KR20230166039A - 항응고인자 9 분비 유도만능줄기세포를 이용한 b형 혈우병 치료제 개발 - Google Patents
항응고인자 9 분비 유도만능줄기세포를 이용한 b형 혈우병 치료제 개발 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인공 유도만능줄기세포 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 인공 유도만능줄기세포는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함하는 것이다. 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하고 있으며, 이를 통하여 상기 인공 유도만능줄기세포는 간세포로 분화된 후 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있다. 또한 본 발명은 인공 유도만능줄기세포를 포함한 B형 혈우병 치료용 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 B형 혈우병의 치료와 관련된 기술이다.
B형 혈우병은 혈액 내 혈액응고인자 9(F9) 단백질의 결핍으로 인해 혈액 응고가 일어나지 않는 X 염색체 연관 유전병이다 (Nienhuis AW 등, 2017). 혈액응고 인자는 출혈 발생 시 상처 부위의 지혈과 회복을 촉진시키는 과정에 필요한 단백질이며, 혈액 응고반응은 zymogen 형태의 serine protease를 포함하는 혈액 응고 단백질들의 일련의 연쇄 활성화 반응과 thrombin, fibrin에 의해 발생한다 (Kalafatis 등, 1997 & Green 등, 2006). F9 단백질은 혈액응고인자 8(F8) 단백질에 의해 활성을 얻어 혈액응고인자 10(F10) 단백질의 p.Arg182 - Ser 183과 p.Arg234 - Ile235 부위를 절단하여 연속적인 혈액 응고 단백질 간의 활성을 통해 혈액 응고 기전을 일으킨다. 혈우병은 혈액 내 결핍된 응고인자의 종류에 따라 A형, B형 그리고 C형 혈우병 세 가지로 구분한다 (Cawthern 등, 1998 & Bolton-Maggs 등, 2003). B형 혈우병은 전체 혈우병 환자의 약 20% 이상을 차지하며 X 염색체의 장완 Xq 27.1 - q 27.2에 존재하는 F9 유전자의 구조 이상 돌연변이에 의한 F9 단백질의 결핍으로 인해 발생한다 (Rogaev 등, 2009). B형 혈우병은 F9 유전자의 뉴클레오타이드 결손에 의한 frame-shift and splice junction changes, nonsense 혹은 missense mutation이 주요 원인이며, 돌연변이가 일어난 유전자는 정상의 F9 단백질을 생성할 수 없어 혈액 응고 반응 cascade에 문제를 보인다 (Lv 등, 2019 & Yi 등, 2020). B형 혈우병 치료를 위해 혈장에서 고순도로 분리한 F9 농축제인 혈장 분획제제나 유전자 재조합제제를 혈액에 직접 투약한다 (Kizilocak 등, 2019). 예방적 치료법의 발전과 혈액 응고 단백질의 반감기 증가로 인해 환자 기대수명은 점진적으로 증가하였지만 일부 환자에서 혈액응고 인자에 대한 항체가 형성되는 것으로 알려져 있고 말초에 발생하는 혈전과 잦은 투약횟수, 비싼 가격으로 인한 환자들의 부담이 큰 실정이다 (Monahan 등, 2015). 보다 근본적인 치료를 위해 다분화능을 지니는 유도만능 줄기세포와 clustered regularly interspaced short palindromic repeat -CRISPR associated protein 9 (이하 CRISPR-Cas9이라 함) 유전자 편집기술을 통한 혈우병 세포 치료제 연구는 부작용을 개선하고 치료 효과의 증진시킬 새로운 대안이다. (Nathwani 등, 2017; Batty 등, 2019; Morishige 등, 2020).
상기 B형 혈우병 치료와 관련된 여러 과제를 해결하기 위해,
본 명세서에서는 인공 유도만능줄기세포를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 인공 간세포를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 B형 혈우병 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 APOC3 유전자 조작용 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 인공 유도만능줄기세포 제조방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 B형 혈우병 치료방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 인공 유도만능줄기세포를 제공한다.
상기 인공 유도만능줄기세포는 인위적으로 조작된 apolipoprotein C3(APOC3) 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열, 및 제3핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 제1핵산서열은 야생형APOC3유전자의 일부 핵산서열일 수 있다.
상기 제2핵산서열은 제9혈액응고인자(Factor IX, F9) 단백질을 암호화하는 핵산서열일 수 있다.
상기 제3핵산서열은 야생형APOC3유전자에서 제1핵산서열을 제외한 부분에서의 일부 핵산서열일 수 있다.
상기 제2핵산서열은 상기 제1핵산서열과 상기 제3핵산서열의 사이에 위치할 수 있다.
상기 인공 유도만능줄기세포는 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자로부터 상기 F9 단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손(exon)1에 위치한 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 80%이상의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 인공 유도만능줄기세포는 B형 혈우병 환자의 체세포로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 인공 간세포를 제공한다.
상기 인공 간세포는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열, 및 제3핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 제1핵산서열은 야생형APOC3유전자의 일부 핵산서열일 수 있다.
상기 제2핵산서열은 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열일 수 있다.
상기 제3핵산서열은 야생형APOC3유전자에서 제1핵산서열을 제외한 부분에서의 일부 핵산서열일 수 있다.
상기 제2핵산서열은 상기 제1핵산서열과 상기 제3핵산서열의 사이에 위치할 수 있다.
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손(exon)1에 위치할 수 있다.
상기 인공 간세포는 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자로부터 상기 F9 단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 적어도 80%이상의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 인공 간세포는 B형 혈우병 환자의 체세포로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 B형 혈우병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 치료학적 유효량의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인공 유도만능줄기세포 및/또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인공 간세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 인공 유도만능줄기세포 및 인공 간세포는 F9단백질을 발현할 수 있는 것으로, B형 혈우병 치료 효과를 나타낸다.
도1은 B형 혈우병 세포치료제의 개략도로, 인공 유도만능줄기세포를 치료제의 예시로 표현했다.
도2는 F9유전자의 엑손1 또는 엑손2를 표적으로 하는 sgRNA의 설계로, 각각의 엑손을 타겟으로 하는 sgRNA에 대한 표적화된 PAM서열을 보여준다.
도3은 유전자 편집된 세포주의 single cell을 제작하기 위한 방법의 모식도이다.
도4는 FIX 녹아웃 세포주에서 유래한 단일 세포의 배양 기간동안 2일 간격으로 촬영한 현미경 사진으로, hFIX-KO 클론 #14의 단일 세포 배양을 보여준다 (바 = 100μm).
도5는 iPSC가 HLC로 분화되는 동안의 형태학적 변화로, FIX 녹아웃 세포주의 형태학적 변화(morphological change)를 보여준다 (바= 200μm).
도6은 F9 녹아웃 iPSC-HLC(FIX/KO iPSC-HLCs) 및 대조군(Con iPSC-HLCs)의 RT-PCR검사를 16,21,25, 및 32일차에 한 결과로, 간세포 마커인 HNF-4 α, CYP3A의 발현이 각각 21일차,25일차부터 확인된다.
도7은 human FIX genepcDNA3.1(+)-hFIX-human donor_Sp20-hAPOC3-I01-Sp15를 암호화(encoding)하는 도너 DNA 플라스미드의 모식도이다.
도8은 F9 유전자의 게놈 통합 검출(detecting genome integration)에 사용되는 프라이머의 표적 부위의 모식도이다.
도9는 프라이머를 사용하여 얻은 F9 넉인 세포주의 RT-PCR 분석 결과로, 3.1kb의 PCR산물이 밴드에서 관찰된다. 3.1kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 성공적으로 넉인 되었음을 나타낸다. 반면, 1.4kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 넉인이 실패되었음을 나타낸다.
도10은 프라이머를 사용하여 얻은 F9 넉인 세포주의 RT-PCR 분석 결과로, 4.7kb의 PCR산물이 밴드에서 관찰된다. 4.7kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 성공적으로 넉인 되었음을 나타낸다. 반면, 3.2kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 넉인이 실패되었음을 나타낸다.
도11은 TA 클로닝 실험의 효소 분해 결과이다.
도12는 F9 넉인 세포주의 생성을 위한 Sanger 시퀀싱 검증으로, 빨간색 상자는 삽입물(F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열)을 표시하기 위한 코돈 변경을 나타낸다.
도13은 F9 넉인 iPSC를 HLC로 분화시킨 후의 세포주의 형태학적 변화를 보여준다 (바= 200μm).
도14는 F9 넉인 iPSC-HLC의 RT-PCR 검증 결과로, iPSC-HLC에서 F9 및 간 마커(APOC3, HNF4, CYP3A)의 발현(A), iPSC, iPSC-HLC 및 HepG2에서 간 마커(AFP, TTR, HNF, Alb, CYP3A, APOC3)의 발현(B) 여부를 보여준다.
도15는 F9을 분비하는 HLC에 대한 면역세포화학적 분석결과로, 간세포 전구 세포 마커(HNF-4α, CK-18), 간세포 성숙 마커(CYP3A, Alb)를 나타낸다 (바 = 200μm).
도16은 iPSC-HLC의 조절 배지에서 분비된 F9을 측정한 그래프이다.
도17은 iPSC-HLC를 비장을 통해 NOD/SCID 마우스에 이식하는 모식도이다.
도18은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 시간에 따른 체중 변화를 확인한 그래프이다.
도19는 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 시간에 따른 혈청 내 hF9 농도를 확인한 그래프이다. ***, p<0.001 대 5.0 x 105개 세포/100㎕; **, p<0.01 대 5.0 x 105개 세포/100㎕; *, p<0.01 대 1.0 x 106개 세포/100μl.
도20은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 비장 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 한 결과로, 왼쪽부터 DPBS(그룹 1), 5.0 x 105(그룹 2), 1.0 x 106(그룹 3), 2.0 x 106(그룹 4)이다 (Bar= 200μm).
도21은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 면역 조직 화학 분석을 하여 인간 핵을 검출한 것으로, 왼쪽부터 DPBS(그룹 1), 5.0 x 105(그룹 2), 1.0 x 106(그룹 3), 2.0 x 106(그룹 4)이다 (Bar= 200μm).
도22는 세포의 수를 측정하기 위한 입체 실험(stereological experiments)의 모식도이다.
도23은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 비장 조직에서 인간 핵의 분포를 분석한 것으로, 왼쪽부터 DPBS(그룹 1), 5.0 x 105(그룹 2), 1.0 x 106(그룹 3), 2.0 x 106(그룹 4)이다 (Bar= 200μm).
도24는 투여용량을 달리하여 iPSC-HLC를 이식한 후 NOD/SCID 마우스의 비장 조직에서 검출된 인간 핵 세포의 수를 나타낸 그래프이다. ***, p<0.001 vs 5.0 x 105 cells/100 μl.
도25는 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 인간 핵(녹색)과 인간 F9(빨간색)을 염색한 결과를 나타낸 것이다 (bar = 30μm).
도26은 투여용량을 달리하여 iPSC-HLC를 이식한 후, C57BL/6FIXKO 마우스의 체중 변화를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. * BS : 수술 전, * PS : 수술 후.
도27은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 C57BL/6FIXKO 마우스에 대하여 혈청 내 hF9 수준을 측정한 그래프이다. ***, p<0.001 vs 5.0 x 105 cells/100 μl.
도28은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 C57BL/6FIXKO 마우스에 대하여 인간 핵(녹색)과 인간 F9(빨간색)을 염색한 결과를 나타낸 것이다 (bar = 30μm).
도29는 투여용량을 달리하여 iPSC-HLC를 이식한 후, C57BL/6FIXKO 마우스의 혈액 응고에 걸리는 시간을 분석한 그래프이다. ***, p<0.001 vs DPBS 100 μl; ###, p<0.001 vs 5.0 x 105 cells/100 μl.
도2는 F9유전자의 엑손1 또는 엑손2를 표적으로 하는 sgRNA의 설계로, 각각의 엑손을 타겟으로 하는 sgRNA에 대한 표적화된 PAM서열을 보여준다.
도3은 유전자 편집된 세포주의 single cell을 제작하기 위한 방법의 모식도이다.
도4는 FIX 녹아웃 세포주에서 유래한 단일 세포의 배양 기간동안 2일 간격으로 촬영한 현미경 사진으로, hFIX-KO 클론 #14의 단일 세포 배양을 보여준다 (바 = 100μm).
도5는 iPSC가 HLC로 분화되는 동안의 형태학적 변화로, FIX 녹아웃 세포주의 형태학적 변화(morphological change)를 보여준다 (바= 200μm).
도6은 F9 녹아웃 iPSC-HLC(FIX/KO iPSC-HLCs) 및 대조군(Con iPSC-HLCs)의 RT-PCR검사를 16,21,25, 및 32일차에 한 결과로, 간세포 마커인 HNF-4 α, CYP3A의 발현이 각각 21일차,25일차부터 확인된다.
도7은 human FIX genepcDNA3.1(+)-hFIX-human donor_Sp20-hAPOC3-I01-Sp15를 암호화(encoding)하는 도너 DNA 플라스미드의 모식도이다.
도8은 F9 유전자의 게놈 통합 검출(detecting genome integration)에 사용되는 프라이머의 표적 부위의 모식도이다.
도9는 프라이머를 사용하여 얻은 F9 넉인 세포주의 RT-PCR 분석 결과로, 3.1kb의 PCR산물이 밴드에서 관찰된다. 3.1kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 성공적으로 넉인 되었음을 나타낸다. 반면, 1.4kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 넉인이 실패되었음을 나타낸다.
도10은 프라이머를 사용하여 얻은 F9 넉인 세포주의 RT-PCR 분석 결과로, 4.7kb의 PCR산물이 밴드에서 관찰된다. 4.7kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 성공적으로 넉인 되었음을 나타낸다. 반면, 3.2kb PCR 밴드는 F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 넉인이 실패되었음을 나타낸다.
도11은 TA 클로닝 실험의 효소 분해 결과이다.
도12는 F9 넉인 세포주의 생성을 위한 Sanger 시퀀싱 검증으로, 빨간색 상자는 삽입물(F9 단백질을 암호화하는 핵산 서열)을 표시하기 위한 코돈 변경을 나타낸다.
도13은 F9 넉인 iPSC를 HLC로 분화시킨 후의 세포주의 형태학적 변화를 보여준다 (바= 200μm).
도14는 F9 넉인 iPSC-HLC의 RT-PCR 검증 결과로, iPSC-HLC에서 F9 및 간 마커(APOC3, HNF4, CYP3A)의 발현(A), iPSC, iPSC-HLC 및 HepG2에서 간 마커(AFP, TTR, HNF, Alb, CYP3A, APOC3)의 발현(B) 여부를 보여준다.
도15는 F9을 분비하는 HLC에 대한 면역세포화학적 분석결과로, 간세포 전구 세포 마커(HNF-4α, CK-18), 간세포 성숙 마커(CYP3A, Alb)를 나타낸다 (바 = 200μm).
도16은 iPSC-HLC의 조절 배지에서 분비된 F9을 측정한 그래프이다.
도17은 iPSC-HLC를 비장을 통해 NOD/SCID 마우스에 이식하는 모식도이다.
도18은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 시간에 따른 체중 변화를 확인한 그래프이다.
도19는 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 시간에 따른 혈청 내 hF9 농도를 확인한 그래프이다. ***, p<0.001 대 5.0 x 105개 세포/100㎕; **, p<0.01 대 5.0 x 105개 세포/100㎕; *, p<0.01 대 1.0 x 106개 세포/100μl.
도20은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 비장 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 한 결과로, 왼쪽부터 DPBS(그룹 1), 5.0 x 105(그룹 2), 1.0 x 106(그룹 3), 2.0 x 106(그룹 4)이다 (Bar= 200μm).
도21은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 면역 조직 화학 분석을 하여 인간 핵을 검출한 것으로, 왼쪽부터 DPBS(그룹 1), 5.0 x 105(그룹 2), 1.0 x 106(그룹 3), 2.0 x 106(그룹 4)이다 (Bar= 200μm).
도22는 세포의 수를 측정하기 위한 입체 실험(stereological experiments)의 모식도이다.
도23은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 비장 조직에서 인간 핵의 분포를 분석한 것으로, 왼쪽부터 DPBS(그룹 1), 5.0 x 105(그룹 2), 1.0 x 106(그룹 3), 2.0 x 106(그룹 4)이다 (Bar= 200μm).
도24는 투여용량을 달리하여 iPSC-HLC를 이식한 후 NOD/SCID 마우스의 비장 조직에서 검출된 인간 핵 세포의 수를 나타낸 그래프이다. ***, p<0.001 vs 5.0 x 105 cells/100 μl.
도25는 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 NOD/SCID 마우스에 대하여 인간 핵(녹색)과 인간 F9(빨간색)을 염색한 결과를 나타낸 것이다 (bar = 30μm).
도26은 투여용량을 달리하여 iPSC-HLC를 이식한 후, C57BL/6FIXKO 마우스의 체중 변화를 시간에 따라 나타낸 그래프이다. * BS : 수술 전, * PS : 수술 후.
도27은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 C57BL/6FIXKO 마우스에 대하여 혈청 내 hF9 수준을 측정한 그래프이다. ***, p<0.001 vs 5.0 x 105 cells/100 μl.
도28은 iPSC-HLC의 투여용량을 달리한 C57BL/6FIXKO 마우스에 대하여 인간 핵(녹색)과 인간 F9(빨간색)을 염색한 결과를 나타낸 것이다 (bar = 30μm).
도29는 투여용량을 달리하여 iPSC-HLC를 이식한 후, C57BL/6FIXKO 마우스의 혈액 응고에 걸리는 시간을 분석한 그래프이다. ***, p<0.001 vs DPBS 100 μl; ###, p<0.001 vs 5.0 x 105 cells/100 μl.
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
핵산 서열 표기
본 명세서에서 사용되는 A, T, C, G 및 U 기호는 당업계 통상의 기술자가 이해하는 의미로 해석된다. 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U) 자체로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 유리딘(U)으로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 N 기호는 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G), 및 우라실(U) 중 어느 하나로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G), 및 유리딘(U) 중 어느 하나로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
작동 가능하게 연결된(operably linked)
본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 유전자 발현 기술에 있어서, 특정 구성이 다른 구성과 연결되어, 상기 특정 구성이 의도된 방식대로 기능할 수 있도록 연결되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 서열이 암호화 서열과 작동적으로 연결되었다고 할 때, 상기 프로모터가 상기 암호화 서열의 세포 내에서의 전사 및/또는 발현에 영향을 미칠 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
표적 유전자 또는 표적 핵산
본 명세서에서 사용되는 "표적 유전자" 또는 "표적 핵산"은 기본적으로, 유전자 편집의 대상이 되는 세포 내 유전자, 또는 핵산을 의미한다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 혼용될 수 있으며, 서로 동일한 대상을 지칭할 수 있다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 달리 기재되지 않은 한, 대상 세포가 가진 고유한 유전자 또는 핵산, 혹은 외부 유래의 유전자 또는 핵산 모두를 의미할 수 있으며, 유전자 편집의 대상이 될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 및/또는 RNA일 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
표적 가닥(target strand), 비표적 가닥(non-target strand)
본 명세서에서 “표적 가닥”, 및 “비-표적 가닥”이라는 용어는, CRISPR/Cas9 복합체가 이중가닥 핵산을 표적 핵산으로 하여 작용하는 것을 서술할 때 각 가닥을 특정하기 위한 의미로 사용된다. 기본적으로, 표적 가닥과 비표적 가닥은 이중가닥 핵산의 각 가닥을 의미하며, 서로 상보적인 서열을 가진다. 여기서, 상기 비-표적 가닥은 Cas9 단백질이 인식하는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이 위치하는 가닥을 의미하고, 표적 가닥은 가이드 RNA 가 상보적으로 결합하게 되는 가닥을 의미한다. 달리 서술하면, CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산을 절단할 때, 1) Cas9 단백질이 비-표적 가닥에 존재하는 PAM 서열을 인식하고, 2) 가이드 RNA 중 표적 서열을 표적화 하도록 설계된 부분(이른바, 가이드 도메인)이 표적 가닥과 상보적으로 결합하여 복합체(duplex)를 형성하여 CRISPR/Cas9 복합체의 핵산 절단 기능이 활성화되게 된다.
또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
표적 서열(target sequence), 비표적 서열(non-target sequence)
본 명세서에서 사용되는 "표적 서열"은 CRISPR/Cas 복합체가 표적 유전자 또는 표적 핵산을 절단하기 위해 인식하는 특정 서열을 의미한다. 상기 표적 서열은 그 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 구체적으로, "표적 서열"은 표적 유전자 또는 표적 핵산 서열 내에 포함된 서열이며, 본 명세서에서 제공하는 가이드 RNA, 또는 엔지니어링 된 가이드 RNA에 포함된 가이드 도메인 서열과 상보성을 가지는 서열을 의미한다. 일반적으로, 상기 가이드 도메인 서열은 표적 유전자 또는 표적 핵산의 서열 및 CRISPR/Cas 시스템의 이펙터 단백질이 인식하는 PAM 서열을 고려하여 결정된다. 상기 표적 서열은 CRISPR/Cas 복합체의 가이드 RNA와 상보적으로 결합하는 표적 가닥에 포한 된 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "비표적 서열"은 상기 표적 서열과 상보성을 가지는 서열을 의미한다. 상기 비표적 서열은 비표적 가닥에 포함되는 서열로, 이중가닥으로 존재하는 경우, 표적 서열과 결합된 상태에 있는 것이 일반적이다. 또한, 상기 비표적 서열은 PAM 서열의 근처(adjacent)에 있다.
상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
비-상동성 말단-결합(Non-homologous end joining, NHEJ)
본 명세서에서 사용되는 "비- 상동성 말단-결합(Non-homologous end joining, NHEJ)"은 절단된 이중가닥 또는 단일가닥의 양 말단이 함께 결합함으로써 DNA 내 이중가닥 파손을 수복 또는 수선하는 방법으로, 일반적으로, 이중가닥의 파손 (예를 들어, 절단)에 의해 형성된 2 개의 적합성 말단이 빈번한 접촉을 반복하여 2 개의 말단이 완전히 결합되는 경우 파손된 이중가닥이 복구된다. NHEJ는 모든 세포 주기에서 가능한 수복 방식으로, 주로 G1 시기와 같이 세포 내에 주형으로 쓸 상동 유전체가 없을 때 발생한다. NHEJ를 이용한 손상된 유전자 또는 핵산의 수복 과정에서 NHEJ 수선 부위에 핵산 서열의 일부 삽입 및/또는 결실(인델, indel)을 초래할 수 있다. 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR)
본 명세서에서 사용되는 "상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR)"는 손상된 유전자 또는 핵산을 수선 또는 수복하기 위해 상동성을 가진 서열을 주형으로 이용하여 오류 없이 교정할 수 있는 방법으로, 일반적으로, 파손된 DNA을 수선 또는 수복하기 위해, 즉 세포가 가지고 있는 원래의 정보를 복원하기 위해, 변형이 이루어지지 않은 상보적인 염기서열의 정보를 이용하거나 자매 염색분체의 정보를 이용하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복한다. HDR의 가장 일반적인 형태는 상동성 재조합(homologous recombination, HR)이다. HDR은 통상적으로 활발하게 분열하는 세포의 S나 G2/M 시기에 주로 발생하는 수선 또는 수복 방식이다.
HDR을 이용하여 손상된 DNA를 수선 또는 수복을 하기 위해, 세포가 본래 가지는 상보적인 염기서열 또는 자매 염색분체를 이용하는 대신에, 상보적인 염기서열 또는 상동성 염기서열 정보를 이용하여 인공적으로 합성한 DNA 주형을 이용할 수 있다. 즉, 상보적인 염기서열 또는 상동성 염기서열을 포함하는 핵산 주형을 세포에 제공하여 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 수 있다. 이때, 상기 핵산 주형에 추가로 핵산 서열 또는 핵산 조각을 포함시켜 파손된 DNA를 수선 또는 수복할 때, 파손된 DNA에 추가로 포함시킨 핵산 서열 또는 핵산 조작을 삽입(Knock-In)할 수 있다. 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
PAM (Protospacer Adjacent Motif)
CRISPR/Cas9 시스템은 표적-특이적인 핵산 절단 활성을 가지는데, 이러한
표적-특이적인 핵산 절단 활성을 나타내기 위해서는 두 가지 조건이 필요하다. 첫째로, 핵산 내에 Cas9 단백질이 인식할 수 있는 일정 길이의 염기 서열이
있어야 한다. 둘째로, 상기 일정 길이의 염기 서열 주변에 가이드 RNA에 포함된 가이드 도메인과 상보적으로 결합할 수 있는 서열이 있어야 한다. 위 두 가지 조건이 만족되어 1) Cas9 단백질이 상기 일정 길이의 염기 서열을 인식하고, 2) 상기 가이드 도메인이 상기 일정 길이의 염기 서열 주변 서열 부분과 상보적으로 결합하는 경우, 핵산 절단 활성이 나타난다. 이때, 상기 Cas9 단백질에 의해 인식되는 일정 길이의 염기 서열을 Protospacer Adjacent Motif(PAM) 서열이라 한다.
상기 PAM 서열은 상기 Cas9 단백질에 따라 정해지는 고유한 서열이다. 상기Cas9 단백질의 PAM 서열을 알고 있다면, 이를 사용하여 PAM 서열 주변의 미리 결정된 표적 서열의 핵산을 표적화하는 CRISPR/Cas9 시스템을 설계할 수 있다.
조작된
본 명세서에서 사용되는 "조작된" 이란 용어는 자연계에서 이미 존재하는 구성을 가진 물질, 분자 등과 구분하기 위해 사용하는 용어로, 상기 물질, 분자 등에 인위적인 변형이 가해진 것을 의미한다. 예를 들어, "조작된 유전자"의 경우, 자연계에 존재하는 유전자의 구성에 인위적인 변경이 가해진 유전자를 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
야생형
본 명세서에서 사용되는 "야생형"이란 용어는 자연적으로 발생하는 염기서열을 포함하는 유전자 및 그 유전자로부터 발현되는 단백질이 정상적인 기능적 특성을 지니는 것을 의미한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰된다. 본 명세서에서 "야생형"이라는 용어가 조작된(또는 인위적으로 조작된) 유전자, 및/또는 세포와 대비해 사용된다면, 이는 인위적으로 조작된 유전자, 및/또는 세포와 상응하는 동종의 "인위적으로 조작되지 않은" 자연적으로 발생하는 염기서열을 포함하는 유전자 및 이를 가지는 세포를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
발현 수준(expression level)
본 명세서에서 사용되는 "발현 수준"이라는 용어는, 특정 유전자로부터 발현된 산물, 예를 들어 mRNA 및/또는 단백질이 얼마나 잘 발현되는지를 의미한다. 일반적으로 세포 내 특정 유전자의 발현 수준이 높은 경우, 세포 내에 포함된 상기 특정 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 특정 단백질의 양, 또는 세포질 내 상기 발현 산물의 농도가 높은 것으로 나타난다. 반대로 세포내 특정 유전자의 발현 수준이 낮은 경우, 세포 내에 포함된 상기 특정 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 특정 단백질의 양, 또는 세포질 내 상기 발현 산물의 농도가 낮은 것으로 나타난다. 본 명세서에서 "발현 수준이 높다" 혹은 "발현 수준이 낮다"고 쓰는 경우, 비교 대상이 달리 명시되지 않는 한, 그 비교 대상은 동종의, 야생형의 세포라고 해석할 수 있다. 또한, 비교 기준이 되는 정량적인 지표는 문맥 상 가장 적합한 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 각 세포의 절대량, 상대량, 및/또는 농도가 비교 기준이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 제1세포 내에서 a유전자의 발현 수준이, 제2세포 내에서 a유전자의 발현 수준보다 높다고 표현하는 경우, 제1세포 내의 a유전자의 발현 산물(mRNA, 단백질 등)이 제2세포 내의 a유전자의 발현 산물보다 절대량이 더 많거나, 상대량이 더 많거나, 및/또는 농도가 더 높을 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
혈우병
개괄
혈우병은 출혈 발생 시 상처 부위의 지혈과 회복을 촉진시키는 과정에 필요한 항응고 단백질의 결핍으로 인해 발생하는 질병이다. 항응고 단백질로는 제8혈액응고인자(Factor VIII, F8) 단백질. 제9혈액응고인자(Factor IX, F9) 단백질, 제10혈액응고인자(Factor X, F10) 단백질 등이 포함되어 있다. 항응고 단백질과 관련하여 혈액 응고 기전을 살펴보면, F9 단백질은 F8 단백질에 의해 활성을 얻어 F10 단백질의 p.Arg182 - Ser 183 과 p.Arg234 - Ile235 부위를 절단하는, 연속적인 항응고 단백질 간의 활성을 통해 혈액 응고 반응을 일으킨다. 따라서 F8,9,10 단백질 중 어느 하나라도 결핍되면, 혈액 응고 반응에 문제가 발생하여 출혈 발생 시 상처 부위의 지혈과 회복에 지연이 생기게 된다. 상기 F8단백질이 결핍된 경우를 A형 혈우병, 상기 F9단백질이 결핍된 경우를 B형 혈우병으로 분류된다. 본 발명은 B형 혈우병의 치료제에 대한 것이다.
B형 혈우병
B형 혈우병은 F9 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 결손에 의한 frame-shift and splice junction changes, nonsense 혹은 missense mutation 이 주요 원인이며, 돌연변이가 일어난 유전자는 정상의 F9 단백질을 생성할 수 없어 혈액이 응고되지 않는 치명적인 유전 질환이다. F9 단백질을 생성할 수 없는 B형 혈우병의 치료방식은 F9단백질을 투여하는 것이 일반적이다.
종래기술의 한계점
기존 B형 혈우병 치료제
기존 B형 혈우병 치료제는 F9 단백질의 농축제인 혈장 분획제제나 유전자조작기술을 이용하여 제조되는 F9단백질을 유효성분으로 하는 유전자 재조합 제제이다. 이를 이용한 치료방법은 혈장에서 고순도로 분리한 F9 단백질의 농축제인 혈장 분획제제나 유전자 재조합제제를 혈액에 직접 투약하는 방법이다.
기존 B형 혈우병 치료제의 문제점
혈장에서 고순도로 분리한 F9 단백질의 농축제인 혈장 분획제제 또는, 유전자조작기술을 이용하여 제조되는 유전자조작기술을 이용하여 제조되는 F9단백질을 유효성분으로 하는 유전자 재조합제제를 이용한 기존의 치료는 외부에서 제조한 F9단백질을 B형 혈우병 환자에게 투여하는 방식이다. 이러한 치료방식에 의한 혈전성 미세혈관 병증이 보고되었으며, 약 20 - 30%의 혈우병 환자에서 F9 단백질 제제에 대한 면역반응에 따른 부작용이 보고되었다. 또한, F9 단백질 제제는 짧은 반감기를 가지고, 치료비용이 비싸기 때문에 빈번한 출혈이 발생하는 B형 혈우병의 특성상 효과적인 치료법이 되기 어렵다.
본 명세서에서 개시하는 발명의 일 양태인 B형 혈우병의 치료용 조성물은 기존의 치료제의 면역문제, 짧은 반감기, 치료비용 등의 문제점을 개선한다. 상기 B형 혈우병의 치료용 조성물은 인공 유도만능줄기세포를 포함하는 것이다. 아래에서 상기 인공 유도만능줄기세포에 대하여 설명을 한다.
인공 유도만능줄기세포
인공 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 개괄
본 발명의 일 양태로 인공 유도만능줄기세포가 있다. 상기 인공 유도만능줄기세포는 인위적으로 조작된 apolipoprotein C3(APOC3) 유전자를 포함한다. 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포의 유전체는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함할 수 있다.
일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인간의 세포로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인공 간세포로 분화될 수 있다.
일 구체예로, 상기 인공유도 만능줄기세포는 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있을 수 있다.
일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인공 간세포로 분화된 후, F9 단백질을 발현할 수 있다.
인공 유도만능줄기세포의 구성1 - 인위적으로 조작된 APOC3유전자
본 발명의 인공 유도만능줄기세포는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함한다. 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포의 유전체는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함한다. 다른 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함하는 게놈DNA를 포함한다.
상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 야생형 APOC3 유전자에 비하여, F9 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 야생형 APOC3 유전자에 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열이 삽입된 것일 수 있다.
인공 유도만능줄기세포의 구성2 - 인간의 세포 유래
일 양태로, 본 발명의 인공 유도만능줄기세포는 인간의 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 B형 혈우병 환자의 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 인공 유도 만능줄기세포는 B형 혈우병 환자의 체세포로부터 유래된 것일 수 있다. 이때, 상기 B형 혈우병 환자의 세포는 F9 단백질을 발현하지 못한다.
인공 유도만능줄기세포의 특징1 - 인공 간세포로 분화될 수 있는 능력
일 양태로, 본 발명의 인공 유도만능줄기세포는 인공 간세포로 분화될 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 체외(in vitro)에서 인공 간세포로 분화될 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 체내(in vitro)에서 인공 간세포로 분화될 수 있다. 다른 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 B형 혈우병 환자에게 주입된 후 인공 간세포로 분화될 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 B형 혈우병 환자의 간 조직에 생착한 후, 인공 간세포로 분화될 수 있다.
인공 유도만능줄기세포의 특징2 - F9단백질을 발현할 수 있는 능력
일 양태로, 본 발명의 상기 인공 유도만능줄기세포는 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있을 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 F9단백질을 발현할 수 있다. 다른 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 F9단백질을 발현할 수 있는 능력이 있다.
일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인공 간세포로 분화된 후 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있을 수 있다. 다른 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인공 간세포로 분화된 후 F9단백질을 발현할 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 인공 간세포로 분화된 후 F9단백질을 발현할 수 있는 능력이 있다.
일 구체예로, 상기 발현되는 F9단백질은 F9단백질을 암호화하는 핵산서열의 발현으로 인한 것일 수 있다. 다른 구체예로, 상기 발현되는 F9단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자에 포함된 서열일 수 있다. 이때, 상기 F9단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자에 포함된 서열일 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 상기 조작된 APOC3 유전자로부터 상기 F9 단백질을 발현할 수 있다. 또 다른 일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포가 발현하는 F9 단백질은 APOC3유전자에 대하여 독립적으로 발현된 단백질일 수 있다. 이때, 독립적으로 발현된다는 것은, F9 단백질이 APOC3 단백질의 일부 구성과 결합한 상태로 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 인공 유도만능줄기세포는 apolipoprotein C3의 일부 아미노산이 결합되지 않은 상태의 F9 단백질을 발현할 수 있다. 또 다른 예를 들면, 상기 인공 유도만능줄기세포가 발현하는 F9 단백질은 야생형 F9단백질과 아미노산 서열이 동일할 수 있다.
인위적으로 조작된 APOC3유전자
야생형 APOC3유전자
야생형 APOC3유전자는 인간에서 apolipoprotein C-III를 암호화하는 유전자다. apolipoprotein C-III는 간 또는 소장에서 주로 분비되며, 킬로미크론, 초저밀도 지단백질 (VLDL) 및 잔류 콜레스테롤과 같은 트리글리세라이드가 풍부한 지단백질에서 발견된다.
야생형 APOC3유전자의 특징 - 세이프 하버 사이트(safe harbor site)
상기 야생형 APOC3유전자는 간조직에서 세이프 하버 사이트이다. 세이프 하버 사이트란, 특정조직 또는 세포에서 안정적으로 유전자를 삽입할 수 있고, 삽입된 유전자의 발현이 안정적으로 되는 위치를 의미한다. 일 구체예로, 상기 야생형 APOC3유전자가 인위적으로 조작되어도, 간 조직에서 안정적으로 발현되는 성질이 유지될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인위적으로 조작된 APOC3유전자에 삽입되어 있는 F9단백질을 암호화하는 핵산서열은 간 조직에서 안정적으로 발현될 수 있다.
야생형 APOC3단백질의 구성
아래에서, 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 구성을 설명하기 위한 편의상, 야생형 APOC3단백질을 제1단백질부분 및 제2단백질부분으로 나누어 설명한다. 이때, 상기 야생형 APOC3 단백질은 제1단백질부분 및 제2단백질부분을 포함하며, 상기 야생형 APOC3단백질은 제1단백질부분 및 제2단백질부분만으로 구성된 것으로 한정되어 해석되는 것은 아니다. 상기 제1단백질부분은 상기 야생형APOC3단백질의 일부에 해당한다. 상기 제2단백질부분은 상기 야생형APOC3단백질에서 상기 제1단백질부분을 제외한 부분의 일부에 해당한다. 일 구체예로, 상기 제1단백질부분은 야생형 APOC3 단백질에서 상기 제2단백질부분과 겹치는 부분이 없을 수 있다.
인위적으로 조작된 APOC3유전자의 구성
상기 인공 유도만능줄기세포의 유전체는 인위적으로 조작된 APOC3유전자를 포함한다. 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 F9단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
설명의 편의상, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자를 제1핵산서열, 제2핵산서열 및 제3핵산서열로 나누어 설명한다. 이때, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열 및 제3핵산서열을 포함하며, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열 및 제3핵산서열만으로 구성된 것으로 한정하여 해석되는 것은 아니다.
일 구체예로, 상기 제1핵산서열은 야생형APOC3유전자의 일부에 해당하고, 상기 제3핵산서열은 야생형APOC3유전자에서 제1핵산서열을 제외한 부분의 일부에 해당할 수 있다.
다른 일 구체예로, 상기 제1핵산서열은 상기 제1단백질부분을 암호화하는 핵산서열이고, 상기 제3핵산서열은 상기 제2단백질부분을 암호화하는 핵산서열일 수 있다. 상기 제2핵산서열은 F9단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
상기 제2핵산서열은 상기 제1핵산서열과 상기 제3핵산서열의 사이에 위치한다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 5'말단에서 3'말단 방향으로 상기 제1핵산서열, 상기 제2핵산서열, 및 상기 제3핵산서열이 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 5'말단에서 3'말단 방향으로 상기 제3핵산서열, 상기 제2핵산서열, 및 상기 제1핵산서열이 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 상기 제1핵산서열, 상기 제2핵산서열, 및 상기 제3핵산서열이 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 위치한 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자는 상기 제3핵산서열, 상기 제2핵산서열, 및 상기 제1핵산서열이 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 위치한 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 제2핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3. 인트론4, 및 인트론5 중 어느 하나에 위치할 수 있다. 구체적으로, 상기 제2핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손1에 위치할 수 있다.
일 구체예로, 상기 F9단백질을 암호화하는 핵산은 다음 핵산 서열을 포함할 수 있다: 3'- GGTCCAGAGGCATGGGGACCTGGGGTGCCCCTCACAGGACACTTCCTTGCAGGAACAGAGGTGCCATGCAGCCCCGGGTACTCCTTGTTGTTGCCCTCCTGGCGCTCCTGGCCTCTGCCCGTAAGCACTTGGTGGGACTGGGCTGGGGGCAGGGTGGAGGCAACTTGGGGATCCCAGTCCCAATGGGTGGTCAAGCAGGAGCCCAGGGCTCGTCCAGAGGCCGATCCACCCCACTCAGCCCTGCTCTTTCCTCAGGAGCTTCAGAGGCCGAGGATGCCTCCCTTCTCAGCTTCATGCAGGGTTACATGAAGCACGCCACCAAGACCGCCAAGGATGCACTGAGCAGCGTGCAGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAGGCCAGGTACACCCGCTGGCCTCCCTCCCCATCCCCCCTGCCAGCTGCCTCCATTCCCACCCGCCCCTGCCCTGGTGAGATCCCAACAATGGAATGGAGGTGCTCCAGCCTCCCCTGGGCCTGTGCCTCTTCAGCCTCCTCTTTCCTCACAGGGCCTTTGTCAGGCTGCTGCGGGAGAGATGACAGAGTTGAGACTGCATTCCTCCCAGGTCCCTCCTTTCTCCCCGGAGCAGTCCTAGGGCGTGCCGTTTTAGCCCTCATTTCCATTTTCCTTTCCTTTCCCTTTCTTTCTCTTTC-5'(서열번호 1). 다른 구체예로, 상기 F9단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 1의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3. 인트론4, 및 인트론5 중 어느 하나에 위치할 수 있다. 구체적으로, 상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손1에 위치할 수 있다.
인위적으로 조작된 APOC3유전자의 특징
상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자로부터 F9단백질이 발현될 수 있다. 일 구체예로, 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자에 포함된 제2핵산서열로부터 mRNA가 전사될 수 있다. 이때, 상기 전사된 mRNA로부터 F9 단백질이 번역될 수 있다.
다음으로 본 발명의 다른 태양으로, APOC3 유전자 조작용 조성물 및 이를 이용하여 상기 인공 유도만능줄기세포를 제작하는 방법이 있다.
상기 APOC3 유전자 조작용 조성물은 인위적으로 게놈 상 APOC3 유전자의 서열에 F9 단백질을 암호화하는 서열을 삽입(insert)할 수 있는 기술을 이용한 것이다. 예를 들어, 유전자 가위(engineered nuclease) 기술을 이용하여 외부 유전자를 삽입할 수 있다.
상기 유전자 가위 기술에서의 APOC3 유전자 조작용 조성물에 사용되는 단백질은 Cas 단백질, 징크핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nuleases; ZFN) 또는 탈렌(TALEN; Tranion Activator-Like Effector Nucleases)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
상기 본 출원의 유전자 조작용 조성물의 구체적인 예로써, CRISPR/Cas시스템을 들 수 있고, 이하, 이를 중심으로 기술한다.
CRISPR/Cas 시스템
CRISPR/Cas 시스템 개괄
CRISPR/Cas 시스템은 원핵생물 유기체에서 발견되는 면역 시스템의 일종이며, Cas 단백질, 및 가이드 RNA를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "Cas 단백질" 이라는 용어는 CRISPR/Cas 시스템에서 이용되는 것으로 해석될 수 있는 뉴클레이즈(nuclease)를 총칭하는 용어이다. 이하에서는 가장 일반적으로 쓰이는 CRISPR/Cas9 시스템의 DNA 절단 과정 및 유전자 편집 과정을 간략히 설명한다.
Cas9 단백질
CRISPR/Cas9 복합체에서, 핵산을 절단하는 뉴클레이즈(nuclase) 활성을 가지는 단백질을 Cas9 단백질이라 한다. 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템 분류 상 Class 2, Type II에 해당하며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum) 유래 Cas9 단백질 등이 있다. 본 출원은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질의 변이체에 관한 것이다.
가이드 RNA
CRISPR/Cas9 복합체에서, 표적 핵산에 포함된 특정 서열을 인식하도록 CRISPR/Cas9 복합체를 유도하는 기능을 가지는 RNA를 가이드 RNA라 한다. 상기 가이드 RNA는 당 분야에서 일반적으로 crRNA 및 tracrRNA로 이루어지는 구성으로 설명될 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA의 구성을 기능적으로 나누어 크게, 1) 스캐폴드 부분, 및 2) 가이드 도메인 부분으로 나눌 수도 있다. 일반적으로, 상기 스캐폴드 부분은 tracrRNA, 반복 서열 부분(direct repeat)을 포함하며, 상기 가이드 도메인 부분 및 일부 반복 서열 부분은 crRNA에 포함된다. 상기 스캐폴드 부분은 Cas9 단백질과 상호작용하는 부분으로, Cas9 단백질과 상호작용하여 복합체를 이룰 수 있도록 하는 부분이다. 상기 스캐폴드 부분은 Cas9 단백질의 유래 미생물의 종류에 의해 서열이 결정된다. 상기 가이드 도메인 부분은, 표적 핵산 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분으로, 약 15 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다. 상기 가이드 도메인 부분은 인위적으로 변형할 수 있는 서열로서, 관심 있는 표적 뉴클레오타이드 서열에 의해 결정된다.
CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산을 절단하는 과정
CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산에 접촉하여 Cas9 단백질이 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열(PAM 서열)을 인식하고, 가이드 RNA의 일부(상기 가이드 도메인 부분)가 표적 서열과 상보적으로 결합하며, CRISPR/Cas9 복합체에 의해 상기 표적 핵산이 절단된다. 이때, Cas9 단백질이 인식하는 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM) 서열이라 하며, 이는 Cas9 단백질의 종류나 기원에 따라 결정되는 서열이다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질은 표적 핵산 내 5’-NGG-3’ 서열을 인식할 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 티미딘(T), 사이티딘(C), 구아노신(G)중 하나이다. CRISPR/Cas9 복합체가 표적 핵산을 절단하기 위해서는 가이드 RNA의 가이드 도메인 부분이 표적 서열(표적 핵산의 이중 가닥에서, PAM 서열과 인접한 부분인 비표적 서열과 상보적으로 결합하는 부분)과 상보적으로 결합해야 한다. 따라서, 상기 가이드 도메인 부분은 표적 핵산의 서열, 구체적으로는 PAM 서열과 인접한 서열에 따라 설계되어 사용된다. CRISPR/Cas9 복합체가 상기 표적 핵산을 절단할 때, 표적 핵산의 PAM 서열부분 및/또는 상기 가이드 도메인과 상보적으로 결합하는 서열을 포함하는 이중 가닥 영역 내 임의의 위치가 절단되게 된다.
표적 핵산 절단 후의 유전자 편집 과정
CRISPR/Cas9 복합체가 상기 표적 핵산을 절단할 때, 표적 핵산의 PAM 서열 부분 및/또는 상기 가이드 도메인과 상보적으로 결합하는 서열 부분 내 임의의 위치가 절단되게 된다. 상기 CRISPR/Cas9 복합체에 의하여, 표적 핵산에서 이중 가닥 절단(Double-strand break, DSB)이 발생한 부분은, 상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR) 또는 비-상동성 말단-결합(non-homologous end joining, NHEJ) 등의 메커니즘(mechanism)을 통하여 수선될 수 있다. HDR에 의하여 수선된 경우, 외부 핵산서열의 삽입(insertion)이 일어날 수 있다. 이때, 외부 핵산서열이란, 도너를 통하여 세포 내로 운반한 핵산서열을 의미한다. 일 구체예로, 상기 외부 핵산서열은 도너의 일부 핵산 서열과 적어도 80% 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
NHEJ에 의하여 수선된 경우, 짧은 유전자 단편의 치환, 삽입 또는 결실을 야기하고, 해당 유전자의 넉아웃(knock-out)이 일어날 수 있다.
APOC3 유전자 조작용 조성물의 예시 - CRISPR/Cas9 조성물
개괄
본 발명의 일 양태로, APOC3 유전자 조작용 조성물이 있다. 상기 APOC3 유전자 조작용 조성물은 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 APOC3 유전자를 편집할 수 있는 구성을 가질 수 있다. 상기 유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산, 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 도너를 포함할 수 있다.
APOC3 유전자 조작용 조성물 구성요소1 - Cas9 단백질
본 발명의 APOC3 유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다. 이때, 상기 Cas9 단백질은 자연계에 존재하는 Cas9 단백질이거나, 자연계에 존재하는 Cas9 단백질에서 하나 이상의 도메인이 인위적으로 변형된 Cas9 단백질일 수 있다.
일 구체예로, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 또는 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum) 유래 Cas9 단백질일 수 있다. 일 구체예로, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질(spCas9 단백질)일 수 있다.
APOC3 유전자 조작용 조성물 구성요소2 - 가이드 RNA
본 발명의 APOC3 유전자 조작용 조성물은 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다. 이때, 상기 가이드 RNA의 표적 유전자는 APOC3 유전자이다.
상기 가이드 RNA는 스캐폴드 부분, 및 가이드 도메인 부분을 포함한다. 일반적으로, 상기 스캐폴드 부분은 tracrRNA, 및 반복 서열 부분(direct repeat)을 포함하며, 상기 가이드 도메인 부분 및 일부 반복 서열 부분은 crRNA에 포함된다. 일 구체예로, 상기 crRNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 가이드 도메인 부분 및 반복 서열 부분이 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 상기 가이드 도메인은, 표적 핵산 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분이다. 상기 가이드 도메인 부분은, 표적 핵산 내 일정 길이의 뉴클레오타이드 서열 부분과 상보적으로 결합할 수 있는 부분으로, 약 15 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다. 상기 가이드 도메인은 인위적으로 변형할 수 있는 서열로서, 관심 있는 표적 뉴클레오타이드 서열에 의해 결정된다. 상기 스캐폴드 부분은 Cas9 단백질과 상호작용하는 부분으로, Cas9 단백질과 상호작용하여 CRISPR/Cas9 복합체를 형성할 수 있다.
일 구체예로, 상기 가이드 RNA는 APOC3 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3, 인트론4, 및 인트론5 중 어느 하나를 표적으로 할 수 있다. 구체적으로는 상기 가이드 RNA는 APOC3 유전자의 엑손1을 표적으로 할 수 있다.
일 구체예로, 상기 가이드 RNA의 가이드 도메인의 서열은 다음 서열을 포함할 수 있다: 5'-GCGAGGGAUCGAGGCCCAAA -3'(서열번호 2) 또는5'-AAACCCGGAGCUAGGGAGCG -3' (서열번호 3). 다른 일 구체예로, 상기 가이드 도메인의 서열은 서열번호 2 또는 서열번호3의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 상기 가이드 RNA의 스캐폴드 부분은 다음 서열을 포함할 수 있다: 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG -3'(서열번호 4) 또는5'-GCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUG -3'(서열번호 5). 다른 일 구체예로, 상기 스캐폴드 부분의 서열은 서열번호 4 또는 서열번호5의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas9 시스템 구성요소의 포함 형태
상기 APOC3 유전자 조작용 조성물 내에 포함된 CRISPR/Cas 시스템의 각 구성요소의 형태는 상기 APOC3 유전자 조작용 조성물이 세포 내에 도입되는 경우, CRISPR/Cas 복합체가 형성되어 APOC3 유전자를 인위적으로 조작할 수 있도록 하는 형태라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구체예로, 상기 APOC3 유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산이 포함된 벡터를 가지고 있을 수 있다.
일 구체예로, 상기 벡터는 발현 조절 요소, 선별 요소 등을 포함할 수 있다. 상기 발현 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides) 또는 복제원점(replication origin) 등일 수 있다. 상기 선별 요소는 형광 단백질 유전자, 태그(tag), 리포터 유전자, 항생제 내성 유전자 등일 수 있다.
일 구체예로, 상기 벡터는 플라스미드 및/또는 바이러스 벡터일 수 있다. 일 구현예로, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 비바이러스 벡터일 수 있다. 일 구체예로, 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 및 mRNA로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 플라스미드는 pcDNA 시리즈, pS456, p326, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, 및 pUC19으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 파지는 λgt4λB, λ-Charon, λ△z1, 및 M13으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 암호화 핵산은 PCR 앰플리콘(amplicon)일 수 있다.
상기 APOC3 유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA를 포함하고, 상기 Cas9 단백질과 상기 가이드 RNA는 리보뉴클레오프로테인(ribonucleoprotein, RNP) 형태로 존재할 수 있다. 일 구체예로, 상기 HR 유전자 조작용 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA가 결합된 리보뉴클레오프로테인(RNP, ribonucleoprotein)을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 상기 APOC3 유전자 조작용 조성물은 다음의 1) 내지 4)의 구성 중 어느 하나 이상의 구성을 포함할 수 있다: 1) Cas9 단백질 및 가이드 RNA; 2) Cas9 단백질를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA; 3) Cas9 단백질를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 4) Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 암호화하는 핵산.
구체적으로는 상기 CRISPR/Cas9 조성물은 SpCas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다.
APOC3 유전자 조작용 조성물 구성요소3 - 도너(donor)
본 발명의 APOC3 유전자 조작용 조성물은 도너를 포함할 수 있다. 상기 도너는 유전자 편집 과정에 따라 손상된 표적 유전자 또는 손상된 표적 핵산의 상동성 재조합 복구(homology-directed repair:HDR)을 통한 수복을 돕는 핵산서열을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 도너는 APOC3 유전자에 삽입되기 위한 핵산서열을 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 도너는 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다.
일 구체예로, 상기 도너는 핵산서열을 삽입하고자 하는 위치, 예를 들어, 상기 손상된 표적 핵산(구체적으로, APOC3 유전자의 핵산)의 절단 위치에서, 5'방향(upstream), 및/또는 3'방향(downstream)으로의 일부 염기서열과 각각 상동성을 가지는 핵산서열(상동성 암, homology arm)을 포함할 수 있다. 이때, 삽입하고자 하는 핵산서열(구체적으로, F9 단백질을 암호화하는 핵산서열)은 타겟의 절단 부위를 중심으로, 5'방향의 염기서열과 상동성을 가지는 핵산서열 및 3'방향의 염기서열과 상동성을 가지는 핵산서열 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상동성을 가지는 핵산서열은 표적 핵산의 5'방향(upstream), 및/또는 3'방향(downstream)의 염기서열과 최소한50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖거나 또는 완전하게 상동성을 가질 수 있다. 이 때, 상동성 암(homology arm) 각각의 사이즈는 당업자가 적절하다고 판단되는 길이로 설계할 수 있다.
인공 유도만능줄기세포를 제작하는 방법
개괄
본 발명의 일 양태로 인공 유도만능줄기세포를 제작하는 방법이 있다. 상기 방법은 유도만능줄기세포에 APOC3 유전자 조작용 조성물을 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 방법은 체세포를 상기 유도만능줄기세포로 역분화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 방법은 체세포를 유도만능줄기세포로 역분화시킨 후, 역분화된 유도만능줄기세포에 APOC3 유전자 조작용 조성물을 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법에 대한 일 실시예로, 상기 체세포는 B형 혈우병 환자의 체세포일 수 있다. 다른 실시예로, 상기 체세포는 F9 단백질을 발현할 수 없는 체세포일 수 있다.
유도만능줄기세포로의 역분화
일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포를 제작하는 방법은 체세포를 유도만능줄기세포로 역분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 역분화 단계는 체세포에 역분화용 조성물을 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 방법을 포함할 수 있다. 이때, 역분화용 조성물은 역분화를 유도하는 유전자를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 역분화를 유도하는 유전자는 Sox2, c-Myc, Klf4, 및 Oct4 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
APOC3 유전자 조작용 조성물의 주입
상기 인공 유도만능줄기세포를 제작하는 방법은 APOC3 유전자 조작용 조성물을 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 단계를 포함한다. 이때, 일 구체예로, 상기 APOC3 유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산, 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 도너(donor)를 포함할 수 있다.
상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은, 세포 내로 APOC3 유전자 조작용 조성물을 세포 내로 전달할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구체예로, 상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은 미세주입법, 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 및/또는 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징일 수 있다.
일 구현예로, 상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 및/또는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 나노파티클을 이용하여 전달하는 것일 수 있다. 이때, 상기 전달 방법은 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염, 및/또는 나노파티클-매개 핵산 전달(Panyam et. , al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13.pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 참조)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로, 상기 지질-매개 형질감염은 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP) 및/또는 PEG를 이용한 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 LNP는 양성자화된 이온화 지질 및/또는 중성을 나타내는 이온화 지질을 포함할 수 있다.
다른 구체예로, 상기 미세주입법은 일정한 흐름 시스템(constant flow system 또는 continuous flow injection mode), 펄스 흐름 시스템(pulsed flow system), 및/또는 pronuclear injection을 이용한 것일 수 있다.
APOC3 유전자 조작 결과 - 도너 삽입(insertion)
상기 APOC3 유전자 조작용 조성물의 주입으로 인하여 APOC3 유전자에서 이중 가닥 절단(Double-strand break, DSB)이 발생할 수 있다. 이때, DSB가 발생한 부분은 상동 재조합 수리(homology directed repairing, HDR)의 메커니즘(mechanism)을 통하여 수선될 수 있다. 이때, HDR에 의하여 수선된 경우, APOC3 유전자에 넉인(knock-in)이 발생할 수 있다. 상기 넉인은 APOC3 유전자에 F9 단백질을 암호화하는 핵산이 삽입되는 것을 의미한다.
일 구체예로, 상기 삽입되는 F9 단백질을 암호화하는 핵산은 도너에 포함된 것일 수 있다.
다음으로 본 발명의 일 태양으로, 인공 간세포에 대하여 개시한다.
인공 간세포
개괄
본 발명의 일 양태로, 인공 간세포가 있다. 상기 인공 간세포는 상기 인공 유도만능줄기세포로부터 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 간세포는 상기 인공 유도만능줄기세포가 간세포로 분화된 것일 수 있다.
인공 간세포의 구성1 - 인위적으로 조작된 APOC3유전자
본 발명의 인공 간세포는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함한다. 일 구체예로, 상기 인공 간세포의 유전체는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함한다. 다른 구체예로, 상기 인공 간세포는 인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함하는 게놈DNA를 포함한다.
상기 인공 간세포의 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 상기 <<인위적으로 조작된 APOC3유전자>> 단락에서 설명한 인위적으로 조작된 APOC3 유전자와 동일한 구성 및/또는 특성을 가질 수 있다.
인공 간세포의 구성2 - 인간의 세포 유래
일 실시예로, 본 발명의 인공 간세포는 인간의 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 간세포는 B형 혈우병 환자의 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 인공 간세포는 B형 혈우병 환자의 체세포로부터 유래된 것일 수 있다. 이때, 상기 B형 혈우병 환자의 세포는 F9 단백질을 발현하지 못한다.
인공 간세포의 특징 - F9단백질을 발현할 수 있는 능력
일 실시예로, 본 발명의 상기 인공 간세포는 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있을 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 간세포는 F9단백질을 발현할 수 있다. 다른 구체예로, 상기 인공 간세포는 F9단백질을 발현할 수 있는 능력이 있다.
일 구체예로, 상기 발현되는 F9단백질은 F9단백질을 암호화하는 핵산서열의 발현으로 인한 것일 수 있다. 다른 구체예로, 상기 발현되는 F9단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자에 포함된 서열일 수 있다. 이때, 상기 F9단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3유전자에 포함된 서열일 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 일 태양으로, B형 혈우병 치료용 약학적 조성물이 있다. 상기 약학적 조성물은 인공 유도만능줄기세포 및/또는 인공 간세포를 포함한다.
일 구체예로, 상기 인공 유도만능줄기세포는 <<인공 유도만능줄기세포>>단락에서 설명한(또는 개시된) 인공 유도만능줄기세포일 수 있다. 일 구체예로, 상기 인공 간세포는 <<인공 간세포>>단락에서 설명한(또는 개시된) 인공 간세포일 수 있다.
일 실시예로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용하는 담체를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 담체는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연; 및 이들의 적절한 조합 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
B형 혈우병 치료방법
치료방법
본 발명의 일 태양으로, B형 혈우병 치료방법이 있다. 상기 치료방법은 <<약학적 조성물>>단락에서 개시된 약학적 조성물을 치료 대상에 주입(inject) 또는 투여(administer)하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 약학적 조성물의 약학적으로 허용하는 양을 적절하게 주입 또는 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 주입 또는 투여 단계에서 치료 대상에 적절한 양의 약학적 조성물을 주입 또는 투여할 수 있다.
일 구체예로, 상기 치료 대상은 B형 혈우병 환자일 수 있다.
일 구체예로, 상기 주입 또는 투여 방법은 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)으로 수행될 수 있다.
일 구체예로, 상기 주입 또는 투여 방법은 비장내(intrasplenic), 망막하(subretinal), 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 안구내(intraocularly), 유리체내(intravitreally) 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic) 또는 복막내(intraperitoneally)에서 선택된 경로로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 주입 또는 투여 방법은 비장내 경로로 수행될 수 있다.
치료방법의 특징
일 실시예로, 본 발명의 B형 혈우병 치료방법은 반영구적인 치료효과를 보일 수 있다. 일 구체예로, F9 단백질을 치료제에 포함하는 기존의 치료에 비하여, 상기 B형 혈우병 치료방법은 반영구적인 치료효과를 보일 수 있다. 이러한 효과는, B형 혈우병 치료방법은 F9 단백질을 발현할 수 있는 인공 세포를 B형 혈우병 환자의 간에 이식하는 것이므로, 이식된 세포가 반영구적으로 F9 단백질을 발현하기 때문으로 볼 수 있다.
일 실시예로, 본 발명의 B형 혈우병 치료방법은 면역반응 부작용이 적은 효과를 보일 수 있다. 일 구체예로, F9 단백질을 치료제에 포함하는 기존의 치료에 비하여, 상기 B형 혈우병 치료방법은 면역반응 부작용이 적은 효과를 보일 수 있다. 이러한 효과는, 상기 치료방법에 사용되는 세포가 B형 혈우병 환자의 세포로부터 유래된 경우, 환자 본인의 세포를 이식받는 것이므로, 환자의 면역체계가 이식된 세포에 반응할 확률이 낮기 때문이다. 일 구체예로, 상기 치료방법에 환자 본인의 세포를 사용하는 경우, 다른 개체 또는 다른 종의 세포를 사용하는 경우에 비하여, 환자의 면역체계가 이식된 세포에 반응할 확률이 낮기 때문에 면역반응 부작용이 적은 효과를 보일 수 있다.
발명의 가능한 실시예
이하 본 명세서에서 제공하는 발명의 가능한 실시예들을 나열한다. 본 단락에서 제공하는 이하의 실시예들은 단지 발명의 일 예시에 해당될 뿐이다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 발명을 하기 실시예로 제한하여 해석할 수 없다. 실시예 번호와 함께 기재된 간략한 설명 또한, 각 실시예 간 구분의 편의를 위한 것일 뿐 본 명세서에서 개시하는 발명에 대한 제한으로 해석될 수 없다.
인공 유도만능줄기세포
실시예1, 인공 유도만능줄기세포
인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함하는 인공 유도만능줄기세포.
실시예2, 조작된 APOC3유전자의 위치
실시예1에 있어서, 상기 인공 유도만능줄기세포의 유전체(또는 게놈DNA)는 상기 조작된 APOC3유전자를 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예3, 조작된 APOC3 유전자의 구성1
실시예1 내지 2에 있어서, 상기 조작된 APOC3 유전자는 F9단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예4, 조작된 APOC3 유전자의 구성2
실시예1 내지 3에 있어서, 상기 조작된 APOC3 유전자의 핵산서열은 야생형 APOC3유전자에서 F9단백질을 암호화하는 핵산서열이 삽입된 핵산서열인 것을 특징으로 함.
실시예5, 조작된 APOC3 유전자의 구성3
실시예1 내지 4에 있어서, 상기 조작된 APOC3 유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열, 및 제3핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예6, 제2핵산서열
실시예5에 있어서, 상기 제2핵산서열은 F9단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예7, 제1핵산서열
실시예5 내지 6에 있어서, 상기 제1핵산서열은 야생형 APOC3 유전자의 핵산서열의 일부인 것을 특징으로 함.
실시예8, 제3핵산서열
실시예5 내지 7에 있어서, 상기 제3핵산서열은 야생형 APOC3 유전자의 핵산서열의 일부인 것을 특징으로 함.
실시예9, 제1핵산서열과 제3핵산서열
실시예5 내지 8에 있어서, 상기 제3핵산서열은 야생형 APOC3 유전자의 핵산서열에서 제1핵산서열을 제외한 부분의 일부인 것을 특징으로 함.
실시예10, 제1핵산서열
실시예5 내지 6에 있어서, 상기 제1핵산서열은 야생형 APOC3 단백질의 일부인 제1단백질 부분을 암호화하는 핵산서열인 것을 특징으로 함.
실시예11, 제3핵산서열
실시예10에 있어서, 상기 제3핵산서열은 야생형 APOC3 단백질에서 제1단백질 부분을 제외한 부분의 일부인 제2단백질 부분을 암호화하는 핵산서열인 것을 특징으로 함.
실시예12, 제1,2,3핵산서열의 순서
실시예5 내지 11에 있어서, 상기 제2핵산서열은 상기 제1핵산서열과 상기 제3핵산서열 사이에 위치한 것을 특징으로 함.
실시예13, F9 핵산서열
실시예3 내지 12에 있어서, 상기 F9단백질을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
실시예14, F9단백질 발현1
실시예1 내지 13에 있어서, 상기 인공 유도만능줄기세포는 간세포로 분화된 후 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 함.
실시예15, F9단백질 발현2
실시예1 내지 14에 있어서, 상기 인공 유도만능줄기세포는 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 함.
실시예16, F9단백질 발현3
실시예1 내지 15에 있어서, 상기 인공 유도만능줄기세포는 간세포로 분화된 후 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있으며, 이때 발현된 F9단백질은 APOC3단백질과는 독립적으로 발현된 것을 특징으로 함.
실시예17, F9단백질 발현4
실시예14 내지 16에 있어서, 상기 발현된 F9단백질은 상기 조작된 APOC3유전자에 포함된 F9단백질을 암호화하는 핵산서열로부터 발현된 것을 특징으로 함.
실시예18, 인간세포유래
실시예1 내지 17에 있어서, 상기 인공 유도만능줄기세포는 B형 혈우병 환자의 세포로부터 유래된 것을 특징으로 함.
인공 간세포
실시예19, 인공 간세포
조작된 APOC3유전자를 포함하는 인공 간세포.
실시예20, 인공 유도만능줄기세포 유래
실시예19에 있어서, 상기 인공 간세포는 실시예1 내지 18 중 어느 하나의 인공 유도만능줄기세포가 분화된 간세포인 것을 특징으로 함.
실시예21, F9단백질 발현1
실시예19 내지 20에 있어서, 상기 인공 간세포는 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 함.
실시예22, F9단백질 발현2
실시예19 내지 21에 있어서, 상기 인공 간세포는 F9단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있으며, 이때 발현된 F9단백질은 APOC3단백질과는 독립적으로 발현된 것을 특징으로 함.
실시예23, F9단백질 발현3
실시예21 내지 22에 있어서, 상기 발현된 F9단백질은 상기 조작된 APOC3유전자에 포함된 F9단백질을 암호화하는 핵산서열로부터 발현된 것을 특징으로 함.
약학적 조성물
실시예24, 약학적 조성물
실시예1 내지 18 중 어느 하나의 인공 유도만능줄기세포 및/또는 실시예19 내지 23 중 어느 하나의 인공 간세포의 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물.
실시예25, 약학적 조성물의 용도
실시예24에 있어서, 상기 약학적 조성물은 B형 혈우병 치료에 사용되는 것을 특징으로 함.
실시예26, 약학적 조성물의 효과
실시예24 내지 25에 있어서, 상기 약학적 조성물은 B형 혈우병 환자에게 투여되면 환자의 체내에서 F9단백질이 발현되도록 하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
실시예27, 담체1
실시예24 내지 26에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용하는 담체를 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예28, 담체2
실시예24 내지 27에 있어서, 상기 담체는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 지방유와 같은 액체 담체; 멸균된 수용액; 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌글리콜; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르; 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연; 및 이들의 적절한 조합 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 함.
B형 혈우병 치료방법
실시예29, B형 혈우병 치료방법
실시예24 내지 28 중 어느 하나의 약학적 조성물을 B형 혈우병 환자에게 투여하는 방법을 포함하는 B형 혈우병 치료방법.
실시예30, 투여용법1
실시예29에 있어서, 상기 투여 방법은 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)으로 수행되는 것을 특징으로 함.
실시예31, 투여용법2
실시예29 내지 30에 있어서, 상기 투여 방법은 비장내(intrasplenic), 망막하(subretinal), 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 안구내(intraocularly), 유리체내(intravitreally) 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic) 또는 복막내(intraperitoneally)에서 선택된 경로로 수행되는 것을 특징으로 함.
APOC3 유전자 조작용 조성물
실시예32, APOC3 유전자 조작용 조성물
다음을 포함하는 APOC3 유전자 조작용 조성물:
Cas9 단백질 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산;
crRNA 및 traceRNA를 포함하는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산,
여기서, 상기 crRNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로 가이드 도메인 부분 및 반복 서열 부분(direct repeat)이 순차적으로 연결된 것이고,
상기 직접 반복부 및 상기 tracrRNA는 상기 Cas9단백질의 변이체와 상호작용하여 CRISPR/Cas 복합체를 이룰 수 있는 것이고,
상기 가이드 도메인 부분은 APOC3 유전자를 표적으로 함; 및
F9단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 도너.
실시예33, Cas9 단백질
실시예32에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 또는 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum) 유래 Cas9 단백질인 것을 특징으로 함.
실시예34, 가이드 RNA1
실시예32 내지 33에 있어서, 상기 가이드 RNA는 가이드 도메인 부분을 포함하며, 상기 가이드 도메인 부분은 APOC3 유전자의 엑손(exon)1, 엑손2, 엑손3, 엑손4, 인트론(intron)1, 인트론2, 인트론3, 인트론4, 및 인트론5 중 어느 하나를 표적으로 하는 것을 특징으로 함.
실시예35, 가이드 RNA2
실시예 34에 있어서, 상기 가이드 도메인 부분은 APOC3 유전자의 엑손1을 표적으로 하는 것을 특징으로 함.
실시예36, 가이드 RNA3
실시예32 내지 35에 있어서, 상기 가이드 RNA는 가이드 도메인 부분을 포함하며, 상기 가이드 도메인 부분의 서열은 서열번호 2 또는 서열번호3의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예37, 가이드 RNA4
실시예32 내지 36에 있어서, 상기 가이드 RNA는 스케폴드 부분을 포함하며, 상기 스케폴드 부분의 서열은 서열번호 4또는 서열번호5의 서열과 적어도 80%이상, 예를 들어, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 100%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예38, 조성물의 형태1
실시예32 내지 37에 있어서, 상기 조성물은 상기 Cas9 단백질 및 상기 가이드 RNA가 결합된 리보뉴클레오프로테인(RNP, ribonucleoprotein)을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예39, 조성물의 형태2
실시예32 내지 38에 있어서, 상기 조성물은 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산이 포함된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예40, 벡터의 요소1
실시예39에 있어서, 상기 벡터는 발현 조절 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
실시예41, 벡터의 요소2
실시예40에 있어서, 상기 발현 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, ITR(inverted terminal repeat), LTR(long terminal repeat), 종결자(terminator), 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 2A 자가 절단 펩타이드(2A self-cleaving peptides), 및 복제원점(replication origin) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예42, 벡터의 종류
실시예 39 내지 41에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 단순포진 바이러스, 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 및 mRNA로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 함.
인공 유도만능줄기세포 제작 방법
실시예43, 인공 유도만능줄기세포 제작 방법
실시예32 내지 42 중 어느 하나의 APOC3유전자 조작용 조성물을 유도만능줄기세포에 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 단계를 포함하는, 인공 유도만능줄기세포 제작 방법.
실시예44, 도입 방법
실시예43에 있어서, 상기 전달, 주입, 및/또는 도입 방법은 미세주입법, 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 및/또는 일시적인 세포 압축, 스퀴징, 나노파티클을 이용한 전달법, 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염, 및/또는 나노파티클-매개 핵산 전달인 것을 특징으로 함.
실시예45, 역분화 단계
실시예43 내지 44에 있어서, 상기 방법은 체세포를 상기 유도만능줄기세포로 역분화시키는 단계를 추가로 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 함.
실시예46, 역분화 단계
실시예 43 내지 45에 있어서, 상기 방법은 체세포를 유도만능줄기세포로 역분화시킨 후, 역분화된 유도만능줄기세포에 APOC3 유전자 조작용 조성물을 전달(deliver), 주입(inject), 및/또는 도입(administer)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 함.
실시예47, 체세포1
실시예45 내지 46에 있어서, 상기 체세포는 B형 혈우병 환자의 체세포인 것을 특징으로 함.
실시예48, 체세포2
실시예45 내지 47에 있어서, 상기 체세포는 F9 단백질을 발현할 수 없는 것을 특징으로 함.
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실험예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예1 실험 방법 및 재료
본 발명자는 APOC3 유전자에 F9단백질을 암호화하는 핵산서열이 넉인된 세포가 B형 혈우병 치료제로 효과가 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여 도1에 도시된 바와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로는, 야생형 인공 유도만능줄기세포(WT iPSCs)의 F9 유전자를 넉아웃시킨 후(F9 knockout iPSCs), APOC3 유전자에 F9단백질을 암호화하는 핵산서열을 넉인한 후(F9 knockin iPSCs), 간세포로 분화시킨 후 B형 혈우병 모델 마우스에 투여하였다.
위의 실험을 진행하기 위하여, 사용된 구체적인 방법 및 재료에 대하여 실험예1에서 설명한다.
실험예1.1 B형 혈우병 환자 모방 세포주 제작
실험예1.1.1 사람 유도만능 줄기세포주 및 시약 준비
사람 유도만능 줄기세포주 (hFmiPS1, Korea National Institute of Health, Korea)는 ㈜한국 줄기세포 은행 (Korea stem cell bank, Korea)에서 분양받았으며, 세포주와 관련한 정보는 표 1과 같다.
유도만능줄기세포주는 ㈜한국 줄기세포 은행에서 배양 프로토콜을 통해 안정화한 뒤, Cellartis®DEF-CS system을 이용하여 세포를 배양 및 유지하였다. 세포 배양에 사용된 시약은 표 2와 같다. 또한, 유도만능줄기세포의 FIX 유전자(F9 유전자)를 넉아웃(knock-out)하기 위하여 사용된 시약은 표 3과 같다. FIX 유전자의 넉아웃을 위한 sgRNA의 합성에 사용된 시약은 표 4와 같으며 FIX 단백질 분비량을 정량하기 위하여 human FIX ELISA kit (Cat #orb564144, byorbyt inc., UK)를 사용하였다.
| Cell line | Parental cell | Passage | Depository Authority | Cryopreservation Date |
| hFmiPS1 | Human Dermal fibroblast | 26 | Korean National Institute of Health | 2014. 07.10 |
| Reagent | Catalogue number | Company |
| mTeSR-E8 | 5990 | STEMCELLTMTechnologies Inc, Canada |
| GeltrexTM | 354234 | BD Biosciences, USA |
| PBS Dulbecco's with Ca2+ & Mg2+ | 14040133 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| PBS Dulbecco's w/o Ca2+ & Mg2+ | 14190144 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| ACCUTASETM | 07922 | STEMCELLTM Technologies Inc, Canada |
| Cellartis* DEF-CS 500 Culture System | Y30010 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| Cellartis* DEF-CS 500 Basal Medium | Y30011 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| Cellartis* DEF-CS 500 Additives | Y30016 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| Cellartis* DEF-CS 500 COAT-1 | Y30012 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| PBS Dulbecco's w/o Ca2+ & Mg2+ | 14040133 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| PBS Dulbecco's w/o Ca2+ & Mg2+ | 14190144 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| Reagent | Catalogue number | Company |
| 4D-NucleofectorTMX kit - NucleofectorTM Solution - Supplement - pmaxGFPTM Vector (1 μg/μl in 10 mM Tris pH 8.0) - Single NucleocuvetteTM (100 μl) |
V4XC-1012 |
Lonza Ltd, Swiss |
| Reagent | Catalogue number | Company |
| CloneAmpTMHifi PCR Premix | 639298 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| LoboPassTMPCR Purification kit | CMR0115 | Cosmogenetech co, Ltd., Korea |
| T7 RNA Polymerase-PlusTMEnzyme Mix - Mixture NTP(100 mM/500 μl) - T7 RNA Polymerase - T7 10x RNAP buffer - Pyrophosphatase - Rnase inhibitor - Nuclease Free water |
AM2716 |
InvitrogenTM, USA |
실험예1.1.2 Human induced pluripotent stem cells (인간 유도만능줄기세포) 배양
hFmiPS1 세포주는 geltrexTM (Cat# 354234, BD Bioscience, USA) coated 6-well-plate에 mTeSR-E8 (Cat# 5990, STEMCELL Technologies, Canada) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 세포는 이틀 간격으로 배지를 교체하였으며, mTeSR-E8 배지는 사용전 37℃에서 30분간 warm-up 한 뒤 사용하였다. 세포가 80-90% confluency를 보이면 500 μl의 ACCUTASETM (Cat# 07922, STEMCELL Technologies, Canada)을 사용하여 세포를 plate에서 분리한 뒤, 15 ml conical tube에 옮겨 담았다. 세포 수를 측량한 뒤, 300 x g, 3분간 원심분리 후, 상층액은 제거해주고 mTeSR-E8 배양액에 현탁하여 1.0 x 105 개/ml 세포를 새로운 geltrexTM (BD Bioscence) coated 6-well-plate에 나누어 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 incubator에서 보관하였다.
실험예1.1.3 Cellartis* DEF-CS 배양 시스템
Cellartis* DEF-CS COAT-1 200 μl과 DPBS (+/+) 800 μl (1:5 dilution rate)를 섞어 코팅 용액을 만들었다. 세포가 안정적으로 안착할 수 있도록 한 개의 vessel 당 9.61 cm2의 면적을 가지는 6-well-plate에 coating 제재 처리를 후 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 incubator에서 30분간 정치하였다. 코팅용액은 세포를 seeding 하기 직전에 제거하였다. 이 후, 진행되는 세포배양에는 Cellartis* DEF-CS COAT-1 50 μl과 DPBS (+/+) 950 μl (1:20 dilution rate)를 섞어 코팅 제제를 만들어 사용하였다.
실험예1.1.4 Cellartis* DEF-CS 배양액 준비
유도만능 줄기세포주의 유지를 위해서 Cellartis* DEF-CS 배양액 3 ml에 1 μl /ml의 GF-1 (1:333), 및 3 μl/ml의 GF-2 (1:1000) supplement를 섞어주었다. 계대배양시에는 DEF-CS 배양액 3 ml에 추가적인 3 μl /ml의 GF-1 (1:333), 1 μl/ml의 GF-2 (1:1000), 및 1 μl/ml GF-3 (1:1000) supplement를 섞어주었다. 사용하는 배양액은 당일에 제작하는 것을 원칙으로 하며, 사용 전에 상온에서 정치하였다.
실험예1.1.5 유도만능 줄기세포주 계대배양
세포는 광학현미경을 이용하여 관찰하였고, 사진촬영을 통해 상태를 매일 기록하였다. 계대배양시 기존의 세포배양액을 제거하고 DPBS(-/-) 1 ml을 이용하여 세포 배양액을 수세(washing)하였다. 200 μl (20 μl/cm2)의 ACCUTASETM를 cell plate vessel에 넣어준 뒤 인큐베이터에서 3분간 정치하며 세포가 바닥에서 떨어지는지 확인하였다. 세포는 Cellartis* DEF-CS 배양액을 이용하여 다시 재현탁시켰다. 세포 현탁액은 파이펫을 이용하여 단일세포로 분리될 수 있도록 수 회에 걸쳐 재현탁 시켜주었다. 앞서 진행한 바와 같이 COAT-1을 이용하여 코팅한 세포 6-well-plate에 5.0 x 104 개/cm2의 세포를 seeding 하였다. Plate는 조심스럽게 앞뒤로 흔들어 세포가 plate vessel 전체로 퍼질 수 있도록 한 뒤, 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 Incubator에서 세포를 배양하였다. 기존의 배양액은 vacuum pump를 이용하여 제거하였고, supplement가 추가된 새로운 배양액 (0.3 ml/cm2)을 culture plate에 넣어주었다. Cell culture plate는 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 Incubator에서 정치하였다.
실험예1.1.6 FIX 유전자 knock-out을 위한 sgRNA 제작
유도만능줄기세포의 X염색체에 존재하는 FIX 유전자를 넉아웃(knock-out)하기 위해 NCBI 유전자 은행에서 FIX 유전자의 서열 정보를 확인하였고, SNAP gene 프로그램을 이용하여 엑손(exon)1또는 엑손 2에 존재하는 PAM 서열(NGG)을 근처의 핵산 서열을 타겟으로 하는 10개의sgRNA 유전자 서열을 선택하였다 (표 5). sgRNA의 forward primer는 CloneAmpTM Hifi PCR premix (Cat# 639298, TaKaRa Bio, Japan)와 미리 짜여진 reverse primer 서열을 이용하여 template DNA를 제작하였다. Template는 PCR purification kit (Cat# CMR0112, Cosmogenetech, Korea)를 사용하여 정제 후 MEGAscriptTM T7 Transcription kit (Cat# AMB13345, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 sgRNA를 합성하였다. 합성된 10개의 sgRNA의 서열과 CRISPR RGEN Tools을 통해 sgRNA의 mismatch가 1 bp, 2 bp, 3bp에서 각각 일어날 경우의 수 및 형질전환 세포에서 out of frame이 발생할 확률은 다음 표 6과 같다.
| sgRNA | Exon number |
Direction | 비표적 서열 및 PAM염기서열(5’ → 3’) |
서열번호 |
| hFIX-gRNA #1 | 1 | Forward | GCAGCGCGTGAACATGATCATGG | 서열번호 32 |
| hFIX-gRNA #2 | 1 | Forward | AGGCAGATGGTGATGAGGCCTGG | 서열번호 33 |
| hFIX-gRNA #3 | 1 | Reverse | CTAAAAGGCAGATGGTGATGAGG | 서열번호 6 |
| hFIX-gRNA #4 | 1 | Reverse | TAGATATCCTAAAAGGCAGATGG | 서열번호 7 |
| hFIX-gRNA #5 | 1 | Reverse | CTACTCAGTGCTGAATGTACAGG | 서열번호 8 |
| hFIX-gRNA #6 | 2 | Reverse | TGGCCGATTCAGAATTTTGTTGG | 서열번호 9 |
| hFIX-gRNA #7 | 2 | Forward | AAATTCTGAATCGGCCAAAGAGG | 서열번호 10 |
| hFIX-gRNA #8 | 2 | Forward | CGGCCAAAGAGGTATAATTCAGG | 서열번호 11 |
| hFIX-gRNA #9 | 2 | Forward | GAGGTATAATTCAGGTAATTGG | 서열번호 12 |
| hFIX-gRNA #10 | 2 | Forward | AAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGG | 서열번호 13 |
| sgRNA Name | Mismatch | Out of frame score | |||
| 0bp | 1bp | 2bp | 3bp | ||
| hFIX-gRNA #1 | 1 | 0 | 2 | 6 | 64.3 |
| hFIX-gRNA #2 | 1 | 0 | 0 | 31 | 68.8 |
| hFIX-gRNA #3 | 1 | 0 | 0 | 19 | 56.6 |
| hFIX-gRNA #4 | 1 | 0 | 0 | 22 | 65.3 |
| hFIX-gRNA #5 | 1 | 0 | 1 | 0 | N/A |
| hFIX-gRNA #6 | 1 | 0 | 0 | 8 | N/A |
| hFIX-gRNA #7 | 1 | 0 | 0 | 6 | 52.5 |
| hFIX-gRNA #8 | 1 | 0 | 0 | 2 | 78 |
| hFIX-gRNA #9 | 1 | 0 | 0 | 0 | 79.3 |
| hFIX-gRNA #10 | 1 | 0 | 0 | 23 | 63.2 |
실험예1.1.7 single guide RNA (sgRNA) 분리 및 정제
PCR products의 정제는 LaboPASSTM PCR purification kit (Cat# CM0112, Cosmogenetech co, Ltd., Korea)을 사용하여 진행하였다. 50 μl PCR products에 PB 완충용액 250 μl를 넣고 교반 한 뒤, 상온에서 2분간 정치하였다. 이후, iso-prophanol 380 μl를 넣고 교반 한 뒤 PCR clean up column에 혼합용액을 옮긴다. 5분간 상온에서 정치한 뒤, 8,000 rpm으로 1분간 원심 분리하였다. 여과액을 버리고 wash 용액 700 μl를 넣고 13,000 rpm에서 다시 1분간 원심분리를 2회 반복 진행하였다. Column 아래 여과액을 버린 뒤 새로운 microtube에 column을 옮긴 뒤, nuclease free water 45 μl를 넣고 상온에서 5분간 정치하였다. 이후, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 정제를 완료하였다.
실험예1.1.8 CRISPR associated (Cas) protein 9 준비
50 μg의 동결건조된 Cas9 wild-type 단백질 (Cat# TGEN_CP1, Toolgene Inc, Korea)은 10 μg/ml의 농도로 glycerol 용액에 녹여 사용하였다.
실험예1.1.9 유도만능 줄기세포 FIX 유전자 knock-out 형질전환
세포 형질전환을 위해 15 μg의 Cas9 단백질과 20 μg의 sgRNA를 혼합하여 최종 농도 8 μg/μl의 농도의 혼합 용액을 만들었다. 혼합용액은 상온에서 10분간 incubation을 진행하였다. 4D-NucleofectorTM kit (Cat# V4XC-1012, Lonza, swiss)에 속해 있는 82 μl의 Nucleofector®용액과 18 μl의 Supplement를 섞어 100 μl의 single Nucleocuvette®용액을 준비하였다. 유도만능줄기세포는 ACCUTASETM (STEMCELL Technologies)를 사용하여 세포 개수를 측정하였고 2 x 105 개의 세포를 15 ml conical tube에 옮겨 담았다. 세포는 상온에서 300 x g로 5 분간 원심분리한 뒤 상층액은 제거하였다. Single nucleocuvette®용액 100 μl와 4 μl의 CRISPR-Cas9 혼합용액에 세포를 교반한 뒤 Nucleocuvette®vessels (Lonza)에 옮겨 담았다. Amaxa®4D-Nucleofector의 human embryonic cells 형질전환 코드번호인 H9을 사용하여 형질전환 하였다. 이 후, vessel을 기기에서 제거하고 얻은 세포를 2 ml의 미리 warm-up 해둔 mTeSR-E8 (STEMCELL Technologies)에 현탁하였다. 유도만능줄기세포는 배양액에 2 μl의 ROCK inhibitor (1:1000) (STEMCELL Technologies)을 섞어 72시간 배양하였다. 세포는 GeltrexTM (BD Bioscience) coated 6-well-plate에 배양시킨 뒤 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다.
실험예1.1.10 단일 세포 분리 배양
형질 전환을 마친 세포는 72시간이 지난 후 ACCUTASETM (STEMCELL Biotechnologies) 500 μl 사용하여 세포를 plate와 분리한 뒤 세포 개수를 측정하여 96개의 세포를 얻었다. 이 후, 20 ml의 mTeSR-E8 배양액에 파이펫을 이용하여 현탁하여 단일세포 상태로 분리 후, geltrexTM (BD Bioscience) coated 96-well-plate에 200 μl씩 나누어 담아 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 인큐베이터에 보관하였다. 각 well 마다 1개의 세포가 seeding 되었는지 광학 현미경을 통해 육안으로 확인하였다. 4일 뒤 단일 세포가 배양된 well에 한하여 48-well-plate로 확장하여 배양 후, 다시 4일 뒤 12-well-plate에 세포를 seeding 하였다. 총 13개의 clone을 확보하였고, 모든 세포는 매일 배양액 교체를 진행하였다.
실험예1.1.11 Genomic DNA 추출
유전자 편집을 하지 않은 유도만능줄기세포 대조군과 유전자 편집된 실험군의 DNA는 TIANamp Genomic DNA Kit (Cat# DP304, TIANGEN®, China)을 이용하여 추출하였다. 각 세포 용해액은 20 μl의 Protease K와 완전히 섞어 주었다. 200 μl의 GB 완충액을 각 샘플에 넣어주고 잘 섞은 뒤 70℃에서 10 분간 정치하였다. 이 후 200 μl의 100% 에탄올을 샘플과 섞어준 뒤, Spin Column CB3로 옮겨 12,000 rpm으로 30초간 원심 분리하였다. spin column collection tube에 모인 관류액을 버리고 다시 500 μl의 GD 완충액을 spin column CB3에 넣고 12,000 rpm으로 30초간 원심 분리하였다. Spin column collection tube에 모인 관류액을 버리고 600 μl의 PW 완충액을 spin column CB3에 넣어준 뒤, 다시 12,000 rpm으로 30초간 원심 분리하였다. 해당 과정은 총 2회 반복 진행하였다. 이 후, spin column CB3의 membrane을 건조시키기 위해 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하였다. 원심분리를 마친 spin column CB3는 1.5 ml microcentrifuge tube로 옮겨, spin column CB3 membrane 중앙에 TE 완충용액 100 μl를 넣어주었다. 3분간 정치한 뒤, 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 최종 genomic DNA를 얻었다.
실험예1.1.12 Deep Sequencing
실험군과 대조군의 각 세포에서 추출한 genomic DNA는 deep sequencing 분석을 진행하였다. Genomic DNA 조각은 Phusion®polymerase (Cat# M0530S, New England BioLabs, UK)를 이용하여 타겟 서열 부위를 증폭하였다. PCR 산물들은 Illumina MiSeq를 사용하여 paired-end sequencing을 진행하였다.
실험예1.2 F9 단백질 분비 세포주 제작
실험예1.2.1 세포 및 시약 준비
본 발명자는 F9 유전자가 넉아웃된 세포주의 APOC3 유전자에 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열(이하 "F9 핵산서열"로 기재한다.)을 넉인(knock-in)한 세포주를 제작하였다.
제작된 세포주를 Cellartis®유도만능줄기세포 culture system을 이용하여 배양하였다. 유전자 형질전환(넉인)을 마친 유도만능줄기세포는 clone selection 통해 단일세포 배양하였다. 단일 세포 배양된 형질 전환 세포는 PCR을 통해 knock-in validation을 진행하였고, agarose gel에서 DNA purification kit (Cat #CMB-007, Cosmogenetech, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 TA cloning kit(Cat # k200040, InvitrogenTM, USA)을 통해 DNA를 증폭시킨 뒤 sequencing을 진행하였다. TA cloning에 필요한 시약은 표 7과 같다.
APOC3 유전자에 F9 핵산서열을 넉인(knock-in)한 세포주의 제작 및 검증 방법은 실험예1.2.2 내지 1.2.11에 기재되어 있다.
| Reagent | Catalogue number | Company |
| pCR®2.1, linearized - ExpressLinkerTMT4DNA Ligase - 5x ExpressLinkerTMT4DNA Ligase -10x PCR Buffer -50nM dNTPs -Control DNA Template -Sterile Water -Control PCR Primer |
K200040 | Thermo Fisher Scientific, USA |
실험예1.2.2 Cellartis® DEF-CS 배양 시스템
FIX 넉아웃(knock-out) 세포주(실험예1.1에서 제작된 B형 혈우병 환자 모방 세포주)는 Cellartis® 유도만능줄기세포 Culture system을 적용하여 분화 및 배양을 하였다. 세포주는 3주간의 안정화 과정을 거쳐 Cellartis® 유도만능줄기세포 to Hepatocyte Differentiation system (Takara Bio)를 이용하여 간세포로 분화를 했다.
실험예1.2.3 Cellartis® DEF-CS culture system세포 배양 plate 코팅
Cellartis® DEF-CS COAT-1 200 μl과 DPBS (+/+) 800 μl (1:5 dilution rate)를 섞어 코팅 용액을 만들었다. 세포가 안정적으로 안착할 수 있도록 한 개의 vessel 당 9.61 cm2의 면적을 가지는 6-well-plate에 coating 제재 처리를 후 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 incubator에서 30분간 정치하였다. 코팅용액은 세포를 seeding 하기 직전에 제거해주었다. 이 후, 진행되는 세포배양에는 Cellartis DEF-CS COAT-1 50 μl과 DPBS (+/+) 950 μl (1:20 dilution rate)를 섞어 코팅 제제를 만들어 사용하였다.
실험예1.2.4 Cellartis® DEF-CS 배양액 준비
유도만능 줄기세포주의 유지를 위해서 DEF-CS 배양액 3 ml에 1 μl /ml의 GF-1 (1:333), 3 μl/ml의 GF-2 (1:1000) supplement를 섞어주었다. 계대배양시에는 Cellartis® DEF-CS 배양액 3 ml에 추가적인 3 μl /ml의 GF-1 (1:333), 1 μl/ml의 GF-2 (1:1000)과 1 μl/ml GF-3 (1:1000) supplement를 섞어주었다. 사용하는 배양액은 당일에 제작하는 것을 원칙으로 하며, 사용 전에 상온에서 정치하였다.
실험예1.2.5 유도만능 줄기세포주 계대배양
세포는 광학현미경을 이용하여 관찰하며, 사진촬영을 통해 상태를 매일 기록하였다. 계대 배양시 기존의 세포배양액을 제거하고 DPBS(-/-) 1 ml을 이용하여 세포 배양액을 수세하였다. 200 μl (20 μl/cm2)의 ACCUTASETM를 cell plate vessel에 넣어준 뒤 인큐베이터에서 3분간 정치하며 세포가 바닥에서 떨어지는지 확인하였다. 세포는 Cellartis®DEF-CS 배양액을 이용하여 다시 재현탁시켰다. 세포 현탁액은 파이펫을 이용하여 단일세포로 분리될 수 있도록 여러회에 걸쳐 재현탁 시켜주었다. 앞서 진행한 바와 같이 COAT-1을 이용하여 코팅한 세포 6-well-plate에 5 x 104 개/cm2의 세포를 seeding 하였다. Plate는 조심스럽게 앞뒤로 흔들어 세포가 plate vessel 전체로 퍼질 수 있도록 한 뒤, 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 Incubator에서 세포를 배양하였다. 기존의 배양액은 vacuum pump를 이용하여 제거해주고, supplement가 추가된 새로운 배양액 (0.3 ml/cm2)을 culture plate에 넣어주었다. Cell culture plate는 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 Incubator에서 정치하였다.
실험예1.2.6 APOC3 site를 타겟으로 하는 sgRNA 및 삽입된 F9 핵산서열 vector 제작
간세포에서 유전자 도입이 가능한 Safe harbor site인 APOC3 전사 부위에 F9 핵산서열을 knock-in하였다. APOC3 유전자는 4개의 exon으로 구성되어 있으며, 유전자의 exon 1또는 2 서열에 F9 핵산서열을 knock-in하여 APOC3 promotor를 통해 F9 핵산서열이 발현되게끔 디자인하였다. Snap gene 프로그램을 이용하여 exon 1또는 2에서 knock-in을 할 수 있는 APOC3 유전자 서열의 PAM 서열을 확인하여 sgRNA 서열을 선택하였다. sgRNA 서열은 CloneAmpTMRHifi PCR premix (TaKaRa Bio)를 이용하여 미리 제작된 reverse primer를 이용하여 template DNA를 제작하였다. Template는 PCR purification kit (COSMOGENETECH)를 사용하여 정제 후 MEGAscriptTM T7 Transcription kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 sgRNA를 합성하였다. F9 핵산서열의 donor DNA제작을 위한 complementary DNA(cDNA)는 pCMV vector에 도입하여 제작하였다 (도 2). 삽입한 F9 핵산서열은 표 8과 같다.
| Gene | Sequence |
| Optimized hFIX | GGTCCAGAGGCATGGGGACCTGGGGTGCCCCTCACAGGACACTTCCTTGCAGGAACAGAGGTGCCATGCAGCCCCGGGTACTCCTTGTTGTTGCCCTCCTGGCGCTCCTGGCCTCTGCCCGTAAGCACTTGGTGGGACTGGGCTGGGGGCAGGGTGGAGGCAACTTGGGGATCCCAGTCCCAATGGGTGGTCAAGCAGGAGCCCAGGGCTCGTCCAGAGGCCGATCCACCCCACTCAGCCCTGCTCTTTCCTCAGGAGCTTCAGAGGCCGAGGATGCCTCCCTTCTCAGCTTCATGCAGGGTTACATGAAGCACGCCACCAAGACCGCCAAGGATGCACTGAGCAGCGTGCAGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAGGCCAGGTACACCCGCTGGCCTCCCTCCCCATCCCCCCTGCCAGCTGCCTCCATTCCCACCCGCCCCTGCCCTGGTGAGATCCCAACAATGGAATGGAGGTGCTCCAGCCTCCCCTGGGCCTGTGCCTCTTCAGCCTCCTCTTTCCTCACAGGGCCTTTGTCAGGCTGCTGCGGGAGAGATGACAGAGTTGAGACTGCATTCCTCCCAGGTCCCTCCTTTCTCCCCGGAGCAGTCCTAGGGCGTGCCGTTTTAGCCCTCATTTCCATTTTCCTTTCCTTTCCCTTTCTTTCTCTTTC (서열번호 1) |
(여기서, 상기 Optimized hFIX의 서열은 5' 내지 3' 방향 또는 3' 내지 5' 방향일 수 있음)
실험예1.2.7 APOC3 promotor Site로의 F9 핵산서열 knock-in
15 μg의 Cas9 단백질과 20 μg의 sgRNA를 섞어 8 μg/μl의 농도에 1.5 μl의 Cas9 단백질과 2.5 μl의 sgRNA의 혼합 용액을 만들었다. 혼합용액은 상온에서 10분간 incubation을 진행하였다. 82 μl의 Nucleofector® (Lonza) 용액과 18 μl의 Supplement (Lonza)를 섞어 100μl의 single Nucleocuvette® (Lonza)를 준비하였다. 유도만능줄기세포는 ACCUTASETM (STEMCELL Technologies)를 사용하여 세포를 수확하여 세포 수를 측정하고 1 x 105개의 세포를 15 mL conical tube에 옮겨 담았다. 세포는 상온에서 300 x g로 5분간 원심분리한 뒤 상층액은 제거하였다. Single nucleocuvette® 용액 100 μl와 4 μl의 CRISPR-Cas9 혼합용액 그리고 4 μl의 donor DNA를 함께 섞어준 뒤 Nucleocuvette® (Lonza) vessels (Lonza)에 옮겨 담았다. 형질전환은 Amaxa® 4D-Nucleofector를 사용하여 human embryonic cells의 형질전환을 위해 H9 코드번호를 사용하여 진행하였다. 형질전환을 마친 뒤에 vessel을 기기에서 제거하고 얻은 세포를 미리 warm-up한 2ml의 DEF-CS 500 배양액에 현탁하였다. 유도만능줄기세포의 배양을 하는 동안 배양액에 3 μl/ml의 GF-1, 1 μl/ml GF-2, 1 μl/ml의 GF-3를 함께 넣어 배양하였다. 세포는 Coat-1이 코팅된 6-well plate에 배양시킨 뒤 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 인큐베이터에 보관하였다. 배양 후 3일이 경과했을 때, clonal selection을 진행하였다.
실험예1.2.8 FIX knock-in validation primer 제작
F9 핵산서열knock-in의 결과를 PCR을 통해 검정하기 위해 F9 핵산서열(또는 FIX 유전자)의 exon 2 서열이 포함된 primer를 제작하였다. 해당 서열은 BLAST/BLAT 검색을 통해 FIX 유전자의 전체 서열을 확인하고, 전체 서열은 Primer3Plus에 추가하였다. 타겟 서열 4.3 kb의 PCR product가 생성되게 제작하였다. F9 핵산서열(또는 FIX 유전자)를 타겟으로 한 Primer의 서열은 표 9와 같다.
| Primer | Sequence | Product size |
| Primer 1 _ Forward | AGGTGAACGAGAGAATCAGT (서열번호 14) | KI3.1kb |
| Primer 1 _ Reverse | TAATACGGGCTCTCAGAAGG (서열번호 15) | |
| Primer 2 _ Forward | AGGTGAACGAGAGAATCAGT (서열번호 16) | KI4.3kb |
| Primer 2 _ Reverse | GGAACAGCTTCATCCCAAAA (서열번호 17) |
실험예1.2.9 Genomic DNA 추출
대조군과 유전자 편집된 실험군의 DNA는 TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN)을 이용하여 추출하였다. 각 세포 용해액은 20 μl의 Protease K와 완전히 섞어 줬다. 200 μl의 GB 완충액을 각 샘플에 넣어주고 잘 섞은 뒤 70℃에서 10분간 정치하였다. 이 후 200 μl의 100 % 에탄올을 샘플과 섞어준 뒤, Spin Column CB3로 옮겨 12,000 rpm으로 30초간 원심 분리하였다. spin column collection tube에 모인 관류액을 버리고 다시 500 μl의 GD 완충액을 spin column CB3에 넣고 12,000 rpm으로 30초간 원심 분리하였다. Spin column collection tube에 모인 관류액을 버리고 600 μl의 PW 완충액을 spin column CB3에 넣어준 뒤, 다시 12,000 rpm으로 30초간 원심 분리하였다. 해당 과정은 총 2회 반복 진행하였다. 이 후, spin column CB3의 membrane을 건조시키기 위해 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하였다. 원심분리를 마친 spin column CB3는 1.5 ml microcentrifuge tube로 옮겨, spin column CB3 membrane 중앙에 TE 완충용액 100 μl를 넣어준다. 3분간 정치한 뒤, 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 최종 genomic DNA를 얻었다.
실험예1.2.10 TA cloning
pCR®2.1 vial을 원심분리하여 vial안의 모든 용액을 모아준다. Agarose gel로부터 추출한 50 ng의 DNA template를 2 μl 5x T4 DNA ligase reaction buffer, pCR®2.1 vector 2 μl를 넣어주고 9 μl가 되도록 distilled water를 넣었다. ligation reaction 용액을 잘 섞어준 뒤, expressLinkTM T4 DNA Ligase 1 μl를 섞어 총 10 μl의 ligation reation 용액을 만들었다. 15분간 상온에서 정치시켰다. 이 후, 50 μl의 frozen One Shot® competent cell을 상온에서 해동하여 각 transformation용 ligation reaction 2 μl와 섞어준 뒤, 30분간 얼음에 정치시켰다. Competent cell에 heat shock을 가하기 위해 30초간 42℃에 정치 후 바로 얼음으로 옮겨주었다. 이 후, 250 μl의 S.O.C. 용액을 각 vial에 섞어준 뒤, 37℃ incubator에서 225 rpm으로 1시간동안 교반하였다. 100 μl의 transformation 세포를 x-gal, 50 μg/ml의 kanamycin과 100 μg/ml의 ampicillin이 들어있는 LB agar배지에 도포한 뒤, 4℃에서 12시간동안 정치하여 colony가 증식하도록 하였다.
실험예1.2.11 Deep Sequencing
실험군과 대조군 각 세포에서 추출한 genomic DNA는 deep sequencing 분석을 위해 Phusion polymerase (New England BioLabs)를 이용하여 타겟 서열 부위를 증폭하였다. PCR 산물들은 Illumina MiSeq를 사용하여 paired-end sequencing을 진행하였다.
실험예1.3 유도만능 줄기세포 유래 간세포(유도만능줄기세포-HLCs) 분화
실험예1.3.1 세포 및 시약 준비
본 발명자는 F9(또는 FIX) knock-out 세포주(실험예1.1에서 제작된, F9 유전자가 Knock-out된 세포)를 간세포로 분화시키고자 하였다. 또한 F9(또는 FIX) knock-in 세포주(실험예1.2에서 제작된, APOC3 유전자에 F9 핵산서열이 knock-in된 세포)를 간세포로 분화시키고자 하였다. 실험예1.3에서 사용된 시약은 표 10 내지 12와 같다.
유전자 편집 후 3주간의 안정화 기간이 지난 후 간세포 분화를 진행하였으며 내배엽 분화에 필요한 시약은 표 10과 같으며 약 일주일의 시간이 소요된다. 이후, 간세포 분화에 필요한 시약은 표 11과 같다. 분화를 마친 세포 검정을 위한 immunocytochemistry에 필요한 시약은 표 12와 같다.
유도만능줄기세포를 간세포로 분화시키기 위한 방법 및 간세포로의 분화 여부를 검증하는 방법은 실험예1.3.2 내지 1.3.6에 기재되어 있다.
| Reagents | Catalogue number | Company |
| Cellartisⓡ Definitive Endoderm Differentiation Kit | Y30030 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| - 10 ml Definitive Endoderm Differentiation Coating | ||
| - 18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 0 | ||
| - 18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 1 | ||
| - 18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 2 | ||
| - 25 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 3 | ||
| - 47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 4 | ||
| - 47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 6 | ||
| PBS Dulbecco's with Ca2+ & Mg2+ | 14040133 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| PBS Dulbecco's w/o Ca2+ & Mg2+ | 14190144 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| ACCUTASETM | 07922 | STEMCELLTM Technologies Inc, Canada |
| Reagents | Catalogue number | Company |
| Cellartisⓡ Hepatocyte Differentiation Kit |
Y30050 | TaKaRa Bio Inc., Japan |
| - 25 ml Hepatocyte Thawing and Seeding Medium (1) | ||
| - 50 ml Hepatocyte Progenitor Medium (2) | ||
| - 2 x 24 ml Hepatocyte Maturation Medium Base (3A) | ||
| - 2.6 ml Hepatocyte Maturation Medium Supplement (3B) | ||
| - 3 x 50 ml Hepatocyte Maintenance Medium (4) | ||
| - 7.5 ml Hepatocyte Coating | ||
| PBS Dulbecco's with Ca2+ & Mg2+ | 14040133 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| PBS Dulbecco's w/o Ca2+ & Mg2+ | 14190144 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| ACCUTASETM | 07922 | STEMCELLTM Technologies Inc, Canada |
| Antibody | Catalogue number | Company |
| HNF-4α | ab41898 | Abcam plc, UK |
| CK-18 | ab668 | Abcam plc, UK |
| CYP3A | ab211076 | Abcam plc, UK |
| Albumin | ab15130 | Abcam plc, UK |
| Alexa fluorⓡ 488 goat anti-rabbit IgG | A32731 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| Alexa fluorⓡ 488 donkey anti-mouse IgG | A32766 | Thermo Fisher Scientific Inc, USA |
| DAKO Mayer's Hematoxylin | S3309 | Dako, Denmark |
| 496-diamidino-2-phenylindole | D9542 | Sigma-Aldrich inc., USA |
실험예1.3.2 Cellartis® DEF-CS system 내배엽 세포 분화 및 배양
세포는 광학현미경을 이용하여 관찰하며, 사진촬영을 통해 상태를 매일 기록하였다. 계대 배양시 기존의 세포배양액을 제거하고 DPBS(-/-) 1 ml을 이용하여 세포 배양액을 수세하였다. 200 μl (20 μl/cm2)의 ACCUTASETM (STEMCELL Technologies)를 cell plate vessel에 넣어준 뒤 인큐베이터에서 3분간 정치하며 세포가 바닥에서 떨어지는지 확인하였다. 세포는 Cellartis® DEF-CS 배양액을 이용하여 다시 재현탁시켰다. 세포 현탁액은 파이펫을 이용하여 단일세포로 분리될 수 있도록 여러회에 걸쳐 재현탁 시켰다. 현탁액 내 세포수를 측정하였다. 대략 1.2 x 106 개의 세포를 두 개의 cell plate well에서 얻었고 15 ml conical tube로 옮겨 상온에서 200 x g, 3분 동안 원심분리하여 세포를 conical tube 바닥면에 가라앉혔다. 상층액을 제거한 뒤에 6 ml (0.2 ml/cm2)의 Day 0 배양액을 이용하여 재현탁 시킨 뒤, 파이펫을 이용하여 단일 세포단위로 분리하였다. 세포 현탁액은 코팅된 plate의 1개의 well 당 2 ml씩 분주하였다. 세포 배양 plate는 37℃, 5% CO2, >90% 습도가 유지되는 Incubator에서 정치하였다.
실험예1.3.3 Cellartis® system 간세포 분화 및 배양
hepatocytes coating solution은 상온에서 녹여준 뒤, 0.15 ml/cm2의 양을 24-well-plate 4개의 well과 8 well-chamber에 각각 모든 바닥면에 잘 퍼지게끔 분주하였다. 세포 배양 plate는 37 ℃ 인큐베이터에서 30분간 정치하였다. Coating 용액은 내배엽으로 분화된 세포를 seeding하기 직전에 제거하였다. Hepatocyte 분화 배지, ACCUTASETM와 DPBS(-/-)는 상온에서 녹여 준비하고 10% FBS를 DPBS(-/-)에 섞어 상온에 정치하였다. 이전의 Day 6 Definitive Endoderm cell media는 vacuum pump를 이용하여 제거하였다. 모든 세포 culture plate는 준비된 DPBS(-/-)를 1 ml을 이용하여 각각 수세하고 1 ml의 ACCUTASETM (STEMCELLTM Technologies)를 이용하여 3분간 인큐베이터에 세포를 정치하여 기존의 세포 plate에서 떼어냈다. 세포 용해액은 15 ml conical tube에 옮겨 담고 세포 용해액과 같은 양의 10% FBS를 섞은 DPBS(-/-) (1:1 dilution)를 이용하여 세척을 진행하였다. 이후, 세포의 갯수를 측정한 뒤에 2 x 106 개의 세포(1.2-1.3 x 105 cells/cm2)를 새로운 15 ml conical tube에 옮겨 담은 뒤, 상온에서 300 x g, 5분간 원심분리를 진행하였다. 상층액을 제거한 뒤 7 ml의 Hepatocyte Thawing and Seeding Medium (0.5 ml/cm2)으로 재현탁시킨 뒤에 세포를 각 well에 seeding하였다. 세포 배양 plate는 37℃, 5 % CO2, >90 % 습도가 유지되는 incubator에서 정치하였다.
실험예1.3.4 Immunocytochemistry
Lab-Tek II chamber slide (Nalge Nunc Int.)를 사용하여 세포를 배양하였으며, PBS 완충용액으로 3번 수세과정 후, 차가운 Methanol을 이용하여 20분간 세포를 고정하였다. 세포는 HNF-4α (1:200, Abcam); CK-18 (1:200, Abcam); CYP3A (1:200, Abcam); Alb (1:200, Abcam)을 이용하여 염색한 뒤, 4℃에 보관하였다. 12시간 뒤에 PBS 완충용액을 이용하여 수세를 진행하였다. 수세된 세포는 Alexa fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (1:200, Thermo Fisher Scientific) 과 Alexa fluor® 488 donkey anti-mouse IgG (1:200, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 1시간 동안 상온에서 정치하였다. 세포의 핵을 염색하기 위해 DAPI (496-diamidino-2-phenylindole; 1 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 10초간 염색을 진행하였다. DAPI 염색을 마친 뒤, 다시 PBS 완충용액으로 수세하고 Vectashield mounting media (Vectashield Laboratories)를 이용하여 mount를 진행 후 커버슬립으로 마무리하였다. 염색된 세포는 LSM 700 confocal microscopy (Carl Zeiss Inc.)를 이용하여 분석하였다. 사용된 항체의 정보는 표 12와 같다.
실험예1.3.5 RNA isolation and Polymerase Chain Reaction (PCR)
세포에서 RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 추출하였고 1 μg의 정제된 RNA는 Reverse Transcription System (Takara)를 이용하여 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 모든 진행과정은 제조사의 안내에 따라 진행하였다. 증폭과정은 denaturation 94℃, 2분간 진행 후, annealing 과정은 각 primer의 Tm값에 따라 30 cycle로 진행하였다. primer의 서열과 Tm값 그리고 PCR 산물 크기에 대한 정보는 표 13과 같다. Annealing 과정 후, 94℃에서 다시 45초간 denaturation 과정을 진행한 뒤, 72℃에서 elongation 과정을 1분간 진행하였다. PCR 과정이 끝난 뒤, 1% agarose gel을 이용하여 20분간 전기영동을 진행하여 보여지는 밴드의 크기를 확인하였다.
| Genes | Product(bp) | Tm (°C) | Forward Primer | Reverse Primer |
| SOX2 | 466 | 59.9 | AGAACCCCAAGATGCACAAC (서열번호 25) | ATGTAGGTCTGCGAGCTGGT (서열번호 18) |
| OCT4 | 272 | 60.0 | AGTGAGAGGCAACCTGGAGA (서열번호 26) | GTGAAGTGAGGGCTCCCATA (서열번호 19) |
| AFP | 402 | 56.8 | TTGACTGCAATTGAGAAACC (서열번호 27) | TGTTTGGAAGCATTCAACTG (서열번호 20) |
| TTR | 412 | 59.2 | CCTTGCTGGACTGGTATTTGTG (서열번호 28) | TTCCTTGGGATTGGTGACGACAG (서열번호 21) |
| HNF-4α | 466 | 57.1 | AGTACATCCCAGCTTTCTGC (서열번호 29) | ATGAACTGGATCTGCTCGAT (서열번호 22) |
| ALB | 497 | 57 | TGAGACCAGAGGTTGATGTG (서열번호 30) | TTTTTCACAGCATTCCTTCA (서열번호 23) |
| GAPDH | 415 | 60 | ACCCAGAAGACTGTGGATGG (서열번호 31) | TGCTGTAGCCAAATTCGTTG (서열번호 24) |
실험예1.3.6 Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
세포에서 생성한 FIX 단백질의 양을 측정하기 위해 세포 배양시에 얻은 배양액을 이용하여 sandwich ELISA 방법을 활용하여 정량하였다. 세포 배양액의 경우 Amicon® Ultra-15 (Millipore)를 사용하여 배양액 속 FIX 단백질의 크기에 맞게 2회 농축 분리하였다. 세포 배양 농축액 18일, 21일, 24일의 3개 샘플을 2회 반복 실험할 수 있도록 100 μl씩 준비했다. Sandwich ELISA는 kit (Cat #orb564144, byobyt, UK)에 첨부되어 있는 제조사 안내에 따라 진행하였다. 간단하게, standard sample을 준비하고 실험 진행 전 wash buffer를 이용하여 plate를 2회 수세하였다. 실험을 하는 동안 well이 마르지 않도록 하였다. 100 μl의 standard와 sample을 각 well에 넣고 37℃에서 90분간 정치하였다. 이 후, standard와 sample을 제거하고 wash buffer로 2회 수세하였다. 100 μl의 biotin-labeled antibody working solution을 각 well에 넣고 37℃에서 60분간 정치하였다. 용액을 제거한 뒤 wash buffer로 3회 수세 한 뒤 100 μl의 SABC working solution을 각 well에 넣고 37℃에서 30분간 정치하였다. 용액을 제거한 뒤 wash buffer를 사용하여 5회 수세 후, 90 μl의 TMB substrate solution을 각 well에 넣어주고 37℃에서 15분간 정치하였다. 이 후, 50 μl stop solution을 넣고 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험예1.4 NOD/SCID 생쥐 모델에서 유도만능줄기세포-HLCs의 효능검정
실험예1.4.1 실험동물 및 시약준비
체중 28 ± 2 g의 NOD/SCID (NOD.CB17-Prkdcsscid/NCrKoat) 수컷 생쥐 24마리를 ㈜코아텍에서 구입하여 사용하였다. 실험 동물은 총 4개의 군으로 나누었다. 대조군인 DPBS 주입군 (1군)과 실험군인 5.0 x 105 cells/100 μl 유도만능줄기세포-HLCs 이식군 (2군), 1.0 x 106 cells/100 μl 유도만능줄기세포-HLCs 이식군 (3군) 그리고 2.0 x 106 cells/100 μl 유도만능줄기세포-HLCs 이식군 (4군)으로 총 4개군 24마리의 실험 동물을 사용하였다. 동물 사육은 외부와 격리된 21℃ 온도를 유지하는 사육장에서 사료와 물은 자유롭게 공급하며 사육하였다. 실험에는 비장에 세포 이식 후 일주일 단위로 혈액을 채취하여 혈중 FIX 단백질의 양을 측정하였다. 4주 후 조직을 채취하여 면역화학 염색을 통해, 이식한 세포의 생착과 유지 여부를 확인하였다.
조직 내 유도만능줄기세포-HLCs 면역화학염색을 위해 사용한 항체와 혈장 속 FIX 단백질 검출시약은 표 14와 같다.
| Antibody & Reagent | Catalogue number | Company |
| Anti-Nuclei antibody | MAB1281 | Merck Millipore, USA |
| Vectastin ABC HRP Kit | PK-6100 | Vector Laboratoires, Inc., USA |
| M.O.M Kit | PK-2200 | Vector Laboratoires, Inc., USA |
| DPX Mount solution | O6522 | Sigma-Aldrich Inc, USA |
| DAKO Mayer's Hematoxylin | S3309 | Dako, Denmark |
| hFIX ELISA Kit | orb439415 | Biorbyt Ltd.., UK |
실험예1.4.2 유도만능줄기세포-HLCs 준비
성숙단계를 마친 20일 경의 유도만능줄기세포-HLCs의 배양액을 파이펫으로 제거한 뒤, DPBS(-/-)를 이용하여 수세하였다. 수세한 세포 plate에 ACCUTASETM 1 ml을 이용하여 plate 바닥에서 세포를 떼어 내어 15 ml conical tube에 옮겨준 뒤 세포 수를 측정하였다. 총 6개의 well에서 약 1.2 x 107 개 (2.0 x 106 개/well)의 세포를 얻었고, 200 x g, 3분간 원심분리 후 상층액은 제거하였다. 세포 침전물은 DPBS에 현탁하여 필요한 세포의 수만큼 분주하여 실린지로 옮겼다.
실험예1.4.3 유도만능줄기세포-HLCs 이식
28 ± 2 g의 7주령 NOD/SCID 생쥐의 복부 좌측면에 1 cm가량 국소절개를 진행한 뒤에 비장을 복막 밖으로 노출시켰다. 준비된 세포를 1 ml 실린지에 100 μl DPBS(-/-)에 현탁시킨 세포를 비장 끝 부분에 천천히 주사하여 이식하였다. 실린지는 천천히 제거하여 비장에서 이식한 세포가 새어 나오지 않도록 하였다. 이후 출혈 부위가 있는지 파악하고 봉합을 진행하였다. 봉합 후 감염을 예방하기 위해 포비돈을 봉합 부위에 도포하였다. 수술을 마친 실험 동물은 마취가 깰 때까지 항온 매트위에 두고 상태를 관찰하였다.
실험예1.4.4 Microsampling
수술 전 꼬리 우측 정맥을 통해 300 μl의 혈액을 모든 동물에서 채취하였다. 수술 후 1 주일 마다 꼬리 정맥을 통해 혈액을 250-300 μl 채취하였고, 4 주차에는 복대동맥 (abdominal aorta)를 통해 700-1000 μl의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 얼음에 2시간 보관 후, 상온에서 2000 rpm, 20분간 원심분리를 통해 혈장을 분리하였다. 상층액으로 분리된 혈장은 -80℃에서 보관하였다.
실험예1.4.5 Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
세포에서 생성한 human FIX 단백질의 양을 측정하기 위해 실험 동물의 꼬리 정맥과 배대동맥에서 채취한 혈장과 세포 배양시에 얻은 배양액을 이용하여 sandwich ELISA 방법을 활용하여 정량하였다. 세포 배양액의 경우 Amicon® Ultra-15 (Millipore)를 사용하여 배양액 속 FIX 단백질의 크기에 맞게 농축 분리하였다. 동물 혈장은 총 0주차, 1주차, 2주차, 3주차, 4주차의 5개 주차의 동물 혈액 샘플과 세포 배양 농축액 18일, 21일, 24일의 3개 샘플을 2회 반복 실험할 수 있도록 100 μl씩 준비했다. Sandwich ELISA는 kit (byobyt)에 첨부되어 있는 제조사 안내에 따라 진행하였다. 간단하게, standard sample을 준비하고 실험 진행 전 wash buffer를 이용하여 plate를 2회 수세하였다. 실험하는 동안 well이 마르지 않도록 하였다. 100 μl의 standard와 sample을 각 well에 넣고 37℃에서 90분간 정치하였다. 이 후, standard와 sample을 제거하고 wash buffer로 2회 수세하였다. 100 μl의 biotin-labeled antibody working solution을 각 well에 넣고 37℃에서 60분간 정치하였다. 용액을 제거한 뒤 wash buffer로 3회 수세 한 뒤 100 μl의 SABC working solution을 각 well에 넣고 37℃에서 30분간 정치하였다. 용액을 제거한 뒤 wash buffer를 사용하여 5회 수세 후, 90 μl의 TMB substrate solution을 각 well에 넣어주고 37℃에서 15분간 정치하였다. 이 후, 50 μl stop solution을 넣고 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험예1.4.6 Immunohistochemistry
채취한 조직은 PBS 완충용액으로 수세 후, 4% PFA 용액에 2 일간 넣어 조직을 고정하였다. 고정된 조직은 embedding 과정을 거쳐 paraffin 블록으로 제작하였고, 7 μm의 두께로 절삭하여 코팅 슬라이드 글라스에 올려 건조시켰다. 슬라이드는 xylene 용액에 5분간 정치한 뒤, 100% 에탄올 5분간 2회, 90% 에탄올 5분 1회, 80% 에탄올 5분 1회, 70% 에탄올 5분 1회 정치 후 흐르는 물에 10분간 수세 작업을 진행하였다. 수세과정을 마친 조직 슬라이드는 MOM Kit (Vector Labs)를 사용하여 blocking 작업을 진행하였고, 희석된 anti-Nuclei antibody (1:200 dilution rate),(Cat# MAB1281, Merck Milipore, USA) 항체와 하루동안 4℃ 냉장고에 정치하였다. 12시간 후, 슬라이드는 2시간 동안 상온에 다시 정치시킨 뒤, PBS 완충용액을 이용해 수세를 진행하였다. 수세한 슬라이드는 peroxidase anti-mouse 항체를 붙여 2시간 동안 상온에 정치하였다. PBS 완충용액을 이용해 5분간 3회씩 수세를 진행한 뒤, 0.05% 의 3,3'-Diaminobenzidine (DAB),(Cat# D9542, Sigma-Aldrich, USA) 300 ml을 이용하여 2분간 발색반응을 진행하였다. 발색을 완료한 슬라이드는 Mayer’s hematoxylin (1:4 dilution rate) (Cat# S3309, Dako, Denmark)를 이용하여 23초간 염색을 진행한 뒤 수세하여 핵에 대한 염색을 마쳤다. 염색을 마친 슬라이드는 DPX mount solution (Sigma-Aldrich)를 이용하여 마무리하였다.
실험예1.4.7 Stereology 분석
동물에서 얻은 장기 조직은 파라핀 블록으로 제작하여 7 μm의 두께로 절삭을 진행하였다. 모든 슬라이드는 140 μm 간격으로 절삭하여 한 조직당 5개의 슬라이드를 골라 조직 전체를 촬영하였다. 촬영된 사진의 분석은 Image J(NIH)의 stereology protocol을 통해 진행하였다. 세포 수는 격자를 기준으로 격자 안의 세포의 개수를 측정하여, 미리 계산된 계산식에 대입하여 조직 전체에 잔존하고 있는 세포의 총 수를 측정하였다.
실험예1.5 C57BL/6FIXKO 생쥐모델 혈액응고 효과 검정
실험예 1.5.1 실험동물 및 시약 준비
체중 27 ± 2 g의 FIX 유전자 knock-out hemophilia B (C57BL/6FIX KO) 생쥐를 암수 구분 없이 30마리(서울대학교 평창캠퍼스)를 이용하여 실험에 사용하였다. 실험 동물은 총 4개의 군으로 나누었다. 대조군인 DPBS 주입군 (1군)과 실험군인 5.0 x 105 cells/100 μl 유도만능줄기세포-HLCs 세포 주입군 (2군), 1 x 106 cells/100 μl 유도만능줄기세포-HLCs 세포 주입군 (3군) 그리고 2 x 106 cells/100 μl 유도만능줄기세포-HLCs 세포 주입군 (4군)으로 총 4개군 30마리의 실험 동물을 사용하였다. 동물 사육은 외부와 격리된 21℃ 온도를 유지하는 사육장에서 사료와 물은 자유롭게 공급하며 사육하였다. 실험에는 비장에 각 세포 이식 후 일주일 뒤에 동물의 혈액을 채취하여 hFIX ELISA kit을 이용하여 혈중 FIX 단백질의 양을 측정과 aPTT 테스트를 통해 혈액응고 반응을 검증하였고 간 조직 면역 형광염색을 통해 이식한 세포의 생착 여부를 확인하였다.
Hemophilia B 동물 모델의 혈청을 통한 aPTT, 혈장 속 FIX 단백질 검출과 조직내 유도만능줄기세포-HLCs 염색을 위해 사용한 시약은 표 15와 같다.
| Antibody & Reagent | Catalogue number | Company |
| Anti-Nuclei antibody | MAB1281 | Merck Millipore, USA |
| Anti FIX antibody | ab236279 | Abcam plc, USA |
| Alexa Fluor®488-Anti-mouse secondary antibody | ab150113 | Abcam plc, USA |
| Alexa Fluor®647-Anti-rabbit secondary antibody | ab150075 | Abcam plc, USA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | D9542 | Sigma-Aldrich Ltd., USA |
| Vectashield Mounting solution | H-1000 | Vector Laboratories, Inc, USA |
| hFIX ELISA Kit | ab108831 | Abcam plc, USA |
| aPTT Reagent | 100309 | Thermo Fisher Scientific Inc., USA |
실험예 1.5.2 B형 혈우병 질환 생쥐 모델(C57BL/6N 생쥐) 준비
실험에 사용된 C57BL/6N 생쥐는 코아텍(주)에서 주문 구매하여 평창 서울대 캠퍼스에서 제작하였다. C57BL/6N 생쥐를 제작한 구체적인 방법은 아래와 같다.
배란기 조절을 통한 과배란을 유도하기 위해 암컷 생쥐에게 5 IU의 혈장 gonadotrophin과 5 IU의 사람 chorionic gonadotropin (hCG)를 48시간 간격으로 투여하였다. 이 후, 수컷 정자공여 생쥐와 교배를 시켰다. 암컷 생쥐의 난관에서 수정란을 채취한 뒤, Opit MEM I 배양액(Invitrogen)을 이용하여 3회 수세작업을 진행하였다. 약 50개의 수정란을 electroporation 용액과 함께 electroporator에 옮겼다. 혼합용액 최종 농도는 200 ng/μl의 spCas9 단백질(Toolgen Inc.)과 50 ng/μl의 sgRNA(FIX 유전자를 타겟으로 하는 sgRNA)가 포함되도록 제조하였다. Electroporator는 pulse 주기 30 V, 30ms으로 7 cycle : on , 97ms off의 조건으로 진행하였다. 이 후, M2 배양액(MTI-Globalstem)을 이용하여 3회 수세 후, 공여 암컷 생쥐의 난관에 다시 이식하였다. 태어난 생쥐는 genotyping을 위해 발가락에서 얻어진 DNA를 통해 genomic DNA를 얻었다. gDNA는 PCR과 sanger sequencing을 통해 FIX 유전자가 knock-out 되었는지 확인하였다.
실험예 1.5.3 Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
세포에서 생성한 FIX 단백질의 양을 측정하기 위해 실험 동물의 꼬리 정맥과 배대동맥에서 채취한 혈장과 세포 배양시에 얻은 배양액을 이용하여 sandwich ELISA 방법을 활용하여 정량하였다. 세포 배양액의 경우 Amicon® Ultra-15 (Millipore)를 사용하여 배양액 속 FIX 단백질의 크기에 맞게 농축 분리하였다. 동물 혈장은 총 0주차, 1주차, 2주차, 3주차, 4주차의 5개 주차의 동물 혈액 샘플과 세포 배양 농축액 18일, 21일, 24일의 3개 샘플을 2회 반복 실험할 수 있도록 100 μl씩 준비했다. Sandwich ELISA는 kit (byobyt)에 첨부되어 있는 제조사 안내에 따라 진행하였다. Standard sample을 준비하고 실험 진행 전 wash buffer를 이용하여 plate를 2회 수세하였다. 실험하는 동안 well이 마르지 않도록 하였다. 100 μl의 standard와 sample을 각 well에 넣고 37℃에서 90분간 정치하였다. 이 후, standard와 sample을 제거하고 wash buffer로 2회 수세하였다. 100 μl의 Biotin-labeled antibody working solution을 각 well에 넣고 37℃에서 60분간 정치하였다. 용액을 제거한 뒤 wash buffer로 3회 수세 한 뒤 100 μl의 SABC working solution을 각 well에 넣고 37℃에서 30분간 정치하였다. 용액을 제거한 뒤 wash buffer를 사용하여 5회 수세 후, 90 μl의 TMB substrate solution을 각 well에 넣어주고 37℃에서 15분간 정치하였다. 이 후, 50 μl stop solution을 넣고 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험예 1.5.4 Immunofluorescence staining
채취한 조직은 PBS 완충용액으로 수세 후, 4% PFA 용액에 2 일간 넣어 조직을 고정하였다. 고정된 조직은 embedding 과정을 거쳐 paraffin 블록으로 제작하였고 7 μm의 두께로 절삭하여 코팅 슬라이드 글라스에 올려 건조시켰다. 슬라이드는 xylene 용액에 5분간 정치한 뒤, 100% 에탄올 5분간 2회, 90% 에탄올 5분 1회, 80% 에탄올 5분 1회, 70% 에탄올 5분 1회 정치 후 흐르는 물에 10분간 수세 작업을 진행하였다. 수세과정을 마친 조직 슬라이드는 MOM Kit (Vector Labs)를 사용하여 blocking 작업을 진행하였고, 희석된 anti-Nuclei antibody (1:200 dilution rate),(Cat# MAB1281, Merck Milipore, USA), anti-human factor9 antibody (1:200 dilution rate), (Cat# ab236279, Abcam, USA) 항체와 하루동안 4℃ 냉장고에 정치하였다. 12시간 후, 슬라이드는 2시간동안 상온에 다시 정치시킨 뒤, PBS 완충용액을 이용해 수세를 진행하였다. 수세한 슬라이드는 Alexa Fluor®488-Anti-mouse secondary antibody와 Alexa Fluor®647-Anti-rabbit secondary antibody 각각 1:200으로 희석하여 조직에 뿌려준 뒤, 2시간 동안 상온에 정치하였다. TPBS 완충용액을 이용해 5분간 3회씩 수세를 진행한 뒤, 0.05% 의 3,3'-Diaminobenzidine (DAB),(Cat# D9542, Sigma-Aldrich, USA) 300 ml을 이용하여 3분간 발색반응을 진행하였다. 염색을 마친 슬라이드는 vectasheild mounting solution (Sigma-Aldrich)를 이용하여 마무리하였다.
실험예 1.5.5 혈액 응고 반응 실험 (aPTT)
실험동물의 복대동맥에서 얻은 혈액 450 μl와 50 μl의 3.2% sodium citrate 용액을 섞어 준 뒤, 4℃, 1500 x g에서 10분간 원심분리를 통해 혈청을 얻었다. Microplate-based activated partial thromboplastin time(aPTT) 분석은 30 μl의 혈청에 aPTT reagent(Thermo Fisher Scientific)과 섞어 96-well-plate에 넣어주고 10분간 37℃에서 정치하였다. 이후, 26 μM CaCl2 30 μl를 함께 섞어주었다. 흡광도는 8분간 405 nm로 10초간격으로 측정을 진행하였으며, 측정이 진행되는 동안 계속 교반하였다.
실험예2 F9 KO세포주 제작 및 간세포로의 분화
실험예2.1 F9 KO세포주 제작 및 sgRNA 형질 전환 효율 검증
본 발명자는 B형 혈우병 환자의 세포를 모방하기 위해 정상 유도만능줄기 세포주의 FIX 유전자가 knock-out되도록 하였다. FIX 유전자의 exon 1, 또는 exon 2의 서열에 존재하는 5‘-NGG-3’의 형태의 PAM 서열을 고려하여 20 nucleotide의 sgRNA를 디자인하였다 (도 2.).
CRISPR RGEN tool을 통해 out of frame score가 60% 이상이며, 3 base pair (bp) 이하의 mismatch를 유도할 것으로 예상되는 10가지 종류의 sgRNA 서열을 선정하여 제작하였다 (Table 5). 유전자 편집의 효율 평가는 human T-lymphocyte 세포주인 Jurkat 세포(TIB158™, ATCC, USA)를 이용하여 검정하였다. 앞서 제작한 10가지 종류의 sgRNA를 포함하는 CRIPSR/Cas9 시스템을 이용하여, Jurkat 세포의 형질을 전환하였다. 형질 전환 후, Illumina RNA Sequencing을 통해 FIX 유전자에 대한 각 sgRNA의 유전자 편집 효율을 평가하였다. hFIX-gRNA #1내지 10을 이용한 형질 전환군의 FIX 유전자의 exon 1 또는 2의 sequencing 분석을 하였다. 그 결과, hFIX-gRNA #1의 경우, 총 5971개의 서열 중 3388개의 서열에서 insertion을 발견하였고, 253개의 서열에서 deletion이 확인되어 61%의 유전자 교정 효율을 보였다. 다른 9개의 sgRNA처리군의 유전자 분석결과에서는 각 6 kb - 12 kb 양의 유전자 서열을 분석하였으나 형질전환에 의한 유전자 교정 효율은 50%를 넘지 않았다 (표 16). sgRNA를 이용한 유전자 교정효율은 60% 이상을 넘지 않는 경우 유전자 교정이 되지 않은 것으로 판단하였다 (Sentmanat 등, 2018). 따라서, FIX 유전자의 Exon 1을 타겟으로 하는 hFIX-gRNA #1을 이용하여 인간 유도만능줄기세포에서 knock-out을 진행하였고, Illumina RNA sequencing 결과에서 hFIX-gRNA #1을 사용한 첫 번째 형질전환 실험군에서 총 330968개의 exon 1 유전자 서열 중, 5448개의 유전자 서열에서 insertion이 발견되었고, 9336개의 유전자 서열의 deletion을 보여 47.7%의 유전자 교정효율을 보였다. 한 편, hFIX-gRNA#1을 사용한 두 번째 형질전환 실험군에서는 총 19611개의 exon 1 유전자의 sequencing 분석 결과, 3420개의 유전자 서열에서 insertion이 발견되었고 10430개의 deletion된 서열을 확인하여 70.6%의 유전자 교정효율을 보였다 (표 17). 해당 조건의 FIX knock-out 세포는 single cell배양하였다 (도 3). 이 후, 총 96개의 clone 중 최종 14개의 clone을 선정하여 gDNA deep sequencing을 통해 형질전환 효율을 검증하였다. 각 Clone별로 8 kb - 35 kb의 유전자 서열을 분석하였고, 이 중 hFIX-KO Clone#14번의 유전자 sequencing 분석 결과 111920개의 유전자 서열 중 2개의 서열에서 insertion이 발생하였고 11915개의 유전자 서열에서 13 bp deletion이 발생하여 100% 유전자 편집효율을 확인하였다 (표 18). 대부분의 clone에서 높은 유전자 편집 효율을 보였으나 sequencing 결과를 분석했을 때, hFIX-KO Clone#14번의 유전자 서열에서 CRIPSR-Cas9에 의한 out of frame이 확인되었다(표 19). 이에 따라, hFIX-KO clone#14를 최종 선정하여 동종의 FIX knock-out 세포주를 제작하였다(도 4).
| sgRNA Number | Total Read | Insertion | Deletion | Indel(%) |
| hFIX-sgRNA#1 | 5971 | 3388 | 253 | 61% |
| hFIX-sgRNA#2 | 9543 | 144 | 8 | 1.6% |
| hFIX-sgRNA#3 | 12174 | 2749 | 1654 | 36% |
| hFIX-sgRNA#4 | 14431 | 1663 | 516 | 15.1% |
| hFIX-sgRNA#5 | 9641 | 2890 | 389 | 34% |
| hFIX-sgRNA#6 | 11204 | 131 | 17 | 1.3% |
| hFIX-sgRNA#7 | 6376 | 183 | 48 | 3.6% |
| hFIX-sgRNA#8 | 6132 | 447 | 85 | 8.7% |
| hFIX-sgRNA#9 | 7672 | 381 | 51 | 5.6% |
| hFIX-sgRNA#10 | 10418 | 304 | 33 | 3.2% |
| Group | Condition (gRNA:Cas9) |
Total Read | Insertion | Deletion | Indel(%) |
| Wild type | - | 23718 | 0 | 2 | 0.0% |
| FIX-KO (Group1) |
1:1 | 330968 | 5448 | 9336 | 47.7% |
| FIX-KO (Group2) |
1:2 | 19611 | 3420 | 10430 | 70.6% |
| Knock-out Clone Number | Total Read | Wild Type | Insertion | Deletion | Indel(%) |
| hFIX-KO-Clone#1 | 8001 | 7962 | 37 | 2 | 39(0.5%) |
| hFIX-KO-Clone#2 | 3098 | 17 | 2 | 3079 | 3081(99.5%) |
| hFIX-KO-Clone#3 | 20513 | 20499 | 0 | 14 | 14(0.1%) |
| hFIX-KO-Clone#4 | 34988 | 23 | 0 | 34965 | 34965(99.9%) |
| hFIX-KO-Clone#5 | 22805 | 22778 | 0 | 27 | 27(0.1%) |
| hFIX-KO-Clone#6 | 35127 | 35107 | 2 | 18 | 20(0.1%) |
| hFIX-KO-Clone#7 | 22690 | 49 | 21 | 22620 | 22641(99.8%) |
| hFIX-KO-Clone#8 | 17887 | 88 | 4067 | 13732 | 17799(99.5%) |
| hFIX-KO-Clone#9 | 10609 | 5 | 2365 | 8239 | 10604(100%) |
| hFIX-KO-Clone#10 | 32563 | 126 | 7066 | 25371 | 32437(99.6%) |
| hFIX-KO-Clone#11 | 15701 | 20 | 15661 | 20 | 15681(99.9%) |
| hFIX-KO-Clone#12 | 25349 | 18 | 14 | 25317 | 25331(99.9%) |
| hFIX-KO-Clone#13 | 24115 | 19 | 24092 | 4 | 24096(99.9%) |
| hFIX-KO-Clone#14 | 11920 | 3 | 2 | 11915 | 11917(100%) |
| Most frequent sequences in hFIX-KO Clone#14 | Type |
| 5'-AAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAG-3' | Wild type |
| 5'-AAAGGT--TGC------------CAT-ATCATGGCAG-3' | 13 bp deletion (Out of Frame) |
실험예2.2 FIX knock-out 세포주의 간세포 분화 및 검증
본 발명자는 FIX knock-out 세포주를 간세포로 분화시키고자 하였다. 유도만능줄기세포(FIX knock-out 세포주)를 간세포로 분화시키기 위해 먼저 definitive endoderm으로 분화가 필요하여, Cellartis® definitive endoderm differentiation protocol을 통해 분화에 필요한 사이토카인과 성장인자를 FIX knock-out 세포주에 공급하였다. 이 후, Cellartis® hepatocyte differentiation protocol을 통해 약 2주간 간세포로의 분화를 진행하였다. 세포 분화를 시작할 때 plate에 적당한 세포의 수는 분화에 중요하게 작용한다. 따라서, 각 well에는 3.5 x 104 개/cm2의 세포를 6-well-plate에 seeding하였다.
분화 7일차에 세포질의 확장이 보였다. 분화 10일차에 간세포의 특징인 한 개의 핵 안에 두 개의 핵소체가 존재하는 세포가 보였다. 분화 16일차에 간세포의 특징인 이핵화 세포(duploid cell)가 보였으며, 핵은 둥글고 넓은 세포질 공간을 가지는 간세포의 형태를 보였다 (도 5).
간세포로의 분화 검정을 위해 세포는 지정된 날짜에 맞춰 gDNA를 추출하였다. 초기 간세포 마커인 HNF-4α와 성숙 간세포 마커인 CYP3A는 PCR 검정을 통해 확인하였다. 분화 21일차 이후부터 초기 간세포 마커인 HNF-4α 유전자의 발현이 PCR 밴드를 통해 확인되었고, 25일 차 이후부터 성숙 간세포 마커인 CYP3A의 발현이 PCR 밴드를 통해 확인되었다 (도 6). 이러한 결과를 통하여, 유도만능줄기세포가 간세포로 정상적으로 분화되었음을 확인하였다.
실험예3 F9 KI 세포주의 제작 및 간세포로의 분화
실험예3.1 FIX knock-in 세포주 제작
본 발명자는 FIX 단백질 분비 세포주를 제작하고자 하였다. 이를 위해, 간 세포에서 유전자 발현율이 높으며 유전자의 삽입이 용이한 safe harbor site 중 하나인 APOC3 유전자를 F9 핵산서열의 삽입 위치로 선정하였다 (Papapetrou 등, 2016). 삽입될 F9 핵산서열은 wobble 현상을 응용하여 알라닌37 (GCA → GCC)과 프롤린120 (CCU → CCC) 과 같이 2개의 아미노산의 세 번째 염기를 바꿔 pcDNA3.1(+) plasmid vector를 제작하였다(도 7). 이 후, plasmid vector로부터 추출한 FIX donor DNA를 CRISPR-Cas9를 이용하여 APOC3 promotor 부위에 knock-in하였다. Knock-in된 세포의 single cell 분리 과정을 통해 총 138개의 clone을 제작하였다.
각 clone에 F9 핵산서열이 APOC3유전자의 exon1에 knock-in 되었는지 확인하기 위하여, PCR validation 용 primer 1 및 primer2를 제작하였다 (도 8). PCR validation용 Primer 1번은 homologous left arm (HLA) 전체 서열과 homologous right arm (HRA)의 일부를 포함하게 만든 primer로, F9 핵산서열이 knock-in되었을 경우 3.1kb의 PCR 산물이 밴드에서 관찰된다 (도 9), PCR validation용 Primer 2번은 HLA 및 HRA 전체 서열을 포함하게 만든 primer로, F9 핵산서열이 knock-in되었을 경우 4.3kb의 PCR산물이 밴드에서 관찰된다 (도 10).
PCR validation용 Primer를 사용하여 확인한 결과, Clone # 57, 132, 135번에서 knock-in이 확인되었으며, 다른 clone의 경우 primer 1에서는 1.4kb, primer 2에서는 2.7kb의 PCR 산물이 관찰되었다. 두 번의 PCR 결과를 통해 Clone # 57번을 최종 FIX knock-in 세포주로 선정하였고, agarose gel에서 DNA를 추출하여 정제하였다. 추출한 DNA는 sequencing을 위해 TA cloning을 진행하여 DNA양을 증폭시켰다(도 11). Sequencing의 결과 2923개의 유전체 중 2920개의 유전체에서 F9 핵산서열이 FIX knock-out 세포주의 APOC3 promotor 부근에 99% knock-in 된 것을 확인하였고, 1%의 mismatch는 HRA과 HLA에서 발견되었다 (도 12).
실험예3.2 FIX knock-in 세포주의 간세포(유도만능줄기세포-HLCs) 분화 및 검증
본 발명자는, APOC3 유전자에 knock-in된 F9 핵산서열에 의하여, FIX 단백질이 발현되는지 확인하고자 하였다. 이를 위해, 실험예3.1에서 최종 선정된 clone #57번을 Cellartis® hepatocyte differentiation protocol을 통해 내배엽 세포로의 분화시킨 후, 간세포로 분화시켰다 (도 13). 간세포로 분화된 세포(유도만능줄기세포-HLCs)의 분화를 확인하기 위해 negative control로 유도만능줄기세포를, positive control로 Hepatocyte primary 세포주 (HepG2)를 사용하여, 유도만능줄기세포 마커인 SOX2, 및 OCT4와 간 세포 마커인 AFP, TTR, HNF-4α, Alb, CYP3A, 및 APOC3를 PCR과 면역염색을 통해 각각 확인하였다. 또한, FIX knock-in 세포주에 knock-in된 F9 핵산서열의 발현 역시 PCR을 통해 검증하였다.
유도만능줄기세포-HLCs의 PCR 결과에서는 유도만능 줄기세포 마커인 SOX2 및 OCT4의 발현이 확인되지 않았다. 반면, 간세포 분화 마커인 AFP, TTR, HNF-4α, Alb, CYP3A, 및 APOC3의 유전자 발현을 확인하여, 간 세포로 정상 분화하였음을 HepG2 세포주와의 동일한 발현 패턴을 통해 확인할 수 있었다 (도 14B). 또한, knock-in 된 F9 핵산서열도 정상적으로 발현되고 있음을 확인하였다 (도 14A).
실험예3.3간세포 분화 후 단백질 분비 확인
본 발명자는 유전자의 발현과 함께 간세포 분화 후 단백질 분비를 확인하기 위해 Immunocytochemistry를 진행하였다. 그 결과, Hepatocyte progenitor 세포 마커인 HNF-4α및 CK-18 단백질이 세포질에서 발현되는 것을 확인하였고 hepatocyte maturation 세포 마커인 CYP3A및 Alb의 염색을 통해 간 세포에서의 정상적인 단백질 분비를 하는 것을 확인하였다 (도 15).
세포 배양액에서 세포에서 분비하는 FIX 단백질의 양을 정량하기 위해 배양액을 농축하여 ELISA 실험을 진행하였다. FIX 단백질의 양은 Mature-Hepatocyte으로 분화가 완료된 23일부터 4일 간격으로 측정하였다. 배양액 속 FIX 단백질의 양은 약 50 ng/ml의 농도로 측정이 되었으며 각 날짜 별 배양액의 FIX 단백질의 양은 통계적으로 차이를 보이지 않았다 (도 16).
실험예4 NOD/SCID 생쥐 모델에서 유도만능줄기세포-HLCs의 효능검정
실험예4.1 유도만능줄기세포-HLCs 비장 이식 후 몸무게 증가
본 발명자는 유도만능줄기세포-HLCs(실험예3에서 제작된 F9 핵산서열이 knock-in된 간세포)의 체내 이식 후 FIX 단백질 분비 검증을 하기 위해, 8주령의 면역 결핍 생쥐 모델인 NOD/SCID 생쥐의 비장에 유도만능줄기세포-HLCs를 실린지를 통해 이식하였다 (도 17).
유도만능줄기세포-HLCs의 이식에 따른 건강상의 문제를 확인하기 위하여, 수술 후 4주간 동물의 몸무게를 측정하였다 (도 18). 수술 직전 몸무게를 확인하면, DPBS를 투여한 1군은 28.00 ± 1.41 g, 유도만능줄기세포-HLCs를 5.0 x 105 cells/μl 투여한 2군은 27.67 ± 0.58 g, 유도만능줄기세포-HLCs를 1.0 x 106 cells/μl 투여한 3군은 26.33 ± 0.58 g, 유도만능줄기세포-HLCs를 2.0 x 106 cells/μl 투여한 4군은 28.00 ±1.73g으로 각 군간 몸무게는 통계적 차이를 보이지 않았다. 수술 후 몸무게 측정 시 각 군별로 수술 전 몸무게에 대비하여 1.33 ± 0.7 g의 몸무게가 감소하였고 동물의 회복을 위해 상처 부위에 포비돈을 도포하고 사료를 바닥에 깔아주었다. 이 후, 4주차까지 몸무게 증가는 모든 동물에서 통계적 차이를 보이지 않았고 1.5 ± 0.3 g의 몸무게 증가를 보였다.
이러한 결과를 통하여, 유도만능줄기세포-HLCs를 NOD/SCID 생쥐에 이식하여도, 건강에 큰 문제가 없음을 확인하였다.
실험예4.2 혈중 F9 단백질양 측정
NOD/SCID 생쥐 모델의 혈장분석을 통해, 이식한 세포에서 분비한 FIX 단백질의 양을 hFIX ELISA를 사용하여 정량하였다. 혈장에서 측정한 FIX 단백질의 양은 2군에 대비하여 3군 및 4군에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 하지만, 3군과 4군에서는 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다. 또한, 4주차까지의 샘플을 통해 혈중 FIX 단백질의 양을 비교해 보았을 때, 1주차와 2주차에서는 각 군별로 FIX 단백질의 양이 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다. 3주차의 혈액샘플에서는 2주차에 대비하여 모든 군에서 통계적으로 유의한 감소 차이를 보였고 4주차에는 3주차에 대비하여 모든 군에서 통계적으로 유의한 감소를 보였다 (도 19).
실험예4.3 조직 내 유도만능줄기세포-HLCs 개수 측정
장기에 이식한 유도만능줄기세포-HLCs가 FIX 단백질을 정상적으로 분비하고 있는지 확인하기 위해 비장 조직을 Hematoxylin & Eosin 염색하여 조직의 상태를 확인하였다 (도 20). 비장의 백색수 측면과 적색수 부분에는 대식세포들이 주로 분포해 있어 많은 핵이 염색된 것을 확인할 수 있었고, 주로 항체가 생성되는 백색수 부근은 상대적으로 핵 염색이 옅게 염색되어 있었다. 조직에 이식된 세포는 대부분 적색수에 넓게 분포되어 혈관을 통해 이동할 것으로 예상하여, 혈관 주변부와 적색수 부근의 핵염색을 비교하였으나 육안으로 비교가 어려웠다.
따라서 NOD/SCID 생쥐 모델의 조직과 이식된 유도만능줄기세포-HLCs를 구분하기 위해 anti-human nucleus (HuNu) 항체를 이용하여 면역 조직 염색을 진행하였다 (도 21). 광학현미경을 이용하여 HuNu 항체에 대하여 positive 한 세포를 관찰한 결과, HuNu postive 세포가 조직에 넓게 번져 있는 것을 확인하였다.
이식된 세포가 혈관을 따라 장기로 얼마나 이동했는지 혹은 비장 조직에 생착해 있는지 판단하기 위해 조직의 세포수를 객관적으로 측정할 수 있는 image J stereology analysis 프로그램을 사용하여 비장 조직에 존재하고 있는 세포의 수를 측정하였다 (도 22). 조직내 세포수를 측정하기 위해 면역염색조직 촬영 사진에 grid를 표시하였다 (도 23). 일정한 넓이를 가지는 grid안의 HuNu positive 세포핵의 개수를 측정하였다. 1군에 대비하여 2군, 3군, 및 4군에서 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, 2군에 대비하여 3군 및 4군에서도 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 3군과 4군은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다 (표 20). 이 후, stereology 수식을 사용한 결과, 조직 전체에 존재하고 있는 세포의 수 (estimated cell number)는 각 군별로 상이 하였으며, 2군에 대비하여 3군 및 4군은 남은 세포의 수가 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 반면, 3군과 4군에서는 조직에 존재하는 세포의 수에서 유의미한 차이를 보이지 않았다 (도 24).
| Actual cell number | ||||
| Group | Con DPBS |
5.0 x 105 cell/100 μl | 1.0 x 106 cell/100 μl |
2.0 x 106 cell/100 μl |
| Mean | 182 | 7982 | 14705 | 16708 |
| STDEV | - | 81.74 | 295.41 | 336.99 |
실험예5 C57BL/6
FIXKO
생쥐모델에서 유도만능줄기세포-HLCs의 효능검정
실험예5.1 유도만능줄기세포-HLCs 비장 이식 후 몸무게 증가
유도만능줄기세포-HLCs의 체내 이식 후 FIX 단백질의 혈액응고 작용 검증을 위해 8주령의 C57BL/6FIXKO 생쥐의 비장에 유도만능줄기세포-HLCs를 실린지를 통해 이식하였다.
유도만능줄기세포-HLCs의 이식에 따른 건강상의 문제를 확인하기 위하여, 수술 후 1주간 동물의 몸무게를 측정하였다 (도 26). 수술 직전 몸무게를 확인하면, DPBS를 투여한 1군은 28.00 ± 1.09 g, 유도만능줄기세포-HLCs를 5.0 x 105 cells/μl 투여한 2군은 27.47 ± 1.58 g, 유도만능줄기세포-HLCs를 1.0 x 106 cells/μl 투여한 3군 28.26 ± 0.88 g, 유도만능줄기세포-HLCs를 2.0 x 106 cells/μl 투여한 4군 27.88 ±1.73 g으로 각 군간 몸무게는 통계적 차이를 보이지 않았다. 수술 후 몸무게 측정 시 각 군별로 수술 전 몸무게에 대비하여 1.83 ± 0.5 g의 몸무게가 감소하였고 동물의 회복을 위해 상처 부위에 포비돈을 도포하고 사료를 바닥에 깔아주었다. 이틀 간격으로 몸무게 측정 시 모든 동물에서 몸무게 변화에 따른 통계적 차이를 보이지 않았다.
이러한 결과를 통하여, 유도만능줄기세포-HLCs를 NOD/SCID 생쥐에 이식하여도, 건강에 큰 문제가 없음을 확인하였다.
실험예5.2 혈중 FIX 단백질양 측정
C57BL/6FIXKO 생쥐 모델의 혈청분석을 통해 이식한 세포에서 분비한 FIX 단백질의 양을 human FIX ELISA를 사용하여 정량하였다. 혈청에서 측정된 FIX 단백질의 양은 1군과 2군에서는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았던 반면, 3군과 4군에서는 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 또한, 4군은 3군에 비해 약 1.8배의 FIX 단백질의 양이 측정되었으며 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (도 27.).
실험예5.3 조직 내 유도만능줄기세포-HLCs 생착 검정
비장에 이식한 유도만능줄기세포-HLCs가 간 조직에 정상적으로 생착하여 FIX 단백질을 정상적으로 분비하고 있는지 확인하기 위해 면역 형광염색을 진행하였다 (도 28.). 이를 위해, 663 nm의 가시광선을 띄는 형광 항체를 사용하여 FIX 단백질을 염색하였고, 488 nm의 가시광선을 띄는 형광 항체를 사용하여 human nucleus를 색하였다. 이때, 공통으로 염색되는 부위를 확인하였다. 1군과 2군에서는 공통으로 염색되는 부위를 찾기 힘들었던 반면, 3군과 4군에서는 공통으로 형광을 발현하는 세포를 조직 내에서 발견하였으며 주로 liver sinusoid 부근에서 발견되었다.
실험예5.4 aPTT 혈액응고 반응 검정
혈청에 존재하는 FIX 단백질의 혈액응고 반응을 검증하기 위해 aPTT를 진행하였다 (도 29.). Wild type 생쥐는 혈액응고인자의 반응에 약 10 ± 10초의 시간이 소요되었다. 반면, 1군에서는 혈액응고인자의 반응까지 평균 150 ± 20 초가 걸렸고, 2군은 100 ± 20초가 소요되어 통계적으로 차이를 보이지 않았다. 반면, 3군은 30 ± 10초가 소요되어 1군, 및 2군에 비하여 통계적으로 차이를 보이는 것을 확인하였다. 하지만, 4군에서는 약 80 ± 20초의 시간이 소요되어 3군과 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, 2군과는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 한편, 1군과는 통계적으로 차이를 보여 혈액응고인자의 반응이 일어난 것으로 볼 수 있다.
Claims (8)
- 다음을 포함하는, 인공 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC):
인위적으로 조작된 apolipoprotein C3(APOC3) 유전자를 포함하는 게놈 DNA,
여기서, 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열, 및 제3핵산서열을 포함하며,
상기 제1핵산서열은 야생형APOC3유전자의 일부 핵산서열이며,
상기 제2핵산서열은 제9혈액응고인자(Factor IX, F9) 단백질을 암호화하는 핵산서열이며,
상기 제3핵산서열은 야생형APOC3유전자에서 제1핵산서열을 제외한 부분에서의 일부 핵산서열이며,
상기 제2핵산서열은 상기 제1핵산서열과 상기 제3핵산서열의 사이에 위치하며,
상기 인공 유도만능줄기세포는 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자로부터 상기 F9 단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는, 인공 유도만능줄기세포. - 제1항에 있어서,
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손(exon)1에 위치한 것을 특징으로 하는, 인공 유도만능줄기세포. - 제1항에 있어서,
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 80%이상의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공 유도만능줄기세포. - 제1항에 있어서,
상기 인공 유도만능줄기세포는 B형 혈우병 환자의 체세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 인공 유도만능줄기세포. - 다음을 포함하는, 인공 간세포:
인위적으로 조작된 APOC3 유전자를 포함하는 게놈 DNA,
여기서, 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자는 제1핵산서열, 제2핵산서열, 및 제3핵산서열을 포함하며,
상기 제1핵산서열은 야생형APOC3유전자의 일부 핵산서열이며,
상기 제2핵산서열은 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열이며,
상기 제3핵산서열은 야생형APOC3유전자에서 제1핵산서열을 제외한 부분에서의 일부 핵산서열이며,
상기 제2핵산서열은 상기 제1핵산서열과 상기 제3핵산서열의 사이에 위치하며,
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자의 엑손(exon)1에 위치하며,
상기 인공 간세포는 상기 인위적으로 조작된 APOC3 유전자로부터 상기 F9 단백질을 발현할 수 있도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는, 인공 간세포. - 제5항에 있어서,
상기 F9 단백질을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1의 핵산서열과 적어도 적어도 80%이상의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공 간세포. - 제5항에 있어서,
상기 인공 간세포는 B형 혈우병 환자의 체세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 인공 간세포. - 다음을 포함하는, B형 혈우병 치료용 약학적 조성물:
치료학적 유효량의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인공 유도만능줄기세포 및/또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인공 간세포; 및
약학적으로 허용되는 담체.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220065389 | 2022-05-27 | ||
| KR20220065389 | 2022-05-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230166039A true KR20230166039A (ko) | 2023-12-06 |
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ID=89164102
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|---|---|---|---|
| KR1020230041899A KR20230166039A (ko) | 2022-05-27 | 2023-03-30 | 항응고인자 9 분비 유도만능줄기세포를 이용한 b형 혈우병 치료제 개발 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230166039A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2023
- 2023-03-30 KR KR1020230041899A patent/KR20230166039A/ko unknown
Patent Citations (1)
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