JP7239649B2 - 角膜ジストロフィーの治療方法 - Google Patents

Description

本開示は、概して角膜ジストロフィーの治療に対する方法に関する。特に、本開示は、遺伝子突然変異と関連する角膜ジストロフィーの治療に対する方法に関する。

角膜ジストロフィーは、眼の外層（角膜）における一群の遺伝性障害である。例えば、角膜ジストロフィーは、眼の透明な前部である角膜における物質の異常な沈着を特徴とする場合がある。角膜ジストロフィーとして、限定されないが、以下の４つのＩＣ３Ｄカテゴリーの角膜ジストロフィーが挙げられる（例えば、非特許文献１を参照されたい）：上皮及び上皮下のジストロフィー、上皮間質ＴＧＦβＩジストロフィー、実質ジストロフィー、及び内皮ジストロフィー。角膜ジストロフィーは、トランスフォーミング成長因子、ベータ誘導（ＴＧＦβＩ）、ケラチン３（ＫＲＴ３）、ケラチン１２（ＫＲＴ１２）、ＧＳＮ、又はＵｂｉＡプレニルトランスフェラーゼドメイン含有タンパク質１（ＵＢＩＡＤ１）に位置する突然変異によって引き起こされ得る。

例えば、かかる角膜ジストロフィーのサブセットである上皮間質角膜ジストロフィーは、トランスフォーミング成長因子ベータ誘導（ＴＧＦβＩ）遺伝子中の突然変異と関連することが知られている。ＴＧＦβＩ遺伝子は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＶ型のコラーゲンに結合するタンパク質を含む、アルギニル－グリシル－アスパラギン酸（ＲＧＤ）をコードする。ＲＧＤモチーフは、細胞接着を調節する多くの細胞外マトリックスタンパク質で見られ、幾つかのインテグリンに対するリガンド認識配列としてはたらく。幾つかの場合、上皮間質角膜ジストロフィーは互いに区別され、該疾患の臨床的特徴である、混濁の臨床所見、及び沈着の組織病理学的な染色特性に基づいて、サブタイプに分類される。いかなる特定の理論に結び付けられるものではないが、ＴＧＦβＩ遺伝子中の特定の突然変異が、かかる角膜ジストロフィーに関連する特定の表現型の原因となり、種々の表現型の臨床的特徴の原因となる角膜混濁は、突然変異したコードされるＴＧＦβＩタンパク質の全て又は一部の沈着に起因すると考えられる。顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型としても知られている、アベリーノ角膜ジストロフィーは、上皮間質角膜ジストロフィーの形態であり、表層中心角膜実質における不規則な形状の境界が明瞭な顆粒の沈着、及び進行性の視力障害を特徴とする。アベリーノ角膜ジストロフィーを患うヘテロ接合の患者は、年齢と共に視力を喪失し、晩年の数年に重篤となる。対照的に、ホモ接合の患者は、６歳までに重篤から完全に視力を喪失する。

円錐角膜（ＫＴＣＮ）は、家族歴が陽性の対象のおよそ６％～２３．５％に最も一般的な角膜拡張障害である（非特許文献２）。ＫＴＣＮの報告される罹患率は、１０００００名当たり８．８名～５４．４名の範囲である。罹患率におけるこの変動は、部分的には、該疾患を診断するために使用される種々の基準に起因する（非特許文献３、及び非特許文献４）。ＫＴＣＮの遺伝原因を明らかにしようとする文献には、多くの研究が存在する。これらの研究は、実験パラメーターに依存する疾患の病因学に寄与すると考えられる、多数の可能性のある遺伝子変異体又は一塩基変異多型（ＳＮＰ）を明らかにした。一連の円錐角膜の間、中心か傍中心の角膜が進行性の菲薄化及び前方突出を経て、不正乱視を引き起こす。遺伝パターンは、顕著ではなく、予測可能でもないが、陽性の家族歴が報告されている。円錐角膜の発生率は、２０００名に１名であることが、しばしば報告される。円錐角膜は、ボーマン層の断片化、実質部の菲薄化及び上皮の積層、デスメ膜の皺襞又は破損、並びに可変的なびまん性角膜瘢痕化を含む、病理学的所見を示す場合がある。

角膜ジストロフィーの初期段階は、角膜浮腫を軽減するために高張性の目薬及び軟膏で
最初に治療され、外科的処置に先立って症状改善を提供する場合がある。角膜ジストロフィーによって引き起こされた準最適視力は、通常角膜移植の形態の外科的処置を必要とする。しかしながら、利用可能なドナー角膜組織の不足により、外科的処置の使用が制限される。しかしながら、更に、ドナー移植片における疾患の再発が角膜移植に続いて生じる場合がある。角膜移植に続いて生じ得る他の合併症として、例えば、瘢痕化、白内障形成、移植切開からの流体の漏出、感染症、及び視力の問題が挙げられる。したがって、角膜ジストロフィーの治療に対する代替法が必要とされている。

Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｎｅａ ３４（２）：１１７－５９（２０１５） Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．，Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｓ Ｓｅｘｕａｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１２；Ｓ：６ Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．，Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｓ Ｓｅｘｕａｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１２；Ｓ：６ Ｎｏｗａｋ，Ｄ．，Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．，Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ａｆｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１１；１８（１）：２－６

本明細書では、角膜ジストロフィーの治療の必要のある対象の角膜ジストロフィーの治療に対する組成物、方法及びシステムを提供する。特定の実施の形態では、角膜ジストロフィーは顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型である。他の実施の形態では、角膜ジストロフィーは円錐角膜である。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えばＴＧＦＢＩ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ、及び／又はＵＢＩＡＤ１の遺伝子における一塩基変異多型（ＳＮＰ）と関連する。

或る一つの態様では、角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療を必要とする対象において、角膜ジストロフィーを予防する、改善する、又は治療する方法を提供する。

或る実施の形態では、上記方法は、対象に由来する幹細胞における角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異を操作して、核酸の突然変異を修正することにより、操作された幹細胞を形成し、該操作された幹細胞を上記対象に移植することを含む。追加の実施の形態では、上記方法は、移植に先立って操作された幹細胞を培養し、複数の操作された幹細胞を形成することを含み、移植は、複数の操作された幹細胞を移植することを含む。更なる実施の形態では、上記方法は、対象に由来する複数の幹細胞における核酸突然変異を操作して核酸突然変異を修正し、それにより１以上の操作された幹細胞を形成すること、該１以上の操作された幹細胞を単離すること、及び該１以上の操作された幹細胞を移植することを含む。また更なる実施の形態では、上記方法は、移植に先立って１以上の操作された幹細胞を培養することにより、複数の操作された幹細胞を形成することを含み、移植は複数の操作された幹細胞を移植することを含む。或る実施の形態では、上記方法は、角膜ジストロフィー標的核酸に核酸突然変異を含む対象幹細胞から得ることを更に含む。

或る実施の形態では、上記方法は、ａ）角膜ジストロフィー標的核酸中に核酸突然変異を含む複数の幹細胞を対象から得る工程、ｂ）複数の幹細胞の１以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作して、核酸突然変異を修正することにより、１以上の操作された幹細胞を形成する工程、ｃ）上記１以上の操作された幹細胞を単離する工程、及びｄ）上記１以上の操作された幹細胞を上記対象に移植する工程、を含む。或る実施の形態では、角膜ジスト
ロフィー標的核酸はＴＧＦβＩ標的核酸である。他の実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、又はＰＬＰ１の標的核酸である。

或る実施の形態では、操作後に培養を行う。

或る実施の形態では、単離された複数の幹細胞に１組の核酸操作試薬を導入することによって核酸突然変異を操作し、それにより該核酸操作試薬が１以上の複数の幹細胞における核酸突然変異を修正する。更なる実施の形態では、電気穿孔、トランスフェクション、又はウイルス送達を用いて、核酸操作試薬を複数の幹細胞に導入する。

特定の実施の形態では、及び上記のいずれかによれば、核酸突然変異は、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５又はヒスチジン６６６のアミノ酸置換をコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐからのアミノ酸置換の選択をコードする。

或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ１中のアミノ酸置換Ｑ１３３４Ｈをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ２中のアミノ酸置換Ｇ６８３Ａをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ２中のアミノ酸置換Ｐ７１８Ｓをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ２中のアミノ酸置換Ｒ５１７Ｋをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ３中のアミノ酸置換Ｄ３２６Ｙをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ３中のアミノ酸置換Ｈ４５１Ｒをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＯＬ４Ａ４中のアミノ酸置換Ｖ１３２７Ｍをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＬＯＸ中のアミノ酸置換Ｒ１５８Ｑをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＡＫＡＰ１３の中のアミノ酸置換Ａ１０４６Ｔをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＡＫＡＰ１３中のアミノ酸置換Ｇ６２４Ｖをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＺＮＦ４６９中のアミノ酸置換Ｇ２３５８Ｒをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＳＬＣ２９Ａ３中のアミノ酸置換Ｓ１５８Ｆをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＭＵＣ５ＡＣ中のアミノ酸置換Ｐ４４９３Ｓをコードする。或る実施の形態では、核酸突然変異は、ＣＲＯＣＣ中のアミノ酸置換Ｐ３７０Ｓをコードする。

或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３７４２２０７に対応する（例えば、米国立バイオテクノロジー情報センターのｄｂＳＮＰデータベース中のｒｓ３７４２２０７によって識別されるＳＮＰ）。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３８０３２３０に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ９５８３５００に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７９９０３８３に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ５５７０３７６７に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１１６７７８７７に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２２９８１３に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１８００４４９に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０５３４１１に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２１１６７８０に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３７４９３５０に対応する。或る実
施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２８６１９４に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１２５３６６５７に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２６１４６６８に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７４５１９１に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１２５９８４７４対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０９３２９７６に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ５９０８６７８に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３５８０３４３８に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７２８に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７２９に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７３０対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ８５９０６３に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２８９３２７６に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６６８７７４９対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３１８９８５５に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６８７６５１４に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６８７６５１５に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３３６１７０１に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ８８３７６４に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７８０６６７に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７８０６６８に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３１６６１４８に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０９４１２８７に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７９０７２７０に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２００９２２７８４に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ９４３５７９３に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１１６３００９７４に対応する。或る実施の形態では、核酸突然変異は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２３３６９６に対応する。

或る実施の形態では、及び上記のいずれかによれば、幹細胞は自己由来又は相同性ドナーから得られる。或る実施の形態では、上記方法は、対象から角膜ジストロフィー標的核酸中に核酸突然変異を含む幹細胞を得ることを含む。

特定の実施の形態では、及び上記のいずれかによれば、複数の幹細胞は、角膜縁上皮幹細胞、口腔の粘膜上皮幹細胞、歯の幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯ライニング（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｌｉｎｉｎｇ）幹細胞、又は胚性幹細胞である。特定の実施の形態では、複数の幹細胞の細胞は角膜縁上皮幹細胞である。

或る実施の形態では、核酸操作試薬のセットは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、再設計（ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ホーミングヌクレアーゼ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬、又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ヌクレアーゼ系試薬を含む。

特定の実施の形態では、核酸操作試薬は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ヌクレアーゼシステムの試薬であり、ａ）複数の幹細胞のＤＮＡ分子内の角膜ジストロフィー標的核酸とハイブリダイズするガイドＲＮＡ核酸と、
ｂ）ヌクレアーゼをコードするヌクレアーゼ核酸とを含む。かかる実施の形態では、ガイドＲＮＡが標的核酸を標的とし（例えば、それとハイブリダイズする）、ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ分子を切断する。或る実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムの試薬は、ｃ）野生型の角膜ジストロフィー標的核酸又はそのフラグメントを含む修復核酸を更に含む。かかる実施の形態では、ガイドＲＮＡは、標的核酸とハイブリダイズして、ヌクレアーゼがＤＮＡ分子を切断することにより標的核酸切断部位を作り、それによって標的核酸切断部位の生成後に修復核酸は角膜ジストロフィー標的核酸と相同的に組み換えることができる。或る実施の形態では、ガイドＲＮＡ及び／又は修復核酸は検出可能な標識を含む。特定の実施の形態では、検出可能な標識は、核酸バーコード又は蛍光バーコード標識である。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸はＴＧＦβＩ標的核酸である。他の実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１又はＰＬＰ１の標的核酸である。或る実施の形態では、ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１又はＰＬＰ１の標的核酸の２以上が操作される。或る実施の形態では、ＴＧＦβＩ標的核酸と、ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１及びＰＬＰ１の標的核酸からなる群から選択される１以上の標的核酸が操作される。

或る実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ系試薬は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に関与する遺伝子を抑制することにより、複数の幹細胞において相同組み換えの頻度を増加させる１以上の薬剤を更に含む。特定の実施の形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。

例示的な実施の形態では、及び上記のいずれかによれば、角膜ジストロフィーは眼レーザー手術の後に生じる。

更なる実施の形態では、及び上記のいずれかによれば、方法は、単離された１以上の操作された幹細胞から安定した細胞株を樹立することを更に含む。

或る実施の形態では、上記方法は、ｄ）１以上の所定頻度（例えば毎週、毎月、三ヶ月毎、半年毎、毎年等）に対象への１以上の操作された幹細胞の移植を繰り返すことを更に含む。

第２の態様では、角膜ジストロフィーの治療の必要のある対象の角膜ジストロフィーの治療に対するキットが本明細書において提供される。キットは、角膜ジストロフィー標的核酸とハイブリダイズするガイドＲＮＡ核酸と、ヌクレアーゼをコードするヌクレアーゼ核酸とを備える。或る実施の形態では、キットはまた、野生型の角膜ジストロフィー標的核酸又はそのフラグメントを含む修復核酸を備える。

その追加的な実施と並んで、対象系及び方法の前述の実施についてのより良い理解のため、参照数字が図の全体にわたる対応部位を指す以下の図面と共に、下記の実施の説明が参照される。

本明細書に記載される主題の或る一つの特定の実施の形態の概要を示す図である。 本明細書に提供される主題の方法を使用して修復することができる例示的な突然変異を示す図である。 新規ＰＡＭに対する変異体の位置を示す図である。 ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９ヌクレアーゼを使用して、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に対する例示的なベクターを示す図である。 野生型及び突然変異体のケラチン１２（Ｋ１２）対立遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡｓの例示的な設計を示す図である。Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子上に見出されたＳＮＰ由来ＰＡＭを使用するためのｓｇＲＮＡを設計した（赤色）。このＰＡＭは野生型対立遺伝子には存在しない。また、野生型及び突然変異体のＫ１２対立遺伝子（緑色）を標的とする、第２のｓｇＲＮＡを設計し、陽性対照として使用した。 外因性発現コンストラクトを使用して、対立遺伝子特異性及びｓｇＫ１２ＬＰの効能の評価を示す図である。野生型及び突然変異体Ｋ１２に対する外因性発現コンストラクトを利用して、ｓｇＫ１２ＬＰの対立遺伝子特異性及び効能を試験した。（ａ）デュアルルシフェラーゼアッセイは、ｓｇＫ１２ＬＰプラスミドの対立遺伝子特異性を実証したが、効能はｓｇＫ１２コンストラクトのそれに匹敵することが示された。Ｎ＝８（ｂ）ウェスタンブロッティングは、処理したがＫ１２野生型タンパク質を発現する細胞と比較して、ｓｇＫ１２ＬＰで処理した細胞におけるＫ１２－Ｌ１３２Ｐタンパク質の顕著な減少によりこれらの特質を更に実証した。β－アクチンをローディング対照として使用した。（ｃ）野生型及び突然変異体の対立遺伝子の両方を発現する細胞の全Ｋ１２に対する定量的逆転写酵素－ＰＣＲは、ｍＲＮＡ発現におけるノックダウンを実証した。Ｎ＝４（ｄ）その後、このｍＲＮＡのノックダウンの対立遺伝子割合をピロシーケンスによって定量し、両方のＫＲＴ１２対立遺伝子を共発現し、ｓｇＫ１２ＬＰで処理された細胞における突然変異対立遺伝子のノックダウンを確認した。Ｎ＝、４、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１． ｓｇＫ１２ＬＰ誘導性ＮＨＥＪをｉｎ ｖｉｖｏで示す。ＧＦＰ発現が実質内注射後２４時間にマウスの角膜上皮で観察され、角膜上皮をトランスフェクトするための実質内プラスミド注射の効能を実証した（ａ；Ｎ＝２）。ＧＦＰ発現は、注射後４８時間で観察されなかった。ｓｇＫ１２ＬＰコンストラクトを注入したヒトのＫ１２－Ｌ１３２Ｐヘテロ接合マウスに由来するｇＤＮＡの配列決定は、大きな欠失、及びＫＲＴ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子の切断によるＮＨＥＪの誘導を実証した。配列決定した１３個のクローンのうち５個は、ＮＨＥＪ（ｂ）を経たことがわかった。 ＴＧＦＢＩ突然変異Ｒ５１４Ｐ（Ａ）、Ｌ５１８Ｒ（Ｂ）及びＬ５０９Ｒ（Ｃ）に対して設計されたＳＮＰ由来ＰＡＭガイドＲＮＡを使用する結果を示し、ルシフェラーゼ発現を使用して野生型及び突然変異体の対立遺伝子発現を評価することを示す図である。陽性対照（ｓｇＷ又はｓｇＷＴ）ガイドを、ＷＴ（青色バー）及びＭＵＴ（赤色バー）の両方の対立遺伝子を切断するように設計し、上に示されるように、予想通り両方の対立遺伝子を切断した。Ｌ５１８Ｒ（ｓｇＭ又はｓｇＭＵＴ）に使用したガイドは、突然変異対立遺伝子（赤色バー）の最小の切断により、最も大きな対立遺伝子特異性を示す。陰性対照ガイド（ｓｇＮ又はｓｇＮＳＣ）は、予想通りＷＴ又はＭＵＴ ＤＮＡのいずれも切断しなかった。 Ｒ１２４に対して設計された突然変異対立遺伝子特異的ガイドＲＮＡを使用する結果を示す図である。ＴＧＦＢＩ突然変異及びルシフェラーゼ発現を使用して、野生型及び突然変異体の対立遺伝子発現を評価した。陽性対照ｓｇＷＴガイドをＷＴ及びＭＵＴの対立遺伝子の両方を切断するように設計し、上に示されるように、予想通りに両方の対立遺伝子を切断する（各グラフの青色及び赤色のバーである中間のバー）。２０ｍｅｒ長を有するガイドは、更なるＷＴ対立遺伝子ＤＮＡエディティングを示した。該アッセイを１８ｍｅｒに短縮した対立遺伝子特異的ＲＮＡガイドを用いて繰り返した。これは、ＷＴ ＤＮＡの切断量を減少した（グラフの右側パネル及びグラフの右側のバー（青色バー））。 左眼を非特異的陰性対照ｓｇＲＮＡでトランスフェクトし、右眼をＬｕｃ２を標的とするｓｇＲＮＡでトランスフェクトしたことを示す図である。 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｐｙ）及びスタフィロコッカス・アウレウスに由来するＣａｓ９ヌクレアーゼの例示的なｓｇＲＮＡ配列、ヌクレオチド、及びアミノ酸配列を示す図である。

Ｉ．緒言
角膜ジストロフィーは、眼の透明な前部である角膜における物質の異常な沈着を特徴とする、一群の遺伝性障害である。かかる角膜ジストロフィーのサブセットである、上皮実質角膜ジストロフィーは、トランスフォーミング成長因子ベータ誘導性（ＴＧＦβＩ）遺伝子中の突然変異に関連することが知られている。ＴＧＦβＩ遺伝子は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＶ型のコラーゲンに結合するＲＧＤ含有タンパク質をコードする。

幾つかの場合には、上皮実質角膜ジストロフィーは、混濁の臨床所見、疾患の臨床的特徴、及び寄託の組織病理学の染色性に基づいて互いに区別され、サブタイプに分けられる。いかなる特定の理論に結び付けられるものではないが、ＴＧＦβＩ遺伝子中の特定の突然変異は、かかる角膜ジストロフィーに関連する特定の表現型を説明し、種々の表現型の臨床的特徴を説明する角膜混濁は、全部又は一部の突然変異したコードされたＴＧＦβＩタンパク質の沈着に起因すると考えられる。

組織修復及び再生のための幹細胞系治療法は、角膜ジストロフィーを含む多くの眼障害の有望な治療法を提供する。幹細胞は、様々な成熟細胞系統を生成する自己複製及び分化が可能である。かかる細胞の移植は、標的組織（例えば角膜の組織）を再構成するための臨床ツールとして利用することができ、それにより、生理学的及び解剖学的な機能性を回復する。

核酸操作試薬の開発における進歩は、幹細胞における核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）の単純で効率的な操作を可能とした。ＣＲＩＳＰＲ試薬の開発は、ＤＮＡにコードされた、ＲＮＡ媒介、ＤＮＡ又はＲＮＡをターゲットとする配列に特異的なターゲッティングを提供する。ＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、標的細胞ゲノムへのドナーＤＮＡの正確な挿入に使用することができる。かかる核酸操作試薬によって、研究者は正確に特定のゲノム要素を操作することができるようになった。

本開示は、少なくとも一部は、幹細胞に基づくアプローチを使用して、眼の疾患の治療に対する方法の発見に基づく。特定の実施の形態では、眼のジストロフィーに対する治療を受けている対象から単離した幹細胞を得て、眼の疾患に関連する突然変異対立遺伝子を修正するためのＣＲＩＳＰＲシステム試薬を使用して遺伝子修飾を行う。

或る一つの態様では、角膜ジストロフィーの治療に対する方法が本明細書で提供される（例えば図１）。上記方法は、例えば、対象に由来する幹細胞において角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異を操作して、核酸突然変異を修正することにより、操作された幹細胞を形成し、該操作された幹細胞を対象に移植することを含む。或る実施の形態では、上記方法は、対象から標的角膜ジストロフィー核酸中に核酸突然変異を含む複数の幹細胞を得る工程、ｂ）複数の幹細胞の１以上の幹細胞中の核酸突然変異を操作して、核酸突然変異を修正することにより、１以上の操作された幹細胞を形成する工程、ｃ）１以上の操作された幹細胞を単離する工程、及びｄ）１以上の操作された幹細胞を対象に移植す
る工程、を含む。主題の方法の特徴を、以下に更に詳細に説明する。

ＩＩ．角膜ジストロフィー
本明細書に提供される方法は、１以上角膜ジストロフィーの治療を必要とする対象における、１以上角膜ジストロフィーの治療方法である。

上記方法で治療することができる対象として、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ヒヒ、ブタ、又はヒト等の哺乳動物の対象が挙げられる。或る実施の形態では、対象はヒトである。上記方法を使用して、１歳、２歳、３歳、５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、又は１００歳の対象を治療することができる

本明細書で使用される「角膜ジストロフィー」は、眼の外層（角膜）における一群の遺伝性障害を指す。例えば、角膜ジストロフィーは、角膜における両側性の物質の異常な沈着を特徴とする場合がある。角膜ジストロフィーとして、限定されないが、以下の４つのＩＣ３Ｄカテゴリーの角膜ジストロフィーが挙げられる（例えば、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｎｅａ ３４（２）：１１７－５９（２０１５）を参照されたい）：上皮及び上皮下ジストロフィー、上皮実質ＴＧＦβＩジストロフィー、実質ジストロフィー、及び内皮ジストロフィー。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、メースマン（Ｍｅｅｓｍａｎｎ）角膜ジストロフィー（ＭＥＣＤ）、ティール－ベンケ（Ｔｈｉｅｌ－Ｂｅｈｎｋｅ）角膜ジストロフィー（ＴＢＣＤ）、格子状角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、顆粒状角膜ジストロフィーＧＣＤ）及びシュナイダー（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ）角膜ジストロフィー（ＳＣＤ）からなる群から選択される。更なる実施の形態では、本明細書において角膜ジストロフィーはＭＥＣＤを除外する。

追加実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えば、トランスフォーミング成長因子、ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）、ケラチン３（ＫＲＴ３）、ケラチン１２（ＫＲＴ１２）、ＧＳＮ、及びＵｂｉＡプレニルトランスフェラーゼドメイン含有１（ＵＢＩＡＤ１）からなる群から選択される遺伝子中に位置するものを含む、ＳＮＰ等の１以上の突然変異によって引き起こされる。更なる実施の形態では、ＳＮＰ部位は、本明細書に示される突然変異タンパク質中の突然変異体アミノ酸のコード化をもたらす。更なる実施の形態では、ＳＮＰ部位を含む突然変異体配列は、（ｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のＴＧＦＢＩにおいて、Ｌｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌに対応する突然変異を含む突然変異体ＴＧＦＢＩタンパク質、（ｉｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｐ１２０３５又はＮＰ＿４７６４２９．２のケラチン３タンパク
質において、Ｇｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓに対応する突然変異を含む突然変異体ＫＲＴ３タンパク質、（ｉｉｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９９４５６．１又はＮＰ＿０００２１４．１のＫＲＴ１２において、Ｍｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／又はＬｅｕ４３３Ａｒｇを含む突然変異体ＫＲＴ１２タンパク質、（ｉｖ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｐ０６３９６のＧＳＮにおいてＡｓｐ２１４Ｔｙｒを含む突然変異体ＧＳＮタンパク質、並びに（ｖ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｚ９のＵＢＩＡＤ１においてＡｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎに対応する突然変異を含む突然変異体ＵＢＩＡＤ１タンパク質からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする。例えば、ＳＮＰ部位を含む突然変異体配列は、少なくともタンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のアミノ酸位置５０９に対応するアミノ酸位置のＬｅｕのＡｒｇによる置換によって突然変異された突然変異体ＴＧＦＢＩタンパク質の少なくとも一部をコードする。この場合、ＳＮＰ部位の突然変異は、タンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のアミノ酸位置５０９に対応するアミノ酸位置での突然変異体アミノ酸のコード化を担う場合がある。本明細書で使用される、ヒトタンパク質中の特定の突然変異に「対応する」突然変異は、ヒトタンパク質の特定の突然変異の対応する部位で生じる、異なる種における突然変異を含んでもよい。また本明細書で使用されるように、突然変異タンパク質が、例えばＬｅｕ５０９Ａｒｇの特定の突然変異体を含むと記載される場合、かかる突然変異タンパク質は、関連するヒトタンパク質中の、例えば、本明細書に記載されるタンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のＴＧＦＢＩタンパク質中の関連するヒトタンパク質における特定の突然変異体に対応する突然変異体部位で生じる任意の突然変異を含んでもよい。

或る実施の形態では、本明細書に記載される突然変異体は、ＫＲＴ１２タンパク質中のいかなる突然変異体も除外する。或る実施の形態では、本明細書に記載される突然変異体は、例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９９４５６．１のＫＲＴ１２中のＬｅｕ１３２Ｐｒｏに対応する突然変異を除外する。更なる実施の形態では、本明細書に記載されるＳＮＰは、ＫＲＴ１２遺伝子に生じる任意のＳＮＰを除外する。また更なる実施の形態では、本明細書に記載されるＳＮＰは、ＫＲＴ１２タンパク質中のＬｅｕ１３２Ｐｒｏ突然変異をもたらす任意のＳＮＰを除外する。ＳＮＰは、ＫＲＴ１２タンパク質中のＬｅｕ１３２Ｐｒｏ突然変異をもたらすＰＡＭ部位（ＡＡＧ＞ＡＧＧ）のＳＮＰを更に除外してもよい。

上皮実質角膜ジストロフィーとして、ライス－ビュックラー角膜ジストロフィー、ティール・ベンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー１型、顆粒状角膜ジストロフィー１型、及び顆粒状角膜ジストロフィー２型が挙げられる。角膜実質ジストロフィーとして、斑状角膜ジストロフィー、シュナイダー角膜ジストロフィー、先天性角膜実質ジストロフィー、後部非晶質（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）角膜ジストロフィー、フランソワ中心部雲状変性、及びデスメ前角膜ジストロフィーが挙げられる。或る実施の形態では、上記方法は、上皮実質角膜ジストロフィーの治療に対する。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーはライス－ビュックラー角膜ジストロフィーである。特定
の実施の形態では、角膜ジストロフィーはティール・ベンケ角膜ジストロフィーである。特定の実施の形態では、角膜ジストロフィーは格子状角膜ジストロフィー１型である。特定の実施の形態では、角膜ジストロフィーは顆粒状角膜ジストロフィー１型である。特定の実施の形態では、角膜ジストロフィーは顆粒状角膜ジストロフィー２型である。上皮実質ジストロフィーは、ＴＧＦβＩ中の突然変異によって引き起こされる。本明細書で使用される「トランスフォーミング成長因子、ベータ誘導」、「ＴＧＦＢＩ」、「ＴＧＦβＩ」、「ＢＩＧＨ３」、「ＣＤＢ１」、「ＣＤＧ２」、「ＣＤＧ１」、「ＣＳＤ」、「ＣＳＤ１」、「ＣＳＤ２」、「ＣＳＤ３」、「ＥＢＭＤ」、及び「ＬＣＤ１」はいずれも、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＶ型のコラーゲン（アクセッション番号：ＮＭ＿００３５８及びＭＰ＿０００３４９（ヒト）、並びにＮＭ＿００９３６９及びＭＰ＿０３３３９５（マウス））に結合する、ＲＧＤ含有タンパク質を指す。ヒトでは、ＴＧＦβＩはＴＧＦＢＩ遺伝子、遺伝子座５ｑ３１によってコードされる。ＲＧＤモチーフは、細胞接着を調節する多くの細胞外マトリックスタンパク質で見られ、幾つかのインテグリンに対するリガンド認識配列としてはたらく。ＴＧＦβＩは、トランスフォーミング成長因子ベータによって誘導され、細胞接着を阻害するように作用する。ＴＧＦＢＩ遺伝子中の突然変異である上皮実質ジストロフィーにおいて、ＴＧＦβＩ構造は異常であり、角膜において、不溶性突然変異体ＴＧＦβＩ又はそのタンパク質分解フラグメントの堆積が起こる。

他の実施の形態では、対象は顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を有する。本明細書で使用される「顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型」、「アベリーノ角膜ジストロフィー」、「顆粒状角膜ジストロフィー２型」、及び「混合型顆粒状－格子状角膜ジストロフィー」はいずれも、ＴＧＦＢＩ遺伝子中、染色体５ｑ３１の位置の突然変異によって引き起こされる顆粒状角膜ジストロフィーの常染色体優性形態を指す。幾つかの場合には、顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型は、表面の中心角膜実質中の不規則形状の境界明瞭な顆粒の堆積、及び進行性の視力障害を特徴とする。顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を患うヘテロ接合の患者は、年齢と共に徐々に視力を失い、晩年にかけて重篤となる。病変は、最初の十年間内に現れ、３歳までに明らかになる場合がある。顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型の発症は、概してホモ接合の患者においてより早く、軽度の角膜びらんを伴う場合がある。視力は、通常、一連の病状の後期まで良好なままである。混濁は、最初は小さな表面の白っぽい斑点である。その後、環状又は星状の実質の混濁へと発展する。最終段階の混濁はより表面的で半透明であり、前部実質前部で癒着する場合がある。

或る実施の形態では、対象は円錐角膜を有する。円錐角膜（ＫＴＣＮ）は、陽性の家族歴を持つ対象のおよそ６％～２３．５％が有する最も一般的な角膜拡張性障害である（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．，Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｓ Ｓｅｘｕａｌ
Ｄｉｓｏｒｄ ２０１２；Ｓ：６）。報告されるＫＴＣＮの罹患率は、１０００００名当たり８．８名～５４．４名の範囲である。罹患率におけるこの変動は、部分的にはその疾患を診断に使用される種々の基準に起因する（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．，Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｓ Ｓｅｘｕａｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１２；Ｓ：６、及びＮｏｗａｋ，Ｄ．，Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．，Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ａｆｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１１；１８（１）：２－６）。ＫＴＣＮの遺伝原因を明らかにしようとする多くの研究が文献に存在する。これらの研究は、実験パラメーターに依存して疾患の病因学に寄与すると考えられる、多数の可能性のある遺伝変異体又はＳＮＰを明らかにした。

以前に、ヘテロ接合の個体は、レーシック眼レーザー手術の後に視力喪失が加速されやすいことが発見された。特に、これらの患者において、手術から２年後、病原力の増加と共に、角膜の混濁の増加が観察され、最終的に完全な失明をもたらした（Ｊｕｎ，Ｒ．Ｍ
．ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１１：４６３，２００４）。以前は、レーシック又はエキシマーレーザーの手術が、角膜ジストロフィーを患う患者のかすみ眼を解消するであろうという期待のもと、眼手術が行われた。３０万の症例のレーシック手術の仮定数に対して、少なく見積もって顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を患うヘテロ接合の患者１／１０００人に基づき、３００人が視力を失っていたであろう。レーシック手術法を受けた患者は、主に、生産活動を行う、２０代及び３０代である。さらに、米国における２０００年のレーシック手術の承認の後、レーシック手術法を受けた、顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を患うアフリカ系アメリカ人の患者は、失明したことがわかり、多くの同様の症例が世界の至る所で生じているかもしれないと推測される。

或る実施の形態では、顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を有する対象は、ＴＧＦβＩ中の突然変異についてホモ接合である。他の実施の形態では、顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を有する対象は、ＴＧＦβＩの中の突然変異についてヘテロ接合である。或る実施の形態では、対象は、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５又はヒスチジン６２６の置換をコードする突然変異を有する。特定の実施の形態では、核酸突然変異は、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐからのアミノ酸置換の選択をコードする。

特定の実施の形態では、治療を受ける対象は顆粒状角膜ジストロフィー１型を有し、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、７６歳、７７歳、７８歳、７９歳、８０歳、８１歳、８２歳、８３歳、８４歳、８５歳、８６歳、８７歳、８８歳、８９歳、９０歳、９１歳、９２歳、９３歳、９４歳、９５歳、９６歳、９７歳、９８歳、９９歳、又は１００歳である。或る実施の形態では、治療を受ける対象は顆粒状角膜ジストロフィー１型を有し、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、あるいは１００歳である。

特定の実施の形態では、治療を受ける対象は顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を有し、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、７６歳、７７歳、７８歳、７９歳、８０歳、８１歳、８２歳、８３歳、８４歳、８５歳、８６歳、８７歳、８８歳、８９歳、９０歳、９１歳、９２歳、９３歳、９４歳、９５歳、９６歳、９７歳、９８歳、９９歳、又は１００歳である。或る実施の形態では、治療を受ける対象は顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を有し、少なくとも５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、又は１００歳である。

特定の実施の形態では、治療を受ける対象は格子状角膜ジストロフィー１型を有し、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１
４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、７６歳、７７歳、７８歳、７９歳、８０歳、８１歳、８２歳、８３歳、８４歳、８５歳、８６歳、８７歳、８８歳、８９歳、９０歳、９１歳、９２歳、９３歳、９４歳、９５歳、９６歳、９７歳、９８歳、９９歳、又は１００歳である。或る実施の形態では、治療を受ける対象は格子状角膜ジストロフィー１型を有し、少なくとも５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、又は１００歳である。

特定の実施の形態では、治療を受ける対象はライス－ビュックラー角膜ジストロフィーを有し、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、７６歳、７７歳、７８歳、７９歳、８０歳、８１歳、８２歳、８３歳、８４歳、８５歳、８６歳、８７歳、８８歳、８９歳、９０歳、９１歳、９２歳、９３歳、９４歳、９５歳、９６歳、９７歳、９８歳、９９歳、又は１００歳である。或る実施の形態では、治療を受ける対象はライス－ビュックラー角膜ジストロフィーを有し、少なくとも５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、又は１００歳である。

特定の実施の形態では、治療を受ける対象は、ティール－ベンケ角膜ジストロフィーを有し、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、７６歳、７７歳、７８歳、７９歳、８０歳、８１歳、８２歳、８３歳、８４歳、８５歳、８６歳、８７歳、８８歳、８９歳、９０歳、９１歳、９２歳、９３歳、９４歳、９５歳、９６歳、９７歳、９８歳、９９歳、又は１００歳である。或る実施の形態では、治療を受ける対象はティール－ベンケ角膜ジストロフィーを有し、少なくとも５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、又は１００歳である。

或る実施の形態では、対象は円錐角膜を有し、次の角膜の標的核酸のうちの１つにおける突然変異についてホモ接合である：ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、又はＰＬＰ１。
他の実施の形態では、対象は円錐角膜を有し、次の角膜の標的核酸のうちの１つにおける突然変異についてヘテロ接合である：ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、又はＰＬＰ１。

或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ１中のアミノ酸置換Ｑ１３３４Ｈをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ２中のアミノ酸置換Ｇ６８３Ａをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ２中のアミノ酸置換Ｐ７１８Ｓをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ２中のアミノ酸置換Ｒ５１７Ｋをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ３中のアミノ酸置換Ｄ３２６Ｙをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ３中のアミノ酸置換Ｈ４５１Ｒをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＯＬ４Ａ４中のアミノ酸置換Ｖ１３２７Ｍをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＬＯＸ中のアミノ酸置換Ｒ１５８Ｑをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＡＫＡＰ１３中のアミノ酸置換Ａ１０４６Ｔをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＡＫＡＰ１３中のアミノ酸置換Ｇ６２４Ｖをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＺＮＦ４６９中のアミノ酸置換Ｇ２３５８Ｒをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＳＬＣ２９Ａ３中のアミノ酸置換Ｓ１５８Ｆをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＭＵＣ５ＡＣ中のアミノ酸置換Ｐ４４９３Ｓをコードする核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象はＣＲＯＣＣ中のアミノ酸置換Ｐ３７０Ｓをコードする核酸突然変異を有する。

或る実施の形態では、対象は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３７４２２０７（例えば米国立バイオテクノロジー情報センターのｄｂＳＮＰデータベース中のｒｓ３７４２２０７によって識別されるＳＮＰ）に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３８０３２３０に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ９５８３５００に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７９９０３８３に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ５５７０３７６７に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１１６７７８７７に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２２９８１３に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１８００４４９に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０５３４１１に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２１１６７８０に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３７４９３５０に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２８６１９４に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１２５３６６５７に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２６１４６６８に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７４５１９１に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１２５９８４７４に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０９３２９７６に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ５９０８６７８に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰ
クラスター識別子ｒｓ３５８０３４３８に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７２８に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７２９に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７３０に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ８５９０６３に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２８９３２７６に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６６８７７４９に相当する核酸突然変異がある。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３１８９８５５に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６８７６５１４に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６８７６５１５に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３３６１７０１に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ８８３７６４に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７８０６６７に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７８０６６８に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３１６６１４８に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０９４１２８７に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７９０７２７０に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２００９２２７８４に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ９４３５７９３に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１１６３００９７４に相当する核酸突然変異を有する。或る実施の形態では、対象は参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２３３６９６に相当する核酸突然変異を有する。

特定の実施の形態では、治療を受ける対象は円錐角膜を有し、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２６歳、２７歳、２８歳、２９歳、３０歳、３１歳、３２歳、３３歳、３４歳、３５歳、３６歳、３７歳、３８歳、３９歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４５歳、４６歳、４７歳、４８歳、４９歳、５０歳、５１歳、５２歳、５３歳、５４歳、５５歳、５６歳、５７歳、５８歳、５９歳、６０歳、６１歳、６２歳、６３歳、６４歳、６５歳、６６歳、６７歳、６８歳、６９歳、７０歳、７１歳、７２歳、７３歳、７４歳、７５歳、７６歳、７７歳、７８歳、７９歳、８０歳、８１歳、８２歳、８３歳、８４歳、８５歳、８６歳、８７歳、８８歳、８９歳、９０歳、９１歳、９２歳、９３歳、９４歳、９５歳、９６歳、９７歳、９８歳、９９歳、又は１００歳である。或る実施の形態では、治療を受ける対象は円錐角膜を有し、少なくとも５歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、又は１００歳である。

特定の実施の形態では、主題の治療を受ける対象は、顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型を有し、また眼レーザー手術を受けたことがある。或る実施の形態では、上記治療は、眼レーザー手術の後、６ヶ月以下、１年以下、１．５年以下、２年以下、２．５年以下）、３年以下、３．５年以下、４年以下、４．５年以下、５年以下、５．５年以下、６年以下、６．５年以下、７年以下、７．５年以下、８年以下、８．５年以下、９年以下、９．５年以下、１０年以下、１５年以下、２０年以下、２５年以下、３０年以下、３５年以下、４０年以下、４５年以下、５０年以下、５５年以下、６０年以下、６５年以下、７０年以
下、７５年以下８０年以下、８５年以下、９０年以下、９５年以下、又は１００年以下に行われる。

本明細書において提供される方法の或る実施の形態では、治療法は、疾患又は状態（例えば角膜ジストロフィー）に関して陽性の治療効果を提供するために使用される。「陽性の治療効果」により、意図される。疾患若しくは状態の改善、及び／又は子癇若しくは状態と関連する症状の改善が意図される。主題の治療法の治療効果を、任意の好適な方法を使用して評価することができる。特定の実施の形態では、対照（例えば治療に先立つタンパク質沈着の量）と比較して、治療後の対象の角膜上のタンパク質沈着の減少によって、治療を評価する。或る実施の形態では、主題の方法は、治療を受ける前の角膜と比較して、対象における角膜タンパク質沈着の量を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％減少させる。また、角膜混濁を、主題の方法を使用することによる治療効果を評価するために使用してもよい。さらに、或る実施の形態では、治療は視覚機能によって評価される。対象の視覚機能の評価は、限定されないが、非矯正視力（ＵＣＶＡ）、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）及び輝度視力検査（ＢＡＴ）の評価を含む、当該技術分野で知られている任意の好適な検査を使用して行うことができる。例えば、全ての目的、特に、視力の評価に対する基準に関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすＡｗａａｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１４５（４）：６５６－６６１（２００８）、及びＳｈａｒｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ８４：８３７－８４１（２０００）を参照されたい。特定の実施の形態では、治療を受ける前と比較して、対象の視力は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％改善する。

或る実施の形態では、対象を１以上の角膜ジストロフィーについて検査する。或る実施の形態では、対象を、本明細書に記載される角膜ジストロフィーに関連する核酸突然変異（ＳＮＰ）について検査する。

例えば、対象を、標的ＴＧＦβＩ核酸中の核酸突然変異について検査する。特定の実施の形態では、対象を、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５又はヒスチジン６２６のアミノ酸置換をコードする核酸突然変異について検査する。或る実施の形態では、核酸突然変異は、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐからのアミノ酸置換の選択をコードする。例えば、対象の頬の細胞を、頬のスワブ（ｓｗａｂ）を使用して収集する。収集した頬の細胞を、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５又はヒスチジン６２６のアミノ酸置換をコードする１以上の核酸突然変異の存在について分析する。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子中のＲ１２４突然変異をもたらすもの等（例えば、限定されないが、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｃ ＳＮＰとも呼ばれる、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１８のＧからＡへの塩基転位によって引き起こされるＲ１２４Ｈ突然変異を含む）のアベリーノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基変異多型（ＳＮＰ）の検出によって検出される。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子中のＲ５５５突然変異をもたらすもの等（例えば、限定されないが、（Ｃ／Ｔ）ＧＧ ＳＮＰとも呼ばれる、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１６６３のＣからＴへの塩基転位によって引き起こされるＲ５５５Ｗ突然変異を含む）の顆粒状角膜ジストロフィーに関連するＳＮＰの検出によって検出される。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子中のＲ１２４及び／又は６２６の突然変異をもたらすもの等（例えば、限定されないが、（Ｃ／Ｔ）ＧＣ ＳＮＰとも呼ばれる、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１７のＣからＴへの塩基転位によって引き起こされるＲ１２４Ｃ突然変異
、又はＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１９２４のＡからＣへの塩基転位によって引き起こされるＨ６２６Ｐ突然変異を含む）の格子状ジストロフィーに関連する関連のＳＮＰの検出によって検出される。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子中のＲ１２４突然変異をもたらすもの等（例えば、限定されないが、Ｃ（Ｇ／Ｔ）Ｃ ＳＮＰ呼ばれる、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１８のＧからＴへの塩基点によって引き起こされるＲ１２４Ｌ突然変異を含む）のライス－ビュックラー角膜ジストロフィーに関連するＳＮＰの検出によって検出される。或る実施の形態では、角膜ジストロフィーは、例えば、ＴＧＦβＩ遺伝子中のＲ５５５突然変異をもたらすもの等（例えば、限定されないが、Ｃ（Ｇ／Ａ）Ｇ ＳＮＰとも呼ばれる、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１６６４のＧからＡへの塩基転位によって引き起こされるＲ５５５Ｑ突然変異を含む）のティール－ベンケ角膜ジストロフィーに関連するＳＮＰの検出によって検出される。或る実施の形態では、対象を、円錐角膜に関連する角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異について検査する。特定の実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、又はＰＬＰ１である。

或る実施の形態では、対象へ１以上の操作された幹細胞を移植する前に、１以上の角膜ジストロフィーに関して対象を検査する。

ＩＩＩ．幹細胞
主題の方法は、複数の幹細胞を得ることを含む。治療される角膜ジストロフィーの種類に応じて、任意の好適な幹細胞を主題の方法に対して使用することができる。特定の実施の形態では、幹細胞は自己由来、相同性、又は異種性のドナーから得られる。幹細胞が異種ドナーから得られる場合、異種ドナー及び治療される対象の幹細胞は、ドナー－レシピエント組織適合性である。特定の実施の形態では、自己由来の幹細胞は、角膜ジストロフィーに対する治療を必要とする対象から得られる。得られた幹細胞は、治療される特定の角膜ジストロフィーに関連する遺伝子に突然変異を持つ（例えば、上で考察されるように、対象のＴＧＦＢＩ遺伝子中に突然変異を有する幹細胞は、上皮実質ジストロフィーを有する）。好適な幹細胞として、限定されないが、歯髄幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯ライニング幹細胞、胚性幹細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、及び角膜縁上皮幹細胞が挙げられる。

或る実施の形態では、上記複数の幹細胞は角膜縁上皮の幹細胞を含む。角膜縁上皮幹細胞（ＬＥＳＣ）は、角膜の縁領域に位置し、角膜表面の維持及び修復を担う。いかなる特定の理論に結び付けられるものではないが、ＬＥＳＣは、幹細胞プールを再配置するため、幹細胞ニッチに残る幹細胞、及び娘初期有限増殖細胞（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｅａｒｌｙ
ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌ）（ｅＴＡＣ）を産生する非対称の細胞分裂を経ると考えられる。このより分化したｅＴＡＣは、幹細胞ニッチから除去され、分裂して有限増殖細胞（ＴＡＣ）を更に生じることができ、最終的には、最終分化細胞（ＤＣ）をもたらす。ＬＥＳＣは、例えば、対象の眼から生検を採取することにより得ることができる。例えば、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４９：９９０－９９３（１９９７）を参照されたい。角膜縁の生検から得られたＬＥＳＣを単離し、限定されないが、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）及び遠心分離の技術を含む任意の好適な技術を使用して、主題の方法における使用のため選別してもよい。ＬＥＳＣは、幹細胞関連マーカーの陽性発現、及び分化マーカー陰性発現を使用して、生検から選別することができる。陽性の幹細胞マーカーとして、限定されないが、転写因子ｐ６３、ＡＢＣＧ２、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＢｍｉ－１が挙げられる。陰性の角膜特異的マーカーとして、限定されないが、サイトケラチン３（ＣＫ３）、サイトケラチン１２（ＣＫ１２）、コ
ネキシン４３、及びインボルクリンが挙げられる。或る実施の形態では、複数の幹細胞が、ｐ６３、ＡＢＣＧ２又はそれらの組み合わせの発現に対して陽性である。特定の実施の形態では、複数の幹細胞において少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の細胞が、ｐ６３、ＡＢＣＧ２、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＢｍｉ－１、又はそれらの組み合わせを発現する。或る実施の形態では、複数の幹細胞がＣＫ３、ＣＫ１２、コネキシン４３、インボルクリン、又はそれらの組み合わせの発現に対して陰性である。特定の実施の形態では、複数の幹細胞において少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の細胞は、ＣＫ１２、コネキシン４３、インボルクリン、又はそれらの組み合わせを発現しない。ＬＥＳＣに有用な他のマーカーは、例えば、全ての目的について、特に、ＬＥＳＣマーカーに関する全ての教示について、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｔａｋａｃｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ７５：５４－６６（２００９）に記載される。細胞の大きさ及び細胞質に対する核の高い比率等の幹細胞の特徴もまた、ＬＥＳＣの同定を支援するために使用することができる。

ＬＥＳＣに加えて、対象の角膜から単離した他の幹細胞も、主題の方法に使用することができる。例示的な角膜の幹細胞として、限定されないが、実質幹細胞、実質線維芽細胞様細胞、実質間葉系細胞、神経冠由来角膜幹細胞、及び推定内皮幹細胞が挙げられる。

或る実施の形態では、本明細書に記載される方法と共に使用される細胞は、対象の角膜から得られた実質幹細胞である。例えば、実質幹細胞は、限定されないが、全ての目的について、特に、様々な実質幹細胞の単離及びの培養に関する全ての技術について、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ １９：１３７１－１３７３（２００５）、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ
ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４６：１６５３－１６５８ （２００５）、Ｄｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２６６－１２７５（２００５）、Ｄｒａｖｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｄｅｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １６０：２３９－２５１（２００５）、及びＰｏｌｉｓｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｖｉｓ １４：４３１－４４２（２００８）に記載されるものを含む、任意の好適な方法を使用して単離され得る。

これらの実質幹細胞の特徴であるマーカーとして、限定されないが、Ｂｍｉ－１、Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ－１、Ｓｉｘ２、Ｐａｘ６、ＡＢＣＧ２、Ｓｐａｇ１０、及びｐ６２／ＯＳＩＬが挙げられる。或る実施の形態では、複数の幹細胞において少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の細胞が、Ｂｍｉ－１、Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ－１、Ｓｉｘ２、Ｐａｘ６、ＡＢＣＧ２、Ｓｐａｇ１０、若しくはｐ６２／ＯＳＩＬ、又はそれらの組み合わせを発現する。特定の実施の形態では、実質幹細胞はＣＤ３１、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、及びＨＬＡ－ＤＲに対して陰性である。特定の実施の形態、複数の幹細胞において少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の細胞がＣＤ３１、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５に対して陽性であり、またＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１０６及びＨＬＡ－ＤＲに対して陰性である。更に他の実施の形態では、実質ステップ細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｓｔｅｐ ｃｅｌｌｓ）は、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ５４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７１、Ｐａｘ６に対して陽性であり、ＳＳＥＡ－１、Ｔｒａ１－８１、Ｔｒａ１－６１、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１
ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１３８、Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ１、及びＶＥカドヘリンに対して陰性である。特定の実施の形態では、複数の幹細胞において、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の細胞がＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ５４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７１、Ｐａｘ６に対して陽性であり、ＳＳＥＡ－１、Ｔｒａ１－８１、Ｔｒａ１－６１、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１３８、Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ１、及びＶＥカドヘリンに対して陰性である。

特定の実施の形態では、主題の方法により使用される細胞は、対象の角膜から単離される内皮幹細胞である。かかる幹細胞を単離する方法は、例えば、全ての目的について、特に、角膜内皮幹細胞の単離及びの培養に関する全ての技術について、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２９：１６５６－１６６２（１９８８）に記載される。

単離の後、複数の幹細胞（例えばＬＥＳＣ）を、安定した細胞株をもたらす任意の好適な方法を使用して培養することができる。幹細胞は、本明細書に記載される核酸突然変異の操作の後に及び／又は前に培養されてもよい。例えば、培養を、フィーダー細胞として線維芽細胞細胞（例えば３Ｔ３）の存在下又は不在下で維持することができる。他の例では、ヒト羊膜上皮細胞又はヒト胚線維芽細胞をフィーダー層として培養に使用する。ＬＥＳＣの培養に対する好適な技術は、全ての目的について、特に、ＬＥＳＣの培養に関する全ての技術について、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｔａｋａｃｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ７５：５４－６６（２００９）、Ｓｈｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｖ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２：４８３－５０２ （２００７）、及びＣａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １４６：２５１－２５９（２００８）に更に記載される。

ＩＶ．核酸操作試薬
或る一つの態様では、幹細胞中の核酸突然変異を操作して、角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異を修正する。本明細書で使用される「角膜ジストロフィー標的核酸」は、１以上の角膜ジストロフィーと関連する突然変異を含む核酸を指す。

或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、ＴＧＦＢＩ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ及びＵＢＩＡＤ１遺伝子中に位置する。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、得られたＳＮＰ部位と関連し、本明細書に示される突然変異タンパク質中の突然変異体アミノ酸のコード化をもたらす。更なる実施の形態では、ＳＮＰ部位を含む突然変異体配列は、（ｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ１５５８２のＴＧＦＢＩにおいて、Ｌｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶ
ａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌに対応する突然変異を含む、突然変異体ＴＧＦＢＩタンパク質、（ｉｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｐ１２０３５又はＮＰ＿４７６４２９．２のケラチン３タンパク質において、Ｇｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓに対応する突然変異を含む突然変異体ＫＲＴ３タンパク質、（ｉｉｉ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９９４５６．１又はＮＰ＿０００２１４．１のＫＲＴ１２において、Ｍｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／又はＬｅｕ４３３Ａｒｇを含む突然変異体ＫＲＴ１２タンパク質、（ｉｖ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｐ０６３９６のＧＳＮにおいてＡｓｐ２１４Ｔｙｒを含む突然変異体ＧＳＮタンパク質、並びに（ｖ）例えばタンパク質アクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｚ９のＵＢＩＡＤ１中において、Ａｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎに対応する突然変異を含む突然変異体ＵＢＩＡＤ１タンパク質からなる群から選択される突然変異タンパク質をコードする。

特定の実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型（例えばＴＧＦβＩ）と関連する。他の実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は円錐角膜と関連する。いかなる特定の理論にも結び付けられるものではないが、図２に示される突然変異は円錐角膜と関連すると考えられる。特定の実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、図２に示される突然変異の１つ以上を含む。

操作される幹細胞は、個々の単離された幹細胞又は単離された幹細胞から樹立された幹細胞株に由来する幹細胞を含む。任意の好適な遺伝子操作方法を使用して、幹細胞中の核酸突然変異を修正してもよい。

特定の実施の形態では、核酸操作試薬を幹細胞に導入する。かかる核酸操作試薬は、その後、幹細胞中の核酸突然変異を修正して、操作された幹細胞を形成する。核酸操作試薬として、限定されないが、Ｚｉｎｇ－ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システム試薬が挙げられる。例えば、全ての目的、特に、核酸操作試薬に関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１（７）：３９７－４０５（２０１３）を参照されたい。かかる試薬は、エラープローン非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）、及び／又は相同組み換え修復（ＨＤＲ）の経路を含む、細胞内ＤＮＡ修復機構を刺激する標的ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）の誘導によって標的核酸の効率的で正確な修飾を可能とすることにより作用する。核酸突然変異の野生型対立遺伝子（例えば、野生型ＴＧＦＢＩ又はそのフラグメント）を含む相同修復核酸の存在下で、ニックの入った標的核酸は相同組み換えを経ることにより、突然変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に置き換え、操作された幹細胞中の核酸突然変異を修正する。

幾つかの例では、本明細書に提供される主題の方法と共に使用される標的核酸操作試薬は、ＣＲＩＳＰＲシステム試薬を含む。主題の方法と共に使用されるＣＲＩＳＰＲシステム試薬は、例えば、ＩＩ型ヌクレアーゼをコードする核酸（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆＩヌクレアーゼ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、及び目的の遺伝子の野生型対立遺伝子、又はそのフラグメントを含む修復核酸を含む。ガイドＲＮＡはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。ＣＲＩＳＰＲシステム試薬を利用する幾つかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはガイドＲＮＡに代えて別々の試薬として含まれている。

或る実施の形態では、修復核酸は、本明細書に記載される角膜ジストロフィーに関連する突然変異を含む幹細胞ゲノム（すなわち、「角膜ジストロフィー標的核酸」）の領域においてＨＤＲ経路による相同組み換えを経ることができる。特定の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦＢＩ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ及びＵＢＩＡＤ１の遺伝子内の標的核酸と相同組み換えすることができる。特定の実施の形態では、修復ヌクレオチド分子は、本明細書に記載される突然変異体アミノ酸（例えばＬｅｕ１３２Ｐｒｏ）をコードするＴＧＦＢＩ遺伝子中の核酸と相同組み換えすることができる。或る実施の形態では、少なくとも１つのベクターが複数の修復核酸を含む。修復核酸は、特定の突然変異を含む本明細書に記載される細胞の同定及び選別のための標識を更に含んでもよい。修復ヌクレオチド分子と共に含まれ得る例示的な標識として、蛍光標識及び長さ又は配列によって識別可能な核酸バーコードが挙げられる。

ＩＩ型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードする核酸は、各々、制御可能に調節要素に連結されてもよく、単一のベクター又は異なるベクターに含まれてもよい。或る実施の形態では、ガイドＲＮＡ及びＩＩ型ヌクレアーゼは同じベクターに含まれる。或る実施の形態では、ガイドＲＮＡ及びＩＩ型ヌクレアーゼは異なるベクターに含まれる。

或る例示的な実施の形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＩＩ型ヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、複数の幹細胞の１以上の細胞のゲノムへの安定した統合が可能である。或る例では、ＩＩ型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、自然界で共に生じない。本発明で使用される例示的なＣＲＩＳＰＲシステム試薬及び方法は、例えば、全ての目的、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム試薬に関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２９９－３１１（２０１３）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３（Ｒ１）：Ｒ４０－６（２０１４）、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８（２０１５）、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５７：１２６２－１２７８（２０１４）に更に詳細に記載される。

ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｇＲＮＡ／ＩＩ型ヌクレアーゼ複合体は、ｇＲＮＡ配列と標的核酸に対する相補鎖の間の塩基対合によってゲノムの標的配列に動員される。ｇＲＮＡ／タイプＩＩヌクレアーゼ複合体の結合は、ＩＩ型ヌクレアーゼがＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことができるように、ゲノム標的配列へとＩＩ型ヌクレアーゼを局在化させる。

ＤＳＢの修復は、（１）非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路、又は（２）相同組み換え修復（ＨＤＲ）経路のいずれかにより起こり得る。ＮＨＥＪ修復経路は、しばしば、フレームシフト及び／又は未熟な停止コドンを生じ、標的核酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を効果的に破壊する場合があるＤＳＢ部位での挿入／欠失（ＩｎＤ
ｅｌｓ）をもたらすことにより、標的核酸によってコードされる遺伝子産物の発現を減少させる。ＨＤＲ経路は、ＤＳＢを固定するために使用される修復核酸の存在を必要とする。特定のヌクレオチド変化（例えば野生型対立遺伝子）を、修復核酸と共にＨＤＲを使用して、標的化変異体遺伝子に導入することができる。ＨＤＲ経路を使用して、例えば、幹細胞における突然変異を修復することができ、ここで、該突然変異は本明細書に記載される角膜障害と関連する（例えば、ＴＧＦＢＩ遺伝子）。

或る実施の形態では、核酸操作試薬は修復核酸を含む。修復核酸は、ＨＤＲ経路によるＩＩ型ヌクレアーゼ誘導性ＤＳＢの修復の際に複数の幹細胞の１以上の細胞のゲノムに特定の対立遺伝子（例えば野生型対立遺伝子）を導入する。或る実施の形態では、修復核酸は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。他の実施の形態では、修復核酸はプラスミドベクターとして細胞に導入される。或る実施の形態では、修復核酸は、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１０５、１０５～１１０、１１０～１１５、１１５～１２０、１２０～１２５、１２５～１３０、１３０～１３５、１３５～１４０、１４０～１４５、１４５～１５０、１５０～１５５、１５５～１６０、１６０～１６５、１６５～１７０、１７０～１７５、１７５～１８０、１８０～１８５、１８５～１９０、１９０～１９５、又は１９５～２００のヌクレオチド長である。或る実施の形態では、修復核酸は、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００のヌクレオチド長である。他の実施の形態では、修復核酸は、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、又は９０００～１００００のヌクレオチド長である。或る実施の形態では、修復核酸は、本明細書に記載される角膜ジストロフィーに関連する突然変異を含む幹細胞ゲノムの領域（すなわち「角膜ジストロフィー標的核酸」）においてＨＤＲ経路による相同組み換えを経ることができる。特定の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦＢＩ遺伝子内内の標的核酸と相同組み換えすることができる。特定の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５又はヒスチジン６２６をコードするＴＧＦＢＩ遺伝子中の核酸と相同組み換えすることができる。特定の実施の形態では、修復核酸は、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐから選択されるアミノ酸置換をコードするＴＧＦＢＩ遺伝子中の核酸と相同組み換えすることができる。或る実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン１２４をコードする核酸を含む。例えば、修復核酸は、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１７にシトシンを挿入するため（例えばＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１７においてＣからＴへの塩基転位を修正するため）、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１８にグアニンを挿入するため（例えばＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド４１８においてＧからＡ又はＧからＴへの塩基転位を修正するため）使用される。特定の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン５５５をコードする核酸を含む。例えば、修復核酸は、ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１６６３にシトシンを挿入するため（例えばＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１６６３においてＣからＴへの塩基転位を修復するため）、及びＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１６６４にグアニンを挿入するため（例えばＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１６６３においてＧからＡへの塩基転位を修正するため）使用される。特定の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチドのヒスチジン６２６をコードする核酸を含む。例えば、修復核酸は、（例えばＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１９２４においてＡからＣへの塩基転位を修正するために）ＴＧＦβＩ遺伝子のヌクレオチド１９２４へのアデニンを挿入するために使用される。更に他の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン１２４、アルギニン５５５及びヒスチジン６２６をコードする核酸を含む。

他の実施の形態では、修復核酸は、円錐角膜と関連する角膜ジストロフィー標的核酸（例えば、図２に表される突然変異の１以上を含む標的核酸）と相同性組み換えすることができる。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、ＣＯＬ４Ａ１－４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１又はＰＬＰ１に突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３７４２２０７（例えば米国立バイオテクノロジー情報センターのｄｂＳＮＰデータベース中のｒｓ３７４２２０７によって識別されるＳＮＰ）に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３８０３２３０に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ９５８３５００に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７９９０３８３に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ５５７０３７６７に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１１６７７８７７に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２２９８１３に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１８００４４９に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０５３４１１に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２１１６７８０に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３７４９３５０に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２８６１９４に相当する突然変異を含んでいる。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１２５３６６５７に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２６１４６６８に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７４５１９１に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１２５９８４７４に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０９３２９７６に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ５９０８６７８に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ３５８０３４３８に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７２８に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７２９に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３２７３０に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ８５９０６３に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２８９３２７６に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６６８７７４９に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３１８９８５５に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６８７６５１４に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ６８７６５１５に相当する突然変異を含
む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３３６１７０１に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ８８３７６４に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７８０６６７に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７８０６６８に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１３１６６１４８に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１０９４１２８７に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ７９０７２７０に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２００９２２７８４に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ９４３５７９３に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ１１６３００９７４に相当する突然変異を含む。或る実施の形態では、角膜ジストロフィー標的核酸は、参照ＳＮＰクラスター識別子ｒｓ２２３３６９６に相当する突然変異を含む。

或る実施の形態では、核酸操作試薬は複数の修復核酸を含む。特定の実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン１２４をコードする核酸、及びＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン５５５をコードする核酸を含む。或る実施の形態では、修復核酸は、ＴＧＦβＩポリペプチドのヒスチジン６２６をコードする核酸を更に含む。或る実施の形態では、対象方法と共に使用されるＣＲＩＳＰＲシステム試薬は、ＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン１２４をコードする核酸に対する第１のガイドＲＮＡをコードする第１の核酸と、ＴＧＦβＩポリペプチドのアルギニン５５５をコードする核酸に対する第２のガイドＲＮＡをコードする第２の核酸とを含む。或る実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム試薬は、ヒスチジン６２６をコードする核酸に対する第３のガイドＲＮＡをコードする第３の核酸を更に含む。或る実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム試薬は、第１の核酸、第２の核酸及び第３の核酸の任意の組み合わせ（例えば、第１の核酸と第３の核酸の組み合わせ、又は第２の核酸と第３の核酸の組み合わせ）を更に含む。或る実施の形態では、修復核酸は、ＣＯＬ４Ａ１中のＱ１３３４Ｈ、ＣＯＬ４Ａ２中のＧ６８３Ａ、ＣＯＬ４Ａ２中のＰ７１８Ｓ、ＣＯＬ４Ａ２中のＲ５１７Ｋ、ＣＯＬ４Ａ３中のＤ３２６Ｙ、ＣＯＬ４Ａ３中のＨ４５１Ｒ、ＣＯＬ４Ａ４中のＶ１３２７Ｍ、ＬＯＸ中のＲ１５８Ｑ、ＡＫＡＰ１３中のＡ１０４６Ｔ、ＡＫＡＰ１３中のＧ６２４Ｖ、ＺＮＦ４６９中のＧ２３５８Ｒ、ＳＬＣ２９Ａ３中のＳ１５８Ｆ、ＭＵＣ５ＡＣ中のＰ４４９３Ｓ、ＣＲＯＣＣ中のＰ３７０Ｓ、又はそれらの組み合わせを含む１以上のアミノ酸置換をコードする角膜ジストロフィー標的核酸を修復することができる。

修復核酸は、特定の突然変異を含む幹細胞の同定及び選別のための標識を更に含んでもよい。修復核酸に含むことができる例示的な標識として、蛍光標識、及び長さ又は配列によって識別可能な核酸バーコードが挙げられる。

また、更なる実施の形態では、核酸操作試薬は、ＤＳＢのＨＮＥＪ修復に対するＨＤＲ経路を促進する、１以上の試薬を含む。かかる試薬は、有利には、ＨＤＲ経路による修復核酸の相同組み換えを可能とする。ＤＳＢのＨＮＥＪ修復に関するＨＤＲ経路を促進する試薬として、限定されないが、ＨＮＥＪ修復に関与する遺伝子を抑制する薬剤、例えばＤＮＡリガーゼＩＶが挙げられる。例えば、全ての目的、特に、ＤＳＢのＨＮＥＪ修復に関与する遺伝子を抑制する薬剤に関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｍａｒｕｙａｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（５）：５３８－４２（２０１５）を参照されたい。

本明細書に提供される主題の方法と共に使用されるＩＩ型ヌクレアーゼは、経時的又は細胞型に依存する方法での発現に最適化さる誘導性ＩＩ型ヌクレアーゼであってもよい。ＩＩ型ヌクレアーゼに連結することができる誘導性プロモーターとして、限定されないが、テトラサイクリン誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーター）、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メチオニン誘導性プロモーター（例えばＭＥＴ２５及びＭＥＴ３プロモーター）、及びガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０プロモーター）が挙げられる。他の好適なプロモーターとして、ＡＤＨ１及びＡＤＨ２のアルコール脱水素酵素プロモーター（グルコース中で抑制され、グルコースが使い尽くされ、エタノールが作製される際に誘導される）、ＣＵＰ１メタロチオネインプロモーター（Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋の存在下で誘導される）ＰＨＯ５プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター及びＡＯＸ１プロモーターが挙げられる。

また、改善された特異性を示す突然変異体タイプＩＩヌクレアーゼを使用してもよい（例えば、全ての目的、特に、標的核酸に対する改善された特異性を有する変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ａｎｎ Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４（６）１３８０－８９（２０１３）を参照されたい）。また、核酸操作試薬は、非活性化されたＩＩ型ヌクレアーゼ（例えばｄＣａｓ９）を含んでもよい。核酸要素への不活性化Ｃａｓ９結合は、立体的にＲＮＡポリメラーゼ機構を妨害することにより単独で転写を抑制し得る。さらに、不活性化Ｃａｓを、標的核酸に不可逆的な突然変異を導入せずに、標的部位で遺伝子発現に影響する、他のタンパク質に対するホーミングデバイス（例えば転写リプレッサー、活性化因子及び誘引ドメイン）として使用してもよい。例えば、標的部位でエピジェネティックなサイレンシングを促進するため、ｄＣａｓ９をＫＲＡＢ又はＳＩＤエフェクター等の転写リプレッサードメインに融合してもよい。また、Ｃａｓ９を、ＶＰ１６／ＶＰ６４又はｐ６４活性化ドメインへの融合によって合成転写活性化因子に変換してもよい。

核酸操作試薬を、任意の好適な方法を使用して、幹細胞へ導入することができる。核酸操作試薬を導入する例示的な方法として、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔及びウイルスに基づく方法が挙げられる。

幾つかの場合、１以上の細胞取り込み試薬はトランスフェクション試薬である。トランスフェクション試薬として、例えば、ポリマー系（例えばＤＥＡＥデキストラン）トランスフェクション試薬、及びカチオンリポソーム媒介トランスフェクション試薬が挙げられる。また、電気穿孔方法を使用して、核酸操作試薬の取り込みを促進してもよい。外部場（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆｉｅｌｄ）を印加することによって、細胞において膜電位差の変更が誘導され、正味の膜電位差の値（印加の合計、及び静止電位差）が閾値より大きい場合、一時的な浸透構造がメンブレンに生成され、電気穿孔が達成される。例えば、Ｇｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１７７：４３７－４４７（２００３）を参照されたい。

また、核酸操作試薬は、幹細胞中へのウイルス形質導入によって送達されてもよい。好適なウイルス送達システムとして、限定されないが、レトロウイルスのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びレンチウイルス送達システムが挙げられる。かかるウイルス送達システムは、幹細胞がトランスフェクションに抵抗性である場合に特に有用である。ウイルス媒介送達システムを使用する方法は、核酸操作試薬をコードするウイルスベクターを作製する工程、及びウイルス粒子中に該ベクターをパッケージングする工程を更に含んでもよ
い。核酸試薬送達の他の方法として、限定されないが、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強された取り込みが挙げられる。また、全ての目的、特に、試薬送達システムに関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｎｅｉｗｏｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：１３４１－１３５３（２０１４）を参照されたい。

或る一つの態様では、幹細胞において、角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異は、幹細胞への操作されたクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムを導入することにより操作され、ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド分子を含む少なくとも１つのベクターを含み、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び上記ｓｇＲＮＡは天然起源ではない。

「非天然起源」又は「操作された」の用語は、同義的に使用され、人の手の関与を示す。上記用語は、核酸分子又はポリペプチドを指す場合、該核酸分子又はポリペプチドが、自然界において本来関連し、自然界で見られる少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。或る実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは天然には共に生じない。

操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、当該技術分野で知られ、本明細書に記載される任意の好適な方法を使用して、細胞に導入することができる。或る実施の形態では、導入は、培養中の幹細胞又は宿主生物に幹細胞に操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与することを含んでもよい。上で考察されるように、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入する例示的な方法として、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔、及びウイルスに基づく方法が挙げられる。幾つかの場合では、１以上の細胞取り込み試薬は、トランスフェクション試薬である。トランスフェクション試薬として、例えば、ポリマー系（例えばＤＥＡＥデキストラン）トランスフェクション試薬、及びカチオンリポソーム媒介トランスフェクション試薬が挙げられる。また、電気穿孔法を使用して、核酸操作試薬の取り込みを促進してもよい。外部場（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆｉｅｌｄ）を印加することによって、細胞において膜電位差の変更が誘導され、正味の膜電位差の値が（印加の合計、及び静止電位差）閾値より大きい場合、一時的な浸透構造がメンブレンに生成され、電気穿孔が達成される。例えば、Ｇｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１７７：４３７－４４７（２００３）を参照されたい。また、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ウイルス形質導入により細胞に送達されてもよい。好適なウイルス送達システムとして、限定されないが、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、及びレンチウイルスの送達システムが挙げられる。かかるウイルス送達システムは、細胞がトランスフェクションに抵抗性である場合に有用である。ウイルス媒介送達システムを使用する方法は、核酸操作試薬をコードするウイルスベクターを作製する工程、及びウイルス粒子中に該ベクターをパッケージングする工程を更に含んでもよい。核酸試薬送達の他の方法として、限定されないが、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強された取り込みが挙げられる。また、全ての目的、特に、試薬送達システムに関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｎｅｉｗｏｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．４２：１３４１－１３５３（２０１４）、並びに米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号、及び米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。或る実施の形態では、導入は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記
載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及びリポソーム等の送達ビヒクルと複合体化した核酸を含む非ウイルスベクター送達システムによって行われる。送達は、細胞（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの投与）に対してでもよく、又は標的組織（例えばｉｎ ｖｉｖｏでの投与）に対してもよい。

一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子、すなわちｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（「重複配列」及び内因性ＣＲＩＳＰＲシステムではｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分重複配列を包含する）、ガイド配列（本明細書では「ｃｒＲＮＡ」、又は内因性ＣＲＩＳＰＲシステムでは「スペーサー」と呼ばれる）、及び／又はＣＲＩＳＰＲ座、並びに他の配列に由来する転写物をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与する又はその活性を制御する転写物及び他の要素を合わせて指す。上に記載されるように、ｓｇＲＮＡは少なくともｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの組み合わせである。或る実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１以上の要素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。或る実施の形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネス又はスタフィロコッカス・アウレウス等のＣＲＩＳＰＲシステムの１以上の要素、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生体に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおいてプロトスペーサー（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）とも呼ばれる）を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成において、「標的配列」は、それに対してガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションをもたらし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある限り、全相補性は必ずしも必要ではない。本開示において「標的部位」は、例えば、二本鎖ヌクレオチド中の標的配列とその相補配列の両方を含む標的配列の部位を指す。或る実施の形態では、本明細書に記載される標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡにハイブリダイズする第１の標的配列、及び／又はＰＡＭの５’末端に隣接する第２の標的配列を意味する場合がある。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリヌクレオチド等の任意のポリヌクレオチドを含んでもよい。或る実施の形態では、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。或る実施の形態では、標的配列は、真核細胞の細胞器官、例えばミトコンドリア、葉緑体の内部にある。

ｓｇＲＮＡは、人工、人造、合成、及び／又は非天然起源であってもよい。或る実施の形態では、ｓｇＲＮＡは、「ｓｇＲＮＡスキャフォルド」とも呼ばれる場合がある、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲターゲッティングＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列及び（ｉｉ）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。或る実施の形態では、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は共に天然起源ではない。本明細書で使用される「ｓｇＲＮＡ」の用語は、（ｉ）ガイド配列（ｃｒＲＮＡ配列）及び（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ誘引する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むシングルガイドＲＮＡを指す場合がある。ｃｒＲＮＡ配列は、目的の遺伝子中の領域に相同であり、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を制御し得る配列であってもよい。ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、共に天然起源ではない。ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡとして送達されてもよく、又はプロモーターの下、ｓｇＲＮＡ－コード配列（ｓｇＲＮＡ遺伝子）を含むプラスミドを用いて形質転換することにより送達されてもよい。

或る実施の形態では、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡは、少なくとも標的配列（例えば標的ゲノム配列）の一部にハイブリダイズし、ｃｒＲＮＡは標的配列に対して相補的な配列を有してもよい。「相補性」は、核酸が、従来のワトソンクリック型又は他の非従来型のいずれかによる別の核酸配列にと水素結合（複数の場合がある）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン－クリック塩基対）形成
することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性である）。「完全に相補的な」は、核酸配列の全ての隣接する残基が、第２の核酸配列中の同数の隣接する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的な」は、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％９７％、９８％、９９％、１００％である相補性の程度を指す、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用されるハイブリダイゼーションに対する「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対して相補性を有する核酸が、その条件下で標的配列に優先的にハイブリダイズし、実質的に非標的配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、多くの因子に応じて変動する。一般に、より長い配列では、該配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度はより高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １， Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。「ハイブリダイゼーション」とは、１以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック型塩基対合、フーグステン結合、又は任意の他の配列特異的な方式によって生じてもよい。複合体は、二重構造を形成する２本鎖、複数の鎖の複合体を形成する３本以上の鎖、単一の１７自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始等のより広いプロセス、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断における工程を構成する場合がある。所与の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所与の配列の「相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」と呼ばれる。本明細書で使用される「約」の用語は、指定される参照値に類似する値の範囲を指す場合がある。特定の実施の形態では、「約」の用語は、１５パーセント、１０パーセント、９パーセント、８パーセント、７パーセント、６パーセント、５パーセント、４パーセント、３パーセント、２パーセント、１パーセント、指定される参照値未満の含まれる値の範囲を指す。追加実施の形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイド配列は、約１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、又は２２個のヌクレオチド長である。更なる実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、ＴＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＡＴＴ（配列番号９）のヌクレオチド配列を含む。追加実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列を有するｃｒＲＮＡ配列を除外する。また更なる実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、ケラチン１２タンパク質中のＬ１３２Ｐ突然変異をもたらすＳＮＰを含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするｃｒＲＮＡ配列を除外する。また更なる実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、ケラチン１２タンパク質中に突然変異をもたらすＳＮＰを含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするｃｒＲＮＡ配列を除外する。

或る実施の形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列の結合に対してｄｓＤＮＡを開放するためＣａｓ９を活性化するヘアピン構造を提供する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、パリンドロームリピートに相補的な配列を有する場合がある。ｔｒａｃｒＲＮＡが短いパリンドロームリピートにハイブリダイズする場合、細菌二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＩＩＩによってプロセッシングを誘発し得る。更なる実施の形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、通常、特定の細菌種に特異的なＤＮＡ座のファミリーを構成する、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート）を有してもよい。ＣＲＩＳＰＲ座
は、大腸菌で認識された別のクラスの散在型短鎖リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９－５４３３［１９８７］、及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３－３５５６［１９８９］）、及び関連する遺伝子を含む。同様の散在型ＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、アナベーナ、及びマイコバクテリウム・ツベルクローシスで確認された（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７－１０６５［１９９３］、Ｈｏｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４－２６３［１９９９］、Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６－３０［１９９６］、及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５－９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ座は、短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる、リピートの構造によって他のＳＳＲと異なる場合がある（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３－３３［２００２］、及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４－２４６［２０００］）。特定の実施の形態では、リピートは、実質的に一定の長さを有する特有の介在配列によって規則的に間隔をおくクラスターを生じる短い要素である（上記のＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］）。リピート配列は株間で高度に保存されるが、幾つかの分散リピート及びスペーサー領域の配列は、典型的には株によって異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３－２４０１［２０００］）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに対するｔｒａｃｒＲＮＡに対する任意の配列であってもよい。追加実施の形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号２及び６のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。例示的な、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、並びにそれらの製造工程及び使用は、いずれもその全体により本明細書の一部をなす、米国特許第８６９７３５９号、米国特許出願公開第２０１５０２３２８８２号、米国特許出願公開第２０１５０２０３８７２号、米国特許出願公開第２０１５０１８４１３９号、米国特許出願公開第２０１５００７９６８１号、米国特許出願公開第２０１５００７３０４１号、米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号、米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号、米国特許出願公開第２０１５００２０２２３号、米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号、米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号、米国特許出願公開第２０１４０３１０８３０号、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３２号、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３１号、米国特許出願公開第２０１４０２５６０４６号、米国特許出願公開第２０１４０２４８７０２号、米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号、米国特許出願公開第２０１４０２４２６９９号、米国特許出願公開第２０１４０２４２６６４号、米国特許出願公開第２０１４０２３４９７２号、米国特許出願公開第２０１４０２２７７８７号、米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６号、米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号、米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号、米国特許出願公開第２０１４０１８６８４３号、米国特許出願公開第２０１４０１７９７７０号、米国特許出願公開第２０１４０１７９００６号、米国特許出願公開第２０１４０１７０７５３号、米国特許出願公開第２０１４００９３９１３号、及び米国特許出願公開第２０１４００８０２１６号、及び国際公開第２０１６０４９０２４号に開示される。

或る実施の形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９ヌクレアーゼは知られており、例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列はアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２のもとＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見出される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモログ又はオーソログであってもよい。また、改善された特異性を示す突然変異
体Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用してもよい（例えば、全ての目的、特に、標的核酸に対する改善された特異性を有する変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ａｎｎ Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４（６）１３８０－８９（２０１３）を参照されたい）。また、核酸操作試薬は、不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）を含んでもよい。核酸要素への不活性化Ｃａｓ９結合は、立体的にＲＮＡポリメラーゼ機構を妨害することにより単独で転写を抑制し得る。さらに、不活性化Ｃａｓを、標的核酸に不可逆的な突然変異を導入せずに、標的部位で遺伝子発現に影響する、他のタンパク質に対するホーミングデバイス（例えば転写リプレッサー、活性化因子及び誘引ドメイン）として使用してもよい。例えば、標的部位でエピジェネティックなサイレンシングを促進するため、ｄＣａｓ９をＫＲＡＢ又はＳＩＤエフェクター等の転写リプレッサードメインに融合してもよい。また、Ｃａｓ９を、ＶＰ１６／ＶＰ６４又はｐ６４活性化ドメインへの融合によって合成転写活性化因子に変換してもよい。

或る実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列内等の標的配列の及び／又は標的配列の相補鎖内の位置の１つ又は両方の切断を指揮する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって指揮されたＤＮＡ切断の後、細胞に対して利用可能なＤＮＡ修復の２方式、すなわち相同組み換え修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が存在する。突然変異部位に近いＣａｓ９切断後のＨＤＲによる突然変異のシームレス修復は魅力的ではあるが、この方法の効率は、修復が行われたそれらの細胞選択し、それらの修飾された細胞のみを精製する追加工程を伴って、幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏの修飾にのみ使用され得ることを意味する。ＨＤＲは、細胞において高い頻度発生しない。ＮＨＥＪは、はるかに高い効率で生じ、多くの角膜ジストロフィーについて記載れるドミナントネガティブ突然変異に適している。追加実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカスに由来する。更に追加実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス－ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・カニス、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・イニエ、ストレプトコッカス・フォカエ、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス、ストレプトコッカス・オラーリス、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス、ストレプトコッカス・インファンタリウス、ストレプトコッカスミュータンス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・カバリイ、ストレプトコッカス・エクイナス、ストレプトコッカス亜種ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ、ストレプトコッカ・ミチス、ストレプトコッカス・ガロリティカス、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、若しくはストレプトコッカス・パステウリアヌス、又はそれらの変異体に由来する。かかる変異体は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１６ Ｎａｔｕｒｅ，５２９，４９０－４９５に記載される、Ｄ１０ＡニッカーゼであるＳｐｙ Ｃａｓ９－ＨＦ１を含んでいてもよい。追加実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカスに由来する。更に追加の実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、スタフィロコッカス・アウレウス、Ｓ．シミエ、Ｓ．アウリクラーリス、Ｓ．カルノーサス、Ｓ．コンジメンティ、Ｓ．マシリエンシス、Ｓ．ピスシフェルメンタンス、Ｓ．シミュランス、Ｓ．カピティス、Ｓ．カプラエ、Ｓ．エピデルミディス、Ｓ．サッカロリティカス、Ｓ．デブリエセイ、Ｓ．ヘモリティカス、Ｓ．ホミニス、Ｓ．アグネティス、Ｓ．クロモゲネス、Ｓ．フェリス、Ｓ．デルフィニ、Ｓ．ヒイカス、Ｓ．インターメディウス、Ｓ．ルトラエ、Ｓ．ミクロティ、Ｓ．ムスカエ、Ｓ．シュードインターメディウス、Ｓ．ロスツリ（ｒｏｓｔｒｉ）、Ｓ．シュライフェリ、Ｓ．ルグドゥネンシス、Ｓ．アーレッタエ、Ｓ．コーニイ、Ｓ．エクオルム、Ｓ．ガリナルム、Ｓ．クルーシイ、Ｓ．レエイ、Ｓ．ネパレンシス、Ｓ．サプロフィティカス、Ｓ．サクシヌス、Ｓ．キシローサス、Ｓ．フレウレッティイ、Ｓ．レンタス、Ｓ．シウリＳ．ステパノビキイ、Ｓ．ビツリヌス、Ｓ．シミュランス、Ｓ．パステウリ、Ｓ．ワーネリ、又はそれらの変異体に由来する。

追加実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号４又は配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また更なる実施の形態では、ヌクレオチド分子をコードするＣａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号３又は配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約６０％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

或る実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する方法がＮＨＥＪによってＤＮＡ塩基配列を変更する。追加実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム又は本明細書に記載される少なくとも１つのベクターは、修復ヌクレオチド分子を含まない。或る実施の形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるＨＤＲによってＤＮＡ塩基配列を変更する。追加実施の形態では、ＭＥＣＤにおける遺伝子治療に対するｅｘ ｖｉｖｏアプローチにおいて、このＨＤＲアプローチを使用してもよい。更なる実施の形態では、このアプローチは対立遺伝子特異的でなくてもよく、ＫＲＴ１２コドン１２９、１３０、１３２、１３３及び１３５中の突然変異を修復するために使用されてもよい。

或る実施の形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、（ａ）本明細書に記載される標的配列とハイブリダイズするｓｇＲＮＡに制御可能に連結された第１の調節性要素と、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレオチドをコードするヌクレオチド分子に制御可能に連結された第２の調節性の要素とを含み、ここで、成分（ａ）及び成分（ｂ）は該システムの同じベクター又は異なるベクターに位置し、ｓｇＲＮＡは、標的配列を標的とし（例えば、それとハイブリダイズする）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＤＮＡ分子を切断する。標的配列は、ＰＡＭの５’端部に隣接する１６個～２５個のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列であってもよい。本明細書において「隣接する」は、「直接隣接すること」を含む、参照部位の２個又は３個のヌクレオチド内にあることを意味し、これは、直接隣接するヌクレオチド配列間にヌクレオチドが介在せず、直接隣接するヌクレオチド配列は互いに１個のヌクレオチド内に存在することを意味する。追加実施の形態では、細胞は真核細胞、又は哺乳動物若しくはヒト細胞であり、調節要素は真核生物の調節因子である。更なる実施の形態では、細胞は本明細書に記載される幹細胞である。或る実施の形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、真核細胞における発現に対してコドン最適化される。

或る実施の形態では、第１の調節要素はポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。或る実施の形態では、第２の調節要素はポリメラーゼＩＩプロモーターである。「調節要素」用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現調節要素（例えば転写終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びポリウリジル酸配列）を含むことが意図される。かかる調節要素は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節要素として、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指揮するもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指揮するもの（例えば組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として目的の所望の組織、筋肉、神経単位、硬骨、皮膚、血液、特定の臓器（例え
ば肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えばリンパ球）等において発現を指揮してもよい。また、調節要素は、これもまた組織又は細胞型に特異的であってもよく、又はそうでなくてもよい、細胞周期依存性、又は発生段階依存性の方法等の経時的に依存する方法で発現を指揮してもよい。或る実施の形態では、ベクターは１以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば１個、２個、３個、４個又は５個以上ｐｏｌＩプロモーター）、１以上のｐｏｌＩＩプロモーター（例えば１個、２個、３個、４個又は５個以上のｐｏｌＩＩプロモーター）、１以上のｐｏｌＩプロモーター（例えば１個、２個、３個、４個、又は５個以上のｐｏｌＩプロモーター）、又はそれらの組み合わせを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例として、限定されないが、Ｕ６及びＨ１のプロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例として、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ
ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスフォグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節要素」の用語によって、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶのＬＴＲ中のＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）、ＳＶ４０エンハンサー、及びウサギβ－グロビンのエクソン２とエクソン３の間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）等のエンハンサー要素が包含される。

或る実施の形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、経時的又は細胞型依存性の方法で発現されるように最適化される、誘導可能なＣａｓ９ヌクレアーゼである。第１の調節要素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに連結することができる誘導性プロモーターであってもよく、限定されないが、テトラサイクリン誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーター）、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メチオニン誘導性プロモーター（例えばＭＥＴ２５及びＭＥＴ３プロモーター）、及びガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０プロモーター）が挙げられる。他の好適なプロモーターとして、ＡＤＨ１及びＡＤＨ２のアルコール脱水素酵素プロモーター（グルコース中で抑制され、グルコースが使い尽くされ、エタノールが作製される際に誘導される）、ＣＵＰ１メタロチオネインプロモーター（Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋の存在下で誘導される）、ＰＨＯ５プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター及びＡＯＸ１プロモーターが挙げられる。

発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞、所望の発現レベル等の因子に依存することが当業者に明らかであろう。ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質又はペプチドを含む、転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、その突然変異体形態、その融合タンパク質等）を産生することができる。

「ベクター」の用語は、それが連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターとして、限定されないが、一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖の核酸分子、１以上の遊離末端を含む、又は遊離末端を含まない（例えば環状）を含む核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの両方を含む核酸分子、及び当該技術分野において知られている他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ベクターの１種は「プラスミド」であり、標準的な分子クローニング技術等により追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環
状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは、ウイルス由来のＤＮＡ又はＲＮＡの配列がウイルス（例えばレトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージング用のベクター中に存在する。また、ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクション用ウイルスによって保持されるポリヌクレオチドを含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製をすることができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムへと統合され、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが制御可能に連結される遺伝子の発現を指揮することができる。本明細書では、かかるベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。組み換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形をしていることが多い。組み換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができ、それは組み換え発現ベクターが、幾つかの場合には、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、１以上の調節要素を含む、すなわち、発現される核酸配列に制御可能に連結されることを意味する。組み換えの発現ベクターにおいて、「制御可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、又はベクターが宿主細胞へ導入される場合の宿主細胞において）該ヌクレオチド配列の発現を可能とする方法で調節要素（複数の場合がある）に連結されることを意味することが意図される。有利なベクターとして、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、またかかるベクターの種類を特定の種類の細胞の標的化に対して選択することができる。

核酸操作の現象を経た幹細胞（すなわち、「操作された」幹細胞）を、任意の好適な方法を使用して単離することができる。或る実施の形態では、修復核酸は、選択可能なマーカーをコードする核酸を更に含む。これらの実施の形態では、宿主幹細胞ゲノムへの修復核酸の相同組み換えの成功もまた、選択可能なマーカーの統合による。したがって、かかる実施の形態では、陽性マーカーを、操作された幹細胞の選択に使用する。或る実施の形態では、選択可能なマーカーは、操作された幹細胞を、その選択マーカーが無ければ細胞を殺傷し得る薬物の存在下での生存を可能とする。かかる選択マーカーとして、限定されないが、ネオマイシン、ピューロマイシン、又はハイグロマイシンＢに対する耐性を与える陽性選択マーカーが挙げられる。さらに、選択可能なマーカーは、操作された幹細胞が幹細胞の集団において視覚的に識別されることを可能とする製品であってもよく、それらのうちの幾つかは選択可能なマーカーを含まない。かかる選択マーカーの例として、限定されないが、その蛍光によって可視化することができる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、その基質ルシフェリンに暴露された場合にその発光によって可視化することができるルシフェラーゼ遺伝子、及びその基質と接触した場合に特徴的な色を生じるβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）が挙げられる。かかる選択マーカーは、当該技術分野においてよく知られており、これらのマーカーをコードする核酸配列を商業的に入手可能である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９を参照されたい）。蛍光によって可視化することができる選択マーカーを使用する方法は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）技術を使用して更に選別されてもよい。

或る実施の形態では、単離した操作された幹細胞を使用して、移植のための細胞株を樹立した。単離した操作された細胞は、任意の好適な方法を使用して培養し、安定した細胞株を産生することができる。例えば、培養を、フィーダー細胞として線維芽細胞細胞（例えば３Ｔ３）の存在下、又は不在下で維持することができる。他の例では、ヒト羊膜上皮細胞又はヒト胚線維芽細胞をフィーダー層として培養に使用する。或る実施の形態では、操作された幹細胞を、補足ホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）中で線維芽細胞（例えば３Ｔ３
株細胞）のフィーダー細胞層上で培養する。特定の実施の形態では、対照の操作された幹細胞の培養に適した培地は、下記成分の１以上を含む：ウシ胎児血清、患者の自己由来血清、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素サブユニットＡ、ＤＭＳＯ、トリヨードチロニン、抗生物質（例えばペニシリン／ストレプトマイシン及びゲンタマイシン）、抗菌剤（例えばアンホテリシンＢ）。ＬＥＳＣの培養に対する好適な技術は、全ての目的、特にＬＥＳＣの培養に関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ｔａｋａｃｓ
ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ７５：５４－６６（２００９）、Ｓｈｏｒｔｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｖ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２：４８３－５０２（２００７）、及びＣａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １４６：２５１－２５９（２００８），に更に記載される。樹立細胞株の所望の核酸操作の検証を、例えば、本明細書で検討される選択可能なマーカー、及び所望の核酸操作の配列を確認する核酸配列の選択を含む、任意の好適な方法を使用して行うことができる。

Ｖ．移植
或る一つの態様では、操作された幹細胞、及び該操作された幹細胞からの細胞株の任意の樹立又は培養に続いて、操作された幹細胞を、その治療を必要とする対象へ移植する。操作された幹細胞を、任意の好適な方法を使用して、対象に移植することができる。

或る実施の形態では、移植に対する外科移植片を操作された細胞から発生させ、その後対象に移植する。特定の実施の形態では、大きさが移植に適切な大きさの面積まで拡張するように操作された幹細胞を十分な期間、羊膜上で培養する。生育の確認は、直接観察、ホールマウント染色調製物、組織病理学、免疫組織化学、チミジン取り込み、及び細胞周期に対するマーカーを使用するフローサイトメトリーによるもの、を含む様々な方法によって行うことができる。その後、培養された操作された幹細胞を、羊膜と共に直接移植することができる。他の実施の形態では、操作された幹細胞は、羊膜から分離され、非羊膜担体上に移植されて外科移植片を得る。好適な担体として、限定されないが、パラフィンガーゼ、コンタクトレンズ、コラージュシールド（ｃｏｌｌａｇｅ ｓｈｉｅｌｄ）、生体高分子、フィブリンゲル、及び水晶体前嚢が挙げられる。

移植に続いて、限定されないが、非矯正視力（ＵＣＶＡ）、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）、及び輝度視力検査（ＢＡＴ）の評価を含む、当該技術分野で知られている任意の好適な検査を使用して、対象の視覚機能の評価を行ってもよい。例えば、全ての目的、特に、視力の評価に対する基準に関する全ての教示に対して、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Ａｗａａｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１４５（４）：６５６－６６１（２００８）、及びＳｈａｒｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ
Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ８４：８３７－８４１（２０００）を参照されたい。特定の実施の形態では、治療を受ける前と比較して、対象の視力が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％改善する。

或る実施の形態では、上記方法は、１以上の所定頻度（例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎、半年毎、毎年等）で対象に１以上の操作された幹細胞を移植することを繰り替えることを更に含む。

ＶＩ．キット
別の態様では、本明細書において、角膜ジストロフィーの治療に対する核酸操作試薬を備えるキットが提供される。或る実施の形態では、キットはＣＲＩＳＰＲ試薬、例えば目的の核酸を標的とする１以上のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型ヌクレアーゼ）を備える。また、追加の実施の形態では、キットは、本明細書に記載される修復さ
れる突然変異の野生型対立遺伝子を含む修復核酸を備える。或る実施の形態では、キットは、細胞、例えばトランスフェクション剤、又は電気穿孔バッファーによって核酸操作の取り込みを促進する薬剤を備える。或る実施の形態では、本明細書に提供される主題のキットは、幹細胞の検出又は単離に対する１以上の試薬、例えばＦＡＣＳと合わせて使用可能な１以上の陽性幹細胞マーカーに対する標識化抗体を備える。

以下の実施例を提示して、本発明の様々な実施の形態を説明する。かかる実施例は、排他的な実施の形態を表す、又はそれを表すことを意図するものではなく、かかる実施例は、単に本発明の実施を例証する役割を果たすに過ぎないことが理解される。

突然変異分析：
様々な角膜ジストロフィーに関連する突然変異を分析して、どれが単独でミスセンス突然変異又はインフレームインデルであるか判定した。この分析は、大多数のＫ１２及びＴＧＦＢＩ疾患については、ナンセンス又はフレームシフトインデル突然変異が疾患に関係していないことを示す。さらに、これらの遺伝子で発見されるいかなる天然起源のナンセンス、フレームシフトインデル、又はスプライス部位突然変異も、これらの個体で疾患と関連しないと報告されている。

突然変異分析は、以下の角膜ジストロフィー遺伝子が標的化ヌクレアーゼ遺伝子治療に適していることを明らかにした（表１）。

ＰＡＭ特異的アプローチ又はガイド対立遺伝子特異的アプローチのいずれかによって標的化可能な突然変異の数を決定するため好適な角膜ジストロフィー遺伝子の調査をこの報告に対して行った。ＰＡＭ特異的なアプローチは新規なＰＡＭを生成するため疾患を引き起こすＳＮＰを必要とするのに対し、対立遺伝子特異的アプローチは、疾患を引き起こすＳＮＰを含むガイドの設計を含む。

１０％超のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）でＰＡＭを生成するＴＧＦＢＩ中の疾患を引き起こさないＳＮＰの全てを同定した。１０％超のＭＡＦによるＳＮＰの選択は、新規ＰＡＭにおいて生じるＳＮＰが疾患を引き起こす突然変異を伴ってｃｉｓに見出される合理的な機会を提供し得る。全てのＴＧＦＢＩ内の変異体を分析して、新規のＰＡＭを生成したかどうかを判断した（表２）。先の報告は、このアプローチを使用して、突然変異対立遺伝子の永久的な不活性化を実証する（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｈｕｍ
ａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。

表２中、「ｂ／ｗ」は、２つのエクソン間に変異（例えば、突然変異）が位置することを示す。例えば、「ｂ／ｗ １ ＆ ２」は、図３に示されるように、エクソン１及びエクソン２の間に変異が位置する（例えば、変異がイントロンに位置する）ことを意味する。図３中、番号が付された四角は、ＴＧＦＢＩ内のエクソンを示す。複数の疾患を引き起こす突然変異が発見される、ＴＧＦＢＩ中のホットスポットを赤色四角によって示す。青い矢印はそれぞれ、新規なＰＡＭを生成するＳＮＰの位置を示す。新規のＰＡＭは、各矢印で示され、必要な変異体は赤で協調される。

コンストラクト：
Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現する３種類のプラスミドを全ての実験を通して使用した。使用した非ターゲッティングプラスミドは、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）であった（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＭＩＴ；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ４８１３９；図４）。公開されたプロトコル（Ｒａｎ ＦＡ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１３；８：２２８１－２３０８）に従い、Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡを含むプラスミドを、以下の２つのプライマーをアニールしクローンニングすることにより設計した（英国ペーズリーのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏへの５’－ＣＡＣＣＧＴＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＡＴＴ－３’、及び５’－ＡＡＡＣＡＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＡＣ－３’。このｓｇＲＮＡは、以下ｓｇＫ１２ＬＰと呼ばれる、Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子上に見られる対立遺伝子特異的ＰＡＭの直接の３’の２０個のヌクレオチドに相当する（図５、赤色）。野生型及び突然変異体の両方のＫ１２配列を標的とするＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを構築し（英国ジリンガムのＳｉｇｍａ）、陽性対照（図５、緑色）として使用した。

以前に記載される追加のＫ１２発現コンストラクトを、対立遺伝子特異性及び効能を評価するために使用した。以下、それぞれＫ１２ＷＴ－Ｌｕｃ及びＫ１２ＬＰ－Ｌｕｃと呼ばれる、停止コドンの３’に挿入されたＫ１２－ＷＴ又はＫ１２－Ｌ１３２Ｐのいずれかに対する全ｍＲＮＡ配列を含むホタルルシフェラーゼプラスミド（Ｌｉａｏ Ｈ， ｅｔ
ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１１；６：ｅ２８５８２．）、並びに以下、それぞれＫ１２ＷＴ－ＨＡ及びＫ１２ＬＰ－ＨＡとして知られるプラスミドによる、成熟した赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付のＫ１２－ＷＴ及びＫ１２－Ｌ１３２Ｐのタンパク質（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ＤＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１４；５５：３３５２－３３６０．）に対する発現プラスミドを使用した。ウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ－ＣＭＶ、英国サザンプトンのＰｒｏｍｅｇａ）に対する発現コンストラクトをデュアルルシフェラーゼアッセイに対して使用し、トランスフェクション効率を正規化した。

デュアルルシフェラーゼアッセイ：
先に記載さる通り適合させた方法（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ＤＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ２０１４；５５：９７７－９８５；Ａｌｌｅｎ ＥＨＡ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１３；５４：４９４－５０２；Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＳＤ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２０１１；１３１：２０７９－２０８６）を使用して、デュアルルシフェラーゼのアッセイを使用し、外因性コンストラクト中の３の試験ｓｇＲＮＡｓの効能及び対立遺伝子特異性を定量した。つまり、ＨＥＫ ＡＤ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、１：４の比率のＫ１２ＷＴ－Ｌｕｃ又はＫ１２ＬＰ－Ｌｕｃの両方の発現コンストラクトと、ｓｇＮＳＣ、ｓｇＫ１２又はｓｇＫ１２ＬＰのコンストラクトによりトランスフェクトした。細胞を、溶解する前に７２時間インキュベート
し、ホタル及びウミシイタケの両方のルシフェラーゼの活性を定量した。全てにおいて、各トランスフェクション条件に対して８回再現を行った。

ウェスタンブロッティング：
以前に記載されるのと同様の方法（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ＤＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１４；５５：９７７－９８５；Ａｌｌｅｎ ＥＨＡ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１３；５４：４９４－５０２）を使用し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＡタグ付けされた野生型（Ｋ１２ＷＴ－ＨＡ）及び突然変異体（Ｋ１２ＬＰ－ＨＡ）の発現コンストラクト（Ｌｉａｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１１；６：ｅ２８５８２．）を、１：４の比率で、ＨＥＫ ＡＤ２９３細胞に一時的に各ｓｇＲＮＡｓと共に重複してコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７２時間インキュベートした。標準的な方法（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ＤＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１４；５５：９７７－９８５；Ａｌｌｅｎ ＥＨＡ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１３；５４：４９４－５０２）を使用し、ＨＡに対するウサギポリクローナル抗体（英国ケンブリッジのＡｂｃａｍ；ａｂ９１１０、１：２０００）、及びヒトβ－アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１５０００）を使用して、ＨＡタグ付Ｋ１２及びβ－アクチンの発現を分析した。メンブレンを二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化ポリクローナルブタ抗ウサギ抗体（英国エリーのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、又はホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗マウス抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共にそれぞれインキュベートした。タンパク質結合を標準的な化学発光（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって検出した。デンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＣＡ，Ｒａｓｂａｎｄ ＷＳ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ ＫＷ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２；９：６７１－６７５）を使用して行い、ＨＡタグ付Ｋ１２（ｎ＝４）のバンド強度を定量した。これをβ－アクチンのバンド強度に対して正規化した。

定量的リアルタイムＰＣＲ：
トランスフェクションを、ウエスタンブロットについて記載されるのと同じ方法で行ったが、Ｋ１２ＷＴ－ＨＡとＫ１２ＬＰ－ＨＡの両方を細胞に同時にトランスフェクトした。全てのトランスフェクションを３回繰り返し行った。トランスフェクションに続いて、４８時間インキュベートし、細胞をＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（オランダ国ヴェンローのＱｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。５００ｎｇのＲＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のｃＤＮＡ転換の後、定量的リアルタイムＰＣＲを行ってＫＲＴ１２ ｍＲＮＡレベルを定量した。ＫＲＴ１２アッセイ（アッセイＩｄ １４０６７９；英国ウェストサセックスのＲｏｃｈｅ）を、ＨＰＲＴアッセイ（アッセイＩＤ １０２０７９；Ｒｏｃｈｅ）及びＧＡＰＤＨアッセイ（アッセイＩＤ １４１１３９；Ｒｏｃｈｅ）と共に使用した。各試料を各アッセイに対して３回繰り返して実行し、遺伝子の相対的な発現を、ΔΔＣＴ法を使用して計算した（Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ
ＴＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５：４０２－４０８）。ＫＲＴ１２発現レベルをＨＰＲＴ及びＧＡＰＤＨに対して標準化し、両方の参照遺伝子の発現を、ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒソフトウェアツールを使用して、治療群にわたって「安定していること」した（Ｐｆａｆｆｌ ＭＷ，Ｔｉｃｈｏｐａｄ Ａ，Ｐｒｇｏｍｅｔ Ｃ，Ｎｅｕｖｉａｎｓ ＴＰ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２００４；２６：５０９－５１５）。

ピロシーケンス：
定量的逆転写酵素－ＰＣＲによって評価された同じｃＤＮＡ試料を使用して、正確に先に記載される通りに（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ＤＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２０１４；５５：３３５２－３３６０）、ピロシーケンス
を使用してＫ１２－ＷＴ ｍＲＮＡに対する残りのＫ１２－Ｌ１３２Ｐ ｍＲＮＡの比率を特定した。

ＫＲＴ１２トランスジェニックマウス：
内因性マウスＫｒｔ１２コード配列を置き換えるためヒトＫ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子をノックインしたＣ５７マウスモデルを得た。これは対立遺伝子特異的なｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９によってＫＲＴ１２－Ｌ１３２Ｐのｉｎ－ｖｉｖｏのターゲティングを可能とする。ヒトＫ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子の１つのコピー及びネズミ科Ｋｒｔ１２の１つのコピーが存在する、２４週齢の雌性ヘテロ接合マウスを使用した。標準ＰＣＲ及びサンガーのジデオキシヌクレオチドシーケンシングを使用して、マウスの遺伝子型を同定し、Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ対立遺伝子の異型接合性を確認した。本研究は１つの角膜に対する治療効果を調査したため、動物の無作為化は必要ではなく、他方で、同じ動物の別の角膜を陰性対照として使用した。研究者は本研究で盲検化されていない。全て実験は倫理規則に従い、地域倫理委員会によって承認された。

ｉｎ ｖｉｖｏ眼実質内注射：
対立遺伝子特異的ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９の一時的発現を達成するため、以前に記載されるプロトコルに従って（Ｍｏｏｒｅ ＪＥ，ＭｃＭｕｌｌｅｎ ＣＢＴ，Ｍａｈｏｎ Ｇ，Ａｄａｍｉｓ ＡＰ．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１：４４３－４５１）、眼実質内注射によってｓｇＫ１２ＬＰプラスミドをヘテロ接合ノックインマウスの角膜実質に導入した。この送達方法を評価するために、野生型マウスに最初に４μｇのＣａｓ９－ＧＦＰプラスミド（ｐＣａｓ９Ｄ１０Ａ＿ＧＦＰ）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４４７２０）を注入した。マウスを２４時間、４８時間、及び７２時間に選別し、角膜を４％パラホルムアルデヒドで固定し、標準的な組織学の手順を使用して処理した。５－マイクロメートル厚の切片に切断し、再水和し、蛍光顕微鏡によって画像処理した。マウスに全身麻酔、及び角膜に対する局所麻酔薬を投与した。合計３μｌのリン酸緩衝生理食塩水で希釈したｓｇＫ１２ＬＰ又はｓｇＮＳＣのプラスミド４μｇを、資格を有する眼科医が、４匹のマウスの右眼と左眼の角膜にそれぞれ注入した。マウスを処理後４８時間に選別した。

ＮＨＥＪのシーケンシング及び決定：
一旦マウスを選別して、眼を摘出し、角膜を解剖した。ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｇＤＮＡを抽出し、試料をｓｇＫ１２ＬＰ及びｓｇＮＳＣの２つの治療群に貯蔵した。試料は、Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ突然変異の周辺領域を増幅するための次の２つのプライマー：５’－ＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴ－３’及び５’－ＡＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＣ－３’を使用して、ＰＣＲ増幅を経た。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＣｌｏｎｅＪｅｔクローニングベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結し、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するために使用した。合計１３個のクローンを選択し、製造業者の手順に従い、ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを作製した。その後、１３個のクローンに由来するＤＮＡをＣｌｏｎｅＪｅｔベクターと共に提供されるシーケンシングプライマーを使用して配列決定した（オクスフォード大学動物学部）。各予測されたオフターゲットに対する分析に１０個のコロニーが選択され、Ｚｈａｎｇ研究室のオンラインツール（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）によって予測されたマウスゲノム中のｓｇＫ１２ＬＰに対する２つの最も可能性のあるエクソンのオフターゲット部位を同じ方法で評価した。予測されたオフターゲット部位は、５’－ＴＡＡＧＴＡＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＧ－３’（Ｇｏｎ４ｌ）及び５’－ＴＧＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧ－３’（Ａｓｐｈｄ１）であった。これらの２つの部位のみが、計算された０．１超のオフターゲットスコアを有したため、これらを選択した。

統計：
全てのエラーバーは、別段の記載が無い限り、ｓ．ｅ．ｍを表す。全て試料が同じ分布を実証したことから、独立ｔ検定を使用して有意性を計算した。統計学的有意差を０．０５％に設定した。分散を群間で計算し、類似するとみなした。

ＫＲＴ１２特異的ｓｇＲＮＡの構築：
ＭＥＣＤを引き起こすＫＲＴ１２ミスセンス突然変異に起因する配列変化の分析は、重篤な形態のＭＥＣＤを引き起こすＬ１３２Ｐ突然変異が、偶然にも新規のＰＡＭ部位（ＡＡＧ＞ＡＧＧ）の生成をもたらすことを明らかにした。ＫＲＴ１２ Ｌ１３２Ｐ突然変異によって生成された新規のＰＡＭ部位の５’末端に隣接する配列２０ヌクレオチドに対し相補的なｓｇＲＮＡ（ｓｇＫ１２ＬＰ）を設計し、’Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ
Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ’ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｚｈａｎｇ ｌａｂ，ＭＩＴ ２０１３を使用して可能性のあるオフターゲットについて評価した（図５、赤色）。このシステムを使用して、ｓｇＲＮＡは６６％のスコアを有すると計算され、ここで、５０％超のスコアは、限られた数の予測される可能性のあるオフターゲットを含み、高品質であるとされる。

ｓｇＫ１２ＬＰ対立遺伝子特異性及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの効能の評価：
ｓｇＫ１２ＬＰの対立遺伝子特異性及び効能を、野生型及び突然変異体のＫ１２に対する外因性発現コンストラクトを使用して、ＨＥＫ ＡＤ２９３細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。最初に、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（図６、項ａ）を使用して、対立遺伝子特異性を特定した。Ｋ１２ＷＴ－Ｌｕｃ又はＫ１２ＬＰ－Ｌｕｃのいずれかを発現し、ｓｇＫ１２で処理した細胞において、ホタルルシフェラーゼ活性は有意に減少することがわかった。ホタルルシフェラーゼ活性の強力で、対立遺伝子特異的な減少が、ｓｇＫ１２ＬＰで処理した細胞で観察された。Ｋ１２ＬＰ－Ｌｕｃを発現する細胞では、７３．４±２．７％（Ｐ＜０．００１）の減少が観察された（図６、項ａ）。また、この対立遺伝子に特異的で強力なノックダウンは、Ｋ１２ＷＴ－ＨＡ又はＫ１２ＬＰ－ＨＡのいずれかを発現する細胞においてウエスタンブロットによって観察され（図６、項ｂ；４つのブロットの代表画像）、デンシトメトリーによる定量は、Ｋ１２ＷＴ－ＨＡタンパク質と比較して、ｓｇＫ１２ＬＰによるＫ１２ＬＰ－ＨＡタンパク質の３２％の有意な減少（Ｐ＜０．０５）を明らかにした。ｓｇＫ１２で処理した細胞において、野生型と突然変異体の両方のＫ１２タンパク質が減少したのがわかったのに対し、ｓｇＫ１２ＬＰで処理したものでは、野生型タンパク質の発現に対して効果は無いようであったが、突然変異体Ｋ１２タンパク質の有意なノックダウンがあるように見えた（図６、項ｂ）。

タンパク質レベルで観察されるこのデータを支持するため、定量的逆転写酵素－ＰＣＲ及びピロシーケンスを行って、ｍＲＮＡのレベルでの対立遺伝子特異性及び効能を特定した。野生型及び突然変異体の両方のＫ１２を同時に（１：１の発現比率で）発現し、そして３つの試験Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現コンストラクト（ＮＳＣ、Ｋ１２及びＫ１２ＬＰ）の各々で処理した細胞において、定量的逆転写酵素－ＰＣＲを使用して全Ｋ１２ ｍＲＮＡのノックダウンを判断した（図６、項ｃ）。全Ｋ１２ ｍＲＮＡの７３．１±４．２％の強力な減少（Ｐ＜０．００１）は、ｓｇＫ１２ＬＰ処理細胞では測定された５２．６±７．０％（Ｐ＜０．０１）のより少ない減少と共に、ｓｇＫ１２に処理した細胞で観察された（図６、項ｃ）。ピロシーケンスを使用して、これらのｓｇＲＮＡで処理した後に残留する成熟ｍＲＮＡ種の細胞内の割合を特定した（図６、項ｄ）。ｍＲＮＡの割合を、「Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐのパーセンテージ／Ｋ１２－ＷＴのパーセンテージ」として計算した。ｓｇＮＳＣで処理した細胞を１に正規化し、突然変異体と野生型のＫ１２ ｍＲＮＡ間の比率を１：１とした。ｓｇＫ１２を用いて試験した細胞では、０．８９±０．０３のＫ１２突然変異体ｍＲＮＡの割合が観察されたが、ＮＳＣ対照に対する差は有意ではなかった（Ｐ＜０．１４）。ｓｇＫ１２ＬＰで処理したそれらの細胞では、０．２８±０．０２のＫ１２突然変異体ｍＲＮＡの割合が検出され、ｓｇＮＳＣ処理細胞と比較して、有意
に変更された（Ｐ＜０．００１）（図６、項ｄ）。

ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｇＲＮＡ－Ｋ１２ＬＰの効能の判定：
Ｃａｓ９－ＧＦＰコンストラクトの実質内注射は、注射から２４時間後の角膜上皮中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タンパク質の存在をもたらした（図７、項ａ）。ＧＦＰの一時的発現は、注射から４８時間後まで見られた。Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐヒト化ヘテロ接合マウスへのｓｇＫ１２ＬＰ又はｓｇＮＳＣの発現コンストラクトのいずれかの基質内の注射、及び４８時間のインキュベーション期間の後、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を角膜から作製した。４匹のｓｇＫ１２ＬＰ又はｓｇＮＳＣで処理した動物の角膜に由来するｇＤＮＡを貯蔵し、ヒト化Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ遺伝子のエクソン１のＰＣＲ増幅、クローニング及びシーケンシングを行った。ｓｇＮＳＣで処理した眼のｇＤＮＡから樹立した１０個のクローンのうち、Ｋ１２－Ｌ１３２Ｐ配列は１０個全てにおいて無傷のままであった。ｓｇＫ１２ＬＰで処理した眼に由来する１３個の個々のクローンをシーケンシングしたところ、８個は変化していないＫＲＴ１２ Ｌ１３２Ｐヒト配列を含むことがわかったが、５個のクローンはＣａｓ９／ｓｇＫ１２ＬＰ複合体の予測された切断部位周辺のＮＨＥＪを実証した（図７、項ｂ）。１個のクローン（１）では、１個のヌクレオチドの挿入が、３２個のヌクレオチドの欠失と共に見出された。最大５３個のヌクレオチドの大きな欠失が、ｉｎ ｖｉｖｏで観察された（クローン５）。これらの５個のクローンのうち、４個（クローン１、及びクローン３～５）は、初期の停止コドンの発生に結び付く可能性のあるフレームシフトをもたらすと予想される欠失を含んだ。また、マウス中のｓｇＫ１２ＬＰの上位２個の予測されるエクソンのオフターゲット部位もこの方法を使用して評価した。１０個のクローンを各標的に対してシーケンシングし、いずれも非特異的な切断を経なかったことがわかった。

Ｒ５１４Ｐ、Ｌ５１８Ｒ及びＬ５０９Ｒにおける突然変異によって作製されたＰＡＭ部位に関連するＴＧＦＢＩ突然変異：
シングルガイドＲＮＡを、これらの突然変異の各々をターゲットとするように設計し、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現プラスミドへとクローニングした。さらに、天然起源の近くのＰＡＭを利用する陽性対照ガイドＲＮＡを各突然変異に対して設計した。野生型及び突然変異体の標的配列をルシフェラーゼレポータープラスミドへとクローニングし、本発明者らが、ＷＴの発現及びＭＵＴ発現に対する遺伝子エディティングの効果をモニターすることを可能とした。両方のプラスミドを使用してＡＤ２９３細胞をトランスフェクトし、本発明者らのハイスループットレポーター遺伝子アッセイを使用してＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９処理の４８時間後にルシフェラーゼ発現を測定し、細胞中に存在するＭＵＴ及びＷＴのＤＮＡ量の測定を得た。

図８は、ＳＮＰ由来ＰＡＭアプローチを使用して評価した３つのＴＧＦＢＩ突然変異（Ｒ５１４Ｐ、Ｌ５１８Ｒ及びＬ５０９Ｒ）について、顕著な対立遺伝子特異性が達成されたことを示す。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システムによって切断された突然変異対立遺伝子、及びガイドのうちの幾つか対してある程度切断されたＷＴ ＤＮＡを伴って達成された。

ＰＡＭ部位に隣接する標的部位内に位置するＳＮＰ突然変異と関連するＴＧＦＢＩ突然変異：
シングルガイドＲＮＡをこれらの突然変異を標的とするように設計し、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現プラスミドにクローニングした。野生型及び突然変異体の標的配列をルシフェラーゼレポータープラスミドにクローニングし、本発明者らのハイスループットレポーター遺伝子アッセイで評価した。両方のプラスミドを使用してＡＤ２９３細胞をトランスフェクトし、２日後にルシフェラーゼ発現を測定した。最初に、２０ｂｐ標的特異的配列を含むｓｇＲＮＡを試験した。しかしながら、これらは十分な対立遺伝子特異性を提供しな
かった。その後、標的配列を１８ｂｐに減じた、トランケートｓｇＲＮＡ（ＴＲＵガイド）を設計した。改善された対立遺伝子特異性が認められた（図９、項ａ～項ｆ）。

Ｅｘ Ｖｉｖｏ遺伝子修正：
ルシフェラーゼレポーターマウスに由来する角膜において、遺伝子サイレンシングを達成する能力を実証した。Ｌｕｃ２に対するヘテロ接合マウスを選別し、それらの角膜を解剖した後、細胞培養培地に移した。解剖した角膜を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用してルシフェラーゼレポーター遺伝子に対して標的化した非特異的対照ｓｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。角膜を３日間培養で維持し、ルシフェラーゼ発現を測定した。

Ｌｕｃ２標的とするｓｇＲＮＡでトランスフェクトした角膜において、ｅｘ ｖｉｖｏでの標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ遺伝子エディティングの成功を表す、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の強力なサイレンシングが観察された（図１０）。Ｌｕｃ２に対するヘテロ接合のマウスに由来する角膜を解剖し、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子エディティングをｅｘ ｖｉｖｏで行った。角膜上皮幹細胞は角膜縁領域に限定されないことから、本発明者らは、図１０に示される全上皮にわたって遺伝子エディティングを示す必要があった。治療の後の右図の濃い色は、完全な遺伝子エディティング、及びこのマウス角膜全体中のｅｘ ｖｉｖｏでのＬｕｃ遺伝子のノックアウトを実証した（Ｍｏｏｒｅ ＪＥ，ＭｃＭｕｌｌｅｎ
ＣＢＴ，Ｍａｈｏｎ Ｇ，Ａｄａｍｉｓ ＡＰ（２００２）．Ｔｈｅ Ｃｏｒｎｅａｌ
Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．ＤＮＡ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１（５－６）ｐｐ．４４３－４５１．）。

顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型の治療に対する外科移植

細胞を顆粒状角膜ジストロフィーＩＩ型に対する治療を受けている患者から得られた角膜縁の生検試料から培養する。治療を受けている患者は、次のアミノ酸置換のうちの１つをコードするＴＧＦＢＩ遺伝子中の突然変異を保持する：Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐ。細胞を洗浄し、角膜縁上皮幹細胞（ＬＥＳＣ）を次のマーカーの１以上に基づいて選別する：転写因子ｐ６３、ＡＢＣＧ２、Ｃ／ＥＢＰδ又はＢｍｉ－１。３Ｔ３フィーダー細胞の存在下で、単離したＬＥＳＣからＡ細胞株を樹立する。その後、樹立したＬＥＳＣ株を、次の陽性マーカー：転写因子ｐ６３、ＡＢＣＧ２、Ｃ／ＥＢＰδ又はＢｍｉ－１の１以上の存在、及び次の陰性マーカー：サイトケラチン３（ＣＫ３）、サイトケラチン１２（ＣＫ１２）、コネキシン４３又はインボルクリンの１以上不在によって確認する。

ＣＲＩＳＰＲシステム試薬を、Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２９９－３１１（２０１３）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３（Ｒ１）：Ｒ４０－６（２０１４）；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８ （２０１５）、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５７：１２６２－１２７８（２０１４）に従って作製する。ＣＲＩＳＰＲシステムの試薬は、同じベクター上に含まれる１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡｓ）、ＩＩ型ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１）、及びおよそ１５０ｂｐ長の修復核酸を含む。修復核酸は、位置相同組み換え現象の選択を可能とする選択可能なＧＦＰマーカーと同様に、Ｒ１２４、Ｒ５５５又はＨ６２６の野生型対立遺伝子を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムの試薬は、標準ポリマー系（ＤＥＡＥデキストラン）トランスフェクション技術を使用して、ＬＥＳＣ細胞株に導入される。ＬＥＳＣに核酸操作現象を経させ、かかる減少に対して陽性の細胞をＧＦＰマーカー及びＦＡＣＳを使用して単離する。所望の相同組み換え減少を、ＦＡＣＳ選別ＬＥＳＣにおいて目的のＴＧＦＢＩ領域をシーケンシングすること
により更に確認する。

所望の野生型ＴＧＦＢＩ対立遺伝子を含む操作されたＬＥＳＣを、操作されたＬＥＳＣに十分な期間の羊膜上で培養して、移植に対して適切な領域サイズに拡大させる。一旦所望のサイズを達成すると、担体として羊膜を使用して操作されたＬＥＳＣを移植することができる。

Claims (11)

1. 角膜ジストロフィーの予防、改善、又は治療を必要とする対象から単離された角膜縁上皮幹細胞において角膜ジストロフィー標的核酸中の核酸突然変異を操作するためのキットであって、
   角膜縁上皮幹細胞中の角膜ジストロフィー標的核酸とハイブリダイズするガイドＲＮＡ核酸（ここで、前記角膜ジストロフィー標的核酸は、ＴＧＦβＩ、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、ＰＬＰ１、ＫＲＴ３、ＫＲＴ１２、ＧＳＮ、又はＵＢＩＡＤ１の標的核酸である）と、
   ヌクレアーゼをコードするヌクレアーゼ核酸と
   を備え、
   野生型の角膜ジストロフィー標的核酸又はそのフラグメントを含む修復核酸を更に備えていてもよい、キット。
2. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＴＧＦβＩ標的核酸であり、前記核酸突然変異が、ＴＧＦβＩポリペプチド中のアルギニン１２４、アルギニン５５５、又はヒスチジン６２６のアミノ酸置換をコードする、請求項１に記載のキット。
3. 前記核酸突然変異が、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ及びＨ６２６Ｐから選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項２に記載のキット。
4. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＬＯＸ、ＳＰＡＲＣ、ＬＲＲＮ１、ＨＧＦ、ＡＫＡＰ１３、ＺＮＦ４６９、ＡＴＧ１２Ｐ２、ＧＳ１－２５６Ｏ２２．５、ＰＬＥＫＨＡ６、ＡＰＯＬ４、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ６Ａ１８、ＳＬＣ２９Ａ３、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＫＣＮＭＡ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＲＯＣＣ、ＡＴＨＬ１、又はＰＬＰ１の標的核酸であり、
   前記核酸突然変異が、ＣＯＬ４Ａ１中のＱ１３３４Ｈ、ＣＯＬ４Ａ２中のＧ６８３Ａ、ＣＯＬ４Ａ２中のＰ７１８Ｓ、ＣＯＬ４Ａ２中のＲ５１７Ｋ、ＣＯＬ４Ａ３中のＤ３２６Ｙ、ＣＯＬ４Ａ３中のＨ４５１Ｒ、ＣＯＬ４Ａ４中のＶ１３２７Ｍ、ＬＯＸ中のＲ１５８Ｑ、ＡＫＡＰ１３中のＡ１０４６Ｔ、ＡＫＡＰ１３中のＧ６２４Ｖ、ＺＮＦ４６９中のＧ２３５８Ｒ、ＳＬＣ２９Ａ３中のＳ１５８Ｆ、ＭＵＣ５ＡＣ中のＰ４４９３Ｓ、ＣＲＯＣＣ中のＰ３７０Ｓ、又はそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸置換をコードする、
   請求項１に記載のキット。
5. 前記核酸突然変異が、ｒｓ３７４２２０７、ｒｓ３８０３２３０、ｒｓ９５８３５００、ｒｓ７９９０３８３、ｒｓ５５７０３７６７、ｒｓ１１６７７８７７、ｒｓ２２２９８１３、ｒｓ１８００４４９、ｒｓ１０５３４１１、ｒｓ２１１６７８０、ｒｓ３７４９３５０、ｒｓ２２８６１９４、ｒｓ１２５３６６５７、ｒｓ２６１４６６８、ｒｓ７４５１９１、ｒｓ１２５９８４７４、ｒｓ１０９３２９７６、ｒｓ５９０８６７８、ｒｓ３５８０３４３８、ｒｓ１３２７２８、ｒｓ１３２７２９、ｒｓ１３２７３０、ｒｓ８５９０６３、ｒｓ２８９３２７６、ｒｓ６６８７７４９、ｒｓ１３１８９８５５、ｒｓ６８７６５１４、ｒｓ６８７６５１５、ｒｓ１３３６１７０１、ｒｓ８８３７６４、ｒｓ７８０６６７、ｒｓ７８０６６８、ｒｓ１３１６６１４８、ｒｓ１０９４１２８７、ｒｓ７９０７２７０、ｒｓ２００９２２７８４、ｒｓ９４３５７９３、ｒｓ１１６３００９７４、又はｒｓ２２３３６９６に相当する、請求項４に記載のキット。
6. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＴＧＦβＩ標的核酸であり、前記核酸突然変異が、ＴＧＦβＩ標的核酸中のＬｅｕ５０９Ａｒｇ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ａｒｇ５５５Ｇｌｎ、Ａｒｇ１２４Ｃｙｓ、Ｖａｌ５０５Ａｓｐ、Ｉｌｅ５２２Ａｓｎ、Ｌｅｕ５６９Ａｒｇ、Ｈｉｓ５７２Ａｒｇ、Ａｒｇ４９６Ｔｒｐ、Ｐｒｏ５０１Ｔｈｒ、Ａｒｇ５１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５１５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５１８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５１８Ａｒｇ、Ｌｅｕ５２７Ａｒｇ、Ｔｈｒ５３８Ｐｒｏ、Ｔｈｒ５３８Ａｒｇ、Ｖａｌ５３９Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４０ｄｅｌ、Ｐｈｅ５４０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５４４Ｓｅｒ、Ａｌａ５４６Ｔｈｒ、Ａｌａ５４６Ａｓｐ、Ｐｈｅ５４７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ５５１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ５５８Ｐｒｏ、Ｈｉｓ５７２ｄｅｌ、Ｇｌｙ５９４Ｖａｌ、Ｖａｌ６１３ｄｅｌ、Ｖａｌ６１３Ｇｌｙ、Ｍｅｔ６１９Ｌｙｓ、Ａｌａ６２０Ａｓｐ、Ａｓｎ６２２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ａｓｎ６２２Ｌｙｓ、Ｇｌｙ６２３Ａｒｇ、Ｇｌｙ６２３Ａｓｐ、Ｖａｌ６２４＿Ｖａｌ６２５ｄｅｌ、Ｖａｌ６２４Ｍｅｔ、Ｖａｌ６２５Ａｓｐ、Ｈｉｓ６２６Ａｒｇ、Ｈｉｓ６２６Ｐｒｏ、Ｖａｌ６２７ＳｅｒｆｓＸ４４、Ｔｈｒ６２９＿Ａｓｎ６３０ｉｎｓＡｓｎＶａｌＰｒｏ、Ｖａｌ６３１Ａｓｐ、Ａｒｇ６６６Ｓｅｒ、Ａｒｇ５５５Ｔｒｐ、Ａｒｇ１２４Ｓｅｒ、Ａｓｐ１２３ｄｅｌｉｎｓ、Ａｒｇ１２４Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５０９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０３＿Ｓｅｒ１０４ｄｅｌ、Ｖａｌ１１３Ｉｌｅ、Ａｓｐ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２４Ｌｅｕ、及び／又はＴｈｒ１２５＿Ｇｌｕ１２６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項１に記載のキット。
7. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＫＲＴ３標的核酸であり、前記核酸突然変異が、ＫＲＴ３標的核酸中のＧｌｕ４９８Ｖａｌ、Ａｒｇ５０３Ｐｒｏ、及び／又はＧｌｕ５０９Ｌｙｓからなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項１に記載のキット。
8. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＫＲＴ１２標的核酸であり、前記核酸突然変異が、ＫＲＴ１２標的核酸中のＭｅｔ１２９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１２９Ｖａｌ、Ｇｌｎ１３０Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３２Ｖａｌ、Ｌｅｕ１３２Ｈｉｓ、Ａｓｎ１３３Ｌｙｓ、Ａｒｇ１３５Ｇｌｙ、Ａｒｇ１３５Ｉｌｅ、Ａｒｇ１３５Ｔｈｒ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｌａ１３７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１４０Ａｒｇ、Ｖａｌ１４３Ｌｅｕ、Ｌｌｅ３９１＿Ｌｅｕ３９９ｄｕｐ、Ｉｌｅ４２６Ｖａｌ、Ｉｌｅ４２６Ｓｅｒ、Ｔｙｒ４２９Ａｓｐ、Ｔｙｒ４２９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４３０Ｐｒｏ、及び／又はＬｅｕ４３３Ａｒｇからなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項１に記載のキット。
9. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＧＳＮ標的核酸であり、前記核酸突然変異が、ＧＳＮ標的核酸中のＡｓｐ２１４Ｔｙｒのアミノ酸置換をコードする、請求項１に記載のキット。
10. 前記角膜ジストロフィー標的核酸が、ＵＢＩＡＤ１標的核酸であり、前記核酸突然変異が、ＵＢＩＡＤ１標的核酸中のＡｌａ９７Ｔｈｒ、Ｇｌｙ９８Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０２Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１２Ａｓｎ、Ａｓｐ１１２Ｇｌｙ、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、Ａｒｇ１１９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１２１Ｖａｌ、Ｌｅｕ１２１Ｐｈｅ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１２２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１７４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ１７５Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１７７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１８１Ａｒｇ、Ｇｌｙ１８６Ａｒｇ、Ｌｅｕ１８８Ｈｉｓ、Ａｓｎ２３２Ｓｅｒ、Ａｓｎ２３３Ｈｉｓ、Ａｓｐ２３６Ｇｌｕ、及び／又はＡｓｐ２４０Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする、請求項１に記載のキット。
11. 前記角膜ジストロフィーが眼レーザー手術後に生じる、請求項１～１０のいずれかに記載のキット。

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