WO2021034168A1 - 줄기세포의 증식 및 전능성 증진용 조성물 - Google Patents

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WO2021034168A1
WO2021034168A1 PCT/KR2020/011266 KR2020011266W WO2021034168A1 WO 2021034168 A1 WO2021034168 A1 WO 2021034168A1 KR 2020011266 W KR2020011266 W KR 2020011266W WO 2021034168 A1 WO2021034168 A1 WO 2021034168A1
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WO
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stem cells
cells
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formula
cell
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PCT/KR2020/011266
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Inventor
조쌍구
데이엠아메드 아브달
이수빈
최상백
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건국대학교 산학협력단
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inducing proliferation of stem cells and enhancing omnipotence, comprising tellaglenastat (CB-839) and derivatives thereof as active ingredients.
  • Multipotent stem cells such as embryonic stem cells (ESC) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) are capable of infinite proliferation (self-renewal) and pluripotency to differentiate into all types of cells that make up organs. Characterized [1]. PSC and cancer cells have similar proliferative and metabolic activities, and show very different proliferative and metabolic characteristics according to environmental factors and cell lines [2].
  • Cancer cells continue to divide to form solid tumors or grow into abnormal cells.
  • Cell division is a normal process for the body to grow and recover.
  • Parent cells divide to form two daughter cells, which form new tissues or replace dead cells. As cancer cells multiply, they can spread from parts of the body to other parts of the body through a process called metastasis.
  • hiPSCs human iPSCs
  • OXPHOS oxidative phosphorylation
  • ATP adenosine triphosphate
  • glutamine the most abundant amino acid in plasma [11, 12].
  • glutamine the step of conversion into glutamate by glutaminase, a mitochondrial enzyme, is important [13, 14].
  • Glutamate and glutamate-derived metabolites are used in a number of key intracellular pathways, including redox balance, tricarboxylic acid (TCA) circulation, and amino acid synthesis.
  • DON is an early GLS I inhibitor that acts as a glutamine-mimicking metabolic antagonist (antimetabolite) [19-21].
  • CB-839 is currently undergoing single and immunological phase 1 clinical trials for solid and hematologic cancers (NCT02071888, NCT02071862, NCT02071927 and NCT02771626).
  • NCT02071888, NCT02071862, NCT02071927 and NCT02771626 solid and hematologic cancers
  • the relationship between these glutaminase inhibitors and the proliferation rate of pluripotent stem cells such as ESC or iPSC has not been reported at all.
  • the present inventors induce efficient proliferation of stem cells that have high therapeutic value in various intractable diseases caused by irreversible loss of tissues, in particular, pluripotent stem cells that can differentiate into cells of all lines, and maintain and enhance omnipotence.
  • pluripotent stem cells that can differentiate into cells of all lines.
  • omnipotent stem cells that can differentiate into cells of all lines.
  • a careful research effort was made.
  • proliferation of omnipotent stem cells was significantly increased, as well as the undifferentiated state was maintained and stemness could be maintained for a long period of time. , Has completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a composition for inducing proliferation of stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing omnipotency of stem cells.
  • the present invention provides a composition for inducing proliferation of stem cells comprising the compound of Formula 1 as an active ingredient:
  • Y is C or S
  • X is halogen
  • n is an integer from 2 to 4.
  • the present inventors induce efficient proliferation of stem cells that have high therapeutic value in various intractable diseases caused by irreversible loss of tissues, in particular, pluripotent stem cells that can differentiate into cells of all lines, and maintain and enhance omnipotence.
  • pluripotent stem cells that can differentiate into cells of all lines.
  • omnipotence a careful research effort was made.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 was treated in the culture medium of stem cells, proliferation of the pluripotent stem cells was significantly increased, as well as the undifferentiated state was maintained, so that stemness could be maintained for a long time. .
  • the stem cells treated with the compounds of the present invention not only significantly increase the number of cells compared to the control group, but also form larger colonies to efficiently induce proliferation of stem cells.
  • stem cell is a cell capable of differentiating into various cells constituting a biological tissue, and is capable of regenerating, but not limited to, specialized cells of tissues and organs. Refers to undifferentiated cells.
  • halogen refers to a halogen element, and includes, for example, fluoro, chloro, bromo, and iodo.
  • Y in Formula 1 is S and X is F.
  • n in Formula 1 is 3.
  • CB-839 is a structural analog of BPTES, and has an anticancer effect based on glutaminase inhibitory activity, but the relationship between the proliferation rate of omnipotent stem cells such as ESC or iPSC or their maintenance and enhancement is not known at all. .
  • the compound of Formula 1 is included in the composition at 50-400nM. More specifically, it is included as 50-300nM, more specifically, it is included as 50-200nM, more specifically, it is included as 70-150nM, and most specifically, it is included as 80-120nM.
  • the stem cells used in the present invention are pluripotent stem cells.
  • pluripotency stem cell refers to a stem cell that can all be differentiated into cells constituting any of the three layers of germ layers: endoderm, mesoderm and ectoderm.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention include embryonic stem cells, embryonic germ cells, embryonic tumor cells (ESC), and induced pluripotent stem cells (iPSCs), and more specifically, embryonic stem cells. These are stem cells (ESCs) or induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • Induced pluripotent stem cells are natural omnipotent stem cells in that they have stem cell gene and protein expression, chromosome methylation, doubling time, embryoid body formation, teratoma formation, viable chimera formation, hybridization and differentiation.
  • embryonic stem cells are considered the same in the art.
  • the present invention provides a composition for enhancing the omnipotency of pluripotent stem cells comprising the compound of Formula 1 as an active ingredient:
  • Y is C or S
  • X is halogen
  • n is an integer from 2 to 4.
  • the term “improving omnipotence” means maintaining or enhancing pluripotency of stem cells and maintaining the undifferentiated state, thereby ultimately maintaining the stemness of stem cells. Therefore, the term “promoting omnipotence” is used in the same meaning as “differentiation inhibition”, “undifferentiated maintenance” and “stemming”.
  • stem cell differentiation inhibition includes not only inhibiting the complete differentiation of stem cells into specific cells by stimulation of specific differentiation, but also inhibiting the formation of precursors formed in the intermediate stages before complete differentiation into specific cells. It means that.
  • the expression levels of the omnipotent markers OCT4, Nanog, and SOX2 are observed to increase significantly. It was confirmed that stem cells can be usefully used for long-term storage or cultivation while maintaining stem cells in an undifferentiated state while retaining the unique regenerative therapeutic utility of stem cells.
  • the compound of Formula 1 is included in 50-150 nM in the composition, more specifically included in 70-130 nM, more specifically included in 90-110 nM, Most specifically, it is included at about 100 nM.
  • the present invention provides a method for inducing proliferation of stem cells and a method for enhancing pluripotency comprising the step of culturing the stem cells in a medium containing the compound of Formula 1 below:
  • Y is C or S
  • X is halogen
  • n is an integer from 2 to 4.
  • the present invention provides a composition for inducing proliferation of stem cells and a composition for enhancing omnipotence.
  • composition of the present invention improves the proliferation rate and omnipotency of pluripotent stem cells while lowering the possibility of stem cells becoming cancerous, thereby simultaneously improving the therapeutic efficacy and safety of stem cells.
  • the present invention can be usefully used in an in vitro proliferation method for obtaining a therapeutically effective amount of pluripotent stem cells, and a process of storing and culturing stem cells while maintaining them in an undifferentiated state until the point of injection into the human body.
  • 1 shows the results of screening the effects of CB-839 on CB-839 cancer, stem cells and cancer stem cells.
  • 1A is a diagram showing the results of measuring cell viability by MTT assay after exposing MCE cells to CB-839 at different concentrations (10-1000 nm) for 48 hours.
  • 1B is a diagram showing the results of measuring cell viability by MTT assay after exposing SH-SY5Y cells to CB-839 at different concentrations (10-1000 nm) for 48 hours.
  • 1C is a schematic diagram showing a process of obtaining CSLC from breast tumor tissue.
  • 1D is a diagram showing the results of measuring cell viability by MTT assay after exposing CSLCs cells to CB-839 at different concentrations (10-1000 nm) for 48 hours.
  • 1E is a schematic diagram showing a process of separating WJ-MSC from umbilical cord blood.
  • 1F is a diagram showing the results of measuring cell viability by MTT assay after exposing WJ-MSC cells to CB-839 at different concentrations (10-1000 nm) for 48 hours.
  • 1G is a schematic diagram showing a process of separating adipose-derived stem cells from human adipose tissue.
  • 1H is a diagram showing the results of measuring cell viability by MTT assay after exposing ADSC cells to CB-839 at different concentrations (10-1000 nm) for 48 hours.
  • 1I is a schematic diagram showing a process of separating peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from blood.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Figure 1j is a schematic diagram showing the process of producing an iPSC cell line from PBMC and a picture showing the expression of stem markers of the produced cell line.
  • Figure 1k-1l shows the results of measuring cell viability by MTT assay after exposing human iPSC (Figure 1k) and ES cells (Figure 1l) to CB-839 at different concentrations (10-1000 nm) for 48 hours, respectively. It is a picture showing.
  • FIG. 2 is a diagram showing the chemical structures of CB-839, BPTES, and DON, and their effects on the viability of MDA-MB-231 cells and human pluripotent stem cells (iPSCs).
  • 2A shows the chemical structures and molecular formulas of CB-839, BPTES, and DON, respectively.
  • Figure 2b-2c shows MDA-MB-231 ( Figure 2b) and human iPSC ( Figure 2c) exposed to different concentrations (10-1000 nm) of CB-839, BPTES, DON for 48 hours, and cell survival by MTT assay. This is a picture showing the results of sex analysis.
  • Figure 2d is a diagram showing the growth curve of human iPSC under CB-839, BPTES, DON treatment.
  • FIG. 3 is a diagram showing that treatment of stem cells with CB-839, BPTES and DON has different effects on glycolytic function and mitochondrial respiration.
  • 3A is a result of measuring the extracellular acidification rate (ECAR) after treatment with 100 nM of CB-839, BPTES and DON on iPSC.
  • 3B is a result of measuring the oxygen consumption rate (OCR) after treating 100 nM of CB-839, BPTES, and DON to WJ-MSC, respectively.
  • 3C is a result of measuring the extracellular acidification rate (ECAR) after treatment with 100 nM of CB-839, BPTES, and DON in WJ-MSC, respectively.
  • Figure 4 is a diagram showing that the expression of the pluripotency marker of human iPSC is increased by treatment with CB-839.
  • Figure 4a is a result of analyzing the expression of omnipotent markers (OCT4, Nanog, SOX2) in iPSC through real-time PCR.
  • 4A and 4C are Western blot analysis results for the expression of omnipotent markers (SOX2, NANOG and OCT4) and phosphorylation of mTOR, AKT, ERK and YAP1.
  • 4D shows the results of performing RT-PCR after treating MDA-MB-231 cells (left panel) and CSLC (right panel) with CB-839, BPTES and DON, respectively.
  • Figure 4e shows the results of treatment with CB-839, BPTES and DON after culturing iPSC in Essential 8TM with glutamine or StemFit without glutamine.
  • FIG. 5 is a diagram showing the effect of treatment with CB-839 on cell proliferation and colony formation in induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • 5A is a result of measuring cell proliferation on days 0, 1, 3, 5, and 7, and
  • FIG. 5B is a result of quantitative analysis of colony formation in hiPSC.
  • 5C shows the results of observation under a phase contrast microscope and the results of alkaline phosphatase (AP) staining, respectively. Scale bar: 40 ⁇ m.
  • Figure 5d is a graph showing the colony size of the control group and CB-839 treatment group
  • Figure 5e is a result of immunocytochemical analysis for human pluripotency markers OCT4 and Nanog, the nucleus was stained with TO-PRO-3.
  • 6 is a diagram showing the results of investigating the effect on colony formation and fluorescence values by co-culture with induced pluripotent stem cells and CSLC containing fluorescence, and then treatment with CB-839.
  • 6A is a phase contrast microscope observation result after co-culture of induced pluripotent stem cells and CSLC (first column), a fluorescence value observed with a fluorescence microscope (second column), alkaline phosphatase (AP) staining result (third column), and Flow cytometry results (fifth column) are shown respectively.
  • 6B is a graph showing the colony size of the control group and the CB-839 treatment group
  • FIG. 6C is a graph showing the flow cytometric analysis results of the control group and the CB-839 treatment group, respectively.
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect on colony formation and fluorescence value by treating CB-839 after co-culture with induced pluripotent stem cells and CSLC containing fluorescence in a small amount.
  • Figure 7a is a result of co-culture with induced pluripotent stem cells and CSLC at a ratio of 100:1 and then microscopic observation (first column), fluorescence values observed with a fluorescence microscope (second column), and alkaline phosphatase (AP) staining results (third Column) and flow cytometry results (fifth column), respectively.
  • 7B is a graph showing the colony size of the control group and the CB-839 treatment group, and FIG.
  • FIG. 7C is a graph showing the flow cytometric analysis results of the control group and the CB-839 treatment group, respectively.
  • Figure 7d is a result of co-culture with induced pluripotent stem cells and CSLC at a ratio of 1000:1, and then the result of microscopic observation (first column) of fluorescence values with a fluorescence microscope (second column), and the result of alkaline phosphatase (AP) staining (third column ), and flow cytometry results (fifth column), respectively.
  • Figure 7e is a graph showing the colony size of the control group and the CB-839 treatment group
  • Figure 7f is a graph showing the flow cytometric analysis results of the control group and the CB-839 treatment group, respectively.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of observing cell migration according to time (0, 12, 24 hours) after CB-839 treatment in WJ-MSC.
  • Telaglenastat (CB-839) was purchased from MedKoo biosciences Inc (North Carolina, USA), Bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl ) Ethylsulfide (BPTES) and 6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) were purchased from Sigma-Aldrich.
  • BPTES Bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl ) Ethylsulfide
  • DON 6-diazo-5-oxo-L-norleucine
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC was reprogrammed according to the instructions of the manufacturer (CytoTune®-iPS 2.0 Sendai virus Reprogramming Kit, Life technology catalog number A1378001) to produce iPSC [Konkuk University Bioethics Committee (IRB, KU 7001355)], MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts) ) Incubated with feeder cells. Cells were transformed with Sendai virus-containing Yamanaka factor and each iPSC colony was identified by morphology. Colonies were taken according to the manual, amplified for 3 weeks after transformation, and then transferred to the feeder layer of irradiated MEF cells. Colonies of iPSCs were plated on matrigel-coated culture plates and cultured in mTeSR1 (StemCell technologies) supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 (ROCK inhibitor, stemRD).
  • mTeSR1 StemTeSR1
  • stemCell technologies supplemented with 10 ⁇ M Y-27632
  • a human umbilical cord with a length of 14 cm and a weight of 16 g was supplied from Konkuk University Hospital. To obtain Wharton's jelly tissue, blood vessels and blood were removed from the umbilical cord, and the tissue was excised and cultured in MSC medium.
  • Human WJ-MSC (hWJ-MSC) (IRB, KU 7001355) was cultured in ⁇ -MEM (Gibco) supplemented with 10% Young in Fronter (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco). Cells were incubated in 5% CO 2 by adding moisture at 37°C.
  • ADSC adipose tissue
  • adipose tissue-PBS mixture was separated into three layers by centrifugation, and the middle layer was transferred to a new tube.
  • the intermediate layer containing adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) was stirred at 37° C. at 200 rpm for 1 hour.
  • the pellet was precipitated through centrifugation and the supernatant was removed, followed by suspension culture at 37° C. and 5% CO 2 using MSC culture medium. Protocols for ADSC and WJ-MSC isolation are shown in Figures 1E and 1G.
  • hiPSC and hESC were cultured in StemFit medium (Ajinomoto, AJ200A). Cells were transferred at a ratio of 1:2 and brought to 50-70% confluent volume.
  • hiPSC and hESC were cultured using Matrigel (cornig, Netherlands) without supporting cells, and Matrigel coating was performed at room temperature 1 hour before incubation.
  • Accutase (Gibco) was used for cell subculture of undifferentiated iPSCs. Briefly, the medium was removed and washed with PBS (Ca 2+ /Mg + free, pH 7, Sigma), and the cells were incubated for 3 minutes at 37°C and 5% CO 2 to separate cells through Accutase treatment.
  • the cells were resuspended, transferred to a conical tube, and centrifuged for 5 minutes at room temperature.
  • the cell pellet was resuspended in StemFit medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and then plated again on a matrigel-coated culture plate. After seeding the cells, the culture plate was stirred once to spread the cell mass evenly, and cultured at 37° C. and 5% CO 2.
  • MDA-MB231 cells were cultured in RPMI-1640 medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic-antifungal agent 100X (anti-vaccine, Gibco) at 37° C. and 5% CO 2 .
  • MCF7 cells were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles medium, Corning) supplemented with 10% FBS and 1% P/S at 37° C. and 5% CO 2 .
  • SH-SY5Y cells were cultured in high-glucose DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P/S at 37° C. and 5% CO 2 .
  • CSLS was isolated according to a previously reported method [29]. Then, CSLS was cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P/S at 37° C. and 5% CO 2 . The cells were again cultured in 0.1% gelatin-encoded culture plates.
  • the MTT assay was used to analyze cell viability. Briefly, after culture, the cells were treated with a final concentration of 0.25 mg/ml MTT solution (Sigma-Aldrich) at 37° C. for 3 hours. When MTT solution is added to living cells, formazan crystals dissolved in dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich) are produced, resulting in dark blue color. The absorbance of each well was measured at 540 nm using a spectrophotometer.
  • alkaline phosphatase kit (Sigma-Aldrich) was used according to the manufacturer's protocol. Briefly, hiPSCs were fixed with citric acid-acetone formalin (Sigma-Aldrich) and stained with FRV-alkaline solution (Sigma-Aldrich). The activity of ALP was visualized under a microscope (Olympus USA, Melville, NY).
  • iPSC For immunocytochemical analysis of iPSC, OCT4 and NANOG (Santa Cruz) antibodies were used.
  • Cell nuclear staining was performed using To-PRO ® -3 (Invitrogen).
  • iPSC was fixed at room temperature for 30 minutes using 4% paraformaldehyde (PFA). After removing 4% PFA, the cells were washed 3 times at 80 rpm for 15 minutes in a stirrer using 1X PBS. Intracellular antigen detection was performed for 10 minutes at room temperature using 0.25% Triton X-100 diluted in 1X PBS. The cells were washed at 80 rpm for 15 minutes in a stirrer using 1X PBS.
  • PFA paraformaldehyde
  • the mixture was stirred for 90 minutes at 65 rpm using 10% bovine serum albumin (BSA) containing PBS.
  • BSA bovine serum albumin
  • the primary antibody was treated with 1:500 to the cells at 4° C. overnight, and then washed with PBS for 15 minutes at room temperature three times.
  • Secondary antibodies to primary antibodies such as anti-rabbit antibodies were used according to the manufacturer's instructions.
  • Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit (Thermo Fisher) antibody was diluted 1:500 and incubated with stirring at 65 rpm for 90 minutes. The cells were washed with 1 ml PBS while stirring at 80 rpm for 15 minutes.
  • TO-PRO-3 iodine was treated at room temperature at a concentration of l ⁇ l/ml for 15 minutes, and washed again with 1 ml PBS while stirring at 80 rpm for 15 minutes. Finally, 20 ⁇ l DAPI (Vectashield) solution (15 mm ⁇ , Paul Marienfeld GmbH & Co.) was added to the microscope slide (Marienfeld) without removing the PBS. After drying the solution, the mounted solution was placed at the end of the cover glass. The sample was kept at 4°C.
  • Micrographs of 40 microscope fields were printed in 10.2 x 12.7 cm format and the surface area of each colony was calculated.
  • Matrigel coating was performed on a 12-well plate at room temperature for 1 hour.
  • the pluripotent stem cell pellet was suspended in StemFit medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632, seeded on a matrigel-coated culture plate, and cultured at 37° C. and 5% CO 2.
  • the next day the fluorescent CSLC was suspended in StemFit medium, the number of cells was measured, and the previously seeded pluripotent stem cells were seeded in a 12-well plate and cultured at 37°C and 5% CO 2.
  • CB-839 was treated after 2 days.
  • MMC mitomycin C
  • CB-839 inhibits the proliferation of cancer cells and increases the proliferation of human iPSC and ES cells when treated with 100 nM.
  • hWJ-MSC Human Wharton Jelly Mesenchymal Stem Cell
  • hWJ-MSC Human Wharton Jelly Mesenchymal Stem Cell
  • ADSC adipose-derived stem cell
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • FGF Ficoll
  • iPSCs were prepared from PBMCs using Sendai virus protocol. After 10 days of treatment with Sendai virus, colonies appeared. Cells were cultured in iPSC medium for 4 weeks (Fig. 1J, left panel), and the cultured colonies were confirmed under a microscope (Fig. 1J, center panel). In order to confirm whether these colonies are iPSC cells, stemness markers (OCT4, SO2, KLF4, c-MYC) were examined, and all markers were observed (Fig.
  • CB-839 inhibits the cell proliferation of MDA-MB-231, but promotes the cell proliferation of iPSC.
  • CB-839, BPTES and DON treated cells have a different tendency than the control in terms of glycolysis and mitochondrial respiration.
  • Oxygen consumption rate reflects the change in the physiological state of cells from the percentage of oxygen in the medium. In other words, when a stress is applied to the mitochondria by a substance that disrupts the membrane potential and ATP is not produced, rapid consumption of energy and oxygen occurs.
  • the extracellular acidification rate measures the process by which pyruvate is converted into lactic acid and hydrogen escapes from the cell. In this case, the acidification rate of the medium with increased hydrogen is measured. Since the mitochondria are in the immature stage, the oxygen consumption rate (OCR) cannot be measured in iPSCs, only the extracellular acidification rate can be measured.
  • ATP production was similar to the control group in CB-839 and higher in BPTES and DON (Fig. 3b).
  • glycolytic capacity was higher in CB-839 and BPTES than in control, and DON was similar.
  • glycolytic reserve CB-839, BPTES, and DON were higher than that of the control group, and CB-839 was the highest (Fig. 3c).
  • OCT4, Nanog and SOX2 were all highly expressed compared to the control group (FIGS. 4A and 4B ).
  • CB-839-treated iPSCs phosphorylation of mTOR, AKT and ERK was increased compared to the control group and BPTES, DON-treated group (Fig. 4c). It has been reported that treatment with CB-839 on breast cancer cells, MDA-MB-231, increases ATF4 expression [31], but there is no report on the amount of ATF4 expression upon treatment with BPTES and DON.
  • FIG. 6A After co-culture with iPSC and CSLC containing fluorescence, the result of treatment with CB-839 was observed (FIG. 6A). As a result of observation with a phase contrast microscope (Nikon, TE2000-U) after CB-839 treatment, it was confirmed that the iPSC shape was the largest at a concentration of 100 nM (FIG. 6A, first row). It was confirmed with a fluorescence microscope (Nikon, TE2000-U) that the fluorescence of CSLC exhibiting fluorescence decreases as the CB-839 concentration increases (Fig. 6A, second column). Alkaline phosphatase (AP) staining was performed on the CB-839-treated group and control cells (Fig.
  • CB-839 of the present invention improves the proliferation rate of pluripotent stem cells while suppressing tumor cells, thereby lowering the possibility of cancerous cancer of the pluripotent stem cells, thereby simultaneously improving the therapeutic efficacy and safety of stem cells. Can be seen.

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 증식 유도용 조성물 및 전능성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 전능성 줄기세포의 증식률과 전능성을 향상시키면서 줄기세포의 암화 가능성도 낮추어 줄기세포의 치료적 효용성과 안전성을 동시에 향상시킨다. 본 발명은 치료적 유효량의 전능성 줄기세포를 수득하기 위한 체외증식 방법 및 인체에 주입할 시점까지 줄기세포를 미분화 상태로 유지하면서 보관 및 배양하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포의 증식 및 전능성 증진용 조성물
본 발명은 텔라글레나스타트(CB-839) 및 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 유도 및 전능성 증진용 조성물에 관한 것이다.
배아줄기세포(ESC) 및 유도만능줄기세포(iPSC)와 같은 전능줄기세포(PSC)는 무한증식(자가재생) 능력과 기관을 구성하는 모든 형태의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)으로 특징지워진다[1]. PSC와 암세포는 유사한 증식 및 대사 활성을 가지며 환경요인 및 세포주에 따라 매우 상이한 증식 및 대사 특성을 보인다[2].
암세포는 계속적으로 분열하여 고형 종양을 형성하거나 비정상적인 세포로 성장한다. 세포 분열은 신체가 성장과 회복을 꾀하기 위한 정상적인 과정으로, 부모세포는 분열하여 2개의 딸세포를 형성하고 이들이 새로운 조직을 형성하거나 죽은 세포를 대체한다. 암세포는 증식하면서 전이(metastasis)라 불리는 과정을 통해 신체 일부분에서 다른 부위로 확산될 수 있다.
PSC의 대사에는 해당작용(glycolysis)과 이후의 피루베이트에서 젖산으로의 전환이 중요한데, 이는 해당작용의 신속한 지속에 필수적인 니코틴아마이드아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)를 재순환시킨다[3]. 인간 iPSC(hiPSCs) 대사는 약 70- 80%의 글루코스를 젖산으로 전환하는 해당작용에 의존한다[3-8]. 이는 글루코스 산화에 의해 36개 분자의 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 생성하는 산화적 인산화 (OXPHOS)와 달리 4분자의 ATP만 생성한다. 그러나, 글루코스가 충분할 경우 ATP가 신속하게 생성되어 동등한 수준으로 만들어질 수 있다.
많은 암종에서 암세포의 성장을 촉진하는 주요 영양분 중의 하나가 혈장에서 가장 풍부한 아미노산인 글루타민이다[11, 12]. 글루타민을 이용함에 있어 미토콘드리아 효소인 글루타미나제에 의해 글루타메이트로 변환되는 단계가 중요하다[13, 14]. 글루타메이트와 글루타메이트-유도된 대사체는 산화 환원 균형, TCA (tricarboxylic acid) 순환 및 아미노산 합성을 포함하는 수많은 주요 세포내 경로에 이용된다.
글루타미나제 효소를 타겟팅하는 몇몇 저분자 억제제가 연구된 바 있는데 [14-16], 예를 들어, bis-2-(5-페닐아세트아미도-1,2,4-티아디아졸-2-일)에틸 설파이드(BPTES)의 구조적 유사체인 CB-839 및 6-디아조-5-옥소-L-노르류신 (DON)은 GLS I 특이적 억제제로서 동정되었다[17, 18]. DON은 글루타민-모방 대사 길항물질(antimetabolite)로 작용하는 초기 GLS I 억제제이다[19-21]. CB-839는 현재 고형암 및 혈액암을 대상으로 단일 및 면역 임상 1상이 진행 중이다 (NCT02071888, NCT02071862, NCT02071927 및 NCT02771626). 그러나, 이들 글루타미나제 억제제와 ESC 또는 iPSC와 같은 전능성 줄기세포의 증식률과의 관계는 전혀 보고된 바가 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 조직의 비가역적인 소실을 원인으로 하는 다양한 난치성 질환에 있어 높은 치료적 가치를 가지는 줄기세포, 특히 모든 계열의 세포로 분화가 가능한 전능성 줄기세포의 효율적인 증식을 유도하고 전능성을 유지 및 증진시키는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 줄기세포의 배양액에 처리할 경우 전능성 줄기세포의 증식이 유의하게 증가할 뿐 아니라 미분화 상태가 지속되어 줄기성(stemness)이 장기간 유지될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포의 증식 유도용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 줄기세포의 전능성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 유도용 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure PCTKR2020011266-appb-I000001
상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
본 발명자들은 조직의 비가역적인 소실을 원인으로 하는 다양한 난치성 질환에 있어 높은 치료적 가치를 가지는 줄기세포, 특히 모든 계열의 세포로 분화가 가능한 전능성 줄기세포의 효율적인 증식을 유도하고 전능성을 유지 및 증진시키는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 줄기세포의 배양액에 처리할 경우 전능성 줄기세포의 증식이 유의하게 증가할 뿐 아니라 미분화 상태가 지속되어 줄기성(stemness)이 장기간 유지될 수 있음을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물을 처리한 줄기세포는 대조군에 비해 세포 수가 현저히 증가할 뿐 아니라, 보다 큰 콜로니가 형성되어 줄기세포의 증식을 효율적으로 유도함을 알 수 있다.
본 명세서에서 용어“줄기세포(stem cell)”는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 만능성 또는 다능성의 미분화 세포들을 지칭한다.
본 명세서에서 용어“할로겐”은 할로겐족 원소를 의미하며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 Y는 S이고, X는 F이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 n은 3이다.
Y는 S이고, X는 F이며, n은 3인 화학식 1 화합물은 CB-839[2-(피리딘-2-일)-N-(5-(4-(6-(2-(3-(트리플루오로메톡시)페닐)아세트아미도)피리다진-3-일)부틸)-1,3,4-티아디아졸-2-일), 텔라글레나스타트(Telaglenastat)]이다. CB-839는 BPTES의 구조적 유사체로서 글루타미나제 억제 활성을 기반으로 한 항암효과가 알려져 있으나, ESC 또는 iPSC와 같은 전능성 줄기세포의 증식률 또는 이들의 전능성 유지, 증진과의 관계는 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 조성물 내에 50-400nM로 포함된다. 보다 구체적으로는 50-300nM로 포함되며, 보다 더 구체적으로는 50-200nM로 포함되고, 보다 더 구체적으로는 70-150nM로 포함되며, 가장 구체적으로는 80-120nM로 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 줄기세포는 전능성(pluripotent) 줄기세포이다.
본 명세서에서 용어“전능성(또는 전분화능, pluripotency) 줄기세포”는 내배엽，중배엽 및 외배엽의 세 층의 배엽 중 어느 배엽을 구성하는 세포로도 모두 분화될 수 있는 줄기세포를 의미한다. 본 발명에서 이용되는 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(ESC) 및 유도만능 줄기세포(iPSC)를 포함하며, 보다 구체적으로는 배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능 줄기세포(iPSC)이다.
본 명세서에서 용어“유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)”는 비-전분화능 세포(예를 들어, 체세포)로부터 특정 미분화 관련 유전자를 삽입하여 인위적으로 전분화능 세포로 역분화된 줄기세포를 의미한다. 유도만능 줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가진다는 점에서 자연계의 전능성 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일한 것으로 당업계에서 간주되고 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전능성(pluripotent) 줄기세포의 전능성 증진용 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure PCTKR2020011266-appb-I000002
상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
본 발명에서 이용되는 화학식 1의 화합물 및 전능성 줄기세포에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“전능성 증진”은 줄기세포의 전분화능을 유지 또는 증진시키고 미분화 상태를 유지시킴으로써 궁극적으로 줄기세포로서의 특성(stemness)을 유지하도록 하는 것을 의미한다. 따라서, 용어“전능성 증진”은 “분화 억제”,“미분화 유지”및 “줄기성 유지”와 동일한 의미로 사용된다. 용어“줄기세포의 분화 억제”는 줄기세포가 특정 분화 자극에 의해 특정세포로 완전히 분화되는 것의 억제 뿐 아니라 특정세포로의 완전 분화 전 중간 단계에서 형성되는 전구체(precursor)의 형성도 억제하는 것을 포함하는 의미이다. 본 발명에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물을 줄기세포, 구체적으로는 전능성 줄기세포 배양액에 첨가할 경우 전능성 마커인 OCT4, Nanog 및 SOX2의 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 관찰함으로써 화학식 1의 화합물이 전분화능 줄기세포를 미분화 상태로 유지하면서 줄기세포 특유의 재생 치료적 유용성을 간직한 채 장기간 보관 또는 배양하는 데에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 조성물 내에 50-150 nM로 포함되며, 보다 구체적으로는 70-130 nM로 포함되고, 보다 더 구체적으로는 90-110 nM로 포함되며, 가장 구체적으로는 약 100 nM로 포함된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 유도 방법 및 전능성 증진 방법을 제공한다:
화학식 1
Figure PCTKR2020011266-appb-I000003
상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
본 발명에서 이용되는 화학식 1의 화합물 및 이에 의한 줄기세포의 증식 유도 방법 및 전능성 증진 효능에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 줄기세포의 증식 유도용 조성물 및 전능성 증진용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 전능성 줄기세포의 증식률과 전능성을 향상시키면서 줄기세포의 암화 가능성도 낮추어 줄기세포의 치료적 효용성과 안전성을 동시에 향상시킨다.
(c) 본 발명은 치료적 유효량의 전능성 줄기세포를 수득하기 위한 체외증식 방법 및 인체에 주입할 시점까지 줄기세포를 미분화 상태로 유지하면서 보관 및 배양하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 CB-839 암, 줄기세포 및 암 줄기세포에 대한 CB-839의 효과를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 도 1a는 MCE 세포를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839에 48시간 동안 노출시킨 뒤 MTT 어세이로 세포 생존성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1b는 SH-SY5Y 세포를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839에 48시간 동안 노출시킨 뒤 MTT 어세이로 세포 생존성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1c는 유방 종양 조직으로부터 CSLC를 수득하는 과정을 보여주는 모식도이다. 도 1d는 CSLCs 세포를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839에 48시간 동안 노출시킨 뒤 MTT 어세이로 세포 생존성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1e는 제대혈로부터 WJ-MSC를 분리하는 과정을 보여주는 모식도이다. 도 1f는 WJ-MSC 세포를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839에 48시간 동안 노출시킨 뒤 MTT 어세이로 세포 생존성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1g는 인간 지방조직으로부터 지방유래 줄기세포를 분리하는 과정을 보여주는 모식도이다. 도 1H는 ADSC 세포를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839에 48시간 동안 노출시킨 뒤 MTT 어세이로 세포 생존성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1I는 혈액으로부터 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하는 과정을 보여주는 모식도이다. 도 1j는 PBMC로부터 iPSC 세포주를 제작하는 과정을 보여주는 모식도 및 제작된 세포주의 줄기성 마커 발현을 보여주는 그림이다. 도 1k-1l은 인간 iPSC(도 1k) 및 ES 세포(도 1l)를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839에 48시간 동안 노출시킨 뒤 MTT 어세이로 세포 생존성을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 CB-839, BPTES, DON의 화학구조와, 이들이 MDA-MB-231 세포 및 인간 전능성 줄기세포(iPSC)의 생존성에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 2a는 CB-839, BPTES, DON의 화학구조 및 분자식을 각각 나타낸다. 도 2b-2c는 MDA-MB-231(도 2b) 및 인간 iPSC(도 2c)를 각각 상이한 농도(10-1000nm)의 CB-839, BPTES, DON에 48시간 동안 노출시키고 MTT 어세이로 세포 생존성을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2d는 CB-839, BPTES, DON 처리 하에 인간 iPSC의 성장 곡선을 나타낸 그림이다.
도 3은 줄기세포에 CB-839, BPTES 및 DON을 처리하면 당분해 기능 및 미토콘드리아 호흡에 상이한 영향을 끼침을 보여주는 그림이다. 도 3a는 iPSC에 100 nM의 CB-839, BPTES 및 DON를 각각 처리한 후의 세포외 산성화율(ECAR)을 측정한 결과이다. 도 3b는 WJ-MSC에 100 nM의 CB-839, BPTES 및 DON를 각각 처리한 후의 산소 소모율(OCR)을 측정한 결과이다. 도 3c는 WJ-MSC에 100nM의 CB-839, BPTES 및 DON를 각각 처리한 후의 세포외 산성화율(ECAR)을 측정한 결과이다.
도 4는 CB-839의 처리에 의해 인간 iPSC의 전능성 마커 발현이 증가함으로 보여주는 그림이다. 도 4a는 iPSC에서의 전능성 마커(OCT4, Nanog, SOX2) 발현을 실시간 PCR을 통해 분석한 결과이다. 도 4a 및 4c는 전능성 마커(SOX2, NANOG 및 OCT4) 발현과 mTOR, AKT, ERK 및 YAP1의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 4d는 MDA-MB-231 세포(왼쪽 패널) 및 CSLC(오른쪽 패널)를 각각 CB-839, BPTES 및 DON으로 처리하고 RT-PCR을 수행한 결과를 보여준다. 도 4e는 iPSC를 글루타민 포함 Essential 8™ 또는 글루타민 불포함 StemFit에서 배양한 뒤 CB-839, BPTES 및 DON를 처리한 결과를 각각 보여준다.
도 5는 CB-839의 처리가 유도만능줄기세포(iPSC)의 세포 증식 및 콜로니 형성에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 5a는 0, 1, 3, 5, 7일째 세포 증식을 측정한 결과이며, 도 5b는 hiPSC에서의 콜로니 형성을 정량분석한 결과이다. 도 5c는 위상차 현미경 관찰 결과 및 알칼린 포스파타제(AP) 염색 결과를 각각 나타낸다. 스케일바: 40μm. 도 5d는 대조군과 CB-839 처리군의 콜로니 크기를 보여주는 그래프이고, 도 5e는 인간 전분화능 마커인 OCT4 및 Nanog에 대한 면역세포화학 분석 결고로서, 핵은 TO-PRO-3로 염색하였다.
도 6은 유도만능줄기세포와 형광이 들어있는 CSLC를 공배양 후 CB-839를 처리하여 콜로니 형성 및 형광값에 미치는 영향을 조사한 결과는 보여주는 그림이다. 도 6a는 유도만능줄기세포와 CSLC를 공배양 후 위상차 현미경 관찰 결과 (첫번째 열), 형광값을 형광 현미경으로 관찰한 결과(두번째 열), 알칼린 포스파타제(AP) 염색 결과(세번째 열), 그리고 유세포 분석 결과(다섯번째 열)를 각각 나타낸 것이다. 도 6b는 대조군과 CB-839 처리군의 콜로니 크기를, 도 6c는 대조군과 CB-839 처리군의 유세포 분석결과를 각각 보여주는 그래프이다.
도 7은 유도만능줄기세포와 형광이 들어있는 CSLC를 적은 양으로 공배양 후 CB-839를 처리하여 콜로니 형성 및 형광값에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 도 7a는 유도만능줄기세포와 CSLC를 100:1 비율로 공배양 후 현미경 관찰 결과 (첫번째 열), 형광값을 형광 현미경으로 관찰한 결과 (두번째 열), 알칼린 포스파타제(AP) 염색 결과(세번째 열), 그리고 유세포 분석 결과(다섯번째 열)를 각각 나타낸 것이다. 도 7b는 대조군과 CB-839 처리군의 콜로니 크기를, 도 7c는 대조군과 CB-839 처리군의 유세포 분석결과를 각각 보여주는 그래프이다. 도 7d는 유도만능줄기세포와 CSLC를 1000:1 비율로 공배양 후 현미경 관찰 결과(첫번째 열) 형광값을 형광 현미경으로 관찰한 결과(두번째 열), 알칼린 포스파타제(AP) 염색 결과(세번째 열), 그리고 유세포 분석 결과(다섯번째 열)를 각각 나타낸 것이다. 도 7e는 대조군과 CB-839 처리군의 콜로니 크기를, 도 7f는 대조군과 CB-839 처리군의 유세포 분석결과를 각각 보여주는 그래프이다.
도 8은 WJ-MSC에서 CB-839를 처리 후 시간(0, 12, 24 시간)에 따른 세포 이동을 관찰한 결과를 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
화합물
텔라글레나스타트(Telaglenastat, CB-839)는 MedKoo biosciences Inc (North Carolina, USA)에서 구입하였고, Bis-2-(5-페닐아세트아미도-1,2,4-티아디아졸-2-일)에틸설파이드(BPTES) 및 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(DON)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
말초혈액 단핵세포 (PBMC)의 iPSC로의 전환 유도
1. 혈액으로부터 PBMC의 분리
정맥 천자(puncture)를 통해 혈액시료를 헤파린화 튜브로 수집하였다. 15 ml 튜브에 피콜(ficoll)을 넣고, 천천히 혈액을 첨가한 뒤 2500rpm에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 시료는 4개의 층(RBC, Ficoll, PBMC, Plasma)으로 나뉘었으며, 이중 PBMC 층을 새로운 15 ml 튜브로 옮겼다(도 1i).
2. hiPSC 제작
PBMC를 제조자(CytoTune®-iPS 2.0 Sendai virus Reprogramming Kit, Life technology catalog number A1378001)의 설명서에 따라 리프로그래밍하여 iPSC를 제작하고[건국대학교 생명윤리위원회(IRB, KU 7001355)], MEF(Mouse Embryonic Fibroblasts) 지지세포(feeder cell)와 함께 배양하였다. 세포를 센다이 바이러스-함유 Yamanaka 인자로 형질전환하고 형태를 통해 각각의 iPSC 콜로니를 확인하였다. 매뉴얼에 따라 콜로니를 취하고, 형질전환 후 3주간 증폭시킨 뒤에 조사된(irradiated) MEF 세포의 영양층으로 옮겼다. iPSCs 콜로니를 마트리젤-코팅된 배양 플레이트에 플레이팅하고 10μM Y-27632(ROCK 억제제, stemRD)가 보충된 mTeSR1 (StemCell technologies)에서 배양하였다.
3. 인간 조직 유래 MSC의 분리
길이 14cm, 무게 16g의 인간 탯줄을 건국대학교 병원으로부터 공급받았다. 와튼 젤리(Wharton’s jelly) 조직을 수득하기 위해, 탯줄에서 혈관 및 혈액을 제거하고 조직을 절개하여 MSC 배지에서 배양하였다. 인간 WJ-MSC (hWJ-MSC)(IRB, KU 7001355)를 10% FBS(Young in Fronter) 및 1% 페니실린/ 스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 α-MEM (Gibco)에서 배양하였다. 세포는 37℃에서 습기를 가하여 5% CO2에서 배양하였다. ADSC(IRB, KU 7001355)를 수득하기 위해, 60cc의 인간 지방 조직을 50 ml 원뿔 튜브로 옮기고 동일한 양의 무-Ca/Mg PBS를 첨가하였다. 원심분리를 통해 지방 조직-PBS 혼합물을 3개의 층으로 분리하고, 가운데 층을 새로운 튜브로 옮겼다. 효소 용액 처리 후에, 지방세포 및 간질혈관분획(stromal vascular fraction, SVF)을 포함하는 중간층을 37℃에서 200rpm으로 1시간 동안 교반하였다. 다음으로, 원심 분리를 통해 펠렛을 침전시키고 상층액을 제거한 뒤 MSC 배양배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서 부유배양하였다. ADSC 및 WJ-MSC 분리를 위한 프로토콜은 도 1e 및 1g에 표시하였다.
CSLC의 제작
생명윤리위원회(IRB, KUH 1020003)의 승인 하에 건국대학교병원 유방암 센터에서 유방암 생체검사를 받은 환자로부터 유방암 조직 표본을 수집하였다. 수술 전 보조요법(Neoadjuvant, 수술 전 4 사이클의 독소루비신 및 사이클로포스파마이드 투여)을 받은 Ⅲ기 유방암 환자의 유방 종양 조직을 PBS(GE Healthcare Hyclone)로 세척하고 IV형 콜라게나제(Sigma-Aldrich)와 함께 배양하였다[29].
*세포 배양
1. hiPSC and hESCs 배양
hiPSC 및 hESC(IRB, KU 7001355)를 StemFit 배지(Ajinomoto, AJ200A)에서 배양하였다. 세포를 1:2의 비율로 옮기고 50-70% 컨플루언트 부피가 되도록 하였다. hiPSC 및 hESC는 지지세포 없이 마트리젤(cornig, Netherlands)을 이용하여 배양하였으며, 배양 1시간 전에 상온에서 마트리젤 코팅을 수행하였다. 미분화 iPSC의 세포 계대배양을 위해 Accutase(Gibco)를 사용하였다. 요약하면, 배지를 제거하고 PBS(Ca2+/Mg+ free, pH 7, Sigma)로 세척한 뒤, 세포를 37℃, 5% CO2로 3분간 배양하면서 Accutase 처리를 통해 세포를 분리하였다. 세포를 재부유시킨 뒤 원뿔 튜브로 옮긴 다음 상온에서 5분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10μM Y-27632가 보충된 StemFit 배지에서 재부유시킨 후 마트리젤-코팅된 배양 플레이트에 다시 플레이팅하였다. 세포를 씨딩한 뒤에, 배양 플레이트를 1회 교반하여 세포 덩어리가 고르게 퍼지도록 하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
2. WJ-MSC 및 ADSC의 배양
WJ-MSC 및 ADSC의 배양은 10% FBS(Hyclore), 1% 항생-항진균제 100 X (항-anti, Gibco)가 보충된 α-MEM(gibco, 12561-056) 배지에서 수행하였다. TrypLE 1X(Gibco)에 의해 80-90% 컨플루언시에 도달했을 때, 세포를 1:2 비율로 계대하였다. 요약하면, 배지를 제거하고 PBS(Ca2+/Mg+ free, pH 7, Sigma)로 두 번 세척한 뒤, 세포를 37℃, 5% CO2로 배양하였다. 분리된 세포를 배양 배지에 재부유하고 상온에서 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10% FBS가 보충된 α-MEM 배지에서 재부유하고 플레이트를 1회 교반하여 세포 덩어리가 고르게 퍼지도록 한 뒤 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
3. MDA-MB231, MCF-7 및 SH-SY5Y 세포의 배양
MDA-MB231 세포(ATCC)를 10% FBS 및 1% 항생-항진균제 100X (항-vaccine, Gibco)가 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL)에서 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. MCF7 세포를 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles medium, Corning)에서 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. SH-SY5Y 세포를 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 고-글루코스 DMEM에서 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다.
4. CSLC 배양
종래에 보고된 방법에 따라 CSLS를 분리하였다[29]. 이후 CSLS를 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM에서 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 세포를 다시 0.1% 젤라틴-코딩된 배양 플레이트에서 배양하였다.
MTT 어세이
세포 생존성을 분석하기 위해 MTT 어세이를 이용하였다. 요약하면, 배양 후 세포에 0.25 mg/ml 최종 농도의 MTT 용액(Sigma-Aldrich)을 37℃에서 3시간 동안 처리하였다. 살아있는 세포에 MTT 용액을 가하면 디메틸설폭사이드(Sigma-Aldrich)에 용해된 포르마잔 결정이 생성되어 어두운 푸른색이 나타난다. 각 웰의 흡광도는 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
알칼린 포스파타제 (ALP) 분석
알칼린 포스파타제 kit(Sigma-Aldrich)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 요약하면, hiPSC를 시트르산-아세톤 포르말린(Sigma- Aldrich)으로 고정시키고 with FRV-알칼린 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. ALP의 활성은 현미경(Olympus USA, Melville, NY)으로 시각화하였다.
RNA 분석
총 RNA 분리 키트인 TRIzol(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 이용하여 hiPSC로부터 총 RNA를 분리하였다. 역전사 효소 M-MLV(Promega, Wis., USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Stockholm, Sweden)를 이용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하였다. 유전자 발현량은 GAPDH에 대해 정규화하였다.
면역세포화학
iPSC의 면역세포화학 분석을 위해 OCT4 및 NANOG(Santa Cruz) 항체를 사용하였다. 세포 핵 염색은 To-PRO®-3(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. iPSC를 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 이용하여 상온에서 30분간 고정하였다. 4% PFA를 제거한 뒤, 1X PBS를 이용하여 세포를 교반기에서 15분간 80rpm으로 3회 세척하였다. 세포에 대해 1X PBS에서 희석한 0.25% Triton X-100을 이용하여 상온에서 10분 간 세포 내 항원 검출을 수행하였다. 세포를 1X PBS를 이용하여 교반기에서 15분간 80rpm으로 세척하였다. 이후 PBS 함유 10% BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 65rpm으로 90분간 다시 교반하였다. 1차 항체를 1:500으로 세포에 4℃로 밤새 처리하고, PBS를 처리한 뒤 상온에서 15분간 3회 세척하였다. 항-래빗 항체와 같은 1차 항체에 대한 2차 항체는 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. Alexa Fluor 488 당나귀 항-래빗(Thermo Fisher) 항체를 1:500로 희석하고 90분간 65rpm으로 교반하면서 배양하였다. 세포를 1 ml PBS로 15분간 80 rpm으로 교반하면서 세척하였다. 용액을 제거한 뒤, TO-PRO-3 요오드를 상온에서 l㎕/ ml 농도로 15분 간 처리하고 다시 1 ml PBS로 15분간 80 rpm으로 교반하면서 세척하였다. 마지막으로, PBS를 제거하지 않은 채 20μl DAPI (Vectashield) 용액(15mm Ø, Paul Marienfeld GmbH & Co.)을 현미경 슬라이드(Marienfeld)에 가하였다. 용액 건조 후 마운팅된 용액을 커버 글래스 끝에 위치시켰다. 시료는 4℃로 유지하였다.
콜로니 수 측정 및 현미경 촬영
플라스크당 10개의 무작위장(random field)을 현미경 플랫폼에 위치시킨 후 선정된 장을 변경시키지 않았다. 마찬가지로, 10개의 무작위장을 사진 촬영을 위해 플랫폼에 위치시킨 경우 카메로 초점 조정을 위한 경우를 제외하곤 이를 변경하지 않았다.
콜로니 크기 측정
40개 현미경 장에 대한 현미경 사진을 10.2 x 12.7 cm 포맷으로 인쇄하고 각 콜로니의 표면적을 계산하였다.
만능줄기세포와 암세포 공배양
12웰 플레이트에 1시간동안 상온에서 마트리젤 코팅을 수행하였다. 만능줄기세포 펠렛을 10μM Y-27632가 보충된 StemFit 배지에서 부유시킨 후 마트리젤-코팅된 배양 플레이트에 씨딩 후 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 다음 날 형광을 띄는 CSLC를 StemFit 배지에서 부유시킨 후 세포 수를 측정한 후 기존 씨딩하였던 만능줄기세포를 12웰 플레이트에 씨딩 후 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 2일 후 CB-839를 처리하였다.
스크래치 어세이
세포 밀도가 80-90%가 될 때, 10mM 미토마이신 C(MMC)를 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 처리하였다. 세포의 증식 능력이 억제되면, PBS로 세척하고 신선한 배지로 교체하였다. 긁히지 않은 영역의 양쪽 면을 현미경으로 관찰하였다(0, 12, 24시간).
통계적 분석
모든 통계적 분석은 GraphPad Prism(version 7)을 이용하여 수행하였다. 대부분의 실험은 3회 반복되었다. p-값은 GraphPad Prism을 이용하여 일원분산분석(one-way ANOVA) 및 t-검정을 통해 계산함으로써 통계적 유의성을 평가하였다. 모든 도면에서, *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 이다.
실험결과
CB-839는 암세포의 증식을 저해하고, 100 nM로 처리되었을 때 인간 iPSC 및 ES 세포의 증식을 증가시킨다.
다양한 농도(10-1000nM)의 CB-839 처리가 암세포인 SH-SY5Y과 MCF-7에 미치는 영향을 조사한 결과, CB-839의 농도가 증가할수록 세포 증식이 억제됨을 확인하였으며, 특히 1000nM에서는 대조군보다 48%가 낮았다(도 1a). SH-SY5Y 세포에서도 CB-839의 농도가 증가할수록 증식이 억제되었고, 특히 1000nM에서 대조군보다 36%가 낮았다(도 1b). CSLC 역시 CB-839를 고농도로 처리할수록 세포증식이 많이 억제되어, 1000nM에서는 대조군보다 88%가 낮았다. 다른 암세포에 비해 CSLC에서 CB-839에 의해 세포증식이 더 많이 억제되었다(도 1d).
다음으로 본 발명자들은 CB-839의 처리가 중간엽 줄기세포(MSC)의 증식에도 영향을 끼치는지를 조사하였다. hWJ-MSC(인간 와튼젤리 중간엽 줄기세포)는 인간 탯줄의 젤라틴성 물질에서 유래한 다분화능 성체 줄기세포로[30], 임신 여성의 탯줄 조직으로부터 분리하였다. 수득한 WJ-MSC를 인 비트로에서 2주간 배양함으로써 증식시켰다. 이후, WJ-MSC에 CB-839를 다양한 농도(10-100nM)로 처리한 결과, 세포 증식은 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다(도 1f). 종래 연구에서는 중간엽 줄기세포에 CB-839를 처리한 적이 없었기 때문에 이러한 결과는 흥미로운 것이었다. 본 발명자들은 또 다른 중간엽 줄기세포인 ADSC(지방-유래 줄기세포)에 CB-839가 미치는 영향을 조사하였다. 정상인의 복부 지방흡입으로 ADSC를 수득하고, 60cc의 지방 조직에 효소를 처리한 뒤 분리하였다(도 1g). ADSC에서는 CB-839를 처리해도 세포 증식이 유의하게 변화하지 않았으며(도 1h), WJ-MSC과 ADSC에 각각 CB-839를 처리한 결과 이들 두 종의 중간엽 줄기세포 사이에도 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
다음으로, CB-839 처리에 따른 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)의 세포 증식률을 조사하였다. 피콜을 이용하여 30ml 혈액에서 말초혈 단핵세포(PBMC)를 분리하고(도 1I), 센다이 바이러스 프로토콜을 이용하여 PBMC로부터 iPSC를 제작하였다. 10일간 센다이 바이러스를 처리하자 콜로니 형태가 나타났다. 세포를 4주간 iPSC 배지에서 배양하고(도 1j, 왼쪽 패널), 배양된 콜로니를 현미경으로 확인하였다(도 1j, 가운데 패널). 이들 콜로니가 iPSC 세포인지 여부를 확인하기 위해 줄기성(stemness) 마커(OCT4, SO2, KLF4, c-MYC)를 조사한 결과 모든 마커가 발현됨을 관찰하였다(도 1j, 오른쪽 패널). iPSC에 상이한 농도(10-1000 nM)의 CB-839를 처리하자 특히 100nM에서 대조군 또는 다른 농도에 비하여 세포 증식이 증가하였다(도 1k). 다양한 농도의 CB-839 처리에 따른 ES의 증식 변화를 관찰한 결과, iPSC에서처럼 100nM 농도에서 대조군보다 세포증식이 증가함을 확인하였다(도 1l).
CB-839는 BPTES 및 DON와 마찬가지로 MDA-MB-231의 세포 증식은 억제하나, iPSC의 세포 증식은 촉진한다.
본 발명자들은 글루타미나제 억제제로 작용하는 CB-839, BPTES 및 DON를 비교하였다. MDA-MB-231 세포에 상이한 농도(10-1000 nM)의 CB-839, BPTES, 및 DON를 처리하여 세포 증식을 확인한 결과, CB-839, BPTES 및 DON의 처리 농도가 증가할수록 MDA-MB-231 세포증식은 감소하였다(도 2b). 앞선 실험에서 CB-839가 암세포에서와 달리 iPSC의 세포 증식을 증가시켰기 때문에, iPSC에서의 CB-839와 BPTES 및 DON에 의한 효과를 비교해보고자 하였다. iPSC에서 BPTES 및 DON 농도가 증가할수록 세포 증식은 감소하였으나, 100nM 농도의 CB-839에서는 세포증식이 증가하였다(도 2c). iPSC에 CB-839, BPTES 및 DON 처리 후 0, 1, 3 및 5일 째의 세포 증식을 확인하였다. 5일째의 세포 증식은 CB-839, 대조군, BPTES 및 DON의 순서로 높았다(도 2d).
CB-839, BPTES 및 DON 처리 세포는 해당 기능과 미토콘드리아 호흡에 있어 대조군과 상이한 경향을 가진다.
산소 소모율(OCR)은 배지 내 산소 비율로부터 세포의 생리적인 상태의 변화를 반영한다. 다시 말해, 막 전위를 붕괴시키는 물질에 의해 미토콘드리아에 스트레스가 가해지고 ATP가 생성되지 못하면, 에너지와 산소의 빠른 소모가 발생한다. 세포외 산성화율(ECAR)은 피루베이트가 젖산으로 전환되어 수소가 세포 밖으로 빠져나가는 과정을 측정하는 것으로, 이 경우 수소가 증가한 배지의 산성화율이 측정된다. 미토콘드리아가 미성숙 단계이기 때문에, iPSC에서는 산소 소모율(OCR)을 측정할 수 없으며 세포외 산성화율만이 측정 가능하다. iPSC에 100 nM의 CB-839, BPTES 및 DON을 3일간 처리한 뒤, ECAR를 측정한 결과, 해당 작용은 대조군에서보다 CB-839, BPTES 및 DON 처리군에서 높았으며, BPTES이 가장 높았다(도 3a). WJ-MSC에 100nM의 CB-839, BPTES 및 DON를 처리하고, 배양 3일 뒤 OCR과 ECAR를 측정하였다. WJ-MSC에서 최대 호흡률은 CB-839, BPTES 및 DON를 처리한 경우 대조군보다 높았고 DON의 경우가 가장 높았다. 예비호흡능력(Spare respiratory capacity, SRC)은 CB-839와 DON은 대조군보다 높고 BPTES는 대조군보다 낮았다. ATP 생산량은 CB-839는 대조군과 유사하고 BPTES 및 DON은 더 높았다(도 3b). 다음으로 WJ-MSC에서 ECAR을 측정한 결과, 해당 능력(glycolytic capacity)은 CB-839 및 BPTES가 대조군보다 높았으며, DON은 유사했다. Glycolytic reserve는 CB-839, BPTES 및 DON가 대조군보다 높았으며, CB-839가 가장 높았다(도 3c).
CB-839 처리에 의한 인간 iPSC 전능성 마커 발현의 증가
실시간 PCR 및 웨스턴 블롯팅을 통해 전능성 마커(OCT4, Nanog 및 SOX2)의 발현 수준을 분석한 결과, OCT4, Nanog, SOX2 모두 대조군에 비해 높게 발현되었다(도 4a 및 4b). CB-839-처리된 iPSC에서, mTOR, AKT 및 ERK의 인산화가 대조군 및 BPTES, DON 처리군에 비해 증가하였다(도 4c). 유방암 세포인 MDA-MB-231에 CB-839를 처리하면 ATF4 발현이 증가한다고 보고된 바 있으나[31], BPTES 및 DON 처리시의 ATF4 발현량에 대한 보고는 없다. 아울러, CSLC에서 CB-839, BPTES 및 DON 처리 후 ATF4의 발현 양상에 대한 보고 역시 없다. MDA-MB-231 및 CSLC에서, ATF4 발현은 CB-839를 처리한 경우 대조군에 비해 높았다(도 4d). 본 발명자들은 iPSC에서의 ATF4 발현 수준도 확인하고자 하였다. iPSC를 글루타민 포함 Essential 8™ 배지 또는 글루타민 불포함 StemFit 배지에서 배양하고 CB-839, BPTES 및 DON을 처리하였다. 흥미롭게도, Essential 8™ 배지 및 StemFit 배지에서 배양한 iPSC는 대조군과 BPTES 및 DON 처리군에 비해 ATF4 발현량이 낮았다(도 4e).
CB-839 처리가 유도만능줄기세포(iPSC)의 증식 및 콜로니 형성에 미치는 영향
7일간 CB-839 처리 iPSC와 대조군 세포를 배양하면서 0, 1, 3, 5, 7일째의 세포 수를 측정하였다. 배양 7일째에, CB-839를 처리한 iPSC는 대조군에 비해 25.8%가 증가하였다(도 5a). 100 nM 농도의 CB-839는 콜로니 형성 효율에도 효과적이었다(도 5b). 다음으로, CB-839를 처리한 iPSC와 대조군 세포에 대한 AP 염색을 수행하였다(도 5c). 콜로니 크기의 측정 결과, CB-839 처리 iPSC가 더 큰 콜로니를 형성했다(도 5d). 면역세포화학 분석을 통해 iPSC 및 CB-839 처리 세포에서 전능성 마커인 OCT4와 Nanog가 잘 발현되고 있음을 확인하였다(도 5e).
CB-839 처리 후 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 시 종양형성 억제 능
iPSC와 형광이 들어있는 CSLC를 공배양 후 CB-839를 처리한 결과를 관찰하였다(도 6a). CB-839 처리 후 위상차 현미경(Nikon, TE2000-U)으로 관찰 결과 100 nM 농도에서 iPSC 모양이 가장 큰 것을 확인하였다(도 6a 첫번재 열). 형광을 띄는 CSLC는 CB-839 농도가 높아질수록 형광이 낮아지는 것을 형광 현미경(Nikon, TE2000-U)으로 확인하였다(도 6a 두번째 열). CB-839를 처리한 군과 대조군 세포에 대한 알칼린 포스파타제(AP) 염색을 수행하고(도 6a 세번째 열), 형광값과 알칼리 포스파타제(AP) 염색 이미지를 합쳐서 비교하였다(도 6a 네번째 열). 유세포 분석결과를 통해 CSLC 형광값이 CB-839 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다(도 6a 다섯번째 열). 콜로니 크기의 측정 결과, CB-839 100 nM 처리 군에서 iPSC가 더 큰 콜로니를 형성함을 확인하였다(도 6b). 유세포 분석 결과, CB-839의 농도가 높아질수록 감소하는 것을 확인하였다(도 6c). iPSC와 형광이 들어있는 CSLC를 100:1 비율로 공배양 후 CB-839를 처리 하여 분석하였다(도 7a). CB-839 처리 후 위상차 현미경으로 관찰 결과 대조군에 비해 100 nM 농도에서 iPSC 모양이 큰 것을 확인하였다(도 7a 첫번재 열). 형광을 띄는 CSLC는 CB-839 100 nM 농도에서 대조군에 비해 낮은 형광값을 보임을 확인하였다(도 7a 두번째 열). CB-839를 처리한 군과 대조군에 대한 알칼린 포스파타제(AP) 염색을 수행하고(도 7a 세번째 열), 형광값과 알칼리 포스파타제(AP) 염색 이미지를 합쳐서 비교하였다(도 7a 네번째 열). 유세포 분석결과를 통해 CSLC 형광값이 CB-839의 100 nM 농도에서 대조군에 비해 낮은 것을 확인하였다(도 7a 다섯번째 열). 콜로니 크기의 측정 결과, CB-839 100 nM 처리 iPSC가 대조군에 비해 더 큰 콜로니를 형성하였다 (도 7b). 유세포 분석 결과, CB-839 100nM 농도가 대조군에 비해 낮은 것을 확인하였다(도 7c). iPSC와 형광이 들어있는 CSLC를 1000:1 비율로 공배양 후 CB-839를 처리하여 분석하였다(도 7d). CB-839 처리 후 위상차 현미경으로 관찰 결과 대조군에 비해 100 nM 농도에서 iPSC 모양이 큰 것을 확인하였다(도 7d 첫번재 열). 형광을 띄는 CSLC는 CB-839 100 nM 농도에서 대조군에 비해 형광값이 낮음을 확인하였다(도 7d 두번째 열). CB-839를 처리한 군과 대조군에 대한 알칼린 포스파타제(AP) 염색을 수행하고(도 7d 세번째 열), 형광값과 알칼리 포스파타제(AP) 염색 이미지를 합쳐서 비교하였다(도 7d 네번째 열). 유세포 분석결과를 통해 CSLC 형광값이 CB-839의 100 nM 농도에서 대조군에 비해 낮은 것을 확인하였다(도 7d 다섯번째 열). 콜로니 측정 결과, CB-839 100 nM 처리 iPSC가 대조군에 비해 더 큰 콜로니를 형성하였다(도 7e). 유세포 분석 결과, CB-839 100nM 농도가 대조군에 비해 낮은 것을 확인하였다 (도 7f).
이상의 결과를 통해, 본 발명의 CB-839는 전능성 줄기세포의 증식률을 향상시키면서도 종양 세포를 억제함으로써 혹시 있을 수 있는 전능성 줄기세포의 암화 가능성도 낮추어, 줄기세포의 치료적 효용성과 안전성을 동시에 향상시킴을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (14)

  1. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 유도용 조성물:
    화학식 1
    Figure PCTKR2020011266-appb-I000004
    상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 Y는 S이고, X는 F인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 n은 3인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 조성물 내에 50-400 nM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 전능성(pluripotent) 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 전능성(pluripotent) 줄기세포는 배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능 줄기세포(iPSC)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전능성(pluripotent) 줄기세포의 전능성 증진용 조성물:
    화학식 1
    Figure PCTKR2020011266-appb-I000005
    상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 화학식 1의 Y는 S이고, X는 F인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 화학식 1의 n은 3인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 조성물 내에 50-150 nM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 전능성(pluripotent) 줄기세포는 배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능 줄기세포(iPSC)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 하기 화학식 1의 화합물을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식 유도 방법:
    화학식 1
    Figure PCTKR2020011266-appb-I000006
    상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 줄기세포는 전능성(pluripotent) 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 하기 화학식 1의 화합물을 함유하는 배지에서 전능성(pluripotent) 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 전능성 증진 방법:
    화학식 1
    Figure PCTKR2020011266-appb-I000007
    상기 화학식에서, Y는 C 또는 S이고, X는 할로겐이며, n은 2 내지 4의 정수이다.
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