ES2905558T3 - Procedimientos para el tratamiento de las distrofias corneales - Google Patents

Procedimientos para el tratamiento de las distrofias corneales Download PDF

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Abstract

Una célula madre epitelial limbal manipulada para su uso en un procedimiento de prevención, mejora o tratamiento de la distrofia corneal en un sujeto que necesite el mismo, en el que dicha célula madre epitelial limbal manipulada se obtiene mediante un procedimiento que comprende la manipulación de una mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal en una célula madre epitelial limbal de dicho sujeto para corregir la mutación del ácido nucleico mediante la sustitución del alelo mutante por un alelo de tipo silvestre a través de la recombinación homóloga con un ácido nucleico de reparación homológica que contiene dicho alelo de tipo silvestre, en el que dicho ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un TGFβI, COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256O22.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1, PLP1, KRT3, KRT12, GSN o UBIAD1.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para el tratamiento de las distrofias corneales
CAMPO TÉCNICO
La presente divulgación se refiere generalmente a procedimientos para el tratamiento de distrofias corneales. En particular, la presente divulgación se refiere a procedimientos para el tratamiento de distrofias corneales asociadas a una mutación genética.
ANTECEDENTES
Las distrofias corneales son un grupo de trastornos hereditarios en la capa externa del ojo (córnea). Por ejemplo, la distrofia corneal puede caracterizarse por el depósito anormal bilateral de sustancias en la córnea, la parte frontal transparente del ojo. Las distrofias corneales incluyen, pero no se limitan a las siguientes cuatro categorías de distrofias corneales de la IC3D(Véase, por ejemplo ,Weiss et al., Cornea 34(2): 117-59 (2015)): distrofias epiteliales y subepiteliales, distrofias TGFpI epiteliales-estromales, distrofias estromales y distrofias endoteliales. La distrofia corneal puede estar causada por una mutación localizada en el factor de crecimiento transformante, betainducidofTGF @I), queratina 3(KRT3), queratina 12(KRT12), GSN o dominio UbiA preniltransferasa que contiene 1 (UBIAD1).
Por ejemplo, se sabe que un subgrupo de tales distrofias corneales, las distrofias corneales epiteliales-estromales, está asociado con mutaciones en el gen inducido del factor de crecimiento transformante beta (TGFpI). El gen TGFpI codifica una proteína que contiene ácido arginil-glicílico-aspártico (RGD) y que se une a los colágenos de tipo I, II y IV. El motivo RGD se encuentra en muchas proteínas de la matriz extracelular que modulan la adhesión celular y sirve como secuencia de reconocimiento de ligandos para varias integrinas. En algunos casos, las distrofias corneales epiteliales-estromales se distinguen unas de otras y se dividen en subtipos con base en el aspecto clínico de las opacidades, las características clínicas de la enfermedad y las propiedades de tinción histopatológica de los depósitos. Sin estar atado a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las mutaciones específicas en el gen TGFpI dan cuenta de los fenotipos específicos asociados con tales distrofias corneales y que las opacidades corneales que dan cuenta de las características clínicas de los diferentes fenotipos resultan de la deposición de toda o parte de la proteína TGFpI codificada mutada. La distrofia corneal de Avellino, también conocida como distrofia corneal granular de tipo II, es una forma de distrofia corneal epitelial-estromal, caracterizada por depósitos granulares de forma irregular y bien delimitados en el estroma corneal central superficial y por un deterioro visual progresivo. Los pacientes heterocigotos que padecen distrofia corneal de Avellino presentan una pérdida de visión creciente con la edad que se agrava en los últimos años de la vida. Por el contrario, los pacientes homocigotos presentan una pérdida de visión entre grave y completa a los seis años de edad.
El queratocono (KTCN) es el trastorno ectásico de la córnea más común, con aproximadamente 6-23,5 % de sujetos con antecedentes familiares positivos (Wheeler, J., Hauser, M.A., Afshari, N.A., Allingham, R.R., Liu, Y., Reproductive Sys Sexual Disord 2012; S:6). La prevalencia declarada de KTCN oscila entre 8,8 y 54,4 por cada 100.000. Esta variación en la prevalencia se debe en parte a los diferentes criterios utilizados para diagnosticar la enfermedad. (Wheeler, J., Hauser, M.A., Afshari, N.A., Allingham, R.R., Liu, Y., Reproductive Sys Sexual Disord 2012; S:6y Nowak, D., Gajecka, M., Middle East Afr J Ophthalmol 2011 ; 18(1): 2-6). Existen muchos estudios en la literatura que intentan definir las causas genéticas del KTCN. Estos estudios han descubierto numerosas posibles variantes genéticas o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que se cree que contribuyen a la etiología de la enfermedad en función de los parámetros experimentales. Durante el curso del queratocono, la córnea central o paracentral sufre un adelgazamiento y una inclinación progresivos que provocan un astigmatismo irregular. El patrón hereditario no es ni prominente ni predecible, pero se han comunicado antecedentes familiares positivos. La incidencia del queratocono suele ser de 1 de cada 2.000 personas. El queratocono puede mostrar los siguientes hallazgos patológicos, incluyendo, fragmentación de la capa de Bowman, adelgazamiento del estroma y del epitelio suprayacente, pliegues o roturas en la membrana de Descemet, y cantidades variables de cicatrización corneal difusa.
Las etapas iniciales de las distrofias corneales se tratan inicialmente con gotas para los ojos y ungüentos hipertónicas para reducir el edema corneal y pueden ofrecer una mejora sintomática antes de la intervención quirúrgica. La visión subóptima causada por la distrofia corneal suele requerir una intervención quirúrgica en forma de trasplante de córnea. Sin embargo, la escasa disponibilidad de tejidos corneales de donantes limita el uso de la intervención quirúrgica. Además, la recurrencia de la enfermedad en el injerto del donante, sin embargo, puede ocurrir después del trasplante de córnea. Otras complicaciones que pueden surgir tras un trasplante de córnea son, por ejemplo, la formación de cicatrices, la formación de cataratas, la fuga de líquido de la incisión del trasplante, la infección y los problemas de visión. En consecuencia, se necesitan procedimientos alternativos para el tratamiento de las distrofias corneales. Courtney et al. (Terapia génica 2015, 23(1):108-112y Int. J. Ophth. Eye Sci. 2015, 32(2):7-18) y el documento WO 2017/004616 A1 divulgan la corrección de mutaciones genéticas que conducen a la distrofia corneal.
RESUMEN
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se proporcionan composiciones para su uso en el tratamiento de una distrofia corneal en un sujeto que necesita el mismo. En ciertas realizaciones, la distrofia corneal es una distrofia corneal granular de tipo II. En otras realizaciones, la distrofia corneal es el queratocono. En algunas realizaciones, la distrofia corneal está asociada a un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), por ejemplo, en el gen TGFBI, KRT3, KRT12, GSN y/o UBIAD1 .
En un aspecto, se proporcionan en el presente documento células madre epiteliales limbales manipuladas para su uso en un procedimiento de prevención, mejora o tratamiento de la distrofia corneal en un sujeto que necesite el mismo.
Las células madre epiteliales limbales manipuladas se obtienen mediante un procedimiento que incluye la manipulación de una mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal en una célula madre epitelial limbal del sujeto para corregir la mutación del ácido nucleico sustituyendo el alelo mutante por un alelo de tipo salvaje mediante recombinación homóloga con un ácido nucleico de reparación de homología que contiene dicho alelo de tipo silvestre. En otras realizaciones, el procedimiento comprende además el cultivo de la célula madre manipulada, formando así una pluralidad de células madre manipuladas. En otras realizaciones, el procedimiento incluye manipular la mutación del ácido nucleico en una pluralidad de células madre epiteliales limbales del sujeto para corregir la mutación del ácido nucleico, formando así una o más células madre manipuladas; y aislar la una o más células madre manipuladas. En otras realizaciones, el procedimiento comprende el cultivo de una o más células madre manipuladas, formando así una pluralidad de células madre manipuladas. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la obtención a partir del sujeto de células madre que incluyen la mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye los pasos de a) obtener una pluralidad de células madre epiteliales del limbo que comprenden una mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de distrofia corneal del sujeto; b) manipular la mutación del ácido nucleico en una o más células madre de la pluralidad de células madre para corregir la mutación del ácido nucleico, formando así una o más células madre epiteliales del limbo manipuladas; y c) aislar la una o más células madre manipuladas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un ácido nucleico objetivo de TGFpI. En otras realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un ácido nucleico objetivo de COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, Z F469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RA BP3L, KC MA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1.
En algunas realizaciones, el cultivo se lleva a cabo después de la manipulación.
En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico se manipula introduciendo un conjunto de reactivos de manipulación del ácido nucleico en la pluralidad aislada de células madre, por lo que los reactivos de manipulación del ácido nucleico corrigen la mutación del ácido nucleico en una o más de la pluralidad de células madre. En otras realizaciones, los reactivos de manipulación del ácido nucleico se introducen en la pluralidad de células madre mediante electroporación, transfección o entrega viral.
En ciertas realizaciones y de acuerdo con cualquiera de las anteriores, la mutación del ácido nucleico codifica para una sustitución de aminoácidos de arginina 124, arginina 555 o histidina 666 en un polipéptido de TGFpI. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para una selección de sustitución de aminoácidos entre R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q y H626P.
En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido Q1334H en COL4A1. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido G683 A en COL4A2. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido P718S en COL4A2. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido R517K en COL4A2. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido D326Y en COL4A3. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido H451R en COL4A3. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido V1327M en COL4A4. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido R158Q en LOX. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido A1046T en AKAP13. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido G624V en AKAP13. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido G2358R en Z F469. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido S158F en SLC29A3. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido P4493S en MUC5AC. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para la sustitución del aminoácido P370S en CROCC.
En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3742207 (por ejemplo, el SNP identificado por rs3742207 en la base de datos dbSNP del National Center for Biotechnology Information). En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3803230. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs9583500. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs7990383. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs55703767. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs11677877. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2229813. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs1800449. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs1053411. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2116780. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3749350. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2286194. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs12536657. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2614668. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs745191. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs12598474. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs10932976. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs5908678. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs35803438. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132728. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132729. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132730. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs859063. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2893276. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6687749. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13189855. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6876514. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6876515. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13361701. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs883764. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs780667. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs780668. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13166148. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs10941287. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs7907270. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs200922784. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs9435793. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs116300974. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2233696.
En algunas realizaciones, el conjunto de reactivos de manipulación de ácidos nucleicos comprende una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa de efectores similares a activadores de la transcripción (TALENs), una nucleasa de reingeniería, un reactivo de interferencia de ARN (ARNi), o reactivos de sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR)/nucleasa.
En realizaciones particulares, los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos son reactivos de sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR)/nucleasa que incluyen: a) un ácido nucleico de ARN guía que se hibrida con el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal dentro de una molécula de ADN de la pluralidad de células madre; y b) un ácido nucleico de nucleasas que codifica una nucleasa. En tales realizaciones, el ARN guía se dirige (por ejemplo, se hibrida con) al ácido nucleico objetivo y la nucleasa escinde la molécula de ADN. En algunas realizaciones, los reactivos del CRISPR/sistema de nucleasa incluyen además c) un ácido nucleico de reparación que comprende una versión de tipo silvestre del ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal o un fragmento del mismo. En tales realizaciones, el ARN guía se hibrida con el ácido nucleico objetivo y la nucleasa escinde la molécula de ADN creando así un sitio de escisión del ácido nucleico objetivo, por lo que el ácido nucleico de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal tras la creación del sitio de escisión del nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el ARN guía y/o el ácido nucleico de reparación comprenden una etiqueta detectable. En determinadas realizaciones, la etiqueta detectable es un código de barras de ácido nucleico o una etiqueta de código de barras fluorescente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un ácido nucleico objetivo de TGFpI. En otras realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1, o ácido nucleico objetivo de PLP1. En algunas realizaciones, se manipulan dos o más de los ácidos nucleicos objetivo COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1. En algunas realizaciones, se manipulan ácido nucleico objetivo de TGFpI y uno o más ácidos nucleicos objetivos seleccionados del grupo que consiste en los ácidos nucleicos objetivo COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 y PLP1.
En algunas realizaciones, los reactivos del CRISPR/sistema de nucleasa comprenden además uno o más agentes que aumentan la frecuencia de recombinación homóloga en la pluralidad de células madre mediante la represión de los genes implicados en la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ). En ciertas realizaciones, la nucleasa es una nucleasa Cas9.
En realizaciones ejemplares y de acuerdo con cualquiera de las anteriores, la distrofia corneal se produce tras una cirugía ocular con láser.
En otras realizaciones y de acuerdo con cualquiera de las anteriores, el procedimiento incluye además establecer una línea celular estable a partir de una o más células madre manipuladas aisladas.
En algunas realizaciones, las una o más células madre manipuladas deben ser trasplantadas al sujeto con una o más frecuencias predeterminadas (por ejemplo, semanal, mensual, trimestral, bianual, anual, etc.).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para una mejor comprensión de las implementaciones antes mencionadas de los sistemas y procedimientos en cuestión, así como de las implementaciones adicionales de los mismos, se debe hacer referencia a la Descripción de las Implementaciones a continuación, junto con los siguientes dibujos en los que los números de referencia similares se refieren a las partes correspondientes en las figuras.
La Figura 1 es un diagrama que muestra un esquema de una realización particular de los procedimientos descritos en el presente documento.
La Figura 2 es un gráfico que muestra mutaciones ejemplares que pueden ser reparadas utilizando los procedimientos de la materia proporcionados en el presente documento.
La Figura 3 muestra las posiciones de las variantes de la nueva PAM.
La Figura 4 ilustra vectores ejemplares para el sistema CRISPR/Cas9, incluyendo el pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) que utiliza la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes.
La Figura 5 ilustra un diseño ejemplar de ARNgus para dirigirse a los alelos de queratina 12 (K12) de tipo silvestre y mutante. Se diseñó un ARNgu para utilizar la PAM derivada de S P encontrada en el alelo K12-L132P (rojo). Esta PAM está ausente en el alelo de tipo silvestre. También se diseñó un segundo ARNgu dirigido tanto a los alelos de tipo silvestre como a los mutantes de K12 (verde) y se utilizó como control positivo.
La Figura 6 ilustra la evaluación de la especificidad alélica y la potencia de sgK12LP utilizando constructos de expresión exógena. Se emplearon constructos de expresión exógena para el K 12 silvestre y mutante para probar la especificidad alélica y la potencia de sgK12LP. (a) Un ensayo de luciferasa dual demostró la especificidad alélica del plásmido sgK12LP, mientras que la potencia se mostró comparable a la del constructo sgK12. N=8 (b ) La prueba de transferencia Western demostró además estos atributos con una notable reducción de la proteína K12-L132P en las células tratadas con sgK12LP en comparación con las células tratadas pero que expresan la proteína K12 de tipo silvestre. La p-actina se utilizó como control de carga. (c ) La PCR cuantitativa de la transcriptasa inversa para el total de K12 en las células que expresan tanto el alelo de tipo silvestre como el mutante demostró una desactiva de la expresión del mPvNA. N=4 (d) Las proporciones alélicas de esta desactivación de ARNm se cuantificaron entonces por pirosecuenciación, confirmando una desactivación del alelo mutante en las células que coexpresan ambos alelos de KRT12 y son tratadas con sgK12LP. N=4, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
La Figura 7 ilustra la NHEJ inducida por sgK12LP in vivo. Se observó la expresión de GFP en el epitelio corneal de los ratones a las 24 horas de la inyección intraestromal, lo que demuestra la eficacia de una inyección intraestromal de plásmido para transfectar el epitelio corneal(a; N=2). No se observó ninguna expresión de GFP a las 48 horas después de la inyección. La secuenciación del ADNg de ratones humanos heterocigotos K12-L132P inyectados con el constructo sgK12LP demostró grandes deleciones y la inducción de NHEJ debido a la escisión del alelo KRT12-L132P. De 13 clones secuenciados, se encontró que 5 habían sufrido NHEJ (b).
La Figura 8 muestra los resultados obtenidos con los ARN guía PAM derivados del SNP diseñados para las mutaciones R514P (A), L518R (B) y L509R (C ) del TGFBI, y se utilizó la expresión de la luciferasa para evaluar la expresión del alelo silvestre y del mutante. Se diseñó una guía de control positivo (sgW o sgWT) para cortar tanto el alelo WT (barra azul) como el MUT (barra roja) y, como se muestra arriba, corta ambos alelos como se esperaba. La guía utilizada para L518R (sgM o sgMUT) muestra la mayor especificidad alélica con un corte mínimo del alelo mutante (barra roja). La guía de control negativo (sgN o sgNSC), como era de esperar, no cortó ni el ADN WT ni el MUT.
La Figura 9 muestra los resultados utilizando ARN guía específicos para el alelo mutante diseñado para R124. Las mutaciones de TGFBI y la expresión de luciferasa se utilizaron para evaluar la expresión del alelo de tipo silvestre y del mutante. Se diseñó una guía WTsg de control positivo para cortar tanto el alelo WT como el MUT y, como se muestra arriba, corta ambos alelos como se esperaba (barras centrales en cada gráfico, barras azules y rojas). Las guías con la longitud de 20 mer mostraron más edición de ADN del alelo WT. El ensayo se repitió con guías de ARN específicas para cada alelo acortadas a 18 mer. Esto redujo la cantidad de corte de ADN WT (panel derecho de los gráficos y barras de la derecha en el gráfico (barras azules).
La Figura 10 muestra que el ojo izquierdo fue transfectado con un ARNgu de control negativo no específico, mientras que el ojo derecho fue transfectado con un ARNgu dirigido a Luc2.
La Figura 11 ilustra secuencias ejemplares de ARNgu, secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (Spy) y Staphylococcus aureus (Sau).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
I. Introducción
Las distrofias corneales son un grupo de trastornos hereditarios que se caracterizan por el depósito anormal bilateral de sustancias en la córnea, la parte frontal transparente del ojo. Se sabe que un subgrupo de estas distrofias corneales, las distrofias corneales epiteliales-estromales, están asociadas a mutaciones en el gen del factor de crecimiento transformante beta inducido (TGFpI). El gen TGFpI codifica una proteína que contiene RGD y que se une a los colágenos de tipo I, II y IV.
En algunos casos, las distrofias corneales epiteliales-estromales se distinguen unas de otras y se dividen en subtipos con base en el aspecto clínico de las opacidades, de las características clínicas de la enfermedad y de las propiedades de tinción histopatológica de los depósitos. Sin estar atado a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las mutaciones específicas en el gen TGFpI dan cuenta de los fenotipos específicos asociados con tales distrofias corneales y que las opacidades corneales que dan cuenta de las características clínicas de los diferentes fenotipos resultan de la deposición de toda o parte de la proteína TGFpI mutada codificada.
La terapia con base en células madre para la reparación y regeneración de tejidos ofrece tratamientos prometedores para una serie de trastornos oculares, incluyendo las distrofias corneales. Las células madre son capaces de autorrenovarse y diferenciarse para generar una variedad de linajes celulares maduros. El trasplante de estas células puede utilizarse como herramienta clínica para reconstituir un tejido objetivo (por ejemplo, el tejido corneal), restaurando así la funcionalidad fisiológica y anatómica.
Los avances en el desarrollo de reactivos para la manipulación de ácidos nucleicos han permitido una manipulación simple y eficiente de los ácidos nucleicos(por ejemplo, ADN y ARN) en las células madre. El desarrollo de los reactivos CRISPR ha proporcionado una focalización específica de la secuencia codificada en el ADN, mediada por el ARN, o dirigida por el ADN o el ARN. Los sistemas CRISPR pueden utilizarse, por ejemplo, para la inserción precisa de ADN donante en el genoma de una célula objetivo. Dichos reactivos de manipulación de ácidos nucleicos han permitido a los investigadores manipular con precisión elementos genómicos específicos.
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de procedimientos para el tratamiento de enfermedades oculares utilizando un enfoque con base en células madre. En realizaciones particulares, se obtienen células madre aisladas de un sujeto sometido a un tratamiento para una distrofia ocular y se modifican genéticamente utilizando reactivos del sistema CRISPR para corregir un alelo mutante asociado a la enfermedad ocular.
En el presente documento se divulga un procedimiento para el tratamiento de una distrofia corneal (por ejemplo, FIG.
1). El procedimiento, por ejemplo, incluye la manipulación de una mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal en una célula madre del sujeto para corregir la mutación del ácido nucleico, formando así una célula madre manipulada; y el trasplante de la célula madre manipulada al sujeto. El procedimiento puede incluir los pasos de obtener una pluralidad de células madre que incluyen la mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico de distrofia corneal objetivo del sujeto; b) manipular la mutación del ácido nucleico en una o más células madre de la pluralidad de células madre para corregir la mutación del ácido nucleico, formando así una o más células madre manipuladas; c) aislar la una o más células madre manipuladas; y d) trasplantar la una o más células madre manipuladas al sujeto. Las características del procedimiento en cuestión se analizan con más detalle a continuación.
II. Distrofias corneales
Los procedimientos proporcionados en el presente documento son para el tratamiento de una o más distrofias corneales en un sujeto que las necesita.
Los sujetos que pueden ser tratados con los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, sujetos mamíferos tales como un ratón, una rata, un perro, un babuino, un cerdo o un humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano. Los procedimientos pueden utilizarse para tratar a sujetos de al menos 1 año, 2 años, 3 años, 5 años, 10 años, 15 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, 65 años, 70 años, 75 años, 80 años, 85 años, 90 años, 95 años o 100 años de edad.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "distrofia corneal" se refiere a cualquiera de un grupo de trastornos hereditarios en la capa externa del ojo (córnea). Por ejemplo, la distrofia corneal puede caracterizarse por el depósito anormal bilateral de sustancias en la córnea. Las distrofias corneales incluyen, pero no se limitan a las siguientes cuatro categorías de distrofias corneales de la IC3D(Véase, por ejemplo ,Weiss et al., Cornea 34(2): 117-59 (2015)): distrofias epiteliales y subepiteliales, distrofias TGFpI epiteliales-estromales, distrofias estromales y distrofias endoteliales. En algunas realizaciones, la distrofia corneal se selecciona del grupo que consiste en distrofia de la membrana basal epitelial (EBMD), distrofia corneal de Meesmann (MECD), distrofia corneal de Thiel-Behnke (TBCD), distrofia corneal reticular (LCD), distrofia corneal granular (GCD) y distrofia corneal de Schnyder (SCD). En otras realizaciones, la distrofia corneal aquí mencionada excluye la MECD.
La distrofia corneal está causada por una o más mutaciones, tal como por , SNP, incluyendo las localizadas en un gen seleccionado del grupo que consiste en el factor de crecimiento transformante, beta-inducido(TGFB/), queratina 3(KRT3), queratina 12(Kr T12), G SN , y dominio UbiA preniltransferasa que contiene 1(UB/AD1). En otras realizaciones, el sitio SNP resulta en la codificación de un aminoácido mutante en una proteína mutante como se muestra en el presente documento. En otras realizaciones, una secuencia mutante que comprende el sitio SNP codifica una proteína mutante seleccionada del grupo que consiste en (i) proteínas TGFBI mutantes que comprenden una mutación correspondiente a Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Argl24Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630enAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, y/o Thr125_Glu126del en el TGFBI, por ejemplo, del número de acceso a la proteína Q15582; (ii) proteínas KRT3 mutantes que comprenden una mutación correspondiente a Glu498Val, Arg503Pro, y/o Glu509Lys en la proteína Queratina 3, por ejemplo, de Proteína de Acceso No. P12035 o NP_476429.2; (iii) proteínas Kr T12 mutantes con Met129Thr, Met129Val, Gln130Pro, Leu132Pro, Leu132Va, Leu132His, Asn133Lys, Arg135Gly, Arg135Ile, Arg135Thr, Arg135Ser, Ala137Pro, Leu140Arg, Val143Leu, Val143Leu, Lle391_Leu399dup, Ile 426Val, Ile 426Ser, Tyr429Asp, Tyr429Cys, Arg430Pro, y/o Leu433Arg en KRT12, por ejemplo, de Proteína de Acceso No. Q99456.1 o NP_000214.1; iv) proteínas GSN mutantes con Asp214Tyr en GSN, por ejemplo, de Proteína de Acceso No. P06396; y v) proteínas UBIAD1 mutantes que comprenden una mutación correspondiente a Ala97Thr, Gly98Ser, Asn102Ser, Asp112Asn, Asp112Gly, Asp118Gly, Arg119Gly, Leu121Val, Leu121Phe, Val122Glu Val122Gly, Ser171Pro, Tyr174Cys, Thr175Ile, Gly177Arg, Lys181Arg, Gly186Arg, Leu188His, Asn232Ser, Asn233His, Asp236Glu, y/o Asp240Asn en UBIAD1, por ejemplo, de Proteína de Acceso No. Q9Y5Z9. Por ejemplo, una secuencia mutante que comprende el sitio SNP codifica al menos una parte de la proteína TGFBI mutada mediante la sustitución de Leu por Arg en la posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácidos 509 de la Proteína de Acceso No. Q15582. En este caso, una mutación en el sitio del SNP puede ser responsable de la codificación del aminoácido mutante en la posición del aminoácido correspondiente a la posición del aminoácido 509 de la de Proteína de Acceso No. Q15582. Tal y como se utiliza en el presente documento, una mutación "correspondiente a" una mutación particular en una proteína humana puede incluir una mutación en una especie diferente que se produce en el sitio correspondiente de la mutación particular de la proteína humana. También como se utiliza en el presente documento, cuando se describe que una proteína mutante incluye un mutante particular, por ejemplo, de Leu509Arg, dicha proteína mutante puede comprender cualquier mutación que se produzca en un sitio mutante correspondiente al mutante particular en una proteína humana relevante, por ejemplo, en la proteína TGFBI de la Proteína de Acceso No. Q15582 como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el mutante descrito en el presente documento excluye cualquier mutante en la proteína KRT12. En algunas realizaciones, el mutante descrito en el presente documento excluye una mutación correspondiente a Leu132Pro en KRT12, por ejemplo, de la Proteína de Acceso No. Q99456.1. En otras realizaciones, el SNP descrito en el presente documento excluye cualquier SNP que ocurra en el gen KRT12 . En otras realizaciones, el SNP descrito en el presente documento excluye cualquier SNP que dé lugar a la mutación Leul32Pro en la proteína KRT12. El SNP puede excluir además el SNP en un sitio PAM (AAG>AGG) que da lugar a la mutación Leul32Pro en la proteína KRT12.
Las distrofias corneales epiteliales-estromales incluyen la distrofia corneal de Reis-Bucklers, la distrofia corneal de Thiel-Behnke, la distrofia corneal reticular tipo 1, la distrofia corneal granular tipo 1 y la distrofia corneal granular tipo 2. Las distrofias corneales estromales incluyen la distrofia corneal macular, la distrofia corneal de Schnyder, la distrofia corneal estromal congénita, la distrofia corneal amorfa posterior, la distrofia turbia central de Francois y la distrofia corneal pre-Descemet. En algunas realizaciones, los procedimientos son para el tratamiento de una distrofia corneal epitelial-estromal. En algunas realizaciones, la distrofia corneal es la distrofia corneal de Reis-Bucklers. En ciertas realizaciones, la distrofia corneal es la distrofia corneal de Thiel-Behnke. En ciertas realizaciones, la distrofia corneal es la distrofia corneal enrejada tipo 1. En ciertas realizaciones, la distrofia corneal es la distrofia corneal granular tipo 1. En ciertas realizaciones, la distrofia corneal es la distrofia corneal granular tipo 2. Las distrofias epitelialesestromales están causadas por mutaciones en TGFpI. En el presente documento, "Factor de crecimiento transformante, beta-inducido", "TGFBI", "TGFpI", "BIGH3", "CDB1", "CDG2", "CDG1", "CSD", "CSD1", "CSD2", "CSD3", "EBMD" y "LCD1" se refieren a una proteína que contiene RGD y que se une a los colágenos de tipo I, II y IV (números de acceso: NM_00358 y MP_000349 (humano) y NM_009369 y MP_033395 (ratón)). En los seres humanos, el TGFpI está codificado por el gen TGFBI, locus 5q31. El motivo RGD se encuentra en muchas proteínas de la matriz extracelular que modulan la adhesión celular y sirve como secuencia de reconocimiento de ligandos para varias integrinas. El TGFpI es inducido por el factor de crecimiento transformante beta y actúa inhibiendo la adhesión celular. En las distrofias epiteliales-estromales, mutaciones en el gen TGFBI, la estructura del TGFpI es anormal y se produce una acumulación del TGFpI mutante insoluble o de su fragmento proteolítico en la córnea.
En otras realizaciones, el sujeto tiene distrofia corneal granular tipo II. Tal y como se utiliza en el presente documento, "distrofia corneal granular tipo II", "distrofia corneal de Avellino", "distrofia corneal granular tipo 2" y "distrofia corneal combinada granular-red" se refieren a una forma autosómica dominante de distrofia corneal granular que está causada por una mutación en el gen TGFBI, localizado en el cromosoma 5q31. En algunos casos, la distrofia corneal granular de tipo II se caracteriza por la presencia de depósitos granulares bien delimitados de forma irregular en el estroma corneal central superficial, así como por el deterioro visual progresivo. Los pacientes heterocigotos que padecen distrofia corneal granular de tipo II presentan una pérdida de visión creciente con la edad, que se vuelve grave en los últimos años de la vida. Las lesiones aparecen en la primera década de vida y pueden ser evidentes a los 3 años de edad. El inicio de la distrofia corneal granular de tipo II suele ser más temprano en los pacientes homocigotos y puede acompañar a erosiones corneales leves. La agudeza visual suele ser buena hasta el final de la enfermedad. Las opacidades son inicialmente pequeños puntos blanquecinos superficiales. Posteriormente, se desarrollan opacidades estromales en forma de anillo o estrelladas. Las opacidades de la fase final son más superficiales y translúcidas, y pueden unirse en el estroma anterior.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene queratocono. El queratocono (KTCN) es el trastorno ectásico de la córnea más común, con aproximadamente un 6 - 23,5 % de sujetos con antecedentes familiares positivos (Wheeler, J., Hauser, M.A., Afshari, N.A., Allingham, R.R., Liu, Y., Reproductive Sys Sexual Disord 2012; S:6). La prevalencia declarada de KTCN oscila entre 8,8 y 54,4 por cada 100.000. Esta variación en la prevalencia se debe en parte a los diferentes criterios utilizados para diagnosticar la enfermedad. (Wheeler, J., Hauser, M.A., Afshari, N.A., Allingham, R.R., Liu, Y., Reproductive Sys Sexual Disord 2012; S:6y Nowak, D., Gajecka, M., Middle East Afr J Ophthalmol 2011 ; 18(1): 2-6). Existen muchos estudios en la literatura que intentan definir las causas genéticas del KTCN. Estos estudios han descubierto numerosas posibles variantes genéticas o S Ps que se cree que contribuyen a la etiología de la enfermedad en función de los parámetros experimentales.
Anteriormente, se descubrió que los individuos heterocigotos eran muy susceptibles de acelerar la pérdida de visión tras la cirugía ocular con láser LASIK. En particular, dos años después de la intervención quirúrgica se observó un aumento de la opacidad de la córnea en estos pacientes con una agresividad cada vez mayor, lo que acabó provocando la pérdida completa de la visión (Jun, R. M. et al., Opthalmology, 111:463, 2004). Anteriormente, la cirugía ocular se realizaba con la expectativa de que el LASIK o la cirugía con láser Excimer eliminaran la visión borrosa de un paciente que sufría distrofia corneal. Para un número hipotético de trescientos mil casos de cirugía LASIK, 300 personas habrían perdido la visión, con base en 1/1.000 de estimación mínima de pacientes heterocigotos que sufren distrofia corneal granular de tipo II. Los pacientes que se han sometido a la cirugía LASIK tienen principalmente entre 20 y 30 años y realizan actividades productivas. Además, tras la aprobación de la cirugía LASIK en el año 2000 en EE. UU., se ha descubierto que los pacientes afroamericanos que padecen distrofia corneal granular de tipo II y que se sometieron a la cirugía LASIK perdieron la vista, lo que infiere que podrían darse muchos casos similares en todo el mundo.
En algunas realizaciones, el sujeto que tiene distrofia corneal granular tipo II es homocigoto para una mutación en TGFpI. En otras realizaciones, el sujeto que tiene distrofia corneal granular tipo II es heterocigoto para una mutación en TGFpI. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación que codifica para una sustitución de arginina 124, arginina 555 o histidina 626 en un polipéptido de TGFpI. En realizaciones particulares, la mutación del ácido nucleico codifica para una selección de sustitución de aminoácidos entre R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q y H626P.
En ciertas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal granular tipo I y es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años. En algunas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal granular tipo I y tiene al menos 5, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 años.
En ciertas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal granular tipo II y es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años. En algunas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal granular tipo II y tiene al menos 5, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 años.
En ciertas realizaciones, el sujeto sometido a tratamiento tiene distrofia corneal reticular tipo 1 y es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años. En algunas realizaciones, el sujeto sometido a tratamiento tiene distrofia corneal reticular de tipo 1 y tiene al menos 5, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 años.
En ciertas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal de Reis-Bucklers y es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años. En algunas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal de Reis-Bucklers y tiene al menos 5, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 años.
En ciertas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal de Thiel-Behnke y es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años. En algunas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene distrofia corneal de Thiel-Behnke y tiene al menos 5, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 años.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene queratocono y es homocigoto para una mutación en uno de los siguientes ácidos nucleicos objetivo de la córnea: COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, Z F469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RA BP3L, KC MA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1. En otras realizaciones, el sujeto tiene queratocono y es heterocigoto para una mutación en uno de los siguientes ácidos nucleicos objetivo de la córnea: COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, Z F469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KC MA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que codifica para la sustitución de aminoácidos Q1334H en COL4A1. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido G683A en COL4A2. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido P718S en COL4A2. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido R517K en COL4A2. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido D326Y en COL4A3. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido H451R en COL4A3. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido V1327M en COL4A4. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido R158Q en LOX. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido A1046T en AKAP13. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido G624V en AKAP13. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido G2358R en Z F469. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido S158F en SLC29A3. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido P4493S en MUC5AC. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación del ácido nucleico que codifica para la sustitución del aminoácido P370S en CROCC.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3742207 (por ejemplo, el SNP identificado por rs3742207 en la base de datos dbSNP del National Center for Biotechnology). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3803230. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs9583500. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs7990383. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs55703767. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs11677877. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2229813. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs1800449. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs1053411. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2116780. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3749350. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2286194. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs12536657. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2614668. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs745191. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs12598474. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs10932976. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs5908678. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs35803438. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132728. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132729. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132730. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs859063. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2893276. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6687749. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13189855. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6876514. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6876515. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13361701. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs883764. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs780667. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs780668. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13166148. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs10941287. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs7907270. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs200922784. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs9435793. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs116300974. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ácido nucleico que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2233696.
En ciertas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene queratocono y es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años. En algunas realizaciones, el sujeto en tratamiento tiene queratocono y tiene al menos 5, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 años.
En ciertas realizaciones, el sujeto que se somete al tratamiento del sujeto tiene distrofia corneal granular tipo II y también se ha sometido a una cirugía ocular con láser. En algunas realizaciones, el tratamiento se lleva a cabo durante 6 meses o menos, 1 año o menos, 1,5 años o menos, 2 años o menos, 2,5 años o menos, 3 años o menos, 3,5 años o menos, 4 años o menos, 4,5 años o menos, 5 años o menos, 6 años o menos, 6,5 años o menos, 7 años o menos, 7,5 años o menos, 8 años o menos, 8,5 años o menos, 9 años o menos, 9,5 años o menos, 10 años o menos, 15 años o menos, 20 años o menos, 25 años o menos, 30 años o menos, 35 años o menos, 40 años o menos, 45 años o menos, 50 años o menos, 55 años o menos, 60 años o menos, 65 años o menos, 70 años o menos, 75 años o menos, 80 años o menos, 85 años o menos, 90 años o menos, 95 años o menos o 100 años o menos después de la cirugía ocular con láser.
En algunas realizaciones de los procedimientos proporcionados en el presente documento, la terapia se utiliza para proporcionar una respuesta terapéutica positiva con respecto a una enfermedad o condición (por ejemplo, una distrofia corneal). Por "respuesta terapéutica positiva" se entiende una mejora de la enfermedad o condición, y/o una mejora de los síntomas asociados a la enfermedad o condición. Los efectos terapéuticos de los procedimientos de tratamiento en cuestión pueden evaluarse mediante cualquier procedimiento adecuado. En ciertas realizaciones, el tratamiento se evalúa por la reducción de la deposición de proteínas en la córnea del sujeto después del tratamiento en comparación con un control (por ejemplo, la cantidad de deposición de proteínas antes del tratamiento). En algunas realizaciones, los procedimientos del sujeto reducen la cantidad de deposición de proteínas en la córnea en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99 % en comparación con la córnea antes de someterse al tratamiento. La opacidad de la córnea también puede utilizarse para evaluar el efecto terapéutico con los procedimientos del sujeto. Además, en algunas realizaciones, el tratamiento se evalúa mediante la función visual. La evaluación de la función visual del sujeto puede llevarse a cabo mediante cualquier prueba adecuada conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ello, las evaluaciones de la agudeza visual no corregida (UCVA), la agudeza visual mejor corregida (BCVA) y la prueba de agudeza luminosa (BAT). Véase, por ejemplo, Awaad et al., Am J Ophthalmol. 145(4): 656-661 (2008) y Sharhan et al., Br J Ophthalmol 84:837-841 (2000), relativos a las normas de evaluación de la agudeza visual. En ciertas realizaciones, la agudeza visual del sujeto mejora al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %), 85 %), 90 %, 95 % o 99 % en comparación con antes de someterse al tratamiento.
En algunas realizaciones, el sujeto se somete a la prueba de una o más distrofias corneales. En algunas realizaciones, el sujeto se somete a una prueba para detectar una mutación de ácido nucleico, tal como un SNP, asociada a la distrofia corneal descrita en el presente documento.
Por ejemplo, el sujeto se somete a una prueba para detectar una mutación de ácido nucleico en un ácido nucleico TGFpI objetivo. En ciertas realizaciones, el sujeto se somete a la prueba de una mutación de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácidos de arginina 124, arginina 555 o histidina 626 en un polipéptido de TGFpI. En algunas realizaciones, la mutación del ácido nucleico codifica para una selección de sustitución de aminoácidos entre R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q y H626P. Por ejemplo, las células bucales del sujeto se recogen mediante un hisopo bucal. Las células bucales recogidas se analizan para detectar la presencia de una o más mutaciones de ácido nucleico que codifican para una sustitución de aminoácidos de arginina 124, arginina 555 o histidina 626 en un polipéptido TGFpI. En algunas realizaciones, la distrofia corneal se detecta, por ejemplo, a través de la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) relacionados con la distrofia corneal de Avellino, tal como los que dan lugar a mutaciones R124 en el gen TGFpI (incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a una mutación R124H causada por una transición de G a en el nucleótido 418 del gen TGFpI, también denominada C(G/A)C SNP). En algunas realizaciones, la distrofia corneal se detecta, por ejemplo, a través de la detección de los SNP relacionados con la distrofia corneal granular, tal como los que dan lugar a mutaciones R555 en el gen TGFpI (incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a una mutación R555W causada por una transición C a T en el nucleótido 1663 del gen TGFpI, también denominada SNP (C/T)GG). En algunas realizaciones, la distrofia corneal se detecta, por ejemplo, a través de la detección de los SNP relacionados con la distrofia de celosía, tal como los que dan lugar a mutaciones R124 y/o 626 en el gen TGFpI (incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a una mutación R124C causada por una transición C a T en el nucleótido 417 del gen TGFpI, también denominada SNP (C/T)GC, o una mutación H626P causada por una transición A a C en el nucleótido 1924 del gen TGFpI. En algunas realizaciones, la distrofia corneal se detecta, por ejemplo, a través de la detección de los SNP relacionados con la distrofia corneal de Reis-Buckler, tal como los que dan lugar a mutaciones R124 en el gen TGFpI (incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a una mutación R124L causada por una transición de G a T en el nucleótido 418 del gen TGFpI, también denominada C(G/T)C SNP). En algunas realizaciones, la distrofia corneal se detecta, por ejemplo, a través de la detección de los SNP relacionados con la distrofia corneal de Thiel-Behnke, tal como los que dan lugar a mutaciones R555 en el gen TGFpI (incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a una mutación R555Q causada por una transición de G a A en el nucleótido 1664 del gen TGFpI, también denominada C(G/A)G SNP). En algunas realizaciones, el sujeto se somete a una prueba para detectar una mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal asociada al queratocono. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1.
III. Células madre
Las células madre epiteliales limbales se obtienen del sujeto que necesita el tratamiento para la distrofia corneal. Las células madre obtenidas son portadoras de una mutación en un gen asociado a la distrofia corneal concreta que se va a tratar (por ejemplo, células madre que tienen una mutación en un gen TGFBI de un sujeto que tiene una distrofia epitelial-estromal, como se ha comentado anteriormente).
Las células madre epiteliales limbales (LESC) se localizan en la región limbal de la córnea y son responsables del mantenimiento y reparación de la superficie corneal. Sin estar atado a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las LESC experimentan una división celular asimétrica produciendo una célula madre que permanece en el nicho de células madre para repoblar la agrupación de células madre, y una célula hija transitoria amplificadora temprana (eTAC). Esta eTAC más diferenciada se retira del nicho de células madre y es capaz de dividirse para seguir produciendo células amplificadoras transitorias (TAC), dando lugar finalmente a células diferenciadas terminales (DC). Las LESC pueden obtenerse, por ejemplo, tomando una biopsia del ojo del sujeto. Véase, por ejemplo, Pellegrini et al., Lancet 349: 990-993 (1997). Las LESC obtenidas a partir de biopsias limbales pueden aislarse y clasificarse para su uso en los procedimientos objeto de estudio utilizando cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a , la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y las técnicas de centrifugación. Las LESC pueden clasificarse a partir de biopsias utilizando la expresión positiva de marcadores asociados a las células madre y la expresión negativa de marcadores de diferenciación. Los marcadores positivos de células madre incluyen, pero no se limitan a, el factor de transcripción p63, ABCG2, C/EBP6 y Bmi-1. Los marcadores negativos específicos de la córnea incluyen, pero no se limitan a, citoqueratina 3 (CK3), citoqueratina 12 (CK12), conexina 43 y la involucrina. En algunas realizaciones, la pluralidad de células madre es positiva para la expresión de p63, ABCG2 o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, al menos el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %. 85 %, 86 %. 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las células de la pluralidad de células madre expresan p63, ABCG2, C/EBP6 y Bmi-1 o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la pluralidad de células madre es negativa para la expresión de CK3, CK12, conexina 43, involucrina o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, al menos el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %. 85 %, 86 %. 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las células de la pluralidad de células madre no expresan CK12, conexina 43, involucrina o combinaciones de las mismas. Otros marcadores útiles para la LESC se describen, por ejemplo, en Takacs et al., Cytometry A 75: 54-66 (2009). Las características de las células madre, tales como el tamaño de la célula y la elevada relación núcleo a citoplasma, también pueden utilizarse para ayudar a la identificación de las LESC.
Después del aislamiento, la pluralidad de células madre (las LESC) puede ser cultivada utilizando cualquier procedimiento adecuado para producir una línea celular estable. Las células madre pueden cultivarse antes y/o después de la manipulación de una mutación de ácido nucleico descrita en el presente documento. Por ejemplo, los cultivos pueden mantenerse en presencia o ausencia de células de fibroblastos (por ejemplo, 3T3) como células alimentadoras. En otros casos, se utilizan células epiteliales amnióticas humanas o fibroblastos embrionarios humanos como capas de alimentación para los cultivos. Las técnicas adecuadas para el cultivo de las LESC se describen con más detalle en Takacs et al. Citometría A 75: 54-66 (2009), Shortt et al., Surv Opthalmol Vis Sci 52: 483-502 (2007); y Cauchi et al. Am J Ophthalmol 146: 251-259 (2008).
IV. Reactivos de Manipulación de Ácidos Nucleicos
Se manipula una mutación del ácido nucleico en una célula madre para corregir la mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal. Como se utiliza en el presente documento, un "ácido nucleico objetivo de distrofia corneal" se refiere a un ácido nucleico como el definido en la reivindicación 1 que incluye una mutación asociada a una o más de las distrofias corneales.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal está localizado en el gen TGFBI, KRT3, KRT12, GSN y UBIAD1 . En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal se asocia con un sitio SNP que resulta en la codificación de un aminoácido mutante en una proteína mutante como se muestra en el presente documento. En otras realizaciones, una secuencia mutante que comprende el sitio SNP codifica una proteína mutante seleccionada del grupo que consiste en (i) proteínas TGFBI mutantes que comprenden una mutación correspondiente a Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Argl24Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630enAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu, y/o Thr125_Glu126del en TGFBI, por ejemplo, de la Proteína de Acceso No. Q15582; (ii) proteínas KRT3 mutantes que comprenden una mutación correspondiente a Glu498Val, Arg503Pro, y/o Glu509Lys en la proteína Queratina 3, por ejemplo, de la Proteína de Acceso No. P12035 o NP_476429.2; (iii) proteínas KRT12 mutantes con Met129Thr, Met129Val, Gln130Pro, Leu132Pro, Leu132Va, Leu132His, Asn133Lys, Arg135Gly, Arg135Ile, Arg135Thr, Arg135Ser, Ala137Pro, Leu140Arg, Val143Leu, Val143Leu, Lle391_Leu399dup, Ile426Val, Ile426Ser, Tyr429Asp, Tyr429Cys, Arg430Pro, y/o Leu433Arg en KRT12, por ejemplo, de la Proteína de Acceso No. Q99456.1 o NP_000214.1; iv) proteínas g Sn mutantes con Asp214Tyr en GSN, por ejemplo, de la Proteína de Acceso No. P06396; y v) proteínas UBIAD1 mutantes que comprenden una mutación correspondiente a Ala97Thr, Gly98Ser, Asn102Ser, Asp112Asn, Asp112Gly, Asp118Gly, Arg119Gly, Leu121Val, Leu121Phe, Val122Glu Val122Gly, Ser171Pro, Tyr174Cys, Thr175Ile, Gly177Arg, Lys181Arg, Gly186Arg, Leu188His, Asn232Ser, Asn233His, Asp236Glu, y/o Asp240Asn en UBIAD1, por ejemplo, de la Proteína de Acceso No. Q9Y5Z9.
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal está asociado con la distrofia corneal granular tipo II (por ejemplo, TGFpI). En otras realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal está asociado al queratocono. Sin estar atado a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las mutaciones representadas en la Figura 2 están asociadas con el queratocono. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una o más de las mutaciones representadas en la Figura 2.
Las células madre que se van a manipular incluyen células madre individuales aisladas o células madre de una línea celular establecida a partir de las células madre aisladas. Se puede utilizar cualquier procedimiento de manipulación genética adecuado para corregir la mutación del ácido nucleico en las células madre.
En ciertas realizaciones, se introducen reactivos de manipulación de ácidos nucleicos en las células madre. Dichos reactivos de manipulación del ácido nucleico corrigen posteriormente la mutación del ácido nucleico en la célula madre para formar células madre manipuladas. Los reactivos de manipulación del ácido nucleico incluyen, entre otros, las nucleasas Zing-finger (ZFN), las nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN) y los reactivos de sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR). Véase, por ejemplo, Gaj et al., Trends Biotechnol 31(7): 397-405 (2013). Dichos reactivos funcionan permitiendo la modificación eficiente y precisa de un ácido nucleico objetivo mediante la inducción de roturas de doble cadena (DSB) en el ADN objetivo que estimulan el mecanismo celular de reparación del ADN, incluyendo las vías de reparación dirigidas por homología (HDR). En presencia de un ácido nucleico de reparación homológica que contiene un alelo de tipo silvestre de la mutación del ácido nucleico(por ejemplo, un TGFBI de tipo silvestre o un fragmento del mismo), el ácido nucleico objetivo mellado se somete a recombinación homóloga, sustituyendo así el alelo mutante por el alelo de tipo silvestre y corrigiendo la mutación del ácido nucleico en la célula madre manipulada.
En algunos casos, los reactivos de manipulación del ácido nucleico objetivo utilizados con los procedimientos sujetos proporcionados en el presente documento incluyen reactivos del sistema CRISPR. Los reactivos del sistema CRISPR utilizados con los procedimientos en cuestión incluyen, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una nucleasa de Tipo II(porejemplo, la nucleasa Cas9 o una nucleasa Cpfl), un ácido nucleico que codifica un ARN guía (ARNg) y un ácido nucleico de reparación que incluye un alelo de tipo silvestre del gen de interés o un fragmento del mismo. El ARN guía incluye un ARN c RiSPR (ARNcr) en combinación con un ARN CRISPR trans-activador (ARNtra). En algunas realizaciones que utilizan reactivos del sistema CRISPR, el ARNcr y el ARNtra se incluyen como reactivos separados en lugar de un ARN guía.
El ácido nucleico de reparación es capaz de someterse a la recombinación homóloga por la vía de la HDR en una región del genoma de una célula madre que incluye una mutación asociada a una distrofia corneal como se describe en el presente documento (es decir, un "ácido nucleico objetivo de distrofia corneal"). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con un ácido nucleico objetivo dentro del gen TGFBI, KRT3, KRT12, GSN y UBIAD1 . En realizaciones particulares, la molécula de nucleótidos de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con un ácido nucleico del gen TGFBI que codifica un aminoácido mutante descrito en el presente documento (por ejemplo, Leul32Pro). En algunas realizaciones, el al menos un vector incluye múltiples ácidos nucleicos de reparación. El ácido nucleico de reparación puede incluir además una etiqueta para la identificación y clasificación de las células descritas en el presente documento que contienen la mutación específica. Las etiquetas ejemplares que pueden incluirse con la molécula de nucleótidos de reparación incluyen etiquetas fluorescentes y códigos de barras de ácidos nucleicos que son identificables por su longitud o secuencia.
Los ácidos nucleicos que codifican la nucleasa de tipo II y el ARN guía pueden estar cada uno de ellos unido de forma operativa a un elemento regulador y pueden incluirse en un único vector o en vectores diferentes. En algunas realizaciones, el ARN guía y la nucleasa de tipo II se incluyen en el mismo vector. En algunas realizaciones, el ARN guía y la nucleasa de tipo II se incluyen en vectores diferentes.
En algunas realizaciones ejemplares, los vectores que incluyen los ácidos nucleicos que codifican el ARN guía y/o la nucleasa de Tipo II son capaces de integrarse de forma estable en el genoma celular de una o más células de la pluralidad de células madre. En algunos ejemplos, la nucleasa de Tipo II y el ARN guía no aparecen juntos en la naturaleza. Los reactivos del sistema CRISPR y los procedimientos para su uso de la presente invención se describen con más detalle, por ejemplo, en Shalem et al., Nature Reviews Genetics 16: 299-311 (2013)Zhang et al., Human Molecular Genetics 23 (Rl): R40-6 (2014) Zetsche et al. dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038 (2015) y Zhu et al. Celda 157: 1262-1278 (2014).
En el sistema CRISPR, un complejo de ARNg/ nucleasa Tipo II es reclutado a una secuencia genómica objetivo por el emparejamiento de bases entre la secuencia de ARNg y el complemento del ácido nucleico objetivo. La unión del complejo ARNg/nucleasa Tipo II localiza a la nucleasa Tipo II en la secuencia genómica objetivo, de modo que la nucleasa Tipo II puede cortar ambas cadenas de ADN causando una rotura de doble cadena (DSB).
La reparación de la DSB puede producirse a través de (1) la vía de reparación del ADN de Unión de Extremos No Homólogos (NHEJ) o (2) la vía de Reparación Dirigida por Homología (HDR). La vía de reparación NHEJ a menudo da lugar a inserciones/deleciones (InDels) en el sitio de la DSB que pueden dar lugar a cambios de marco y/o codones de parada prematuros, interrumpiendo efectivamente el marco de lectura abierto (ORF) del ácido nucleico objetivo, disminuyendo así la expresión del producto génico codificado por el ácido nucleico objetivo. La vía de la HDR requiere la presencia de un ácido nucleico de reparación, que se utiliza para fijar el DSB. Los cambios de nucleótidos específicos(por ejemplo, un alelo de tipo salvaje) pueden introducirse en un gen mutante dirigido mediante el uso de HDR con un ácido nucleico de reparación. La vía de la HDR puede utilizarse, por ejemplo, para corregir una mutación en una célula madre, cuando la mutación está vinculada a un trastorno de la córnea descrito en el presente documento(por ejemplo, gen TGFBI).
Los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos incluyen un ácido nucleico de reparación. El ácido nucleico de reparación introduce un alelo específico (por ejemplo, un alelo de tipo silvestre) en el genoma de una o más células de la pluralidad de células madre tras la reparación de un DSB inducido por una nucleasa Tipo II a través de la vía HDR. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es un ADN monocatenario (ADNss). En otras realizaciones, el ácido nucleico de reparación se introduce en la célula como un vector plasmídico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45, 45 a 50, 50 a 55, 55 a 60, 60 a 65, 65 a 70, 70 a 75, 75 a 80, 80 a 85, 85 a 90, 90 a 95, 95 a 100, 100 a 105, 105 a 110, 110 a 115, 115 a 120, 120 a 125, 125 a 130, 130 a 135, 135 a 140, 140 a 145, 145 a 150, 150 a 155, 155 a 160, 160 a 165, 165 a 170, 170 a 175, 175 a 180, 180 a 185, 185 a 190, 190 a 195, o 195 a 200 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación tiene una longitud de 200 a 300, 300, a 400, 400 a 500, 500 a 600, 600 a 700, 700 a 800, 800 a 900, 900 a 1.000 nucleótidos. En otras realizaciones, el ácido nucleico de reparación tiene de 1.000 a 2.000, 2.000 a 3.000, 3.000 a 4.000, 4.000 a 5.000, 5.000 a 6.000, 6.000 a 7.000, 7.000 a 8.000, 8.0009.000, o 9.000 a 10.000 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es capaz de someterse a la recombinación homóloga por la vía de la HDR en una región del genoma de una célula madre que incluye una mutación asociada a una distrofia corneal como se describe en el presente documento (es decir, un "ácido nucleico objetivo de distrofia corneal"). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con un ácido nucleico objetivo dentro del gen TGFBI. En realizaciones particulares, el ácido nucleico de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con un ácido nucleico del gen TGFBI que codifica para arginina 124, arginina 555 o histidina 626 en un polipéptido TGFpI. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con un ácido nucleico del gen TGFBI que codifica para una selección de sustitución de aminoácidos entre R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q y H626P. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación comprende un ácido nucleico que codifica para arginina 124 de un polipéptido TGFpI. Por ejemplo, el ácido nucleico de reparación se utiliza para insertar citosina en el nucleótido 417 de un gen TGFpI (por ejemplo, para corregir una transición C a T en el nucleótido 417 del gen TGFpI), guanina en el nucleótido 418 de un gen TGFpIf por ejemplo, para corregir una transición G a A o G a T en el nucleótido 418 del gen TGFpI). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de reparación comprende un ácido nucleico que codifica para la arginina 555 de un polipéptido TGFpI. Por ejemplo, el ácido nucleico de reparación se utiliza para insertar citosina en el nucleótido 1663 del gen TGFpI (por ejemplo, para corregir una transición de C a T en el nucleótido 1663 del gen TGFpI) y para insertar guanina en el nucleótido 1664 de un gen TGFpI (por ejemplo, para corregir una transición de G a A en el nucleótido 1663 del gen TGFpI). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de reparación comprende un ácido nucleico que codifica para la histidina 626 de un polipéptido TGFpI. Por ejemplo, el ácido nucleico de reparación se utiliza para insertar adenina en el nucleótido 1924 de un gen TGFpI (por ejemplo, para corregir una transición de A a C en el nucleótido 1924 del gen TGFpI). En otras realizaciones, el ácido nucleico de reparación comprende un ácido nucleico que codifica para arginina 124, arginina 555 y histidina 626 de un polipéptido TGFpI.
En otras realizaciones, el ácido nucleico de reparación que es capaz de recombinarse homológicamente con un ácido nucleico objetivo de distrofia corneal está asociado con el queratocono (por ejemplo, un ácido nucleico objetivo que incluye una o más de las mutaciones representadas en la Figura 2). En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación en COL4A1-4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256022.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3742207(por ejemplo, SNP identificado por rs3742207 en la base de datos dbSNP del National Center for Biotechnology Information). En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3803230. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs9583500. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs7990383. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs55703767. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs11677877. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2229813. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs1800449. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs1053411. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2116780. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs3749350. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2286194. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs12536657. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2614668. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs745191. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs12598474. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs10932976. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs5908678. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs35803438. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132728. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132729. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs132730. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs859063. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2893276. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6687749. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13189855. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6876514. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs6876515. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13361701. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs883764. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador del grupo S P de referencia rs780667. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs780668. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs13166148. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs10941287. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs7907270. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs200922784. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs9435793. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs116300974. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal incluye una mutación que corresponde al identificador de grupo SNP de referencia rs2233696.
En algunas realizaciones, los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos de reparación múltiple. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de reparación comprenden un ácido nucleico que codifica para arginina 124 de un polipéptido TGFpI y un ácido nucleico que codifica para arginina 555 del polipéptido TGFpI. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de reparación comprenden además un ácido nucleico que codifica para histidina 626 de un polipéptido TGFpI. En algunas realizaciones, los reactivos del sistema CRISPR utilizados con los procedimientos del sujeto incluyen un primer ácido nucleico que codifica un primer ARN guía para el ácido nucleico que codifica para arginina 124 de un polipéptido TGFpI y un segundo ácido nucleico que codifica un segundo ARN guía para el ácido nucleico que codifica para arginina 555 de un polipéptido TGFpI. En algunas realizaciones, los reactivos del sistema CRISPR incluyen además un tercer ácido nucleico que codifica un tercer ARN guía para el ácido nucleico que codifica histidina 626. En algunas realizaciones, los reactivos del sistema CRISPR incluyen además cualquier combinación del primer ácido nucleico, el segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico (por ejemplo, una combinación del primer ácido nucleico y el tercer ácido nucleico, o una combinación del segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico). En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación es capaz de reparar un ácido nucleico objetivo de distrofia corneal que codifica para una o más sustituciones de aminoácidos que incluyen Q1334H en COL4A1, G683A en COL4A2, P718S en COL4A2, R517K en COL4A2, D326Y en COL4A3, H451R en COL4A3, V1327M en COL4A4, R158Q en LOX, A1046T en AKAP13, G624V en AKAP13, G2358R en Z F469, S158F en SLC29A3, P4493S en MUC5AC, P370S en CROCC o combinaciones de los mismos.
El ácido nucleico de reparación puede incluir además una etiqueta para identificar y clasificar las células madre que contienen la mutación específica. Las etiquetas ejemplares que pueden incluirse con el ácido nucleico de reparación incluyen etiquetas fluorescentes y códigos de barras de ácido nucleico que son identificables por su longitud o secuencia.
En otras realizaciones, los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos también incluyen uno o más reactivos que promueven la vía HDR sobre la reparación HNEJ de las DSB. Estos reactivos permiten ventajosamente la recombinación homóloga del ácido nucleico de reparación por la vía de la HDR. Los reactivos que promueven la vía HDR sobre la reparación HNEJ de las DSB incluyen, pero no se limitan a, agentes que reprimen los genes que participan en la reparación HNEJ, por ejemplo, la ADN ligasa IV. Véase, por ejemplo, Maruyana et al. Nat Biotechnol.
33(5): 538-42 (2015).
La nucleasa Tipo II utilizada con los procedimientos del sujeto proporcionados en el presente documento puede ser una nucleasa Tipo II inducible que está optimizada para la expresión de una manera temporal o dependiente del tipo de célula. Los promotores inducibles que pueden vincularse a la nucleasa de tipo II incluyen, entre otros, promotores inducibles por tetraciclina, promotores de metalotioneína, promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por metionina (por ejemplo, promotores MET25, MET3) y promotores inducibles por galactosa (promotores GAL1, GAL7 y GALlO). Otros promotores adecuados son los promotores de alcohol deshidrogenasa ADH1 y ADH2 (reprimidos en glucosa, inducidos cuando se agota la glucosa y se fabrica etanol), el promotor de la metalotioneína CUP1 (inducido en presencia de Cu2+, Zn2+), el promotor PHO5, el promotor CYC1, el promotor HIS3, el promotor PGK, el promotor GAPDH, el promotor ADC1, el promotor TRP1, el promotor URA3, el promotor LEU2, el promotor ENO, el promotor TP1 y el promotor AOX1.
También pueden utilizarse nucleasas mutantes Tipo II que presentan una especificidad mejorada (véase, por ejemplo, Ann Ran et al. Cell 154(6) 1380-89 (2013)). Los reactivos de manipulación del ácido nucleico también pueden incluir una nucleasa Tipo II desactivadafpor ejemplo, dCas9). La unión de Cas9 desactivada a elementos de ácido nucleico por sí sola puede reprimir la transcripción al obstaculizar estéricamente la maquinaria de la ARN polimerasa. Además, el Cas desactivado puede utilizarse como un dispositivo de localización para otras proteínas (por ejemplo, represores transcripcionales, activadores y dominios de reclutamiento) que afectan a la expresión génica en el sitio objetivo sin introducir mutaciones irreversibles en el ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, dCas9 puede fusionarse con dominios represores de la transcripción, como los efectores KRAB o SID, para promover el silenciamiento epigenético en un sitio objetivo. Cas9 también puede convertirse en un activador transcripcional sintético mediante la fusión con los dominios de activación VP16/VP64 o p64.
Los reactivos de manipulación del ácido nucleico pueden introducirse en las células madre mediante cualquier procedimiento adecuado. Los procedimientos ejemplares para introducir los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación y procedimientos con base en virus.
En algunos casos, los uno o más reactivos de captación celular son reactivos de transfección. Los reactivos de transfección incluyen, por ejemplo, reactivos de transfección con base en polímeros (por ejemplo, DEAE dextrano) y reactivos de transfección mediada por liposomas catiónicos. También pueden utilizarse procedimientos de electroporación para facilitar la captación de los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos. Al aplicar un campo externo, se induce una alteración del potencial transmembrana en una célula, y cuando el valor neto del potencial transmembrana (la suma de la diferencia de potencial aplicada y en reposo) es mayor que un umbral, se generan estructuras de permeabilidad transitoria en la membrana y se consigue la electroporación. Véase, por ejemplo, Gehl et al., Acta Physiol. Escand. 177:437-447 (2003).
Los reactivos de manipulación del ácido nucleico también pueden ser entregados a través de la transducción viral en las células madre. Los sistemas de administración viral adecuados incluyen, pero no se limitan a, sistemas de administración de virus adeno-asociados (AAV) retrovirales y lentivirus. Estos sistemas de administración viral son particularmente útiles en los casos en que la célula madre es resistente a la transfección. Los procedimientos que utilizan un sistema de entrega mediado por virus pueden incluir además un paso de preparación de vectores virales que codifican los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos y el empaquetamiento de los vectores en partículas virales. Otros procedimientos de administración de reactivos de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policationes o lípidos: ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales y la captación de ácidos nucleicos potenciada por agentes. Véase también Neiwoehner et al., Nucleic Acids Res. 42: 1341-1353 (2014).
En un aspecto, la mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de distrofia corneal en una célula madre se manipula introduciendo un sistema diseñado de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR)/proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9) en la célula madre, donde el sistema CRISPR/Cas9 comprende al menos un vector que comprende una molécula de nucleótidos que codifica la nucleasa Cas9 y un ARN guía único (ARNsg), y la nucleasa Cas9 y dicho ARNsg no se encuentran juntos de forma natural.
Los términos "de origen no natural" o "diseñados" se utilizan indistintamente e indican la participación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a las moléculas de ácido nucleico o a los polipéptidos, indican que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido están al menos sustancialmente libres de al menos otro componente con el que están asociados de forma natural y tal como se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, la nucleasa Cas9 y el ARNgu no se encuentran juntos de forma natural.
El sistema CRISPR/Cas9 de ingeniería puede introducirse en las células utilizando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica y los descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la introducción puede comprender la administración del sistema diseñado CRISPR/Cas9 descrito en el presente documento a células madre en cultivo, o en un organismo huésped. Como se ha comentado anteriormente, los procedimientos ejemplares para introducir el sistema CRISPR/Cas9 modificado incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación y procedimientos con base en virus. En algunos casos, los uno o más reactivos de captación celular son reactivos de transfección. Los reactivos de transfección incluyen, por ejemplo, reactivos de transfección con base en polímeros (por ejemplo, DEAE dextrano) y reactivos de transfección mediada por liposomas catiónicos. También pueden utilizarse procedimientos de electroporación para facilitar la captación de los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos. Al aplicar un campo externo, se induce una alteración del potencial transmembrana en una célula, y cuando el valor neto del potencial transmembrana (la suma de la diferencia de potencial aplicada y en reposo) es mayor que un umbral, se generan estructuras de permeabilidad transitoria en la membrana y se consigue la electroporación. Véase, por ejemplo, Gehl et al., Acta Physiol. Escand. 177:437-447 (2003). El sistema diseñado CRISPR/Cas9 también se puede introducir mediante transducción viral en las células. Los sistemas de administración viral adecuados incluyen, pero no se limitan a, los sistemas de administración de virus adeno-asociados (AAV), retrovirales y lentivirus. Estos sistemas de administración viral son útiles en los casos en que la célula es resistente a la transfección. Los procedimientos que utilizan un sistema de entrega mediado por virus pueden incluir además un paso de preparación de vectores virales que codifican los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos y el empaquetamiento de los vectores en partículas virales. Otros procedimientos de administración de reactivos de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policationes o lípidos: ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales y la captación de ácidos nucleicos potenciada por agentes. Véase también Neiwoehner et al., Nucleic Acids Res. 42: 1341­ 1353 (2014), y Patente de EE. UU. No. 5,049,386, 4,946,787y 4,897,355. En algunas realizaciones, la introducción se lleva a cabo mediante sistemas de entrega de vectores no virales que incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ejemplo, una transcripción de un vector descrito en el presente documento), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de entrega, tal como un liposoma. La entrega puede ser a las células (por ejemplo, administración in vitro o ex vivo) o a los tejidos objetivo (por ejemplo, administración in vivo).
En general, el "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a los transcritos y otros elementos implicados en la expresión o dirigen la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo las secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activador) (por ejemplo ARNtra o un ARNtra parcial activo), una secuencia tracr-mate (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtra en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada "ARNcr" en el presente documento, o un "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), y/o otras secuencias y transcripciones de un locus CRISPR. Como se ha descrito anteriormente, el ARNgu es una combinación de al menos ARNtra y ARNcr. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un sistema CRISPR tipo II. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes o Staphylococcus aureus. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por tener elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en el lugar de una secuencia objetivo (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia con la que una secuencia guía está diseñada para tener complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente una complementariedad total, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. En esta divulgación, "sitio objetivo" se refiere a un sitio de la secuencia objetivo que incluye tanto la secuencia objetivo como su secuencia complementaria, por ejemplo, en nucleótidos de doble cadena. En algunas realizaciones, el sitio objetivo descrito en el presente documento puede indicar una primera secuencia objetivo que se hibrida con ARNgu o ARNcr del sistema CRISPR/Cas9, y/o una segunda secuencia objetivo adyacente al extremo 5' de una PAM. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia objetivo está localizada en el núcleo o en el citoplasma de una célula. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo está localizada dentro de un orgánulo de una célula eucariótica, por ejemplo, mitocondria o cloroplasto.
El ARNgu puede ser artificial, hecho por el hombre, sintético y/o de origen no natural. En algunas realizaciones, el ARNgu comprende (i) una secuencia de ARN objetivo CRISPR (ARNcr) y (ii) una secuencia de ARNcr trans-activador (ARNtra), que también puede denominarse "andamio ARNgu" En algunas realizaciones, la secuencia de ARNcr y la secuencia de ARNtra no se dan juntas de forma natural. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ARNgu" puede referirse a un ARN guía único que contiene (i) una secuencia guía (secuencia ARNcr) y (ii) una secuencia reclutadora de nucleasas Cas9 (ARNtra). La secuencia de ARNcr puede ser una secuencia homóloga a una región de su gen de interés y puede dirigir la actividad de la nucleasa Cas9. La secuencia de ARNcr y la del ARNtra no aparecen juntas de forma natural. El ARNgu puede entregarse como ARN o mediante la transformación con un plásmido con la secuencia que codifica ARNgu (gen ARNgu) bajo un promotor.
En algunas realizaciones, el ARNgu o el ARNcr se hibridan con al menos una parte de una secuencia objetivo (por ejemplo, la secuencia del genoma objetivo), y el ARNcr puede tener una secuencia complementaria a la secuencia objetivo. La "complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico de formar enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico, ya sea de tipo Watson-Crick tradicional o de otro tipo no tradicional. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % complementarios). "Perfectamente complementario" indica que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán por enlace de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos de una segunda secuencia de ácido nucleico. "Sustancialmente complementario", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que hibridan en condiciones estrictas. Tal y como se utiliza en el presente documento, las "condiciones estrictas" para la hibridación se refieren a las condiciones en las que un ácido nucleico que tiene complementariedad con una secuencia objetivo se hibrida predominantemente con la secuencia objetivo, y sustancialmente no se hibrida con secuencias no objetivo. Las condiciones estrictas suelen depender de la secuencia y varían en función de una serie de factores. En general, cuanto más larga es la secuencia, mayor es la temperatura a la que la secuencia hibrida específicamente con su secuencia objetivo. Ejemplos no limitativos de condiciones estrictas se describen en detalle en Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology- Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1 , Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y. La "hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede producirse mediante el emparejamiento de bases Watson Crick, la unión Hoogstein o de cualquier otra forma específica de la secuencia. El complejo puede comprender dos cadenas que formen una estructura dúplex, tres o más cadenas que formen un complejo multicadena, una sola cadena autohibridante, o cualquier combinación de éstas. Una reacción de hibridación puede constituir un paso en un procedimiento más extenso, tal como la iniciación de la RGP, o la escisión de un polinucleótido por una enzima. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se denomina "complemento" de la secuencia dada. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" puede referirse a un intervalo de valores que son similares al valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 15, 10, 9, 8,7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 por ciento o menos del valor de referencia indicado. En otras realizaciones, el ARNcr o la secuencia guía tiene una longitud de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos. En otras realizaciones, el ARNcr incluye las secuencias nucleotídicas de TAGGAAGCTAATCTATCATT (SEQ ID NO: 9). En otras realizaciones, el ARNcr excluye las secuencias de ARNcr que tienen las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, el ARNcr excluye las secuencias de ARNcr que hibridan con una secuencia de nucleótidos que comprende un SNP que da lugar a la mutación L132P en la proteína kratina 12. En otras realizaciones, el ARNcr excluye las secuencias de ARNcr que hibridan con una secuencia de nucleótidos que comprende un SNP que da lugar a una mutación en la proteína queratina 12.
En algunas realizaciones, el ARNtra proporciona una estructura de horquilla que activa a Cas9 para abrir el ADNds para la unión de la secuencia de ARNcr. El ARNtra puede tener una secuencia complementaria a la repetición palindrómica. Cuando el ARNtra se hibrida con la repetición palindrómica corta, puede desencadenar el procesamiento por parte de la ribonucleasa bacteriana específica del ARN de doble cadena, la ARNasa III. En otras realizaciones, el ARNtra puede tener las SPIDR (Repeticiones Directas Intercaladas de Espaciador), que constituyen una familia de loci de ADN que suelen ser específicos de una especie bacteriana concreta. El locus CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencias cortas intercaladas (SSR) que fueron reconocidas en E. coli (Ishino et al., J. Bacterid., 169:5429-5433 [1987]; y Nakata et al., J. Bacterid., 171 :3553-3556 [1989]), y los genes asociados. Se han identificado las SSR intercalados similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al., Mol. Microbiol, 10: 1057-1065 [1993] Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254- 263 [1999] Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; y Mojica et al., Mol. Microbiol, 17:85-93 [1995]). Los loci CRISPR pueden diferenciarse de otros SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; y Mojica et al., Mol. Microbiol, 36:244-246 [2000]). En ciertas realizaciones, las repeticiones son elementos cortos que ocurren en grupos que están regularmente espaciados por secuencias intermedias únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Aunque las secuencias de repetición están muy conservadas entre las cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras suelen diferir de una cepa a otra (van Embden et al., J. Bacterid., 182:2393-2401 [2000]). La secuencia de ARNtra puede ser cualquier secuencia de ARNtra para el sistema CRISPR/Cas9 conocida en la técnica. En otras realizaciones, el ARNtra comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y 6. Los sistemas CRISPR/Cas9, el ARNgu, el ARNcr y el ARNtra ejemplares, así como su procedimiento de fabricación y uso, se divulgan en la Patente de EE. UU. No. 8697359, Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. Nos.
20150232882, 20150203872, 20150184139, 20150079681, 20150073041, 20150056705, 20150031134, 201500202 23, 20140357530, 20140335620, 20140310830, 20140273234, 20140273232, 20140273231, 20140256046, 201402 48702, 20140242700, 20140242699, 20140242664, 20140234972, 20140227787, 20140189896, 20140186958, 201 40186919, 20140186843, 20140179770, 20140179006, 20140170753, 20140093913, 20140080216,
y WO2016049024.
En algunas realizaciones, las nucleasas Cas9 descritas en el presente documento son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 de S. pyogenes puede encontrarse en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q99ZW2. La nucleasa Cas9 puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. También pueden utilizarse nucleasas Cas9 mutantes que presentan una especificidad mejorada (véase, por ejemplo, Ann Ran et al. Cell 154(6) 1380-89 (2013)). Los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos también pueden incluir una nucleasa Cas9 desactivada (dCas9). La unión de Cas9 desactivada a elementos de ácido nucleico por sí sola puede reprimir la transcripción al obstaculizar estéricamente la maquinaria de la ARN polimerasa. Además, el Cas desactivado puede utilizarse como un dispositivo de localización para otras proteínasfpor ejemplo, represores transcripcionales, activadores y dominios de reclutamiento) que afectan a la expresión génica en el sitio objetivo sin introducir mutaciones irreversibles en el ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, dCas9 puede fusionarse con dominios represores de la transcripción, como los efectores KRAB o SID, para promover el silenciamiento epigenético en un sitio objetivo. Cas9 también puede convertirse en un activador transcripcional sintético mediante la fusión con los dominios de activación VP16/VP64 o p64.
En algunas realizaciones, las nucleasas Cas9 dirigen la escisión de una o ambas cadenas en la ubicación de una secuencia objetivo, tal como dentro de la secuencia objetivo y/o dentro del complemento de la secuencia objetivo. Tras la escisión dirigida del ADN por la nucleasa Cas9, la célula dispone de dos modos de reparación del ADN: la reparación dirigida por homología (HDR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Aunque la corrección sin fisuras de la mutación mediante la HDR tras la escisión de Cas9 cerca del sitio de la mutación es atractiva, la eficacia de este procedimiento indica que sólo podría utilizarse para la modificación in vitro/exvivo de células madre o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) con un paso adicional para seleccionar las células en las que se ha producido la reparación y purificar sólo esas células modificadas. La HDR no se produce con una alta frecuencia en las células. La NHEJ se produce con una eficiencia mucho mayor y es adecuada para las mutaciones dominantes-negativas descritas para muchas de las distrofias corneales. En otras realizaciones, la nucleasa Cas9 es de Streptococcus. En otras realizaciones, la nucleasa Cas9 es de Streptococcus pyogenes, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus equi, Streptococcus iniae, Streptococcus phocae, Streptococcus pseudoporcinus, Streptococcus oralis, Streptococcus pseudoporcinus, Streptococcus infantarius, Streptococcus mutans, Streptococcus agalactiae, Streptococcus caballi, Streptococcus equinus, Streptococcus sp. taxón oral, Streptococcus mitis, Streptococcus gallolyticus, Streptococcus gordonii o Streptococcus pasteurianus, o sus variantes. Dichas variantes pueden incluir la nicasa D10A, la espía Cas9-HF1 como se describe en Kleinstiver et al, 2016 Nature, 529, 490-495. En otras realizaciones, la nucleasa Cas9 es de Staphylococcus. En otras realizaciones, la nucleasa Cas9 es de Staphylococcus aureus, S. simiae, S. auricularis, S. carnosus, S. condimenti, S. massiliensis, S. piscifermentans, S. simulans, S. capitis, S. caprae, S. epidermidis, S. saccharolyticus, S. devriesei, S. haemolyticus, S. hominis, S. agnetis, S. chromogenes, S.felis, S. delphini, S. hyicus, S. intermedius, S. lutrae, S. microti, S. muscae, S. pseudintermedius, S. rostri, S. schleiferi, S. lugdunensis, S. arlettae, S. cohnii, S. e quorum, S. gallinarum, S. kloosii, S. leei, S. nepalensis, S. saprophyticus, S. succinus, S. xylosus, S. fleurettii, S. lentus, S. sciuri, S. stepanovicii, S. vitulinus, S. simulans, S. pasteuri, S. warneri, o sus variantes.
En otras realizaciones, la nucleasa Cas9 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 u 8. En otras realizaciones, la molécula de nucleótidos que codifica la nucleasa Cas9 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 o 7.
En algunas realizaciones, el sistema CRISPR/Cas9 y los procedimientos que utilizan el sistema CRISPR/Cas9 descritos en el presente documento alteran una secuencia de ADN mediante la NHEJ. En otras realizaciones, el sistema CRISPR/Cas9 o el al menos un vector descrito en el presente documento no incluye una molécula de nucleótidos de reparación. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento alteran una secuencia de ADN mediante la HDR descrita en el presente documento. En otras realizaciones, este enfoque de HDR podría utilizarse en un enfoque ex vivo de la terapia génica en MECD. En otras realizaciones, este enfoque puede no ser específico del alelo y puede utilizarse para reparar mutaciones en los codones 129, 130, 132, 133 y 135 de KRT12.
En algunas realizaciones, el sistema CRISPR/Cas9 modificado comprende (a) un primer elemento regulador vinculado de forma operativa al ARNsg que se hibrida con la secuencia objetivo descrita en el presente documento, y (b) un segundo elemento regulador vinculado de forma operativa a la molécula de nucleótidos que codifica la nucleasa Cas9, en el que los componentes (a) y (b) se encuentran en un mismo vector o en vectores diferentes del sistema, el ARNsg se dirige a la secuencia objetivo (por ejemplo, se hibrida con) la secuencia objetivo, y la nucleasa Cas9 escinde la molécula de ADN. La secuencia objetivo puede ser una secuencia de nucleótidos complementaria de 16 a 25 nucleótidos adyacentes al extremo 5' de una PAM. Ser "adyacente" en el presente documento indica estar dentro de 2 o 3 nucleótidos del sitio de referencia, incluyendo ser "inmediatamente adyacente", lo que indica que no hay nucleótidos intermedios entre las secuencias de nucleótidos inmediatamente adyacentes y las secuencias de nucleótidos inmediatamente adyacentes están dentro de 1 nucleótido de cada una. En otras realizaciones, la célula es una célula eucariota, o una célula de mamífero o humana, y los elementos reguladores son reguladores eucariotas. En otras realizaciones, la célula es una célula madre descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la nucleasa Cas9 está optimizada en cuanto a codones para su expresión en una célula eucariótica.
En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un promotor de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un promotor de la polimerasa II. El término "elemento regulador" incluye promotores, potenciadores, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de terminación de la transcripción, tales como señales de poliadenilación y secuencias poli-U). Estos elementos reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: MeTh Od S IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los elementos reguladores incluyen los que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células anfitrión y los que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células anfitrión (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Un promotor específico de tejido puede dirigir la expresión principalmente en un tejido de interés deseado, tal como el músculo, la neurona, el hueso, la piel, la sangre, órganos específicos (por ejemplo, el hígado, el páncreas) o tipos de células particulares (por ejemplo, los linfocitos). Los elementos reguladores}- también pueden dirigir la expresión de una manera dependiente del tiempo, tal como por ejemplo de una manera dependiente del ciclo celular o de la etapa de desarrollo, que puede o no ser también específica del tejido o del tipo de célula. En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más promotores poi III (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más promotores pol I), uno o más promotores pol II (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más promotores pol II), uno o más promotores pol I (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, o más promotores pol I), o combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de promotores de la polimerasa se encuentran, entre otros, los promotores U6 y HI. Entre los ejemplos de promotores de la pol II se incluyen, entre otros, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retroviral (opcionalmente con el potenciador del RSV), el promotor del citomegalovirus (CMY) (opcionalmente con el potenciador del CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor del SV40, el promotor de la dihidrofolato reductasa, el promotor de la p-actina, el promotor de la fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor de la EFla. El término "elemento regulador" también abarca los elementos potenciadores, tales como el WPRE; los potenciadores del CMV; el segmento R-U5' de la LTR del HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988): SV40 enhancer; and the intron sequence between exons 2 and 3 of rabbit p-globin (Proc. Natl. Acad. Sci . EE. UU.., Vol .78(3), p. 1527-31, 1981).
En algunas realizaciones, la nucleasa Cas9 proporcionada en el presente documento es una nucleasa Cas9 inducible que está optimizada para la expresión de una manera temporal o dependiente del tipo de célula. El primer elemento regulador puede ser un promotor inducible que puede vincularse a la nucleasa Cas9 incluye, pero no se limita a, promotores inducibles por tetraciclina, promotores de metalotioneína; promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por metionina (por ejemplo, promotores MET25, MET3); y promotores inducibles por galactosa (promotores GAL1, g AL7 y GAL10). Otros promotores adecuados son los promotores de la alcohol deshidrogenasa ADH1 y ADH2 (reprimidos en glucosa, inducidos cuando se agota la glucosa y se fabrica etanol), el promotor de la metalotioneína CUPl (inducido en presencia de Cu2+, Zn2+), el promotor PHO5, el promotor CYC1, el promotor HIS3, el promotor PGK, el promotor GAPDH, el promotor ADO, el promotor TRP1, el promotor URA3, el promotor LEU2, el promotor ENO, el promotor TP1 y el promotor AOX1.
Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitrión que se va a transformar, el nivel de expresión deseado, etc. Un vector puede introducirse en las células anfitrión para producir así transcritos, proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en el presente documento (por ejemplo, transcritos de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes de los mismos, proteínas de fusión de los mismos, etc.).
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (por ejemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidas en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden insertar segmentos adicionales de ADN, tal como por ejemplo mediante técnicas estándar de clonación molecular. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que están presentes secuencias de ADN o ARN derivadas del virus para su empaquetamiento en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, adenovirus de replicación defectuosa y virus adenoasociados). Los vectores virales también incluyen polinucleótidos transportados por un virus para su transfección en una célula huésped. Algunos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula anfitrión en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores no episomales de mamíferos) se integran en el genoma de una célula anfitrión al introducirse en la célula anfitrión y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del anfitrión . Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión" Los vectores de expresión comunes de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen tener la forma de plásmidos. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitrión, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que, en algunos casos, se seleccionan con base en las células huésped que se van a utilizar para la expresión, que están vinculados operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operablemente ligado" indica que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a los elementos reguladores de manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula anfitrión cuando el vector se introduce en la célula anfitrión). Entre los vectores ventajosos se encuentran los lentivirus y los virus adeno-asociados, y los tipos de dichos vectores también pueden seleccionarse para dirigirse a tipos particulares de células.
Las células madre que han sufrido un evento de manipulación de ácido nucleico (es decir, una célula madre "manipulada") pueden ser aisladas utilizando cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de reparación comprende además un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable. En estas realizaciones, la recombinación homóloga exitosa del núcleo de reparación en el genoma de una célula madre anfitrión también se acompaña de la integración del marcador seleccionable. Así, en dichas realizaciones, el marcador positivo se utiliza para seleccionar las células madre manipuladas. En algunas realizaciones, el marcador seleccionable permite que la célula madre manipulada sobreviva en presencia de un fármaco que de otro modo mataría a la célula. Tales marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, marcadores seleccionables positivos que confieren resistencia a la neomicina, puromicina o higromicina B. Además, un marcador seleccionable puede ser un producto que permite identificar visualmente una célula madre manipulada entre una población de células madre, algunas de las cuales no contienen el marcador seleccionable. Ejemplos de tales marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a la proteína verde fluorescente (GFP), que puede visualizarse por su fluorescencia; el gen de luciferasa, que, cuando se expone a su sustrato luciferina, puede visualizarse por su luminiscencia; y p-galactosidasa (p-gal), que, cuando entra en contacto con su sustrato, produce un color característico. Tales marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y las secuencias de ácido nucleico que codifican estos marcadores están disponibles comercialmente(Véase, por ejemplo ,Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Los procedimientos que emplean marcadores seleccionables que pueden visualizarse por fluorescencia pueden clasificarse además mediante técnicas de Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).
En algunas realizaciones, las células madre manipuladas aisladas se utilizan para establecer líneas celulares para el trasplante. Las células manipuladas aisladas pueden cultivarse mediante cualquier procedimiento adecuado para producir una línea celular estable. Por ejemplo, los cultivos pueden mantenerse en presencia o ausencia de células de fibroblastos ( por ejemplo, 3T3) como células alimentadoras. En otros casos, se utilizan células epiteliales amnióticas humanas o fibroblastos embrionarios humanos como capas de alimentación para los cultivos. En algunas realizaciones, las células madre manipuladas se cultivan sobre una capa alimentadora de fibroblastos ( por ejemplo, células 3T3) en medio epitelial hormonal suplementado (SHEM). En ciertas realizaciones, el medio adecuado para el cultivo de las células madre manipuladas por el sujeto incluye uno o más de los siguientes componentes: suero bovino fetal, suero autólogo del paciente, EGF, insulina, transferrina, selenito de sodio, hidrocortisona, subunidad A de la toxina del cólera, DMSO, triyodotironina, antibióticos (por ejemplo, penicilina/estreptomicina y gentamicina) y antimicóticos (por ejemplo, anfotericina B). Las técnicas adecuadas para el cultivo de las LESC se describen con más detalle en Takacs et al. Citometría A 75: 54-66 (2009), Shortt et al., Surv Opthalmol Vis Sci 52: 483-502 (2007); y Cauchi et al. Am J Ophthalmol 146: 251-259 (2008). La verificación de la manipulación nucleica deseada en las líneas celulares establecidas puede llevarse a cabo utilizando cualquier técnica adecuada, incluyendo, por ejemplo, la selección de un marcador seleccionable como se discute en el presente documento y la secuencia del ácido nucleico para confirmar la secuencia de la manipulación del ácido nucleico deseado.
V. Trasplante
Tras el aislamiento de las células madre manipuladas y el establecimiento o cultivo opcional de una línea celular a partir de las células madre manipuladas, las células madre manipuladas pueden trasplantarse al sujeto que necesita tratamiento. Las células madre manipuladas pueden ser trasplantadas en el sujeto utilizando cualquier procedimiento adecuado. Los procedimientos de trasplante no forman parte de la invención.
A partir de las células manipuladas se puede desarrollar un injerto quirúrgico para trasplante que posteriormente se trasplanta al sujeto. Las células madre manipuladas pueden cultivarse en una membrana amniótica durante un periodo de tiempo suficiente para que las células madre manipuladas se expandan hasta alcanzar un área de tamaño adecuado para el trasplante. La confirmación del crecimiento puede hacerse por diversos procedimientos, incluyendo la observación directa, la preparación de la tinción de la montura completa, la histopatología, la inmunohistoquímica, la incorporación de timidina y por citometría de flujo utilizando marcadores del ciclo celular. A continuación, las células madre manipuladas cultivadas pueden trasplantarse directamente con la membrana amniótica. Las células madre manipuladas pueden separarse de la membrana amniótica y trasplantarse a un soporte de membrana no amniótica para obtener un injerto quirúrgico. Los soportes adecuados incluyen, pero no se limitan a, gasas de parafina, lentes de contacto, escudos de collage, biopolímeros, geles de fibrina y cápsulas de lente anterior.
Tras el trasplante, la evaluación de la función visual en el sujeto puede llevarse a cabo utilizando cualquier prueba adecuada conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, evaluaciones de la agudeza visual no corregida (UCVA), la agudeza visual mejor corregida (BCVA) y la prueba de agudeza de brillo (BAT). Véase, por ejemplo, Awaad et al., Am J Ophthalmol. 145(4): 656-661 (2008) y Sharhan et al., Br J Ophthalmol 84:837-841 (2000), relativos a las normas de evaluación de la agudeza visual. En ciertas realizaciones, la agudeza visual del sujeto mejora al menos en 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % en comparación con antes de someterse al tratamiento.
En algunas realizaciones, una o más células madre manipuladas deben ser administradas al sujeto en una o más frecuencias predeterminadas (por ejemplo, semanal, mensual, trimestral, bianual, anual, etc.).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar diversas realizaciones de la invención. Se entiende que dichos ejemplos no representan ni pretenden representar realizaciones exclusivas; dichos ejemplos sirven simplemente para ilustrar la práctica de esta invención.
Análisis de mutaciones: Se analizaron las mutaciones asociadas a diversas distrofias corneales para determinar cuáles eran únicamente mutaciones de sentido erróneo o indeles dentro del marco. Este análisis indica que para la mayoría de las enfermedades K12 y TGFBI, las mutaciones sin sentido o de cambio de marco no están asociadas a la enfermedad. Además, un análisis de la base de datos de variantes del exoma confirmó que no se ha notificado ninguna mutación natural sin sentido, indeles de cambio de marco o de sitio de empalme en estos genes que esté asociada con la enfermedad en estos individuos.
El análisis de las mutaciones reveló que los siguientes genes de distrofia corneal son adecuados para la terapia génica con nucleasas dirigidas (Tabla 1).
Tabla 1 : n i r fi rn l i n r n nf m i r RI PR/Cas9
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Para esta memoria descriptiva se llevó a cabo una investigación de los genes de distrofia corneal adecuados para determinar el número de mutaciones abordables mediante un enfoque específico de PAM o un enfoque específico de alelo guía. Un enfoque específico de la PAM requiere el S P causante de la enfermedad para generar una nueva PAM, mientras que el enfoque específico del alelo implica el diseño de una guía que contenga el SNP causante de la enfermedad.
Se identificaron todos los SNP no causantes de enfermedad en TGFBI que generan una nueva PAM con una frecuencia alélica menor (MAF) de >10 %. La selección de los SNP con un MAF de >10 % puede proporcionar una probabilidad razonable de que el SNP que da lugar a una nueva PAM se encuentre en cis con la mutación causante de la enfermedad. Se analizaron todas las variantes dentro de TGFBI para determinar si se había creado una nueva APM (Tabla 2). Informes anteriores demuestran la inactivación permanente del alelo mutante utilizando este enfoque (Shin et al., 2016. Human Molecular Genetics).
Tabla 2: Las variantes dentro de TGFBI que dan como resultado un nuevo PAM que tiene un MAF > 10 %. El nuevo PAM se muestra con la variante requerida indicada con un subrayado
Figure imgf000023_0001
En la Tabla 2, "b/w" indica que la variante (por ejemplo, la mutación) está localizada entre dos exones. Por ejemplo, "b/w 1 & 2" indica que la variante se encuentra entre el exón 1 y el exón 2 (por ejemplo, la variante se encuentra en el intrón), como se muestra en la Figura 3. En la Figura 3, los recuadros numerados indican los exones dentro del TGFBI. Los puntos calientes en TGFBI, donde se encuentran múltiples mutaciones causantes de la enfermedad, se muestran con los recuadros rojos. Cada flecha azul indica la posición de un SNP que genera una nueva PAM. Para cada flecha se muestra la nueva PAM, con la variante requerida resaltada en rojo.
Constructos: En todos los experimentos se utilizaron tres plásmidos que expresaban Cas9 y un ARNgu. El plásmido no objetivo utilizado fue pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) (Instituto Broad, MIT; plásmido Addgene 48139; Figura 4). Siguiendo un protocolo publicado (Ran FA, et al., Nat Protoc 2013; 8: 2281-2308), el plásmido que contenía el ARNgu específico del alelo K12-L132P se diseñó mediante la fusión y la clonación de los siguientes 2 cebadores (Life Technologies, Paisley, Reino Unido): 5'-C ACCGTAGGAAGCT AATCTATCATT-3' y 5'-AAACAATGATAGATTAGCTTCCTAC-3' en pSpCas9(BB)-2A-Puro. Este ARNgu corresponde a los 20 nucleótidos directamente 3' del PAM específico del alelo que se encuentra en el alelo K12-L132P (Figura 5, rojo), en adelante denominado sgK12LP. Se construyó un plásmido Cas9/ARNsg para dirigirse a las secuencias de K12 de tipo silvestre y mutante (Sigma, Gillingham, Reino Unido) y se utilizó como control positivo (Figura 5, verde).
Se utilizaron constructos de expresión K12 adicionales descritas anteriormente para evaluar la especificidad y la potencia de los alelos. Plásmidos de luciferasa de luciérnaga con la secuencia completa de ARNm de K12-WT o K12-L132P insertada a 3' del codón de parada, denominados en lo sucesivo K12WT-Luc y K12LP-Luc, respectivamente (Liao H, et al. PLoS One 2011; 6: e28582.), y plásmidos de expresión para la proteína K12-WT y K12-L132P marcada con hemaglutinina (HA) madura (Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 3352-3360.) con plásmidos denominados en lo sucesivo K12WT-HA y K12LP-HA, respectivamente. Se utilizó un constructo de expresión para la luciferasa Renilla (pRL-CMV, Promega, Southampton, Reino Unido) para el ensayo de luciferasa dual con el fin de normalizar la eficiencia de transfección.
Ensayo de doble luciferasa: Se utilizó un ensayo de doble luciferasa para cuantificar la potencia y la especificidad alélica de los tres ARNgu de prueba en constructos exógenos, utilizando procedimientos adaptados como los descritos anteriormente (Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985 Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502 Atkinson SD, et al. J Invest Dermatol 2011; 131 : 2079-2086). En resumen, se transfectaron células HEK AD293 (Life Technologies) utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) con constructos de expresión K12WT-Luc o K12LP-Luc y constructos sgNSC, sgK12 o sgK12LP en una relación de 1:4. Las células se incubaron durante 72 horas antes de ser lisadas y se cuantificaron las actividades de la luciferasa Firefly y Renilla. En total, se realizaron ocho réplicas para cada condición de transfección.
Transferencia Western : Constructos de expresión de tipo silvestre(K12WT-HA) y mutante (K12LP-HA) marcadas con HA (Liao H, et al. PLoS One 2011; 6: e28582.) fueron transitoriamente cotransfectados con cada uno de los ARNgu en una relación de 1:4 en células HEK AD293 por duplicado usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), utilizando procedimientos similares a los descritos previamente (Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977­ 985 Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502). Las células transfectadas se incubaron durante 72 horas. La expresión de K12 marcada con HA y de p-actina se analizó utilizando un anticuerpo policlonal de conejo contra la HA (Abeam, Cambridge, Reino Unido; ab9110, 1:2000) y un anticuerpo monoclonal de ratón contra la pactina humana (Sigma, 1:15.000) utilizando procedimientos estándar (Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 977-985 Allen EHA, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 494-502). Las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-conejo policlonal porcino conjugado con peróxido de rábano picante secundario (DakoCytomation, Ely, Reino Unido) o con un anticuerpo de cabra antiratón conjugado con peróxido de rábano (DakoCytomation), respectivamente. La unión de proteínas se detectó mediante quimioluminiscencia estándar (Life Technologies). La densitometría se realizó con ImageJ (Schneider CA, Rasband W s , Eliceiri KW. Nat Methods 2012; 9: 671-675), para cuantificar la intensidad de la banda del K12 marcadA con HA (n=4). Esto se normalizó con respecto a la intensidad de la banda de p-actina.
PCR cuantitativa en tiempo real: Las transfecciones se llevaron a cabo de la misma manera que la descrita para la transferencia western ; sin embargo, tanto K12WT-HA como K12LP-HA se transfectaron simultáneamente en las células. Todas las transfecciones se realizaron por triplicado. Tras la transfección, las células se incubaron durante 48 horas y se extrajo el ARN con el kit RNAeasy Plus (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Tras la conversión del ADNc de 500 ng de ARN (Life Technologies) se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real para cuantificar los niveles de ARNm de KRT12. Se utilizó un ensayo KRT12 (ensayo Id 140679; Roche, West Sussex, Reino Unido) junto con un ensayo HPRT (ensayo ID 102079; Roche) y un ensayo GAPDH (ensayo ID 141139; Roche). Cada muestra se ejecutó por triplicado para cada ensayo y la expresión génica relativa se calculó mediante el procedimiento AAOT (Livak KJ, Schmittgen TD. procedimientos 2001; 25: 402-408). Los niveles de expresión de KRT12 se normalizaron con respecto a HPRT y GAPDH, cuando la expresión de ambos genes de referencia se consideró "estable" en todos los grupos de tratamiento, utilizando la herramienta de software BestKeeper (Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Biotechnol Lett 2004; 26: 509-515).
Pirosecuenciación: Utilizando las mismas muestras de ADNc evaluadas por la transcriptasa inversa-PCR cuantitativa, se llevó a cabo la pirosecuenciación para determinar la proporción del ARNm K12-L132P restante con respecto al ARNm K12-WT, exactamente como se describió anteriormente (Courtney DG, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2014; 55: 3352-3360).
Ratón transgénico KRT12: Se obtuvo un modelo de ratón C57, con un alelo humano K12-L132P desactivado para reemplazar la secuencia de codificación endógena de Krtl2 del ratón. Esto permitió la focalización in vivo de KRT12-L132P mediante el ARNgu específico del alelo y Cas9. Se utilizaron ratones hembra heterocigotos de 24 semanas de edad, en los que había una copia del alelo humano K12-L132P y una copia del Krtl2 murino. Se utilizó la PCR estándar y la secuenciación de nucleótidos de Sanger para genotipar los ratones y confirmar la heterocigosidad del alelo K12-L132P. No fue necesario aleatorizar a los animales, ya que este estudio investigó el efecto del tratamiento en una córnea, mientras que la otra córnea del mismo animal se utilizó como control negativo. Los investigadores no estaban cegados en este estudio. Toda la experimentación cumplió la normativa ética y fue aprobada por el comité de ética local.
Inyección ocular intrastromal in vivo: Para lograr la expresión transitoria del ARNgu específico del alelo y del Cas9, se introdujo el plásmido sgK12LP en el estroma corneal de los ratones desactivados heterocigotos mediante una inyección ocular intraestromal, siguiendo los protocolos descritos anteriormente (Moore JE, McMullen CBT, Mahon G, Adamis AP. DNA Cell Biol 21 : 443-451). Para evaluar este procedimiento de administración, se inyectaron primero ratones de tipo silvestre con 4 |jg de un plásmido Cas9-GFP (pCas9D10A_GFP) (plásmido Addgene 44720). Los ratones fueron sacrificados a las 24, 48 y 72 horas, y las córneas se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se procesaron mediante procedimientos histológicos estándar. Se cortaron secciones de cinco metros de espesor, se rehidrataron y se obtuvieron imágenes mediante microscopía de fluorescencia. A los ratones se les administró anestesia general y un anestésico local en la córnea. Un oftalmólogo cualificado inyectó 4 |jg de plásmido sgK12LP o sgNSC diluido en un total de 3 de solución salina tamponada con fosfato en la córnea del ojo derecho y del ojo izquierdo, respectivamente, de cuatro ratones. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después del tratamiento.
Secuenciación y determinación del HEJ: Una vez sacrificados los ratones, se enuclearon los ojos y se diseccionaron las córneas. Se extrajo el ADNg con un kit de extracción de ADN (Qiagen) y se agruparon las muestras en dos grupos de tratamiento: sgK12LP y sgNSC. Las muestras se sometieron a la amplificación por PCR utilizando los siguientes dos cebadores para amplificar la región alrededor de la mutación K12-L132P: 5'-a Ca CCCATCTTGCAGCCTAT-3' y 5-AAAATTCCCAAAGCGCCTC-3'. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se ligaron al vector de clonación CloneJet (Life Technologies) y se utilizaron para transformar células competentes DH5a (Life Technologies). Se seleccionaron un total de 13 clones y se preparó ADN plasmídico utilizando un kit de minipreparación (Qiagen) siguiendo los procedimientos del fabricante. A continuación, se secuenció el ADN de los 13 clones (Departamento de Zoología, Universidad de Oxford) utilizando los cebadores de secuenciación suministrados con el vector CloneJet. Los dos sitios exónicos más probables fuera del objetivo para sgK12LP en el genoma del ratón, según lo predicho por la herramienta en línea del Laboratorio Zhang (crispr.mit.edu) se evaluaron de la misma manera, donde se seleccionaron 10 colonias para el análisis de cada objetivo fuera predicho. Los sitios fuera del objetivo previstos fueron 5'-TAAGTAGCTGATCTATCAGTGG-3 ' (Gon41) y 5-TGGGAAGCATATCTGTCATTTGG-3 ' (Asphd1). Sólo se seleccionaron estos dos sitios, ya que eran los únicos que tenían una puntuación calculada fuera del objetivo >0,1.
Estadísticas: Todas las barras de error representan el m.e.s. a menos que se indique lo contrario. La significancia se calculó mediante una prueba t no emparejada, ya que todas las muestras presentaban la misma distribución. La significancia estadística se fijó en el 0,05 %. Se calculó la varianza entre los grupos y se consideró que era similar.
Construcción de un ARNgu específico para KRT12: Un análisis de los cambios de secuencia que resultan de las mutaciones de sentido erróneo de KRT12 que causan MECD reveló que la mutación L132P que causa la forma severa de MECD resulta casualmente en la generación de un nuevo sitio PAM (AAG>AGG). Se diseñó un ARNgu (sgK12LP) complementario a la secuencia 20 nucleótidos adyacente al extremo 5' del nuevo sitio PAM generado por la mutación L132p de KRT12 y se evaluó su potencial fuera de los objetivos utilizando la "Herramienta de diseño CRISPR optimizado" proporcionada en línea por el laboratorio Zhang, MIT 2013, (Figura 5, rojo). Se calculó que el ARNgu tenía una puntuación del 66 % utilizando este sistema, donde una puntuación >50 % se considera de alta calidad con un número limitado de posibles objetivos fuera de la línea.
Evaluación de la especificidad y potencia del alelo sgK12LP in vitro : La especificidad alélica y la potencia de la sgK12LP se evaluaron in vitro, en células HEK AD293, utilizando constructos de expresión exógena para la K12 de tipo silvestre y mutante. La especificidad de los alelos se determinó en primer lugar mediante un ensayo de reportero de luciferasa dual (Figura 6 punto a). Se comprobó que la actividad de la luciferasa de luciérnaga disminuía significativamente en las células que expresaban K12WT-Luc o K12LP-Luc y eran tratadas con sgK12. En las células tratadas con sgK12LP se observó una reducción potente y específica del alelo de la actividad de la luciferasa de luciérnaga. En las células que expresan K12LP-Luc, se observó una reducción del 73,4±2,7 % (P<0,001) (Figura 6 punto a). Esta potente desactivación específica de alelos también se observó mediante transferencia western , en células que expresaban K12WT-HA o K12LP-HA (Figura 6 punto b; imagen representativa de cuatro transferencias) y la cuantificación por densitometría reveló una reducción significativa del 32 % de la proteína K12LP-HA por sgK12LP en comparación con la proteína K12WT-HA (P<0,05). En las células tratadas con sgK12, se comprobó que tanto la proteína K12 de tipo silvestre como la mutante habían disminuido, mientras que en las tratadas con sgK12LP no parecía haber ningún efecto sobre la expresión de la proteína de tipo silvestre, pero sí una desactivación significativa de la proteína K12 mutante (Figura 6 punto b).
Para soportar estos datos, observados a nivel de proteínas, se llevaron a cabo la transcriptasa-PCR inversa cuantitativa y la pirosecuenciación para determinar la especificidad del alelo y la potencia a nivel del ARNm. En las células que expresan simultáneamente K12 de tipo silvestre y mutante (en una relación de expresión de 1:1) y que son tratadas con cada una de las tres construcciones de expresión de Cas9/ARNsg de prueba (NSC, K12 y K12LP), se utilizó la transcriptasa-PCR inversa cuantitativa para determinar la desactivación del ARNm total del K12 (Figura 6 punto c). Se observó una potente reducción del 73,1±4,2 % (P<0,001) del ARNm total de K12 en las células tratadas con sgK12, con una reducción menor del 52,6±7,0 % (P<0,01) medida en las células tratadas con sgK12LP (Figura 6 punto c). Se utilizó la pirosecuenciación para determinar la proporción intracelular de las especies restantes de ARNm maduro tras el tratamiento con estos ARNsg (Figura 6 punto d). Las proporciones de ARNm se calcularon como 'porcentaje de K12-L132P'/porcentaje de K12-WT. Las células tratadas con sgNSC se normalizaron a 1, asumiendo una relación de 1:1 entre el ARNm del K12 mutante y el de tipo silvestre. En las células analizadas con sgK12, se observó una proporción de ARNm del mutante K12 de 0,89±0,03, pero la diferencia con el control NSC no fue significativa (P<0,14). En las células tratadas con sgK12LP, se detectó una proporción de ARNm del mutante K12 de 0,28±0,02 que estaba significativamente alterada en comparación con las células tratadas con sgNSC (P<0,001) (Figura 6 punto d).
Determinación de la eficacia del ARNgu-K12LP in vivo : La inyección intraestromal del constructo Cas9-GFP dio lugar a la presencia de la proteína verde fluorescente (GFP) en el epitelio corneal a las 24 horas de la inyección (Figura 7 punto a). Se encontró una expresión transitoria de GFP hasta 48 horas después de la inyección. Tras la inyección intraestromal de los constructos de expresión sgK12LP o sgNSC en ratones heterocigotos humanizados K12-L132P y un periodo de incubación de 48 horas, se procedió a la eutanasia de los ratones y se preparó ADN genómico (ADNg) de las córneas. El ADNg de las córneas de cuatro animales tratados con sgK12LP o sgNSC se agrupó y se realizó la amplificación por PCR del exón 1 del gen K12-L132P humanizado, la clonación y la secuenciación. De 10 clones establecidos a partir de ADNg de ojos tratados con sgNSC, la secuencia K12-L132P permaneció intacta en los 10. Se secuenciaron trece clones individuales de ojos tratados con sgK12LP; se encontró que ocho contenían una secuencia humana KRT12 L132P inalterada, mientras que cinco clones demostraron NHEJ alrededor del sitio de escisión predicho del complejo Cas9/sgK12LP (Figura 7 punto b). En un clon (1), se encontró una inserción de 1 nucleótido, con una deleción de 32 nucleótidos. Se observaron grandes deleciones de hasta 53 nucleótidos in vivo (clon 5). De estos 5 clones, 4 contenían deleciones (clones 1 y 3-5) que se prevé que den lugar a un cambio de marco que llevaría a la aparición de un codón de parada temprano. También se evaluaron los dos principales sitios exónicos fuera del objetivo de sgK12LP en el ratón utilizando este procedimiento. Se secuenciaron diez clones para cada objetivo y no se encontró ninguno que hubiera sufrido una escisión inespecífica.
Mutaciones TGFBI asociadas a un sitio PAM creado por la mutación en R514P, L518R y L509R: Se diseñaron ARNs guía individuales para dirigirse a cada una de estas mutaciones y se clonaron en el plásmido de expresión ARNgu/Cas9. Además, para cada mutación se diseñó un ARN guía de control positivo que utilizaba una PAM cercana natural. Las secuencias objetivo de tipo silvestre y mutante se clonaron en un plásmido reportero de luciferasa para permitir el control del efecto de la edición de genes en la expresión de WT y MUT. Ambos plásmidos se utilizaron para transfectar las células AD293 y se midió la expresión de luciferasa 48 horas después del tratamiento con CRISPR Cas9 utilizando el ensayo de genes reporteros de alto rendimiento para obtener una medida de la cantidad de ADN MUT y WT presente en las células.
La Figura 8 muestra que para 3 mutaciones de TGFBI (R514P, L518R y L509R) evaluadas mediante el enfoque PAM derivado de S P se logró una significativa especificidad alélica, con el alelo mutante cortado por el sistema CRISPR Cas9 y el ADN WT cortado en cierto grado para algunas de las guías.
Mutaciones TGFBI asociadas a una mutación SNP que se encuentra dentro de una región objetivo adyacente a un sitio PAM: Se diseñaron ARNs guía simples para dirigirse a estas mutaciones y se clonaron en el plásmido de expresión ARNgu/Cas9. Las secuencias objetivo de tipo silvestre y mutante se clonaron en un plásmido reportero de luciferasa y se evaluaron en el ensayo de genes reporteros de alto rendimiento. Ambos plásmidos se utilizaron para transfectar células AD293 y se midió la expresión de luciferasa dos días después. En primer lugar, se probaron los ARNgu que contenían una secuencia específica del objetivo de 20 pb. Sin embargo, éstos no proporcionaron suficiente especificidad alélica. Posteriormente, se diseñaron ARNgu truncados (TRU-guías) que reducían la secuencia objetivo a 18bp. Se observó una mejora de la especificidad alélica (Figura 9, puntos a-f).
Corrección Genética Ex Vivo : Se demostró la capacidad de lograr el silenciamiento de genes en córneas del ratón reportero de luciferasa. Los ratones heterocigotos para Luc2 fueron sacrificados, y sus córneas fueron disecadas y transferidas a un medio de cultivo celular. Las córneas disecadas se transfectaron con un ARNgu de control no específico o con un ARNgu dirigido al gen reportero de la luciferasa utilizando Lipofectamine 2000. Las córneas se mantuvieron en cultivo durante 3 días y se midió la expresión de luciferasa.
Se observó un silenciamiento potente del gen reportero de la luciferasa (Figura 10) en las córneas transfectadas con el ARNgu dirigido a Luc2 , lo que representa una edición genética CRISPR exitosa del gen objetivo ex vivo. Se diseccionó la córnea de un ratón heterocigoto para Luc2 y se realizó la edición genética CRISPR ex vivo. La célula madre epitelial de la córnea del ratón no está restringida a la región limbal y, por lo tanto, se necesitaba mostrar la edición de genes en todo el epitelio, como se muestra en la Figura 10. El color oscuro de la figura de la derecha después del tratamiento demostró la edición completa del gen y la desactivación del gen Luc en toda la córnea de este ratón ex vivo. (Moore JE, McMullen CBT, Mahon G, Adamis AP (2002). The Corneal Epithelial Stem Cell. DNA & Cell Biology, 21 (5-6) pp. 443-451.)
Injerto Quirúrgico para el Tratamiento de la Distrofia Corneal Granular Tipo II
Las células se cultivan a partir de una muestra de biopsia limbales obtenida de un paciente sometido a tratamiento por distrofia corneal granular tipo II. El paciente en tratamiento es portador de una mutación en el gen TGFBI que codifica

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una célula madre epitelial limbal manipulada para su uso en un procedimiento de prevención, mejora o tratamiento de la distrofia corneal en un sujeto que necesite el mismo,
en el que dicha célula madre epitelial limbal manipulada se obtiene mediante un procedimiento que comprende la manipulación de una mutación del ácido nucleico en un ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal en una célula madre epitelial limbal de dicho sujeto para corregir la mutación del ácido nucleico mediante la sustitución del alelo mutante por un alelo de tipo silvestre a través de la recombinación homóloga con un ácido nucleico de reparación homológica que contiene dicho alelo de tipo silvestre,
en el que dicho ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un TGFpI, COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256O22.5, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1, PLP1, KRT3, KRT12, GSN o UBIAD1.
2. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento:
manipular la mutación del ácido nucleico en una pluralidad de células madre epiteliales limbales de dicho sujeto para corregir la mutación del ácido nucleico, formando así una o más células madre manipuladas; y aislar la una o más células madre epiteliales limbales manipuladas.
3. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, comprendiendo dicho procedimiento además cultivar la una o más células madre epiteliales limbales manipuladas, formando así una pluralidad de células madre epiteliales limbales manipuladas.
4. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el cultivo se realiza después de la manipulación, y/o en la que el cultivo comprende el establecimiento de una línea celular estable.
5. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un ácido nucleico objetivo de TGFpI y la mutación del ácido nucleico codifica para una sustitución de aminoácidos de la arginina 124 arginina 555, o histidina 626 en un polipéptido de TGFpI, o en el que opcionalmente la mutación del ácido nucleico codifica para una sustitución de aminoácidos seleccionada entre R124C, R124H, R124L, R555W, R555Q, y H626P.
6. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un ácido nucleico objetivo COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, LOX, SPARC, LRRN1, HGF, AKAP13, ZNF469, ATG12P2, GS1-256O225, PLEKHA6, APOL4, SLC44A3, SLC6A18, SLC29A3, RANBP3L, KCNMA1, MUC5AC, CROCC, ATHL1 o PLP1, y en el que la mutación del ácido nucleico codifica para una sustitución de aminoácidos seleccionada entre Q1334H en COL4A1, G683A en COL4A2, P718S en COL4A2, R517K en COL4A2, D326Y en COL4A3, H451R en COL4A3, V1327M en COL4A4, R158Q en LOX, A1046T en AKAP13, G624V en AKAP13, G2358R en ZNF469, S158F en SLC29A3, P4493S en MUC5AC, P370S en CROCC o cualquier combinación de los mismos, en la que opcionalmente la mutación del ácido nucleico corresponde a rs3742207, rs3803230, rs9583500, rs7990383, rs55703767, rs11677877, rs2229813, rs1800449, rs1053411, rs2116780, rs3749350, rs2286194, rs12536657, rs2614668, rs745191, rs12598474, rs10932976, rs5908678, rs35803438, rs132728, rs132729, rs132730, rs859063, rs2893276, rs6687749, rs13189855, rs6876514, rs6876515, rs13361701, rs883764, rs780667, rs780668, rs13166148, rs10941287, rs7907270, rs200922784, rs9435793, rs116300974, o rs2233696 .
7. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal es un ácido nucleico objetivo de TGFpI, KRT3, KRT12, GSN o UBIAD1, y en la que la mutación del ácido nucleico codifica para una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(i) Leu509Arg, Arg666Ser, Gly623Asp, Arg555Gln, Arg124Cys, Val505Asp, Ile522Asn, Leu569Arg, His572Arg, Arg496Trp, Pro501Thr, Arg514Pro, Phe515Leu, Leu518Pro, Leu518Arg, Leu527Arg, Thr538Pro, Thr538Arg, Val539Asp, Phe540del, Phe540Ser, Asn544Ser, Ala546Thr, Ala546Asp, Phe547Ser, Pro551Gln, Leu558Pro, His572del, Gly594Val, Val613del, Val613Gly, Met619Lys, Ala620Asp, Asn622His, Asn622Lys, Asn622Lys, Gly623Arg, Gly623Asp, Val624_Val625del, Val624Met, Val625Asp, His626Arg, His626Pro, Val627SerfsX44, Thr629_Asn630insAsnValPro, Val631Asp, Arg666Ser, Arg555Trp, Arg124Ser, Asp123delins, Arg124His, Arg124Leu, Leu509Pro, Leu103_Ser104del, Val113Ile, Asp123His, Arg124Leu,, y/o Thr125_Glu126del en el ácido nucleico objetivo del TGFpI;
(ii) Glu498Val, Arg503Pro, y/o Glu509Lys en el ácido nucleico objetivo KRT3;
(iii) Met129Thr, Met129Val, Gln130Pro, Leu132Pro, Leu132Va, Leu132His, Asn133Lys, Arg135Gly, Arg135Ile, Arg135Thr, Arg135Ser, Ala137Pro, Leu140Arg, Val143Leu, Val143Leu, Lle391_Leu399dup, Ile 426Val, Ile 426Ser, Tyr429Asp, Tyr429Cys, Arg430Pro, y/o Leu433Arg en el ácido nucleico objetivo KRT12; (iv) Asp214Tyr en el ácido nucleico objetivo GSN; y
(v) Ala97Thr, Gly98Ser, Asn102Ser, Asp112Asn, Asp112Gly, Asp118Gly, Arg119Gly, Leu121Val, Leu121Phe, Val122Glu, Val122Gly, Serl71Pro, Tyr174Cys, Thr175Ile, Glyl77Arg, Lys181Arg, Gly186Arg, Leu188His, Asn232Ser, Asn233His, Asp236Glu, y/o Asp240Asn en el ácido nucleico objetivo UBIAD1.
8. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la distrofia corneal se produce después de una cirugía ocular con láser.
9. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la mutación del ácido nucleico se manipula introduciendo un conjunto de reactivos de manipulación del ácido nucleico en la pluralidad de células madre aisladas, en la que los reactivos de manipulación del ácido nucleico corrigen la mutación del ácido nucleico en una o más de la pluralidad de células madre, en la que preferentemente los reactivos de manipulación del ácido nucleico se introducen en la pluralidad de células madre mediante electroporación, transfección o entrega viral, en la que opcionalmente el conjunto de reactivos de manipulación de ácidos nucleicos comprende una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa efector de tipo activador de la transcripción (TALENs), una nucleasa de localización rediseñada, un reactivo de interferencia de ARN (ARNi), o reactivos de sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR)/nucleasa.
10. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que los reactivos de manipulación de ácidos nucleicos son reactivos de sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR)/nucleasa.
un ácido nucleico de ARN guía que se hibrida con el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal dentro de la pluralidad de células madre;
un ácido nucleico que codifica una nucleasa;
un ácido nucleico de reparación que comprende una versión de tipo silvestre del ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal o un fragmento del mismo,
por lo que el ARN guía se dirige al ácido nucleico objetivo y la nucleasa escinde el ácido nucleico objetivo creando así un sitio de escisión del ácido nucleico objetivo y por lo que el ácido nucleico de reparación es capaz de recombinarse homológicamente con el ácido nucleico objetivo de la distrofia corneal después de la creación del sitio de escisión del ácido nucleico objetivo, en la que preferiblemente el ácido nucleico de reparación comprende una etiqueta detectable, en la que más preferiblemente la etiqueta detectable del ácido nucleico de reparación es un código de barras de ácido nucleico o una etiqueta de código de barras fluorescente;
en la que opcionalmente los reactivos del sistema de CRISPR/nucleasa comprenden además uno o más agentes que aumentan la frecuencia de la recombinación homóloga en la pluralidad de células madre mediante la represión de los genes implicados en la vía de unión final no homóloga (NHEJ).
11. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la manipulación comprende introducir en la célula madre un sistema diseñado de Repeticiones Palindrómicas Cortas Espaciadas Regularmente Agrupadas (CRISPR)/proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9), en la que el sistema CRISPR/Cas9 comprende al menos un vector que comprende una molécula de nucleótidos que codifica la nucleasa Cas9 y un ARN guía único (ARNsg), y la nucleasa Cas9 y dicho ARNsg no se encuentran juntos de forma natural, en la que preferentemente el ARNsg comprende (i) una secuencia de ARN objetivo CRISPR (ARNcr), y (ii) una secuencia de ARNcr trans-activador (ARNtra), en la que la secuencia de ARNcr y la secuencia de ARNtra no se encuentran juntas de forma natural, en la que más preferentemente el ARNtra comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 6.
12. La célula madre manipulada para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en la que la nucleasa es una nucleasa Cas9, en la que opcionalmente:
la nucleasa Cas9 es de Streptococcus, Staphylococcus o variantes de los mismos; y/o
la nucleasa Cas9 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 u 8; y/o la molécula de nucleótidos que codifica la nucleasa Cas9 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 o 7; y/o
el ARNgu, si está presente, y la nucleasa Cas9 se incluyen en el mismo vector.
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