WO2018221904A2 - 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물 - Google Patents

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WO2018221904A2
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hepatic progenitor
progenitor cells
cdh
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정재민
김요한
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한양대학교 산학협력단
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/14—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from hepatocytes

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for reprogramming human adult hepatocytes into hepatic progenitor cells.
  • liver transplantation is the only cure for chronic liver disease.
  • Regenerative medicine is one of the most useful breakthrough technologies to overcome this problem.
  • specific stem cells of patients can be considered a reliable source of liver regenerative medicine.
  • Stem cells similar to stem cells are derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), direct reprogrammed cells and small hepatocytes, but do not show a clear therapeutic potential for chronic liver disease.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • hepatic progenitor cells derived from rodent-derived chemicals have become a potential source for developing cell therapies and drug tests for various types of liver disease.
  • Orthotropic liver transplantation has been approved as one of the treatment options for end-stage liver disease, which has greatly improved the outcome of liver transplantation and has been recognized as a standard treatment for many types of terminal liver disease.
  • new hepatocytes recent developments in stem cell research have shown promising potential for cell replacement therapy.
  • primary hepatocytes are easy to kill cells, difficult to handle in vitro culture conditions, and establishing the culture conditions of functionally proliferating hepatocytes is an essential part of liver regenerative medicine.
  • hepatocytes Although many researchers have reported human embryonic stem cells (hESCs) and iPSCs (iPSCs) as alternative cell sources of hepatocytes, these cells have some limitations. Hepatocytes converted directly from terminal differentiated cells are a recently developed cell source and express hepatocyte specific marker genes and proteins. They are relatively primitive and require more manipulation. In addition, many researchers are looking for liver progenitors / stem cells to overcome this problem. To date, several studies have suggested that hepatocytes / stem cells can be derived from mice and rats.
  • hESCs human embryonic stem cells
  • iPSCs iPSCs
  • Another object of the present invention is to provide a method for reprogramming human adult hepatocytes into hepatic progenitor cells by culturing in the medium composition for reprogramming.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for treating liver disease comprising hepatic progenitor cells derived from the reprogramming and the hepatic progenitor cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating liver disease, comprising administering an effective amount of the hepatic progenitor cells to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a reprogramming medium composition of human adult hepatocytes into hepatic progenitor cells, including HGF, A83-01 and CHIR99021.
  • the invention also provides a method for reprogramming human adult hepatocytes to hepatic progenitor cells comprising culturing human adult hepatocytes in a reprogramming medium composition of human adult hepatocytes to hepatic progenitor cells comprising HGF, A83-01 and CHIR99021. To provide.
  • the invention also derives from human adult hepatocytes, wherein expression of hepatic progenitor specific markers including albumin, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1 ⁇ , CK19, CD44 and CD90 is 1.5-fold compared to human adult hepatocytes.
  • hepatic progenitor cells having bipotent stem cell properties that are aberrantly increased and differentiate into hepatocytes and bile epithelial cells.
  • the present invention also provides a composition for treating liver disease comprising the hepatic progenitor cells.
  • the present invention also provides a method for treating liver disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating liver disease comprising the liver progenitor cells.
  • the present invention is reprogrammed into hepatic progenitor cells by adding various chemical combinations to human adult hepatocytes, and the hepatic progenitor cells have a differentiation ability that can be differentiated into hepatocytes and bile epithelial cells. It can be used as a source and can be used to treat liver disease.
  • Figure 1 illustrates a method for producing hepatic progenitor cells chemically derived from human hepatocytes of the present invention.
  • FIG. 2a shows morphological changes (a) of human hepatocytes cultured under AC (+) and AC ( ⁇ ) conditions with HGF for 14 days during cell differentiation.
  • 2D shows the results of quantitative comparison of relative gene expression levels of hepatic progenitor markers in human hepatocytes cultured under AC (+) and AC ( ⁇ ) conditions (data represented by mean ⁇ standard deviation).
  • Figure 2e shows the results of karyotype image analysis of human hepatocytes cultured in AC conditions.
  • Figure 3a shows the timelapse results of human hepatocytes containing HGF for 9 days and cultured in AC conditions.
  • 4B is a quantitative comparison of gene expression levels of hepatocyte markers for CdH, hepatocyte differentiated CdH (CdH-Hep) and human hepatocytes (hPH) (data shown as mean ⁇ standard deviation).
  • Figure 4c is a bile duct cell induced retardation contrast image of CdH (CdH-Chol).
  • Figure 4d shows the results of immunofluorescence analysis of bile duct cell markers during choleblast differentiation of CdH.
  • 4E is a quantitative comparison of relative gene expression levels of bile duct markers for CdH, CdH (CdH-Chol) differentiated into bile duct cells and human hepatocytes (hPH).
  • 5A is a projection electron microscope image of hepatocyte differentiated CdH (CdH-Hep).
  • 5B is an evaluation result of albumin levels secreted during hepatocyte induction.
  • 5C shows the results of comparing the expression of hepatocyte specific genes between human hepatocytes (hPH), CdH, and hepatocyte-induced CdH (CdH-Hep).
  • 6B shows the relative gene expression levels of hepatic progenitor markers of CdH following passage (data shown as mean ⁇ standard deviation).
  • Figure 6c is the result of immunofluorescence analysis of hepatocyte marker protein of hepatocellular differentiated CdH (CdH-Hep) according to passage.
  • FIG. 6D shows hepatocyte marker gene expression patterns in hepatocyte differentiated CdH (CdH-Hep) compared to CdH (data shown as mean ⁇ standard deviation).
  • FIG. 7A shows the growth curve of CdH according to passage (data represented by mean ⁇ standard deviation) and FIG. 7B shows karyotype image of CdH upon passage.
  • 8A is a schematic of experimental procedures for establishing human CdH and in vivo cell transplantation assays.
  • the present invention relates to a reprogramming medium composition of human adult hepatocytes into hepatic progenitor cells comprising HGF, A83-01 and CHIR99021.
  • the present invention also relates to reprogramming of human adult hepatocytes to hepatic progenitor cells comprising culturing human adult hepatocytes in a reprogramming medium composition of human adult hepatocytes to hepatic progenitor cells comprising HGF, A83-01 and CHIR99021.
  • a method for reprogramming of human adult hepatocytes to hepatic progenitor cells comprising culturing human adult hepatocytes in a reprogramming medium composition of human adult hepatocytes to hepatic progenitor cells comprising HGF, A83-01 and CHIR99021.
  • the present invention is chemically induced in human primary hepatocytes by the addition of hepatocyte growth factor (HGF), ALK inhibitor A83-01 (A), and GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 inhibitor, CHIR99021 (C). It is characterized in that it provides a method for stably inducing into hepatic progenitor cells (CdH).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • A83-01 A
  • GSK Glycogen Synthase Kinase 3 inhibitor
  • hepatic progenitor cells In the step of isolating human primary hepatocytes, homogenous polygonal cells appear and grow rapidly for several days after treatment of human primary hepatocytes with two different chemical agents, while coexisting primary hepatocytes die. These chemically derived cells express genes of the liver and bile duct epithelial lineage and are stained with hepatic progenitor specific markers. According to one embodiment of the present invention, hepatic progenitor cells have an expression of hepatic progenitor specific markers including albumin, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1 ⁇ , CK19, CD44 and CD90 compared to human adult hepatocytes. Increased more than 1.5-fold.
  • CdH hepatic progenitor cells
  • CdH Hepatic progenitor cells derived from chemicals from the human liver can differentiate into hepatocytes and bile epithelial cells, suggesting the properties of bipotent hepatic stem cells. Even after the 10th passage, CdH does not lose growth pattern and hepatic progenitor phenotype. CdH also engrafts and functions for several weeks in immunosuppressive mouse models after transplantation via the splenic pathway. Thus, CdH induction techniques can be used as therapeutics in the field of liver regenerative medicine.
  • the reprogramming medium composition to hepatic progenitor cells using human adult hepatocytes includes HGF, A83-01 and CHIR99021, and HGF may be included at a concentration of 2 to 100 ng / mL for the human adult hepatocyte reprogramming medium composition. have. If the content is more than 100 ng / mL affects apoptosis, if the content is less than 2 ng / mL, hepatic progenitor cells are not produced.
  • the A83-01 is known as an ALK inhibitor which is an inhibitor of TGF-beta signaling, and may be included at a concentration of 0.4 to 4 ⁇ M with respect to the human adult hepatocyte reprogramming medium composition. Sandpaper death was induced when the content was above 4 ⁇ M, and when the content was below 0.4 ⁇ M, the production of hepatic progenitor cells was weak.
  • the CHIR99021 is known as a small molecule inhibitor of GSK (Glycogen Synthase Kinase) -3, and may be included at a concentration of 0.3 to 3 ⁇ M with respect to human adult hepatocyte reprogramming medium composition. When the content exceeds 3 ⁇ M, cell death is induced, and when the content is less than 0.3 ⁇ M, the production of hepatic progenitor cells is weak.
  • GSK Glycogen Synthase Kinase
  • the HGF, A83-01 and CHIR99021 can be added to the hepatocyte reprogramming medium.
  • the media composition of the present invention may comprise hepatocyte reprogramming medium and growth medium.
  • the hepatocyte reprogramming medium may include all of the medium commonly used in the art as well as somatic cell culture as well as stem cell and progenitor cell culture.
  • the medium used for culturing generally contains a carbon source, a nitrogen source and a trace element component.
  • 0.1 ⁇ M dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 1% INS (insulin-transferrin-selenium) premix, and DMEM / F-12 medium supplemented with penicillin / streptomycin / glutamine were used.
  • Elements necessary for the cultivation may include without limitation.
  • Human adult hepatocytes in the reprogramming medium composition of human adult hepatocytes into hepatic progenitor cells of the present invention may be cultured for 3 to 14 days to be induced into hepatic progenitor cells. If it is out of the above range, the production of hepatic progenitor cells may not be possible.
  • INS insulin-transferrin-selenium
  • hepatic progenitor cells induced from human adult hepatocytes have increased expression of hepatic progenitor specific markers compared to human adult hepatocytes, and hepatocytes and bile epithelial cells. It is a novel cell with differentiating stem cell characteristics.
  • the present invention is derived from human adult hepatocytes, the expression of hepatic progenitor specific markers including albumin, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1 ⁇ , CK19, CD44 and CD90 is 1.5 compared to human adult hepatocytes. It provides hepatic progenitor cells that are more than doubled and have bipotent stem cell properties that differentiate into hepatocytes and bile epithelial cells.
  • the hepatic progenitor cells can be used as therapeutic agents for liver disease in that they can be provided as a source of hepatic progenitors for liver regeneration due to the differentiation of stem cell characteristics.
  • the present invention provides a composition for treating liver disease comprising the hepatic progenitor cells.
  • the liver disease treatment composition may be a cell therapy.
  • liver diseases include, but are not limited to, chronic hepatitis, liver cirrhosis, metabolic liver disease, liver cancer, or congenital hereditary liver disease.
  • composition for treating liver disease of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the pharmaceutical arts, and in particular, ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, Various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g., protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, hydrogen carbonate, sodium chloride and zinc salts) Silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulosic substrates, polyethylene glycols, sodium carboxymethylcellulose, polyarylates, waxes, polyethylene glycols or wool, and the like.
  • composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.
  • the composition according to the invention may be prepared in an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffered solution such as Hanks' solution, Ringer's solution or physically buffered saline. Can be used.
  • Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
  • compositions of the present invention may be administered systemically or topically and may be formulated in suitable formulations by known techniques for such administration.
  • oral administration it can be administered by mixing with an inert diluent or an edible carrier, sealed in hard or soft gelatin capsules, or pressed into tablets.
  • the active compounds can be mixed with excipients and used in the form of intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like.
  • formulations such as for injection and parenteral administration, can be prepared and administered according to techniques known in the art or commonly used techniques.
  • the solution may be formulated into a saline solution or a buffer immediately before administration in a form suitable for intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
  • Suitable dosages of the compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. have. For example, at least about 10 4 to 10 6 and typically 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 hepatic progenitor cells may be injected intravenously or intraperitoneally in a 70 kg patient over approximately 60 to 120 minutes.
  • hepatic progenitor cells are at a rate determined by LD-50 (or other toxicity measurement method), depending on the type of cell, and adverse effects, depending on the type of cell at various concentrations.
  • Administration can be administered at one time or in divided portions.
  • the present invention also relates to a method for treating liver disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating liver disease comprising the liver progenitor cells.
  • the subject may be a vertebrate, preferably a mammal, eg, a dog, cat, mouse, human, or the like.
  • treatment means any action that inhibits, alleviates or beneficially alters the clinical situation associated with a disease.
  • treatment may mean increased survival as compared to expected survival if untreated.
  • Treatment includes simultaneously prophylactic measures in addition to therapeutic means.
  • the composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved and, in some cases, whether other agents are used, the age, body weight, general health, sex and diet of the patient. It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including the time of administration, the route of administration and the rate of administration of the composition, the duration of treatment, and the drugs used with or concurrent with the specific composition.
  • the present inventors cultured human primary hepatocytes in various combinations based on the hepatocyte culture medium for direct reprogramming to confirm the reprogramming of hepatocytes. (FIG. 1).
  • the experimental method related to this is as follows.
  • hepatocytes were isolated from informed consent in the liver of normal patients using a two-step collagenase perfusion method (Table 1). Briefly, in step 1 the liver was perfused with Solution A consisting of EDTA as calcium chelating agent at 37 ° C. for 5 minutes. In step 2, the liver was perfused with solution B consisting of trypsin inhibitor and collagenase at 37 ° C. for 8 minutes. The liver was then extracted and chopped off the dish. Primary hepatocytes were washed with Medium E (Gibco, NY, USA) from Williams and treated with 25% Percoll (GE Healthcare, Bucks, UK). Primary hepatocytes thus obtained showed 80-90% viability.
  • Medium E Gibco, NY, USA
  • human primary hepatocytes were treated with 10 mM nicotinamide (Sigma-Aldrich, MO, USA), 1% penicillin / streptomycin (Gibco), 20 ng / mL HGF (Peprotech, NJ, USA). ), In a 37 ° C., CO 2 incubator in DMEM / F-12 (11965, Gibco, CA, USA) with 20 ng / mL EGF (Peprotech) and 4 ⁇ M A83-01 (Gibco) and 3 ⁇ M CHIR99021 (StemCell Technologies). Incubated. The medium was changed daily.
  • mCherry was packaged by co-transfection with psPAX2 lentivirus packaging plasmid and pCMV-VSV-G plasmid in human embryonic kidney (HEK) 293T cells. After 48 and 72 hours the culture supernatant was harvested and stored at -80 ° C. Lenti virus transfection of mCherry was performed in culture medium supplemented with 8 ⁇ g / mL polybrene (Sigma-Aldrich).
  • Oligonucleotide Primer List for Real-Time PCR gene Forward primer sequence (5'-3 ') Reverse primer sequence (5'-3 ') AFP AGACTGCTGCAGCCAAAGTGA GTGGGATCGATGCTGGAGTG SOX9 GAGGAAGTCGGTGAAGAACG ATCGAAGGTCTCGATGTTGG EpCAM GAACAATGATGGGCTTTATG TGAGAATTCAGGTGCTTTTT FOXJ1 CCTGTCGGCCATCTACAAGT AGACAGGTTGTGGCGGATT CD44 CATCTACCCCAGCAACCCTA CTGTCTGTGCTGTCGGTGAT ITGA6 TCGCTGGGATCTTGATGCTTGC TGAGCATGGATCTCAGCCTTGTGA HNF6 AGGGTGCTCTGCCGCTCCCAGG CATGCTGCTAAGCGGAGCGCGGAC HNF1 ⁇ GGGGCCCGCGTCCCAGCAAA GGCCGTGGGCTTTGGAGGGGG CK19 TCCGAACCAAGTTTGAGACG CCCTCAGCGTACTGATTTCC CD90
  • Tissue samples were fixed with paraformaldehyde and glutaraldehyde and then once again with osmium tetraoxide (OsO 4 ). After filling the tissue samples fixed in the resin ultrathin sections were photographed by staining with uranyl acetate and lead citrate.
  • OsO 4 osmium tetraoxide
  • Time-lapse imaging was performed using the JuLi stage system (Nano & Tack). The plate was placed on a microscope and cultured at 5% CO 2 , 37 ° C., and the production of hepatic progenitor cells was taken once every 60 minutes. Data analysis was performed using JuLi stage software v1.0.
  • mCherry fluorescent CdH cells were resuspended in PBS containing 10% FBS and 2 mM EDTA and sorted by FACS Aria III (BD Bioscience) equipped with Turbo Sort for high speed sorting. After sorting, survival was determined by trypan blue, typically at least 90%.
  • Nuclei were counterstained with Hoechst 33342 (1: 10000, Molecular Probes) dissolved in PBS. After incubation with the secondary antibody, the slides were washed with running tap water, dehydrated, cleared and mounted. Samples were imaged with a TCS SP5 confocal microscope (Leica).
  • RNA samples were extracted with Trizol Reagent (Gibco) and provided to LAS, Inc (LAS, Korea) for analysis.
  • mouse Ref-8v3 Sentrix bead chips (Illumina, San Diego, Calif., USA) were used and standardized by quantum standardization methods in all samples.
  • Arrays were scanned using an Illumina Bead Array Reader confocal scanner.
  • Microarray data has been deposited with NCBI Gene Expression Omnibus. Genes were clustered in Cluster 3.0 and heatmaps were generated in Tree View 3.0.
  • CdH was cultured in 4 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 collagen type I coated dishes according to the previously published hepatocyte maturation method for hepatocyte differentiation. After two days incubation in CdH medium, 20ng / mL of oncostatin M (R & D systems) and 10 - 7 mol / L Dex was replaced with hepatocyte induction medium consisting of (Sigma-Aldrich) to give the induction medium between every two days. After 6 days of culture, the medium was replaced with a 1: 7 mixture of matrigel (BD Bioscience) and liver induction medium. On day 8, the mixture was removed by washing with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • a three-dimensional culture system using collagen type I was used according to the manufacturer's instructions. Briefly, 800 ⁇ l collagen type 1, 100 ⁇ l 10 ⁇ PBS, 20 ⁇ l 1N NaOH and 80 ⁇ l H 2 O were mixed on ice. This mixture was mixed with the same volume of 1 ⁇ 10 5 replicated CdH suspended in cholangiocytic differentiation medium (CDM) (DMEM F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 20 ng / mL HGF [BD]). Cell suspensions were transferred to 6-well plates and left at 37 ° C. for 30 minutes. After the gel was formed, CDM was added gently to the gel.
  • CDM cholangiocytic differentiation medium
  • the induced cells were harvested from the top of matrigel gel by dispase and used for periodic acid Schiff (PAS) staining and indocyanine green (ICG) staining.
  • PAS staining was performed using a PAS kit (abcam) for glycogen detection with or without saliva diastatase pretreatment at 37 ° C for 15 minutes.
  • Hematoxylin and eosin (HE) staining was performed using standard procedures.
  • Induced cells were stained with indocyanine green (ICG, Dai-ichi Pharmaceutical) and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After washing the cells with PBS, ICG uptake was observed under a phase contrast microscope.
  • Albumin secretion measurements were performed by Human Albumin ELISA Kit (Bethyl Laboratories). To observe albumin secretion, culture conditioned media was collected every two days for liver induction time. The assay procedure followed the protocol of the Human Albumin ELISA Kit.
  • NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wj1 / SzJ mice were purchased from the Jackson Laboratory and stored under specific pathogen-free conditions according to experimental animal care principles and laboratory animal use guidelines from the Samsung Biomedical Research Institute. CdH and human hepatocytes directly reprogrammed hepatic progenitor cells (1 ⁇ 10 6 cells / 10 ⁇ L) 24 hours after intraperitoneal injection of Jo2 antibody / PBS at 0.1-2.2 mg / kg body weight (BD Pharmingen, CA, USA) was implanted. 100 mg / L ciprofloxacin (CJ Pharma, Korea) was administered to drinking water to prevent infection after spleen transplantation of NSG mice. At termination, mouse liver tissues were immediately fixed in 10% formalin.
  • Quantitative data are expressed as mean ⁇ standard deviation (SD) along with inference statistics (p values). Statistical significance was assessed by a significant two-tailed t-test set to * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • hepatocytes that did not process small molecules changed to fibrous form without proliferation in vitro, and AC conditions (HGF, A83-01).
  • HGF HGF, A83-01
  • hepatocytes cultured in a combination of CHIR99021 proliferated into epithelial form after 7 days.
  • Hepatocytes cultured under AC conditions did not show significant change in growth rate until 3 days, but then showed rapid growth rate.
  • the proliferative capacity for 2 weeks was confirmed to form 22.6 to 26.4 fold and single cell proliferation capacity (FIGS. 2A and 2B).
  • Human hepatocytes were cultured in medium containing YAC to confirm that human hepatocytes were converted to hepatic progenitor cells in the YAC conditions found in mice, and the medium was changed every two days.
  • mice primary hepatocytes were isolated and cultured under AC (+) or AC ( ⁇ ) conditions by two-step collagenase perfusion to determine if mouse hepatocytes could be converted to CdH under AC (+) conditions.
  • primary hepatocytes of mice cultured for 7 days under AC (+) conditions were differentiated into CdH (FIG. 3C).
  • Mouse CdH showed high levels of hepatic progenitor markers as compared to primary hepatocytes (not shown).
  • HGF (+) and AC (+) conditions As a result, the morphology of CdH was observed under HGF (+) and AC (+) conditions (FIG. 3D). However, in the case of HGF (-) condition, the growth rate of CdH was decreased and eventually lost proliferative capacity. Therefore, the combination of HGF and AC seems to play an important role in the conversion of human hepatocytes into hepatic progenitor cells, and HGF appears to be involved in the maintenance and proliferation of hepatic progenitor cells.
  • hepatocellular and bile duct differentiation protocols were used to identify the most important differentiation characteristics of hepatic progenitor cells that can differentiate into hepatocytes and bile duct cells.
  • CdH derived from liver showed typical hepatocytes with bile cannula structure.
  • glycogen storage, indocyanine green uptake and albumin secretion results showed that induced CdH gained the functional properties of hepatocytes.
  • the results of immunostaining showed that expression of hepatocyte specific protein, albumin, HNF4 ⁇ , CK18 and CYP3A4 were expressed in CdH induced hepatocyte differentiation (FIG. 4A).
  • mRNA expression of liver genes such as albumin, HNF1 ⁇ , HNF4 ⁇ , ASGR1, CYP genes related to liver function was significantly higher than mRNA expression of CdH that did not induce hepatocyte differentiation (FIG. 4B).
  • albumin secretion of CdH was little changed, but albumin secretion of hepatocellular differentiated CdH increased gradually (FIG. 5B).
  • hepatocyte differentiated CdH (CdH-Hep) showed a global gene expression pattern that was completely different from that of CdH before differentiation, and the pattern was very similar to hepatocytes extracted from human liver (FIG. 5C).
  • CdH When CdH was cultured in a three-dimensional (3D) type I collagen gel culture system, the cells were differentiated into bile duct cells having a representative branched structure (FIG. 4C), and 9 days after the induction, the bile duct markers CK19, AE2, CK7, and CFTR were identified. 4d). Many CdH-derived cells in the branched structure had functional bile duct cell markers CK19, CK7, AE2 and CFTR observed with human gallbladder (FIG. 4D), and marker gene expression was also increased (FIG. 4E). This suggests that CdH has differentiated into bile duct cell-like cells.
  • 3D three-dimensional
  • CdH In order to confirm that CdH maintains hepatic progenitor properties even in long-term passages, CdH was characterized in 5th and 10th passages, and CdH passages were stable up to at least 15th passage.
  • CdH maintained homogeneous polygonal morphology up to 10 th or more (FIG. 6A).
  • Liver progenitor specific proteins were immunostained after the 10th passage to ensure that CdH was well characterized as liver progenitors even after passage.
  • the expression of hepatic progenitor specific proteins such as OV6, EpCAM, CD44, CD90, AFP and SOX9 was nearly similar in the 1st, 5th and 10th passages (FIG. 6A).
  • CdH NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wj1 / SzJ) was injected to mice (Fig. 8a).
  • CdH NSG NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wj1 / SzJ
  • Fig. 8a mCherry-expressed CdH was engrafted or differentiated into hepatocytes through staining of albumin and Hnf4a proteins.
  • MCherry-expressed CdH was expressed by staining bile duct markers CK19 and CK7 proteins. It was confirmed that the differentiation into bile duct cells (Fig. 8c).
  • the present invention is the first report of chemically reprogrammed human liver progenitor cells (CdH) in a powerful culture system to produce significant amounts of hepatocytes and bile epithelial cells, and upon transplantation of immunodeficient mice to the liver, Can be a valuable source of liver precursors for liver regeneration by acquiring differentiated properties and growth patterns of adult hepatocytes without the occurrence of teratomas.
  • CdH chemically reprogrammed human liver progenitor cells
  • the present invention can be applied to the field of treating liver disease.

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Abstract

본 발명은 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 화학물질의 조합을 통해 인간 성체 간세포로부터 간 전구세포를 유도하는 방법을 제공한다.

Description

인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물
본 발명은 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.
간 이식은 만성 간 질환을 치료할 수 있는 유일한 치료법이다. 재생 의학은 이러한 문제를 극복하기 위한 가장 유용한 획기적인 기술 중 하나이다. 최근에는 환자의 특정 줄기세포가 간 재생 의학의 신뢰할 수 있는 출처로 간주될 수 있다. 줄기세포와 유사한 간세포는 유도만능줄기세포(iPSCs), 직접 리프로그래밍된 세포 및 작은 간세포에서 유래되었지만 만성 간 질환에 대한 확실한 치료 가능성을 보이지는 않는다. 최근에 설치류에서 유래된 화학 물질에 의해 유도된 간 전구세포는 다양한 종류의 간 질환에 대한 세포 치료 및 약물 검사를 개발할 수 있는 잠재적인 원천이 되고 있다.
직교 간 이식(orthotropic liver transplantation)은 말기 간 질환의 치료 옵션 중 하나로 승인되어, 간 이식 수술 결과가 크게 개선되었으며 여러 종류의 말기 간 질환에 대한 표준 치료법으로 인정받고 있다. 1년 동안 수천 건의 간 이식이 있었지만 오랫동안 장기 기증을 기다려야 하고 기증자로부터 신선한 기관이나 간세포를 얻지 못하는 환자가 여전히 많다. 새로운 간세포의 관점에서, 줄기세포연구에서의 최근의 발전은 세포 대체 요법에 대한 유망한 가능성을 보여주었다. 그러나 프라이머리 간세포는 세포 사멸이 쉽고, 시험관내 배양 조건을 다루기가 어려우며, 기능적으로 증식하는 간세포의 배양 조건을 확립하는 것이 간 재생 의학의 필수적인 부분이다.
비록 많은 연구자가 간세포의 대안적인 세포 공급원으로 인간 배아줄기세포(hESCs) 및 유도만능줄기세포(iPSCs)를 보고하였지만, 이러한 세포들은 몇 가지 한계가 존재한다. 말단 분화 세포로부터 직접 변환된 간세포는 최근에 개발된 세포 공급원이며 간세포 특이적인 마커 유전자 및 단백질을 발현한다. 그들은 상대적으로 원시적이고 더 많은 조작이 필요하다. 또한, 많은 연구자가 이러한 문제를 극복하기 위해 간 전구세포/줄기세포를 찾고 있다. 지금까지 여러 연구에서 간세포/줄기세포가 마우스와 랫트에서 유래될 수 있다고 제안했다. 또한, 몇몇 논문은 몇몇 작은 분자의 조합, 특히, Y-27632, A83-01 및 CHIR99021의 조합이 마우스 및 랫트의 간세포에서 간 전구세포/줄기세포로 유도됨을 보여주었으나, 사람 성체 간세포에서는 확립되어 있지 않았다.
본 발명의 목적은 인간 성체 간세포에 여러 가지 화학물질을 첨가하여 간 전구세포로 리프로그래밍하기 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 성체 간세포를 상기 리프로그래밍을 위한 배지 조성물에서 배양하여 간 전구세포로 리프로그래밍하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 리프로그래밍을 통해 유도된 간 전구세포와 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유효량의 상기 간 전구세포를 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 인간 성체 간세포에서 유래하고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 간 전구세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환 치료방법을 제공한다.
본 발명은 인간 성체 간세포에 여러 가지 화학조합물을 첨가하여 간 전구세포로 리프로그래밍하고, 상기 간 전구세포는 간세포와 담즙 상피 세포로 분화될 수 있는 이분화능을 가지고 있어 간 재생을 위한 간 전구체의 공급원으로 제공될 수 있으므로 간질환 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 인간 간세포로부터 화학적으로 파생된 간 전구세포의 제조방법을 도시한 것이다.
도 2a는 세포분화 과정에서 14일 동안 HGF를 포함하며 AC(+) 및 AC(-) 조건에서 배양된 인간 간세포의 형태학적 변화(a)를 나타낸 것이다.
도 2b는 AC(+) 및 AC(-) 조건에서 0일에서 15일 사이의 인간 간세포 성장 곡선(그림에서 A는 A83-01의 약어이고, C는 CHIR99021의 약자임. 스케일 바=500 ㎛ 및 100 ㎛)(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄, 배양배지에 HGF가 첨가되어있음)을 나타낸 것이다.
도 2c는 14일간 AC 조건에서 배양된 인간 간세포의 간 전구 마커의 면역 형광 분석 결과(스케일 바=50 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 2d는 AC(+) 및 AC(-) 조건에서 배양된 인간 간세포에서 간 전구 마커의 상대적 유전자 발현 수준의 정량적 비교 결과(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄)를 나타낸 것이다.
도 2e는 AC 조건에서 배양된 인간 간세포의 핵형 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 9일 동안 HGF를 포함하며 AC 조건에서 배양된 인간 간세포의 저속 촬영 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 화학 물질(Y27632,A83-01, CHIR99021)로 배양한 인간 간세포의 형태학적 변화(그림에서 Y는 Y27632의 약어이고, A는 A83-01의 약어이고, C는 CHIR99021의 약자임. 스케일 바=100 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 3c는 HGF를 포함하며 AC(+) 및 AC(-) 조건에서 배양된 마우스 간세포의 형태학적 변화 (스케일 바=100 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 3d는 HGF(+) 및 HGF(-) 조건에서 AC 또는 A, C 단독 조건의 인간 간세포의 형태학적 변화 (스케일 바=100 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 4a는 CdH의 간세포 및 담관 상피세포로의 이분화성을 나타낸 것으로, CdH의 시험관 (in vitro)내 간 분화(화살표는 담즙 정낭을 나타냄), PAS 염색에 의한 글리코겐 저장 분석, ICG 섭취 분석(스케일 바=100 ㎛), 간세포 분화된 CdH(CdH-Hep)에서 간 표지자의 면역형광분석 결과이다(스케일 바=50 ㎛).
도 4b는 CdH, 간세포 분화된 CdH(CdH-Hep) 및 인간 간세포(hPH)에 대한 간세포 마커의유전자 발현 수준 정량적 비교 결과이다(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄).
도 4c는 CdH의 담관세포 유도 위상차 대비 이미지이다(CdH-Chol).
도 4d는 CdH의 담관세포 분화 시 담관세포 마커의 면역형광분석 결과를 나타낸다.
도 4e는 CdH, 담관세포로 분화된 CdH(CdH-Chol) 및 인간 간세포(hPH)에 대한 담관세포 마커의 상대적 유전자 발현 수준 양적 비교 결과이다.
도 5a는 간세포 분화된 CdH (CdH-Hep)의 투사 전자 현미경 이미지이다.
도 5b는 간세포 유도 중 분비된 알부민 수치의 평가 결과이다.
도 5c는 마이크로어레이를 분석하여 인간 간세포(hPH), CdH 및 간세포 유도된 CdH(CdH-Hep) 간의 간세포 특이 유전자의 발현을 비교한 결과이다.
도 6a는 계대배양 후 CdH의 장기 유지 및 안정된 상태를 보여주는 도면으로, 계대배양에 따른 CdH 형태의 안정적인 유지(스케일 바=100 ㎛) 및 CdH의 간 전구세포 마커의 면역형광분석 결과이다(스케일 바=50 ㎛).
도 6b는 계대배양에 따른 CdH의 간 전구세포 마커의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타낸 것이다(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄).
도 6c는 계대배양에 따라 간세포분화된 CdH(CdH-Hep)의 간세포 마커 단백질의 면역형광분석 결과이다.
도 6d는 간세포 분화된 CdH (CdH-Hep)에서의 간세포 마커 유전자 발현 양상을 CdH와 비교해 나타낸 것이다(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄).
도 7a는 계대배양에 따른 CdH의 성장 곡선을 나타내고(데이터는 평균±표준 편차로 나타냄), 도 7b는 계대배양에 따른 CdH의 핵형 이미지를 나타낸 것이다.
도 8a는 인간 CdH 및 생체 내 세포 이식 분석을 수립하기 위한 실험 절차의 도식도이다.
도 8b는 NOD.Cg-Prkdcscid의 간에서 이식한 CdH의 간세포 분화능을 확인할 수 있는 간세포 마커 단백질에 대한 면역형광분석 결과(Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스에 이식된 CdH는 hALB, HNF4a를 발현하고, mCherry로 표지되어 있어 14일에 함께 확인할 수 있음, 스케일 바=250㎛)이며, (C)는 NOD.Cg-Prkdcscid의 간에서 CdH의 담관세포 분화능을 확인할 수 있는 담관세포 마커 단백질에 대한 면역형광분석결과(Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스에 이식된 CdH는 CK19, CK7을 발현하고 mCherry로 표지되어 있어 14일에 함께 확인할 수 있음, 스케일 바=250㎛)이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법을 제공한다.
본 발명은 간세포 성장 인자인 HGF(Hepatocyte Growth Factor;H), ALK 저해제인 A83-01(A), GSK(Glycogen Synthase Kinase) 3 저해제인 CHIR99021(C)을 첨가하여 인간 프라이머리 간세포에서 화학적으로 유도된 간 전구세포(CdH)로 안정적으로 유도하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법은,
전통적인 2 단계 콜라게나제 관류법을 통해 정상 및 간 질환 환자의 간으로부터 인간 프라이머리 간세포를 분리하는 단계; 및
상기 인간 프라이머리 간세포를 HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 간 전구세포를 유도하는 단계를 포함한다.
상기 인간 프라이머리 간세포를 분리하는 단계의 경우, 인간의 프라이머리 간세포에 두 가지 다른 화학 제제를 처리한 후 며칠 동안 상동의 다각형 세포가 나타나고 빠르게 성장하는 반면 공존하는 인간의 프라이머리 간세포는 죽는다. 이들 화학적 파생 세포는 간 및 담관 상피 혈통 계통의 유전자를 발현하고 간 전구세포 특이 마커로 염색된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 간 전구세포는 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가하였다.
차세대 시퀀싱(NGS) 연구에 따르면 빠르게 성장하는 간전구세포(CdH)는 사람의 간모세포와 유사한 유전자 발현 패턴을 보였다. 인간의 간으로부터 화학물질에 의해 유래된 간 전구세포(CdH)는 간세포와 담즙 상피 세포로 분화할 수 있으므로 이분화성(bipotent) 간줄기세포의 성질이 있음을 시사한다. 10번째 계대배양 후에도, CdH는 성장 패턴과 간 전구성 표현형을 잃지 않는다. CdH는 또한 비장내 경로를 통한 이식 후 면역억제 마우스 모델에서 몇 주간 생착 및 기능을 한다. 따라서, CdH 유도 기술은 간 재생 의학 분야에서 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 인간 성체 간세포를 이용한 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에는 HGF, A83-01 및 CHIR99021이 포함되며 HGF는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 2 내지 100 ng/mL 의 농도로 포함될 수 있다. 상기 함량이 100 ng/mL를 초과하는 경우 세포사멸에 영향을 주고, 상기 함량이 2 ng/mL 미만인 경우, 간 전구세포가 생성되지 않는다.
상기 A83-01는 TGF-beta 신호전달의 저해제인 ALK 저해제로 알려져 있으며, 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.4 내지 4 μM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 함량이 4 μM을 초과하는 경우사포사멸이 유도되고, 상기 함량이 0.4 μM 미만인 경우, 간 전구세포의 생성이 미약하였다.
상기 CHIR99021는 GSK(Glycogen Synthase Kinase)-3의 저분자 저해제로 알려져 있으며, 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.3 내지 3 μM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 함량이 3 μM을 초과하는 경우, 세포사멸이 유도되고, 상기 함량이 0.3 μM 미만인 경우, 간 전구세포의 생성이 미약하다.
상기 HGF, A83-01 및 CHIR99021는 간세포 리프로그래밍 배지에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 간세포 리프로그래밍 배지 및 성장 배지를 포함할 수 있다.
상기 간세포 리프로그래밍 배지는 당해 분야에서 체세포 배양뿐 아니라 줄기세포(stem cell) 및 전구세포(progenitor cell) 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 0.1μM dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 1% ITS(insulin-transferrin-selenium) premix, 및 penicillin/streptomycin/glutamine이 보충된 DMEM/F-12 배지를 사용하였고, 이 외에도 세포의 배양에 있어서 필요한 요소들은 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포는 3 내지 14일 동안 배양되어 간 전구세포로 유도될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 간 전구세포의 생성이 되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 10% FBS, 0.1 μM dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 1% ITS(insulin-transferrin-selenium) premix, penicillin/streptomycin/glutamine, 20 ng/mL의 EGF, 20 ng/mL의 HGF, 4 μM A-83-01 및 3 μM CHIR99021이 보충된 DMEM/F-12 배지에서 3일 내지 14일간 배양할 경우, 간 전구세포로 유도되었고, 간 전구세포의 특성 즉, 간 전구세포 특이적 마커의 발현은 7일부터 증가하기 시작하여 14일 이상 유지되었다.
본 발명의 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포에서 유도된 간 전구세포는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포에 비해 증가하고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성 줄기세포 특성을 가지고 있는 신규한 세포이다.
따라서, 본 발명은 인간 성체 간세포에서 유래되고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 간 전구세포를 제공한다.
상기 간 전구세포는 이분화성 줄기세포 특성으로 인해 간 재생을 위한 간 전구체의 공급원으로 제공될 수 있다는 점에서 간질환 치료제로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물을 제공한다.
상기 간 질환 치료용 조성물은 세포치료제일 수 있다.
이러한 간질환의 예로, 만성간염, 간경화, 대사성 간질환, 간암, 또는 선천성 유전성 간질환 등을 들 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
본 발명의 간질환 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조 및 투여할 수 있다. 예컨대, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 적어도 약 104 내지 106 및 전형적으로 1×108 내지 1×1010개의 간 전구세포를 70kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 간 전구세포를 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번에 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환 치료방법에 관한 것이다.
상기 대상체는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐, 인간 등일 수 있다.
본 발명에서 "치료" 란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한, 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.
본 명세서에서, “유효량”은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 간세포에서 화학물질에 의한 간 전구세포의 유도
본 발명자들은 인간 성체 간세포의 직접적인 리프로그래밍에 관여할 수 있는 소분자의 조합을 조사하기 위해, 직접 리프로그래밍을 위한 간세포 배양 배지를 기초로 다양한 조합으로 인간 프라이머리 간세포를 배양하여 간세포의 리프로그래밍을 확인하였다(도 1). 이와 관련된 실험 방법은 다음과 같다.
(인간 프라이머리 간세포의 분리)
프라이머리 간세포는 2단계 콜라게나제 관류법을 사용하여 정상적인 환자의 간에서 정보에 입각한 동의하에 분리하였다(표 1). 간략하게, 단계 1에서 간은 37℃에서 5분 동안 칼슘 킬레이트제로서 EDTA로 구성된 용액 A로 관류되었다. 2단계에서 간은 37℃에서 8분 동안 트립신 저해제와 콜라게나제로 구성된 용액 B로 관류되었다. 이어서, 간을 추출하고 접시에서 잘게 잘랐다. 프라이머리 간세포를 Williams의 Medium E(Gibco, NY, USA)로 세척하고 25% Percoll(GE Healthcare, Bucks, UK)로 치료하였다. 이렇게 얻어진 프라이머리 간세포는 80-90 %의 생존력을 보였다.
간 기증자의 임상 정보
번호 연령 성별 진단 수술 무게
1 80 여성 간암 우후구역 절제술 4.02g
2 56 남성 간암 좌후구역 절제술 5.95g
3 86 여성 대장암 간 전이 쐐기절제술 0.74g
4 75 남성 간암 복강경 쐐기 1.01g
5 54 여성 간 내 담석 좌외측구역 절제술 0.54g
6 64 남성 지방간 0.7g
7 31 여성 정상 0.71g
(화학적으로 유도된 간 전구세포의 확립)
William의 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 인간 프라이머리 간세포를 10mM 니코틴아마이드(Sigma-Aldrich, MO, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco), 20ng/mL의 HGF(Peprotech, NJ, 미국), 20ng/mL의 EGF(Peprotech) 및 4μM A83-01(Gibco) 및 3μM CHIR99021(StemCell Technologies)가 첨가된 DMEM/F-12(11965, Gibco, CA, USA)에서 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 매일 배지를 교체하였다.
(렌티바이러스 생성)
mCherry는 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포에서 psPAX2 렌티 바이러스 패키징 플라스미드 및 pCMV-VSV-G 플라스미드와의 동시 형질 감염에 의해 패키징 되었다. 48시간 및 72시간 후에 배양 상등액을 수확하고 -80℃에서 보관하였다. mCherry의 렌티 바이러스 형질 도입은 8㎍/mL의 폴리브렌(Sigma-Aldrich)이 보충된 배양 배지에서 수행되었다.
(mRNA 분리 및 RT-PCR 분석)
트리졸 시약(Gibco)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche, PA, USA)로 1㎍의 RNA 샘플을 역전사하고 qPCR PreMix(Dyne bio, Korea) 10㎕, cDNA 1㎕ 및 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 2)를 사용하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection system(Bio-rad, CA, USA)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 반응은 각 유전자에 대해 3반복 분석하였다. PCR 사이클은 95℃에서 20초, 60℃에서 40초의 40사이클로 구성된다. 용융 곡선 및 용융 피크 데이터를 수득하여 PCR 산물을 특성화하였다.
실시간 PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 목록
유전자 정방향 프라이머 서열(5’-3’) 역방향 프라이머 서열(5’-3’)
AFP AGACTGCTGCAGCCAAAGTGA GTGGGATCGATGCTGGAGTG
SOX9 GAGGAAGTCGGTGAAGAACG ATCGAAGGTCTCGATGTTGG
EpCAM GAACAATGATGGGCTTTATG TGAGAATTCAGGTGCTTTTT
FOXJ1 CCTGTCGGCCATCTACAAGT AGACAGGTTGTGGCGGATT
CD44 CATCTACCCCAGCAACCCTA CTGTCTGTGCTGTCGGTGAT
ITGA6 TCGCTGGGATCTTGATGCTTGC TGAGCATGGATCTCAGCCTTGTGA
HNF6 AGGGTGCTCTGCCGCTCCCAGG CATGCTGCTAAGCGGAGCGCGGAC
HNF1β GGGGCCCGCGTCCCAGCAAA GGCCGTGGGCTTTGGAGGGGG
CK19 TCCGAACCAAGTTTGAGACG CCCTCAGCGTACTGATTTCC
CD90 CTAGTGGACCAGAGCCTTCG ACAGGGACATGAAATCCGTG
CK7 GATAAAAGGCGCGGAGTGTC GAAACCGCACCTTGTCGATG
CFTR AGTTGCAGATGAGGTTGGGC AAAGAGCTTCACCCTGTCGG
AE2 GGGGAAAGTTGAGTTGGGAGA CTGGCTCTGGCGTACAGAAA
AQPR1 GGCCAGCGAGTTCAAGAAGAA TCACACCATCAGCCAGGTCAT
Alb CACAGAATCCTTGGRGAACAGG ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA
HNF1α AGAGAGGGGTGTCCCCATCA CTTGTGCCGGAAGGCTTCTT
HNF4α CCAAAACCCTCGTCGACATG GCACATTCTCAAATTCCAGG
ASGR1 CAGCAACTTCACAGCCAGCA AGCTGGGACTCTAGCGACTT
CYP1A2 CGGACAGCACTTCCCTGAGA AGGCAGGTAGCGAAGGATGG
CYP2A6 CAGCACTTCCTGAATGAG AGGTGACTGGGAGGACTTGAGGC
CYP2C9 CTACAGATAGGTATTAAGGACA GCTTCATATCCATGCAGCACCAC
CYP3A4 TTCAGCAAGAAGAACAAGGACAA GGTTGAAGAAGTCCTCCTAAGC
GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG
(주사전자현미경)
조직 샘플을 파라포름알데히드와 글루타알데히드로 고정한 후, 사산화 오스뮴(OsO4)으로 다시 한번 고정하였다. 레진에 고정된 조직샘플을 충전 후 초박절편 하여 아세트산 우라닐과 납시트레이트로 염색하여 사진 촬영하였다.
(시간 경과 이미징)
시간 경과 이미징은 JuLi stage 시스템 (나노앤택)을 사용하여 수행하였다. 세포 배양접시를 현미경에 올린 후 5% CO2, 37℃에서 배양하며 간 전구세포의 생성을 시간 경과에 따라 60분에 한 번씩 사진을 찍었다. 데이터 분석은 JuLi stage 소프트웨어 v1.0을 사용하였다.
(FACS 소팅)
mCherry 형광발현된 CdH 세포를 분리하기 위해, 10% FBS와 2mM EDTA가 포함된 PBS에 재현탁하고 고속 분류를 위해 Turbo Sort가 장착된 FACS AriaⅢ(BD Bioscience)로 분류하였다. 분류 후, 생존률은 트리판 블루에 의해 결정되었고, 전형적으로 90% 이상이었다.
(면역조직화학)
매회 5분 동안 크실렌으로 3회 세척하여 4㎛ 단면을 탈파라핀화 시켰다. CdH를 에탄올로 재수화하고, 마지막으로 증류수로 세척하였다. 세척 후, 슬라이드를 pH 6.0 및 10mM 시트르산 나트륨 완충액에서 오토클레이브하여 항원을 노출시킨 후 회수하였다. 슬라이드를 5분 동안 증류수에서 배양하고 밤새 4℃에서 1차 항체를 첨가한 후 일정습도가 유지되는 챔버에 넣었다. 다음날, 절편을 1% FBS가 보충된 PBS인 염색 용액으로 5분 동안 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 30분 동안 2차 항체와 함께 배양하였다. 항체는 표 3에 나타내었다. 핵을 PBS에 녹인 Hoechst 33342(1:10000, Molecular Probes)로 대조 염색하였다. 2차 항체와 함께 항온 배양한 후, 슬라이드를 흐르는 수돗물로 세척하고, 탈수시키고, 맑게 하고, 장착시켰다. 샘플을 TCS SP5 공초점 현미경(Leica)으로 영상화하였다.
항체 목록
단백질 회사 상품번호
Albumin Abcam ab19194
CK19 Santa Cruz Biotechnology sc-376126
OV-6 Santa Cruz Biotechnology sc-101863
EpCAM Abcam ab32392
CD44 Cell Signaling 5640S
CD90 Abcam ab92574
AFP Abcam ab3980
SOX9 Abcam ab185966
HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-8987
CK18 Abcam ab668
CYP3A4 Santa Cruz Biotechnology sc-27639
AE2 Abcam ab42687
CK7 Abcam ab9021
CFTR Almone Acl006
mCherry Abcam ab167453
(마이크로어레이 분석)
총 RNA 샘플을 트리졸 시약(Gibco)로 추출하고 분석을 위해 LAS, Inc(LAS, Korea)에 제공하였다. 간단히 말하면, 마우스 Ref-8v3 Sentrix 비드 칩(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하고 모든 샘플에서 양자 표준화 방법으로 표준화하였다. Illumina Bead Array Reader 공초점 스캐너를 사용하여 어레이를 스캔하였다. 마이크로어레이 데이터는 NCBI Gene Expression Omnibus에 기탁되어 있다. 유전자는 Cluster 3.0으로 클러스터링 되었으며, 히트맵은 Tree View 3.0으로 생성되었다.
(간 유도)
간세포 분화를 위해 이전에 발표된 논문의 간세포 성숙법에 따라 CdH를 4×105 ~ 5×104 cells/cm2의 콜라겐 타입 I 코팅 접시에서 배양하였다. CdH 배지로 2일간 배양한 후, 20ng/mL의 oncostatin M(R&D systems) 및 10- 7 mol/L Dex(Sigma-Aldrich)로 구성된 간세포 유도 배지로 교체하였고 간 유도 배지를 2일마다 제공하였다. 6일 배양 후, 배지를 matrigel(BD Bioscience)과 간 유도 배지의 1:7 혼합물로 교체하였다. 8일째, Hank 's Balanced Salt Solution(HBSS)로 세척하여 혼합물을 제거하였다.
(담관세포 유도)
담관세포의 생성을 위해서는 콜라겐 타입 I(BD)을 이용한 3차원 배양 시스템을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 간단히 말해서, 800㎕의 콜라겐 타입 1, 100㎕의 10×PBS, 20㎕의 1N NaOH 및 80㎕의 H2O를 얼음 위에 혼합하였다. 이 혼합물을 cholangiocytic differentiation medium(CDM)(10% 태아소혈청, 20ng/mL의 HGF[BD]가 보충된 DMEM F-12 배지)에 현탁된 동일한 부피의 1×105 복제된 CdH와 혼합하였다. 세포 현탁액을 6-웰 플레이트로 옮기고 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 겔이 형성된 후, CDM을 겔에 부드럽게 첨가하였다.
(Periodic Acid Schiff(PAS) 염색 및 인도시아닌 그린)
유도된 세포를 디스파제(dispase)에 의해 matrigel gel의 꼭대기에서 수확한 후 PAS(periodic acid Schiff) 염색, indocyanine green(ICG) 염색에 사용하였다. PAS kit(abcam)를 사용하여 37℃에서 15분간 타액 디아스타제 전처리 유무와 상관없이 글리코겐 검출을 위해 PAS 염색을 시행하였다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색은 표준 절차를 사용하여 수행하였다. 유도된 세포에 indocyanine green(ICG, Dai-ichi Pharmaceutical) 염색을 시행하고 37℃에서 15분간 배양하였다. 세포를 PBS로 세정한 후, ICG 섭취를 위상차 현미경으로 관찰하였다.
(Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA))
알부민 분비 측정은 Human Albumin ELISA Kit(Bethyl Laboratories)에 의해 수행되었다. 알부민 분비능을 관찰하기 위해, 배양 컨디션드 배지를 2일마다 간 유도시간 동안 수집하였다. 검정 절차는 Human Albumin ELISA Kit의 프로토콜을 따랐다.
(핵형분석)
간 전구세포 (CdH)의 핵형분석은 이원의료재단에서 수행하였다.
(실험동물 모델)
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여 실험 동물 관리 원칙 및 삼성 생명 의학 연구소의 실험실 동물 사용 안내서에 따라 특정 병원균이 없는 조건으로 보관하였다. 0.1-2.2 mg/kg 체중의 Jo2 항체/PBS(BD Pharmingen, CA, USA)를 복강 내 주사한 후 24시간 후에 CdH 및 인간 간세포 직접 재 프로그램된 간 전구세포(1×106 세포/10㎕)를 이식하였다. NSG 마우스의 비장 이식 후 감염을 예방하기 위해 음용수에 100mg/L 시프로플록사신(CJ Pharma, Korea)을 투여받았다. 종료 시, 마우스 간 조직을 10% 포르말린에 즉시 고정하였다.
(통계 분석)
정량적 데이터는 추론 통계치(p 값)와 함께 평균±표준 편차(SD)로 표시된다. 통계적 유의성은 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 설정한 유의미한 양측 t- 검정으로 평가하였다.
<실험예 1> 소분자에 의한 간 전구세포 생성
상기와 같이, 인간 성체 간세포의 직접적인 리프로그래밍에 관여할 수 있는 소분자의 조합을 조사한 결과, 소분자를 처리하지 않은 간세포는 인 비트로에서 증식하지 않고 섬유 형태로 변하였고, AC 조건(HGF, A83-01 및 CHIR99021의 조합)에서 배양된 간세포는 7일 후에 상피 형태로 증식하였다. AC 조건에서 배양된 간세포는 3일까지 성장 속도에 유의한 변화를 보이지 않았으나 이후 빠른 성장 속도를 보였다. 2주 동안 증식능력은 22.6 내지 26.4배와 단일세포 증식능력을 형성함을 확인하였다(도 2a 및 2b).
CdH의 단백질 수준에서 간 전구세포의 특성을 조사하기 위해, 면역세포화학법을 실시하여 다양한 간전구 마커의 양을 시각화하였다. 이미지는 알부민, CK19, OV-6, EpCAM, CD44, CD90, AFP 및 SOX9와 같은 다양한 전구 마커가 안정적으로 발현되었음을 보였다(도 2c). 이러한 결과는 인간 간세포가 다시 전구세포로 리프로그래밍되어 변하는 것을 의미한다.
qRT-PCR에 의한 간세포로부터 CdH로의 전환 시점을 확인한 결과, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90의 발현이 7-14일에서 상승되는 것을 발견하였다(도 2d). 따라서 인간 간세포는 AC 조건하에서 7일에서 14 일간 배양하였을 때 CdH로 분화되었고 CdH의 간 전구세포의 특성은 7일부터 나타나기 시작하여 14일까지 유지되었다.
또한, 분석된 20개의 중기 세포에서 클론성 염색체 이상은 관찰되지 않았고 모두 정상 핵형을 보였다(도 2e).
9일 동안 AC 조건에서 배양된 인간 간세포를 저속 촬영한 결과, AC 조건 하에서 배양된 간세포는 3일 후에 급격한 증식을 보였다(도 3a).
인간 간세포가 마우스에서 발견된 YAC 조건에서 간 전구세포로 전환되었는지를 확인하기 위해 YAC를 함유한 배지에서 인간 간세포를 배양하고, 2일마다 배지를 교체하였다.
그 결과, YAC 조건하에서 9일 동안 배양된 인간 간세포는 CdH로 형성되지 않고 섬유화되어 사멸되었다(도 3b).
또한, 반대로 마우스 간세포가 AC(+) 조건에서 CdH로 변할 수 있는지를 확인하기 위해 2단계 콜라게나제 관류법으로 마우스 프라이머리 간세포를 분리하고 AC(+) 또는 AC(-) 조건하에서 배양하였다. 그 결과, AC(+) 조건하에서 7일간 배양한 마우스의 프라이머리 간세포는 CdH로 분화됨을 확인하였다(도 3c). 마우스 CdH는 프라이머리 간세포와 비교하여 높은 수준의 간 전구 마커를 나타냈다(미도시됨).
인간 간세포에서 CdH로의 전환은 AC(+) 조건하에서 발생하였지만, YAC 조건 하에서는 일어나지 않았다. 따라서 인간 간세포가 CdH로 전환될 때 주요 인자를 결정하기 위해 인간 간세포와 함께 YAC 배양 조건을 달리하여 조사하였다.
그 결과, HGF(+), AC(+) 조건하에서 CdH의 형태가 관찰되었다(도 3d). 그러나 HGF(-) 조건인 경우에는 CdH의 성장 속도가 감소하여 결국 증식능을 상실하게 되었다. 따라서 HGF와 AC의 조합은 인간 간세포의 간 전구세포로의 전환에 중요한 역할을 하는 것으로 보이며 HGF는 간 전구세포의 유지 및 증식에 관여하는 것으로 보인다.
<실험예 2> CdH의 간세포 및 담관 상피로의 이분화성 분화
간세포와 담관세포로 분화할 수 있는 간 전구세포의 가장 중요한 이분화 특징을 확인하기 위해 이전에 보고된 간세포와 담관세포 분화 프로토콜을 사용하였다.
간에서 유도된 CdH는 담즙 캐뉼러 구조를 갖는 전형적인 간세포를 보였다. 또한, 글리코겐 저장, 인도시아닌 녹색 흡수 및 알부민 분비 결과는 유도된 CdH가 간세포의 기능적 특성을 획득하였음을 보여 주었다. 또한, 면역 염색의 결과는 간세포 특이적 단백질, 알부민, HNF4α, CK18 및 CYP3A4의 발현이 CdH 유도된 간세포 분화에서 발현되었음을 보여준다(도 4a). 또한, 간 기능에 관련된 알부민, HNF1α, HNF4α, ASGR1, CYP 유전자와 같은 간 유전자의 mRNA 발현은 간세포 분화를 유도하지 않은 CdH의 mRNA 발현보다 유의하게 높았다(도 4b).
또한, 간세포 유도 중 분비된 알부민의 수치 평가 결과, CdH의 알부민 분비의 변화가 거의 없었으나 간세포 분화된 CdH의 알부민 분비는 서서히 증가하였다(도 5b).
마이크로어레이 분석 결과, 간세포 분화된 CdH (CdH-Hep)은 분화전인 CdH와는 완전히 다른 글로벌 유전자 발현 패턴을 보였으며, 그 패턴은 사람의 간에서 분리 추출한 간세포와 매우 유사하였다(도 5c).
CdH를 3차원(3D) 타입 I 콜라겐 젤 배양 시스템에서 배양했을 때 대표적인 분지 구조를 가진 담관세포로 분화하고 (도 4c) 유도 9일 후에 담관세포 마커인 CK19, AE2, CK7, CFTR를 확인하였다(도 4d). 분지 구조에서 많은 CdH-유래 세포는 기능적 담관세포 마커 CK19, CK7, AE2 및 CFTR가 인간 담낭과 더불어 관찰되었으며(도 4d), 마커 유전자 발현도 증가하였다(도 4e). 이것은 CdH가 담관세포 유사 세포로 분화되었다는 것을 시사하는 것이다.
<실험예 3> 계대배양 후 CdH의 장기 유지 및 안정한 상태
CdH가 장기간의 계대배양에서도 간 전구성 특성을 유지하는지 확인하기 위해 5번째 및 10번째 계대배양에서 CdH의 특성을 확인하였고, CdH의 계대배양은 적어도 15 번째 계대배양 까지도 안정적이었다.
형태학적으로, CdH는 동질의 다각형 형태를 10번째 이상까지 유지하였다(도 6a).
계대배양 후에도 CdH가 간 전구세포로서 잘 특징지어졌는지 확인하기 위해 10번째 계대배양 후 간 전구세포 특이적 단백질을 면역염색하였다. OV6, EpCAM, CD44, CD90, AFP 및 SOX9와 같은 간 전구세포 특이적 단백질의 발현은 1, 5 및 10번째 계대배양에서 거의 유사하였다(도 6a).
간 전구성 유전자인 EpCAM, FOXJ1, ITGA6, HNF1β, CD44 및 CD90의 발현을 qRT-PCR 분석을 통해 비교하여 장기간 계대배양에서 mRNA 수준에서 간 전구성 유전자의 발현을 확인하였다. 결과적으로, 10번째 계대배양 후에도 전구성 마커가 일관되게 발현된다는 것이 확인되었다(도 6b).
또한, CdHs의 증식 능력은 계대배양 후 거의 비슷한 속도였고 계대배양이 지나갈수록 더 빨리 성장하였다(도 7a).
CdH의 염색체 결함 상태를 알아보기 위해 1, 5, 10번째 계대배양의 20개의 중기 세포의 핵형 분석을 수행하였다. 1, 5, 10번째 계대배양의 20개의 중기 세포에서 클론형성능이 있는 염색체 이상은 관찰되지 않았고 모두 정상 핵형을 보였다(도 7b). 이러한 결과는 CdH가 안정적으로 염색체 전좌로의 변형 없이 전파된다는 것을 의미한다.
다음으로, CdH가 장기적인 계대배양에서 간세포 분화능을 안정적으로 가지고 있는지를 조사한 결과, 5, 10번째 계대배양한 CdH가 간세포로 안정적으로 분화되었음을 확인하였다(도 6c). 간세포 특이적 단백질인 알부민, HNF4α, CK18 및 CYP3A4는 단백질 수준에서 CdH 유도 간세포에서 잘 발현되었으며, 이 결과는 간세포 분화능이 장기간의 계대배양에서 잘 유지된다는 것을 보여 주는 것이다(도 6c). 계대배양에 따라 간 기능과 관련된 다양한 유전자의 mRNA 발현 수준이 변동되었으나 간세포 분화능을 유지함으로써 이들 유전자의 발현이 증가하고 P450 관련 유전자가 계대배양으로 증가하는 것으로 나타났다(도 6d). 이러한 결과는 CdH가 안정적으로 계대배양되어 장기간에 걸쳐 간세포로 분화하는 능력을 갖추고 있음을 시사한다.
<실험예 4> 생체 내 이식 및 CdH의 생착
CdH를 Jo2 항체가 처리된 NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ) 마우스에 주사하였다(도 8a). CdH가 이식된 NSG 마우스의 간은 albumin과 Hnf4a 단백질의 염색을 통하여 mCherry 발현된 CdH가 간세포로 생착 또는 분화됨을 확인하였으며(도 8b), 담관세포 표지자 CK19, CK7 단백질의 염색을 통하여 mCherry 발현된 CdH가 담관세포로도 분화됨을 확인하였다(도 8c).
상기 결과로부터, 현재 주요 문제점으로 남아있는 공여자 부족 및 프라이머리 간세포의 증식 능력 부족으로 인한 간세포 공급 부족이 자가 재생 능력을 갖춘 간줄기세포인 CdH에 의해 해결될 수 있음을 시사할 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상당량의 간세포 및 담즙 상피 세포를 생성하기 위한 강력한 배양 시스템의 화학적으로 리프로그래밍된 인간 간 전구세포 (CdH)의 최초 보고이며, 면역결핍 마우스의 간으로의 이식 시, CdH는 테라토마의 발생 없이 성체 간세포의 분화된 성질 및 성장 패턴을 획득하여 간 재생을 위한 간 전구체의 귀중한 공급원이 될 수 있다.
본 발명은 간질환 치료 분야에 적용할 수 있다.

Claims (12)

  1. HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    간 전구세포는 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 것인, 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물.
  3. HGF, A83-01 및 CHIR99021를 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에서 인간 성체 간세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    HGF는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 2 내지 100 ng/mL의 농도로 포함되는, 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    A83-01는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.4 내지 4 μM 의 농도로 포함되는, 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    CHIR99021는 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물에 대해 0.3 내지 3 μM 의 농도로 포함되는, 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    인간 성체 간세포는 3 내지 14일 동안 배양하는, 방법.
  8. 인간 성체 간세포에서 유래하고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 간 전구세포.
  9. 제8항의 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    간질환은 만성간염, 간경화, 대사성 간질환, 간암 또는 선천성 유전성 간질환 중 어느 하나인, 간질환 치료용 조성물.
  11. 간 전구세포를 포함하는 간질환 치료용 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 간 전구세포는 인간 성체 간세포에서 유래하고, 알부민, AFP, SOX9, ITGA6, HNF6, EpCAM, FOXJ1, HNF1β, CK19, CD44 및 CD90를 포함하는 간 전구세포 특이적 마커의 발현이 인간 성체 간세포 대비 1.5배 이상 증가되고, 간세포 및 담즙 상피 세포로 분화하는 이분화성(bipotent) 줄기세포 특성을 갖는 것인, 간질환 치료방법.
  12. 제11항에 있어서,
    간질환은 만성간염, 간경화, 대사성 간질환, 간암 또는 선천성 유전성 간질환 중 어느 하나인, 간질환 치료방법.
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