neurofilament, NF)가 발현되었음을 확인하였다(도 3A).
또한 hiNSC의 자가재생 잠재능을 평가하기 위하여 클론 분석을 수행한 결과 뉴런 분화를 유도하였고, 다중계대(multiple passage)에서의 클론에서 NF 및 알파-인터넥신이 염색되었음을 확인하였다. 뉴런 유도 후 10-25일 이후에 성숙 뉴런마커인 MAP2, 도파민작동성 및 노르아드레날린작동성 뉴런 마커인, Tyrosine hydroxylase(TH) 및 콜린작동성 뉴런 마커인 choline acetyltransferase(ChAT)가 H9-NSC와 비교하여 유사한 수준으로 발현되었음을 확인하였다(도 3A 및 9A).
실시예 6-2: 별아교세포으로의 분화능 확인
별아교세포 유도용 배지는 N2 (Gibco BRL), Gmax, 및 1 % FBS를 포함한 DMEM (high glucose) 배지를 사용하였다.
그 결과, SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC가 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)-양성 세포를 생산함을 확인함으로써 hiNSC의 별아교세포 분화를 확인하였다(도 3A).
실시예 6-3: 희소돌기아교세포으로의 분화능 확인
희소돌기아교세포 유도용 배지는 2가지 타입이 있다. 첫째로, N2, MEM 비필수 아미노산 용액(MEM NEAA; Gibco BRL), heparin (Sigma), RA, SHH (Peprotech), B27를 함유한 DMEM/F12 배지에서 2주간 배양하였고, 이후 N2, B27, MEM NEAA, T3, cAMP (Sigma), PDGF (Peprotech), IGF (R&D), and NT3 (Sigma)를 함유한 DMEM/F12에서 2주간 배양하였다.
그 결과, 희소돌기아교세포 마커인, O4 및 OLIG2 이중 양성 세포를 oligodendroglial fate에 대한 유도 20-35일 후에 발견함으로써 SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC의 희소돌기아교세포로의 분화를 확인하였다(도 3A).
실시예 7: hiNSC의 전기생리학적 특성 분석
SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC의 기능성을 평가하기 위하여, 패치클램프 계량(Patch clamp reading)을 통해 전기생리학적 특성을 시험하였다. 구체적으로, iNSC로부터 유래된 뉴런에서의 전체 세포 patch-clamp recording은 실온(22 ± 1℃)에서 EPC 10 USB amplifier (HEKA Electronik, Lamprecht, Germany)를 사용하여 기록되었다. recording chamber는 계속적으로 흐르는 Tyrode solution(유속 10ml/min)으로 채워져 있고, 패치 전극은 PC-10 puller (Narishige Company)을 사용하여 붕규산유리관(borosilicate glass capillaries)으로 만들어진 것을 사용하였다. 전극의 저항은 pipette solution으로 충진되었을 때 4-7MΩ이었고, 데이터는 Pulse program version 8.67(HEKA Electronik) 및 Origin 6.1 software(MircoCal)를 사용하여 수득하였고 분석하였다. 전류는 four-pole Bessels filter를 사용하여 3kHz에서 필터되었고, 10kHz에서 디지털화되었다. 143mM NaCl, 5.4mM KCl, 0.5mM MgCl2, 1.8mM CaCl2, 0.5mM NaHPO4, 10mM glucose, 및 5mM (4-(2 hydroethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)을 포함한 Tyrode solution; 및 pH는 NaOH로 7.5로 조정하였다. 150mM KCl, 1.0mM MgCl2, 10mM HEPES, 5mM EGTA, 2mM Mg-ATP를 포함한 pipette solution; 및 pH는 NaOH로 7.2로 조정하였다. Lidocaine (0.1%)은 나트륨 전류를 차단하기 위하여 사용되었다.
그 결과, SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC가 나트륨 전류(sodium current)를 발현하는 뉴런을 생성시키면서 다양한 활성 전위를 이끌어냄을 확인하였다. 나트륨 전류(또는 내부 전류) 및 활성 전위는 나트륨 채널 차단제 리도카인(lidocaine)에 의해서 억제되었고, 세척 이후에 정상 상태를 회복하였다(도 3B-3D, 9B-9D). 이들 데이터는 hiNSC로부터 분화된 뉴런은 기능성 막 특성 및 정상적인 뉴런의 활성을 가짐을 시사한다.
실시예 8: 동물모델에서의 hiNSC의 분화 및 생존가능성 시험
실시예 8-1: CMDil로 라벨링된 hiNSC의 이식
accutase를 사용하여 SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC를 분리시켰고, PBS로 부유시켰다. hiNSC는 주사 후의 자취를 확인하기 위하여 CM-DiI (Molecular Probes)로 라벨링하였다. hiNSC를 37℃ bath에서 15분간 CM-DiI와 함께 배양하였고, 이후 4℃에서 10분간 추가로 배양하였다. CM-DiI이 라벨링된 hiNSC를 1 x 105 세포/㎕의 밀도로 PBS에 부유시켰다. CMDil로 라벨링된 hiNSC는 stereotaxic apparatus and ultra-micropump (World Precision Instruments, Sarasota, FL)를 사용하여 뇌실하부(subventricular zone, SVZ)에 이식하였다. 이식 이후, 봉합하였고, 동물은 마취로부터 회복되도록 함으로써 4주령의 마우스 모델을 제조하였다.
실시예 8-2: IHC cryosection
이식 3주 후에, 상기 마우스 모델에서 뇌를 분리하여 4% PFA에 밤새 침지시켰으며, 그 후 48시간 동안 30% 수크로즈로 이동시켰다. 분리된 뇌는 침윤 혼합물(OCT compound; Sakura Finetek, Tokyo, Japan)로 주형화되었고, -70℃에서 밤새 유지하였으며, 저온유지장치(cryostat (CM 3050, Leica, Wetzlar, Germany)) 상에서 cryosection을 수행하였다. 구체적으로, 조직을 0.05% Triton X-100에서 20분간 배양하였다. 상기 조직을 비특이적인 항체결합을 방지하기 위하여 5% NGS로 배양하였다. 그리고나서, 4℃에서 밤새 5% NGS의 희석비율로 1차 항체를 배양하였다. 상기 조직은 실온에서 1시간동안 2차 Alexa 488- or Alexa 594-labeled 항체 (1:1000)로 배양하였다. 핵은 10분간 DAPI로 염색되었다. confocal microscope (Nikon)를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
그 결과, 이식된 세포는 면역염색법(immunostaining)에 의해 발견되었고, 또한 발견된 세포는 세 가지 상이한 계통의 마커로 동시에 염색되었음을 확인하였다. 즉, 이식된 hiNSC가 CMDil 형광과 함께 동시 존재하는(co-localized) TUJ1(뉴런), GFAP(별아교세포) 및 MBP(희소돌기아교세포)에 대하여 양성임을 확인하였다(도 3E, S5E). 이는 이식된 SOX2/HMGA2-형질도입된 hiNSC는 생체 내에서 뉴런, 별아교세포 및 희소돌기아교세포로의 분화 및 생존가능함을 시사하는 것이다.
실시예 9: HMGA2에 의한 다양한 체세포의 hiNSC로의 효율적인 리프로그래밍
실시예 9-1: HMGA2에 의한 hUCB-MSC의 iNSC 리프로그래밍
인간 제대혈 세포는 섬유아세포에 비하여 침습없이 수득할 수 있고, 최소의 유전적 변이를 가지고 있다는 장점이 있는 바, 인간 제대혈 세포가 iNSC 리프로그래밍의 원천(source)이 될 수 있는지를 평가하였다.
상기 제조예 1에 기재한 바와 같이, 인간 제대혈로부터 중간엽 줄기세포(MSC) 군집을 분리하였다. 인간 제대혈 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC)에 SOX2/HMGA2를 형질도입시킨 후에, hUCB-MSC 유래의 hiNSC 콜로니는 전환 후 7일 내지 12일이 지난 후에 관찰되었고, 면역세포화학적으로 PAX6 및 NESTIN으로 양성적으로 염색된 iNSC임을 입증하였다(도 4A).
MSC는 CD73, CD105에 대하여 양성인 것으로 알려져 있으나, 조혈성 마커인 CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여는 음성인 것으로 알려져 있다. hUCB-MSC 유래의 hiNSC는 CD73 및 CD105에 대하여 음성인 것으로 확인되었고, 이는 세포 표면 마커 신호가 변화하였음을 시사한다(도 10A).
또한, HMGA2의 발현이 hDF와 비교하였을 때 hUCB-MSC에서 상당히 더 높았음을 확인하였다(도 10B)으며, SOX2/HMGA2-형질도입된 hUCB-MSC는 SOX2-형질도입된 hUCB-MSC에 비하여 3~4배 더 많은 PAX6/NESTIN 양성 콜로니를 발생시켰다(도 10C).
실시예 9-2: H9-NSC와 hiNSC 간의 증식력 차이
다른 세포 유래 및 전이유전자(transgene)의 조합으로부터 H9-NSC와 hiNSC 간의 증식력 차이를 확인하기 위하여, 누적 집단 더블링 레벨 분석(Cumulative Population Doubling Level Analysis)을 통해 세포 성장속도를 측정하였다. 구체적으로, 공식(CPDL = ln(Nf/Ni)ln2, Ni 는 초기 시딩 세포 수, Nf는 최종 수거 세포수, ln은 자연로그)을 사용한 전체 누적 집단 더블링 레벨에 의해 결정되었다. 세포(5×104 개)는 6웰 배양 플레이트에 3배수로 접종하고, 매 4일마다 계대배양(subculture)하였고, 생존한 세포만을 검출하기 위하여 tryphan blue를 사용하여 최종 세포수를 계수하고, 5×104 개의 세포를 다시 접종하였다. 누적된 더블링 레벨을 산출하기 위해서, 각 패시지의 집단 더블링을 계산하고, 이를 이전 패시지의 집단 더블링 레벨에 합산하였다.
그 결과, H9-NSC 및 hiNSC 세포주의 세포성장속도는 큰 차이가 없었음을 확인하였고, 이는 H9-NSC와 hiNSC 세포주 간의 유사한 증식력을 가짐을 시사하는 것이다(도 10D).
실시예 9-3: 노화된 hUCB-MSC의 신경줄기세포로 유도가능 여부 확인
리프로그래밍 효율에 관한 let-7b/HMGA2의 역할을 알아보기 위하여, SOX2 단독 또는 이와 let-7이 표적으로 하는 인자들의 조합의 형질도입에 의하여 노화된 hUCB-MSC가 신경줄기세포로 유도될 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 위하여 노화 관련-베타 갈락토시데이즈(senescence-associated(SA)-β-galactosidase) 어세이를 통해 노화가 확인된 hUCB-MSC에 SOX2, SOX2/CMYC, SOX2/LIN28 및 SOX2/HMGA2를 형질도입하였다(도 4B).
갈락토시데이즈 어세이는 hUCB-MSC를 6-웰 플레이트에 시딩 후 군집(population)이 40-50%에 도달할 때까지 배양하였고, 그 후 PBS로 2번 세척하였고, 실온에서 5분간 PBS 내에서 0.5% glutaldehyde로 고정시켰다. 세포는 1 mM MgCl2 (pH 7.2)를 함유한 PBS로 세척하였고, X-gal solution (1 mg/ml X-gal, 0.12 mM K3Fe[CN]6 (potassium ferricyanide), 0.12 mM K4Fe[CN]6 (potassium ferrocyanide) 및 1 mM MgCl2, pH 6.0)으로 37℃에서 밤새 배양되었다. 다음날 현미경(IX70, Olympus, Japan)을 사용하여 이미지를 촬영하였다.
SOX2/CMYC과 SOX2/LIN28 조합은 형태학적 변화는 있었지만, hiNSC 콜로니를 생성하는 것에는 실패한 반면, 오직 SOX2/HMGA2 과발현만이 두드러지게 hiNSC 콜로니의 생성을 촉진시켰음을 확인하였다(도 4B). SOX2/HMGA2 과발현은 전환 3주 후에 1×105 개의 노화된 hUCB-MSC 중에서 2-4개의 콜로니가 생성되었다(0.004~0.008%의 변환율)(도 4C).
실시예 10: 제대혈 CD34+ 세포의 hiNSC 리프로그래밍
실시예 10-1: 제대혈 CD34+ 세포의 분리 및 정제
CD34+세포의 분리는 CD34 microbead sorting system(MACS)을 이용하였다. 구체적으로, CD34 microbeads(#130-046-703, Miltenyi Biotech) 50 ㎕를 30분 간 2~8℃에서 Lymphoprep(ProteoGenix, Portland, OR) 밀도-구배 원심분리기를 사용하여 제대혈로부터 수득한 약 1×108 개의 단핵세포와 세포와 배양시켜서 CD34+세포를 자기적으로 표지하였다. 단핵구 세포의 부유액을 자기장을 띠고 있는 MACS 분리기에 MACS® Column을 부착한 뒤, 통과를 시킴으로써 자기적으로 표지된 CD34+세포만 column의 내부에 저류되도록 하였다. column을 MACS 분리기에서 제거한 뒤, 버퍼용액을 압력으로 밀어내어 저류된 CD34+ 세포를 분리하였다. CD34+세포는 10% FBS, 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml IL-6, 50 ng/ml TPO, 100 ng/ml Flt3를 함유한 IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium) 배지에서 배양하였다.
CD34+의 정제효율은 anti-CD34-FITC 항체(Miltenyi Biotech)를 사용하여 유세포측정기(flow cytometry)에 의해 측정되었으며, 그 결과 84.15%의 순도를 가진 CD34+ 세포를 분리 정제하였음을 확인하였다(도 4E, 도 27).
실시예 10-2: 제대혈 CD34+ 세포의 hiNSC 리프로그래밍 확인
세포질 분열을 자극하기 위하여, hUCB-CD34+ 세포를 사이토카인(SCF, Flt3L, TPO, 및 IL-6)과 함께 3일간 배양시킨 후, SOX2/HMGA2를 레트로바이러스로 도입시켰다(도 4D). 도입 10~14일 후까지 상기 세포를 feeder 상에 플레이트시켰고, NSC 조건 하에 iNSC 콜로니가 관찰되었다. 면역세포화학적 염색법은 hUCB-CD34+ iNSC가 PAX6, SOX2 및 NESTIN의 양성적 발현을 가짐을 밝혀내었다. 나아가 이들 hUCB-CD34+ iNSC는 뉴런 또는 별아교세포로 발달할 수도 있었다(도 4F). SOX2 단독은 hUCB-CD34+ iNSC를 생성시키기에 충분했지만, 매우 낮은 효율을 보였다. SOX2와 HMGA2를 동시에 발현하는 hUCB-CD34+ 세포는 PAX6/NESTIN 양성 콜로니의 생성빈도가 10~20배 가까이 증가하였다(도 10E).
결론적으로, SOX2와 HMGA2의 상호작용에 의한 효율적인 직접 리프로그래밍 과정은 줄기세포뿐만 아니라 혈액세포 등과 같은 다양한 체세포가 hiNSC로 리프로그래밍될 수 있게 한다.
실시예 11: 형질전환된 hUCBSCs 세포에 있어서 HMGA2 단백질 발현 증가 확인
실시예 11-1: HMGA2 과발현을 위한 형질 전환
인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 분화 및 노화에 있어서 HMGA2 단백질의 역할을 증명하기 위해서 8 계대 이하의 초기 계대(early stage) 의 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)를 HMGA2로 형질전환시켰다.
먼저 HMGA2 서열이 pMX 레트로 바이러스 벡터에 클로닝되었다. HMGA2 플라스미드, VSV-G 및 gag/pol 플라스미드와 함께 293T 세포를 형질 전환(transfection)시켰다. 48시간 내지 72시간 동안 형질전환(transfection) 시킨 후 부유물을 채취하고, polybrene 5 ㎍/mL 과 함께 사용하여 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)를 형질전환(transfection)시켰다. transduction efficiency를 측정한 결과 도 12에서 보는 바와 같이 80% 이상으로 측정되었다.
실시예 11-2: 면역세포 화학적 방법(immunocytochemical analyse)
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2로 형질전환된 8 계대 이하의 early stage의 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 단백질의 발현이 증가된 것을 면역세포 화학적 방법(immunocytochemical analyse)으로 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
실시예 11-3: 마이크로 어레이(microarray)
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2로 형질전환된 8 계대 이하의 early stage의 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 단백질의 발현이 증가된 것을 마이크로 어레이로 분석한 결과를 도 14에 나타내었다.
실시예 11-4: 계대 진행에 따른 HMGA2 발현 정도 측정
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 HMGA2 발현 정도를 PCR 방법에 따라 확인하였다.
제조사가 권장하는 방법에 따라 Trizol Reagent™(Invitrogen, USA)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고, 여기에 oligo dT primer 및 Accupower RT premix(Bioneer, Korea)를 혼합하여 cDNA를 합성하였으며, 상기 cDNA를 주형으로 하여 Accupower PCR premix(Bioneer, Korea)를 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 따라 PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다. PCR 실험 결과에서 6계대에서 20계대로 진행할수록 HMGA2 발현 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 12: 계대 진행에 따른 모폴로지 변화 확인
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 모폴로지를 phase contrast image 방법으로 측정하고 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 비교예의 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 경우 계대가 진행할수록 세포가 평탄화되고 길어지는데 비하여 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 경우 변화 정도가 완화되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 13: SA-b-gal(Senescence associated beta-galactosidase) 염색
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 형질도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 노화 정도를 확인하기 위하여 계대 진행에 따른 SA-β-gal(Senescence associated beta-galactosidase)의 발현 정도를 β-gal staining 방법으로 측정하고 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에서 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 경우 SA-β-gal(Senescence associated beta-galactosidase) 발현 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 14: 계대에 따른 세포 증식
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 증식을 MTT assay 방법으로 측정하고 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에서 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)는 계대 진행에 따라 세포 증식이 비교예보다 덜 감소하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 15: PI3K/AKT 경로에 대한 HMGA2 의 영향력 평가
실시예 15-1: 관련 유전자 확인
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 과발현 관련 신호 경로 관련 유전자와 분자 세포 기능 관련 유전자를 IPA(ingenuity Pathway Anaylsis) 소프트웨어로 특정하고 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에서 전사 조절과 관련된 elF4 및 p70S6K 신호가 많이 발현되고 있으며, elF4 및 p70S6K 와 관련된 mTOR과 PI3K/AKT 신호 경로가 많이 발현되는 것을 알 수 있다.
실시예 15-2: 웨스턴 블롯
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 형질 도입된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 과발현이 PI3K/AKT 경로 및 mTOR/p70s6K 에 대한 영향력을 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석은 (i) HMGA2 가 과발현되는 hUCBSCs 세포, 및 (ii) LY294002 처리된 HMGA2가 과발현되는 hUCBSCs 세포, (iii) 비교예로서 GFP 에 대해서 수행하였다.
구체적으로, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM aprotinin, 1 mM leupeptin, 1 mM antipain, 및 0.1 mM sodium orthovanadate가 첨가된 1% Triton X-100, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% SDS를 포함하는 50 mM Tris-HCl buffer에서 파쇄시켰다. DC assay kit(Bio-Rad, USA)를 이용해 단백질 함량을 확인하였고, 10~15%의 Polyacrylamide gel에 일정량의 단백질을 로딩(Loading)하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, 단백질을 50 V, 350 mA에서 5시간 동안 nitrocellulose membrane로 전사시켰다. 모든 항체는 제조업체의 지시에 따라 사용하였고, enhanced chemiluminescence detection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)를 이용해 단백질 밴드를 확인하고 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 20에서 AKT, mTOR 및 p70S6K의 인산화는 HMGA2에 의해 유도되고, LY294002 처리되는 경우에는 전체 단백질 발현양은 변화가 없었지만, AKT, mTOR 및 p70S6K 의 인산화가 저해되는 것을 확인할 수 있다.
HMGA2 에 의해 p16INK4A 와 p21CIP1/WAF1 의 발현 정도는 저해되었으나, LY294002 처리에 의해 발현 정도가 회복되어 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K 경로는 p16INK4A 와 p21CIP1/WAF1 발현을 감소시키기에 적절하다는 것을 알 수 있다.
또한, 이를 통해 HMGA2 과발현은 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K 경로를 활성화시키고, p16INK4A 와 p21CIP1/WAF1 발현을 저해하는 것을 알 수 있다.
실시예 16: HMGA2 억제시 계대 진행에 따른 모폴로지 변화 확인
인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 분화 및 노화에 있어서의 HMGA2 단백질의 역할을 증명하기 위해서 8 계대 이하의 early stage 의 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에서 siRNA를 이용하여 HMGA2 발현을 억제하였다.
HMGA2 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 모폴로지를 phase contrast image 방법으로 측정하고, 그 결과를 도 21에 나타내었다. 즉, HMGA2가 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 경우 세포가 평평해지고 길어짐을 확인하였다.
실시예 17: HMGA2 억제시 SA-β-gal(Senescence associated beta-galactosidase) 발현 정도 측정
HMGA2 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 노화 정도를 확인하기 위하여 계대 진행에 따른 SA-β-gal(Senescence associated beta-galactosidase)의 발현 정도를 β-gal staining 방법으로 측정하고 그 결과를 도 21에 나타내었다.
HMGA2 형질 도입된 hUCBSCs 세포의 경우 SA-β-gal(Senescence associated beta-galactosidase) 발현 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 18: 계대에 따른 세포 증식 영향 확인
HMGA2 발현이 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 계대 진행에 따른 세포 증식을 MTT assay 방법으로 측정하고 그 결과를 도 22 에 나타내었다. 도 22에서 HMGA2 억제 hUCBSCs 세포는 계대 진행에 따라 세포 증식이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 19: 웨스턴 블롯
인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 있어서 HMGA2 억제가 PI3K/AKT 경로 및 mTOR/p70s6K 에 대해 미치는 영향력을 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하고 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23에서 AKT, mTOR 및 p70S6K 의 인산화는 급격히 감소하였으며, p16INK4A 와 p21CIP1/WAF1 의 발현 정도는 증가하였다. 이를 통해 HMGA2 억제가 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K 경로를 억제하고, p16INK4A 와 p21CIP1/WAF1 발현을 증가시키는 것을 알 수 있다.
상기 실시예 15-2 및 상기 실시예의 결과를 바탕으로 HMGA2 단백질 발현이 인간 제대혈 유래 기질 세포의 신호 전달 경로는 도 24에 나타내었다.
실시예 20: 지방조직으로의 분화능 측정
HMGA2 발현이 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)에 대해 지방 조직으로의 분화능을 측정하였다.
세포 내에 존재하는 지방축적 여부로 분화정도를 파악하기 위하여, 배양된 세포에 Oil Red O 염색하고, 100% isopropyl alcohol을 사용하여, 세포에 침투된 Oil Red O를 다시 추출하여, 이를 OD 500에서 ELISA plate reader(EL800, Bio-Tek Instruments, USA)로 정량한 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에서 보는 바와 같이 HMGA2 억제된 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 Oil Red O 염색비중이 대조군보다 더 낮았으며, PPARr, aP2 alc C/EBP-b 와 같은 지방 세포 분화와 관련된 유전자의 발현 비율이 급격하게 감소하였다.
실시예 21: HMGA2 조절 관련 유전자 탐색 및 PCR
상기 실시예 11-1에서 제조된 HMGA2 과발현 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 유전자 발현과 상기 실시예 7에서 제조된 HMGA2 억제 인간 제대혈 유래 기질 세포(hUCBSCs)의 유전자 발현을 도 26과 같이 대비하였다.
도 26에 의해 HMGA2 과발현시 발현이 증가하고 HMGA2 억제시 발현이 감소하는 유전자로 Cyclin F, Cyclin E1, 및 CDC25A 3개를 선택하고 HMGA2 과발현시 발현이 감소하고 HMGA2 억제시 발현이 증가하는 C14orf153, EID2B, ZNF394, CDKN2AIPNL 및 C9orf80의 5개의 유전자를 선택하였다. 상기 선택된 8개의 유전자에 대해 PCR 을 수행한 결과를 도 27에 나타내었다.

Claims (28)

  1. SOX2(SRY (sex determining region Y)-box 2) 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및
    HMGA2(High mobility group AT-hook 2) 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 구비하는,
    비신경 세포의 신경줄기세포(NSC)로의 리프로그래밍 유도용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자는 각각 독립적으로 발현벡터에 포함된 것인 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자는 크로마틴 조절인자(chromatin modulator)인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. (a) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나; 또는,
    비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계를 포함하여,
    비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포를 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, (c) 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 신경줄기세포-유사 콜로니(neural stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 단계 (b)는 신경세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 비신경세포로부터 유도 신경줄기세포가 형성되고, 상기 유도 신경줄기세포로부터 신경세포가 형성되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 단계 (a)는 SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를, 비신경 세포의 배양액에 투여하는 방법, 비신경 세포에 직접 주입하는 방법, 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 삽입한 바이러스 벡터로 형질전환(transfection)시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스로 비신경 세포를 전환시키는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 비신경세포에서 SOX2 단백질 또는 HMGA2 단백질의 발현을 증가시키는 단계는, 상기 비신경 세포 내로 SOX2 또는 HMGA2의 발현조절인자를 도입하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 HMGA2의 발현조절인자는 let-7 miRNA 클러스터 저해제 또는 PDE4D 저해제인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 SOX2의 발현조절인자는 PDE4D 저해제인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 세포는 인간으로부터 유래된 것인 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 비신경 세포는 체세포 또는 성체줄기세포인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서 상기 체세포는 혈액 세포인 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인 방법.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포; 또는 상기 유도 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포.
  16. 제15항의 유도 신경줄기세포; 또는 상기 유도 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, 신경세포 재생용 세포 치료제.
  17. SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및
    HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는,
    신경세포손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 신경세포손상 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환 및 척추 손상(spinal cord injury)으로 이루어진 군에서 선택되는 신경세포손상 질환 치료 또는 예방용 약학조성물.
  19. 1) 분리된 비신경 세포를 준비하는 제1단계:
    2) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나, 또는,
    비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시켜 유도 신경줄기세포의 생성을 유도하는 제2단계;
    3) 선택적으로, 제2단계에서 생성된 유도 신경줄기세포로부터 신경세포를 형성시키는 제3단계; 및
    4) 제1단계 이후 또는 제2단계 이후에 후보물질을 처리하여, 후보물질의 처리 유무에 따라 유도 신경줄기세포 또는 신경세포의 생성 여부 또는 생성 정도를 확인하는 제4단계를 포함하는,
    신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제 또는 재생 억제제의 스크리닝 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    4) 상기 제3단계에서 유도 신경줄기세포 또는 신경세포의 생성 정도가 증가되면 상기 후보물질은 신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 스크리닝 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 환자로부터 분리된 비신경 세포를 이용하여, 환자 맞춤형 신경줄기세포 또는 신경세포의 재생 촉진제 또는 재생 억제제를 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 것인, 스크리닝 방법.
  22. 1) 분리된 비신경 세포를 준비하는 제1단계:
    2) SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 비신경 세포에 전달하거나, 또는,
    비신경 세포에서 SOX2 단백질 및 HMGA2 단백질의 발현을 증가시켜 유도 신경줄기세포의 생성을 유도하는 제2단계;
    3) 제2단계에서 생성된 유도 신경줄기세포로부터 신경세포를 형성시키는 제3단계; 및
    4) 제3단계에서 형성된 신경세포에 후보물질을 처리하여, 상기 비신경 세포가 유래된 개체에 맞춤형인 신경세포 치료제를 확인하는 제4단계를 포함하는,
    개인 맞춤형 신경세포 치료제의 스크리닝 방법.
  23. HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 비신경 세포의 신경줄기세포(NSC)로의 리프로그래밍 촉진용 조성물.
  24. HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 세포 증식용 조성물.
  25. HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포는 제대혈 유래 기질세포인 것인 조성물.
  27. 제15항의 유도 신경줄기세포; 또는 상기 유도 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경세포손상 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  28. SOX2 단백질 또는 SOX2 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 단백질을 코딩하는 핵산분자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경세포손상 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2014/002918 2013-04-06 2014-04-04 Hmga2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법 WO2014163425A1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201480032201.8A CN105492597B (zh) 2013-04-06 2014-04-04 利用hmga2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的方法
AU2014250190A AU2014250190B2 (en) 2013-04-06 2014-04-04 Method for producing reprogrammed derivative neuronal stem cell from non-neuronal cell by using HMGA2
JP2016506245A JP6316938B2 (ja) 2013-04-06 2014-04-04 Ｈｍｇａ２を用いて非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞を調製する方法
RU2015144631A RU2646099C2 (ru) 2013-04-06 2014-04-04 Способ получения индуцированных нервных стволовых клеток, перепрограммированных из клеток, не являющихся нервными, с использованием hmga2
EP14779347.5A EP2982747B1 (en) 2013-04-06 2014-04-04 Method for producing reprogrammed derivative neuronal stem cell from non-neuronal cell by using hmga2
US14/782,340 US11512285B2 (en) 2013-04-06 2014-04-04 Method of preparing induced neural stem cells reprogrammed from non-neuronal cells using HMGA2

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130037790 2013-04-06
KR10-2013-0037790 2013-04-06
KR1020130087020A KR20140121317A (ko) 2013-04-06 2013-07-23 비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포
KR10-2013-0087020 2013-07-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014163425A1 true WO2014163425A1 (ko) 2014-10-09

Family

ID=51992925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/002918 WO2014163425A1 (ko) 2013-04-06 2014-04-04 Hmga2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11512285B2 (ko)
EP (1) EP2982747B1 (ko)
JP (1) JP6316938B2 (ko)
KR (3) KR20140121317A (ko)
CN (1) CN105492597B (ko)
AU (1) AU2014250190B2 (ko)
MY (1) MY171861A (ko)
RU (1) RU2646099C2 (ko)
WO (1) WO2014163425A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219729A (zh) * 2015-09-28 2016-01-06 首都医科大学宣武医院 一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途
CN107709549A (zh) * 2015-04-10 2018-02-16 新加坡科技研究局 从干细胞产生功能细胞
US11027047B2 (en) 2015-03-31 2021-06-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Delivery vehicles for stem cells and uses thereof

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101971557B1 (ko) 2016-01-14 2019-04-24 한양대학교 산학협력단 Lin28의 발현을 이용한 재생능 및 분화능이 우수한 줄기세포의 제조방법
CN105925719B (zh) * 2016-07-06 2019-09-27 北京泱深生物信息技术有限公司 与肝癌分化相关的基因及其应用
KR102315249B1 (ko) * 2017-04-26 2021-10-21 주식회사 파이안바이오테크놀로지 세포막 투과성 Sox2 단백질을 이용해 체세포를 신경전구세포로 직접교차분화 시키는 방법
KR102167826B1 (ko) * 2018-05-09 2020-10-20 주식회사 강스템바이오텍 Sox2, c-Myc를 이용하여 비신경 세포로부터 직접 리프로그래밍된 유도신경줄기세포를 제조하는 방법
KR102051403B1 (ko) * 2018-05-29 2019-12-03 연세대학교 산학협력단 개선된 생체 내 리프로그래밍 시스템 및 이를 이용한 스크리닝방법
KR102143320B1 (ko) * 2018-08-28 2020-08-12 주식회사 스템랩 합성 메신저 rna를 이용하여 소변세포를 신경줄기세포로 직접 역분화하는 방법
CN109674809B (zh) * 2018-12-27 2022-08-09 吉林大学 一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物中的应用
KR102249776B1 (ko) * 2019-11-25 2021-05-10 연세대학교 산학협력단 개선된 생체 내 리프로그래밍 시스템 및 이를 이용한 세포 전환 방법
WO2022025783A1 (ru) 2020-07-28 2022-02-03 Общество с ограниченной ответственностью "Ангиолайф" Применения комбинации генов ангиогенных и нейротрофических факторов
CN112608904B (zh) * 2020-12-30 2023-02-07 滨州医学院 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110250684A1 (en) * 2008-11-05 2011-10-13 Keio University Method for producing neural stem cells
WO2012022725A2 (en) * 2010-08-19 2012-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Conversion of somatic cells to induced reprogrammed neural stem cells (irnscs)
US20120269778A1 (en) * 2009-11-10 2012-10-25 Yadong Huang Methods of generating neural stem cells
US20130045187A1 (en) * 2011-02-14 2013-02-21 Ruslan Semechkin Methods and compositions of producing patient-specific multipotent neuronal stem cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100846643B1 (ko) * 2002-06-24 2008-07-16 미쓰비시 타나베 파마 코퍼레이션 신경 세포의 제조 방법
KR100875437B1 (ko) 2005-02-21 2008-12-22 재단법인서울대학교산학협력재단 신경줄기세포의 자체재생 및 분화에 관여하는 ｎｐｃ１유전자 및 그 용도
WO2009117439A2 (en) * 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
US20100021437A1 (en) * 2008-04-07 2010-01-28 The McLean Hospital Corporation Whitehead Institute for Biomedical Research Neural stem cells derived from induced pluripotent stem cells
KR101299733B1 (ko) 2010-03-31 2013-08-28 주식회사 강스템홀딩스 ｍｉＲＮＡ의 발현 억제를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 방법
WO2011158967A1 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Kyoto University Method for efficiently establishing induced pluripotent stem cell
US9506188B2 (en) * 2013-03-14 2016-11-29 Wireco Worldgroup, Inc. Torque balanced hybrid rope

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110250684A1 (en) * 2008-11-05 2011-10-13 Keio University Method for producing neural stem cells
US20120269778A1 (en) * 2009-11-10 2012-10-25 Yadong Huang Methods of generating neural stem cells
WO2012022725A2 (en) * 2010-08-19 2012-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Conversion of somatic cells to induced reprogrammed neural stem cells (irnscs)
US20130045187A1 (en) * 2011-02-14 2013-02-21 Ruslan Semechkin Methods and compositions of producing patient-specific multipotent neuronal stem cells

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNYING, CELL, vol. 318, pages 1917 - 1920
See also references of EP2982747A4
SHINYA YAMANAKA: "Pluripotency and Nuclear Reprogramming", PHILOS TRANS R SOC LOND B BIOL SCI., vol. 363, no. 1500, 27 June 2008 (2008-06-27), pages 2079 - 2087
TAKAHASHI, CELL, vol. 126, pages 663 - 676
TAKAHASHI, CELL, vol. 131, pages 861 - 872
TAKAHASHI, K. ET AL.: "Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors", CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
TAKAHASHI, Y.; S. YAMANAKA: "Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors", CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676
THIER M.; WORSDORFER P; LAKES YB; GORRIS R; HERMS S; OPITZ T; SEIFERLING D; QUANDEL T; HOFFMANN P; NOTHEN MM: "Edenhofer F (2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells", CELL STEM CELL, vol. 10, no. 4, pages 473 - 479
THIER M; WORSDORFER P; LAKES YB; GORRIS R; HERMS S; OPITZ T; SEIFERLING D; QUANDEL T; HOFFMANN P; NOTHEN MM: "Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells", CELL STEM CELL, vol. 10, no. 4, 2012, pages 473 - 479
VIERBUCHEN T; OSTERMEIER A; PANG ZP; KOKUBU Y; SUDHOF TC; WEMIG M: "Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors", NATURE, vol. 463, no. 7284, 2010, pages 1035 - 1041
YU , K. R. ET AL.: "HMGA2 regulates the in vitro aging and proliferation of human umbilical cord blood-derived stromal cells through the mTOR/p70S6K signaling pathway", STEM CELL RESEARCH, vol. 10, no. 2, 16 November 2012 (2012-11-16), pages 156 - 165, XP055289274, DOI: 10.1016/J.SCR.2012.11.002 *
YU JUNYING ET AL.: "Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells", SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11027047B2 (en) 2015-03-31 2021-06-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Delivery vehicles for stem cells and uses thereof
CN107709549A (zh) * 2015-04-10 2018-02-16 新加坡科技研究局 从干细胞产生功能细胞
CN105219729A (zh) * 2015-09-28 2016-01-06 首都医科大学宣武医院 一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途
CN105219729B (zh) * 2015-09-28 2018-09-25 首都医科大学宣武医院 一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN105492597A (zh) 2016-04-13
KR20140121317A (ko) 2014-10-15
EP2982747B1 (en) 2020-04-22
AU2014250190A1 (en) 2015-11-05
RU2646099C2 (ru) 2018-03-01
RU2015144631A (ru) 2017-05-15
US11512285B2 (en) 2022-11-29
KR101870125B1 (ko) 2018-06-26
KR20140121329A (ko) 2014-10-15
AU2014250190B2 (en) 2017-09-28
EP2982747A4 (en) 2016-09-21
CN105492597B (zh) 2020-11-10
JP6316938B2 (ja) 2018-04-25
MY171861A (en) 2019-11-05
EP2982747A1 (en) 2016-02-10
KR20140121787A (ko) 2014-10-16
JP2016520296A (ja) 2016-07-14
US20160215259A1 (en) 2016-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014163425A1 (ko) Hmga2를 이용하여 비신경 세포로부터 리프로그래밍된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법
WO2017179767A1 (ko) 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법, 및 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 성장인자를 다량 분비하는 인간 줄기세포의 분화 유도 방법
WO2011096728A2 (en) Method for proliferating stem cells by activating c-met/hgf signaling and notch signaling
WO2010147395A2 (en) Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2011043591A2 (en) Method for differentiation into retinal cells from stem cells
WO2011043592A2 (en) Compositions for inducing differentiation into retinal cells from retinal progenitor cells or inducing proliferation of retinal cells comprising wnt signaling pathway activators
WO2013180395A1 (ko) 다능성 줄기세포의 제작, 유지, 증식을 증진하는 대사산물 및 이를 포함하는 조성물과 배양방법
WO2020251181A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물
WO2022025559A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물 및 이의 제조방법
WO2018135907A1 (ko) 슈반 세포 전구체 및 이로부터 분화된 슈반 세포의 제조 방법
WO2019216667A1 (ko) Sox2, c-Myc를 이용하여 비신경 세포로부터 직접 리프로그래밍된 유도신경줄기세포를 제조하는 방법
WO2012096552A2 (ko) Ｒｅｘ１을 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도 만능줄기세포 제조방법
WO2018026212A2 (ko) 섬유증 질환 모델의 제조방법 및 섬유증 질환 모델의 용도
WO2011102680A2 (ko) Pi3k/akt/gsk3 경로를 통해 성체줄기세포의 증식, 다분화능 및 재프로그래밍을 촉진하는 cd49f
WO2020045990A1 (ko) 합성 메신저 rna를 이용하여 소변세포를 신경줄기세포로 직접 역분화하는 방법
EP3041928A1 (en) Compositions comprising a mitofusin inhibitor for promoting cell reprogramming and a use thereof
WO2019035690A1 (ko) 근육 질환 및 신경근육 질환 예방, 치료 또는 진단을 위한 miR-18b의 용도
WO2019059713A2 (ko) 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
WO2021015584A1 (ko) 불사화된 줄기세포주의 제조 방법 및 이의 용도
WO2020209636A1 (ko) 소변세포로부터 신장전구세포로의 직접 역분화를 유도하는 방법 및 이의 방법으로 역분화된 신장전구세포를 포함하는 신장세포 손상 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2021034168A1 (ko) 줄기세포의 증식 및 전능성 증진용 조성물
WO2021145467A1 (ko) 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 3d 오가노이드를 해체하여 세포를 다량 확보하는 분화방법
WO2023128659A1 (ko) 운동성 신경세포 직접교차 분화용 인자
WO2022255825A1 (ko) 신규한 만능성 세포
WO2024215151A1 (ko) 세포의 줄기세포능 유도 인자 및 이를 이용하여 세포의 줄기세포능을 증가 또는 유지시키는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480032201.8

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14779347

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016506245

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14782340

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014779347

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: IDP00201507015

Country of ref document: ID

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014250190

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20140404

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015144631

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A