KR20220021883A - 체외에서 유전자 교정된 세포 및 이의 용도 - Google Patents
체외에서 유전자 교정된 세포 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220021883A KR20220021883A KR1020210107462A KR20210107462A KR20220021883A KR 20220021883 A KR20220021883 A KR 20220021883A KR 1020210107462 A KR1020210107462 A KR 1020210107462A KR 20210107462 A KR20210107462 A KR 20210107462A KR 20220021883 A KR20220021883 A KR 20220021883A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell
- gene
- cells
- mcdhs
- corrected
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 163
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims abstract description 21
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 201000011296 tyrosinemia Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000032001 Tyrosinemia type 1 Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 11
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 11
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 102100034279 Calcium-binding mitochondrial carrier protein Aralar2 Human genes 0.000 claims description 7
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 7
- 102100029115 Fumarylacetoacetase Human genes 0.000 claims description 7
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 claims description 6
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 claims description 6
- 102100032360 Alstrom syndrome protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022272 Fructose-bisphosphate aldolase B Human genes 0.000 claims description 6
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 101000797795 Homo sapiens Alstrom syndrome protein 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000755933 Homo sapiens Fructose-bisphosphate aldolase B Proteins 0.000 claims description 6
- 101000955481 Homo sapiens Phosphatidylcholine translocator ABCB4 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100039032 Phosphatidylcholine translocator ABCB4 Human genes 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 208000031045 adult-onset type II citrullinemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000025812 citrin deficiency Diseases 0.000 claims description 6
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100027591 Copper-transporting ATPase 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000936280 Homo sapiens Copper-transporting ATPase 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010022687 fumarylacetoacetase Proteins 0.000 claims description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 102000012437 Copper-Transporting ATPases Human genes 0.000 claims description 4
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 claims description 4
- 208000033981 Hereditary haemochromatosis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 102100028734 1,4-alpha-glucan-branching enzyme Human genes 0.000 claims description 3
- 206010068783 Alstroem syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005932 Alstrom Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 108700036689 Calcium-binding mitochondrial carrier protein Aralar2 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010072104 Fructose intolerance Diseases 0.000 claims description 3
- 206010053249 Glycogen Storage Disease Type IV Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011123 Glycogen storage disease due to glycogen branching enzyme deficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019878 Hereditary fructose intolerance Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012619 Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 Diseases 0.000 claims description 3
- 108091006418 SLC25A13 Proteins 0.000 claims description 3
- 201000003554 argininosuccinic aciduria Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024042 cholesterol ester storage disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013760 cholesteryl ester storage disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001024 intrahepatic cholestasis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010457 gene scissor Methods 0.000 claims 1
- 108700005579 progressive familial intrahepatic 3 Cholestasis Proteins 0.000 claims 1
- 201000002148 progressive familial intrahepatic cholestasis 3 Diseases 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 66
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 101150094145 FAH gene Proteins 0.000 description 22
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 14
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 12
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- OUBCNLGXQFSTLU-UHFFFAOYSA-N nitisinone Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O OUBCNLGXQFSTLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960001721 nitisinone Drugs 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 9
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 9
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010052875 Adenine deaminase Proteins 0.000 description 7
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 7
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 7
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 7
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 6
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 5
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 5
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 5
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 5
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010082610 Deoxyribonuclease (Pyrimidine Dimer) Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037595 EN1-related dorsoventral syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102100037696 Endonuclease V Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 101000637245 Escherichia coli (strain K12) Endonuclease V Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101150023976 Krt19 gene Proteins 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 2
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNXIKVLOVZVMQF-UHFFFAOYSA-N (3beta,16beta,17alpha,18beta,20alpha)-17-hydroxy-11-methoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]-yohimban-16-carboxylic acid, methyl ester Natural products C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(C(=O)OC)C(O)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 DNXIKVLOVZVMQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101150075175 Asgr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238017 Astacoidea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101150117450 CYP1A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101150040913 DUT gene Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000983292 Homo sapiens N-fatty-acyl-amino acid synthase/hydrolase PM20D1 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 101150078927 KRT18 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100260702 Mus musculus Tinagl1 gene Proteins 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026873 N-fatty-acyl-amino acid synthase/hydrolase PM20D1 Human genes 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 101150074224 Onecut1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- LCQMZZCPPSWADO-UHFFFAOYSA-N Reserpilin Natural products COC(=O)C1COCC2CN3CCc4c([nH]c5cc(OC)c(OC)cc45)C3CC12 LCQMZZCPPSWADO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-SFWBKIHZSA-N Reserpine Natural products O=C(OC)[C@@H]1[C@H](OC)[C@H](OC(=O)c2cc(OC)c(OC)c(OC)c2)C[C@H]2[C@@H]1C[C@H]1N(C2)CCc2c3c([nH]c12)cc(OC)cc3 QEVHRUUCFGRFIF-SFWBKIHZSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 206010043395 Thalassaemia sickle cell Diseases 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 101150055123 afp gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150088826 arg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000025341 autosomal recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 108010084210 citrin Proteins 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000003459 common hepatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940111205 diastase Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 etc. Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002989 hepatic vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 231100000405 induce cancer Toxicity 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- BJOIZNZVOZKDIG-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C([C]5C=CC(OC)=CC5=N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 BJOIZNZVOZKDIG-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 229960003147 reserpine Drugs 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- MDMGHDFNKNZPAU-UHFFFAOYSA-N roserpine Natural products C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(OC(C)=O)C(OC)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 MDMGHDFNKNZPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 201000007972 tyrosinemia type I Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/407—Liver; Hepatocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/14—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 유전자 결함이 교정된 세포의 제조방법 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 개체에서 세포를 단리한 다음, 화합물을 처리하여 화학유래 선조세포를 제조한 다음, 체외(ex vivo)에서 돌연변이 유전자를 교정하는 방법을 포함하는 세포의 제조방법 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 세포치료제는 오프타겟 효과 및 종양생성 등의 부작용이 현저하게 적고, 단순한 세포를 이식하는 경우 보다 유의한 수준의 티로신 혈증 1형의 치료효과를 보여주었으므로, 티로신 혈증 1형을 비롯한 유전자 돌연변이에 의해 발생된 질환의 치료분야에 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 세포치료제는 오프타겟 효과 및 종양생성 등의 부작용이 현저하게 적고, 단순한 세포를 이식하는 경우 보다 유의한 수준의 티로신 혈증 1형의 치료효과를 보여주었으므로, 티로신 혈증 1형을 비롯한 유전자 돌연변이에 의해 발생된 질환의 치료분야에 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 유전자 결함이 교정된 세포의 제조방법 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 개체에서 세포를 단리한 다음, 화합물을 처리하여 화학유래 선조세포를 제조한 다음, 체외(ex vivo)에서 돌연변이 유전자를 교정하는 방법을 포함하는 세포의 제조방법 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
유전자 돌연변이는 세포가 분열하면서 유전자의 복제와 분열이 일어나는 과정에서 유전자를 구성하는 DNA의 구조적인 변화가 생김으로써 발생하는 것으로, 그 원인은 고령임신, 방사선, 흡연, 항암제, 독성 화학물질, 중금속 등으로 다양하며, 한 개 유전자 이상에 의한 질환은 수천가지가 있으나, 대부분 질환으로 나타나는 경우는 드물고 흔한 질환으로는 혈우병, 낭포성 섬유증, 겸상적혈구 빈혈, 지중해 빈혈 등이 있다. 유전자 변이는 약 100명당 1명꼴로 발생한다. 몇몇의 유전자 이상은 태어나자마자, 또는 수개월 이내에 알 수 있는 반면에, 헌팅턴병 같은 질환은 한 개 유전자에 의한 것으로 성인이 된 후에 발생한다.
희귀질환 중 하나인 티로신혈증 1형(Tyrosinemia type 1, TH1)은 푸마릴아세토아세타아제(FAH)의 결핍에 의해 야기되는 상염색체 열성 질환 중 하나로서, 티로신 대사 경로에서 유래하는 독성 대사산물의 축적으로 인한 간 부전(liver failure)을 초래하며, 간세포 암종(HCC)으로 이어질 수 있음이 알려져 있다.
현재 상기 티로신혈증을 치료하기 위하여 2-[2-nitro-4-triuoromethylbenzoyl]-1,3-cyclohexane- dione(NTBC)이 사용되고 있으나, 이는 근본적인 치료방법이 아니고, 일부 환자의 경우 NTBC 민감성이 결여되어 있으며, 치료요법 동안에도 간세포 암종이 발생할 위험성이 여전히 존재한다.
상기와 같은 기존치료의 문제점을 극복하기 위하여, 비-바이러스성 전달 시스템을 이용하여 아데닌 염기 편집장치(Adenine base editors, 이하 ABEs)를 유체역학적 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하여 Fah 유전자 돌연변이의 성공적인 교정을 이루어냈지만(Nature Biomedical Engineering volume 4, pages125-130 (2020)), 이러한 in vivo 치료전략의 경우, 표적이 아닌 세포에 작용하는 CRISPR 매개 유전자 교정효과를 조절할 수 없기에, 기존과 같은 유전자 교정을 통한 치료 전략은 한계가 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
(a)개체로부터 세포를 단리하는 단계;
(b)상기 단리된 세포에 화합물을 처리하여 화학유래 선조세포(chemically derived projenitor cell)를 제조하는 단계; 및
(c)체외(ex vivo)에서 상기 화학유래 선조세포의 타겟 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 돌연변이 유전자가 교정된 세포의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돌연변이 유전자가 교정된 세포 또는 그의 세포집단을 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 포함하는, 유전자 돌연변이 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
(a)개체로부터 세포를 단리하는 단계;
(b)상기 단리된 세포에 화합물을 처리하여 화학유래 선조세포(chemically derived projenitor cell)를 제조하는 단계; 및
(c)체외(ex vivo)에서 상기 화학유래 선조세포의 타겟 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 돌연변이 유전자가 교정된 세포의 제조방법을 제공하는 것을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자를 교정하는 단계는 아데닌 염기교정 유전자가위(Adenine Base Editors) 또는 프라임 편집(Prime editing)에 의해 교정되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 교정되는 유전자는 Fah(fumarylacetoacetate hydrolase), ATP7B(ATPase copper transporting beta), SERPINA1(Serpin family A member 1), ABCB4(ATP binding cassette subfamily B member 4), ALDOB(aldolase, fructose-bisphosphate B), GBE(glycogen branching enzyme), SLC25A13(Solute Carrier Family 25 Member 13), CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance) 및 ALMS1(ALMS1 Centrosome And Basal Body Associated Protein)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 단리된 세포는 일차 간세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 단리된 세포에 처리하는 화합물은 간세포 성장 인자(hepatic growth factor), A83-01 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 화학유래 선조세포(chemically derived projenitor cell)는 화학유래 간선조 세포(chemically derived hepatic projenitor cell)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돌연변이 유전자가 교정된 세포 또는 그의 세포집단을 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포치료제는 유전자 돌연변이로 인해 유발된 질환을 치료하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 포함하는, 유전자 돌연변이 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 돌연변이 관련 질환은 티로신혈증 1형(Tyrosinemia type 1), 페닐케톤뇨증(Phenylketonuria), 윌슨병(Wilson disease), 알파-1 항트립신 결핍증(Alpha-1 antitrypsin deficiency), 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형(Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3), 유전성 과당 불내증(Hereditary fructose intolerance), 글리코겐 축적 질환 4형(Glycogen storage disease type IV), 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍증(Argininosuccinate lyase deficiency), 시트린 결핍증(Citrin deficiency), 시트린 결핍에 의한 신생아 담증정체(Neonatal intrahepatic cholestasis by citrin deficiency), 콜레스테롤 에스테르 축적병(Cholesteryl ester storage disease), 낭포성 섬유증(Cystic fibrosis), 유전성 혈색소 침착증(Hereditary hemochromatosis) 및 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 돌연변이 유전자가 교정된 세포를 포함하는 세포치료제를 사용하는 경우, 기존의 일차 간세포를 이식하는 경우 보다 오프타겟 효과 및 종양생성 등의 부작용이 적음을 확인하였고, 유의한 수준의 티로신 혈증 1형의 치료효과를 보여주었으므로, 티로신 혈증 1형을 비롯한 유전자 돌연변이에 의해 발생된 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1a는 HT1 마우스로부터 간세포를 단리하여 화학적으로 유도된 간선조세포(HT1-mCdHs)를 제조하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 분리된 1차 간세포에 면역형광염색을 수행한 결과이다.
도 1c는 HT1-CdHs에 RT-qPCR을 수행하여, 유전자 마커의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 1d는 HT1-CdHs에 면역형광염색을 수행한 결과이다.
도 1e는 일반적인 유전자 및 세포주기와 관련된 유전자의 발현 프로파일을 나타낸 것이다.
도 1f는 HT1-CdHs 세포에서 세포주기 및 줄기 모듈 특이적인 유전자 세트를 GSEA로 확인한 결과이다.
도 1g는 HT1-CdHs 세포에 클러스터링 분석을 수행한 결과이다.
도 1h는 WT-mCdHs와 HT1-mCdHs를 72시간 동안 3계대 배양했을 때, 배가시간을 측정한 결과이다.
도 1i는 HT1-mCdHs의 계대 배양 중, 초기(p1) 및 후기(p21)의 Bright-field 이미지를 확인한 결과이다.
도 1j는 단리한 일차 간세포를 YAC 및 HAC 배지에 배양하면서 Bright-field 이미지를 확인한 결과이다.
도 1k는 HT1-mCdHs에 RT-qPCR을 수행하여, 간선조세포 관련 유전자 마커를 발현하고 있는지 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 간세포 분화조건에서 HT1-mCdHs 세포의 특성을 Gright-field, ICG uptake 수준, PAS 염색 및 면역형광염색법으로 확인한 결과이다.
도 3a는 HT1을 유발하는 유전자를 교정하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3b는 ABEmax, NG-ABEmax 및 NG-ABE8e를 인코딩하는 플라스미드의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 3c는 프라임 편집기술에 사용되는 pegRNA1 및 sgRNA1b의 구조를 나타낸 것이다.
도 3d는 ABE 기술 및 PE 기술을 사용하여 HT-mCdHs 세포의 유전자를 교정한 다음, 고속처리 서열분석을 통해 A에서 G으로의 전환율을 시각화하여 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 3e는 ABE 기술을 사용하여 유전자를 교정한 HT-mCdHs 세포에서 염기위치에 따른 A에서 G로의 전환율을 구체적으로 나타낸 것이다.
도 3f는 ABE 기술을 사용하여 유전자를 교정한 HT-mCdHs 세포에서 삽입 및 결실(insertion and deletion, indel) 비율을 확인한 결과이다.
도 3g는 pegRNA와 nicking sgRNA의 대상 부위를 나타낸 결과이고, 도 3h는 대상 부위의 서열을 구체적으로 나타낸 결과이다.
도 3i는 질환을 유발하는 돌연변이를 교정하기위해 디자인한 pegRNA1의 구조를 나타낸 것이다.
도 3j는 상이한 길이(n=1~4) 프라임 결합부위를 가지는 pegRNA로 HT1-mCdHs를 형질전환한 다음, 삽입 및 결실(indel) 비율을 확인한 결과이다.
도 4a는 ABE 처리한 mCdHs 세포에서 Fah 유전자가 교정된 세포를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4b는 ABE 처리한 mCdHs 세포에서 유전자가 교정된 세포를 선별하고(HT1-mCdHs-ABE#1, HT1-mCdHs-ABE#2), 벌크세포에서 고속처리 서열분석을 통해, 염기의 변화수준을 확인한 결과이다.
도 4c는 Cas-OFFinder를 활용하여 HT1-mCdHs-ABE#1-1의 오프 타겟 효과를 확인한 결과이다.
도 5a는 ABE처리한 HT1-mCdHs 세포를 HT1 마우스에 이식하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5b는 ABE처리한 HT1-mCdHs 세포 이식 여부에 따른 HT1 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸 결과이다.
도 5c는 HT1-mCdHs, HT1-mCdHs-ABE#1, HT1-mCdHs-ABE#2, HT1-mCdHs-ABE#1-1 및 WT-mPH의 혈청에서 아스파르테이트 트랜스아미나아제(aspartate transaminase, AST), 알리닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase, ALT), 총 빌리루빈(total bilirubin) 및 알부민(albumin, ALB)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5d는 HT1 마우스에 HT1-mCdHs-ABE#1-1을 이식하고 40, 130 및 180일이 경과했을 때, 간에서 Fah 유전자를 면역세포염색하여 치료효과를 확인한 결과이다.
도 5e는 WT-mPHs를 이식한 HT1 마우스의 간에서 Fah 유전자를 면역세포염색하여 치료효과를 확인한 결과이다.
도 5f는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 마우스에 이식한 다음, 재분리하여 RT-qPCR을 통해 성숙한 간세포 특이적인 마커 발현여부를 확인한 결과이다.
도 5g는 HT1-mCdHs-ABE#1-1를 HT1 마우스에 이식하고 180일이 경과한 다음, 편집된 뉴클레오티드의 비율을 확인한 결과이다.
도 5h는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포 또는 WT-mPHs 세포를 이식한 HT1 마우스의 간을 이미지 촬영한 결과이다(화살표는 간세포암을 나타냄).
도 5i는 HT1 마우스에 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고 180일이 경과한 다음, Fah 유전자에 대한 면역염색 및 간 조직에 대한 H&E 염색을 수행한 결과이고, 도 5j는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고 130일이 경과한 다음, Fah 유전자에 대한 면역염색 및 간 조직에 대한 H&E 염색을 수행한 결과이다.
도 5k는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고 130일이 경과한 HT1 마우스의 간조직에 AFP를 면역조직화학염색 수행한 결과이다.
도 5l는 상기 5h에서 화살표로 나타낸 간세포암 세포에 고속처리 시퀀싱을 수행하여 각 뉴클레오티드의 백분율을 확인한 결과이다.
도 6a는 PE에 의해 유전자가 교정된 HT1-mCdHs-PE3b 세포를 HT1 마우스에 이식하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6b는 PE에 의해 유전자가 교정된 세포를 이식한 마우스(13 마리) 또는 PBS만을 주입한 대조군 마우스(9 마리)에서 카플란-마이어 생존곡선을 확인한 결과이다.
도 6c는 HT1-mCdHs-PE3b 및 WT-mPHs를 이식한 마우스의 혈청에서 아스파르테이트 트랜스아미나아제(aspartate transaminase, AST), 알리닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase, ALT), 총 빌리루빈(total bilirubin) 및 알부민(albumin, ALB)의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 6d는 HT1-mCdHs-PE3b를 HT1 마우스에 이식하고 80일 또는 140일이 경과한 다음, Fah 유전자를 면역조직염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 HT1-mCdHs-PE3b를 HT1 마우스에 이식하고 140일이 경과한 다음, 편집된 뉴클레오티드의 비율을 확인한 결과이다.
도 1b는 분리된 1차 간세포에 면역형광염색을 수행한 결과이다.
도 1c는 HT1-CdHs에 RT-qPCR을 수행하여, 유전자 마커의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 1d는 HT1-CdHs에 면역형광염색을 수행한 결과이다.
도 1e는 일반적인 유전자 및 세포주기와 관련된 유전자의 발현 프로파일을 나타낸 것이다.
도 1f는 HT1-CdHs 세포에서 세포주기 및 줄기 모듈 특이적인 유전자 세트를 GSEA로 확인한 결과이다.
도 1g는 HT1-CdHs 세포에 클러스터링 분석을 수행한 결과이다.
도 1h는 WT-mCdHs와 HT1-mCdHs를 72시간 동안 3계대 배양했을 때, 배가시간을 측정한 결과이다.
도 1i는 HT1-mCdHs의 계대 배양 중, 초기(p1) 및 후기(p21)의 Bright-field 이미지를 확인한 결과이다.
도 1j는 단리한 일차 간세포를 YAC 및 HAC 배지에 배양하면서 Bright-field 이미지를 확인한 결과이다.
도 1k는 HT1-mCdHs에 RT-qPCR을 수행하여, 간선조세포 관련 유전자 마커를 발현하고 있는지 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 간세포 분화조건에서 HT1-mCdHs 세포의 특성을 Gright-field, ICG uptake 수준, PAS 염색 및 면역형광염색법으로 확인한 결과이다.
도 3a는 HT1을 유발하는 유전자를 교정하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3b는 ABEmax, NG-ABEmax 및 NG-ABE8e를 인코딩하는 플라스미드의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 3c는 프라임 편집기술에 사용되는 pegRNA1 및 sgRNA1b의 구조를 나타낸 것이다.
도 3d는 ABE 기술 및 PE 기술을 사용하여 HT-mCdHs 세포의 유전자를 교정한 다음, 고속처리 서열분석을 통해 A에서 G으로의 전환율을 시각화하여 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 3e는 ABE 기술을 사용하여 유전자를 교정한 HT-mCdHs 세포에서 염기위치에 따른 A에서 G로의 전환율을 구체적으로 나타낸 것이다.
도 3f는 ABE 기술을 사용하여 유전자를 교정한 HT-mCdHs 세포에서 삽입 및 결실(insertion and deletion, indel) 비율을 확인한 결과이다.
도 3g는 pegRNA와 nicking sgRNA의 대상 부위를 나타낸 결과이고, 도 3h는 대상 부위의 서열을 구체적으로 나타낸 결과이다.
도 3i는 질환을 유발하는 돌연변이를 교정하기위해 디자인한 pegRNA1의 구조를 나타낸 것이다.
도 3j는 상이한 길이(n=1~4) 프라임 결합부위를 가지는 pegRNA로 HT1-mCdHs를 형질전환한 다음, 삽입 및 결실(indel) 비율을 확인한 결과이다.
도 4a는 ABE 처리한 mCdHs 세포에서 Fah 유전자가 교정된 세포를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4b는 ABE 처리한 mCdHs 세포에서 유전자가 교정된 세포를 선별하고(HT1-mCdHs-ABE#1, HT1-mCdHs-ABE#2), 벌크세포에서 고속처리 서열분석을 통해, 염기의 변화수준을 확인한 결과이다.
도 4c는 Cas-OFFinder를 활용하여 HT1-mCdHs-ABE#1-1의 오프 타겟 효과를 확인한 결과이다.
도 5a는 ABE처리한 HT1-mCdHs 세포를 HT1 마우스에 이식하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5b는 ABE처리한 HT1-mCdHs 세포 이식 여부에 따른 HT1 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸 결과이다.
도 5c는 HT1-mCdHs, HT1-mCdHs-ABE#1, HT1-mCdHs-ABE#2, HT1-mCdHs-ABE#1-1 및 WT-mPH의 혈청에서 아스파르테이트 트랜스아미나아제(aspartate transaminase, AST), 알리닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase, ALT), 총 빌리루빈(total bilirubin) 및 알부민(albumin, ALB)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5d는 HT1 마우스에 HT1-mCdHs-ABE#1-1을 이식하고 40, 130 및 180일이 경과했을 때, 간에서 Fah 유전자를 면역세포염색하여 치료효과를 확인한 결과이다.
도 5e는 WT-mPHs를 이식한 HT1 마우스의 간에서 Fah 유전자를 면역세포염색하여 치료효과를 확인한 결과이다.
도 5f는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 마우스에 이식한 다음, 재분리하여 RT-qPCR을 통해 성숙한 간세포 특이적인 마커 발현여부를 확인한 결과이다.
도 5g는 HT1-mCdHs-ABE#1-1를 HT1 마우스에 이식하고 180일이 경과한 다음, 편집된 뉴클레오티드의 비율을 확인한 결과이다.
도 5h는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포 또는 WT-mPHs 세포를 이식한 HT1 마우스의 간을 이미지 촬영한 결과이다(화살표는 간세포암을 나타냄).
도 5i는 HT1 마우스에 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고 180일이 경과한 다음, Fah 유전자에 대한 면역염색 및 간 조직에 대한 H&E 염색을 수행한 결과이고, 도 5j는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고 130일이 경과한 다음, Fah 유전자에 대한 면역염색 및 간 조직에 대한 H&E 염색을 수행한 결과이다.
도 5k는 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고 130일이 경과한 HT1 마우스의 간조직에 AFP를 면역조직화학염색 수행한 결과이다.
도 5l는 상기 5h에서 화살표로 나타낸 간세포암 세포에 고속처리 시퀀싱을 수행하여 각 뉴클레오티드의 백분율을 확인한 결과이다.
도 6a는 PE에 의해 유전자가 교정된 HT1-mCdHs-PE3b 세포를 HT1 마우스에 이식하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6b는 PE에 의해 유전자가 교정된 세포를 이식한 마우스(13 마리) 또는 PBS만을 주입한 대조군 마우스(9 마리)에서 카플란-마이어 생존곡선을 확인한 결과이다.
도 6c는 HT1-mCdHs-PE3b 및 WT-mPHs를 이식한 마우스의 혈청에서 아스파르테이트 트랜스아미나아제(aspartate transaminase, AST), 알리닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase, ALT), 총 빌리루빈(total bilirubin) 및 알부민(albumin, ALB)의 발현수준을 확인한 결과이다.
도 6d는 HT1-mCdHs-PE3b를 HT1 마우스에 이식하고 80일 또는 140일이 경과한 다음, Fah 유전자를 면역조직염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 HT1-mCdHs-PE3b를 HT1 마우스에 이식하고 140일이 경과한 다음, 편집된 뉴클레오티드의 비율을 확인한 결과이다.
본 발명자들은 본 발명의 돌연변이 유전자가 교정된 세포를 포함하는 세포치료제를 사용하는 경우, 기존의 일차 간세포를 이식하는 경우 보다 오프타겟 효과 및 종양생성 등의 부작용이 적고, 유의한 수준의 티로신 혈증 1형의 치료효과를 보여줌을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 (a) 개체로부터 세포를 단리하는 단계;
(b)
상기 단리된 세포에 화합물을 처리하여 화학유래 선조세포(chemically derived projenitor cell)를 제조하는 단계; 및
(c) 체외(ex vivo)에서 상기 화학유래 선조세포의 타겟 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 돌연변이 유전자가 교정된 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자를 교정하는 단계는 아데닌 염기교정 유전자가위(Adenine Base Editors) 또는 프라임 편집(Prime editing)에 의해 교정되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아데닌 염기교정 유전자가위 (Adenine Base Editors, ABEs)"는 아데닌을 구아닌으로 교정하기 위해, 임의의 자연유래 탈아미노화효소 (ecTadA) 및 아데닌 탈아미노화효소 변이체 (ecTadA*)를 Cas9 니카아제 (nickase)의 N-말단에 융합시킴으로써 구축되었으며, ABEs의 종류로는 버전에 따라 ABE6.3 ABE7.8, ABE7.9, ABE 7.10, NG-ABEmax, NG-ABE8e 및 ABEmax 등이 있을 수 있으나 이에 제한되지 않고, 본 발명에 따른 "아데닌 탈아미노화효소(adenine deaminase) 및 Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 포함하는, 사이토신(C) 염기교정용 조성물"을 "ABEs"로 지칭할 수 있다.
본 발명에 따른 "아데닌 탈아미노화효소 (adenine deaminase)"는 아데닌에서 아미노기를 제거하고 히포크산틴(hypoxanthine)의 생성에 관여하는 효소이고, 상기 효소는 고등 동물에는 거의 발견되지 않으나 암소의 근육내, 우유, 쥐의 혈액에 조금 존재하며 가재의 내장 및 곤충 등에서는 많이 존재한다고 보고된다. 아데닌 탈아미노화효소는 ecTadA와 같은 자연유래 아데닌 탈아미노화 효소를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아데닌탈아미노화효소는 ecTadA의 돌연변이 (ecTadA*)와 같은 아데닌 탈아미노화효소의 변이체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 "Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질"은 DNA 바이러스에 대한 특정 박테리아의 면역학적 방어에서 중요한 역할을 하는 단백질로 유전자 공학 응용에 많이 사용되는데, 상기 단백질의 주요 기능이 DNA를 절단하는 것이기 때문에 세포의 게놈을 변형하는 데에 적용할 수 있다. 기술적으로 Cas9은 Streptococcus pyogenes의 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 적응 면역 시스템과 관련된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 (RNA-guided DNA endonuclease)이며, Cas9는 외래 DNA 가닥을 풀고 가이드 RNA의 20개 염기쌍 스페이서 영역에 상보적인 부위를 확인하여, 상기 DNA가 가이드 RNA와 상보적인 경우 침입 DNA로 간주하고 이를 절단하는 기작으로 작동한다.
본 발명에 있어서 사용되는 용어 "프라임 편집(Prime editing) 기술"은 CRISPR 유전자 가위 기술의 낮은 정확성을 개선하기 위해 개발된 4세대 유전자 가위 기술로서, 기존 CRISPR 기술과 달리, 타겟 DNA의 두 가닥 중, 하나의 가닥만을 절단하는 것을 특징으로 하며, nicking sgRNA와 pegRNA(prime editing guide RNA)를 포함하는 융합단백질로 구성되어 있고, pegRNA는 RNA 스페이서, 역전사 템플릿(reverse transcription template, RTT) 및 프라이머 결합 부위로 구성되어 있으며, 본 발명에서 프라임 편집을 위해 사용된 조성물은 PE 또는 PE3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 교정은 대상으로 하는 세포에 프라임 편집을 위한 조성물 또는 ABE 조성물을 전기천공 처리하여 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단리된 세포는 일차 간세포일 수 있으며, ABE 또는 PE에 의해 교정되는 유전자는 돌연변이를 통해 질환을 유발하는 유전자로서, 이에 제한되는 것은 아니나, Fah(fumarylacetoacetate hydrolase), ATP7B(ATPase copper transporting beta), SERPINA1(Serpin family A member 1), ABCB4(ATP binding cassette subfamily B member 4), ALDOB(aldolase, fructose-bisphosphate B), GBE(glycogen branching enzyme), SLC25A13(Solute Carrier Family 25 Member 13), CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance) 또는 ALMS1(ALMS1 Centrosome And Basal Body Associated Protein) 유전자 일 수 있고, 바람직하게는 Fah(fumarylacetoacetate hydrolase) 유전자 일 수 있다.
상기 단리된 세포는 화합물 처리에 의해 줄기세포와 유사한 능력을 가지는 화학유래 선조세포로 제조될 수 있으며, 보다 구체적으로는 간세포 성장 인자(HGF), A83-01(TGF-β 억제제) 및 CHIR99021(GSK-3 억제제)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 인간 성체 간세포의 간 전구세포로의 리프로그래밍 배지 조성물에 의해 리프로그래밍되어 화학유래 간선조세포(CdHs)가 될 수 있다. 본 발명의 상기 CdHs는 간 및 담관 상피 혈통 계통의 유전자를 발현하고 간 전구세포 특이 마커로 염색될 수 있으며, 담관세포 및 간세포로 분화할 수 있어, 이분화성(bipotent) 간줄기세포 성질이 있다.
본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 체외에서 유전자를 교정한 본 발명의 세포를 사용하는 경우, 티로신 혈증을 비롯한 유전자 돌연변이에 의해 발생한 질환을 유의적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 유전자 편집 기술에 의해 유전자가 교정된 세포는 표적하는 유전자를 제외한 나머지 부분에서 오프 타겟 효과가 확인되지 않아 예상치 못한 부작용 등이 나타나지 않을 것으로 확인되었다(실시예 4 참조)
본 발명의 다른 실시예에 있어서, HT1 돌연변이 마우스 모델의 식음수에서 NTBC를 완전히 제외한 경우에도 대조군 마우스 및 단순 HT1-mCdHs를 이식한 마우스의 경우, 90일이 되는날 모두 죽은 것을 확인하였으나, ABE에 의해 체외(ex vivo)에서 유전자가 교정된 본 발명의 세포의 경우, 9마리의 마우스 중, 2마리가 180이상 생존한 것을 확인하여 본 발명의 세포 치료제가 유의한 수준으로 돌연변이 관련 질환을 치료할 수 있음을 확인하였고(실시예 5-1 참조), 본 발명의 세포는 간세포암(HCC)의 발생과도 관련이 없음을 확인하였다(실시예 5-2 참조). 또한, ABE가 아닌, PE로 교정한 HT1-mCdHs-PE3b 세포를 이식한 13마리의 마우스 중, 7마리의 마우스가 160일 이상 생존함을 확인할 수 있었다(실시예 6 참조).
본 발명자들은 상기와 같은 구체적인 실험 결과를 통해, 본 발명의 세포 및 이를 포함하는 세포치료제를 사용하는 경우, 부작용 없이도 유전자 돌연변이에 의해 발생한 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 방법으로 제조된 돌연변이 유전자가 교정된 세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포치료제를 포함하는, 유전자 돌연변이 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 예방이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유전자 돌연변이에 의해 발생한 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 유전자 돌연변이에 의해 발생한 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 본 발명의 유전자가 교정된 세포를 포함하는 세포치료제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명자들은 구체적인 실험예를 통해, 본 발명의 유전자가 교정된 세포를 포함하는 세포치료제를 포함하는, 약학적 조성물의 유전자 돌연변이 관련 질환의 예방 및 치료용도를 규명하였다.
본 발명에 있어서 상기 유전자 돌연변이 관련 질환은 티로신혈증 1형(Tyrosinemia type 1), 페닐케톤뇨증(Phenylketonuria), 윌슨병(Wilson disease), 알파-1 항트립신 결핍증(Alpha-1 antitrypsin deficiency), 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형(Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3), 유전성 과당 불내증(Hereditary fructose intolerance), 글리코겐 축적 질환 4형(Glycogen storage disease type IV), 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍증(Argininosuccinate lyase deficiency), 시트린 결핍증(Citrin deficiency), 시트린 결핍에 의한 신생아 담증정체(Neonatal intrahepatic cholestasis by citrin deficiency), 콜레스테롤 에스테르 축적병(Cholesteryl ester storage disease), 낭포성 섬유증(Cystic fibrosis), 유전성 혈색소 침착증(Hereditary hemochromatosis) 및 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
1-1. 실험 동물 및 질환 모델 준비
HT1(티로신 혈증 1, Tyrosinemia type I) 마우스는 김형범(Hyoungbum Kim, Henry)으로부터 받은 것을 사용하였다. 6주 내지 8주령 수컷 및 암컷 마우스에 대해 실험을 수행하였으며, 한양 대학교 산학협력단(HYU Industry-University Cooperation Foundation)의 실험동물 관리 원칙 및 실험동물의 사용을 위한 지침 규정(2018-0196A)에 따라 마우스를 특정 무균 조건 하에 사육 및 관리하였다. HT1 마우스에서 1주일 동안 NTBC를 처리하지 않는 방법을 통해 간 손상을 유도하였다.
1-2. 일차 간세포(primary hepatocytes)의 단리 및 세포 배양
Fah-/- 마우스 일차 간세포를 단리하기 위해, HT1 마우스의 간을 용액 A(0.19 g/L의 EDTA(Sigma-Aldrich), 8 g/L의 NaCl, 0.4 g/L의 KCl, 0.078 g/L의 NaH2PO4·2H2O, 0.151 g/L의 Na2HPO4·12H2O 및 0.19 g/L의 HEPES)를 이용하여 간문맥을 통해 37℃에서 5분 동안 관류한 후, 용액 B(0.3 g/L의 콜라게나아제(Worthington Biochemical), 0.56 g/L의 CaCl2, 8 g/L의 NaCl, 0.4 g/L의 KCl, 0.078 g/L의 NaH2PO4·2H2O, 0.151 g/L의 Na2HPO4·12H2O 및 0.19 g/L의 HEPES)를 이용하여 37℃에서 8분 동안 관류하였다. 생존 가능한 일차 간세포를 Percoll 용액(GE Healthcare)에서 등밀도 원심분리에 의해 수득하였다. 단리된 Fah-/- 마우스 일차 간세포를 콜라겐 피복 접시에 2,000개의 세포/cm2로 접종하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 분위기에서 윌리엄 E 배지(William's E medium(Gibco))에서 배양하였다.
HT1 일차 간세포로부터 화학 유래 간 선조세포(chemically derived hepatic progenitors, 이하, HT1-mCdHs)를 생성하기 위해, 접종 1일 후 배지를 재프로그래밍 배지[1% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)(Gibco), 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(insulin-transferrin-selenium)(Gibco), 0.1 μM의 덱사메사손(dexamethasone)(Sigma-Aldrich), 10 mM의 니코틴아미드(nicotinamide)(Sigma-Aldrich), 50 μM의 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)(Sigma-Aldrich), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)(Gibco), 20 ng/mL의 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)(Peprotech), 20 ng/mL의 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)(Peprotech), 4 μM의 A83-01(Sigma-Aldrich) 및 3 μM의 CHIR99021(Sigma-Aldrich)을 함유하는 DMEM/F-12 배지]로 교체하였고, 상기 재프로그래밍 배지는 2일마다 교체하였다. 먼저, 1X 트리플 익스프레스(TrypLE Express) 효소(Gibco)를 이용하여 플레이트로부터 세포를 분리시키고, 박리된 세포를 신선한 배지에서 1:4의 비율로 희석하고, 신선한 콜라겐 피복 접시에 세포를 도말함으로써 4일 내지 6일마다 세포를 계대 배양하였다. 염기 편집 이후, 세포의 벌크 개체군를 희석하고, 96-웰 플레이트에 접종하여 단일 세포 유래 클론을 선별할 수 있었다.
간세포로의 분화를 유도하기 위해, HT1-mCdHs를 콜라겐 피복 접시 상에 1,000개의 세포/cm2로 접종하였고, 1일간의 배양 후, 배지를 20 ng/mL의 온코스타틴 M(oncostatin M)(Prospec) 및 10 μM의 덱사메사손이 보충된 재프로그래밍 배지로 구성된 분화 배지로 교체하였으며; 그 이후에 배지를 2일마다 교체하였다. 6일이 경과한 다음, 세포를 분화 배지로 1:7의 비율로 희석된 마트리겔(Matrigel)(Corning)로 덮은 후, 2일 이상 동안 배양하였다.
담관세포로의 분화를 유도하기 위해서는, 1X 트리플 익스프레스 효소로 처리하여 HT1-mCdHs를 수확하고, 6-웰 플레이트 내에서 10% FBS 및 20 ng/mL의 간세포 성장 인자를 함유하는 DMEM/F-12 배지[담관세포 분화 배지(cholangiocyte differentiation medium, CDM)로 명명됨]에서 1 x 105개의 세포/웰의 밀도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 CDM을 동일한 부피의 콜라겐 I형(pH 7.0)과 혼합하고, 응고를 위해 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 혼합물과 중첩시키고, 7일 동안 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였다.
상기와 같이 수득한 HT1 마우스에서 얻은 화학유래 간 선조세포를 Kasuda et al.(Cell Stem Cell Volume 20, Issue 1, 5 January 2017, Pages 41-55)에서 제작했던 CLiPs(chemically induced liver progenitors)와 비교하기 위하여, 마우스의 일차 간세포(primary Hepatocytes, PH)는 상기와 같은 방법으로 분리되어, 상기 Kasuda et al.의 방식대로 제조하였고, YAC을 포함하는 배지에서 배양하여 7일이 경과한 다음, RT-qPCR 분석을 수행하기 위하여 수득하였다.
1-3. 면역 염색(Immunostaining)
면역 세포화학법을 위해, 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 내에서 4℃에서 하룻밤 동안 고정시킨 다음, 고정된 세포를 PBS에서 세척한 하고, 실온에서 10분 동안 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 처리하였다. 이어, PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin), 22.52 ng/mL의 글리신(glycine) 및 0.1% 트윈 20(Tween 20)으로 이루어진 차단 용액(blocking solution)으로 세포를 실온에서 1시간 동안 처리하였으며, 그 이후에 세포를 차단 용액에서 희석된 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 세척한 다음, 일차 항체를 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488)-접합 또는 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)-접합된 이차 항체(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 검출하였다. 핵은 Hoechst 33342(1:10,000, 분자 프로브)를 이용하여 대비 염색하였다. 본 연구에서 사용된 일차 항체는 주요 자원표(Key Resources Table)에 나열되어 있다. 염색된 세포를 TCS SP5 공초점 현미경(라이카(Leica)) 하에서 시각화하였다.
면역 조직화학법을 위해, 간 조직 샘플을 10% 포르말린에서 고정하고, 파라핀에 포매하였다. 절편에 면역 조직화학적 염색을 가하였다. 다코 리얼TM 엔비전TM(Dako REALTM EnVisionTM) 검출 시스템(Dako)을 이용하여 면역 조직화학적 염색을 실행하였다. 항-FAH 항체(예쿠리스(Yecuris), 20-0034)를 일차 항체로서 사용하고, 핵은 헤마톡실린을 이용하여 대비 염색하였다. 염색된 조직은 가상 현미경 Axio Scan.Z1(Zelss) 하에 관찰하였다.
1-4. RT-PCR 분석
트리졸(Trizol) 시약(Gibco)을 이용하여 총 RNA(Total RNA)를 단리하였고, 1 ㎍의 RNA 샘플은 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA(Transcriptor First Strand cDNA) 합성 키트(Roche)를 이용하여 역전사 하였다. CFX 코넥트 실시간 PCR 검출(CFX Connect Real-Time PCR Detection) 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 각각의 반응액에는 10 ㎕의 qPCR PreMix(Dyne Bio), 1 ㎕의 cDNA 및 올리고뉴클레오티드 프라이머가 함유되어 있으며, 각각의 유전자에 대해 반응액을 3회 분석하였다. PCR 사이클은 95℃에서의 20초, 60℃에서의 40초를 1사이클로 하여, 40 사이클을 수행하였다. 용융 곡선 및 용융 피크 데이터를 수득하여 PCR 생성물의 특성을 분석하였고, 이를 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
| Gene | Primer | Sequence (5' to 3') |
| Primers for qRT-PCR | ||
| Alb | Fwd | GGCTACAGCGGAGCAACTGA |
| Rev | GCCTGAGAAGGTTGTGGTTGTG | |
| Sox9 | Fwd | TCCTAACGCCATCTTCAAGG |
| Rev | ACGTCTGTTTTGGGAGTGGT | |
| Epcam | Fwd | TCGTGGTGGTGTTAGCAGTC |
| Rev | TCTGTGTATCTCACCCATCTCC | |
| Afp | Fwd | CGTCCCTCCACCATTCTCTG |
| Rev | CGTGCTGCTCCTCTGTCATT | |
| Krt19 | Fwd | TTCCGGACCAAGTTTGAGAC |
| Rev | CCTCGTGGTTCTTCTTCAGG | |
| Itga6 | Fwd | GGATCATCCTCCTGGCTGT |
| Rev | TGTGGTAGGTGGCATCGTAA | |
| Cd44 | Fwd | GGCTTATCATCTTGGCATCC |
| Rev | CTGTTCCATTGCCACTGTTG | |
| Cd90 | Fwd | AACTTCACCACCAAGGAT |
| Rev | TTGTCTCTATACACACTGATACT | |
| Hnf6 | Fwd | GACCATGGCCTGTGAAACTC |
| Rev | TGAAACTACCGCTCACGTTG | |
| Asgr1 | Fwd | CAGCTCTGTGAGGCCTTGGA |
| Rev | GGGCCCGTTCTGGTCAGTTA | |
| Hnf4α | Fwd | ATCGRCAAGCCTCCCTCTGC |
| Rev | GACTGGTCCCTCGTGTCACATC | |
| Cyp1a2 | Fwd | AGGAGCTGGACACGGTGGTT |
| Rev | AGGTGTCCCTCGTTGTGCTG | |
| Cyp2c9 | Fwd | TGACTTGTTTGGAGCTGGGACAGA |
| Rev | ACAGCATCTGTGTAGGGCATGT | |
| Aat | Fwd | AATGGAAGAAGCCATTCGAT |
| Rev | AAGACTGTAACTGCTGCAGC | |
| Ttr | Fwd | AGTCCTGGATGCTGTCCGAG |
| Rev | TTCCTGAGCTGCTAACACGG | |
| Arg1 | Fwd | ACAGCTAATGAGGACGACAG |
| Rev | CCACCCAAATGACACATAGG | |
| Cps1 | Fwd | TGAGACAGGCCAAAGAGATTGGGT |
| Rev | TGCTCCTGGCCATTGTAGGTAACA | |
| Fxr | Fwd | TGTGAGGGCTGCAAAGGTT |
| Rev | ACATCCCCATCTTGGAC | |
| Oct | Fwd | TCCTGCTCAACAAGGCAGCTCTTA |
| Rev | TCACGGCCTTTCAGCTGTACTTGA | |
| Cftr | Fwd | GGTCATAGAGCAGGGCAATG |
| Rev | TGCACTTCTTCCTCCGTCTC | |
| Ae2 | Fwd | GACTCCTTTCCCTGTGTGGA |
| Rev | GAAGCATCCGCTCTTTCTTG | |
| Aqpr1 | Fwd | CTGTGCGTTCTGGCTACCAC |
| Rev | GCACAGCAGAGCCAAATGAC | |
| Aqpr9 | Fwd | CTCAGTCCCAGGCTCTTCAC |
| Rev | TAAGACCTCCCAGGAAAGCA | |
| Grhl2 | Fwd | GTTCGATGCTCTGATGCTGA |
| Rev | GCAGCCCGTACTTCTCAGAC | |
| Gabdh | Fwd | CCAATGTGTCCGTCGTGGAT |
| Rev | TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG | |
| Primers for high-throughput sequencing | ||
| Fah | 1st_Fwd | AGTAATGCCAGGTCCTCAGG |
| 1st_Rev | GTCAGCTCCATCCTTCCACT | |
| 2nd_Fwd | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCT CTCCATGGCAGGCTTTCTTC | |
| 2nd_Rev | GTGACTGGAGTTCAGACGTGT GCTCTTCCGATCT CCACACCCACAGAGTCAGAA | |
1-5. 라이브러리 준비 및 전사체 시퀀싱(Transcriptome sequencing)
총 RNA 농도는 Quant-IT RiboGreen(Invitrogen, USA)을 사용하여 계산하였으며, 무결성 값(integrity values)는 TapeStation RNA ScreenTape(Agilent Technologies, USA)으로 엑세스 하였습니다. 무결성 번호가 7.0 보다 높게 확인되는 고품질의 RNA만을 선별하여 라이브러리의 구성으로 활용하였으며, Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 각 샘플에 대해 1mg의 총 RNA 라이브러리를 독립적으로 준비하였다.
라이브러리 준비 초기단계는 Poly-T가 부착된 자기 비드(beads)로 Poly-A를 포함하는 mRNA 분자를 정제하고, 정제된 mRNA를 승온에서 2가 양이온을 사용하여 절편화 시켰습니다. 절단된 mRNA 단면은 SuperScript II 역전사 효소(Invitrogen), 랜덤 프라이머 및 DNA 중합효소 I을 사용하여 cDNA의 첫번째 가닥으로 복사되었으며, cDNA의 상보적인 가닥은 DNA 중합효소 I, RNase H 및 dUTP를 사용하여 합성하였다.
상기의 단계를 거쳐 수득된 cDNA 단편에 단일 'A' 염기를 추가하고 어댑터를 부착하여 최종 복구 과정을 수행하여 최종적으로 cDNA 라이브러리를 만들었다. 라이브러리는 qPCR 정량화 프로토콜 가이드(Kapa Biosystems, USA)에 따라 Illumina 시퀀싱 플랫폼용 KAPA 라이브러리 정량화 키트를 사용하여 정량화 하였으며, TapeStation D1000 ScreenTape(Agilent Technologies)로 검증하였다. 인덱싱된 라이브러리는 마크로젠(Macrogen, Inc.)에서 Illumina HiSeq 2500(Illumina, Inc.)으로 Paired-end 시퀀싱하였다.
1-6. 생물정보학(Bioinformatic) 분석
표준 Illumina 파이프라인 및 실시간 분석 도구는 raw 이미지 처리, 염기 불러오기(base calling) 및 paired-end RNA 시퀀싱 데이터로부터 FASTQ 데이터를 생성하기 위해 사용하였다. Sickle(V1.33, https://github.com/najoshi/sickle)을 사용하여 100 bp x 2 리드 시퀀스(read sequence)를 전처리하여 품질이 낮은 서브 시퀀스(sub sequence)를 트리밍(trimming)한 다음 RSEM(v1.2.31) 및 STAR(v2.5.2b)를 사용하여 hg19 인간 레퍼런스 게놈에 정렬하였다.
클러스터링 분석은(clustering analysis)는 Cluster3.0(http://eisenlab.org/) 및 heatmap(v3.3.2, https://www.r-project.org)을 사용하여 수행하였다. 유전자 세트 농축 분석(Gene set enrichment analysis, GSEA) 점수는 C5 및 C8 bp 데이터 세트의 유전자 세트에 대해 생성하였고, 정규화된 농축 점수 및 p-값은 GSEA 소프트웨어(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)를 사용하여 계산하였다.
1-7. 배가 시간(Doubling time)의 계산
HT1-mCdHs를 콜라겐 피복 6-웰 플레이트 상에 1 x 104개의 세포/웰의 밀도로 접종한 다음, 3일 및 7일째 날에 세포수를 측정하였다. 배가 시간은 http://www.doubling-time.com/compute.php에 기술되어 있는 바와 같이 하기 식을 이용하여 계산하였다.
[수학식]
배가 시간 = 시간 * log(2)/[log(최종 농도) - log(초기 농도)]
1-8. PAS 염색 ICG 흡수
글리코겐을 검출하기 위해, 공급 회사에서 권장하는 바와 같이, 다아스타아제(diastase)(Sigma)의 존재 유무를 달리하면서, PAS 염색 키트(Abcam)를 이용하여 PAS 시약으로 세포를 염색하였다. ICG(Sigma) 흡수를 검출하기 위해, 세포를 1 ㎎/mL의 ICG를 함유하는 배지에서 37℃에서 30분 동안 배양한 다음, 위상차 현미경(phase-contrast microscope)으로 검사하였다.
1-9. sgRNA 발현 및 pegRNA 발현 플라스미드의 구축
sgRNA 발현 플라스미드를 구축하기 위해, 표적 서열을 나타내는 상보성 올리고를 어닐링하고, pRG2(Addgene #104174) 내에 클로닝하였다. pegRNA 발현 플라스미드를 구축하기 위해, 표적 서열, sgRNA 스캐폴드 및 3' 확장부를 나타내는 상보성 올리고를 어닐링하고, pU6-pegRNA-GG-수용체(Addgene #132777) 내에 클로닝하였다.
1-10. HT1-mCdHs의 형질 감염
Amaxa 4-D 장치(Lonza) 또는 Neon 형질 감염 시스템(Thermo Fisher)을 이용하여 전기 천공을 통한 형질감염(transfection)을 수행하였다. Amaxa 4-D 장치의 경우, P3 일차 세포 4D-Nucleofector X 키트(P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit; 프로그램 EX-147)를 사용하였다. 200,000개의 HT1-mCdHs를 750 ng의 ABEmax 암호화 플라스미드(Addgene, #112095) 및 250ng의 sgRNA 암호화 플라스미드를 이용하여 전기 천공하였다. 네온 형질 감염 시스템을 이용하여 100,000개의 HT1-mCdHs를 하기 파라미터에 따라 900 ng의 PE2 암호화 플라스미드(Addgene #132775); 300 ng의 pegRNA 암호화 플라스미드 및 83 ng의 니킹 가이드 RNA(nicking guide RNA; ngRNA) 암호화 플라스미드; 또는 900 ng의 NG-ABE 암호화 플라스미드(NG-ABE8e, 애드진 #138491) 및 250 ng의 sgRNA 암호화 플라스미드;로 전기천공(전압: 1,200V, 기간: 50ms, 개수: 1개)하여 형질 감염시켰다. NG-ABEmax 암호화 플라스미드는 본 발명자의 실험실에서 적합한 백본 플라스미드(Addgene # 112095)에 기초하여 형성되었다.
형질 감염된 세포는 리프로그램 배지에서 3일동안 배양한 다음, TrypLE Express Enzyme을 처리하고, 원심분리 하여 동결 및 고속처리 서열분석(High-throughput sequencing)을 준비하였다. 동결을 위해서, 세포들은 리프로그램 배지에 재현탁 한다음 -80 ℃ 온도에서 보관하였다.
1-11. 고속처리 서열 분석
고속처리 서열을 위해서, 세포 펠릿을 100㎕의 프로테이나아제 K 추출 완충액[40mM의 트리스-HCl(pH 8.0)(Sigma), 1% 트윈-20(시그마), 0.2mM의 EDTA(Sigma), 10㎎의 프로테이나아제 K, 0.2% nonidet P-40(VWR Life Science)]에서 재현탁하고, 60℃에서 15분 동안 배양하고, 98℃에서 5분 동안 가열하였다.
SUN-PCR 블렌드(Sun Genetics)를 이용하여 추출된 게놈 DNA로부터 ABE 표적 부위를 증폭하였다. 엑스핀TM PCR SV 미니(ExpinTM PCR SV mini)(GeneAll)를 이용하여 PCR 생성물을 정제하고, MiniSeq 서열 분석 시스템(Illumina)을 이용하여 서열 분석하였다. 카스-분석기(Cas-Analyzer; http://www.rgenome.net/cas-analyzer/) 및 BE-분석기(BE-Analyzer; http://www.rgenome.net/be-analyzer/) 및 프라이머(사용한 프라이머는 상기 표 1에 나타내었다)를 이용하여 결과를 분석하였다.
1-12. 제한효소 V-커플링된 절단 게놈 서열 분석
DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 HT1-mCdHs로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 8 ㎍의 게놈 DNA를 시험관 내에서 전사된 sgRNA 24㎍과 함께 사전 배양된 32 ㎍의 ABE와 함께 실온에서 5분 동안 배양하였으며, 그 이후에 300 ㎕의 2X BF 완충액(Biosesang)을 첨가하고, 반응 부피를 600 ㎕로 맞추었다. 이러한 혼합물을 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 37℃에서 15분 동안의 RNase A(50 ㎍/mL, Thermo Scientific) 처리 이후, DNeasy Blood & Tissue Kit를 이용하여 ABE-처리된 게놈 DNA를 정제하였다. 3 ㎍의 정제된 DNA를 200 ㎕의 반응액에서 8유닛의 Endonuclease V(New England Biolabs)를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 절단하였다. 이어서, DNeasy Blood & Tissue Kit를 이용하여 게놈 DNA를 정제하였다. 마크로젠(Macrogen)에서 HiSeq X Ten Sequencer(Illumina)를 이용하여 1 ㎍의 절단된 DNA를 이용하여 전체 게놈 서열 분석을 수행하였다.
1-13. sgRNA의 시험관 내 전사
시험관 내 전사용 주형을 생성하기 위해, T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 및 표적 서열을 함유하는 전방향 올리고 및 가이드 RNA 스캐폴드를 함유하는 역방향 올리고를 마크로젠으로부터 구입하였으며, Phusion DNA Polymerase(Thermo Scientific)를 이용하여 확장시켰다. 확장된 DNA는 Expin PCR SV mini(GeneAll)를 이용하여 확장하였으며, T7 RNA Polymerase(New England Biolabs)로 전사시켰다. 37℃에서 16시간 동안의 배양 후, DNA 주형을 DNase I(New England Biolabs)로 절단하고, Expin PCR SV mini(GeneAll)를 이용하여 RNA 생성물을 정제하였다.
1-14. 세포이식
체외에서 유전자 조작을 수행한 세포를 마우스 내로 이식하기 위해서, 마우스 내로의 세포 이식 7일 전, NTBC를 음용수로부터 제외하였다. 100 ㎕의 PBS 중의 1 x 106개의 세포를 비장의 하위극(inferior pole) 내로 이식하였다. 마우스가 이들의 초기 체중의 80%에 도달하였을 때 3일 마다 일시적으로 NTBC를 제공하였으나, HT1-mCdHs-ABE을 이식한 마우스의 경우 90일, -PE3b을 이식한 마우스의 경우 60일이 경과했을 때, 음용수에서 완전히 제외하였다. 이식 후, 바이오마커 분석을 위해 혈청을 수집하였다. 혈청을 1:4의 비율로 희석하여 평균을 도출하였다.
1-15. 배수성 분석
HT1 mPHs, mCdHs 및 mCdHs-ABE#1-1 세포의 배수성(ploidy) 분석은 세포들에 트립신을 처리하여 플레이트로부터 분리한 후, 15 ㎍/mL의 Hoechst 33342 및 5 μM의 reserpine과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 Duncan et al.(Nature volume 467, pages707-710 (2010))에 기술된 바와 같이, FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 세포 배수성을 분석하였다.
1-16. 통계 분석
배가 시간 실험 및 qRT-PCR을 3중 생물학적 복제물로 수행하였다. 정량적 데이터는 추론적 통계(p-값)을 이용하여 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타나 있다. GraphPad Prism 7(GraphPad)을 이용하여 생존 수준을 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve)으로 분석하였다. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 설정된 양측 t-검정(two-tailed t-test)에 의해 통계적 유의성을 평가하였다.
실시예 2. HT1 모델 마우스에서 유래된 화학유래 간선조세포(mCdHs) 제조 및 특성확인
2-1. HT1-mCdHs의 제조
HT1 모델 마우스로부터 mCdHs를 생성하기 위해, 본 발명자들은 인간 간세포의 재프로그래밍을 위해 사용된 이전 프로토콜이 마우스에서 유래한 PH(HT1-mPHs)에도 또한 적용할 수 있는지를 검사하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 간세포 성장 인자(HGF), A83-01(TGF-β 억제제) 및 CHIR99021(GSK-3 억제제)을 비롯한 하나의 성장 인자 및 2개의 화합물(HAC로도 지칭됨)로 PH를 처리하였다(도 1a). 그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, HAC-처리된 HT1-mPHs가 처리 3일 후에 작은 상피 세포 형태를 나타내고, 세포 개체군이 확장하여 8일 이후에는 접시를 덮어 버리는 것을 확인하였다. 또한, 이 세포는 도 1c 및 도 1d에 나타낸 바와 같이, Krt19, Sox9 및 Afp를 비롯한 간 줄기 세포 특이적인 마커를 발현하는 것으로 확인되었기에, 본 발명자들은 이 세포가 HT1 마우스에서 유래한 화학 유래 간 선조세포(이하, HT1-mCdHs)인 것을 확인하였다.
HT1-mCdHs의 특징을 보다 구체적으로 확인하기 위하여, RNA sequencing을 수행하였다. 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)를 수행했을 때, 도 1e에 나타낸 바와 같이, HT1-mCdHs의 전체 유전자 발현 패턴은 HT1 마우스 일차 간세포(HT1-mPHs)와 상이하며, 특히 HT1-mCdHs에서 높게 발현된 세포 주기 관련된 유전자들의 발현 패턴이 상이하게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 도 1f에 나타낸 바와 같이, 유전자 세트 농축 분석(Gene set enrichment analysis, GSEA)을 수행했을 때에도 유사한 결과를 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 도 1c 및 도 1g에 나타낸 바와 같이, 야생형 C57BL/6N 마우스의 화학 유래 간 선조세포(WTmCdHs)와 비교할때는 유전자 발현 수준 및 증식능에서 유의한 차이를 보여주지 않았다. HT1-mCdHs는 23회 계대 배양을 수행했음에도, 전사체 전체 발현자의 발현이 유지되었으며, 이는 이들 세포가 유전자 교정 클론(gene-corrected clones)을 생성할 수 있을 정도로 안정화된 세포주임을 보여주는 것이다(도1i). HT1-mCdHs 세포를 상기 실시예 1-2에서 준비한 CliPs와 비교했을 때, 도 1j 및 1k에 나타낸 바와 같이, 비슷한 수준의 유전자 발현을 보여주는 것을 확인하였다.
2-2. HT1-mCdHs의 이분화능(bipotent differentiation capacity) 확인
HT1 마우스 유래 간선조 세포(HT1-mCdHs)는 성숙한 간세포 및 담관세포 둘 모두로 분화하는 능력을 갖고 있다. HT1-mCdHs의 분화 능력을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 이들을 간 분화 조건 하에 배양하였다. 본 발명자들은, 도 1D(일반) Indocyanine green(ICG) 흡수 및 periodic acid-Schiff(PAS) 염색의 분석에 의해 나타나 있는 바와 같이, HT1-mCdHs로부터 분화한 간세포 유사 세포(HT1-mCdHs-Heps)가 성숙한 간세포 형상 및 성숙한 간 특징 둘 모두를 획득했다는 것을 확인하였다. 면역형광의 결과에서도 HT1-mCdHs-Heps는 알부민(Albumin), Hnf4a, Krt18 및 Asgpr1을 비롯한 성숙한 간세포-특이적 마커는 간 분화 이후에 발현되는 것으로 나타났다. 상기와 같은 결과는 mCdHs가 적절한 조건 하에서 성숙한 간세포로 다시 분화할 수 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 HT1-mCdHs가 간세포 외의 세포인 담관세포로 분화가 가능한지 확인하기 위하여, 3차원 배양방법을 포함하는 추가 실험을 수행하였다. 구체적으로, 이러한 방식으로 분화된 세포(HT1-mCdH-Chols)는 도 S2에 나타낸 바와 같이, 특징적인 관형 구조를 형성하고 있음을 확인하였으며, HT1-mCdHs와 비교할 때, 담관세포 특이적 마커인 Krt19, Cftr, Ae2, 및 Aqpr1을 더 높은 수준으로 발현하고 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해, HT1 세포에서 단리한 일차 간세포에 화학적 처리하여 이분화능을 가지는 화학유래 간선조 세포를 확립하였음을 구체적으로 확인하였다.
실시예 3.
Fah
돌연변이 교정을 위한 아데닌 염기 편집 및 프라임 편집
HT1 모델마우스에 존재하는 Fah 돌연변이는 엑손 8의 30말단에서 G > A 돌연변이가 발생하여, 스플라이싱 과정에서 엑손 8을 스킵(skipping)되어 비기능성 Fah 효소가 생성되는 것을 의미한다(도 3a). 상기 돌연변이를 수정하기 위하여, ABE(도 3b) 및 PE(도 3c)를 모두 테스트 해보았다. 우선, NGG protospacer 인접 모티프를 인식하는, 기존에 개발되었던 ABE 및 ABEmax를 사용하기 위한 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하였다. 이 방법을 활용했을 때, 점 돌연변이는 교정 윈도우(editing window)(4번째에서 7번째)가 아닌, 그 주변부에 위치했다. 전기천공법을 사용하여 ABEmax를 인코딩하는 플라스미드를 sgRNA 인코딩 플라스미드와 함께 HT1-mCdH로 형질전환 시킨 다음, 3일이 경과하고 고속처리 서열 분석(High-throughput sequencing)을 벌크 세포 집단(bulk cell population)에 수행했을 때, 도 2A(new 일반)변화가 필요한 위치의 아데노신(A9)은 평균 2.4%가 염기 전환된 반면에, 방관자 A(bystander A)(A6)의 경우, 29.3% 수준으로 염기의 전환이 일어나는 것을 확인하였다. 이는 상기 ABEmax가 9번째 위치에 비해 6번재 위치의 아데노신을 보다 용이하게 편집하는 것으로 알려져 있기 때문에 예상되는 결과이다.
목적으로 하는 아데노신의 전환율을 높이기 위해서, 최근에 개발된 NG PAM을 인식하는 Richter et al.(Nat. Biotechnol. 38, 883-891.)에 개시되어 있는 ABE 변형체(ABE variants)를 활용하였다. 그 결과, (도 3b, 3d, 3e 및 3f)에 나타낸 바와 같이, 원하는 위치의 아데노신(현재 A3)의 아데노신 전환율이 평균 9.2%로서, 기존의 2.4% 전환율보다 상당한 진전이 있음을 확인하였다.
마지막으로 방관자 염기의 전환 없이, 목적으로 하는 염기만을 정밀하게 변환시키기 위해서, 프라임 편집(Prime editors, PE)을 테스트 하였다. 프라임 편집 시스템(PE3 또는 PE3b)는 추가적인 nicking sgRNA와 프라임 편집 가이드 RNA(prime editing guide RNA, pegRNA)를 필요로 하는데, pegRNA는 가이드 RNA 스페이서 서열과 역전사 템플릿(Reverse transcription templat, RTT) 및 프라이머 결합 부위로 구성되어 있다(도 3c). 이러한 PE3의 편집 활성을 최적화 하기 위하여, 2개의 서로다른 PE 표적을 설계한 다음, 9~15nt 범위의 서로 다른 길이의 프라이머 결합 부위와 결합된 15nt RTT를 포함하는 다양한 pegRNA를 테스트 하였고(도 3g 및 3j), PE3와 PE3b를 모두 활용할 수 있도록 각 pegRNA에 대해서 2개의 nicking sgRNA를 설계하였다. 결과적으로, 상기 테스트를 통해 11nt 길이의 프라임 결합부위를 가진 pegRNA1과 nicking sgRNA1b를 선정하였으며, 이를 통해 방관자 염기 전환없이, 가장 높은 편집률(평균 2.3%)을 얻을 수 있었다(도 3d 및 3j).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 HT1-mCdHs에서 최적의 돌연변이 유전자 교정을 위한, ABE 및 PE 기반 돌연변이 수정 전략을 수립하였음을 확인하였다.
실시예 4. 유전자 편집 기술의 오프타겟 효과(Off-target effect) 확인
본 발명의 유전자 편집기술을 사용했을 때, 오프 타겟 효과가 발생하는지 여부를 확인하기 위하여, ABEmax 처리된 HT1-mCdH에 대한 실험을 수행하였다. 구체적으로 교정된 Fah 유전자를 포함하는 클론 세포주를 분리 하기 위해서 ABE를 처리한 벌크 세포(bulk cells)를 희석한 다음, 고속처리 서열분석(high-throughput sequencing)을 수행하여, 교정된 Fah 유전자를 포함하는 세포주를 선별해 내었다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, HT1-mCdHs-ABE#1 및 HT-mCdHs-ABE#2라는 높은 교정율을 보여주는 2 세포주를 선정하였다. 상기 세포주들은 도 4b에 나타낸 바와 같이, 적어도 4개의 상이한 서열패턴과 연관되어 있음을 확인하였으며, 이러한 세포주가 동일한 클론으로 구성되지 않을 가능성을 배제하기 위하여, HT1-mCdHs-ABE#1 세포주를 다시 희석하여 단일세포를 분리하고, 고속처리 서열분석을 수행하여 각 세포주에서 교정된 유전자의 존재를 재확인하였다. 얻어진 클론 모두는 적어도 4개의 상이한 서열 패턴을 갖는다는 것을 관찰하였으며, 이는 기존의 연구에서 성체 포유동물에서 간세포의 배수체 특징 및 설치류의 전체 간세포 개체군의 약 90%가 배수체 있음이 이미 알려져 있기에, HT1-mCdHs가 일차 간세포와 유사한 배수체일 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 이배체 HT1-mCdHs를 분리하고 14일 동안 배양하는 경우, 그들의 배수체 분포가 원래 집단에서와 같이, 사배체(tetraploid) 또는 팔배체(octaploid)까지 이동하는 것을 확인하였다.
HT1-mCdHs-ABE#1의 클론 세트 중, 목표하는 시퀀스의 가장 높은 교정 빈도(13.1%)를 보여주는 세포주를 선정하고, HT1-mCdHs-ABE#1-1으로 명명하였다. HT1-mCdHs-ABE#1-1에서 ABEmax 매개 오프 타겟 효과를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1-12와 같이, 제한효소 V(Endonuclease V, EndoV) 절단 게놈 서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 시험관 외(Ex vivo) 절단 부위는 이러한 세포가 표적 부위를 포함하여 11개의 시험관 외 절단 부위를 갖고 있음을 확인할 수 있었으며, Cas-OFFinder 소프트웨어를 사용하여 10개의 잠재적인 오프 타겟 사이트를 in sillico로 확인하였고, 이를 하기 표 2에 나타내었다.
| Potential off-target sites captured by Digenome-seq | ||||||
| OT | Chr : position | Cleavage score | ||||
| Control genomic DNA |
- | chr19:60315442 | 6.37 | |||
| - | chr8:72112588 | 5.87 | ||||
| - | chr3:28912995 | 5.46 | ||||
| - | chr9:37000968 | 4.38 | ||||
| - | chr18:60089364 | 4.26 | ||||
| - | chr9:104123406 | 4.06 | ||||
| - | chr19:60141777 | 4.01 | ||||
| - | chr8:75136581 | 4 | ||||
| ABE/EndoV-treated genomic DNA |
1 | chr3:117504849 | 6.01 | |||
| 2 | chr3:84545503 | 5.5 | ||||
| 3 | chr9:74162358 | 5.45 | ||||
| 4 | chr17:45840609 | 5.24 | ||||
| 5 | chr19:37449202 | 5.02 | ||||
| 6 | chr19:8955071 | 4.65 | ||||
| 10 | chr19:60680279 | 4.62 | ||||
| On | chr7:84595450 | 4.48 | ||||
| 7 | chr3:152059170 | 4.16 | ||||
| 8 | chr7:16025764 | 4.12 | ||||
| 9 | chr17:47517533 | 4.1 | ||||
| Genomic sites predicted using Cas-OFFinder | ||||||
| OT | Target (5' to 3') with PAM sequence | chr : position | Direction | Mismatches | ||
| 1 | ACTGaAGCAGTAAaGCCTGGTGG | chr12:25231004 | - | 2 | ||
| 2 | AaTGGAGCAGTAATGgCaGGAGG | chr7:16834673 | + | 3 | ||
| 3 | tCTGaAGCAGTAgTGCCTGGGGG | chr4:76815045 | - | 3 | ||
| 4 | ACTGGAaCAGTAgTGCtTGGGGG | chr5:25858421 | - | 3 | ||
| 5 | ACaGGAGCAGgAAgGCCTGGGGG | chr16:90485210 | - | 3 | ||
| 6 | ACTGGAGCAGTAggGCaTGGGGG | chr19:46263600 | - | 3 | ||
| 7 | gCTGGAGCAaTAATGgCTGGTGG | chr17:70886653 | - | 3 | ||
| 8 | ACTGGtGatGTAATGCCTGGGGG | chr10:86492242 | - | 3 | ||
| 9 | ACTGGAGCAGTAAgGCCaGaGGG | chr18:5622427 | + | 3 | ||
| 10 | gCTGGtGCAGTgATGCCTGGAGG | chr18:25501316 | + | 3 | ||
HT1-mCdHs-ABE#1-1의 각 절단 사이트에 대해 고속처리 서열분석을 수행하였을 때, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 유의한 수준의 오프 타겟 효과를 확인하지 못하였다.
실시예 5. ABE에 의해 체외 유전자 교정된 HT1-mCdHs 세포의 티로신 혈증1 치료효과 확인
5-1. ABE에 의해 유전자 교정된 세포의 치료효과 확인
본 발명자들은 교정된 mCdHs가 HT1 마우스에서 신뢰 가능한 재증식 능력을 나타낼 수 있으며, 따라서 치료 잠재성을 나타낼 수 있는지를 시험하였다. 본 발명자들은 유의한 오프 타겟 효과가 확인되지 않은 부분적으로 교정된 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포주를 HT1 마우스의 비장 내 이식하였다. 구체적으로 이식 7일 전, 9마리의 HT1 마우스의 식수로부터 NTBC를 철회하여 간 손상을 유도하였으며, 그 결과 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포의 이식이 용이하게 되었다(도 5a). 인산 완충 식염수(Phosphate-buffered saline, PBS) 및 HT1-mCdHs 세포를 음성 대조군으로서 사용하였으며, 야생형 마우스에서 유래한 일차 간세포(WT-mPHs 세포) 이식군을 양성 대조군으로서 사용하였다. 이식 후, PBS 주사 그룹(5마리의 마우스) 및 HT1-mCdHs 이식 그룹(5마리의 마우스)의 마우스는 빠르게 죽기 시작하여 도 5b에 나타낸 바와 같이, 모든 마우스는 90째 날에 죽었으며(도 4b), WT-mPHs 이식한 그룹내의 모든 동물(5마리의 마우스) 또한 대략 120일에 모두 죽는 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 유전자 편집기술을 활용하여 체외에서 교정한 HT1-mCdHs-ABE#1-1를 이식한 마우스 그룹(9마리의 마우스) 중, 2마리는 180일 넘게 생존하였다. 180일 넘게 생존한 2마리의 마우스의 경우, 아스파르테이트 트랜스아미나아제(aspartate transaminase, AST), 알리닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase, ALT), 총 빌리루빈(total bilirubin) 및 알부민(albumin, ALB)을 포함하는 혈청 바이오마커의 수준은 HT1-mCdHs- ABE #1-1 세포의 이식 이후에 간 손상이 유의하게 감소하였다는 것을 보여주었다(도 4c).
HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포의 재증식 능력을 확인하기 위해, 본 발명자들은 40일, 130일 및 180일에 HT1-mCdHs-ABE#1-1 이식 그룹의 마우스에서 Fah-양성 세포 개체군을 검사하였다. Fah-양성 세포 개체군은 이식 후 40일에 간 정맥 주변에 생착되는 것으로 확인되었다(도 5d). 130일 이후, Fah-양성 세포가 정착한 면적은 간 절편의 15%까지 증가하였고, 180일에는 거의 50%까지 추가로 증가하였으며, 이들 세포는 초기 일차 간세포와는 상이한 형상을 나타냈다(도 5d). 반면에, 일차 간세포를 이식한 그룹의 경우, 도 e에 나타낸 바와 같이 5.1% 정도의 Fah-양성 세포만이 관찰되었다. 또한, 본 발명의 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포를 이식하고, 치료효과를 확인한 다음, 다시 분리하여 mRNA 발현을 확인하였을 때에, 도 5f에 나타낸 바와 같이, 유전자 발현 수준이 HT1 마우스의 간과 유사하게 나타났고, 이를 통해 본 발명 세포의 in vivo에서 분화 능력을 재확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 체외에서 유전자 교정된 세포인 HT1-mCdHs-ABE#1-1이 단순히 일차 간세포를 이식하는 것보다 유의적인 대상질환 치료효과를 보여줌을 확인하였다.
또한, 방관자 아데노신의 교정없이, 목표하는 표적 아데노신(A9)만이 편집되어 있는 대립 유전자의 빈도는 180일째에 확인하였을 때, 갑자기 증가(0.2%에서 13.3%까지)하는 반면, 표적 아데노신(A9) 및 방관자 아데노신(A6) 둘 모두가 편집되어 있는 대립 유전자의 빈도는 HT1-mCdHs-ABE#1-1-이식된 마우스에서 감소(12.9%에서 0.1%까지)하는 것을 확인하였다(도 5g). 이는 교정된 대립 유전자를 함유하는 세포를 이식하는 경우, 세포 복제 동안에 간에서 우세해 지고, A6가 치환된 세포는 생체 내에서 제거됨을 의미한다.
본 발명자의 생체 외 유전자 편집 전략의 재현 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 기타 교정된 mCdHs 세포주인 HT1-mCdHs-ABE#1 및 HT1-mCdHs-ABE#2를 이용하여 실험을 반복하였다(도 4b). 본 발명자들은 HT1-mCdHs-ABE#1 이식 그룹(4마리의 마우스) 및 HT1-mCdHs-ABE#2 이식 그룹(7마리의 마우스) 내의 마우스가 또한 NTBC를 처리하지 않았음에도 130일 넘게 생존한다는 것을 확인하였다(도 5b). 또한, 간 손상을 나타내는 마커의 수준도 감소하였다(도 5c). 마찬가지로, 이들 2개의 그룹 내의 FAH-양성 세포 개체군은 HT1-mCdHs-ABE#1-1 이식 그룹과 유사한 패턴을 나타내는 것으로 관찰되었지만(도 5i 내지 도 5l), 돌연변이가 교정되어 있는 서열의 빈도가 HT1-mCdHs-ABE#1-1 그룹에서 보다 낮게 나타남을 확인하였다.
5-2. ABE에 의해 유전자 교정된 세포의 안정성 확인
상기 이식실험 중, 본 발명자는 HT1-mCdHs-ABE#1-1를 이식한 9마리의 마우스 중, 2마리와 WT-mPHs 이식한 5마리의 마우스 중, 1마리에서 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)이 발생했음을 확인하였다. 상기 간세포암이 HT1-mCdHs-ABE#1-1 세포에 의해 유발되었는지 여부를 확인하기 위하여, 간세포암 섹션의 세포에 대한 시퀀싱 분석을 수행하였을 때, 도 5h 내지 5l에 나타낸 바와 같이, 간세포암 섹션의 세포에서 본 발명의 편집기술에 의해 교정된 유전자를 확인할 수 없었으며, 이는 상기 간세포암이 기존에 Buitrago-Molina et al.(HepatologyVolume 58, Issue 3 p. 1143-1152)에서 개시하고 있는 것과 같이, NTBC가 없는 환경에서 HT1 모델 마우스에서 자연적으로 발생한 것이고, 본 발명의 편집기술에 의해 체외에서 교정된 세포는 암의 유발하지 않음을 확인하였다.
실시예 6. PE에 의해 체외 유전자 교정된 HT1-mCdHs 세포의 티로신 혈증1 치료효과 확인
ABE에 의해 교정된 세포 외에도, 프라임 편집(Prime editing, PE)에 의해 교정된 세포도 유전자 돌연변이에 의한 질환의 치료효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, PE3b를 활용한 프라임 편집된 HT1-mCdHs-PE3b 세포를 사용하여 실험을 진행하였다. 이 경우, 상기 ABE에 의한 편집과 달리, 충분한 편집 효율(평균 2.3%)을 보여주었으며, 방관자 염기의 교정 또한 거의 발생하지 않았기에, 분리된 클론 세포주가 아닌, 벌크 세포 집단을 사용하였다. 구체적으로 상기 실시예 5-1과 유사하게 도 6a에 나타낸 바와 같이, NTBC를 음용수에서 제외하여 간손상을 유도하였고, 60일째에는 완전하게 제외하였다. PBS가 주입된 마우스는 음성 대조군으로 사용하였다.
상기 대조군으로 활용된 PBS를 투여한 마우스(9마리)는 90일 전에 빠르게 사망하였다. 그러나, PE에 의해 유전자가 교정된 HT1-mCdHs-PE3b 세포를 이식한 마우스 집단(13마리) 중, 7마리의 마우스는 160일 이상 생존하였고, 이는 프라임 편집 기술을 활용하여 유전자를 교정한 본 발명의 화학유래 간선조 세포가 NTBC 없이도, HT1 질환을 유의하게 치료할 수 있음을 나타낸다(도 6b). 상기 마우스 중 140일 이상 생존한 마우스의 경우, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 혈청내 AST, ALT, T.BIL 및 ALB 바이오마커의 발현이 유의하게 감소되었고, 이를 통해 간손상이 회복되었음을 확인하였다. 140일 이상 생존한 마우스의 경우, 면역조직화학을 수행했을 때, 도 6d에 나타낸 바와 같이, Fah 양성 세포 집단이 관찰되고, 세포가 증식되는 것을 확인하였으나, PBS를 주입한 대조군의 경우, Fah 양성 세포 집단이 관찰되지 않음을 확인하였다. 또한, HT1-mCdHs-ABE#1-1 이식 마우스와 유사하게 HT1-mCdHs-PE3b 이식 마우스의 간에서 도 6e에 나타낸 바와 같이, 편집된 뉴클레오티드의 빈도가 증가함을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통하여, 본 발명자들은 생체 외 유전자 편집 전략이 마우스에서 HT1 질병의 치료를 위한 신뢰 가능하고 견고한 접근법임을 보여준다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- (a)개체로부터 세포를 단리하는 단계;
(b)상기 단리된 세포에 화합물을 처리하여 화학유래 선조세포(chemically derived projenitor cell)를 제조하는 단계; 및
(c)체외(ex vivo)에서 상기 화학유래 선조세포의 타겟 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 돌연변이 유전자가 교정된 세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 유전자를 교정하는 단계는 아데닌 염기교정 유전자가위(Adenine Base Editors) 또는 프라임 편집(Prime editing)에 의해 교정되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 교정되는 유전자는 Fah(fumarylacetoacetate hydrolase), ATP7B(ATPase copper transporting beta), SERPINA1(Serpin family A member 1), ABCB4(ATP binding cassette subfamily B member 4), ALDOB(aldolase, fructose-bisphosphate B), GBE(glycogen branching enzyme), SLC25A13(Solute Carrier Family 25 Member 13), CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance) 및 ALMS1(ALMS1 Centrosome And Basal Body Associated Protein) 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단리된 세포는 일차 간세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단리된 세포에 처리하는 화합물은 간세포 성장 인자(hepatic growth factor), A83-01 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 화학유래 선조세포(chemically derived projenitor cell)는 화학유래 간선조 세포(chemically derived hepatic projenitor cell)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제1항 내지 제6항의 어느 한 항의 방법으로 제조된 돌연변이 유전자가 교정된 세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는, 세포치료제.
- 제7항에 있어서,
상기 세포치료제는 유전자 돌연변이로 인해 유발된 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
- 제8항의 세포치료제를 포함하는, 유전자 돌연변이 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 유전자 돌연변이 관련 질환은 티로신혈증 1형(Tyrosinemia type 1), 페닐케톤뇨증(Phenylketonuria), 윌슨병(Wilson disease), 알파-1 항트립신 결핍증(Alpha-1 antitrypsin deficiency), 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형(Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3), 유전성 과당 불내증(Hereditary fructose intolerance), 글리코겐 축적 질환 4형(Glycogen storage disease type IV), 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍증(Argininosuccinate lyase deficiency), 시트린 결핍증(Citrin deficiency), 시트린 결핍에 의한 신생아 담증정체(Neonatal intrahepatic cholestasis by citrin deficiency), 콜레스테롤 에스테르 축적병(Cholesteryl ester storage disease), 낭포성 섬유증(Cystic fibrosis), 유전성 혈색소 침착증(Hereditary hemochromatosis) 및 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20200102636 | 2020-08-14 | ||
| KR1020200102636 | 2020-08-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220021883A true KR20220021883A (ko) | 2022-02-22 |
Family
ID=80247224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210107462A KR20220021883A (ko) | 2020-08-14 | 2021-08-13 | 체외에서 유전자 교정된 세포 및 이의 용도 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230303979A1 (ko) |
| KR (1) | KR20220021883A (ko) |
| WO (1) | WO2022035287A1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2922247C (en) * | 2013-08-28 | 2023-03-07 | Promethera Biosciences S.A./N.V. | Method for producing adult liver progenitor cells |
| KR102107602B1 (ko) * | 2017-05-29 | 2020-05-08 | 한양대학교 산학협력단 | 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물 |
-
2021
- 2021-08-13 KR KR1020210107462A patent/KR20220021883A/ko not_active Application Discontinuation
- 2021-08-13 WO PCT/KR2021/010828 patent/WO2022035287A1/ko active Application Filing
- 2021-08-13 US US18/021,135 patent/US20230303979A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230303979A1 (en) | 2023-09-28 |
| WO2022035287A1 (ko) | 2022-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kim et al. | Adenine base editing and prime editing of chemically derived hepatic progenitors rescue genetic liver disease | |
| US11920148B2 (en) | Compositions and methods for gene editing | |
| US11197935B2 (en) | Talen targeting blood coagulation factor VIII intron 1 inversion gene and composition for treating hemophilia comprising same | |
| US20180127786A1 (en) | Compositions and methods for gene editing | |
| JP2021182934A (ja) | アルファ１アンチトリプシン欠乏症の治療のための材料および方法 | |
| JP2021536244A (ja) | 遺伝子操作されたａｄａｒのリクルートを介したｒｎａ及びｄｎａ塩基の編集 | |
| JP2020508659A (ja) | プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｐｃｓｋ９）関連障害の処置のための組成物および方法 | |
| JP2019520079A (ja) | 疼痛関連障害を処置するための物質及び方法 | |
| KR20150080573A (ko) | 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들 | |
| KR20170103697A (ko) | 엑소좀 또는 엑소좀 유래 리보핵산을 포함하는 간섬유증 예방 또는 치료용 조성물 | |
| EP3896162A1 (en) | Artificially engineered sc function control system | |
| US20240166999A1 (en) | Hemocompatible mesenchymal stem cells, preparation method therefor and use thereof | |
| KR20220021883A (ko) | 체외에서 유전자 교정된 세포 및 이의 용도 | |
| CN115806989B (zh) | 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用 | |
| KR20230010617A (ko) | 산화스트레스 저항성을 갖는 중간엽줄기세포, 이의 제조방법 및 용도 | |
| KR20100074386A (ko) | 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 이를 이용한 간 질환 치료제 | |
| KR101658135B1 (ko) | 혈액 응고인자 ⅷ 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 및 이의 용도 | |
| KR102089088B1 (ko) | 혈액 응고인자 ⅷ의 교정용 조성물 및 이를 이용한 방법 | |
| JP2021522865A (ja) | 栄養要求性調節可能な細胞を使用する遺伝子療法の方法および組成物 | |
| NL2019517B1 (en) | New therapy for Pompe disease | |
| WO2021037234A1 (zh) | 一种高效修复环状铁粒幼细胞性贫血基因突变的方法 | |
| CN114072502A (zh) | 使用营养缺陷型可调控细胞的方法和组合物 | |
| KR20230151023A (ko) | 일차 인간 근육 줄기 세포 (위성 세포)의 시험관내 유전자 복구 방법 및 유전자 복구된 인간 근육 줄기 세포 | |
| KR20230166039A (ko) | 항응고인자 9 분비 유도만능줄기세포를 이용한 b형 혈우병 치료제 개발 | |
| Massimino | Supplementary results |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |