JP2017504312A - ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用 - Google Patents

ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的配列の配列及び／又は活性を操作するための系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング及び最適化を提供する。送達系及び送達部位として標的化される組織又は臓器が提供される。また、一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分をコードするベクター及びベクター系、並びにかかるベクターの設計及び使用方法も提供される。また、標的認識に対する特異性の増進及び毒性の回避を確実にし、且つ目的のゲノム遺伝子座における標的部位を編集又は改変して疾患状態又は病態を変化させ又は改善するため、真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ複合体形成を誘導する方法も提供される。

Description

関連出願及び参照による組み入れ
本出願は、各々２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，１７６号明細書；同第６１／９１５，１９２号明細書；同第６１／９１５，２１５号明細書；同第６１／９１５，１０７号明細書、同第６１／９１５，１４５号明細書；同第６１／９１５，１４８号明細書；及び同第６１／９１５，１５３号明細書に対する優先権を主張するものである。
上記の出願、及びこれらの出願で引用される又はこれらの出願の審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、及びこの出願引用文献において引用又は参照される全ての文献、及び本明細書において引用又は参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書の引用文献において引用又は参照される全ての文献は、本明細書において又は本明細書での参照により組み入れられる任意の文献において述べられる任意の製品についての任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれ個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により組み入れられる。
本発明は、一般に、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分が関係する配列標的化を伴う遺伝子発現の制御、例えばゲノム摂動又は遺伝子編集に用いられる系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング、最適化及び治療適用に関する。詳細には、本発明は、哺乳動物を含めた動物においてゲノム編集によって治療利益が得られるようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を送達するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ系、方法、及び組成物に関する。
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から授与されたＮＩＨパイオニアアワード（ＮＩＨ Ｐｉｏｎｅｅｒ Ａｗａｒｄ）（１ＤＰ１ＭＨ１００７０６）及び同様に国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成１ＤＰ１ＯＤ００９５５２に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
ゲノムシーケンシング技術及び分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより原因遺伝子変異体の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、並びに合成生物学、バイオテクノロジー用途、及び医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼが、標的化されるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数の位置を標的化しやすい新たなゲノム工学技術が依然として必要とされている。
有効な治療仮説及び薬剤開発における強力な取り組みにも関わらず、強い遺伝的関与を有する疾患の治療に小分子を使用して成功した例は限られた数しかない。従って、疾患に罹患した細胞及び組織内で核酸を改変することが可能な治療ストラテジーに向けた代替的且つロバストな系が差し迫って必要とされている。治療的ゲノムエンジニアリング方法のレパートリーにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が加わることで、方法論が大幅に単純化され、且つ様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝的要因の列挙及びマッピング能力、遺伝性疾患の動物モデルの開発能力、及び安全で有効な治療選択肢の開発能力が促進される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有害作用なしに有効にゲノム編集に利用するためには、これらのゲノムエンジニアリングツールの操作、最適化及び細胞型／組織／臓器特異的な送達を理解することが決定的に重要であり、それらが特許請求される本発明の態様である。本発明の態様はこの必要性に対処し、関連する利点を提供する。
例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結し、次にはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。出願者らは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳａＣａｓ９を使用することを含め、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノムエンジニアリング系の構成成分を最適化している。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（ｓｙｔｅｍ）の構成成分をｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞、組織及び臓器に送達するには、様々な送達手段を用い得る。出願者らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系構成成分（例えば、ＳａＣａｓ９を含む）をウイルス送達ベクター、例えばＡＡＶに有効にパッケージングしており、それを使用してｉｎ ｖｉｖｏで哺乳類細胞の内因性ゲノム配列を改変し得ることを実証している。出願者らの本発明の重要な特徴は、それが低い（治療構成成分の）ｉｎ ｖｉｖｏ送達効率及び低い相同依存性修復（ＨＤＲ）効率の課題に有効に対処することであり、詳細には、共送達に関連する課題が、Ｃａｓ９タンパク質及びその対応する１つ以上のｓｇＲＮＡの両方を発現するように単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに容易にパッケージングすることのできる小さいＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳａＣａｓ９によって解決されることである。さらに、重要なことには、出願者らは、小さいＳａＣａｓ９を導入すると、ＨＤＲの実行に必要なウイルスベクターの数が３つのベクターから２つのベクターに減少したことを示している。本発明の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分の送達には粒子が用いられ得る。そして接触させる粒子の数は１つ又は２つであり得る。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、ゲノム遺伝子座の標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供し、ここでゲノム遺伝子座は、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異（ｍｕａｔｉｏｎ）を含め、突然変異に関連する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体には、ゲノム遺伝子座内、例えばかかる標的遺伝子座のコード（ｃｏｐｄｉｎｇ）エレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的ポリヌクレオチドを改変すること（例えば、欠失させること、挿入すること、転位させること、不活性化させること、活性化させること）を含め、幅広い有用性がある。従って本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子又はゲノム編集、遺伝子療法、創薬、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において広範囲の応用性を有する。本発明の態様は、野生型Ｃａｓ９酵素及びそれをコードする核酸分子と比べて長さの短い、最適な活性のガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系における標的化特異性が向上したＣａｓ９酵素、及びキメラＣａｓ９酵素、並びにＣａｓ９酵素の標的特異性を向上させる方法又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を設計する方法であって、最適な活性のガイドＲＮＡを設計又は調製するステップ及び／又は野生型Ｃａｓ９と比べてサイズ又は長さが小さく、従って野生型Ｃａｓ９と比べて送達ベクターにおけるそのコーディングが少ないため、それをコードする核酸を送達ベクターにパッケージングすることが一層捗るＣａｓ９酵素を選択又は調製するステップ、及び／又はキメラＣａｓ９酵素を作成するステップを含む方法に関する。また、本発明の配列、ベクター、酵素又は系の医薬における使用も提供される。また、それの遺伝子又はゲノム編集における使用も提供される。
本発明において、Ｃａｓ酵素は、任意の天然に存在する細菌性Ｃａｓ９を含めた野生型Ｃａｓ９であってもよい。Ｃａｓ９オルソログは、典型的には３〜４個のＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとの一般的構成を共有する。最も５’側のＲｕｖＣドメインが非相補鎖を切断し、及びＨＮＨドメインが相補鎖を切断する。表記は全てガイド配列を基準とする。５’ＲｕｖＣドメインの触媒残基は、目的のＣａｓ９を他のＣａｓ９オルソログ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、及びフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来）と相同性比較することによって同定され、保存されたＡｓｐ残基（Ｄ１０）をアラニンに突然変異させることにより、Ｃａｓ９が相補鎖ニッキング酵素に変換される。同様に、ＨＮＨドメインの保存されたＨｉｓ及びＡｓｎ残基をアラニンに突然変異させることにより、Ｃａｓ９が非相補鎖ニッキング酵素に変換される。一部の実施形態では、二組の突然変異を両方とも作製し、Ｃａｓ９を非切断酵素に変換し得る。従って、Ｃａｓ酵素は、任意の天然に存在する細菌性Ｃａｓ９を含めた野生型Ｃａｓ９であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ又はＣａｓ９酵素は、特定の種類のヒト細胞、又は任意のキメラ、突然変異体、ホモログ若しくはオルソログを含む改変型を含めたヒト細胞にコドンを最適化することができる。本発明のさらなる態様において、Ｃａｓ９酵素は１つ以上の突然変異を含んでもよく、機能ドメインとの融合を伴う又は伴わない一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用し得る。突然変異は人為的に導入された突然変異であってもよく、又は機能獲得型若しくは機能喪失型突然変異であってもよい。突然変異には、限定はされないが、それぞれＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン中の触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の一方の突然変異が含まれ得る。さらなる突然変異が特徴付けられている。本発明の一態様では、転写活性化ドメインはＶＰ６４であってもよい。本発明の他の態様では、転写リプレッサードメインはＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであってもよい。本発明の他の態様は、限定はされないが、転写活性化因子、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメイン又は化学誘導性／制御性ドメインを含むドメインに融合した突然変異Ｃａｓ９酵素に関する。本発明には、ｓｇＲＮＡ若しくはｔｒａｃｒＲＮＡ又は細胞におけるこれらのＲＮＡのパフォーマンスを増進させるガイド若しくはキメラガイド配列が関わり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は任意のＣａｓ酵素であってよい。Ｃａｓ９が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の複数のヌクレアーゼドメインを含む最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的な酵素クラスを指し得るとおり、好ましいＣａｓ酵素はＣａｓ９と特定し得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素はｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９由来であり、又はそれから誘導される。誘導されるとは、出願者らは、その誘導された酵素が野生型酵素と高度な配列相同性を有するという意味では主に野生型酵素をベースとするが、しかしそれは本明細書に記載されるとおり何らかの形で突然変異している（改変されている）ものであることを意味する。
用語Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素は、特に明らかでない限り、概して本明細書では同義的に使用されることが理解されるであろう。上述のとおり、本明細書で使用される残基の付番の多くは化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を基準とする。しかしながら、本発明がＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９などの他の微生物種由来のさらに多くのＣａｓ９を含むことは理解されるであろう。さらなる例が本明細書に提供される。当業者は、関連するアミノ酸配列の比較により、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓ９酵素における適切な対応する残基を決定することができるであろう。従って、ＳｐＣａｓ９付番を使用して特定のアミノ酸置換が言及される場合に、それが他のＣａｓ９酵素を参照しないよう意図されることが文脈上明らかでない限り、本開示は、他のＣａｓ９酵素における対応する改変を包含するよう意図される。この場合にはヒトに最適化された（即ちヒトでの発現に最適化されている）コドン最適化配列の例が本明細書に提供される（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと）。これが好ましいものの、他の例が可能であることは理解され、宿主種に対するコドン最適化は公知である。本発明は、Ｃａｓ９がキメラＣａｓ９タンパク質である方法を包含する。これらの方法は、あるＣａｓ９ホモログの１つ以上のＮ末端断片を１つ以上の他の又は別のＣａｓ９ホモログの１つ以上のＣ末端断片と共に含み得る。本方法において、生物が動物である場合、改変がｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば細胞培養物において、場合によってはｉｎ ｖｉｖｏ以外で行われ得ることは理解されるであろう。他の実施形態では、改変はｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。本発明は、一部の実施形態において、本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（それに含めて又は代えてＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を包含し、ここで標的配列には、特にＣａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である（又はそれから誘導される）場合に、５’−モチーフを含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列がその３’末端に隣接する。例えば、好適なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又は誘導酵素）について５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲである（ここでＮは任意のヌクレオチドである）。ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９由来のものであるか、又はそれから誘導されるものであることは理解されるであろう。
一態様において、本発明は、
Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及びＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し；及び
この方法は、任意選択で、ＨＤＲ鋳型を例えばウイルス送達ベクター又は粒子を介して送達するステップもまた含むことができ、ＨＤＲ鋳型、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び
任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物から前記異常タンパク質を発現する細胞を単離又は入手するステップ、任意選択でこの細胞集団を拡大するステップ、１つ以上のウイルスベクター又は粒子と前記細胞の接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変細胞を生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
一態様において、本発明は、Ｉ．（ａ）ＨＳＣ中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、ＩＩ．任意選択で１つ以上のＮＬＳを有するＣＲＩＳＰＲ酵素、及びＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列［ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列はＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、を含有するウイルスベクター又は粒子と細胞を接触させるステップを含む、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し；及び
この方法は、任意選択で、ＨＤＲ鋳型を例えばウイルス送達ベクター又は粒子を介して送達するステップもまた含むことができ、ＨＤＲ鋳型、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び
任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物から前記異常タンパク質を発現する細胞を単離又は入手するステップ、任意選択でこの細胞集団を拡大するステップ、１つ以上のウイルスベクター又は粒子と前記細胞の接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変細胞を生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
この送達は、例えば、１つ以上の調節エレメントに機能的に連結している１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターを含有する１つ以上の粒子を介した、ＣＲＩＳＰＲ複合体の任意の１つ以上又は全てをコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、有利にはｉｎ ｖｉｖｏ発現のための１つ以上の調節エレメントに連結したポリヌクレオチドの送達であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又はｔｒａｃｒ配列の一部又は全部がＲＮＡであってもよい。ＲＮＡであって、かかるｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の特徴を「含む」と言われるポリヌクレオチドが言及される場合、ＲＮＡ配列がその特徴を備えることは理解されるであろう。ポリヌクレオチドがＤＮＡであって、かかるｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の特徴を含むと言われる場合、ＤＮＡ配列はその問題の特徴を含むＲＮＡに転写されるか、又は転写されることができる。特徴がＣＲＩＳＰＲ酵素などのタンパク質である場合、言及されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列は（ＤＮＡの場合には、初めに転写されてから）翻訳されるか、又は翻訳されることができる。
特定の実施形態において、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を細胞又は細胞集団と例えば接触させることによって送達するステップを含む、目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物、例えばヒトを含む哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法を提供し、ここで組成物は、組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルス、プラスミド又は核酸分子ベクター（例えばＲＮＡ）を含む１つ以上の送達ベクター又は粒子を含み、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む、第１の調節エレメント、及びＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は一部の実施形態はＮＬＳが関与しないこともあるため任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］、又は（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Ｉ．（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結している第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及びＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含み；この方法は、任意選択で、例えば細胞又は細胞集団と接触する送達ベクター又は粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の送達ベクター又は粒子に細胞、細胞又は細胞集団を接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、前記異常タンパク質を発現する細胞を生物又は非ヒト生物から単離又は入手するステップ、任意選択で前記細胞集団を拡大するステップ、１つ以上の送達ベクター又は粒子と、前記異常タンパク質を発現する前記細胞との接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップ及び任意選択で改変細胞を生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分ＩＩＩが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分ＩＩが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分Ｉが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの各々が異なるベクターに位置する。本発明はまた、本明細書に記載されるとおりのウイルス又はプラスミドベクター系も提供する。
標的配列の操作とは、出願者らは標的配列の後成的操作も意味する。これは、標的配列のメチル化状態の改変（即ちメチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧ島の付加又は除去）、ヒストン改変、標的配列への接触し易さの増加又は低減によるか、又は三次元折り畳みの促進によるなどの、標的配列のクロマチン状態の操作であってもよい。目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によってヒトを含む生物若しくは哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法が言及される場合、これは生物（又は哺乳動物）に全体として適用されても、又は（その生物が多細胞生物である場合）当該生物の単一細胞若しくは細胞集団だけに適用されてもよいことは理解されるであろう。例えばヒトの場合、出願者らは特に単一細胞又は細胞集団を想定し、それらは好ましくはｅｘ ｖｉｖｏで改変されて、次に再び導入され得る。この場合、生検又は他の組織試料若しくは生体液試料が必要となり得る。これに関して幹細胞もまた特に好ましい。しかし、当然ながらｉｎ ｖｉｖｏ実施形態もまた想定される。そして本発明は、眼細胞、網膜細胞、血管細胞、上皮細胞、内皮細胞、及び蝸牛細胞に関して特に有利である。
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列
を含む第１のポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｂ）第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含む第２のポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並ぶ］；又は
ＩＶ．Ｉ．〜ＩＩＩ．の１つ以上の１つ又は複数の発現産物、例えば第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素；
［転写されると、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がそれぞれ第１及び第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と第１及び第２の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド配列、及び（２）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド配列、及び（２）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む送達ベクター、例えばウイルスベクター又は粒子を細胞又は細胞集団に接触させることによる送達するステップを含む、細胞又は細胞集団の目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、；及びこの方法（ｍｔｈｏｄ）は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有する細胞又は細胞集団と接触する送達ベクターを介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の送達ベクターに細胞又は細胞集団を接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物から細胞又は細胞集団を単離又は入手するステップ、任意選択でこの細胞集団を拡大するステップ、１つ以上の送達ベクター又は粒子と細胞又は細胞集団との接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップを含み得る。真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法であって、組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップであって、この組成物が、
（Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
（ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、及び
ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＳａＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＳａＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
又は
（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＳａＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント
［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＳａＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む、ステップと、任意選択で改変細胞を生物又は非ヒト生物に投与するステップとを含む、前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法。本発明の一部の方法において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列の一部又は全部がＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される；しかし、送達はウイルスベクター又は粒子によることが有利である。本発明の特定の実施形態において、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を共有し、及び／又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素、例えばＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。本発明の態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、この１つ以上の突然変異は、ＳｐＣａｓ９を基準に、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択され、例えばＤ１０Ａ突然変異である。好ましい実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第２の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明の好ましい方法において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
ＣＲＩＳＰＲ酵素の突然変異に関連して、酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で起こり得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、ＳｐＣａｓ９では、任意の又は全ての以下の突然変異が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；さらに、任意の置換アミノ酸が保存的置換であることも想定される。一態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の、又はそれぞれの、又は全ての実施形態を提供し、この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つ以上、又は少なくとも２つ以上の突然変異を含み、少なくとも１つ以上の突然変異又は少なくとも２つ以上の突然変異が、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、若しくはＤ９８６、例えば、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／若しくはＤ９８６Ａ、例えば、ＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａ、又はＳｐ若しくはＳａのオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異である、或いはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＳｐＣａｓ９におけるＨ８４０若しくはＮ８６３Ａ又はＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａが突然変異し；例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、又はＳｐタンパク質若しくはＳａタンパク質のオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異を含む。
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．第２の調節エレメントであって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第２の調節エレメント、
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、及び
ＩＶ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第４の調節エレメント、
Ｖ．Ｉ．〜ＩＶ．の１つ以上の１つ又は複数の発現産物、例えば第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素；
［構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２の標的配列に対する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む１つ以上の送達ベクター又は粒子を細胞又は細胞集団に接触させることにより送達するステップを含む、細胞又は細胞集団の目的のゲノム遺伝子座であって、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し；及びこの方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有する細胞又は細胞集団と接触する送達ベクター又は粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子に細胞又は細胞集団を接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物から細胞又は細胞集団を単離又は入手するステップ、任意選択でこの細胞を拡大するステップ、１つ以上の送達ベクター又は粒子と細胞又は細胞集団との接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
本発明はまた、本明細書に記載されるとおりのベクター系も提供する。この系は、１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターを含み得る。従って構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターに位置してもよく、本明細書では、構成成分の可能な位置の全ての組み合わせが想定され、例えば：想定される全ての位置の組み合わせで、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが同じベクターに位置してもよく；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが各々異なるベクターに位置してもよく；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが合計２つ又は３つの異なるベクターに位置してもよい等である。本発明の一部の方法において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列の一部又は全部がＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態において、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を共有し、及び／又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を共有する。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、この１つ以上の突然変異は、ＳｐＣａｓ９を基準に、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択され；例えばＤ１０Ａ突然変異である。好ましい実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第２の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明のさらなる実施形態において、ウイルスベクターの１つ以上は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される；しかし、ウイルス送達又は粒子送達が有利である。
本発明の好ましい方法において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
本発明は、一部の実施形態では、例えば、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質と細胞又は細胞集団中のＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的にする２つのガイドＲＮＡとを含む１つ以上の送達ベクター又は粒子を細胞又は細胞集団に接触させることにより、細胞又は細胞集団に導入し、それによりガイドＲＮＡがＤＮＡ分子を標的化し、且つＣａｓタンパク質がＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々をニッキングし、それにより細胞又は細胞集団中の標的を変化させることにより（及び、Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない）、細胞又は細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｕｌａｔｉｏｎ）における目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含し、及びこの方法（ｍｔｈｏｄ）は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有する細胞又は細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｕｌａｔｉｏｎ）と接触する送達ベクター又は粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の送達ベクター又は粒子に細胞又は集団を接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物から細胞を単離又は入手するステップ、任意選択でこの細胞集団を拡大するステップ、１つ以上の送達ベクター又は粒子と細胞との接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップ及び任意選択で改変細胞を生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。本発明の好ましい方法において、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々をニッキングすることにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。本発明の実施形態はまた、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含むガイドＲＮＡも包含する。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９に基づき、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異；例えばＤ１０Ａ突然変異を有する。本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
ａ）細胞又は細胞集団内の細胞の二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的化する２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡの各々に機能的に連結している第１の調節エレメント、及び
ｂ）Ｃａｓタンパク質に機能的に連結している第２の調節エレメント、又は
ｃ）ａ）又はｂ）の１つ以上の発現産物、
［構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクターに位置する］を含む１つ以上の送達ベクター又は粒子を細胞又は細胞集団に接触させることにより、細胞又は細胞集団に導入し、それによりガイドＲＮＡが細胞又は細胞集団内の細胞のＤＮＡ分子を標的化し、且つＣａｓタンパク質がその細胞又は細胞内の細胞のＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々をニッキングすることにより（及び、Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない）、細胞又は細胞集団における目的のゲノム遺伝子座、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含し；及びこの方法は、任意選択で、例えばＨＤＲ鋳型を含有する細胞又は細胞集団と接触する送達ベクター又は粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子に細胞又は細胞集団を接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物から細胞を単離又は入手するステップ、任意選択で前記細胞集団を拡大するステップ、１つ以上の送達ベクター又は粒子と細胞との接触を実施して改変された細胞集団を入手するステップ、任意選択で改変細胞の集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変細胞を生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。本発明の態様において、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明のある実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９を基準に、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異；例えばＤ１０Ａ突然変異を有する。本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、系のベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、系のベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達され；及び粒子が好ましい。一態様において、本発明は、細胞又は細胞集団中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させるステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結し、次にはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置で１つ又は２つの鎖を切断することを含む。一部の実施形態では、前記切断は、標的遺伝子の転写の低下をもたらす。一部の実施形態では、この方法は、前記切断した標的ポリヌクレオチドを外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって修復するステップをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質における１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態では、この方法は、１つ以上のベクター又はその１つ以上の発現産物を例えば１つ以上の送達ベクター又は粒子を介して前記細胞又は細胞集団に送達するステップをさらに含み、ここで１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結したガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、前記ベクターは対象の細胞又は細胞集団に送達される。一部の実施形態では、前記改変するステップは細胞培養物中の前記細胞又は細胞集団において行われる。一部の実施形態では、この方法は、前記改変するステップの前に対象から前記細胞又は細胞集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、前記細胞又は細胞集団及び／又はそれに由来する細胞を前記対象に戻すステップをさらに含む。
一態様において、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含む細胞又は細胞集団を作成する方法を提供する。一部の実施形態では、疾患遺伝子は、疾患を有する又は発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）１つ以上のベクター又はその１つ以上の発現産物を例えば１つ以上の送達ベクター又は粒子を介して細胞又は細胞集団に導入するステップであって、１つ以上のベクターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結したガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する、ステップ；及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させるステップであって、前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ［ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］、それにより突然変異疾患遺伝子を含む細胞又は細胞集団を作成するステップを含む。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置で１つ又は２つの鎖を切断することを含む。一部の実施形態では、前記切断は、標的遺伝子の転写の低下をもたらす。一部の実施形態では、この方法は、前記切断した標的ポリヌクレオチドを外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって修復するステップをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現における１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態では、改変細胞又は細胞集団は動物に投与され、それにより動物モデルが作成される。
一態様において、本発明は、細胞又は細胞集団中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させるステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結し、次にはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。他の実施形態では、本発明は、異常タンパク質を発現する細胞又は細胞集団から生じる真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。この方法は、細胞又は細胞集団中のポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は低下させるステップを含み；有利にはＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つ以上のウイルス送達ベクター又は粒子を介して送達される。
一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化することにより細胞又は細胞集団における発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞中の標的配列に結合すると標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されなくなり、コードタンパク質が産生されなくなり、又はその配列は野生型配列のようには機能しなくなる。
一部の実施形態では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態では、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態では、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態では、機能ドメインは後成的修飾ドメインであり、従って後成的修飾酵素が提供される。一部の実施形態では、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。
本発明は、医薬又は治療に使用される本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ複合体若しくは酵素又はそのＲＮＡ（それに含めて又は代えてＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）をさらに包含する。一部の実施形態では、本発明は、本発明に係る方法において使用される本発明に係る組成物又はその構成成分を包含する。一部の実施形態では、本発明は、特に、任意選択で次には細胞又は細胞集団が得られた元の生物又は非ヒト生物か或いは同じ種の別の生物又は非ヒト生物に導入され得る細胞又は細胞集団におけるｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集における本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ複合体若しくは酵素又はそのＲＮＡ（それに含めて又は代えてＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）の使用を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子若しくはゲノム編集用薬剤又は本発明に係る方法において使用される薬剤の製造における本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ複合体若しくは酵素又はそのＲＮＡ（それに含めて又は代えてＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）の使用を包含する。特定の実施形態において、本発明は、それを必要としている対象（例えば、哺乳動物又はヒト）又は非ヒト対象（例えば、哺乳動物）における目的のゲノム遺伝子座の標的配列の欠陥によって引き起こされる病態を治療又は阻害する方法を提供し、この方法は、細胞又は細胞集団中の標的配列の操作によって対象又は非ヒト対象の細胞又は細胞集団を改変するステップ、及び改変細胞を対象又は非ヒト対象に投与するステップを含み、有利には、細胞を改変するステップは、ＣＲＩＳＰＲ複合体又はその構成成分を含有する送達ベクター（例えばウイルス送達ベクター）又は粒子を細胞に接触させることを介し、有利には特定の実施形態において送達ベクター（ウイルス送達ベクター）又は粒子はＨＤＲ鋳型もまた提供し、又は別の粒子又はベクターがＨＤＲ鋳型を提供し、及び病態は、標的配列の操作による治療又は阻害の影響を受け易い。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ複合体の特定のＲＮＡもまた知られており、ｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）と称される。有利な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ複合体のＲＮＡはｓｇＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、細胞又は細胞集団中の１つ又は複数の遺伝子座を標的化するようにエンジニアリングされている。有利には真核細胞及び特に哺乳類細胞、例えばヒト細胞（例えば、眼細胞、血管細胞、蝸牛細胞（ｃｏｃｈｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）等）にコドンが最適化されたＣａｓ９タンパク質、及び細胞中の１つ又は複数の遺伝子座、例えば遺伝子ＲＨＯ、ＡＴＯＨ１、ＶＥＧＦＡを標的化するｓｇＲＮＡが調製されており、本明細書で例示する。これらは、有利には、ウイルス送達（ＡＡＶ）によって送達された。粒子による送達の場合、その粒子はＣａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとを混合することにより形成される。ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質混合物は、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか又はそれらから本質的になるか又はそれらからなる混合物と混合され、それによりｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含有する粒子が形成される。本発明は、粒子をそのように作製すること及びかかる方法からの粒子並びにその使用を包含する。より一般的には、粒子は効率的なプロセスを用いて形成された。第一に、Ｃａｓ９タンパク質と遺伝子又は対照遺伝子ＬａｃＺを標的化するｓｇＲＮＡとを、有利には滅菌ヌクレアーゼフリー緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中に好適な、例えば３：１〜１：３又は２：１〜１：２又は１：１のモル比で、好適な温度、例えば１５〜３０℃、例えば２０〜２５℃、例えば室温で、好適な時間、例えば１５〜４５、例えば３０分間にわたり共に混合する。別途、界面活性剤、例えば、カチオン性脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ、及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなどの、又はそれらを含む粒子構成成分を、アルコール、有利にはＣ１〜６アルキルアルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解した。これらの２つの溶液を共に混合して、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子を形成する。特定の実施形態において、粒子はＨＤＲ鋳型を含有し得る。これは、ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質含有粒子と共投与される粒子であってもよく、又は即ち、細胞又は細胞集団をｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質含有粒子と接触させることに加え、細胞又は細胞集団を、ＨＤＲ鋳型を含有する粒子と接触させるか；又はＨＳＣが、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９及びＨＤＲ鋳型の全てを含有する粒子と接触する。ＨＤＲ鋳型は別個のベクターによって投与されてもよく、それにより第１の例では粒子がＨＳＣ細胞に侵入し、及び別個のベクターもまたその細胞に侵入し、ここでＨＳＣゲノムはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９によって改変され、及びＨＤＲ鋳型もまた存在し、それによりゲノム遺伝子座がＨＤＲによって改変される；例えばこれにより突然変異の修正がもたらされ得る。本明細書の考察における粒子は、有利には、１つ以上のｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との混合物（任意選択で１つ以上のＨＤＲ鋳型を含有するか、又は１つ以上の鋳型に関する別個の粒子が所望される場合に１つ以上のＨＤＲ鋳型のみを含有するかかる混合物）を、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか又はそれらから本質的になるか又はそれらからなる混合物と混合することにより得られるか、又は得ることができる（ここでは１つ以上のｓｇＲＮＡが、異常タンパク質発現（ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する１つ又は複数の遺伝子座を標的化する）。
一態様において、本発明は、真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法を提供し、この方法は、
（Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］、
又は
（Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
（ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
を含むポリヌクレオチド、
ＩＩ．Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列、
［転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む。
特定の好ましい実施形態において、Ｃａｓ９はＳａＣａｓ９である。
一態様において、本発明は、真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法を提供し、この方法は、組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含み、組成物は、
（Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
（ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、及び
ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９（好ましくはＳａＣａｓ９）をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
又は
（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．Ｃａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、
［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む。
一態様において、本発明は、真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態又は疾患を治療又は阻害する方法を提供し、この方法は、標的配列の操作によって対象又は非ヒト対象を改変するステップを含む、それを必要としている対象又は非ヒト対象における標的配列中の前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含み、及び病態又は疾患が、
組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含む、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む治療を提供するステップを含む標的配列の操作による治療又は阻害の影響を受け易く、標的配列は発現時に組成物によって操作され、組成物は、
（Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
（ａ）真核細胞における標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、及び
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９、好ましくはＳａＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
［（Ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列（ａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
又は
（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．Ｃａｓ９、好ましくはＳａＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、
［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む。
特定の実施形態において、本発明は、本発明の方法のいずれかにおいて使用されるＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを調製する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶ又はレンチウイルスをコードする１つ以上の核酸分子を含有するか、又はそれから本質的になる１つ以上のプラスミドをＡＡＶ感染又はレンチウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップ、及びＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ及び／又はヘルパー核酸分子を供給するステップを含む。
一態様において、本発明は、本発明の方法のいずれか（例えば、真核生物又は非ヒト生物における遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法）であって、前記遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法で使用される組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、治療用途を含めた、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集における組成物の使用を提供する。
一態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集用薬剤、又は疾患に関連するゲノム遺伝子座の標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法において使用されるか、又は真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態又は疾患（ｄｉｅｓｅａｓｅ）を治療又は阻害する方法において使用される薬剤の製造において使用される組成物を提供する。
一態様において、本発明は、
（Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９、好ましくはＳａ Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］、
又は
（Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
を含むポリヌクレオチド、
ＩＩ．Ｃａｓ９、好ましくはＳａＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列、
［転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＳａＣａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］を含む組成物であって；
医薬又は治療において使用されるか；又は疾患又は障害に関連するゲノム遺伝子座の標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法において使用されるか；又は真核生物又は非ヒト生物における疾患に関連する遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態を治療又は阻害する方法において使用されるか；又はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集において使用される組成物を提供する。
一態様において、本発明は、真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態又は疾患を治療又は阻害するための治療的ゲノム編集方法を提供し、この方法は、標的配列の操作によって対象又は非ヒト対象を改変するステップを含む、それを必要としている対象又は非ヒト対象における標的配列中の前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含み、及び病態又は疾患は、
組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含む、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む治療を提供するステップを含む標的配列の操作による治療又は阻害の影響を受け易く、標的配列は発現時に組成物によって操作され、組成物は、
（Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、
（ａ）真核細胞における標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、及び
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９、好ましくはＳａＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列（ａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
又は
（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＳａＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント
［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒにハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む。
一態様において、本発明は、かかる治療を必要としている対象における遺伝性疾患の個別化又は個人化された治療方法を提供し、この方法は、
（ａ）組織、臓器、細胞又は哺乳動物の１つ以上の細胞に本明細書で考察するとおりのベクターを送達するステップを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで、１つ以上のＣａｓ９発現真核細胞（好ましくはＳａ Ｃａｓ９）を含む組織、臓器又は細胞株において、又はｉｎ ｖｉｖｏで、Ｃａｓ９を発現する細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、複数の突然変異を導入するステップであって、特定の突然変異又は正確な配列置換が遺伝性疾患と関係付けられるか、又は関係付けられている、ステップ；
（ｂ）ベクターが送達された、遺伝性疾患に関係付けられる特定の突然変異又は正確な配列置換を有する細胞に対して、遺伝性疾患の１つ以上の治療を試験するステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の１つ以上の治療の試験結果に基づき対象を治療するステップを含む。
本発明の前述の態様及び実施形態のいずれかの特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ＤＪ又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。
標的が突然変異又は疾患状態に関連することに関する本明細書の考察において、かかる突然変異又は疾患状態は、例えば、神経疾患；眼疾患（例えば、網膜疾患、例えば、網膜色素変性症；色覚異常（ａｃｈｒｏｍｔａｏｐｓｉａ）；加齢性黄斑変性症；視力障害）、聴覚疾患（例えば、蝸牛細胞関連疾患、聴覚障害、難聴）等であり得る。
従って、本発明の目的は、本発明の範囲内に、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法を含めないことであり、本出願人らは、あらゆる既知の製品、プロセス、又は方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条の第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣの第８３項）の記述及び実施可能要件を満たさない、あらゆる製品、プロセス、又はこのような製品の製造、又はこのような製品を使用する方法が本発明の範囲内に含まれないものとし、本出願人らは、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示することにさらに留意されたい。
本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、米国特許法による意味を有し得；例えば、これらの語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し；そして「〜本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「〜本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの語が、米国特許法による意味を有し、例えば、明確に述べられていない要素は許容されるが、従来技術に見られる要素又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素は排除されることに留意されたい。本発明の実施において、条項５３（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣを順守することが有利であろう。本明細書において、誓約は存在しない。
これら及び他の実施形態が、開示される、又は以下の詳細な説明から明らかになり、かつこの説明に包含される。
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の原理が利用された例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面から、本発明の特徴及び利点をより良く理解できるであろう。
図１Ａ〜図１Ｈは、マウス脳におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系送達及びＭｅｃｐ２遺伝子座の標的化を示す。（ａ）ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９及びＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅ（Ｍｅｃｐ２）発現ベクター。ｓｇＲＮＡベクターは、形質導入ニューロンを同定するためのＧＦＰ−ＫＡＳＨ融合タンパク質のコード配列を含む。（ｂ）マウス海馬の背側歯状回（ＤＧ）におけるＨＡ−Ｃａｓ９及びＧＦＰ−ＫＡＳＨの発現。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）デュアルベクターＣａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ系によって効率的に標的化される細胞の定量化。（ｄ）Ｃａｓ９標的位置を示すマウスＭｅｃｐ２遺伝子座の図解表示；ｓｇＲＮＡは青色で示される。ＰＡＭ配列は紫色で示される。Ｍｅｃｐ２遺伝子座のシーケンシングによって検出される代表的な突然変異パターンを下に示した：緑色−野生型配列；赤色ダッシュ記号−欠失した塩基；赤色の塩基：挿入又は突然変異；赤色の三角矢印はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９切断部位を示す。（ｅ）ＤＧ領域へのＡＡＶ送達後２週間のＭｅｃｐ２遺伝子座の改変を示すＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイゲル。（ｆ）標的化した脳領域におけるＭｅＣＰ２タンパク質発現のウエスタンブロット分析及び背側ＤＧにおけるＭｅＣＰ２タンパク質レベルの定量化（ｔ検定、＊＊ｐ＜０．００１、３匹の動物からのｎ＝４、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。（ｇ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＭｅｃｐ２遺伝子座の標的化後２週間の背側ＤＧ領域の画像。スケールバー、１５０μｍ。（ｈ）標的化した脳領域において検出された全ての細胞中にあるＭｅＣＰ２陽性細胞集団（ＤＡＰＩ染色）の、対照側副部位と比較した定量化（ｔ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２匹の動物からのそれぞれｎ＝２９０及び２４９細胞；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ＩＴＲ−逆方向末端反復配列；ＨＡ−ヘマグルチニンタグ；ＮＬＳ−核局在化シグナル；ｓｐＡ−合成ポリアデニル化シグナル；Ｕ６−ＰｏｌＩＩＩプロモーター；ｓｇＲＮＡ−シングルガイドＲＮＡ；ｈＳｙｎ−ヒトシナプシン１プロモーター；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；ＫＡＳＨ−Ｋｌａｒｓｉｃｈｔ、ＡＮＣ１、Ｓｙｎｅ相同性核膜貫通ドメイン；ｂＧＨ ｐＡ−ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏ ｓｉｇｎａｌ）；ＷＰＲＥ−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）。 図２Ａ〜図２Ｂは、Ｃａｓ９媒介性ＭｅＣＰ２ノックダウンニューロンにおける遺伝子発現の解析を示す。（ａ）マウス脳からのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的細胞の細胞核精製戦略。（ｂ）ＲＮＡｓｅｑによって検出された差次的発現遺伝子の階層クラスタリング（ｔ検定、ｐ＜０．０１、８匹の動物からの選別した核のｎ＝１９集団）。行毎に遺伝子の相対ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）発現レベルを正規化し、赤色−青色カラースケールで表示する。各列が、指示するとおり、対照動物又はＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡ形質導入動物のいずれかに由来する単離歯状回細胞集団からＦＡＣＳ選別した１００個の標的神経核の集団を表す。 図３Ａ〜図３Ｅは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＭｅＣＰ２ノックダウン後のニューロンの細胞応答特性における細胞自律的欠陥を示す。（ａ）マウス視覚野からの生体内実験構成及び視覚刺激パラメータを示す略画。ＧＦＰ＋ニューロンを示す。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）対側眼及び同側眼の両方に特異的な入力を受け取る第２／３層興奮性ニューロンにおける記録構成を示す略画。ゲノム改変ＧＦＰ＋細胞は緑色であり、一方、非改変細胞は灰色である。正規化したスパイク形状は、規則的にスパイク発火する興奮性ニューロンを示す。（ｃ、ｄ）それぞれＭｅｃｐ２及び対照ｓｇＲＮＡを発現するＧＦＰ＋細胞から平均ＯＳＩ（ｃ）及び誘発ＦＲ（ｄ）を測定した（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５；グラフ中の数字は記録された細胞の数を示す；ｎ＝２〜３匹の動物；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。 図４Ａ〜図４Ｆは、マウス脳における同時多重遺伝子編集を示す。（ａ）多重ゲノム標的化用に設計されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の概略図。（ｂ）標的ＤＮＭＴマウス遺伝子座の図解表示。ガイドＲＮＡを青色で示す。ＰＡＭ配列を紫色で示す。（ｃ）ＤＧ領域へのＡＡＶ送達後４週間の、ＦＡＣＳ選別したＧＦＰ−ＫＡＳＨ陽性細胞におけるＤＮＭＴ遺伝子座の改変を示すＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイゲル。（ｄ）単一細胞におけるＤＮＭＴ遺伝子座改変のディープシーケンシングベースの解析であって、複数の遺伝子座に改変が同時に起こることを示す。（ｅ）ＤＮＭＴファミリー遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系をｉｎ ｖｉｖｏ送達した後のＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１タンパク質のウエスタンブロット分析（上）。ｉｎ ｖｉｖｏＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的化後のＤＧにおけるＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１タンパク質レベルのウエスタンブロット定量化（下；ｔ検定、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、Ｄｎｍｔ３ａ：ｎ＝７；Ｄｎｍｔ１：５匹の動物からのｎ＝５；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ｆ）訓練文脈及び文脈変化で試験した、海馬のＤＧ領域でＳｐＣａｓ９を使用してＤＮＭＴ遺伝子を標的化した８週間後の文脈学習障害（ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝１８匹の動物、２つの独立した実験；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。 図５Ａ〜図５Ｆは、ＡＡＶパッケージングのためのＨＡタグ標識ＳｐＣａｓ９（ＨＡ−ＳｐＣａｓ９）のクローニング及び発現を示す。（ａ）短鎖ラットＭａｐ１ｂプロモーター（ｐＭａｐ１ｂ）、トランケート型のマウスＭｅｃｐ２プロモーター（ｐＭｅｃｐ２）及び短鎖ポリＡモチーフ（ｓｐＡ）を使用してＳｐＣａｓ９発現カセットサイズを最小限に抑える種々のクローニング戦略の概略図。（ｂ）種々のＳｐＣａｓ９発現カセットを使用してＨＡ−ＳｐＣａｓ９を発現する初代皮質ニューロン培養物のウエスタンブロット分析。（ｃ）Ｍｅｃｐ２プロモーターはＨＡ−ＳｐＣａｓ９（赤色）発現をニューロンでは駆動するが（Ｍａｐ１ｂ、ＮｅｕＮ；矢印）、しかしアストログリアでは駆動しない（ＧＦＡＰ、三角矢印）。ＨＡ−ＳｐＣａｓ９とＧＦＰ−ＫＡＳＨとの同時発現が示される（下）。核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。スケールバー、２０μｍ。（ｄ）ＧＦＰ標識の概略図。核膜貫通ＫＡＳＨドメインに融合した高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び核外膜へのＧＦＰ−ＫＡＳＨの組込みが示される。（ｅ）ＨＡ−ＳｐＣａｓ９とＧＦＰ−ＫＡＳＨとの両方を発現する細胞の集団を示す重感染効率計算（３つの培養物からのｎ＝９７３ニューロン；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ｆ）ウイルス送達７日後に細胞をＬＩＦＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）キットで染色した。ＤＡＰＩ＋及び死滅（ＤＥＡＤ＋）細胞の定量化（対照 ｎ＝５１８個のＤＡＰＩ＋核；ＳｐＣａｓ９／ＧＦＰ−ＫＡＳＨ ２つの培養物からのｎ＝１００３個のＤＡＰＩ＋核；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ＩＴＲ−逆方向末端反復配列；ＨＡ−ヘマグルチニンタグ；ＮＬＳ−核局在化シグナル；ｓｐＡ−合成ポリアデニル化シグナル；Ｕ６−ＰｏｌＩＩＩプロモーター；ｓｇＲＮＡ−シングルガイドＲＮＡ；ｈＳｙｎ−ヒトシナプシン１プロモーター；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；ＫＡＳＨ−Ｋｌａｒｓｉｃｈｔ、ＡＮＣ１、Ｓｙｎｅ相同性 核膜貫通ドメイン；ｂＧＨ ｐＡ−ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ＷＰＲＥ−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）。 図６Ａ〜図６Ｂは、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞におけるＭｅｃｐ２の標的化を示す。（ａ）Ｍｅｃｐ２標的化配列及び対応するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）。（ｂ）Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞にＳｐＣａｓ９とコトランスフェクトした６つのＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡの評価。トランスフェクション後４８時間にＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイを用いて遺伝子座改変効率を分析した。 図７Ａ〜図７Ｄは、初代皮質ニューロンにおけるＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９によるＭｅｃｐ２の標的化を示す。（ａ）ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ形質導入７日後の培養ニューロンにおけるＭｅＣＰ２（赤色）の免疫蛍光染色（緑色、ＧＦＰ−ＫＡＳＨ）。核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）ＳｐＣａｓ９又はｄＳｐＣａｓ９をＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡ又は対照（細菌ｌａｃＺ遺伝子を標的化する）ｓｇＲＮＡと共に使用したＭｅｃｐ２遺伝子座標的化に関するＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイゲルを用いた評価。（ｃ）標的ニューロン集団中のＭｅＣＰ２陽性核の定量化（ＧＦＰ＋）。（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９によるＭｅｃｐ２遺伝子座の標的化後におけるＭｅＣＰ２タンパク質レベルのウエスタンブロット及びＭｅＣＰ２タンパク質レベルの定量化（ｔ検定、＊＊ｐ＜０．００１、３個の培養物からのｎ＝５、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。 図８Ａ〜図８Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳｐＣａｓ９媒介性ＭｅＣＰ２ノックダウン後のニューロンの樹状突起樹における形態学的変化を示す。（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９によるＭｅｃｐ２遺伝子座の標的化後のニューロンにおける樹状突起樹の複雑さの低下。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）ＳｐＣａｓ９及びＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡで標的化したニューロンにおける樹状突起棘形態の変化。スケールバー、１０μｍ。細胞の形態はｍＣｈｅｒｒｙ構築物とのコトランスフェクションで可視化した。形態分析用の細胞はＭｅｃｐ２染色の結果に基づき選択した。（ｃ）樹状末端の数で評価した樹状突起樹形態、及び（ｄ）Ｓｈｏｌｌ解析（ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１、２つの培養物からのｎ＝４０）。（ｅ）棘密度定量化（ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１、２つの培養物からのｎ＝４０、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。 図９は、対照動物及びＳｐＣａｓ９媒介性Ｍｅｃｐ２ノックダウンの神経核のＲＮＡｓｅｑを示す。発現レベルの分位点毎の全ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ（各々１００個の、対照ｓｇＲＮＡから取った核又はＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡを形質導入した核の１９個のライブラリ；ｎ＝４匹の動物／群）で検出された遺伝子の数を示す箱ひげ図。全ての遺伝子をその平均ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）発現レベルで１０分位に分け、次に各分位点について、試料毎に検出された（ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）＞２）遺伝子の数をカウントした。図示する３つの標的配列は、それぞれＤｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ｂについて、配列番号＿＿＿、配列番号＿＿＿及び配列番号＿＿＿である。 図１０Ａ〜図１０Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＭＴファミリーメンバーの多重ゲノム標的化を示す。（ａ）Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ｂ標的化配列及び対応するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）。（ｂ）Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ｂ遺伝子座を標的化するＳｐＣａｓ９及びＤＮＭＴ ３ｘｓｇＲＮＡベクターのトランスフェクション後４８時間におけるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼアッセイ分析。標的化された３つ全ての遺伝子の効率的なゲノム編集が示される。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、標的Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ｂ遺伝子座の次世代シーケンシングを示す。ＳｐＣａｓ９及びＤＮＭＴ ３ｘｓｇＲＮＡをマウス歯状回にｉｎ ｖｉｖｏ送達した後の突然変異Ｄｎｍｔ３ａ（ａ）、Ｄｎｍｔ１（ｂ）及びＤｎｍｔ３ｂ（ｃ）遺伝子座のシーケンシング結果の例。緑色：野生型配列、赤色ダッシュ記号：欠失した塩基、赤色の塩基：挿入又は突然変異。赤色の三角矢印はＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９切断部位を示す。この図に用いた完全配列は、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ｂ遺伝子座についてそれぞれ、配列番号 、配列番号 、及び配列番号 として提供される。これらは以下である：配列番号 （Ｄｎｍｔ３ａ）：ＣＣＴ ＣＣＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ Ａ、配列番号 （Ｄｎｍｔ１）：ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＣＧ及び配列番号 （Ｄｎｍｔ３ｂ）ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＣＧＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＧＡＧ Ｇ 図１２は、種々のプログラム可能なヌクレアーゼプラットフォームの比較を示す。 図１３Ａ〜図１３Ｃは、治療的ゲノム改変のタイプを示す。ゲノム編集療法の具体的なタイプは、疾患を引き起こす突然変異の性質に依存する。ａ、遺伝子破壊においては、ＮＨＥＪで遺伝子座を標的化することにより、タンパク質の病原性機能がサイレンシングされる。目的の遺伝子にインデルが形成されることにより、多くの場合にフレームシフト突然変異が生じて未成熟終止コドン及び非機能性タンパク質産物が作り出されるか、又は転写物のナンセンス変異依存分解が生じ、遺伝子機能が抑制される。ｂ、ＨＤＲ遺伝子修正を用いて有害な突然変異を修正することができる。外因的に提供される修正ＨＤＲ鋳型の存在下で突然変異部位の近傍においてＤＳＢが標的化される。外因性鋳型によるこの切断部位のＨＤＲ修復により、突然変異が修正され、遺伝子機能が回復する。ｃ、遺伝子修正の代替法は、遺伝子付加である。この治療法は、治療用トランス遺伝子をゲノム中のセーフハーバー遺伝子座に導入するものである。ＤＳＢはセーフハーバー遺伝子座に標的化され、切断部位との相同性を含むＨＤＲ鋳型、プロモーター及びトランス遺伝子が核に導入される。ＨＤＲ修復によってプロモーター−トランス遺伝子カセットがセーフハーバー遺伝子座にコピーされ、遺伝子機能が回復するが、但し遺伝子発現に対する真の生理的制御はない。 図１４は、ｅｘ ｖｉｖｏ対ｉｎ ｖｉｖｏ編集療法の概略図を示す。ｅｘ ｖｉｖｏ編集療法では、患者から細胞を取り出し、編集し、次に再移植する（上部パネル）。この治療法が成功するには、標的細胞が体外での生存能及び移植後の標的組織への帰巣能を有しなければならない。ｉｎ ｖｉｖｏ療法には、インサイチュでの細胞のゲノム編集が含まれる（下部パネル）。ｉｎ ｖｉｖｏ全身療法については、細胞のアイデンティティ又は状態に比較的依存しない送達剤を使用すれば、広範囲の組織型に編集を生じさせ得る。この編集治療方式は将来可能となり得るが、現在のところ、これを実現可能にするに足る効率的な送達系は存在しない。特定の器官系に向性を有する送達剤が患者に投与されるｉｎ ｖｉｖｏ標的療法は、臨床的に関連性のあるウイルスベクターを用いて実現可能である。 図１５は、眼の遺伝子療法に対するＳａＣａｓ９系を示す。 図１６は、Ｃａｓ９相同組換え（ＨＲ）ベクターによる遺伝子療法の概略図を示す。 図１７は、眼の遺伝子療法の例示的プロトコルを示す。 図１８Ａ〜図１８Ｂは、ヒトＲＨＯ遺伝子座（Ｐ２３Ｈ突然変異を示す対立遺伝子）を示す。図７Ａは、ＲＨＯ遺伝子座に対するガイド設計を示す。図７Ｂは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏガイドスクリーニング結果を示す。 図１９は、ＲＨＯ ＨＲ ＡＡＶベクターを示す。 図２０Ａ〜図２０Ｂは、ＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３のガイド選択を示す。（ａ）は、ヒトＣＮＧＡ３遺伝子座（２つの疾患突然変異を示す対立遺伝子）及びガイド選択を示す。（ｂ）は、ヒトＣＮＧＢ３遺伝子座（疾患突然変異を示す対立遺伝子）及びガイド選択を示す。 図２１は、ＣＮＧＡ３ ＨＲ ＡＡＶベクターを示す。 図２２は、ＣＮＧＢ３ ＨＲ ＡＡＶベクターを示す。 図２３Ａ〜図２３Ｂは、ＶＥＧＦＡのガイド選択を示す。（ａ）は、ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子座（ｌｃｏｕｓ）（共通領域１）を示す；（ｂ）は、ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子座（ｌｃｏｕｓ）（共通領域２）を示す。 図２４は、ｄＣａｓ９ベースの後成的モジュレーション系の設計を示す（系の３つの構成成分、ｄＳａＣａｓ９、融合エフェクター、及びｓｇＲＮＡが示される）。 図２５Ａ〜図２５Ｃは、ＡＴＯＨ１に対するガイド選択を示す。（ａ）は、選択した２つの高度に（ｈｉｇｌｙ）接触し易い領域を示す；（ｂ）は高度に接触し易い領域１を示す−青色の線はガイド配列を示し、マゼンタ色の線はＰＡＭを示す；（ｃ）は高度に接触し易い領域２を示す−青色の線はガイド配列を示し、マゼンタ色の線はＰＡＭを示す。
本明細書の図面は、単に例示目的であり、必ずしも正確な縮尺で描かれているものではない。
全て本発明の実施に有用であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その構成成分、及びこのような構成成分の送達だけではなく、これらの方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ、並びに作製及び使用、さらにはこの量及び製剤についての一般情報についは、以下を参照されたい。米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、及び同第８，８９５，３０８；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２８７９３８ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２５６０４６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４８７０２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２７００ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６９９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６６４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２３４９７２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２２７７８７ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８９８９６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９１９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６８４３ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７９７７０ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）、及び米国特許出願公開第２０１４−０１７９００６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許出願第２７７１４６８号明細書（欧州特許第１３８１８５７０．７号明細書）、同第２７６４１０３号明細書（欧州特許第１３８２４２３２．６号明細書）、及び同第２７８４１６２号明細書（欧州特許第１４１７０３８３．５号明細書）；並びに国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、及び同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）。また、２０１３年１月３０日出願の米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；２０１３年３月１５日出願の同第６１／８０２，１７４号明細書；２０１３年３月２８日出願の同第６１／８０６，３７５号明細書；２０１３年４月２０日出願の同第６１／８１４，２６３号明細書；２０１３年５月６日出願の同第６１／８１９，８０３号明細書；及び２０１３年５月２８日出願の同第６１／８２８，１３０号明細書も参照されたい。また、２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照されたい。また、それぞれ２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、及び同第６１／８３５，９７３号明細書も参照されたい。さらに、２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日出願の同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日出願の同第６１／９６０，７７７号明細書、及び２０１３年１０月２８日出願の同第６１／９６１，９８０号明細書も参照されたい。なおさらに、それぞれ２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書；２０１４年１０月２８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書、及びそれぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書、及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日出願の同第６１／７５７，９７２号明細書及び２０１３年２月２５日出願の同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日出願の同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書、及び同第６１／８３５，９３１号明細書；共に２０１４年６月１１日出願の同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書；それぞれ２０１４年６月１０日出願の同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；それぞれ２０１４年２月１２日出願の同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日出願の同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日出願の同第６２／０３８，３５８号明細書；それぞれ２０１４年９月２５日出願の同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；並びに２０１４年１０月２７日出願の同第６２／０６９，２４３号明細書を参照されたい。また、２０１４年９月２５日出願の米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日出願の米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書；並びに２０１４年２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書を参照されたい。特に米国を指定国とする２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書を参照されたい。２０１４年１月２２日出願の米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書を参照されたい。それぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書、及び同第６１／９１５，２６７号明細書を参照されたい。２０１４年４月１５日出願の米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書を参照されたい。特に米国を指定国とする２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書を参照されたい。これらの特許、特許公報、及び特許出願のそれぞれ、並びにこれらの特許において又はこれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、並びにその出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、これらの特許において又は本明細書での参照により組み入れられるこれらの特許の任意の文献において述べられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照によりこれらの特許に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報、及び出願、並びに出願引用文献）は、それぞれの個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により組み入れられる。
また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報については、以下を参照されたい（同様に、参照により本明細書に組み入れられる）：
それぞれ参照により本明細書に組み入れられ、以下に簡単に説明される：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３；
Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９，
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ ５，２０１４）（Ｈｓｕ ２０１４），
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１，
Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ オンラインで公表 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６，及び
Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；オンラインで公表 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５．
Ｃｏｎｇらは、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方をベースとした真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングして、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、短鎖ＲＮＡによって誘導されて、ヒト細胞及びマウス細胞におけるＤＮＡの正確な切断を誘導できることを実証した。彼らの研究は、切断酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、変異原作用が最小限の真核細胞における相同組換え修復を容易にできることをさらに示した。加えて、彼らの研究は、複数のガイド配列を単一ＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができ、これにより哺乳動物ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位におけるいくつかの同時編集を可能にすることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術が容易にプログラム可能であること及びその広範な適用性を実証している。細胞においてＲＮＡを用いて配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムするこの能力は、ゲノム工学ツールの新たなクラスを定義した。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、哺乳動物細胞に移植可能である可能性が高く、哺乳動物ゲノム切断も媒介し得ることをさらに示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいくつかの態様をさらに改善して、その効率及び多用途性を高めることができることが企図され得る。
Ｊｉａｎｇらは、二重ＲＮＡと複合体を形成した、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。このアプローチは、標的ゲノム部位における二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９依存性切断に依存して、突然変異しなかった細胞を殺し、選択マーカー又はカウンター選択系の必要性を回避した。この研究は、編集鋳型が単一ヌクレオチド変化及び複数ヌクレオチド変化を有するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変更することによる二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性の再プログラミングを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡの同時の使用により多重突然変異誘発を可能にすることを示した。さらに、このアプローチが、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）においてリコンビニアリングと組み合わせて使用される場合、説明されるアプローチを用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、回収した６５％が突然変異を含んでいた。
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎらは、ＤＮＡ結合ドメインをベースとするＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及び転写アクチベーター様エフェクターの光学的及び化学的調節を可能にする用途の広いロバストな技術についての当該技術分野の要求に対処した。
微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、２０ｎｔのガイド配列により特定のゲノム遺伝子座を標的とし、このガイド配列は、ＤＮＡ標的に対する特定のミスマッチを許容することができ、これにより不所望の標的外の突然変異を促進する。これに対処するために、Ｒａｎらは、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異を対ガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するアプローチを説明した。ゲノム中の個々の切れ目は、高い忠実性で修復されるため、適切にオフセットされたガイドＲＮＡによる同時ニッキングが、二本鎖切断に必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数を増加させる。著者らは、対ニッキング（ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋｉｎｇ）を用いて、細胞株において標的外活性を１／５０〜１／１，５００に低下させて、標的上の切断有効性を犠牲にすることなく、マウス接合体における遺伝子ノックアウトを容易にできることを実証した。この多用途戦略は、高い特異性を必要とする多様なゲノム編集用途を可能にする。
Ｈｓｕらは、標的部位の選択を知らせて標的外の影響を回避するためにヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化特異性を特徴付けた。この研究は、２９３Ｔ細胞及び２９３ＦＴ細胞の１００を超える推定ゲノム標的外遺伝子座における７００を超えるガイドＲＮＡ変異体及びＳｐＣＡｓ９誘導性挿入欠失変異レベルを評価した。著者らは、ＳｐＣａｓ９が、配列依存的に異なる位置でのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチを許容し、ミスマッチの数、位置、及び分布の影響を受けることを報告した。著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介切断がＤＮＡメチル化による影響を受けないこと、並びにＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの量を、標的外の変更を最小限にするために増減できることをさらに示した。加えて、哺乳動物ゲノムエンジニアリングの用途を拡大するために、著者らは、標的配列の選択及び評価及び標的外分析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールを提供することを報告した。
Ｒａｎらは、哺乳動物細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同依存性修復（ＨＤＲ）によるＣａｓ９媒介ゲノム編集のための一連のツール、及び下流機能の研究のための改変細胞株の作製について説明した。標的外切断を最小限にするために、著者らは、対ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９ニッカーゼ突然変異を使用するダブルニッキング法についてさらに説明した。著者らによって提供されるプロトコルは、標的部位の選択、切断効率の評価、及び標的外の活性の分析についてのガイドラインを経験的に導き出した。この研究は、標的の設計から開始して、遺伝子改変を僅か１〜２週間で達成することができ、改変クローナル細胞系を２〜３週間以内に得ることができることを示した。
Ｓｈａｌｅｍらは、ゲノム規模で遺伝子機能を問い合わせる新たな方法について説明した。著者らの研究は、１８，０８０の遺伝子を標的とするゲノム規模ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーの６４，７５１のユニークなガイド配列を用いた送達により、ヒト細胞におけるネガティブ選択スクリーニング及びポジティブ選択スクリーニングの両方が可能になることを示した。第１に、著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリーを使用した、癌細胞及び多能性幹細胞において細胞の生存に必須の遺伝子の同定を示した。次に、黒色腫モデルにおいて、著者らは、その減少が、変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬であるベムラフェニブに対する耐性に影響を与える遺伝子をスクリーニングした。著者らの研究は、最高位の候補が、既に評価された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２、並びに新規にヒットしたＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１を含むことを示した。著者らは、同じ遺伝子を標的とする独立のガイドＲＮＡと高いヒット確認率との間の高いレベルの一貫性を観察し、従ってＣａｓ９を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることを実証した。
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕらは、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成した化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を２．５Åの解像度で報告した。この構造により、その界面で正に帯電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を収容する、標的認識ローブとヌクレアーゼローブからなる２ローブ構造が明らかになった。認識ローブは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの結合に必須であるが、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの相補鎖の切断に適切な位置にあり、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシ末端ドメインも含む。この高解像度構造及び付随する機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機構を明らかにし、従って新規な多用途ゲノム編集技術の合理的設計の道が開かれた。
Ｗｕらは、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が付加された化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイド結合部位をマッピングした。著者らは、試験された４種類のｓｇＲＮＡのそれぞれが、ｓｇＲＮＡの５−ヌクレオチドシード領域によって頻繁に特徴付けられる数十〜数千のゲノム部位とＮＧＧプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）との間のｄＣａｓ９を標的とすることを示した。クロマチン非アクセシビリティ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）により、マッチングシード配列を有するｄＣａｓ９の他の部位への結合が減少し；従って、標的外部位の７０％が遺伝子に関連する。著者らは、触媒活性Ｃａｓ９でトランスフェクトされたｍＥＳＣにおける２９５のｄＣａｓ９結合部位のターゲットシークエンシングにより、バックグラウンドレベルよりも高い突然変異部を１つしか同定されなかったことを示した。著者らは、シードマッチ（ｓｅｅｄ ｍａｔｃｈ）が結合をトリガーするが切断のために標的ＤＮＡとの広範な対合を必要とする、Ｃａｓ９の結合及び切断のための２状態モデルを提案した。
Ｈｓｕ ２０１４は、ヨーグルトからゲノム編集までのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を一般的に論じる総説であり、このゲノム編集には、２０１４年６月５日以前に出願された本出願の系統の出願の情報、データ、及び知見中にある細胞の遺伝子スクリーニングが含まれる。Ｈｓｕ ２０１４の一般的な教示は、特定のモデル、本明細書の動物に無関係である。
本発明又は出願の従来技術とは考えられないが、本発明の実施で考慮され得るＴｓａｉ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９−７７（２０１４）についても言及する。
加えて、ｓｇＲＮＡ・Ｃａｓ９タンパク質含有粒子を調製する方法であって、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（及び任意選択でＨＤＲ鋳型）を含む混合物を界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか又はそれらから本質的になるか又はそれらからなる混合物と混合するステップを含む方法；及びかかる方法からの粒子に関して、「ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」と題される同時出願のＰＣＴ出願＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿、代理人整理番号４７６２７．９９．２０６０及びＢＩ−２０１３／１０７（２０１４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書；２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，４４１号明細書；及び各々２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，１１８号明細書、同第６１／９１５，２１５号明細書及び同第６１／９１５，１４８号明細書の１つ以上又は全てからの優先権を主張する）（「粒子送達ＰＣＴ」）（参照により本明細書に組み入れられる）が言及される。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが、有利には滅菌ヌクレアーゼフリー緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中に、好適な、例えば３：１〜１：３又は２：１〜１：２又は１：１のモル比で、好適な温度、例えば１５〜３０℃、例えば２０〜２５℃、例えば室温で、好適な時間、例えば１５〜４５、例えば３０分間にわたり共に混合された。別途、界面活性剤、例えば、カチオン性脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ、及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなどの、又はそれらを含む粒子構成成分が、アルコール、有利にはＣ１〜６アルキルアルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解された。これらの２つの溶液が共に混合され、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子が形成された。従って、粒子として複合体全体を形成する前に、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と予め複合体に形成してもよい。細胞への核酸の送達を促進することが知られる種々のモル比の種々の構成成分（例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコレステロール）を伴い製剤が作製されてもよく、例えばＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比はＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ１０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ５、コレステロール５、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０であってもよい。従って当該出願は、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質と粒子を形成する構成成分とを混合するステップ；並びにかかる混合ステップからの粒子を包含する。本発明の態様は、粒子；例えば、本発明のようなｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む混合物と、例えば粒子送達ＰＣＴにあるような、粒子を形成する構成成分とを混合して粒子を形成することにより、例えば、粒子送達ＰＣＴと類似した方法を使用する粒子、及びかかる混合ステップからの粒子（又は、当然ながら、本発明にあるようなｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む他の粒子）を含み得る。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分が関係する配列標的化を伴う遺伝子発現の制御、例えばゲノム摂動又は遺伝子編集に用いられる系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。有利な実施形態において、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９、好ましくはＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。
本方法の利点は、このＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果生じる副次的効果を回避することである。これは、標的ＤＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ、エフェクターヌクレアーゼのような転写活性化因子、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａ９などのプログラム可能なヌクレアーゼに基づくゲノム編集技術の開発における最近の進歩により、真核細胞のゲノムを正確に変更する出願者らの能力は大幅に向上している。ゲノム編集によって病的過程のより正確な細胞及び動物モデルを作成することが容易となり、疾患に対する遺伝学の寄与を解明する出願者らの能力は既に広がっている。プログラム可能なヌクレアーゼの特に興味をかき立てる適用は、罹患組織及び細胞における遺伝子突然変異を直接修正して、従来の治療法に不応性の遺伝性疾患を治療する可能性である。出願者らは、本明細書において、プログラム可能なヌクレアーゼをベースとする治療法の開発に向けた現在の進捗並びに将来の見通しと課題の考察を提供する。
ヒトゲノムにおける約２５，０００個のアノテートされた遺伝子のうち、３，０００個を超える遺伝子の突然変異が既に疾患表現型と関係付けられており（ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ｇｅｎｅＭａｐ）、より疾患との関連性の高い遺伝的変異が驚くほど急速に明らかになりつつある。現在、シーケンシングのコストが急激に下落し、ヒトゲノムプロジェクトが完了し、且つ患者からのゲノムシーケンシングデータが指数関数的に増加しているため、ヒトの健康における遺伝学の役割が、標的治療法の研究、臨床医学及び開発の主要な焦点領域となっている［Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４７０，１８７−１９７（２０１１）］。疾患の遺伝学的基礎に関する出願者らの理解がこのように進歩したことにより、出願者らの疾患機序に関する理解は向上しており、注目は可能性のある治療ストラテジーに向いている。しかしながら、有効な治療仮説及び薬剤開発における強力な取り組みにも関わらず、強い遺伝的関与を有する疾患の治療に小分子を使用して成功した例は限られた数しかない［Ｔｈｏｅｎｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１０）］。従って、代替的な手法が必要とされている。疾患に罹患した細胞及び組織内で核酸を改変することが可能な新たに出現しつつある治療ストラテジーは、治療の非常に大きな可能性を秘めている。遺伝学が十分に定義されており、且つ多くの場合に安全で有効な治療選択肢が欠如していることが理由となって、浸透度の高い単一遺伝子疾患、例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血友病、及び特定の酵素欠損症などが、かかる治療の焦点となっている。
これまでに開発された最も強力な遺伝子治療ストラテジーの２つは、トランス遺伝子発現によって欠損遺伝子機能の補完が可能なウイルス遺伝子療法、及び標的ｍＲＮＡのノックダウンによる欠陥遺伝子の標的化した抑制を媒介するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２，３１６−３２８（２０１１）及びＶａｉｓｈｎａｗ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｌｅｎｃｅ １，１４（２０１０）にレビューされる）。ウイルス遺伝子療法は、罹患遺伝子の機能性コピーを造血幹細胞／前駆細胞のゲノムに半ランダムに組み込むことによる、ＳＣＩＤ及びヴィスコット・オールドリッチ症候群などの造血系を冒す単一遺伝子劣性遺伝疾患の治療への使用が成功している［Ｇａｓｐａｒ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３，９７ｒａ７９（２０１１），Ｈｏｗｅ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，３１４３−３１５０（２００８），Ａｉｕｔｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１，１２３３１５１（２０１３）］。ＲＮＡｉは、とりわけ癌、加齢性黄斑変性症及びＴＴＲアミロイドーシスに関わる遺伝子の機能を抑制するために用いられており、臨床試験で治療効果をもたらしている（ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、治験番号：ＮＣＴ００６８９０６５、ＮＣＴ０１９６１９２１及びＮＣＴ００２５９７５３。有望さ及び最近の成功にも関わらず、ウイルス遺伝子療法及びＲＮＡｉには、多数の疾患に対するその有用性を妨げる限界がある。例えば、ウイルス遺伝子療法は挿入突然変異誘発及びトランス遺伝子発現の調節異常を引き起こし得る［Ｈｏｗｅ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，３１４３−３１５０（２００８）］。或いは、ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を抑制し得るのみであり、従ってその利用はノックダウンが有益である標的に限られている。また、ＲＮＡｉは多くの場合に遺伝子発現を完全には抑制することができず、従って治療に遺伝子機能の完全な消失が必要な疾患に利益をもたらす可能性は低い。これらの限界を乗り越え得る大胆な代替法があるとすれば、それは、有害な突然変異の除去若しくは修正又は保護的突然変異の挿入をもたらす標的細胞のゲノムの正確な改変であろう。Ｃａｒｔｉｅｒ。
Ｗａｔｔｓ，「造血幹細胞発現と遺伝子療法（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １３（１０）：１１６４−１１７１．ｄｏｉ：１０．３１０９／１４６５３２４９．２０１１．６２０７４８（２０１１）（その引用文献と共に、全てが示されたものとして参照により本明細書に組み入れられる）は、血液学的病態、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを含めた免疫不全症、及びリソソーム蓄積症などの他の遺伝的障害、例えば、ＳＣＩＤ−Ｘ１、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ、βサラセミア、Ｘ連鎖ＣＧＤ、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、ファンコニー貧血、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、及び異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を含めた多くの障害に対する極めて魅力的な治療選択肢として、造血幹細胞（ＨＳＣ）遺伝子療法、例えばウイルス媒介性造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）遺伝子療法（ｔｈｅｒｅａｐｙ）を考察している。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，「造血幹細胞遺伝子療法の適用の広がり（Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：２６３−２６４（２０１３）（その引用文献と共に、全てが示されたものとして参照により本明細書に組み入れられる）は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）の欠損によって引き起こされ、神経脱髄が生じる遺伝性疾患であるリソソーム蓄積症の異染性白質ジストロフィー疾患（ＭＬＤ）患者由来のＨＳＣ／Ｐ細胞へのレンチウイルス媒介性遺伝子導入；及びヴィスコット・オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）患者（血液細胞系統における細胞骨格機能を調節する小ＧＴＰアーゼＣＤＣ４２のエフェクターであるＷＡＳタンパク質の欠陥を有し、従って反復感染を伴う免疫不全、自己免疫症状、並びに出血多量及び白血病及びリンパ腫のリスク増加をもたらす異常に小さい機能不全の血小板を伴う血小板減少症に罹患している患者）のＨＳＣへのレンチウイルス媒介性遺伝子導入を報告している。レンチウイルスの使用と対照的に、当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、ＭＬＤ（アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）の欠損）に関して、突然変異（アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）の欠損）を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、ＡＲＳＡのコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用してＨＳＣを修正することができる。レンチウイルスの使用と対照的に、当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、ＷＡＳに関して、突然変異（ＷＡＳタンパク質の欠損）を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、ＷＡＳタンパク質のコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用してＨＳＣを修正することができる；具体的には、ｓｇＲＮＡが、ＷＡＳ（欠損ＷＡＳタンパク質）を生じさせる突然変異を標的化することができ、及びＨＤＲが、適切なＷＡＳタンパク質発現のコーディングをもたらすことができる。
当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの免疫不全症病態に関してＨＳＣを修正することができ、これは、ＣＣＲ５を標的化してノックアウトするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系にＨＳＣを接触させることを含む。ＣＣＲ５を標的化してノックアウトするｓｇＲＮＡ（及び有利にはデュアルガイド手法、例えば、一対の異なるｓｇＲＮＡ；例えば、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ３４＋造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）において２つの臨床的に関連性のある遺伝子、Ｂ２Ｍ及びＣＣＲ５を標的化するｓｇＲＮＡ）及びＣａｓ９タンパク質をＨＳＣに導入することができる。これらの細胞は投与することができ；及び任意選択で処理／拡大することができる；例えば、Ｃａｒｔｉｅｒ。また、Ｋｉｅｍ，「ＨＩＶ疾患に対する造血幹細胞ベースの遺伝子療法（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＨＩＶ ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．Ｆｅｂ ３，２０１２；１０（２）：１３７−１４７（その引用文献と共に参照により本明細書に組み入れられる）；Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したヒト造血幹細胞及びエフェクター細胞における効率的な遺伝子アブレーション（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）」，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １５，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐ６４３−６５２，６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１４（その引用文献と共に参照により本明細書に組み入れられる）も参照のこと。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用してＨＩＶ／ＡＩＤＳと闘う別の手段として、Ｅｂｉｎａ，「ＨＩＶ−１組込みプロウイルスＤＮＡの編集によってＨＩＶ−１発現を抑制するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ＨＩＶ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｅｄｉｔｉｎｇ ＨＩＶ−１ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ）」 ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＲＥＰＯＲＴＳ ｜ ３：２５１０ ｜ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０２５１０（その引用文献と共に参照により本明細書に組み入れられる）も言及される。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１，６３６−６４６（２０１０）にレビューされる）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．＆Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１８４３−１８４６（２０１１）にレビューされる）、及びクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼＣａｓ９（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（２０１４）にレビューされる）などのプログラム可能なヌクレアーゼに基づくゲノム編集技術が、罹患細胞及び組織において治療的ゲノム編集を実現する可能性を開いている。出願者らは、本明細書において最近のレビューを提供する。
ゲノム編集技術
プログラム可能なヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に標的化したＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することにより、正確なゲノム編集を可能にする。続いてＤＳＢがＤＮＡ損傷のシグナルを送り、ＤＳＢ部位に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同依存性修復（ＨＤＲ）のいずれかのための内因性修復機構を動員してゲノム編集を媒介する。
現在まで、３つの主要なヌクレアーゼクラス、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、図１２、左側のパネル）［Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９３，１１５６−１１６０（１９９６）；Ｗｏｌｆｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２９，１８３−２１２（２０００）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，７６４（２００３）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１，１１６９−１１７５（２００２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ４，１６０９−１６１４（１９８５）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，７７８−７８５（２００７）］、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、図１中央のパネル）［Ｂｏｃｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，１５０９−１５１２（２００９）；Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，１５０１（２００９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６，７５７−７６１（２０１０）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１４３−１４８（２０１１）］、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９（図１、右側のパネル）［Ｂｏｌｏｔｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５１，２５５１−２５６１（２００５）；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５，１７０９−１７１２（２００７）；Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７−７１（２０１０）；Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２−６０７（２０１１）；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９，９２７５−９２８２（２０１１）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９，Ｅ２５７９−２５８６（２０１２）；Ｃｏｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）］が開発され、部位特異的ゲノム編集を可能にしている。これらの３種類のヌクレアーゼ系は、そのＤＮＡ認識様式に基づき２つのカテゴリーに大別することができる−ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して特異的ＤＮＡ結合を実現する一方、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡと直接塩基対形成する低分子ＲＮＡガイド分子を介して特定のＤＮＡ配列に標的化される（図１３）。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、配列に依存しないヌクレアーゼドメインＦｏｋＩにＤＮＡ結合ドメインが融合したものからなるキメラ酵素である［Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９３，１１５６−１１６０（１９９６）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６，７５７−７６１（２０１０）］。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの再標的化には、ＤＮＡ結合ドメインのタンパク質エンジニアリングが必要であり、これはＺＦＮにとって特に難題であり、ＴＡＬＥＮにとってもなお困難である［Ｉｓａｌａｎ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ９，３２−３４（２０１２）；Ｓｕｎ，Ｎ．＆Ｚｈａｏ，Ｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１０，１８１１−１８２１（２０１３）］。対照的に、Ｃａｓ９タンパク質は不変であり、付随するＲＮＡガイドのごく一部の配列を変更して新しいゲノム遺伝子座に容易に再標的化することができる。３つのヌクレアーゼは全て、広範囲のモデル生物及び哺乳類細胞において効率的なゲノム編集を実現することが実証されており、現在、産業界及び学術界の両方で、これらのツールを治療法として開発する試みが進められている［Ｔｅｂａｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７０，９０１−９１０（２０１４）；Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１０，２３５−２４０（２０１４）；Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７５，２１７−２２１（２０１１）；Ｙｉｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５５１−５５３（２０１４））］。
ＤＳＢが作製されると、その傷害が、細胞状態及び修復鋳型の存在に応じてＮＨＥＪ又はＨＤＲのいずれかによって修復され得る。ＮＨＥＪは、修復鋳型を必要としないプロセスで２つのＤＳＢ末端を直接つなぎ直すことにより傷害を修復し得る。ＮＨＥＪ媒介性ＤＳＢ修復は正確であり得るが、ヌクレアーゼ活性に起因してＮＨＥＪ機構による同じＤＳＢの修復が繰り返されると、最終的に切断部位にわたる小さい挿入又は欠失突然変異が形成される［Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１，１１６９−１１７５（２００２）］。遺伝子のコード配列に導入されるかかる挿入又は欠失（インデル）はフレームシフト突然変異を引き起こし、そのためナンセンス変異依存分解機構を介したｍＲＮＡ分解が生じて機能性遺伝子が枯渇するか、又は非機能性のトランケート型タンパク質が産生されることになり得る［Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．＆Ｋｕｌｏｚｉｋ，Ａ．Ｅ．Ｃｅｌｌ ９６，３０７−３１０（１９９９）］。従って、ＮＨＥＪを用いると、ＲＮＡｉと同様に遺伝子機能を抑制し得るが、しかしながらＮＨＥＪによってゲノムに永続的な共有結合修飾が導入されることにより、標的細胞において遺伝子発現が抑制され続ける。
比較して、ＨＤＲは、研究者が外来性ＤＮＡ鋳型を使用してＤＳＢ修復の結果を指定することを可能にする［Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，７６４（２００３）；Ｃｈｏｕｌｉｋａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５，１９６８−１９７３（１９９５）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２１，２８９−２９７（２００１）；Ｋｒｅｊｃｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０，５７９５−５８１８（２０１２）；Ｐｌｅｓｓｉｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３０，４５１−４６０（１９９２）；Ｒｏｕｅｔ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １４，８０９６−８１０６（１９９４）；Ｒｕｄｉｎ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２，５１９−５３４（１９８９）］。標的化されたＤＳＢが導入されると、ＨＤＲ機構が、切断部位と配列相同性を有する外因的に提供された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して、その鋳型ＤＮＡにコードされた任意の変化を組み込むプロセスでＤＮＡを合成し、このＤＮＡを用いてその傷害を修復し得る。例えば、ＨＤＲは、適切に設計された修復鋳型と共に使用して有害な突然変異を直接修正し、それにより遺伝子発現の生理的調節は維持しながらも遺伝子機能を回復し得る。
治療適用の考察
ゲノム編集療法における第一の考慮点は、配列特異的ヌクレアーゼの選択である。各ヌクレアーゼプラットフォームがそれに固有の一連の長所及び弱点を有し、治療の文脈上治療利益が最大となるように、その多くを均衡させなければならない（図１２）。
これまで、ヌクレアーゼによる２つの治療的編集手法、即ち遺伝子破壊及び遺伝子修正が、顕著な有望さを示している。遺伝子破壊は、ＮＨＥＪを刺激することによる遺伝エレメントにおける標的インデルの作成を含み、多くの場合に、患者にとって有益な機能喪失型突然変異をもたらす（図１３Ａ）。対照的に、遺伝子修正は、疾患を引き起こす突然変異をＨＤＲを用いて直接復帰させ、修正されたエレメントの生理的調節を維持しながら機能を回復させる（図１３Ｂ）。ＨＤＲはまた、ゲノムの定義付けられた「セーフハーバー」遺伝子座に治療用トランス遺伝子を挿入して欠損遺伝子機能を回復させるためにも用いられ得る（図１３Ｃ）。
特定の編集療法が有効となるには、標的細胞集団において疾患症状を逆転させるのに十分に高い改変レベルが達成されなければならない。この治療改変「閾値」は、治療後の編集された細胞の適応度及び症状を逆転させるのに必要な遺伝子産物の量によって決まる。
細胞適応度及び結果
適応度に関して、治療された細胞には、その編集されていない対応物と比べて編集により３つの結果が生じる可能性がある：適応度の増加、中間的な適応度、又は適応度の低下。適応度が増加する場合（例えばＳＣＩＤ−Ｘ１の治療において）、その編集されていない対応物と比べて改変造血前駆細胞が選択的に拡大する。ＳＣＩＤ−Ｘ１は、造血・リンパ球系列の正常な発達にその機能が必要とされるＩＬ２ＲＧ遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患である［Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ １３８，６１−８６（１９９４）；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｋ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１０）］。ＳＣＩＤ−Ｘ１のウイルス遺伝子療法を受けた患者による臨床試験、及びＳＣＩＤ−Ｘ１突然変異の自然修正の希少例では、修正された造血前駆細胞がこの発達阻止を解消し、その罹患対応物と比べて拡大することにより、治療法を媒介することができた［Ｂｏｕｓｓｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９７，２７４−２７８（２０００）；Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４６，１１８５−１１９３（２００２）；Ｇａｓｐａｒ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６４，２１８１−２１８７（２００４）］。この場合に、編集された細胞は選択的優位性を有し、編集された細胞が少数であったとしても、拡大を通じて増幅することができ、患者に治療利益をもたらす。対照的に、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）などの他の造血疾患の編集では、編集された造血前駆細胞の適応度に変化は生じず、治療改変閾値は増加し得る。ＣＧＤは、通常は病原体を死滅させる活性酸素種を生成するために好中球が使用する食細胞オキシダーゼタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる［Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．＆Ｔｈｒａｓｈｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｇｅｎｅ ５２５，１７４−１８１（２０１３）］。これらの遺伝子の機能不全は造血前駆細胞の適応度又は発達に影響を及ぼさず、成熟造血細胞型が感染と闘う能力のみに影響を及ぼすため、この疾患では編集された細胞の優先的な拡大がないものと思われる。実際、遺伝子療法試験において遺伝子が修正されたＣＧＤ細胞についての選択的優位性は観察されておらず、長期細胞生着が困難となっている［Ｍａｌｅｃｈ，Ｈ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９４，１２１３３−１２１３８（１９９７）；Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９，２０９２−２１０１（２０１１）］。従って、編集によって標的細胞に適応度の増加が生じる疾患と比べ、編集によって中間的な適応度優位性が生じるＣＧＤのような疾患の治療には、著しく高いレベルの編集が必要となり得る。癌細胞における腫瘍抑制遺伝子に対する回復機能の場合のように、編集によって適応度不利性が課せられる場合、改変細胞はその罹患対応物に打ち負かされ、編集率に比して治療利益が低くなり得る。この後者のクラスの疾患は、ゲノム編集療法による治療が特に困難であり得る。Ｘ連鎖性慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）は、食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性の欠如又は低下に起因する宿主防御の遺伝性障害である。当業者は、本開示及び当該技術分野における知識から、突然変異（食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性の欠如又は低下）を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼのコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用することが可能となる；具体的には、ｓｇＲＮＡが、ＣＧＤ（食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの欠損）を生じさせる突然変異を標的化することができ、及びＨＤＲが、適切な食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼ発現のコーディングをもたらすことができる。
細胞適応度に加え、疾患を治療するのに必要な遺伝子産物の量もまた、症状を逆転させるために達成されるべき治療的ゲノム編集の最低レベルに影響を与える。血友病Ｂは、遺伝子産物レベルの僅かな変化が臨床転帰の大きい変化をもたらし得る一つの疾患である。この疾患は、通常肝臓によって血中に分泌されるタンパク質である第ＩＸ因子（第ＩＸ因子は凝固カスケードの一構成成分として機能する）をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。血友病Ｂの臨床的重症度は第ＩＸ因子の活性量に関係する。重症疾患は正常活性の１％未満に関連付けられる一方、より軽症型の疾患は１％を超える第ＩＸ因子活性に関連付けられる［Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｋ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１０）；Ｌｏｆｑｖｉｓｔ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４１，３９５−４００（１９９７）］。これは、第ＩＸ因子発現を回復させることのできる編集療法をごく一部であっても肝細胞に対して行うことにより、臨床転帰に大きい影響が及び得ることを示唆している。生後間もなくＺＦＮを用いて血友病Ｂのマウスモデルを修正する試験では、疾患症状を逆転させるのに３〜７％の修正で十分であったことが実証されており、この仮説に対する前臨床エビデンスを提供している［Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７５，２１７−２２１（２０１１）］。
遺伝子産物レベルの僅かな変化が臨床転帰に影響を及ぼし得る障害、及び編集された細胞に適応度優位性がある疾患は、現在の技術を所与として高い奏効率を可能にするのに治療改変閾値が十分に低いため、ゲノム編集療法の理想的な標的である。
現在、これらの疾患を標的化することにより、前臨床レベル及び第Ｉ相臨床試験で編集療法の成功がもたらされている（下表参照）。編集細胞について中間的な適応度優位性の疾患、又は治療に多量の遺伝子産物が必要とされる疾患にこれらの有望な結果を拡大するには、ＤＳＢ修復経路操作及びヌクレアーゼ送達の改良が必要となる。下表は、治療モデルに対するゲノム編集の適用例を示す。
ある実施形態は、血友病Ｂ、ＳＣＩＤ（例えば、ＳＣＩＤ−Ｘ１、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）又は遺伝性チロシン血症突然変異を保因する造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）幹細胞を、血友病Ｂ、ＳＣＩＤ（例えば、ＳＣＩＤ−Ｘ１、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）又は遺伝性チロシン血症に関する目的のゲノム遺伝子座（例えば、Ｌｉ、Ｇｅｎｏｖｅｓｅ又はＹｉｎにあるもの）を標的化するｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質と接触させ；有利には、突然変異を修正するため好適なＨＤＲ鋳型と接触させるステップを包含する。
ＤＳＢ修復経路の効率
ＮＨＥＪ及びＨＤＲ ＤＳＢ修復活性は、細胞型及び細胞状態によって大きく異なる。ＮＨＥＪは細胞周期によっては高度に調節されず、全細胞型にわたって効率的であるため、接触可能な標的細胞集団における高レベルの遺伝子破壊が可能となる。対照的に、ＨＤＲは主としてＳ／Ｇ２期の間に働き、従って活発に分裂している細胞に制限され、正確なゲノム改変を必要とする治療は有糸分裂細胞に限定される［Ｃｉｃｃｉａ，Ａ．＆Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ４０，１７９−２０４（２０１０）；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ４７，４９７−５１０（２０１２）］。
ＨＤＲによる修正効率は、標的遺伝子座の後成的状態又は配列、又は使用する具体的な修復鋳型構成（一本鎖対二本鎖、長鎖対短鎖ホモロジーアーム）によって制御され得る［Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４６，１１８５−１１９３（２００２）；Ｇａｓｐａｒ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６４，２１８１−２１８７（２００４）；Ｂｅｕｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｇ３（２０１３）］。標的細胞におけるＮＨＥＪ及びＨＤＲ機構の相対活性もまた、これらの経路はＤＳＢの解消に関して競合し得るため、遺伝子修正効率に影響を及ぼし得る［Ｂｅｕｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，１９８２１−１９８２６（２００８）］。ＨＤＲはまた、ヌクレアーゼと修復鋳型との同時送達が必要であるため、ＮＨＥＪストラテジーでは見られない送達の課題ももたらす。実際にはこれらの制約が、これまでのところ、治療上関連性のある細胞型における低レベルのＨＤＲにつながっている。従って臨床解釈では、疾患の治療に主としてＮＨＥＪストラテジーが着目されており、しかしながら現在、血友病Ｂ及び遺伝性チロシン血症のマウスモデルについて概念実証の前臨床ＨＤＲ治療が報告されている［Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７５，２１７−２２１（２０１１）；Ｙｉｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５５１−５５３（２０１４）］。
細胞及び組織標的化
所与のゲノム編集適用はいずれも、タンパク質、小ＲＮＡ分子、及び／又は修復鋳型の組み合わせを含み得るため、小分子治療薬と比べてこれらの複数の部分の送達が実質的に難題となる。ゲノム編集ツールの送達に関しては、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの２つの主なストラテジーが開発されている。ｅｘ ｖｉｖｏ治療では、体から罹患細胞が取り出され、編集されて、次に患者に移植し戻される（図１４、上部パネル）。ｅｘ ｖｉｖｏ編集は、標的細胞集団が十分に定義付けられ、且つ細胞に送達される治療用分子の具体的な投薬量を特定することが可能であるという利点がある。ヌクレアーゼの量をタイトレートすることによりかかる突然変異は減少し得るため、後者の考慮点は、オフターゲット改変が懸念される場合に特に重要となり得る（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ｅｘ ｖｉｖｏ手法の別の利点は、研究及び遺伝子療法適用に培養下の細胞へのタンパク質及び核酸の効率的な送達系が開発されているため、典型的には高い編集率を実現し得ることである。
しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏ手法には、その適用を少数の疾患に限られたものとする２つの大きい欠点がある。第一に、標的細胞が体外での操作を生き残る能力を有しなければならない。脳などの多くの組織にとって、細胞を体外で培養することは、細胞が生存できないか、或いは生体内でのその機能に必要な特性を失うため、主要な課題である。従って、ｅｘ ｖｉｖｏ療法は概して、造血系など、ｅｘ ｖｉｖｏ培養及び操作に適している成体幹細胞集団を有する組織に限られている。第二に、培養細胞は多くの場合に患者への再導入時の生着が悪く、治療の有効性が低下する。しかしながら、生着は、移植前に宿主細胞を枯渇させるアブレーションコンディショニングレジメンによって増進することができ、これは臨床的には実現可能であるが、しかし患者に重大なリスクをもたらす［Ｂｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．＆Ａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１）］
ｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集は、編集系の送達をその天然組織中の細胞型に仕向けることを含む（図１４、下部パネル）。ｉｎ ｖｉｖｏ編集は、罹患細胞集団がｅｘ ｖｉｖｏ操作に適しない疾患の治療を可能にする。さらに、ヌクレアーゼをインサイチュで細胞に送達するため、複数の組織及び細胞型の治療が可能である。恐らくはこれらの特性により、ｉｎ ｖｉｖｏ治療はｅｘ ｖｉｖｏ療法と比べてより広範囲の疾患に適用可能である。
現在まで、ｉｎ ｖｉｖｏ編集は概して、定義付けられた組織特異的向性を有するウイルスベクターの使用によって実現されている。かかるベクターは、現在、カーゴ運搬能力及び向性の点で限界があり、この治療法は、肝臓、筋肉及び眼などの、臨床的に有用なベクターによる形質導入が効率的である器官系に限られたものとなっている［Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５，４４５−４５１（２０１４）；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｈ．＆Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １１ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ７６−８４（２００４）；Ｂｏｙｅ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，５０９−５１９（２０１３）］。
ｉｎ ｖｉｖｏ送達の主要な潜在的障壁は、治療に必要な大量のウイルスに応答して生じ得る免疫応答であり、しかしこの現象はゲノム編集に特有というわけではなく、他のウイルスベースの遺伝子療法にも見られる［Ｂｅｓｓｉｓ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １１ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ１０−１７（２００４）］。また、編集ヌクレアーゼそれ自体のペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に提示され、免疫応答を刺激する可能性もあるが、しかし前臨床レベルではこれが起こることを裏付けるエビデンスはほとんどない。この治療法の別の大きな難題は、予測が困難であり得るオフターゲット突然変異プロファイルをもたらすｉｎ ｖｉｖｏでの分布、ひいてはゲノム編集ヌクレアーゼの投薬量を制御することである。
ゲノム編集療法ストラテジーの成功例
ｅｘ ｖｉｖｏ編集療法
造血細胞の精製、培養及び移植に関する長年にわたる臨床的見解により、ＳＣＩＤ、ファンコニー貧血、ヴィスコット・オールドリッチ症候群及び鎌状赤血球貧血などの血液系を冒す疾患が、ｅｘ ｖｉｖｏ編集療法の主眼となってきた。造血細胞が主眼となる別の理由は、血液障害に対する遺伝子療法の設計を試みる先行する取り組みのおかげで、比較的高効率の送達系が既に存在することである。これらの利点にも関わらず、多くの場合に移植時の細胞生着効率が低いため、必然的にこの治療法は、編集細胞が適応度優位性を有し、従って少数の生着した編集細胞が拡大して疾患を治療することのできる疾患に適用されている。
ファンコニー貧血：少なくとも１５個の遺伝子（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１／ＢＲＣＡ２、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＪ／ＢＡＣＨ１／ＢＲＩＰ１、ＦＡＮＣＬ／ＰＨＦ９／ＰＯＧ、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＮＣＮ／ＰＡＬＢ２、ＦＡＮＣＯ／Ｒａｄ５１Ｃ、及びＦＡＮＣＰ／ＳＬＸ４／ＢＴＢＤ１２）の突然変異が、ファンコニー貧血を引き起こし得る。これらの遺伝子から産生されるタンパク質は、ＦＡ経路として知られる細胞プロセスに関与する。ＦＡ経路は、ＤＮＡ複製と呼ばれるＤＮＡの新規コピーの作製プロセスがＤＮＡ損傷に起因して遮断されたときにオンになる（活性化される）。ＦＡ経路は特定のタンパク質を損傷範囲に送り込み、それに誘発されてＤＮＡ修復が始まり、そのためＤＮＡ複製は続行することができる。ＦＡ経路は、鎖間架橋（ＩＣＬ）として知られる特定のタイプのＤＮＡ損傷に特に応答性を示す。ＩＣＬはＤＮＡの逆鎖上の２つのＤＮＡ構成要素（ヌクレオチド）が異常に結合又は連結して一体になるときに起こり、それによりＤＮＡ複製のプロセスが停止する。ＩＣＬは、体内で産生される毒性物質の蓄積によるか、又はある種の癌療法薬による治療によって引き起こされ得る。ファンコニー貧血に関連する８個のタンパク質が一つのグループにまとまって、ＦＡコア複合体として知られる複合体を形成する。ＦＡコア複合体は、ＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩと呼ばれる２つのタンパク質を活性化する。これらの２つのタンパク質が活性化すると、ＤＮＡ修復タンパク質がＩＣＬの範囲に運ばれ、そのようにして架橋が取り除かれ得るとともに、ＤＮＡ複製が続行し得る。ＦＡコア複合体。より詳細には、ＦＡコア複合体は、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＬ、及びＦＡＮＣＭからなる核多タンパク質複合体であり、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能し、ＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩで構成されるヘテロ二量体であるＩＤ複合体の活性化を媒介する。ＦＡコア複合体はモノユビキチン化されると、ＦＡＮＣＤ１／ＢＲＣＡ２、ＦＡＮＣＮ／ＰＡＬＢ２、ＦＡＮＣＪ／ＢＲＩＰ１、及びＦＡＮＣＯ／Ｒａｄ５１Ｃを含むＦＡ経路の下流の古典的腫瘍抑制因子と相互作用し、それにより相同組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ修復に寄与する。８０〜９０パーセントのＦＡ症例が、３つの遺伝子、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、及びＦＡＮＣＧのうちの１つの突然変異に起因する。これらの遺伝子は、ＦＡコア複合体の構成成分の産生に関する指示を与える。ＦＡコア複合体に関連するかかる遺伝子の突然変異は、複合体を非機能性にし、ＦＡ経路全体を破壊し得る。結果として、ＤＮＡ損傷は効率的に修復されず、時間が経つにつれＩＣＬが蓄積する。Ｇｅｉｓｅｌｈａｒｔ，「レビュー論文、ファンコニー貧血経路を通じたシグナル伝達の破壊は機能不全造血幹細胞バイオロジーをもたらす：根底にある機序と可能性のある治療ストラテジー（Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ，Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ Ｐａｔｈｗａｙ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」，Ａｎｅｍｉａ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１２（２０１２），Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２６５７９０，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１２／２６５７９０では、ＦＡ、及びｉｎ ｖｉｖｏでのＨＳＣの修正をもたらすＦＡＮＣＣ遺伝子をコードするレンチウイルスの大腿内注射を含む動物実験が考察された。この開示及び当該技術分野における知識から、ＦＡに関連する突然変異の１つ以上を標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系、例えば、ＦＡを生じさせるＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、又はＦＡＮＣＧの突然変異の１つ以上を標的化し、且つＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ又はＦＡＮＣＧの１つ以上の修正発現を提供するそれぞれ１つ以上のｓｇＲＮＡ及び１つ以上のＨＤＲ鋳型を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用することができる。
かかる一つの疾患はＨＩＶであり、ここでは感染がＣＤ４＋ Ｔ細胞に適応度不利性をもたらす。
ＨＩＶ治療に対するゲノム編集の理論的根拠は、ウイルスに対する細胞共受容体であるＣＣＲ５における機能喪失型突然変異に関してホモ接合の個体が、感染に対して極めて抵抗性が高く、及び他の形で健常であるという観察に由来し、ゲノム編集でこの突然変異を模倣すれば安全且つ有効な治療ストラテジーとなり得ることが示唆される［Ｌｉｕ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８６，３６７−３７７（１９９６）］。この着想は、ＨＩＶ感染患者が、機能喪失型ＣＣＲ５突然変異に関してホモ接合のドナーから同種骨髄移植を受けたとき、ＨＩＶの検出不能レベル及び正常なＣＤ４ Ｔ細胞数の回復が得られたことで、臨床的に検証された［Ｈｕｔｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６０，６９２−６９８（２００９）］。費用及び潜在的な移植片対宿主病が理由で、多くのＨＩＶ患者にとって骨髄移植は現実的な治療ストラテジーではないが、患者自身のＴ細胞を変えるＨＩＶ治療は現実的である。
ＨＩＶのヒト化マウスモデルでＺＦＮ及びＮＨＥＪを用いてＣＣＲ５をノックアウトする初期の研究では、ＣＣＲ５編集ＣＤ４ Ｔ細胞を移植するとウイルス負荷及びＣＤ４ Ｔ細胞数が改善することが示された［Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６，８０８−８１６（２００８）］。重要なことには、これらのモデルはまた、ＨＩＶ感染によってＣＣＲ５ヌル細胞の選択がもたらされることも示し、編集によって適応度優位性が付与されて少数の編集細胞で治療効果が生じ得る可能性が示唆された。
この及び他の有望な前臨床試験を受けて、現在、患者Ｔ細胞のＣＣＲ５をノックアウトするゲノム編集療法がヒトで試験されている［Ｈｏｌｔ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，８３９−８４７（２０１０）；Ｌｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１２５９−１２６９（２０１３）］。最近の第Ｉ相臨床試験では、ＨＩＶ患者由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞が取り出され、ＣＣＲ５遺伝子をノックアウトするように設計されたＺＦＮで編集され、及び自家移植で患者に戻された［Ｔｅｂａｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７０，９０１−９１０（２０１４）］。この試験の初期結果は、ＣＣＲ５遺伝子座のＺＦＮによるゲノム編集が安全であることを示唆しており、しかしながらフォローアップ時間が短いため、治療のリスク及び有効性を完全に理解するには至っていない。
近年、ｅｘ ｖｉｖｏ編集療法は、遺伝子修正ストラテジーを包含するように拡張されつつある。ｅｘ ｖｉｖｏでのＨＤＲの障壁は、Ｇｅｎｏｖｅｓｅ及び共同研究者らによる最近の論文で打開されており、この著者らはＳＣＩＤ−Ｘ１に罹患している患者から得た造血幹細胞（ＨＳＣ）における突然変異ＩＬ２ＲＧ遺伝子の遺伝子修正を実現した［Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１０，２３５−２４０（２０１４）］。Ｇｅｎｏｖｅｓｅ ｅｔ．ａｌ．は、集学的ストラテジーを用いてＨＳＣにおける遺伝子修正を達成した。第一に、ＩＬ２ＲＧの治療用ｃＤＮＡをコードするＨＤＲ鋳型を含有する組込み欠損レンチウイルスを使用して、ＨＳＣを形質導入した。形質導入後、ＩＬ２ＲＧにおける突然変異ホットスポットを標的化してＨＤＲベースの遺伝子修正を刺激するＺＦＮをコードするｍＲＮＡで細胞を電気穿孔処理した。ＨＤＲ率を増加させるため、ＨＳＣ分裂が促進されるように小分子で培養条件を最適化した。最適化された培養条件、ヌクレアーゼ及びＨＤＲ鋳型で、培養下に治療上有意味な速度でＳＣＩＤ−Ｘ１患者由来の遺伝子が修正されたＨＳＣが得られた。同じ遺伝子修正手順を受けた非罹患者由来のＨＳＣは、マウスにおいて、ＨＳＣ機能のゴールドスタンダードである長期造血を維持することができた。ＨＳＣはあらゆる造血細胞型を生じさせる能力を有し、自家移植することができるため、ＨＳＣはあらゆる造血遺伝的障害にとって極めて有用な細胞集団となる［Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．＆Ｓｈｉｚｕｒｕ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｏｏｄ １１２，３５４３−３５５３（２００８）］。遺伝子が修正されたＨＳＣは、原則的に広範囲の遺伝的血液障害の治療に用いることができ、この試験は治療的ゲノム編集の興奮に満ちたブレークスルーとなっている。
ｉｎ ｖｉｖｏ編集療法
ｉｎ ｖｉｖｏ編集療法はｅｘ ｖｉｖｏストラテジーと同様の課題に直面し、また効率的な送達系が少ないことによっても制限されている。標的遺伝子座の非効率な改変は、送達の非効率性によって悪化し、ロバストな送達プラットフォームを欠く組織をこの治療法で治療することは特に困難となっている。しかしながら、送達が効率的な器官系については、興奮するような前臨床治療の成功が既にいくつもある。
ｉｎ ｖｉｖｏ編集療法の最初の成功例は、血友病Ｂのマウスモデルで実証された［Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７５，２１７−２２１（２０１１）］。先述のとおり、血友病Ｂは、凝固カスケードの重要な構成成分である第ＩＸ因子をコードする遺伝子の機能喪失型突然変異によって引き起こされるＸ連鎖性劣性遺伝疾患である。第ＩＸ因子活性が重症罹患者においてそのレベルの１％を上回るまで回復すると、この疾患は顕著に軽症型に変わることができ、これは、かかる患者に組換え第ＩＸ因子を若年期から予防的に注入してかかるレベルを実現すると、概して臨床的合併症が改善されるとおりである［Ｌｏｆｑｖｉｓｔ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４１，３９５−４００（１９９７）］。従って、患者の臨床転帰を変化させるのに、低レベルのＨＤＲ遺伝子修正のみが必要となり得る。加えて、第ＩＸ因子は肝臓によって合成及び分泌されるが、肝臓は、編集系をコードするウイルスベクターによって効率的に形質導入することのできる臓器である。当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、血友病Ｂに関して、突然変異（第ＩＸ因子をコードする遺伝子の機能喪失型突然変異によって引き起こされるＸ連鎖性劣性遺伝疾患）を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、第ＩＸ因子のコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用してＨＳＣを修正することができる；具体的には、ｓｇＲＮＡが、血友病Ｂを生じさせる突然変異を標的化することができ、及びＨＤＲが、適切な第ＩＸ因子発現のコーディングをもたらすことができる。
ＺＦＮ及び修正ＨＤＲ鋳型をコードする肝向性のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型を使用して、マウス肝において突然変異ヒト化第ＩＸ因子遺伝子の最大７％の遺伝子修正が実現した［Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７５，２１７−２２１（２０１１）］。これにより、凝固カスケード機能の尺度である凝血塊形成動態が改善され、ｉｎ ｖｉｖｏ編集療法が実現可能であるのみならず、また有効でもあることが初めて実証された。
この試験を基に、最近になって他のグループがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による肝臓のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集を用いて遺伝性チロシン血症のマウスモデルの治療及び心血管疾患からの保護を提供する突然変異の作成に成功している。これらの２つの異なる適用は、肝機能不全が関わる障害に対するこの手法の多用途性を実証している［Ｙｉｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５５１−５５３（２０１４）；Ｄｉｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ １１５，４８８−４９２（２０１４）］。このストラテジーが広く適用可能であることを証明するには、他の器官系に対するｉｎ ｖｉｖｏ編集の適用が必要である。現在、この治療法で治療し得る障害の範囲を広げるため、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターの両方を最適化しようとする取り組みが進行中である［Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５，４４５−４５１（２０１４）；Ｙｉｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５，５４１−５５５（２０１４）］。
編集ヌクレアーゼの特異性
ゲノム編集ツールの特異性は、臨床適用に際しての主要な安全上の懸念の一つである。遺伝子改変は永続的であり、有害なオフターゲット突然変異は、発癌可能性及び他の望ましくない副作用のある細胞を作り出す可能性がある。さらに、オフターゲット編集によって生じる発癌性突然変異は編集された細胞の拡大をもたらし得るため、ひいては低いオフターゲット突然変異誘発レベルであっても深刻な帰結となり得る。
２つの問題、即ちオフターゲット効果の評価及び低減が、依然として未解決である。数々の研究によって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓ９ヌクレアーゼの標的化特異性の評価が試みられている。ＺＦＮ［Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ８，７６５−７７０（２０１１）；Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，８１６−８２３（２０１１）］及びＴＡＬＥＮ［Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １１，４２９−４３５（２０１４）］の特異性を特徴付ける限られた数の研究が、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮオフターゲット活性を検出するという課題を浮き彫りにしたに過ぎない。注目すべきことに、これらの２つの独立した研究は同じ一対のＣＣＲ５標的化ＺＦＮのオフターゲットプロファイルを特徴付けようと試みているが、別個の重複しないオフターゲット部位を報告しており、これはヌクレアーゼ特異性の分析に伴う課題を浮き彫りにしている。
多くの研究においてＣａｓ９の特異性を評価する試みが行われており、これは一部には、Ｃａｓ９のＲＮＡガイドによるＤＮＡ標的化機構が単純で、ワトソン・クリック塩基対合則に基づき可能なオフターゲット機構に関して仮説を立てることが著しく容易なためである。初期の細菌実験［Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９，９２７５−９２８２（２０１１）］、生化学的実験［Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９，Ｅ２５７９−２５８６（２０１２）］、及び哺乳類実験［Ｃｏｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３）］では、ガイド配列の３’側８〜１２ｂｐシード領域が一塩基ミスマッチに感受性を有し得ることが示唆されたが、さらなる研究では、この経験則が、特に高濃度のＣａｓ９及びガイドＲＮＡがある状況では、必ずしも正確でないことが示されている［Ｆｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２２−８２６（２０１３）；Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４，１３２−１４１（２０１４）；Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２７−８３２（２０１３）；Ｍａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８３３−８３８（２０１３）；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８３９−８４３（２０１３）］。これらの研究の多くは細胞株で行われたもので、オンターゲット配列と高い相同性レベルを有するゲノム部位におけるＣａｓ９媒介性突然変異誘発を調べており、当然ながら、高度の相同性を示す一部のオフターゲット部位がヌクレアーゼによって顕著に突然変異したことが分かった。しかしながら、これらの研究で評価された可能なオフターゲット部位の範囲は、計算的に予測された部位に限られていた。最近になって、Ｃａｓ９編集細胞株の全ゲノムシーケンシングにより、オフターゲット突然変異の発生率が低いことが明らかとなり、これは、Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集が特異的であり得ることを示唆している［Ｖｅｒｅｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ １５，２７−３０（２０１４）］。これらの研究にも関わらず、より高度な方法を用いたゲノムワイドなオフターゲティングの偏りのない評価、例えばＤＳＢの直接捕捉［Ｃｒｏｓｅｔｔｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０，３６１−３６５（２０１３）］及び潜在的にヌクレアーゼ処理によって課されるより大きい構造変動（即ち転位）を検出することのできる技術が、依然として差し迫って必要とされており、プログラム可能なヌクレアーゼによって課される真の突然変異誘発リスクを理解するため試みられなければならない。オフターゲット効果が細胞型特異的であり得ることは注目に値する；例えば調節異常ＤＳＢ修復経路を有する形質転換細胞株におけるオフターゲット効果は、初代健常細胞で観察され得るオフターゲット効果を過大評価し得る。
オフターゲット効果の頻度を減らすため、多くのグループによってＣａｓ９の標的化特異性が急速に改善されている。例えば、強制的ヘテロ二量体として機能する一本鎖ＤＮＡニッカーゼにＣａｓ９を形質転換すると、計算的に予測されたオフターゲット部位におけるオフターゲットインデル形成は劇的に減少する［Ｍａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８３３−８３８（２０１３）；Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，１３８０−１３８９（２０１３）］。加えて、触媒的に不活性なＣａｓ９とＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの間の融合に基づくガイドＲＮＡ並びにＲＮＡにガイドされるＦｏｋＩヌクレアーゼのトランケーションもまた、標的化特異性レベルの向上を実現することができる［Ｆｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，２７９−２８４（２０１４）；Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５７７−５８２（２０１４）；Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５６９−５７６（２０１４）］。治療適用に対し、それがいつであれ、これらの、及び今後の改良されたヌクレアーゼストラテジーが考えられる。
治療適用、例えばゲノム編集のためのＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ系及び組成物
一般に、本明細書全体におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ系に関する考察に加えて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書に記載される文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）で使用され、これらの系はまとめて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ］）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス−活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも呼ばれる）、又は本明細書で使用される語である「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ、又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核内又は細胞質内に位置する。一部の実施形態では、直接反復は、次の基準：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接したゲノム配列の２Ｋｂの枠内に見られる；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；３．２０〜５０ｂｐの間隔が空いている、のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で特定することができる。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ｔｒａｃｒ配列が、１つ以上のヘアピンを有し、かつ３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長であり：ガイド配列が、１０〜３０ヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素がＩＩ型Ｃａｓ９酵素であることが好ましいであろう。本発明の実施形態では、ガイド配列及びガイドＲＮＡという語は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と互換的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列されたときの、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約５０％を超える、約６０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列を整列させるための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定することができ、このような適切なアルゴリズムの非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づいたアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、若しくはそれ以上、又は約５を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２１を超える、約２２を超える、約２３を超える、約２４を超える、約２５を超える、約２６を超える、約２７を超える、約２８を超える、約２９を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約７５を超える、若しくはそれ以上のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１２未満、又はそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列に対する配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験するべきガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に導入し、続いて、標的配列内の優先的切断の評価を、例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験するべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分を用意し、そして標的配列における結合又は切断率を試験配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって試験管で評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者であれば想到するであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列として、標的ゲノム中のユニークな配列が挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと見なす際に考慮する必要がない。一部の実施形態では、ガイド配列は、このガイド配列内の二次構造の程度を低下させるように選択される。一部の実施形態では、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約１％、若しくはそれより未満、又は約７５％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、若しくはそれ未満が、最適に折り畳まれるときの自己相補的塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出に基づいている。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）によって説明されている。折り畳みアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズム（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照）を用いて、ウィーン大学の理論化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである。
一般に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に隣接したガイド配列の切除；及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列での形成、の１つ以上を促進する、ｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列とｔｒａｃｒ配列の短い方の長さに沿った、これらの配列の最適なアラインメントについてである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、かつ二次構造、例えば、ｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列のいずれかの中の自己相補性をさらに考慮することができる。一部の実施形態では、最適に整列されたときのｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の短い方の長さに沿ったこれらの配列間の相補性の程度は、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約２５％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、若しくはそれを超える、又は約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約４０を超える、約５０を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、これらの配列間のハイブリダイゼーションが、二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を形成するように、単一転写物内に含まれる。本発明の一実施形態では、転写物又は転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つ、又は５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最多で５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、ループの上流の最後の「Ｎ」の５’側の配列の部分がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分がｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下の通りであり（５’から３’に記載）、配列中の「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の第１のブロックはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を表し、小文字の第２のブロックはｔｒａｃｒ配列を表し、かつ最終ポリＴ配列は転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴＴＴＴ．
一部の実施形態では、配列（１）〜（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、配列（４）〜（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む転写物とは別個の転写物である。
一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって後に予測することができる：１．反復を誘導する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における推定Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。
一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を含み得る。
毒性及び標的外の影響を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要である。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞又は非ヒト真核動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、そしてディープシークエンシングを用いて潜在的な標的外ゲノム遺伝子座における変更の程度を分析することによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子における５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合は、ディープシークエンシングを使用して、次の２つの標的外遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における変更のレベルを評価することができる。標的外の変更のレベルを最低にすると共に標的上の変更を最高レベルにする濃度を、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために選択するべきである。別法では、毒性及び標的外の影響のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対で送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。毒性及び標的外の影響を最小限にするガイド配列及び戦略は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と同様とすることができる。
ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系から有利に送達される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。
一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、又はそれ未満である場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が、ゼロ、又は非突然変異型と比較してごく僅かであるときであり得る。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する一部又は全ての残基において生じさせることができる（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、以下の突然変異の一部又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；また置換アミノ酸のいずれかの保存的な置換も企図される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの突然変異の同じ（又は保存的な）置換も好ましい。ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０が特に好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基も好ましい。例えばＳａ Ｃａｓ９において、Ｎ５８０、例えば、Ｎ５８０Ａでの突然変異が有利である。ＳｐＣａｓ９のオーソログを、本発明の実施に使用することができる。Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指し得るため、同定されたＣａｓ９であり得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はｓａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）からであるか、又はこれらに由来する。ＳｔＣａｓ９”は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの野生型Ｃａｓ９を指し、このタンパク質配列は、アクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに存在する。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又はｓｐＣａｓ９も、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として収蔵されている。由来とは、本発明者らにおいては、由来酵素は、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で大いに野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載される任意の方法で突然変異している（修飾されている）ことを意味する。Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのより多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０のヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位の配列において二本鎖の切断を果たし、この標的配列は、その２０のヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例として、本明細書に記載されるように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭが挙げられる）を有する。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断についてのＣａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、このガイド配列に部分的にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列、及びＰＡＭ配列によって決定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様は、Ｋａｒｇｉｎｏｖ及びＨａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載されている。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１の４つの遺伝子のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び短い長さの非反復配列（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）が間に挿入された反復配列（直接反復）の特徴的なアレイを含む。この系では、標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、４つの連続ステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでこのハイブリダイズしたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成によってプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内にＤＳＢを生じさせる。２つの直接反復（ＤＲ）に隣接した単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイもまた、「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」という語に包含される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、構成的に存在し得る、又は誘導的に存在し得る、又は条件付きで存在し得る、又は投与され得る、又は送達され得る。Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。そしてＣａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。
コドン最適化配列の一例は、この場合には、真核生物、例えば、ヒトでの発現が最適化された配列（即ち、ヒトでの発現が最適化されている）、又は本明細書に記載の別の真核生物、動物、又は哺乳動物での発現が最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例も可能であり、かつヒト以外の他の宿主種のコドン最適化、又は特定の生物のコドン最適化も知られていることを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されるものではないがヒトを含む哺乳動物、又は非ヒト真核生物、動物、又は本明細書に記載の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物若しくは霊長類であっても良いし、これらに由来するものでも良い。一部の実施形態では、ヒト又は動物に実質的な医学的利点が全くない、ヒト又は動物を苦しめる可能性の高い、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除することができる。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換える一方で、天然アミノ酸配列を維持することにより目的の宿主細胞での発現の促進のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対する特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手できる「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における０又は少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における０又は１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合は、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。
本発明の態様は、遺伝子産物の発現の減少、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は遺伝子産物の発現の増加に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対のみが、検出可能な挿入欠失の発生を媒介することができた。重要なことに、これらのアッセイに使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対を形成したときに挿入欠失を効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置が、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメーターであることを示唆する。Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡがＤＮＡの逆鎖に切れ目を入れるため、所与のｓｇＲＮＡ対を用いたＣａｓ９ｎのＣａｓ９Ｈ８４０Ａでの置換は、オーバーハング型の逆のはずであるが；Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されず、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａが、全ＤＮＡ切断活性が実質的に欠損しているＣＲＩＳＰＲ酵素であることを示唆する（これは、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれ未満であるときであり；これにより、一例は、非突然変異型と比較して、突然変異型のＤＮＡ切断活性がゼロ又はごく僅かである場合、例えば、生化学系又は原核生物系とは対照的に真核生物系におけるＣａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されない場合であり得る）。とはいえ、Ｃａｓ９ｎで５’オーバーハングを形成するｓｇＲＮＡの対は、原則として、代わりに対応する３’オーバーハング及び二重ニッキングを形成するはずである。従って、Ｃａｓ９ｎでの３’オーバーハングの形成をもたらすｓｇＲＮＡ対を別の突然変異Ｃａｓ９と共に使用して、５’オーバーハング及び二重ニッキングを形成することができる。従って、一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、本明細書に記載される、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によって切れ目が入れられる又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列、及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける調節エレメントを分離するために機能的に連結することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡを、トランスジェニックＣａｓ９動物又は哺乳動物、例えば、Ｃａｓ９を構成的に、若しくは誘導的に、若しくは条件付きで発現する動物又は哺乳動物；あるいは、他の方法、例えば、Ｃａｓ９をコードし、かつｉｎ ｖｉｖｏでＣａｓ９を発現する１つ又は複数のベクターの事前投与によりＣａｓ９を発現する、又はＣａｓ９を含む細胞を有する動物若しくは哺乳動物に送達することができる。別法では、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びこれらの構成成分が、上述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）に記載されているように使用される。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素、又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡを別個に送達することができ；そして有利なことに、これらの少なくとも１つが、ナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるために、ガイドＲＮＡの前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは約２〜６時間）前に投与しても良い。別法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを一緒に投与することができる。有利なことに、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率の高いレベルのゲノム改変を達成するのに有用であろう。
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、複数の細胞型内で標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）するステップを含む多種多様な有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドを切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断部（例えば、一本鎖又は二本鎖の切断部）を形成する。例えば、この方法を使用して細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって形成された切断部は、修復プロセス、例えば、修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流の配列及び下流の配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。望ましい場合は、ドナーヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、裸の核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソーム若しくはポロキサマーと複合体を形成した核酸であり得る。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であっても良いし、又は外因性の配列であっても良い。組み込まれる配列の例として、タンパク質又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。従って、組み込みのための配列を、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結することができる。別法では、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又は特に７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例として、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変する方法では、二本鎖の切断部をＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に導入し、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断部の存在は、鋳型の組み込みを促進する。他の実施形態では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ酵素の使用によってこの標的ポリヌクレオチドの発現を増加させる又は低下させるステップを含む。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列を不活性化させて、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの転写が行われないようにすることができる。一部の方法では、制御配列を不活性化させて、この制御配列が制御配列として機能しなくなるようにすることができる。本明細書で使用される「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例として、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路に関連した配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患の影響を受けた組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写産物又は翻訳産物を生じさせるあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得；疾患関連遺伝子は、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得、この発現の変更は、疾患の発症及び／又は進行に相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に直接関与する、又は疾患の病因に関与する遺伝子と連鎖不平衡である、突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写産物又は翻訳産物は、既知又は未知であり得、かつ正常レベル又は異常レベルであり得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に関連するはずであると考えられる；即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭにとっての正確な配列及び長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに近接した２〜５塩基対の配列（即ち、標的配列）である。ＰＡＭ配列の例として、以下の実施例のセクションに示され、当業者であれば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定できるであろう。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一態様では、本発明は、真核細胞内でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増加又は低下するステップを含み；このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に、同様の考慮及び条件が上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。一態様では、本発明は、真核細胞で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏで全ての段階を行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され得、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分に関連した、配列標的化、例えば、ゲノム摂動又はゲノム編集に関与する遺伝子発現の制御に使用される系、方法、及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関連する。有利な実施形態では、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９である。本発明の方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系が、標的外の結合及びその副作用を最小限にする又は回避することである。これは、標的ＤＮＡに対する高度の配列特異性を有するように配置された系を用いて達成される。
自己不活性化系
細胞のゲノムにおける遺伝子の意図したコピーを編集することによるなどして意図した変化が導入された後は、それ以上当該細胞においてＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、ある種の場合には望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、さらに出願者らは、ＣＲＩＳＰＲベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系をエンジニアリングしている。従って、発現開始後、ＣＲＩＳＰＲ系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る（標的遺伝子は、二倍体細胞における通常の点突然変異では、高々２つの編集を必要とする）。単純に、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の１つ以上に存在するユニーク配列に相補的な１つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なＲＮＡ（即ち、ガイドＲＮＡ）を含む：（ａ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、（ｂ）Ｃａｓ９遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、（ｃ）Ｃａｓ９コード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ内、（ｄ）例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）内。
ＨＤＲ効率
治療効果を生じるために必要な標的細胞集団におけるゲノム改変の量は疾患に応じて異なるが、多くの編集治療の有効性は、編集率の増加によって改善する。先述のとおり、編集率はＤＳＢ修復経路の活性及び目的の細胞への送達効率によって制御される。従って、これらの要因のいずれか一方を改善すると、編集治療の有効性が改善される可能性が高い。
ＤＳＢ修復経路の活性率を増加させる試みは、概してＨＤＲに主眼が置かれており、これは、細胞周期調節及びＨＤＲ鋳型をヌクレアーゼと共に送達するという課題により、この経路を用いるストラテジーの効率がＮＨＥＪと比べて低いためである。現在、細胞周期調節は、ゆっくりとした周期の細胞型について、ｅｘ ｖｉｖｏで薬理的薬剤によって有糸分裂を刺激することにより幾らか回避されている［Ｋｏｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４−１５７（２０１１）］。しかしながら、真の分裂終了細胞はかかる操作に適していないものと思われ、このストラテジーの適用性は限られている。治療用トランス遺伝子を含有するＤＮＡ鋳型を標的ＤＳＢに直接ライゲートすることによってＨＤＲの必要性を完全に回避することが試みられている。かかるライゲーションイベントは観察されているが、治療上有用となるには低率過ぎる［Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，１３８０−１３８９（２０１３）；Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８，ｅ１５２（２０１０）］。恐らくは、ＨＤＲ効率を改善して、正確なゲノム修正を要するストラテジーの治療有効性を増加させるには、劇的に新しい手法が必要と思われる。
ゲノム編集は、いくつもの難病に立ち向かうための興味深い機会を提供する。それにも関わらず、この技術はなおもその初期段階にあり、幾度も反復してその有効性、安全性、及び特異性を体系的に最適化する必要がある。加えて、ゲノム編集を取り巻く非常に大きな興奮にも関わらず、このクラスの潜在的に人生を変えるような医薬の開発の成功を確実にするには、戦略的計画及び厳密ながらも実現可能な調節プロセスが必要である。
送達の概略を含めた、送達
ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでゲノム編集ヌクレアーゼを標的細胞に導入するため、種々の核酸又はタンパク質送達方法を用いることができる。送達方法の選択に応じて、ヌクレアーゼは標的細胞で一過性に又は永続的に発現し得る。ヌクレアーゼがオフターゲット切断活性を呈し、又は免疫応答を誘発し得ることを考慮して、送達系は慎重に選択しなければならない。造血幹細胞の編集などのｅｘ ｖｉｖｏ適用には、電気穿孔を用いることにより、ＤＮＡベースのヌクレアーゼ発現ベクター、ｍＲＮＡ、又はタンパク質の送達による一過性のヌクレアーゼ発現を実現し得る。組込みコンピテント及び組込み欠損の両方のレンチウイルスベクターもまた、ヌクレアーゼ発現の駆動に対する使用が成功している。しかしながら、レンチウイルスベクターの組込みは、それにより構成的発現が駆動されてオフターゲット活性が多くなり得るため、それ程望ましくないこともある。加えて、３つヌクレアーゼプラットフォーム全てがまた、操作された細胞透過性又は化学的コンジュゲーションのいずれかによってタンパク質を細胞に直接送達し得るような改変に適していることも実証されている［Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １１，４２９−４３５（２０１４）；Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）；Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ９，８０５−８０７（２０１２）］。
ｉｎ ｖｉｖｏ適用については、最も有望な送達系はウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、これは最近、臨床使用が承認されている［Ｗｉｒｔｈ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５２５，１６２−１６９（２０１３）］。ＡＡＶには多くの血清型があり、眼、脳、肝臓、及び筋肉を含む種々の組織型に高い送達有効性を有することが示されている［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １，４２７−４５１（２０１４）］。しかしながら、ＡＡＶベクターはパッケージング能力が比較的小さく、ヌクレアーゼ送達についていくつかの課題が提起される。ＺＦＮは比較的小さく、二量体ＺＦＮペアを単一のＡＡＶにパッケージングできるが、一方、二量体ＴＡＬＥＮペアははるかに大きく、２つの別個のＡＡＶベクターにパッケージングしなければならない可能性が高い。Ｃａｓ９に関しては、短いオルソログはガイドＲＮＡと共に単一のＡＡＶにパッケージングし得る。これまで、ＡＡＶ媒介性ヌクレアーゼ発現は、肝臓及び脳を含めたいくつかの組織型で成功が実証されている［Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７５，２１７−２２１（２０１１）；Ｓｗｉｅｃｈ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）］。
ＡＡＶ媒介性ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ発現の潜在的可能性にも関わらず、さらなる展開を要するいくつかの課題がある。第一に、ＡＡＶ媒介性ヌクレアーゼ発現は多くの場合に構成的であり、標的細胞においてゲノム編集イベントが成功裏に起こった後にヌクレアーゼ発現を遮断可能であれば、より望ましい。第二に、既にＡＡＶに自然曝露されたことのある患者は、特定の血清型に対して免疫を生じたことがある可能性が高い。従ってＡＡＶは、これらの患者にとって適切な送達媒体ではないこともあり得る。ウイルスベクターで直面するこれらの課題を克服するため、ナノ粒子ベース及び脂質ベースのｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ又はタンパク質送達系は魅力的な代替法を提供し得る［Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）；Ｋｏｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４−１５７（２０１１）］。
この開示及び当該技術分野における知識を用いることにより、概略的にも、また詳細にも記載される本明細書の送達系によってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、又はその構成成分又はその核酸分子（例えばＨＤＲ鋳型を含む）又はその構成成分をコードし若しくはそれを提供する核酸分子を送達し得る。
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９、及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡを、任意の適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他の種ルのウイルスベクター、又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡを、１つ以上のベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉注射によって目的の組織に送達され、そうでないときは、送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、又は他の送達方法による。このような送達は、単回投与又は複数回投与であり得る。当業者であれば、本明細書で送達される実際の用量は、様々な因子、例えば、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、処置するべき対象の全身の健康、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与方式、求められる形質転換／改変の種類などによって大幅に異なり得ることを理解されよう。
このような用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容され得る担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容され得る賦形剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物をさらに含み得る。用量は、１つ以上の薬学的に許容され得る塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；及び有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などをさらに含み得る。加えて、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤なども、この中に存在しても良い。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分は、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤なども、特に剤形が再構成可能な形態である場合は、存在しても良い。適切な例示的な成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容され得る賦形剤の徹底的な議論は、参照により本明細書に組み入れられるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
本明細書の一実施形態では、送達はアデノウイルスにより、この送達は、少なくとも１×１０５の粒子（粒子単位、ｐｕとも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含む単回ブースター投与であり得る。本明細書の一実施形態では、この用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６の粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２の粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７の粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８の粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１の粒子又は約１×１０８〜１×１０１２の粒子）、そして最も好ましくは少なくとも約１×１００の粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０の粒子又は約１×１０９〜１×１０１２の粒子）、又はさらに少なくとも約１×１０１０の粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２の粒子）のアデノウイルスベクターである。別法として、用量は、約１×１０１４以下の粒子、好ましくは約１×１０１３以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１２以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１１以下の粒子、そして最も好ましくは約１×１０１０以下の粒子（例えば、約１×１０９以下の粒子）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６の粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１のｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクターの単回用量を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる２０１３年６月４日にＮａｂｅｌらに付与された米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書のアデノウイルスベクターを参照されたい；投与量は、その段落２９の３６〜５８行目を参照されたい。本明細書の一実施形態では、アデノウイルスは、複数回投与によって送達される。
本明細書の一実施形態では、送達はＡＡＶによる。ＡＡＶのヒトへのｉｎ ｖｉｖｏ送達での治療有効量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能的ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含む約２０〜約５０ｍｌの範囲の生理食塩水であると考えられる。投与量は、治療効果をあらゆる副作用に対してバランスさせるために調整することができる。本明細書の一実施形態では、ＡＡＶの用量は、一般に約１×１０５〜１×１０５０のゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０のゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６のゲノム、又は約１×１０１１〜約１×１０１６のゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投与量は、約１×１０１３のゲノムＡＡＶであり得る。このような濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達することができる。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立するルーチンの試験によって当業者により容易に確立することができる。例えば、２０１３年３月２６日にＨａｊｊａｒらに付与された米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書の段落２７の４５〜６０行目を参照されたい。
本明細書の一実施形態では、送達はプラスミドによる。このようなプラスミド組成物では、投与量は、プラスミドが応答を引き出すのに十分な量にするべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な量は、７０ｋｇの人で約０．１〜約２ｍｇ、又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、一般に、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに機能的に連結された、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流の、（ｉｉ）に機能的に連結された転写ターミネーターを含む。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらの１つ以上は、代わりに異なるベクターにコードされても良い。
本明細書の用量は、平均７０ｋｇの人に基づいている。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内である。また、実験に使用されるマウスは、典型的には、約２０ｇであり、マウスの実験から、７０ｋｇの人にスケールアップすることができることに留意されたい。
一部の実施形態では本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム又はリポフェクション製剤などで送達され、かつ当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、及び同第５，５８０，８５９号明細書に記載されている。特に改良されて改善されたｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞への送達を目的とした送達系が開発され（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８、及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照されたい）、本発明に適用することができる。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類での遺伝子発現の抑制での使用に成功している（例えば、本発明にも適用され得るＴｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたい）。
実際、ＲＮＡの送達は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達の有用な方法である。リポソーム又はナノ粒子を用いてＣａｓ９及びｇＲＮＡ（及び、例えば、ＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９の送達及び／又は本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム、又はナノ粒子によって行うことができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達のためにリポソーム粒子内にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
ＲＮＡの送達手段はまた、好ましくは、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９： ３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）を含む。実際、エキソソームは、ｓｉＲＮａ、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系の送達に特に有用なはずである。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５．）に、エキソソームがいかに、様々な生物学的障壁を越える薬物送達にとっての有望なツールであるか、かつｉｎ ｖｔｉｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用できるかが記載されている。このアプローチでは、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションにより標的エキソソームを作製する。次いで、エキソソームが精製され、トランスフェクトされた細胞上清から特徴付けられ、次いで、ＲＮＡがエキソソーム内に導入される。限定されるものではないが特に脳への本発明による送達又は投与は、エキソソームを用いて行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏら（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達する方式と同様の方式で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬで満たされ、Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）によりマウスに注入した。脳注入カニューレを、背側第３脳室内への注入のために正中線におけるブレグマの後約０．５ｍｍに配置した。Ｕｎｏらは、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法により同程度の標的の減少をもたらすことができることを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、本発明においてヒトで企図され得、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。Ｚｏｕら（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達の方法を記載している。Ｚｏｕらは、１×１０９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターで発現される同様の量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、本発明においてヒトで企図され得、例えば、１×１０９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスでの、脳を標的とする約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
脳への局所送達に関して、これを様々な方法で達成することができる。例えば、物質を、例えば、注入により線条体内に送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される動物をさらに提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）ＣＲＩＳＰＲ酵素が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。
かかる方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照のこと。核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）、及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ投与）、又は標的組織に対してであってもよい（例えば生体内投与）。脂質：核酸複合体の調製は、免疫脂質複合体などの標的リポソームを含め、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照のこと）。ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースの系を使用した核酸の送達では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化してウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターは患者に直接投与してもよく（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の処理に使用してもよく、任意選択でその改変細胞が患者に投与され得る（ｅｘ ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法では宿主ゲノムにおける組込みが可能であり、多くの場合に挿入されたトランス遺伝子の長期発現がもたらされる。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。レトロウイルスの向性は外来性エンベロープタンパク質の取込みによって変えることができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、又は感染させることが可能な、且つ典型的には高いウイルス価を生じるレトロウイルスベクターである。従ってレトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込むと、永続的なトランス遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照のこと）。別の実施形態において、コーカル（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０１６４１１８号明細書を参照のこと）。コーカルウイルスはベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）であり、哺乳動物における水疱性口内炎の原因病原体である。コーカルウイルスは、当初はトリニダードでダニから分離されたもので（Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンで昆虫、ウシ、及びウマから感染が同定されている。哺乳動物に感染するベシクロウイルスの多くは、自然感染した節足動物から分離されており、それがベクター媒介性であることが示唆される。ベシクロウイルスに対する抗体は農村地域に住む人々によく見られ、そこではこのウイルスが地方病性であり、実験室内感染性である；ヒトにおける感染は、通常はインフルエンザ様症状をもたらす。コーカルウイルスエンベロープ糖タンパク質はアミノ酸レベルでＶＳＶ−Ｇインディアナと７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的比較では、ベシクロウイルスの中でコーカルウイルスがＶＳＶ−Ｇインディアナ株と血清学的には異なるものの最も近縁であることが示される。Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ．＆Ｈｙｇｉｅｎｅ ３３：９９９−１００６（１９８４）。コーカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／又は１つ以上のアクセサリータンパク質及びコーカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の態様の範囲内において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質はレンチウイルス及び／又はガンマレトロウイルスのものである。一過的発現が好ましい適用には、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で極めて高い形質導入効率を示すことができ、細胞分裂が不要である。このようなベクターで、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸及びペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、並びにｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のため、標的核酸による細胞の形質導入に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染する能力を有するウイルス粒子の形成に使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を作製することにより作成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び続く宿主中への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるポリヌクレオチド用の発現カセットに置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給する。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム中への組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。この細胞株もまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させ得る。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列がないため、大きい量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも高い感受性を有する熱処理によって低減することができる。従って、ＡＡＶは形質導入ベクターとして使用するのに理想的な候補と考えられる。かかるＡＡＶ形質導入ベクターは、トランスに提供されるアデノウイルス又はヘルペスウイルス又はポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）ヘルパー機能の存在下で複製するのに十分なシス作用性機能を含み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）
を使用して種々の系統の細胞に外来性遺伝子を運び込むことができる。これらのベクターでは、ＡＡＶ ｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子がウイルスゲノムから欠失し、選択のＤＮＡセグメントに置き換えられている。現在のＡＡＶベクターは、最大４３００塩基の挿入ＤＮＡを収容し得る。ｒＡＡＶの作製方法はいくつもあり、本発明はｒＡＡＶ及びｒＡＡＶの調製方法を提供する。例えば、所望のウイルス構築物を含む又はそれから本質的になる１つ又は複数のプラスミドをＡＡＶ感染細胞にトランスフェクトする。加えて、第２の又は追加のヘルパープラスミドをこれらの細胞にコトランスフェクトして、組換えウイルス構築物の複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を提供する。これらの条件下で、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質はトランスに作用してｒＡＡＶ構築物の複製及びパッケージングを刺激する。トランスフェクション後２〜３日でｒＡＡＶを回収する。従来、ｒＡＡＶはアデノウイルスと共に細胞から回収される。次に汚染アデノウイルスが熱処理によって不活性化される。本発明では、ｒＡＡＶは有利には、細胞それ自体からではなく、細胞上清から回収される。従って、最初の態様において本発明はｒＡＡＶを調製することを提供し、及び前述に加えて、以下を含む又はそれから本質的になる方法によりｒＡＡＶを調製することができる：発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶと、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）とを感受性細胞に感染させるステップであって、ｒＡＡＶが機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損している（及びヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）がｒＡＡＶに欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｖ機能を提供する）ステップ；又は発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、組換え体が機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しているステップと、ｒＡＡＶに欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｐ機能を提供するプラスミドを前記細胞にトランスフェクトするステップ；又は発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、組換え体が機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しており、前記細胞が、組換え体に欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｐ機能を提供するステップ；又は機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しているＡＡＶと、組換え体によって外来性ＤＮＡが発現されるように外来性ＤＮＡを組換え体に挿入するための、且つｒｅｐ及び／又はｃａｐ機能を提供するためのプラスミドとを感受性細胞にトランスフェクトするステップであって、従ってトランスフェクションにより、機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐが欠損した、発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶがもたらされるステップ。ｒＡＡＶは、本明細書に記載されるとおりＡＡＶ由来であってもよく、有利には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを含み得るハイブリッド又はカプシドを有するｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はｒＡＡＶであり得る。ｒＡＡＶのＡＡＶは、ｒＡＡＶが標的とする細胞に関連して選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化には、ＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッド若しくはカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化には、ＡＡＶ４を選択することができる。２９３細胞に加えて、本発明の実施に用いることのできる他の細胞及びそれらの細胞に関するインビトロでの特定のＡＡＶ血清型の相対的感染力（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）は以下のとおりである：
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼ又はヘリカーゼタンパク質）、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセット、及びプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる２つ、又はそれ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含む又はそれからなる複数のカセットを含む又はそれから本質的になるｒＡＡＶ、又は２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つ又は２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセットを含み、及び第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる複数の４つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶ又はｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、一部の実施形態では、有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達するさらなる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書を参照のこと。一部の実施形態では、宿主細胞が本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトする細胞は対象から採取される。一部の実施形態では、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞から誘導される。組織培養向けの広範な細胞株が、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定されないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々のソースから入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系の構成成分によって一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションによる）、且つＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して、改変は含むものの他のあらゆる外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はかかる細胞から誘導される細胞株が、１つ以上の試験化合物の評価において使用される。
ＮＨＥＪ効率又はＨＲ効率を高めることも送達に役立つ。ＮＨＥＪ効率は、末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）の共発現によって高められることが好ましい。ＨＲ効率は、ＮＨＥＪ装置、例えば、Ｋｕ７０及びＫｕ８６の一過性の阻害によって増大されるのが好ましい。ＨＲ効率はまた、原核生物又は真核生物相同組換え酵素、例えば、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡの共発現によっても増大させることができる。
一般的なパッケージング及びプロモーター
ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム改変を媒介するためにＣａｓ９コード核酸分子、例えば、ＤＮＡをベクター、例えば、ウイルスベクター内にパッケージングする方法は：
・ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成する：
・単一ウイルスベクター：
・２つ以上の発現カセットを含むベクター：
・プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター：（最大でベクターのサイズ制限まで）：
・二重ウイルスベクター：
・Ｃａｓ９の発現を駆動する１つの発現カセットを含むベクター１：
・プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター：
・１つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動する１つ以上の発現カセットを含むベクター２：
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター：（最大でベクターのサイズ制限まで）：
・相同性依存性修復を媒介する：
・上記の単一及び二重ウイルスベクターアプローチに加えて、追加のベクターを使用して相同性依存性修復鋳型を送達する。
Ｃａｓ９コード核酸分子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）が必要ないという点で有利である。自由になった追加の空間を使用して、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現を駆動することができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃａｓ９の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。偏在発現の場合は、プロモーターを使用することができる：
ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、及びＦｅｒｒｉｔｉｎ重鎖又は軽鎖など。
脳又は他のＣＮＳでの発現の場合は、以下のプロモーターを使用することができる：あらゆるニューロンに対するＳｙｎａｐｓｉｎＩ、興奮性ニューロンに対するＣａＭＫＩＩａｌｐｈａ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対するＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等。
肝臓での発現の場合は、アルブミンプロモーターを使用することができる。
肺での発現の場合は、ＳＰ−Ｂを使用することができる。
内皮細胞の場合は、ＩＣＡＭを使用することができる。
造血細胞の場合は、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。
骨芽細胞の場合は、ＯＧ−２を使用することができる。
ガイドＲＮＡを駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：
Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６又はＨ１
Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、及びｇＲＮＡを発現させるイントロンカセットの使用。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のタイプのプラスミド若しくはウイルスベクターを用いて、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドの製剤、用量）からの、並びに臨床試験やレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスに関する臨床試験に関する出版物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関する臨床試験と同様にすることができる。アデノウイルスの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関する臨床試験と同様にすることができる。プラスミド送達の場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関する臨床研究と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの人（例えば、ヒト成人男性）に基づく又は外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳動物の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）の領域内であり、年齢、性別、全身の健康、患者又は対象の他の状態、及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の因子によって決まる。ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的ゲノム改変の場合は、Ｃａｓ９の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用することができ、ニューロン特異的発現（例えば、ＣＮＳ障害を標的とする場合）はＳｙｎａｐｓｉｎ Ｉプロモーターを使用することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ送達に関しては、ＡＡＶは、２、３の理由：低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製法により得る）から他のウイルスベクターよりも有利である。
ＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異を引き起こす可能性が低い。
ＡＡＶは、４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。これは、Ｃａｓ９並びにプロモーター及び転写ターミネーターが全て、同じウイルスベクター内に適合しなければならないことを意味する。４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂよりも大きい構築物は、ウイルスの産生を大幅に減少させる。ＳｐＣａｓ９は、かなり大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶ内にパッキングすることが困難である。従って、本発明の実施形態は、比較的短いＣａｓ９のホモログを利用することを含む。例えば：
従って、これらの種は、一般に好ましいＣａｓ９種である。
ＡＡＶについては、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せであり得る。標的とされるべき細胞に関するＡＡＶについてＡＡＶを選択することができ；例えば、脳又は神経細胞を標的とする場合は、ＡＡＶ血清型１、２、５、又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せを選択することができ；心臓組織を標的とする場合はＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓に送達するのに有用である。本明細書のプロモーター及びベクターは個々に好ましい。これらの細胞についての特定のＡＡＶ血清型の表（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照されたい）は次の通りである：
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸核分裂細胞及び分裂終了細胞の両方に感染してその遺伝子を発現させる能力を有する複合レトロウイルスである。最も良く知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的とする。
レンチウイルスは、以下のように好ましいであろう。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルストランスファープラスミド主鎖を含む）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清が添加された、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中でのトランスフェクションの前日にＴ−７５フラスコに播種して５０％コンフルエンスにした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び次のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇ偽型）、及び７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）でトランスフェクトした。陽イオン性脂質送達剤（５０ｕＬのリポフェクタミン２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中でトランスフェクションを行った。６時間後に、培地を、１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質を含まないＤＭＥＤに交換した。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清法が好ましい。
レンチウイルスを以下のように精製することができる。４８時間後にウイルス上清を回収した。まずこの上清からデブリを除去し、これを、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターに通してろ過した。次いで、上清を、２４，０００ｒｐｍで２時間、超遠心機にかけた。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中、４℃で一晩再懸濁した。次いで、これを等分して−８０℃で急速冷凍した。
別の実施形態では、特に眼の遺伝子療法（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６； ８：２７５ − ２８５を参照されたい）のための、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとした最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、網型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療用の網膜下注入により送達されるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、即ち、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスをベースとしたレンチウイルス遺伝子療法ベクターも企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２））、このベクターは、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のために改変することができる。
別の実施形態では、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖ、核局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムによって共有される共通のエキソンを標的とするｓｉＲＮＡを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３）を、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。患者の体重１ｋｇ当たり最低でも２．５×１０６のＣＤ３４＋細胞を収集して、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で１６〜２０時間、前刺激することができる。前刺激した細胞を、フィブロネクチンがコーティングされた７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で１６〜２４時間、５重感染でレンチウイルスを用いて形質導入することができる。
レンチウイルスベクターは、パーキンソン病の治療で開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書並び米国特許第７，３０３，９１０号明細書及び同第７，３５１，５８５号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、眼の疾患の治療でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、同第２００９０００７２８４号明細書、同第２０１１０１１７１８９号明細書；同第米国２００９００１７５４３号明細書；同第２００７００５４９６１号明細書、同第２０１００３１７１０９号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；同第２０１１０２９３５７１号明細書、同第２００４００１３６４８号明細書、同第２００７００２５９７０号明細書、同第２００９０１１１１０６号明細書、及び米国特許第７，２５９，０１５号明細書を参照されたい。
ＲＮＡの送達
ＲＮＡの送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達することもできる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて作製することができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、次のエレメント：βグロビン−ポリＡ尾部（１２０以上の一連のアデニン）からのＴ７＿プロモーター−ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃａｓ９−３’ ＵＴＲを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含むカセットからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて転写することができる。
発現を促進し、かつ生じ得る毒性を低減するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列及び／又はガイドＲＮＡを、例えば、偽Ｕ又は５−メチル−Ｃを用いて、１つ以上の改変ヌクレオチドを含めるように改変することができる。
ｍＲＮＡ送達法は、現在、肝臓への送達に特に有望である。
ＲＮＡ送達についての多くの臨床研究は、ＲＮＡｉ又はアンチセンスに集中しているが、これらの系は、本発明の実施のためにＲＮＡの送達に適用することができる。ＲＮＡｉなどについての以下の参照文献を宜読むべきである。
粒子送達系及び／又は製剤：
いくつかの種類の粒子送達系及び／又は製剤は、幅広い生物医学的応用に有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性に関して全体として一つの単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は直径に従いさらに分類される。粗粒子は２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は１００〜２，５００ナノメートルのサイズである。超微粒子、又はナノ粒子は、概してサイズが１〜１００ナノメートルである。この１００ｎｍの限界は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実に基づく。
本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明に係る粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明に係る粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大寸法（例えば直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態では、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子は５００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は２５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は２００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は１５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大寸法を有する粒子が、本発明の一部の実施形態において使用される。一部の実施形態では、本発明の粒子は２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は、種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法測定）は天然粒子（即ち、負荷前）に関して行われてもよく、又は本発明の任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ適用に対する送達に最適なサイズの粒子を提供するため、カーゴ（本明細書ではカーゴは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを指し、さらなる担体及び／又は賦形剤を含み得る）の負荷後に行われてもよい。特定の好ましい実施形態において、粒子の寸法（例えば直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた測定に基づく。粒子、それらの作製及び使用方法並びにその測定に関しては、米国特許第８，７０９，８４３号明細書；米国特許第６，００７，８４５号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，５４３，１５８号明細書；及びＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）オンライン刊行 １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が参照される。
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含めた任意の形態で提供され得る。従って、本明細書に記載される任意の送達系が、限定はされないが、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、又は遺伝子銃を含め、本発明の範囲内にある粒子送達系として提供され得る。
ナノ粒子
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて同時に送達することができる。
例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、リン脂質二重層シェルによって覆われたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子について記載している。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ構成成分は、エンドソームの破壊を促進するために選択されたが、脂質表面層は、ポリカチオンコアの毒性を最小限にするために選択された。従って、これらは、本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
一実施形態では、自己構築生体接着ポリマーに基づいたナノ粒子が企図され、このナノ粒子は、全て脳への送達であるペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用することができる。他の実施形態、例えば、疎水性薬物の経口吸収及び眼送達も企図される。分子エンベロープ技術は、保護された疾患部位に送達される改変ポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９、及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照されたい）。約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、標的組織によって単回投与又は複数回投与である。
一実施形態では、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室で開発された、ＲＮＡを癌細胞に送達して腫瘍の成長を停止させることができるナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。特に、Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室は、新たな生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤を完全に自動化した組み合わせシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２−９、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９−９３を参照されたい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、ポリヌクレオチドの投与にも特に有用な脂質化合物に関し、この脂質化合物は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に適用することができる。一態様では、アミノアルコール脂質化合物は、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成するために細胞又は対象に送達するべき作用物質と組み合わせられる。粒子、リポソーム、又はミセルによって送達するべき作用物質は、気体、液体、又は固体の形態であり得、この作用物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であり得る。このアミノアルコール脂質化合物は、他のアミノアルコール脂質化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子を、任意に医薬賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコール脂質化合物を調製する方法を提供する。アミンの１つ以上の等価物を、本発明のアミノアルコール脂質化合物を形成するのに適切な条件下でエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と反応させる。特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基が、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成するわけではなく、従ってアミノアルコール脂質化合物中に第１級アミン又は第２級アミンが形成される。これらの第１級アミン又は第２級アミンは、そのまま残る、又は別の求電子体、例えば、異なるエポキシド末端化合物と反応することができる。当業者には分かるように、アミンを過剰未満のエポキシド末端化合物と反応させると、様々な数の尾部を有する複数の異なるアミノアルコール脂質化合物が生じる。特定のアミンは、２つのエポキシド由来化合物尾部で十分に官能性を持たせることができるが、他の分子は、エポキシド由来化合物尾部では十分に官能性を持たない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分から離れた１つ、２つ、３つ、又は４つのエポキシド由来化合物尾部を含み得、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンが形成される。特定の実施形態では、全てのアミノ基が、完全には官能性を持たない。特定の実施形態では、２つの同じタイプのエポキシド末端化合物が使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコール脂質化合物の合成は、溶媒を用いて又は用いずに行われ、この合成は、３０〜１００℃の高温、好ましくは約５０〜９０℃で行うことができる。調製したアミノアルコール脂質化合物は、任意に精製することができる。例えば、アミノアルコール脂質化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物尾部を有するアミノアルコール脂質化合物を得ることができる。又は、この混合物を精製して特定の立体異性体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコール脂質化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化することもでき、かつ／又はアシル化することもできる。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコール脂質化合物のライブラリーも提供する。これらのアミノアルコール脂質化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピューターなどを含む高スループット技術を用いて調製及び／又はスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、アミノアルコール脂質化合物は、ポリヌクレオチド又は他の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞内にトランスフェクトするその能力についてスクリーニングされる。
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、組み合わせ重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（例えば、医療器具又はインプラント用の薄膜又は多層薄膜のコーティング）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、微細パターン化剤、及び細胞封入剤としてバイオテクノロジー及び医用用途に使用することができる。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、その化学構造により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で異なるレベルの炎症を引き起こした。このクラスの材料の幅広い化学的多様性により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの活性を阻害するポリマーコーティングを特定することができた。さらに、これらのコーティングは、炎症細胞のリクルートを低減し、かつカルボキシル化ポリスチレン微粒子の皮下注入後の線維症を軽減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入のための高分子電解質複合カプセルを形成することができる。本発明はまた、例えば、抗菌コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの送達、及び幹細胞組織のエンジニアリングなどの多くの他の生物学的用途も有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。
別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も企図される。抗トランスサイレチン短鎖干渉ＲＮＡが、脂質ナノ粒子内に封入されてヒトに送達され（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）、かつこのような系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適合させて適用することができる。静脈投与される体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１ｍｇの用量が企図される。注入に関連した反応のリスクを軽減する薬剤が企図され、例えば、デキサメタゾン、アセトアンピノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンが企図される。合計５回の４週間ごとの約０．３ｍｇ／ｋｇの複数回投与も企図される。
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示され（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３−４７０を参照されたい）、従ってＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達が企図される。２週間毎のＬＮＰの６ｍｇ／ｋｇの約４回の投与が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏらは、最初の２サイクルの０．７ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ投与後に腫瘍退縮が観察され、６サイクルの終了までに、患者が、リンパ節転移の完全な退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を含む部分反応を達成したことを実証した。完全反応が、この患者での４０回の投与後に得られ、この患者は、寛解期を維持し、２６か月に亘る投与後に処置を終了した。ＶＥＧＦ経路阻害剤での前治療の後に進行した、腎臓、肺、及びリンパ節を含む疾患の肝外部位及びＲＣＣを有する２人の患者は、約８〜１２か月間全ての部位で疾患が安定しており、ＰＮＥＴ及び肝転位を有する患者は、疾患が安定した状態で１８か月間（３６回の投与）の延長研究を続けた。
しかしながら、ＬＮＰの変化を考慮しなければならない。カチオン性脂質を、細胞内送達を促進する単層構造を誘導するために負に帯電した脂質と組み合わせる。帯電ＬＮＰは、静脈注射の後に循環から迅速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン性カチオン性脂質を開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。負に帯電したポリマー、例えば、ＲＮＡを低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに導入し、このイオン性脂質は正電荷を示すことができる。しかしながら、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰは、長い循環時間に適合する低い表面電荷を示す。４種類のイオン性カチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡで）、１，２−ジリノレイオキシケト（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙｋｅｔｏ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に集中した。これらの脂質を含むＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、ｉｎ ｖｉｖｏでの肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を示し、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを利用するシリーズＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従って異なる効力を有することが示された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。特に、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含む製剤の場合は、１μｇ／ｍｌの用量のＬＮＰ又はこのＬＮＰ内の、又はこのＬＮＰに関連したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡが企図され得る。
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入の調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。カチオン性脂質、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイオキシケト−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−Ｏ−［２’’−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）は、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から与えられても良いし、又は合成しても良い。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入することができる。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（４０：１０：４０：１０のモル比）のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を含むＬＮＰに封入することができる。必要に応じて、０．２％ ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を封入して、細胞の取り込み、細胞内送達、及び生体内分布を評価することができる。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０のモル比）からなる脂質混合物をエタノール中で溶解して、１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度にすることによって行うことができる。この脂質のエタノール溶液を、５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して多重小胞を形成し、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度にすることができる。押し出し機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて二重の８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターに多層小胞を通した後に、大きい単層小胞を形成することができる。この押し出されて事前に形成された大きい単層小胞に、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に２ｍｇ／ｍｌに溶解したＲＮＡを滴下し、そして０．０６／１ ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることによって封入を達成することができる。エタノールの除去及び製剤緩衝液の中和を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対する１６時間の透析によって行った。ナノ粒子のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒子選別機（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を小胞／強度モードで用いた動的光散乱、及びガウシアンフィッティングによって決定することができる。３つ全てのＬＮＰ系の粒子サイズは、直径が約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡの封入効率は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた、透析の前及び後に収集されたサンプルからの遊離ＲＮＡの除去によって決定することができる。封入ＲＮＡは、溶出ナノ粒子から抽出することができ、２６０ｎｍで定量することができる。ＲＮＡの脂質に対する比は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のコレステロール酵素アッセイを用いた小嚢中のコレステロール含有量の測定によって決定した。ＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の本明細書の考察に関連して、ペグ化リポソーム又はＬＮＰは同様に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に適している。
大きいＬＮＰの調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌの全脂質濃度）を、５０：１０：３８．５のモル比でＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含むエタノール中で調製することができる。酢酸ナトリウムを、０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比で脂質プレミックスに添加することができる。続いて、この混合物を強く撹拌しながら１．８５倍量のクエン酸塩緩衝液（（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と化合させることによって脂質を水和させることができ、これにより、３５％エタノールを含む水性緩衝液中に自然にリポソームが形成される。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒子サイズを時間依存性に増加させることができる。インキュベーション中の様々な時間にアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））によってリポソームのサイズの変化を評価することができる。所望の粒子サイズが達成されたら、水性ＰＥＧ脂質溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中、１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ−ＤＭＧ）をリポソーム混合物に添加して、全脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度にすることができる。ＰＥＧ−脂質の添加時に、リポソームは、そのサイズがさらに成長するのを効果的に停止するべきである。次いで、ＲＮＡを、ＲＮＡと全脂質との比が約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）で空のリポソームに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートして充填ＬＮＰを形成することができる。続いて、この混合物を、ＰＢＳ中で一晩透析し、０．４５−μｍシリンジフィルターでろ過することができる。
Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を意図する標的に送達する手段として企図される。有意なデータが、核酸−機能化金ナノ粒子に基づいたＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
本明細書の教示に関連して利用することができる文献として：Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４−９２５７，Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８−３１６２，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２−６９７０，Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１，Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５−６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６，Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０，Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。
ＲＮＡを含む自己構築ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端部に付着したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて形成することができる。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管を標的とし、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡを送達し、これにより腫瘍の血管新生を達成する手段として使用した（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に付与して調製することができる。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。約１００〜２００ｍｇの用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓらの自己構築ナノ粒子での送達のために考えられる。
Ｂａｒｔｌｅｔｔら（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用することができる。Ｂａｒｔｌｅｔｔらのナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に加えて調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。ＢａｒｔｌｅｔｔらのＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを次のように合成した：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で注文した。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）中のアミン修飾ＲＮＡセンス鎖及び１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒと共に微小遠心管に加えた。室温で４時間撹拌して内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンス鎖コンジュゲートをエタノール沈殿させ、水に再懸濁し、そして未修飾アンチセンス鎖にアニーリングさせてＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。微量の金属汚染物を除去するために全ての液体をＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で処理した。Ｔｆ標的ｓｉＲＮＡナノ粒子及びＴｆ非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を、シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用して形成することができる。典型的には、ナノ粒子は、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で、水中で形成された。標的ナノ粒子の表面上の１％のアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆで修飾した（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）。このナノ粒子を、注入のために５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液に懸濁した。
Ｄａｖｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を用いるＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準癌療法では効果がない固形癌の患者に、３０分間の静脈注射により２１日サイクルの１日目、３日目、８日目、及び１０日目に標的ナノ粒子が投与される。ナノ粒子は：（１）線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡ（クリニックで使用される配列は、既にｓｉＲ２Ｂ＋５として示された）を含む合成送達系からなる。ＴＦＲは、悪性細胞で上方制御されることが以前から知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（ＣＡＬＡＡ−０１として示される臨床型）は、非ヒト霊長類での複数回投与試験で十分に耐容性であることが示されている。一人の慢性骨髄性白血病患者に、リポソーム送達によってｓｉＲＮＡが投与されたが、Ｄａｖｉｓらの臨床試験は、標的送達系を用いてｓｉＲＮＡを全身に送達して、固形癌患者を治療する最初のヒト試験である。標的送達系が、機能的ｓｉＲＮＡをヒト腫瘍に有効に送達できるかを確認するために、Ｄａｖｉｓらは、３つの異なる投薬コホートを構成する３人の患者：それぞれが転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４、及び３０ｍｇ／ｍ２の用量のＣＡＬＡＡ−０１が投与された患者Ａ、Ｂ、及びＣからの生検を調べた。本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系でも同様の用量が企図され得る。本発明の送達は、線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むナノ粒子で達成することができる。
本発明に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ又は存在する場合ＨＤＲ鋳型を、１つ以上の粒子又はナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて送達し得ることが好ましい。他の送達系又はベクターを、本発明のナノ粒子の態様に関連して使用することができる。
一般に、「ナノ粒子」とは、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子のことである。ある好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、５００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。
本発明に包含されるナノ粒子は、様々な形態、例えば、固体ナノ粒子（例えば、金属、例えば、銀、金、鉄、チタン）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして提供することができる。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、さらにはハイブリッド構造（例えば、コア−シェルナノ粒子）を調製することができる。半導体材料から形成されたナノ粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるほど十分に小さい（典型的には、１０ｎｍ未満）場合は標識量子ドットであり得る。このようなナノスケールの粒子は、薬物担体又は造影剤として生物医学的応用に使用され、かつ本発明の同様の目的のために適合させることができる。
半固体ナノ粒子及び柔軟なナノ粒子が製造されるが、これらは本発明の範囲内である。半固体性のプロトタイプナノ粒子はリポソームである。様々な種類のリポソームナノ粒子が、現在、抗癌剤及びワクチンの送達系として臨床で使用されている。半分が親水性で残りの半分が疎水性のナノ粒子は、Ｊａｎｕｓ粒子と呼ばれ、エマルションの安定化に特に有効である。このナノ粒子は、水／油の界面で自己構築して、固体界面活性剤として機能し得る。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，７０９，８４３号明細書は、治療剤を含む粒子の組織、細胞、及び細胞内区画への標的送達用の薬物送達系を提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー、又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，００７，８４５号明細書は、多官能化合物と１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーとの共有結合によって形成されたマルチブロックコポリマーのコアを有し、かつ生物学的に活性な材料を含む粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５５，９１３号明細書は、０．４ｇ／ｃｍ３未満のタップ密度及び５μｍ〜３０μｍの平均直径を有する空気力学的に軽い粒子を有し、かつその表面に肺系統への薬物送達用の界面活性剤を含む微粒子組成物を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９８５，３０９号明細書は、肺系統への送達用の界面活性剤及び／又は正若しくは負に帯電した治療薬若しくは診断薬と反対の電荷の荷電分子との親水性若しくは疎水性複合体を含む粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５４３，１５８号明細書は、表面に生物学的に活性な材料及びポリ（アルキレングリコール）部分を含む生分解性固体コアを有する生分解性の注射用ナノ粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）は、コンジュゲートポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲートアザ大員環（まとめて「コンジュゲートリポマー（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と呼ばれる）を説明している。特定の実施形態では、このような本明細書に記載される方法及び材料、例えば、コンジュゲートリポマーを、タンパク質の発現の調節を含む、遺伝子発現を調節するためにｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでゲノム摂動を達成するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系との関連で使用できることが想定され得る。
一実施形態では、ナノ粒子は、エポキシド修飾脂質ポリマー、有利に７Ｃ１であり得る（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）オンラインで公表 １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）。Ｃ７１は、１４：１のモル比でＣ１５エポキシド終端脂質とＰＥＩ６００とを反応させて合成し、Ｃ１４ＰＥＧ２０００を用いて、少なくとも４０日間ＰＢＳ溶液中で安定なナノ粒子（３５〜６０ｎｍの直径）を製剤化した。エポキシド修飾脂質−ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞、又は腎細胞に送達することができるが、当業者であれば、他の標的器官に送達するためにこの系を適合させることができるであろう。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの用量が考えられる。総用量が約２ｍｇ／ｋｇである数日又は数週間に亘る投与も考えられる。
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性ナノ−小胞であり、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低減するために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉら（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）は、エキソソームの作製に自己由来樹状細胞を使用した。脳を標的とすることは、ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したＬａｍｐ２ｂ、エキソソーム膜タンパク質を発現させるために樹状細胞をエンジニアリングすることによって達成した。精製エキソソームを、エレクトロポレーションによって外因性ＲＮＡに付加した。静脈注射されたＲＶＧ−標的エキソソームは、特に脳内のニューロン、小膠細胞、乏突起膠細胞にＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを送達し、結果として特定の遺伝子ノックダウンが起きた。ＲＶＧエキソソームへの事前曝露は、ノックダウンを弱めず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が、アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）のノックダウンによって実証された。
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、同種主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞活性化物質、例えば、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６を含まない大量のエキソソームを産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、７日間、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて樹状細胞を選択した。翌日、十分に確立された超遠心分離プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。得られたエキソソームは、物理的に均質であり、サイズ分布は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定される８０ｎｍの直径でピークであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１０６細胞当たり６〜１２μｇ（タンパク質濃度に基づいて測定）のエキソソームを得た。
次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ナノスケールの適用例に適合されたエレクトロポレーションプロトコルを用いて、外因性カーゴが改変エキソソームに導入される可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子のエレクトロポレーションが十分には特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを、エレクトロポレーションのプロトコルの経験的な最適化に使用した。封入されるＲＮＡの量を、エキソソームの超遠心分離及び溶解の後に分析した。４００Ｖ及び１２５μＦでのエレクトロポレーションにより、ＲＮＡが最大に保持されたため、後の全ての実験にこれを使用した。
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１５０μｇのＲＶＧエキソソーム中に封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、ノックダウン効率を４つの対照：未処置マウス、ＲＶＧエキソソームのみが注射されたマウス、ｉｎ ｖｉｖｏカチオン性リポソーム試薬と複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ、即ち、ｓｉＲＮＡに静電結合する９Ｄ−アルギニンにコンジュゲートしたＲＶＧペプチドと複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウスと比較した。皮質組織サンプルを、投与の３日後に分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ処置マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム処置マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、これは、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下（それぞれ６６％［＋又は−］１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％［＋又は−］１３％、Ｐ＜０．０１）から生じた。さらに、本出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム処置動物において、アルツハイマー病の病理におけるアミロイドプラークの主成分である全［β］−アミロイド１〜４２のレベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、ＢＣＡＥ１阻害剤の脳室内注射後の正常なマウスで実証されたβ−アミロイド１〜４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＢＣＡＥ１切断産物におけるｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の５’迅速増幅を行い、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介ノックダウンのエビデンスを得た。
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα、及びＩＦＮ−αの血清濃度を評価することによってＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導したか否かを調べた。エキソソーム処置の後、全てのサイトカインにおける有意でない変化が、ＩＬ−６の分泌を強力に刺激するｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒとは対照的なｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬処置と同様に記録され、エキソソーム処置の免疫学的に不活性なプロフィールが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないとすると、ＲＶＧエキソソームでの送達は、同等のｍＲＮＡのノックダウン及びより大きなタンパク質のノックダウンが、対応するレベルの免疫刺激無しで１／５のｓｉＲＮＡで達成されたため、ＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であると思われる。この実験は、ＲＶＧエキソソーム技術の治療の可能性を実証し、この治療は、神経変性疾患に関連した遺伝子の長期間のサイレンシングに適している可能性がある。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらのエキソソーム送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療標的、特に神経変性疾患への送達に適用することができる。本発明では、約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入される約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの用量が企図され得る。
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、どのようにすれば培養細胞由来のエキソソームをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡの送達に利用できるかを開示している。このプロトコルはまず、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作製を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、トランスフェクト細胞の上清からのエキソソームの精製及び特徴付けの方法を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ＲＮＡをエキソソームに導入する重要なステップを詳述する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでマウスの脳にＲＮＡを効率的に送達するためにエキソソームをどのように使用するかを概説する。エキソソーム媒介ＲＮＡ送達が機能アッセイ及びイメージングによって評価される予想結果の例も示される。全プロトコルには、約３週間かかる。本発明による送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されるエキソソームを用いて行うことができる。本明細書の教示から、これを本発明の実施に利用することができる。
別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞を含む多くの細胞型で産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍのサイズ）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内向き出芽によって形成され、次いで、血漿膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは、自然に細胞間でＲＮＡを輸送するため、この特性は、遺伝子療法に有用であり得、そしてこの開示を、本発明の実施に利用することができる。
血漿からのエキソソームは、９００ｇでの２０分間の軟膜の遠心分離によって血漿を分離し、そして細胞上清を回収し、３００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、そして１６５００ｇで３０分間遠心分離し、次いで０．２２ｍｍフィルターに通して濾過することによって調製することができる。１２００００ｇでの７０分間の超遠心分離によってエキソソームをペレット化する。ｓｉＲＮＡのエキソソームへの化学的トランスフェクションを、ＲＮＡｉ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製造者の取扱説明書に従って行う。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌのＰＢＳに加えて、２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度にする。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬の添加後、混合物をＲＴで１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するために、アルデヒド／流酸塩ラテックスビーズを用いてエキソソームを再分離する。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓのエキソソームへの化学的なトランスフェクションを、ｓｉＲＮＡと同様に行うことができる。エキソソームは、健康なドナーの末梢血から単離された単球及びリンパ球と共に培養することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含むエキソソームを単球及びリンパ球に導入して、ヒトに自己再導入できることが企図され得る。従って、本発明による送達又は投与は、血漿エキソソームを用いて行うことができる。
リポソーム
本発明による送達又は投与は、リポソームで行うことができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲んでいる単膜又は多重膜の脂質二重層及び比較的不浸透性の外側親油性リン脂質二重層から構成された球形小胞構造である。リポソームは、生体適合性かつ非毒性であり、親水性薬物分子及び親油性薬物分子の両方を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、その充填物を生体膜を通過させて血液脳関門（ＢＢＢ）に輸送するため、薬物送達担体としてかなりの注目を集めた（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７（参照用）を参照されたい）。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から形成することができるが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを形成するために最もよく使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自然に起こるが、ホモジナイザー、超音波処理器、又は押し出し機を用いることによって振蘯の形態で力を加えることによって促進することもできる（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
リポソームの構造及び特性を変更するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加することができる。リポソーム構造を安定させて、リポソーム内部のカーゴの漏れを防止するために、例えば、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加することができる。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズが、約５０〜１００ｎｍに調整された（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。リポソーム製剤は、主に天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドから構成され得る。この製剤は、リン脂質のみから調製されるため、リポソーム製剤は、多数の課題に直面し、その１つが血漿中での不安定性である。これらの課題を克服するためにいくつかの試み、特に脂質膜の処置が行われた。これらの試みの１つは、コレステロールの処置に重点を置いた。従来の製剤へのコレステロールの添加は、封入された生物活性化合物の血漿への急速な放出を低減する、又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が安定性を高める（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
特定の有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（Ｔｒｏｊａｎ Ｈｏｒｓｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、プロトコルをｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇで確認することができる。これらの粒子は、血管注入後に脳全体に導入遺伝子を送達することができる。限定されるものではないが、特定の抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子は、エンドサイトーシスにより血液脳関門を通過できると考えられる。本出願人らは、トロイの木馬リポソームを利用して血管注入によってヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを脳に送達すると仮定し、これにより、胎児を操作しなくても全脳トランスジェニック動物が可能となる。リポソームでの約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの投与が企図され得る。
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分を、リポソーム、例えば、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）で投与することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ中の標的とされる特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの約１ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈注射が企図される。毎日の処置を約３日間行い、次いで週１回の投与を５週間行うことができる。別の実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投与されるＳＮＡＬＰに封入された特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓも企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含み得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。
別の実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生されたＨｅｐＧ２由来肝腫瘍では効果的な分子の送達が証明されたが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍では証明されなかった（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及びコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを４８／４０／１０／２モル比で、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと調合することによって調製することができる。得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍの大きさである。なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレオイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈注入として、１投与当たり約２ｍｇ／ｋｇの用量の全ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究に使用される製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を有し得る。ＲＮＡｉナノ薬剤の安全性プロフィールが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ及びＧｏｌｌｏｂによって再検討された（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−ｐＨの低いカチオン性のイオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質から構成されている。この粒子は、直径が約８０ｎｍであり、生理学的ｐＨで中立電荷である。製剤中、イオン性脂質は、粒子形成中にアニオン性ＲＮＡで脂質を凝縮する役割を果たす。酸性が強まるエンドソーム条件下で正に帯電すると、イオン性脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合を媒介し、ＲＮＡの細胞質への放出が可能となる。ＰＥＧ−脂質は、粒子を安定させ、かつ製剤中の凝集を軽減し、かつ薬物動態学的特性を改善する中性で親水性の外部を後に提供する。
今日まで、ＲＮＡを含むＳＮＡＬＰ製剤を用いた２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが、近年、ＬＤＬコレステロールの高い成人ボランティアでＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第１相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、主に肝臓及び空腸で発現され、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの構築及び分泌に必須である。１７人の対象が、ＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの単回投与を受けた（７つの用量レベルで用量を増加）。（前臨床試験に基づいて潜在的な用量制限毒性と予想された）肝臓毒性は見られなかった。最も高い用量の（２人のうちの）１人の対象が、免疫系の刺激に一致するインフルエンザに似た症状を示し、この試験を結論付ける決定がなされた。
Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めた。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、上記のＳＮＡＬＰ技術を利用し、突然変異型及び野生型ＴＴＲの両方の肝細胞産生を標的としてＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する。３つのＡＴＴＲ症状が説明されている：家族性アミロイド多発性ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−共にＴＴＲにおける常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。近年、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回投与用量増加第１相試験がＡＴＲの患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡを基準）の用量範囲で、３１人の患者（試験薬物の２３人とプラセボの８人）に１５分の静脈注入として投与された。処置は、肝機能試験で有意な増加が見られず、良好な耐容性を示した。注射関連反応は、０．４ｍｇ／ｋｇ以上で、２３人の患者のうち３人で見られ；全てが、注入速度の低下に応答し、全てで試験を継続した。血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０、及びＩＬ−１ｒａの最小限及び一過性の上昇が、１ｍｇ／ｋｇの最高用量で２人の患者に見られた（これは前臨床及びＮＨＰ試験から予測された）。血清ＴＴＲの低下により、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の予想された薬力学的効果が、１ｍｇ／ｋｇで観察された。
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質をそれぞれ、例えば、４０：１０：４０：１０のモル比で、例えば、エタノールで可溶化することによって行うことができる（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照されたい）。この脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４）に添加し、混合して最終エタノール濃度及び脂質濃度をそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌにし、押し出しの前に２２℃で２分間平衡化した。この水和脂質を、動的光散乱分析によって決定される７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまでＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて２２℃で、孔径が８０ｎｍの二層フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出した。これには、一般に、１〜３回の通過が必要である。（３０％エタノールを含む５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４の水溶液に可溶化された）ｓｉＲＮＡを、混合しながら約５ｍｌ／分の速度で、前平衡化した（３５℃）小胞に添加した。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達したら、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートして、小胞の再構築及びｓｉＲＮＡの封入を行った。次いで、エタノールを除去し、透析又は接線流透析濾過によって外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）で置換した。ｓｉＲＮＡを、制御された段階希釈法のプロセスを用いてＳＮＡＬＰ中に封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質成分は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用されるＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。封入粒子が形成されたら、使用の前にＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、０．２μｍフィルターに通して滅菌した。平均粒子サイズは、７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が、脂質粒子内に封入された。ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用される製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を、使用の直前に滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈し、この製剤を、１０ｍｌ／ｋｇの総量で外側尾静脈に静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に対して外挿することができる。
他の脂質
他のカチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分又は、例えば、ｓｉＲＮＡに類似したこれをコードする核酸分子（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９ −８５３３を参照されたい）を封入するために利用することができ、従って、本発明の実施に利用することができる。次の脂質組成物を含む予備成形小胞が企図され得る：それぞれ４０／１０／４０／１０のモル比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、並びに約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／全脂質比。７０〜９０ｎｍの狭い範囲の粒子サイズ分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数にするために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡを添加する前に８０ｎｍの膜で粒子を最大３回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含む粒子を、４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比で使用することができ、このモル比は、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を促進するためにさらに最適化することができる。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎら（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を説明している。脂質エンベロープの使用は、本発明でも好ましい。
別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。脂質は、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールを含み、ＰＥＧ−ＤＭＧを、自然小胞形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合にそれぞれ、約１２：１及び９：１とすることができる。製剤は、９０％を超える封入効率で、約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇの用量が企図され得る。
Ｔｅｋｍｉｒａは、全てが本発明に使用することができ、かつ／又は適合させることができる、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関連する、米国及び海外の約９５の対応特許のポートフォリオ（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書、同第７，７９９，５６５号明細書、同第８，０５８，０６９号明細書、同第８，２８３，３３３号明細書、同第７，９０１，７０８号明細書、同第７，７４５，６５１号明細書、同第７，８０３，３９７号明細書、同第８，１０１，７４１号明細書、同第８，１８８，２６３号明細書、同第７，９１５，３９９号明細書、同第８，２３６，９４３号明細書、及び同第７，８３８，６５８号明細書、並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書、同第１５１９７１４号明細書、同第１７８１５９３号明細書、及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）を有する。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子を、ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入して送達することができ、このＰＬＧＡマイクロスフェアは、例えば、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的若しくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質若しくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書、同第２０１３０２４５１０７号明細書、及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡）で詳述されているＰＬＧＡマイクロスフェアである。この製剤は、５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）のモル比を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。融合脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書を参照されたい。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含む広範囲の治療におけるバイオアベイラビリティの課題に取り組んでいる。この技術が明確な利点を実証した特定の投与経路として、経口経路、血液脳関門を通る輸送、固形腫瘍への送達、及び眼が挙げられる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０、及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照されたい。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書に、生物活性分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド、及び／又は医薬品を哺乳動物の体に送達するためのカチオン性デンドリマーが記載されている。デンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓、又は心臓（さらには脳）への生物活性分子の送達を目的とするのに適している。デンドリマーは、単一の分岐単量体単位から段階的に合成された合成３次元巨大分子であり、その性質及び機能性は、容易に制御でき、かつ変更することができる。デンドリマーは、多機能コアに対して（合成への発散型アプローチ）、又は多機能コアに向けて（合成への収束型アプローチ）ビルディングブロックを反復付加することにより合成され、ビルディングブロックが３次元シェルに付加される度に、高位世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、１級アミンへのアクリロニトリルのダブルマイケル付加により、このジアミノブタンに２倍量のアミノ基が付加され、次に、ニトリルの水素化が行われる。この結果、アミノ基が２倍になる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４の末端アミノ基（世代５、ＤＡＢ６４）を含む。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容できるアミノ基である。デンドリマーの遺伝子送達剤としての使用は、接合単位としてアミン／アミドの混合物又はＮ−Ｐ（Ｏ２）Ｓと共にそれぞれ、ポリアミドアミン及びリン含有化合物を使用することに概ね集中しているが、低位世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達としての使用は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬剤送達用のｐＨ感受性制御放出システムとして、及び抹消アミノ酸基によって化学的に修飾されたゲスト分子の封入用のｐＨ感受性制御放出システムとして研究されている。細胞毒性及びＤＮＡとポリプロピレンイミンデンドリマーとの相互作用、並びにＤＡＢ６４のトランスフェクション効力も研究されている。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、以前の報告に反して、カチオン性デンドリマー、例えば、ポリプロピレンイミンデンドリマーは、生物活性分子、例えば、遺伝物質の標的への送達に使用されると、適切な特性、例えば、特定の標的化及び低い毒性を示すという知見に基づいている。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も、生物活性分子の標的への送達にとって適切な特性を示す。また、カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含む様々なポリマーを開示する米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書の生物活性ポリマーを参照されたい。この生物活性ポリマーは、抗増殖活性を有することが示され、従って、不所望の細胞増殖によって特徴付けられる障害、例えば、新生物及び腫瘍、炎症障害（自己免疫障害を含む）、乾癬、及びアテローム性動脈硬化の処置に有用であり得る。これらのポリマーは、活性剤として単独で、又は他の治療薬、例えば、遺伝子療法用の薬物分子又は核酸の送達ビヒクルとして使用することができる。このような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達されるべき作用物質の活性を補完し得る。これらの特許公報の開示は、本明細書の教示と共に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。
超荷電タンパク質（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）
超荷電タンパク質は、異常に高い正又は負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされた又は天然のタンパク質のクラスであり、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。正又は負に過剰に荷電されたタンパク質はいずれも、熱的又は化学的に誘導された凝集に耐える優れた能力を示す。正に過剰に荷電されたタンパク質はまた、哺乳動物細胞に進入することができる。これらのタンパク質に結合するカーゴ、例えば、プラスミド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でのこれらの巨大分子の哺乳動物細胞への機能的な送達を可能にし得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室が、超荷電タンパク質の作製及び特徴付けを２００７年に報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０−１０１１２）。
ＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの哺乳動物細胞への非ウイルス送達は、研究への応用及び治療への応用の双方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６ＧＦＰタンパク質（又は他の正に過剰に荷電されたタンパク質）を適切な無血清培地でＲＮＡと混合し、細胞の添加の前に複合体が形成されるようにする。この段階で血清を含むと、超荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、処置の有効性が低下する。以下のプロトコルは、様々な細胞株に有効であることが分かった（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６）。しかしながら、タンパク質及びＲＮＡの用量を変更するパイロット実験を行って特定の細胞株の手順を最適化するべきである。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製＋３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２００ｎＭの最終濃度にする。ＲＮＡを５０ｎＭの最終濃度まで添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＲＮＡ複合体を細胞に添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬ ヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地でさらに４８時間、活性のアッセイによってはそれ以上の時間インキュベートする。
（７）免疫ブロット法、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、＋３６ＧＦＰが、様々な細胞における有効なプラスミド送達試薬であることをさらに見出した。プラスミドＤＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、効果的にプラスミドを複合体化するためには比例して多い＋３６ＧＦＰタンパク質が必要である。効果的なプラスミド送達のために、本出願人らは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質に由来の既知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを有する＋３６ＧＦＰタンパク質の変異体を開発した。以下のプロトコルは、様々な細胞に有効であるが、上記のようにプラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を、特定の細胞株及び送達の適用例に最適化することが推奨される。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製ｐ３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２ｍＭの最終濃度にする。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）ｐ３６ＧＦＰタンパク質及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を細胞に静かに添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。細胞を血清含有培地でインキュベートし、さらに２４〜４８時間インキュベートする。
（７）適宜、プラスミド送達を（例えば、プラスミド駆動遺伝子発現によって）分析する。
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１−８４３（２０１２）を参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。Ｄｒ．Ｌｕｉのこれらの系及び本明細書の文献は、本明細書の教示と共に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
さらに別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、様々な分子カーゴ（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片まで）の細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の任意の構成成分又は機能性のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップと、（ｂ）その複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、髄腔内に、動脈内に（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、又は局所的に投与するステップとを含む。カーゴは、共有結合による化学的連結を介するか、或いは非共有結合性の相互作用を介してペプチドと会合する。
ＣＰＰの機能はカーゴを細胞に送達することであり、一般に、哺乳類生細胞のエンドソームに送達されるカーゴでエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスである。細胞透過性ペプチドはサイズ、アミノ酸配列、及び電荷が様々であるが、しかしＣＰＰは全てが、細胞膜を移行して細胞質又は細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力という１つの明確な特徴を有する。ＣＰＰ移行は３つの主要な侵入機構に分類され得る：膜における直接の侵入、エンドサイトーシス媒介性の侵入、及び一過性の構造を形成することによる移行。ＣＰＰは、医薬において癌及びウイルス阻害薬を含めた種々の疾患の治療における薬物デリバリー剤として、並びに細胞標識用の造影剤として、数多くの適用が見出されている。造影剤の例には、ＧＦＰの担体、ＭＲＩ造影剤、又は量子ドットとして働くことが含まれる。ＣＰＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ送達ベクターとして研究及び医薬での使用に多大な可能性を秘めている。ＣＰＰは、典型的には、高い相対存在量の正電荷アミノ酸、例えばリジン又はアルギニンを含有するか、或いは極性／荷電アミノ酸と非極性、疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有する。これらの２つのタイプの構造は、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは疎水性ペプチドであり、低い正味電荷で非極性残基のみを含有するか、又は細胞取込みに決定的に重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの１つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）由来のトランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）であり、これは培養下で数多くの細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増加しており、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰには、限定はされないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８−６０）、トランスポータン、及び（Ｒ−ＡｈＸ−Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が含まれる。
米国特許第８，３７２，９５１号明細書は、高度な細胞透過効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）に由来するＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴを伴い脊椎動物対象に送達する態様もまた提供される。ＣＰＰ及びその送達のさらなる態様については、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；同第８，６１４，１９４号明細書及び同第８，０４４，０１９号明細書に記載される。ＣＰＰは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分を送達し得ることはまた、全体として参照により組み入れられるＳｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ−Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］による論稿「Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの細胞透過性ペプチド媒介性送達による遺伝子破壊（Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」に提供され、ここではＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる治療がヒト細胞株において内因性遺伝子破壊を引き起こすことが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質はチオエーテル結合を介してＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化されて凝縮正電荷ナノ粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理することにより、遺伝子が効率的に破壊され、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が減少したことが示された。
植え込み型装置
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達用の植え込み型装置も企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に、薬物を局所的に長期間に亘って溶出する植え込み型医療装置が開示され、この開示には、いくつかのタイプのこのような装置、実施の処置モード、及び植え込みの方法が含まれる。この装置は、その本体として使用される、例えば、マトリックスなどのポリマー物質、及び薬物、場合によっては追加の足場材料、例えば、金属又は追加のポリマー、及び視認性及びイメージングを促進する材料から構成される。植え込み型送達装置は、局所的に長期間に亘って放出させるのに有利であり得、薬物が、罹患部、例えば、腫瘍、炎症、変性の細胞外基質（ＥＣＭ）に、又は症状の緩和のために、又は障害した平滑筋細胞に、又は予防のために直接放出される。１種類の薬物は、上で開示されたＲＮＡであり、この系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。一部の実施形態における植え込みのモードは、最近開発されて使用されている、近接照射療法及び針生検を含む他の処置用の既存の植え込み手順である。このような場合、本発明で説明される新たなインプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、数個の装置が、同じ処置手順中に植え込まれる。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書において、空洞部、例えば、腹腔に適用可能なシステムを含む薬物送達植え込み型又は挿入型のシステム、及び／又は、例えば、任意にマトリックスであり得る生体安定性かつ／又は分解性かつ／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、薬物送達系が固定又は付着されないその他のタイプの投与が提供される。「挿入」という語は、植え込みも含むことに留意されたい。薬物送達系は、好ましくは、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されている「Ｌｏｄｅｒ」として実施される。
１つのポリマー又は複数のポリマーは、生体適合性であり、１つの作用物質及び／又は複数の作用物質を含み、制御された速度での作用物質の放出を可能にし、一部の実施形態では、例えば、マトリックスなどのポリマー基質の総量は、任意に、かつ好ましくは、作用物質の治療レベルに達するのを可能にする最大量以下である。非限定的な一例として、このような量は、好ましくは、導入される作用物質の量に応じて０．１ｍ３〜１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、例えば、機能性、例えば、限定されるものではないが膝関節及び子宮内又は子宮頸リングなどによってサイズが決まる装置に組み込まれる場合は、任意に大きめにすることができる。
（組成物送達用の）薬物送達系は、一部の実施形態では、好ましくは分解性ポリマーを利用するように設計され、主な放出機構はバルク浸食である；又は一部の実施形態では、非分解性又は徐々に分解されるポリマーが使用され、主な放出機構は、バルク浸食ではなく拡散であり、このため外部が膜として機能し、その内部は、長期間（例えば、約１週間〜約数か月）に亘って周囲による影響を実際に受けない薬物貯蔵部として機能する。異なる放出機構の異なるポリマーの組み合わせも、任意に使用することができる。表面における濃度勾配は、好ましくは、全薬物放出期間のかなりの期間の間、事実上一定に維持され、従って、拡散速度は事実上一定である（「０モード」拡散と呼ばれる）。「一定」という語は、好ましくは、治療効果の下側閾値よりも上に維持される拡散速度を意味するが、なお任意に初期バーストの特徴を有し得、かつ／又は、例えば、一定程度の増減で変動し得る。拡散速度は、好ましくは、長期間に亘ってこのように維持され、治療有効期間、例えば、有効サイレンシング期間を最適化するためにあるレベルまで一定であると見なすことができる。
薬物送達系は、任意に、かつ好ましくは、化学的性質又は対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃によるものであっても、ヌクレオチドベースの治療薬を分解から保護するように設計される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の薬物送達系は、任意に検出器具及び／又は活性化器具に関連し、このような器具は、例えば、任意に、限定されるものではないが、熱による加熱及び冷却、レーザービーム、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波を含め、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性の方法によって、装置の植え込み時及び／又は植え込み後に作動される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によると、局所送達の部位は、腫瘍を含む細胞の異常に高い増殖及びアポトーシスの抑制、自己免疫疾患状態を含む活動性及び／又は慢性炎症及び感染症、筋肉組織及び神経組織を含む組織の変性、慢性痛、変性部位、及び組織の再生が促進される骨折部位及び他の創傷部位、及び傷害した心筋、平滑筋、及び横紋筋によって特徴付けられる標的部位を任意に含み得る。
組成物の植え込み部位、又は標的部位は、好ましくは、標的局所送達にとって十分に小さい半径、面積、及び／又は体積を有することを特徴とする。例えば、標的部位は、任意に、約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。
標的部位の位置は、好ましくは、最大治療効果が得られるように選択される。例えば、薬物送達系の組成物は（任意に、上記の植え込み用の装置と共に）、任意に、かつ好ましくは、腫瘍環境又はこの腫瘍環境に関連した血液供給部の内部又はその近傍に植え込まれる。
例えば、組成物は（任意に、装置と共に）、任意に、血管系などの中でニップルを介して膵臓、前立腺、乳房、肝臓の中又はその近傍に植え込まれる。
標的位置は：１．大脳基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合の脊椎；３．ＨＰＶ感染を防ぐための子宮頸部；４．活動性及び慢性炎症関節；５．乾癬の場合の真皮；６．鎮痛効果用の交感神経及び感覚神経部位；７．骨移植内；８．急性及び慢性感染部位；９．膣内；１０．内耳−聴覚系、内耳迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心臓内；冠状動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されるものではないが腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む空洞部（例えば、限定されるものではないが、卵巣癌の場合）；２４．食道内、及び２５．直腸内（単に非限定的な例として、任意に、体内のあらゆる部位がＬｏｄｅｒの植え込みに適し得る）からなる群から任意に選択される。
任意に、システム（例えば、組成物を含む装置）の挿入は、標的部のＥＣＭ及びその部位の近傍に材料を注入して、標的部位及びこのような部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭ中での薬物の拡散及び／又は薬物動態に作用する他の生物学的因子に影響を与えることに関連する。
任意に、一部の実施形態によると、前記作用物質の放出は、検出器具及び／又は活性化器具に関連し得、このような器具は、レーザービーム、照射、熱による加熱及び冷却、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波、及び化学活性剤を含む、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性及び／又は他の方法によって、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に作動される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によると、薬物は、好ましくは、例えば、後述するように、乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性癌の場合にはＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物が、Ｌｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かつこのような薬物がＬｏｄｅｒ基質、例えば、マトリックスなどで封入できるのであれば、本発明に関連して使用することができ、この系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例の別の例として、神経及び筋肉の変性疾患が、異常な遺伝子発現によって発症する。ＲＮＡの局所送達は、このような異常な遺伝子発現を妨げる治療特性を有し得る。小さい薬物及び巨大分子を含む抗アポトーシス薬、抗炎症薬、及び抗変性薬の局所送達もまた、任意に、治療用とすることができる。このような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定速度での、かつ／又は別個に植え込まれる専用装置による長期間の放出に適用される。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例のなお別の例として、精神疾患及び認知障害が、遺伝子改変剤（ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）で処置される。遺伝子ノックダウンが、処置の選択肢である。作用物質を中枢神経部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定されるものではないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害、及び行動疾患を含む精神疾患及び認知障害の治療の選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳の部位に植え込まれると、小さい薬物及び巨大分子を含む薬物を局所的に送達することができる。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例の別の例として、局所部位における先天性及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、臓器移植拒絶反応を防止することができる。移植された臓器及び／又は植え込まれた部位に植え込まれたＬｏｄｅｒでのＲＮＡ及び免疫調節剤の局所送達により、移植された臓器に対して活性化される免疫細胞、例えば、ＣＤ８の撃退による局所免疫抑制が可能となる。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオジェニンを含む血管成長因子などが、新血管形成に必須である。因子、ペプチド、ペプチド模倣薬の局所送達、又はこれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療様式であり；リプレッサーのサイレンシング、及びＬｏｄｅｒでの血管形成を刺激する因子、ペプチド、巨大分子、及び小さい薬物の局所送達は、末梢血管疾患、全身血管疾患、及び心血管疾患に治療効果がある。
挿入、例えば、植え込みの方法は、このような方法において任意の変更なしで、又は別法として任意の僅かな変更のみで、任意に、他のタイプの組織の植え込み及び／又は挿入及び／又は組織のサンプリングに既に使用しても良い。このような方法は、任意に、限定されるものではないが、小線源療法、生検、超音波を用いる及び／又は用いない内視鏡検査、例えば、ＥＲＣＰ、脳組織に入れる定位法、腹腔鏡を関節、腹部臓器、膀胱壁、及び体腔に入れる植え込みを含む腹腔鏡検査を含む。
本明細書で考察される植込み型装置技術は、本明細書の教示を用いて、従ってこの開示及び当該技術分野における知識によって用いることができ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分又は構成成分をコードし若しくは提供するその核酸分子は、植込み型装置によって送達されてもよい。
流体送達装置方法
別の実施形態において、針のアレイを備える流体送達装置（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書を参照のこと）が、固形組織に対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に企図され得る。流体を固形組織に送達するための米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書の装置は、アレイ状に配置された複数の針と；各々が複数の針のそれぞれ１つと流体連通している複数のリザーバと；複数のリザーバのそれぞれ１つに動作可能に結合され且つリザーバ内の流体圧力を制御するように構成された複数のアクチュエータとを含み得る。特定の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が複数のプランジャの１つを含むことができ、複数のプランジャの各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに受け入れられ、及び特定の別の実施形態では複数のプランジャのプランジャがそれぞれの第２の端部で一体に動作可能に結合され、同時に押し下げることが可能である。特定のさらに別の実施形態は、複数のプランジャの全てを選択的に変更可能な速度で押し下げるように構成されたプランジャ駆動装置を含み得る。他の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が、第１の端部と第２の端部とを有する複数の流体送出路の１つを含むことができ、複数の流体送出路の各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに結合される。他の実施形態では、この装置は流体圧力源を含むことができ、及び複数のアクチュエータの各々が流体圧力源と複数のリザーバのそれぞれ１つとの間の流体継手を含む。さらなる実施形態において、流体圧力源は、圧縮機、真空アキュムレータ、蠕動ポンプ、マスターシリンダー、マイクロ流体ポンプ、及びバルブのうちの少なくとも１つを含み得る。別の実施形態において、複数の針の各々は、その長さに沿って配置された複数のポートを含み得る。
患者特異的スクリーニング法
ヌクレオチド、例えば、トリヌクレオチド反復を標的とするＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を使用して、このような反復の存在について患者又は患者のサンプルをスクリーニングすることができる。この反復は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡの標的であり得、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によるこの反復への結合が存在すると、この結合を検出することができ、これによりこのような反復が存在することが示される。従って、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、反復の存在について患者又は患者のサンプルをスクリーニングすることができる。次いで、患者に、症状に対処するために適切な化合物を投与することができる；又は、結合して挿入、欠失、又は突然変異を引き起こして症状を緩和するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を投与することができる。
骨
Ｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ．２０００ Ｏｃｔ；（３７９ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１０１−１２）は、骨への遺伝子の送達を考察している。特定の解剖学的部位にある細胞に遺伝子を移入させることにより、成長因子の骨誘導特性を生理的用量で長時間使用して、より有意な治癒反応を促進することができる。特定の解剖学的部位、骨質、及び軟部組織エンベロープが、局部遺伝子療法の標的細胞の選択に影響する。骨誘導性担体で治療部位に送達される遺伝子療法ベクターが、有望な結果をもたらしている。複数の研究者が、動物モデルにｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ局部遺伝子療法を用いて面白い結果を示している。かかる系は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の骨への送達に使用し及び／又は適合させることができる。
標的化した欠失、治療適用
遺伝子の標的化した欠失が好ましい。従って、数ある障害の中でも特に、コレステロール生合成、脂肪酸生合成、及び他の代謝障害に関与する遺伝子、アミロイド病及び他の疾患に関与する誤って折り畳まれたタンパク質をコードする遺伝子、細胞形質転換を生じさせる癌遺伝子、潜伏ウイルス遺伝子、及びドミナントネガティブな障害を生じさせる遺伝子が好ましい。ここに例示するとおり、出願者らによれば、ウイルス又はナノ粒子のいずれかの送達系を使用した、代謝障害、アミロイドーシス及びタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異及び転座によって生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染、及び他の関連症状に罹患している、必要性がある対象又は患者の眼（視覚）、耳（聴覚）、上皮、造血、又は別の組織に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子送達が好ましい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用には、限定はされないが、網膜色素変性症、色覚異常、黄斑変性症、緑内障等を含めた、遺伝性眼疾患（ｏｃｕｌａｒ ｄｉｅａｓｅ）が含まれる。眼疾患のリストは本明細書に提供される（眼の遺伝子療法と題される節を参照）。
例として、ＨＩＶ−１による慢性感染症が治療又は予防され得る。これを達成するため、有効範囲及び有効性を最大化するＨＩＶ−１株変異体を考慮しながら、大多数のＨＩＶ−１ゲノムを標的化するＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓガイドＲＮＡを作成し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達は、従来どおりの宿主免疫系のアデノウイルス又はレンチウイルス媒介性感染により達成し得る。手法に応じて、宿主免疫細胞は、ａ）単離され、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓで形質導入され、選択され、及び宿主に再導入されてもよく、又はｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の全身送達によりｉｎ ｖｉｖｏで形質導入されてもよい。第１の手法は抵抗性免疫集団の作成を可能にする一方、第２の手法は宿主内の潜伏ウイルスリザーバを標的化する傾向が強い。これは実施例の節でさらに詳細に考察する。
別の例において、Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１３０１７１７３２号明細書は、ゲノムへの抗ＨＩＶトランス遺伝子の挿入に関し、この方法は本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。別の実施形態において、ＣＸＣＲ４遺伝子が標的化されてもよく、Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１００２９１０４８号明細書のＴＡＬＥ系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号明細書及び同第２０１３０１２２５９１号明細書並びにＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１００１４６６５１号明細書の方法は、遺伝子改変頻度を増加させるためのヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子座の改変に関するため、トランス遺伝子の発現にさらに一般的に適用可能であり得る。
また、本発明が遺伝子ノックアウト細胞ライブラリを作成することも想定される。各細胞が単一遺伝子ノックアウトを有し得る。
ＥＳ細胞のライブラリを作製してもよく、ここでは各細胞が単一遺伝子ノックアウトを有し、且つＥＳ細胞のライブラリ全体があらゆる遺伝子ノックアウトを有することになる。このライブラリは、細胞プロセス並びに疾患における遺伝子機能のスクリーニングに有用である。この細胞ライブラリを作製するには、誘導性プロモーター（例えばドキシサイクリン誘導性プロモーター）によって駆動されるＣａｓ９をＥＳ細胞に組み込み得る。加えて、特異的遺伝子を標的化するシングルガイドＲＮＡをＥＳ細胞に組み込み得る。ＥＳ細胞ライブラリを作製するには、単純に、ヒトゲノムにおける各遺伝子を標的化するガイドＲＮＡをコードする遺伝子のライブラリとＥＳ細胞を混合し得る。初めに単一のＢｘＢ１ ａｔｔＢ部位をヒトＥＳ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座に導入し得る。次にＢｘＢ１インテグラーゼを使用してＡＡＶＳ１遺伝子座のＢｘＢ１ ａｔｔＢ部位に対する個々のガイドＲＮＡ遺伝子の組込みを促進し得る。組込みを促進するため、各ガイドＲＮＡ遺伝子が、単一のａｔｔＰ部位を担持するプラスミド上に含まれてもよい。このようにしてＢｘＢ１がゲノムのａｔｔＢ部位をガイドＲＮＡ含有プラスミド上のａｔｔＰ部位と組み換え得る。細胞ライブラリを作成するため、組み込まれたシングルガイドＲＮＡを有し且つＣａｓ９発現を誘導する細胞のライブラリを取り得る。誘導後、ガイドＲＮＡによって指定された部位でＣａｓ９が二本鎖切断を媒介する。
タンパク質治療薬の慢性投与は、特定のタンパク質に対する許容し難い免疫応答を誘発し得る。タンパク質薬物の免疫原性は、いくつかの免疫優性ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープに起因し得る。これらのタンパク質内に含まれるこれらのＨＴＬエピトープのＭＨＣ結合親和性を低下させると、免疫原性がより低い薬物を作成することができる（Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（「免疫原性が低い合理的にエンジニアリングされた治療用タンパク質（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６）。本発明において、特にＣＲＩＳＰＲ酵素の免疫原性は、当初Ｔａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌにおいてエリスロポエチンに関連して示され、続いて展開された手法に従い低下させることができる。従って、定向進化又は合理的設計を用いて、宿主種（ヒト又は他の種）におけるＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣａ９）の免疫原性を低下させることができる。
出願者らは、例示的実施形態では３つの目的とするガイドＲＮＡを使用したｉｎ ｖｉｖｏでの標的切断を示しており、ごく一部の細胞のみに起こるｉｎ ｖｉｖｏでの効率的なＤＮＡ切断を可視化することが可能である（例えば、実施例１を参照）。詳細にはこれは、哺乳動物などの高等生物における特異的標的化もまた達成し得ることを示している。またこれは、複数のガイド配列（即ち別個の標的）を（共送達という意味で）同時に使用することができる点で多重的な側面も強調する。換言すれば、出願者らは、いくつかの異なる配列が同時に、しかし独立して標的化される、多重的手法を使用した。
血液
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を血液に送達することも企図する。
Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．の血漿エキソソーム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）を利用して、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を血液に送達し得る。ナノ粒子を介するなど、他の送達手段又はＲＮＡもまた好ましい（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「低分子干渉ＲＮＡのための脂質様ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」。
本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系はまた、異常ヘモグロビン症、例えばサラセミア及び鎌状赤血球症を治療することも企図される。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系により標的化し得る潜在的標的については、国際公開第２０１３／１２６７９４号パンフレットを参照のこと。Ｄｒａｋｏｐｏｕｌｏｕ，「レビュー論文、βサラセミアに対する造血幹細胞ベースの遺伝子療法の進行中の課題（Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ，Ｔｈｅ Ｏｎｇｏｉｎｇ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）」，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９８７９８０，１０ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．４０６１／２０１１／９８７９８０（その引用文献と共に、全てが示されたものとして参照により本明細書に組み入れられる）は、β−グロビン又はγ−グロビンの遺伝子を送達するレンチウイルスを使用したＨＳＣの改変を考察している。レンチウイルスを使用するのとは対照的に、当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、βサラセミアに関して、突然変異を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、β−グロビン又はγ−グロビン、有利には非赤血球鎌状化β−グロビン又はγ−グロビンのコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用してＨＳＣを修正することができる；具体的には、ｓｇＲＮＡが、βサラセミアを生じさせる突然変異を標的化することができ、及びＨＤＲが、適切なβ−グロビン又はγ−グロビン発現のコーディングをもたらすことができる。これに関して、Ｃａｖａｚｚａｎａ，「ｅｘ ｖｉｖｏでレンチウイルスβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンベクターによって形質導入した自家造血幹細胞の移植による重症型βサラセミアの遺伝子療法の結果（Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｍａｊｏｒ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｅｘ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ βＡ−Ｔ８７Ｑ−Ｇｌｏｂｉｎ Ｖｅｃｔｏｒ）」．ｔｉｆ２０１４．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔＦｉｌｅｓ／Ｊｅａｎ％２０Ａｎｔｏｉｎｅ％２０Ｒｉｂｅｉｌ＿Ａｂｓｔｒａｃｔ．ｐｄｆ；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ，「ヒトβサラセミアの遺伝子療法後の輸血非依存性及びＨＭＧＡ２活性化（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ ＨＭＧＡ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ β−ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ）」，Ｎａｔｕｒｅ ４６７，３１８−３２２（１６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１０）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３２８；Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，「サラセミアに対する遺伝子療法の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｐｓｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１１８３３（２０１２）、ＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５、エンジニアリングされたβ−グロビン遺伝子（βＡ−Ｔ８７Ｑ）を含むレンチウイルスベクター；及びＸｉｅ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びピギーバックを使用した患者特異的ｉＰＳＣにおけるβサラセミア突然変異のシームレス遺伝子修正（Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ β−ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉＰＳＣｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ｐｉｇｇｙｂａｃｋ）」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒ．１７３４２７．１１４（２０１４）２４：１５２６−１５３３（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（これは、ヒトβサラセミアを含むＣａｖａｚｚａｎａの研究主題及びＸｉｅの研究主題である）が言及され、これらはいずれも、その全ての引用文献又は関連文献と共に参照により本明細書に組み入れられる。本発明において、ＨＤＲ鋳型は、エンジニアリングされたβ−グロビン遺伝子（例えばβＡ−Ｔ８７Ｑ）、又はＸｉｅにあるとおりのβ−グロビンを発現するＨＳＣを提供することができる。鎌状赤血球貧血は、赤血球が鎌形になる常染色体劣性遺伝疾患である。これは、１１番染色体の短腕に位置するβ−グロビン遺伝子の一塩基置換によって引き起こされる。結果として、グルタミン酸の代わりにバリンが産生され、鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）の産生が引き起こされる。その結果、歪んだ形状の赤血球が形成される。この異常な形状によって微小血管が閉塞され、骨、脾臓及び皮膚組織に重大な損傷が起こり得る。これは、疼痛のエピソード、感染症の頻発、手足症候群又はさらには多臓器不全につながり得る。歪んだ赤血球はまた溶血を起こし易く、これは重篤な貧血症につながり得る。βサラセミアの場合と同様に、鎌状赤血球貧血はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系でＨＳＣを改変することにより修正し得る。この系は、ゲノムのＤＮＡを切断して次にそれを自己修復させることにより、細胞のゲノムを特異的に編集することが可能である。Ｃａｓ９タンパク質が挿入され、ＲＮＡガイドによって突然変異した箇所に仕向けられると、次に当該の箇所でＤＮＡを切断する。同時に、健常型の配列が挿入される。この配列は、誘導された切断を直すために細胞の自己修復システムによって用いられる。このようにして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、予め得られた幹細胞において突然変異を修正することが可能である。当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、鎌状赤血球貧血に関して、突然変異を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、β−グロビン、有利には非赤血球鎌状化β−グロビンのコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用してＨＳＣを修正することができる；具体的には、ｓｇＲＮＡが、鎌状赤血球貧血を生じさせる突然変異を標的化することができ、及びＨＤＲが、適切なβ−グロビン発現のコーディングをもたらすことができる。
Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２２５６６４号明細書、同第２０１１００９１４４１号明細書、同第２０１００２２９２５２号明細書、同第２００９０２７１８８１号明細書及び同第２００９０２２２９３７号明細書は、ＣＲＥＩ変異体に関し、ここでは２つのＩ−ＣｒｅＩ単量体のうちの少なくとも一方が、Ｉ−ＣｒｅＩのそれぞれ２６位〜４０位及び４４位〜７７位に位置するＬＡＧＬＩＤＡＤＧコアドメインの２つの機能性サブドメインの各々に１つずつ、少なくとも２つの置換を有し、前記変異体は、共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子又はγＣ遺伝子とも呼ばれるヒトインターロイキン−２受容体γ鎖（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子からＤＮＡ標的配列を切断することができる。米国特許出願公開第２０１１０２２５６６４号明細書、同第２０１１００９１４４１号明細書、同第２０１００２２９２５２号明細書、同第２００９０２７１８８１号明細書及び同第２００９０２２２９３７号明細書に同定される標的配列を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に利用することができる。
重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、リンパ球Ｂの機能的欠陥を常に伴うリンパ球Ｔ成熟の欠陥により生じる（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２００５，５６，５８５−６０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。全発生率は出生７万５０００人につき１人と推定される。未治療のＳＣＩＤ患者は多重日和見微生物感染を起こし易く、概して１年を超えて生きることはない。ＳＣＩＤは、家族ドナーからの同種造血幹細胞移植によって治療することができる。ドナーとの組織適合性は幅広く異なり得る。ＳＣＩＤ形態の一つであるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症の場合、患者は組換えアデノシンデアミナーゼ酵素の注射によって治療することができる。
ＳＣＩＤ患者ではＡＤＡ遺伝子が突然変異することが明らかになって以来（Ｇｉｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１９７２，２，１０６７−１０６９）、ＳＣＩＤに関与するいくつかの他の遺伝子が同定されている（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２００５，５６，５８５−６０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。ＳＣＩＤには４つの主要な原因がある：（ｉ）最も高頻度の形態のＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−Ｘ１（Ｘ連鎖ＳＣＩＤ又はＸ−ＳＣＩＤ）はＩＬ２ＲＧ遺伝子の突然変異により引き起こされ、成熟Ｔリンパ球及びＮＫ細胞が存在しなくなる。ＩＬ２ＲＧは、少なくとも５つのインターロイキン受容体複合体に共通する構成成分であるγＣタンパク質をコードする（Ｎｏｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７３，１４７−１５７）。これらの受容体はＪＡＫ３キナーゼを介していくつかの標的を活性化し（Ｍａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７７，６５−６８）、その不活性化はγＣ不活性化と同じ症候群をもたらす；（ｉｉ）ＡＤＡ遺伝子の突然変異は、リンパ球前駆細胞にとって致死的なプリン代謝の欠損をもたらし、ひいてはＢ、Ｔ及びＮＫ細胞がほぼ存在しないことになる；（ｉｉｉ）Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは、免疫グロブリン及びＴリンパ球受容体（ＴＣＲ）の成熟に必須のステップである。このプロセスに関与する３つの遺伝子、組換え活性化遺伝子１及び２（ＲＡＧ１及びＲＡＧ２）及びＡｒｔｅｍｉｓの突然変異は、成熟Ｔ及びＢリンパ球の欠如をもたらす；及び（ｉｖ）ＣＤ４５など、Ｔ細胞特異的シグナル伝達に関与する他の遺伝子の突然変異もまた報告されているが、それらは少数例に相当する（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２００５，５６，５８５−６０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。
その遺伝的基礎が特定されて以来、主に２つの理由でこれらの種々のＳＣＩＤ形態が遺伝子療法手法のパラダイムとなっている（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。ｅｘ ｖｉｖｏ治療が想定される。造血幹細胞（ＨＳＣ）は骨髄から回収し、数回の細胞分裂にわたりその多能性特性を保つことができる。従って、ＨＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏで処理し、次に患者に再注入することができ、ＨＳＣは骨髄で再増殖する。ＳＣＩＤ患者ではリンパ球の成熟が損なわれているため、修正された細胞が選択的優位性を有する。従って、少数の修正された細胞が機能性の免疫系を回復することができる。この仮説は、他の系において、（ｉ）ＳＣＩＤ患者における突然変異の復帰に伴う免疫機能の部分的回復（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，１３，２９０−２９５；Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９６，３３５，１５６３−１５６７；Ｂｏｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７，２７４−２７８；Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００１，９８，８６９７−８７０２；Ｎｉｓｈｉｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０３，４５６５−４５７２）、（ｉｉ）造血細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣＩＤ−Ｘ１欠損の修正（Ｃａｎｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７，３０９７−３１０２；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８，３９０１−３９０９；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７，３１０３−３１０７；Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２，４０９０−４０９７）、（ｉｉｉ）動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＩＤ−Ｘ１（Ｓｏｕｄａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０００，９５，３０７１−３０７７；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００，７２−７９）、ＪＡＫ−３（Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９８，４，５８−６４；Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０００，１１，２３５３−２３６４）及びＲＡＧ２（Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００，３９４２−３９４９）欠損の修正により、及び（ｉｖ）遺伝子療法臨床試験の結果により（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８，６６９−６７２；Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００２；８，４２３−４２５；Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００４，３６４，２１８１−２１８７）、検証されている。この開示から、ＳＣＩＤに関連する突然変異の１つ以上を標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系、例えば、それぞれ、ＳＣＩＤを生じさせるＩＬ２ＲＧの突然変異を標的化し、及びγＣタンパク質の修正発現を提供する、１つ以上のｓｇＲＮＡ及び１つ以上のＨＤＲ鋳型を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用することができる。
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＰｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅに譲渡された米国特許出願公開第２０１１０１８２８６７号明細書は、ＲＮＡｉ及び抗体などの、ＢＣＬ１１Ａ発現又は活性の阻害剤によって造血前駆細胞における胎児ヘモグロビン発現（ＨｂＦ）を調節する方法及び使用に関する。米国特許出願公開第２０１１０１８２８６７号明細書に開示される標的、例えばＢＣＬ１１Ａは、胎児ヘモグロビン発現を調節するため本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系によって標的化し得る。さらなるＢＣＬ１１Ａ標的に関しては、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３：Ｖｏｌ．３４２ ｎｏ．６１５５ ｐｐ．２５３−２５７）及びＸｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １８ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１：Ｖｏｌ．３３４ ｎｏ．６０５８ ｐｐ．９９３−９９６）も参照のこと。
耳
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の耳に送達することも企図する。
研究者は、遺伝子療法を用いて現在の難聴治療、即ち人工内耳を補助し得るかどうかを調べている。難聴は多くの場合に、有毛細胞が失われ又は損傷して信号を聴覚ニューロンに中継できないために引き起こされる。その場合、人工内耳を使用して音に反応し、電気信号を神経細胞に伝達し得る。しかしこれらのニューロンは、多くの場合に、損なわれた有毛による成長因子の放出が減ることに伴い変性し、蝸牛から後退している。
米国特許出願公開第２０１２０３２８５８０号明細書は、シリンジ、例えば単回投与シリンジを例えば使用した、医薬組成物の耳への注入（例えば、耳介投与）、例えば蝸牛の管腔（例えば、中央階、前庭階、及び鼓室階）への注入を記載している。例えば、本明細書に記載される化合物の１つ以上を、鼓室内注入により（例えば中耳に）、及び／又は外耳、中耳、及び／又は内耳への注入により投与することができる。かかる方法は当該技術分野では常法として、例えばヒト耳に対するステロイド及び抗生物質の投与に用いられている。注入は、例えば、耳の正円窓からであっても、又は蝸牛嚢からであってもよい。他の内耳投与方法が当該技術分野において公知である（例えば、Ｓａｌｔ ａｎｄ Ｐｌｏｎｔｋｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，１０：１２９９−１３０６，２００５を参照のこと）。
別の投与方法では、医薬組成物はカテーテル又はポンプを用いてインサイチュ投与することができる。カテーテル又はポンプは、例えば、医薬組成物を蝸牛管腔又は耳の正円窓及び／又は結腸の管腔に送り込むことができる。本明細書に記載される化合物の１つ以上を耳、例えばヒトの耳に投与するのに好適な例示的薬物送達器具及び方法が、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００６／００３０８３７号明細書）及びＪａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第７，２０６，６３９号明細書）によって記載されている。一部の実施形態では、カテーテル又はポンプは外科手技中に例えば患者の耳（例えば、外耳、中耳、及び／又は内耳）に配置され得る。一部の実施形態では、カテーテル又はポンプは外科手技を必要とすることなく例えば患者の耳（例えば、外耳、中耳、及び／又は内耳）に配置され得る。
それに代えて又は加えて、本明細書に記載される化合物の１つ以上は、人工内耳又は補聴器などの、外耳に装着される機械的装置と組み合わせて投与することができる。本発明で使用するのに好適な例示的人工内耳が、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００７／００９３８７８号明細書）によって記載されている。
一部の実施形態では、上記に記載する投与方法はいずれの順序で組み合わせてもよく、同時であっても又は分散させてもよい。
それに代えて又は加えて、本発明は、例えばＣＤＥＲ Ｄａｔａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｍａｎｕａｌ、第００４版（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍにおいて利用可能）に記載されるとおりの、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された方法のいずれかに従い投与されてもよい。
一般に、米国特許出願公開第２０１２０３２８５８０号明細書に記載される細胞治療方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内耳の成熟細胞型（例えば有毛細胞）となる又はそれに向けた細胞の完全な又は部分的な分化を促進することができる。かかる方法によって得られる細胞を、次にかかる治療を必要とする患者に移植し又は植え込むことができる。このような方法を実施するために必要な細胞培養方法について、好適な細胞型の同定及び選択方法、選択された細胞の完全な又は部分的な分化を促進する方法、完全な又は部分的に分化した細胞型を同定する方法、及び完全な又は部分的に分化した細胞を植え込む方法を含め、以下に記載する。
本発明での使用に好適な細胞としては、限定はされないが、本明細書に記載される化合物の１つ以上と例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させたときに、内耳の成熟細胞、例えば有毛細胞（例えば内有毛細胞及び／又は外有毛細胞）に完全に又は部分的に分化する能力を有する細胞が挙げられる。有毛細胞に分化する能力を有する例示的細胞としては、限定はされないが、幹細胞（例えば、内耳幹細胞、成体幹細胞、骨髄由来幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、皮膚幹細胞、ｉＰＳ細胞、及び脂肪由来幹細胞）、前駆細胞（例えば、内耳前駆細胞）、支持細胞（例えば、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞、視蓋細胞及びヘンゼン細胞）、及び／又は生殖細胞が挙げられる。内耳感覚細胞を補充するための幹細胞の使用が、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００５／０２８７１２７号明細書）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願第１１／９５３，７９７号明細書）に記載されている。内耳感覚細胞を補充するための骨髄由来幹細胞の使用が、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００７／０８４６５４号明細書に記載されている。ｉＰＳ細胞については、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １３１，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｐａｇｅｓ ８６１−８７２（２００７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６，６６３−７６（２００６）；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，２６０−２６２（２００７）；Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０（２００７）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；及びＺａｅｈｒｅｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｃｅｌｌ １３１（５）：８３４−８３５（２００７）に記載されている。
かかる好適な細胞は、１つ以上の組織特異的遺伝子の存在を（例えば定性的に又は定量的に）分析することにより同定し得る。例えば、１つ以上の組織特異的遺伝子のタンパク質産物を検出することにより、遺伝子発現を検出し得る。タンパク質検出技術には、適切な抗原に対する抗体を使用してタンパク質を（例えば細胞抽出物又は全細胞を使用して）染色することが含まれる。この場合、適切な抗原は、組織特異的遺伝子発現のタンパク質産物である。原則的には一次抗体（即ち、抗原と結合する抗体）を標識し得るが、一次抗体を標的とする二次抗体（例えば抗ＩｇＧ）を使用することがより一般的である（そして可視化が向上する）。この二次抗体は、蛍光色素とコンジュゲートされるか、或いは適切な酵素と比色反応用に、又は金ビーズ（電子顕微鏡法用に）、又はビオチン−アビジン系とコンジュゲートされ、これにより一次抗体、ひいては抗原の位置を認識できるようになる。
本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ分子は、米国特許出願公開第２０１１０１４２９１７号明細書から改良される組成物によって、医薬組成物を外耳に直接適用することにより耳に送達し得る。一部の実施形態では医薬組成物は外耳道に適用される。耳への送達は、耳送達（ａｕｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）又は耳送達（ｏｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）とも称され得る。
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子はリポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法によって調製され得る。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは本明細書において参照により組み込まれる）に記載されている。
哺乳類細胞に対するｓｉＲＮＡの送達の亢進及び向上を特に目標とする送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照のこと）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類において遺伝子発現を阻害するための使用が成功している（例えばＴｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたく、これもまた本発明に適用することができる。
Ｑｉ ｅｔ ａｌ．は、タンパク質による（ｐｒｏｔｅｉｄｉｃ）新規送達技術によるインタクトな正円窓からの内耳に対する効率的なｓｉＲＮＡトランスフェクション方法を開示しており、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る（例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），１−９を参照のこと）。詳細には、ＴＡＴ二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ＴＡＴ−ＤＲＢＤ）が（これは、内耳（例えば内有毛細胞及び外有毛細胞）、膨大部稜、卵形嚢斑及び球形嚢斑の細胞にＣｙ３標識ｓｉＲＮＡを、インタクトな正円窓を介した透過によってトランスフェクトすることができる）、種々の内耳の病気を治療し及び聴覚機能を維持するのための二本鎖ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に成功している。約４０μｌの１０ｍＭ ＲＮＡが、耳への投与についての投薬量として企図され得る。
Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｊｕｎ；２２８（１−２）：１８０−７）によれば、インプラントによる電気刺激の標的であるらせん神経節ニューロンの良好な維持により人工内耳機能を改善することができ、実験的に聴覚を奪った耳において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）がらせん神経節生存を増強することが以前示されている。Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＤＮＦ遺伝子インサートを有するウイルスベクターによって形質導入された線維芽細胞のコーティングを含む改良型設計の人工内耳電極を試験した。この種のｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入を達成するため、Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＤＮＦ遺伝子カセットインサートを有するアデノウイルスをモルモット線維芽細胞に形質導入し、これらの細胞がＢＤＮＦを分泌したことを決定し、次にアガロースゲルでＢＤＮＦ分泌細胞を人工内耳電極に取り付けて、その電極を鼓室階に植え込んだ。Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．は、このＢＤＮＦを発現する電極が、植え込みの４８日後に対照電極と比較したとき有意に多いらせん神経節ニューロンを蝸牛の基底回転部に維持可能であったことを決定し、らせん神経節ニューロンの生存を増強するため人工内耳療法をｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入と組み合わせることの実現可能性を実証した。かかる系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の耳への送達に適用することができる。
Ｍｕｋｈｅｒｊｅａ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｎｕｍｂｅｒ ５，２０１０）は、損傷からのＯＨＣの保護及び聴性脳幹反応（ＡＢＲ）における閾値シフトの低下から明らかなとおり、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡを使用したＮＯＸ３のノックダウンがシスプラチン中毒性難聴を解消したことを報告している。種々の用量のｓｉＮＯＸ３（０．３、０．６、及び０．９μｇ）がラットに投与され、ＮＯＸ３発現がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価された。用いられた最も低い用量（０．３μｇ）のＮＯＸ３ ｓｉＲＮＡは、スクランブルｓｉＲＮＡ又は未治療の蝸牛の経鼓室投与と比較したときＮＯＸ３ ｍＲＮＡのいかなる阻害も示さなかった。しかしながら、より高用量のＮＯＸ３ ｓｉＲＮＡ（０．６及び０．９μｇ）の投与は、対照のスクランブルｓｉＲＮＡと比較してＮＯＸ３発現を低下させた。かかる系は、ヒトに対する投与に関して約２ｍｇ〜約４ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量による経鼓室投与について本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。
Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２１ ｎｏ．４，８３４−８４１ ａｐｒ．２０１３）は、卵形嚢におけるＨｅｓ５レベルがｓｉＲＮＡの適用後に低下したこと、及びそれらの卵形嚢における有毛細胞の数が対照治療後と比べて有意に多かったことを実証している。このデータは、ｓｉＲＮＡ技術が内耳における修復及び再生の誘導に有用であり得ること、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路が特異的遺伝子発現阻害に潜在的に有用な標的であることを示唆している。Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．は、凍結乾燥したｓｉＲＮＡに滅菌通常生理食塩水を添加することにより調製した２μｌ容積の８μｇのＨｅｓ５ ｓｉＲＮＡを、耳の前庭上皮に注入した。かかる系は、ヒトに対する投与に関して約１〜約３０ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量による耳の前庭上皮への投与について本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。
Ｐｉｎｙｏｎ Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４ Ａｐｒ ２３；６（２３３）：２３３ｒａ５４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００８１７７．人工内耳電極アレイを使用した近接電界電気穿孔遺伝子デリバリーは人工耳を増強する（Ｃｌｏｓｅ−ｆｉｅｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｉｍｐｌａｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｂｉｏｎｉｃ ｅａｒ））は、モルモットにおけるその研究を報告したもので、研究では、ニューロトロフィン遺伝子療法を人工内耳に組み込むと、らせん神経節神経突起再生が刺激されてそのパフォーマンスが改善したことが示された。この著者らは、新規「近接電界」電気穿孔用の人工内耳電極アレイを使用して、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターの発現を駆動するネイキッド相補ＤＮＡ遺伝子構築物を蝸牛外リンパ管内壁の間葉細胞に形質導入した。特定の人工内耳電極構成によって電界をフォーカスすると、意外にも、隣接する間葉細胞への効率的な遺伝子送達が生じた。結果として起こったＢＤＮＦ発現が、両側性感音難聴モデルにおいて耳毒性処置の２週間後に萎縮したらせん神経節神経突起の再生を刺激した。このモデルでは、ＧＦＰのみの対照ベクターの送達ではニューロン構造を復元することはできず、萎縮したニューロンは植え込まれていない蝸牛と区別がつかなかった。ＢＤＮＦ療法では、再生されたらせん神経節神経突起は人工内耳電極に近接して伸び、限局的な異所性の分岐を伴った。この神経リモデリングは人工内耳アレイによるバイポーラ刺激を可能にし、電気的に誘発された聴性脳幹反応によって決定される蝸牛神経の刺激閾値は低く、且つダイナミックレンジは拡張された。この開発は、神経インターフェースを広範に改善し、分子医学適用を拡大し得る。
Ａｔｋｉｎｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４ Ｊｕｌ １８；９（７）：ｅ１０２０７７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０２０７７．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４．最重度聴覚障害成体モルモットの蝸牛におけるＡＴＯＨ１遺伝子療法後の有毛細胞再生（Ｈａｉｒ ｃｅｌｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ＡＴＯＨ１ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｃｈｌｅａ ｏｆ ｐｒｏｆｏｕｎｄｌｙ ｄｅａｆ ａｄｕｌｔ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ））は、成熟蝸牛における感覚有毛細胞の再生、並びに有毛細胞発生に必要であることが知られる転写因子ＡＴＯＨ１の導入及び神経栄養因子の導入による聴覚ニューロンとの感覚有毛細胞の再接続を促進することを目的とした研究の結果を報告した。ＡＴＯＨ１のみ、又はそれをニューロトロフィン−３及び脳由来神経栄養因子と共に含有するアデノウイルスベクターが耳毒性難聴４日後のモルモット蝸牛の基底下部中央階に注射された。ＡＴＯＨ１遺伝子療法単独で治療したモルモットは、治療３週間後に調べたとき、対側無処置蝸牛と比較して有毛細胞マーカーを発現する細胞を有意に多く有した。しかしながら、この増加が聴力閾値の相応の改善をもたらすことはなく、また、単独での、又はニューロトロフィンと組み合わせたときのＡＴＯＨ１治療後のＣｔＢＰ２点によって計測するとき、シナプスリボンの増加もなかった。しかしながら、ＡＴＯＨ１及び神経栄養因子との同時治療後の有毛細胞形成及びシナプス形成については、試料を組み合わせたときウイルス力価が半減したことに起因してウイルス形質導入が減少したため、結論が出ないままである。この著者らは、総じてこれらのデータが、ＡＴＯＨ１単独は成熟蝸牛において非感覚細胞を未成熟感覚有毛細胞表現型となるように駆動することができるが、これによってはアミノグリコシド誘導性難聴後の機能は改善されないことを示唆していると結論付けた。
難聴及び聴覚障害遺伝子療法の説明
支持（ｂｅａｒｉｎｇ）及び平衡障害の一つの主因は、ヒト蝸牛内の有毛細胞の喪失である。この喪失は、騒音、耳毒性損傷等に起因し得る。残念ながら、ヒトを含めた成体哺乳動物において新しい有毛細胞が自然に産生され得ることを裏付けるエビデンスはなく、哺乳類において有毛細胞再生を確実に刺激する方法はない。
出生後の蝸牛
それにも関わらず、最近の報告では、ヒトＡＴＯＨ１などの特定の遺伝子の過剰発現が新規有毛細胞の産生を誘導し得ることが示されている。ＡＴＯＨ１は、有毛細胞再生の主要な調節因子であることが示されている塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。従って、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いた後成的エンジニアリングによるｉｎ ｖｉｖｏでのＡＴＯＨ１発現のモジュレーションは、ヒト難聴又は他のタイプの聴覚障害に対する潜在的な治療手法として用いることができる。このタイプの聴覚障害に有効な遺伝子療法の開発における主要課題は、以下である：（ａ）容易に設計可能なゲノムエンジニアリングの欠如：これはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術によって対処される。詳細には、標的ＤＮＡ配列との結合能を有するが、いかなるＤＮＡ損傷又は改変も導入しない非切断突然変異型のＣａｓ９タンパク質、ｄＣａｓ９を作成する能力。（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ送達の低い効率：これは小型Ｃａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳａＣａｓ９によって改善され、ＳａＣａｓ９は、ｄＣａｓ９タンパク質、融合エフェクター、及び対応する１つ以上のキメラガイドＲＮＡの両方を発現するように単一のＡＡＶベクターに容易にパッケージングすることができる。（ｃ）単一遺伝子を操作するのに複数のガイドを適用する必要があること、従って複数のウイルスベクターの共送達が要求されることに起因する後成的モジュレーションの低い効率。
出願者らは、ｄＣａｓ９及び融合エフェクター、キメラガイドＲＮＡ設計を最適化することにより、複数ガイドの問題を解決している。詳細には、タンデム挿入によって複数のＭＳ２結合部位をキメラＲＮＡ骨格にエンジニアリングすることができた。このようにして、ｄＣａｓ９と改変キメラガイドＲＮＡと融合エフェクター（ｆｕｓｉｏｎ ｅｆｆｏｒｔ）とからなる三成分複合体による後成的エンジニアリングが実施される。融合エフェクターは、ＭＳ２タンパク質並びにＶＰ６４、ｐ６５、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、又はＳＩＤ４Ｘドメインなどの後成的修飾因子を含む。重要なことには、他のＲＮＡ−タンパク質相互作用も同じようにして調べることができる。加えて、複数ベクターの問題はまた、小型ＳａＣａｓ９の導入によって実験の実施に必要なウイルスベクターの数が（合計２又は３個のベクター）からたった（合計１又は２個のベクター）に減少したため、改善される。
出願者らのＳａＣａｓ９を使用したゲノムエンジニアリング系は、ＡＡＶ又はＡｄウイルスに有効にパッケージングすることができ、詳細には、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳類細胞において内因性の後成的状態を改変して、それにより疾患に関連する遺伝子又はゲノム遺伝子座の発現レベルをモジュレートして治療効果を達成することができる。単一ベクター設計における系の構成成分を図２４に示し、図２４は、ｄＣａｓ９ベースの後成的モジュレーション系の設計を示す（系の３つの構成成分、ｄＳａＣａｓ９、融合エフェクター、及びｓｇＲＮＡが示される）。この系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）又は他の送達ビヒクルをベースとする送達方法と組み合わせて、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の後成的状態を改変することができる。
ｄＳａＣａｓ９を使用してＡＴＯＨ１発現を刺激することにより難聴又は聴覚障害を治療する非限定的な例が、本明細書の実施例６、並びに図２４及び図２５に提供される。
眼
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の眼に送達することも企図する。
本発明のさらに別の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，編者Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されるいくつかの遺伝子突然変異により生じる眼の異常が修正され得る。
眼への投与には、レンチウイルスベクター、詳細にはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が特に好ましい。
別の実施形態において、特に眼の遺伝子療法に対して、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小非霊長類レンチウイルスベクターもまた企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５，２００５年１１月２１日オンライン発行，Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５を参照のこと）。ベクターは、標的遺伝子の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有することが企図される。前房内、網膜下、眼内及び硝子体内注射は全て企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５，２００５年１１月２１日オンライン発行，Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５を参照のこと）。眼内注射は手術用顕微鏡の助けを借りて実施される。網膜下注射及び硝子体内注射に関しては、指で軽く押すことにより眼を脱出させ、ガラス製顕微鏡スライドカバースリップで覆った角膜上の一滴の伝播媒質溶液からなるコンタクトレンズ系を使用して眼底を可視化してもよい。網膜下注射に関しては、５μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに取り付けられた１０ｍｍの３４ゲージ針の先端を、直接可視化しながら、網膜下腔に針の孔が見えるまで上方赤道強膜から接線方向に後極に向かって進めてもよい。次に、２μｌのベクター懸濁液を注入して上方胞状網膜剥離を生じさせ、そのようにして網膜下ベクター投与を確認し得る。この手法は自己閉鎖創強膜切開を作り出し、ベクター懸濁液がＲＰＥによって通常手技の４８時間以内に吸収されるまで網膜下腔に維持されることを可能にする。この手順を下半球に繰り返して下方網膜剥離を生じさせてもよい。この技法により、感覚神経網膜及びＲＰＥの約７０％がベクター懸濁液に曝露されることになる。硝子体内注射に関しては、針の先端を角膜強膜縁の１ｍｍ後方の強膜から進め、２μｌのベクター懸濁液を硝子体腔に注入してもよい。前房内注射に関しては、針の先端を角膜強膜縁穿刺によって進め、角膜中央部に向かって送り、及び２μｌのベクター懸濁液を注入してもよい。前房内注射に関しては、針の先端を角膜強膜縁穿刺によって進め、角膜中央部に向かって送り、及び２μｌのベクター懸濁液を注入してもよい。これらのベクターは１．０〜１．４×１０１０又は１．０〜１．４×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌのいずれかの力価で注入され得る。
別の実施形態において、湿潤型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢性黄斑変性症の治療に対する網膜下注入によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｉｎ）及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図される（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照のこと）。かかるベクターを本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系用に改良し得る。各眼につき１．１×１０５形質導入単位（ＴＵ／眼）の用量、総容積１００μｌのＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）で各眼を治療し得る。
別の実施形態において、眼への送達にＥ１欠失、部分的Ｅ３欠失、Ｅ４欠失アデノウイルスベクターが企図され得る。２８人の進行性新生血管加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）患者に、ヒト色素上皮由来因子を発現するＥ１欠失、部分的Ｅ３欠失、Ｅ４欠失アデノウイルスベクター（ＡｄＰＥＤＦ．ｌｌ）の単回硝子体内注射が投与された（例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１６７−１７６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６）を参照のこと）。１０６〜１０９．５粒子単位（ＰＵ）の範囲の用量が調べられ、ＡｄＰＥＤＦ．ｌｌに関連する重篤な有害事象及び用量制限毒性はなかった（例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１６７−１７６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６）を参照のこと）。アデノウイルスベクター媒介性眼内遺伝子導入は、眼障害の治療に実行可能な手法であるものと見られ、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。
別の実施形態では、ＲＸｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのｓｄ−ｒｘＲＮＡ（登録商標）系を、眼に対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に使用し及び／又は適合させることができる。この系では、３μｇのｓｄ−ｒｘＲＮＡの単回硝子体内投与が、１４日間にわたりＰＰＩＢ ｍＲＮＡレベルの配列特異的低下をもたらす。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（登録商標）系は、ヒトに約３〜２０ｍｇのＣＲＩＳＰＲの用量を投与することを企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。
Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９ ｎｏ．４，６４２−６４９ ａｐｒ．２０１１）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づくロドプシン抑制因子と、ＲＮＡｉ標的部位にわたる縮重位置のヌクレオチド変化に起因して抑制に抵抗性のコドン改変ロドプシン置換遺伝子とを送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを記載する。６．０×１０８ｖｐ又は１．８×１０１０ｖｐ ＡＡＶのいずれかの注射が、Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．により眼内に網膜下注射された。Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．のＡＡＶベクターは、ヒトに約２×１０１１〜約６×１０１３ｖｐの用量を投与することを企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。
Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８９ｒａ７６（２０１３））はまた、眼の硝子体液に対する非傷害性注射後に網膜全体に野生型バージョンの欠陥遺伝子を送達するＡＡＶベクターを作り出すｉｎ ｖｉｖｏ定向進化に関する。Ｄａｌｋａｒａは、７ｍｅｒペプチド提示ライブラリ及びＡＡＶ１、２、４、５、６、８、及び９のｃａｐ遺伝子のＤＮＡシャフリングによって構築されたＡＡＶライブラリを記載している。これらのｒｃＡＡＶライブラリ及びＣＡＧ又はＲｈｏプロモーター下でＧＦＰを発現するｒＡＡＶベクターがパッケージングされ、定量的ＰＣＲによってデオキシリボヌクレアーゼ耐性のゲノム力価が得られた。ライブラリがプールされ、初期ライブラリ多様化と、続く３つのｉｎ ｖｉｖｏ選択ステップとから各々がなる２ラウンドの進化が実施された。かかるステップのそれぞれにおいて、Ｐ３０ ｒｈｏ−ＧＦＰマウスに、約１×１０１２ｖｇ／ｍｌのゲノム力価の２ｍｌのイオジキサノール精製リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）透析ライブラリが硝子体内注射された。Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．のＡＡＶベクターは、ヒトに約１×１０１５〜約１×１０１６ｖｇ／ｍｌの用量を投与することを企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。
別の実施形態において、網膜色素変性症（ＲＰ）の治療にロドプシン遺伝子が標的化されてもよく、ここではＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０２０４２８２号明細書の系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に従い改良し得る。
別の実施形態において、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された、ヒトロドプシン遺伝子から標的配列を切断する方法に関する米国特許出願公開第２０１３０１８３２８２号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。
Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２０２６７８号明細書は、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子（これは網膜神経節細胞及び眼組織の色素含有細胞で発現し、ユニークな抗アポトーシス活性を示す）を眼の網膜下腔又は硝子体内腔に送達することに関する網膜症及び視力を脅かす眼科学的障害の治療方法に関する。詳細には、望ましい標的は、ｚｇｃ：１９３９３３、ｐｒｄｍ１ａ、ｓｐａｔａ２、ｔｅｘ１０、ｒｂｂ４、ｄｄｘ３、ｚｐ２．２、Ｂｌｉｍｐ−１及びＨｔｒＡ２であり、これらは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系により標的化し得る。
Ｗｕ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１３：６５９−６２，２０１３）は、マウスにおいて白内障を引き起こす単一塩基対突然変異にＣａｓ９を導くガイドＲＮＡを設計し、そこでＣａｓ９がＤＮＡ切断を誘導した。次に接合体修復機構に提供される他の野生型アレル又はオリゴのいずれかを使用して、変異マウスにおける壊れたアレルの配列が修正され、且つ白内障を引き起こす遺伝的欠陥が修正された。
米国特許出願公開第２０１２０１５９６５３号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した黄斑変性症（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｒａｔｉｏｎ）（ＭＤ）に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載する。黄斑変性症（ＭＤ）は、高齢者における視力障害の主な原因であるが、また、スタルガルト病、ソーズビー眼底、及び致死性小児神経変性疾患などの、発症年齢が乳児期という若さである小児期疾患の顕著な症状でもある。黄斑変性症は網膜の損傷が原因となって視野中心（斑）の視力喪失をもたらす。現行の既存の動物モデルは、ヒトで観察されるとおりのこの疾患の主要な特徴を再現しない。ＭＤに関連するタンパク質をコードする突然変異遺伝子を含む利用可能な動物モデルはまた、極めて可変的な表現型も生じ、ヒト疾患に対する解釈及び治療法開発は困難となっている。
米国特許出願公開第２０１２０１５９６５３号明細書の一態様は、ＭＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することに関し、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。ＭＤに関連するタンパク質は、典型的にはＭＤに関連するタンパク質とＭＤ障害との実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＭＤ障害を有する集団では、ＭＤ障害を有しない集団と比べて、ＭＤに関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＭＤに関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。
非限定的な例として、ＭＤに関連するタンパク質としては、限定はされないが以下のタンパク質が挙げられる：（ＡＢＣＡ４）ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４ ＡＣＨＭ１色覚異常（杆体一色型色覚異常）１ ＡｐｏＥ アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ） Ｃ１ＱＴＮＦ５（ＣＴＲＰ５） Ｃ１ｑ及び腫瘍壊死因子関連タンパク質５（Ｃ１ＱＴＮＦ５） Ｃ２ 補体成分２（Ｃ２） Ｃ３ 補体成分（Ｃ３） ＣＣＬ２ ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２） ＣＣＲ２ ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＣＲ２） ＣＤ３６ 表面抗原分類３６ ＣＦＢ 補体因子Ｂ ＣＦＨ 補体因子ＣＦＨ Ｈ ＣＦＨＲ１ 補体因子Ｈ関連１ ＣＦＨＲ３ 補体因子Ｈ関連３ ＣＮＧＢ３ 環状ヌクレオチド開口チャネルβ３ ＣＰ セルロプラスミン（ＣＰ） ＣＲＰ Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ） ＣＳＴ３ シスタチンＣ又はシスタチン３（ＣＳＴ３） ＣＴＳＤ カテプシンＤ（ＣＴＳＤ） ＣＸ３ＣＲ１ ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）受容体１ ＥＬＯＶＬ４ 極長鎖脂肪酸の伸長４ ＥＲＣＣ６ 除去修復交差相補げっ歯類修復欠損、相補群６ ＦＢＬＮ５ フィビュリン５ ＦＢＬＮ５ フィビュリン５ ＦＢＬＮ６ フィビュリン６ ＦＳＣＮ２ ファスシン（ＦＳＣＮ２） ＨＭＣＮ１ ヘミセンチン（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｉｎ）１ ＨＭＣＮ１ ヘミセンチン１ ＨＴＲＡ１ ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１） ＨＴＲＡ１ ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１ ＩＬ−６ インターロイキン６ ＩＬ−８ インターロイキン８ ＬＯＣ３８７７１５仮定タンパク質 ＰＬＥＫＨＡ１ プレクストリン相同ドメイン含有ファミリーＡメンバー１（ＰＬＥＫＨＡ１） ＰＲＯＭ１ プロミニン１（ＰＲＯＭ１又はＣＤ１３３） ＰＲＰＨ２ ペリフェリン−２ ＲＰＧＲ 網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子 ＳＥＲＰＩＮＧ１ セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＧ、メンバー１（Ｃ１−阻害因子） ＴＣＯＦ１ トリークル（Ｔｒｅａｃｌｅ） ＴＩＭＰ３ メタロプロテイナーゼ阻害因子３（ＴＩＭＰ３） ＴＬＲ３ Ｔｏｌｌ様受容体３。
染色体配列が編集されるＭＤ関連タンパク質のアイデンティティは様々であってよく、且つ様々となる。好ましい実施形態において、染色体配列が編集されるＭＤ関連タンパク質は、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、ＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）、ＣＣＲ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２タンパク質（ＣＣＲ２）、ＣＰ遺伝子によりコードされるセルロプラスミンタンパク質（ＣＰ）、ＣＴＳＤ遺伝子によりコードされるカテプシンＤタンパク質（ＣＴＳＤ）、又はＴＩＭＰ３遺伝子によりコードされるメタロプロテイナーゼ阻害因子３タンパク質（ＴＩＭＰ３）であり得る。例示的実施形態において、遺伝子改変を受ける動物はラットであり、及びＭＤ関連タンパク質をコードする編集される染色体配列は以下であり得る：（ＡＢＣＡ４）ＡＴＰ結合カセット、ＮＭ＿０００３５０ サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４ ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ ＮＭ＿１３８８２８（ＡＰＯＥ） ＣＣＬ２ケモカイン（Ｃ−Ｃ ＮＭ＿０３１５３０モチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２） ＣＣＲ２ケモカイン（Ｃ−Ｃ ＮＭ＿０２１８６６モチーフ）受容体２（ＣＣＲ２） ＣＰ セルロプラスミン（ＣＰ） ＮＭ＿０１２５３２ ＣＴＳＤ カテプシンＤ（ＣＴＳＤ） ＮＭ＿１３４３３４ ＴＩＭＰ３メタロプロテイナーゼ ＮＭ＿０１２８８６ 阻害因子３（ＴＩＭＰ３）。動物又は細胞は、ＭＤ関連タンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７個又はそれ以上の破壊された染色体配列及び破壊されたＭＤ関連タンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。
編集され又は組み込まれる染色体配列は、変化したＭＤ関連タンパク質をコードするように改変され得る。ＭＤ関連染色体配列におけるいくつかの突然変異がＭＤと関連付けられている。ＭＤに関連する染色体配列における突然変異の非限定的な例としては、ＡＢＣＲタンパク質における、Ｅ４７１Ｋ（即ち４７１位のグルタミン酸がリジンに変わる）、Ｒ１１２９Ｌ（即ち１１２９位のアルギニンがロイシンに変わる）、Ｔ１４２８Ｍ（即ち１４２８位のスレオニンがメチオニンに変わる）、Ｒ１５１７Ｓ（即ち１５１７位のアルギニンがセリンに変わる）、Ｉ１５６２Ｔ（即ち１５６２位のイソロイシンがスレオニンに変わる）、及びＧ１５７８Ｒ（即ち１５７８位のグリシンがアルギニンに変わる）；ＣＣＲ２タンパク質における、Ｖ６４Ｉ（即ち１９２位のバリンがイソロイシンに変わる）；ＣＰタンパク質における、Ｇ９６９Ｂ（即ち９６９位のグリシンがアスパラギン又はアスパラギン酸に変わる）；ＴＩＭＰ３タンパク質における、Ｓ１５６Ｃ（即ち１５６位のセリンがシステインに変わる）、Ｇ１６６Ｃ（即ち１６６位のグリシンがシステインに変わる）、Ｇ１６７Ｃ（即ち１６７位のグリシンがシステインに変わる）、Ｙ１６８Ｃ（即ち１６８位のチロシンがシステインに変わる）、Ｓ１７０Ｃ（即ち１７０位のセリンがシステインに変わる）、Ｙ１７２Ｃ（即ち１７２位のチロシンがシステインに変わる）及びＳ１８１Ｃ（即ち１８１位のセリンがシステインに変わる）を含めた、ＭＤを引き起こすものが挙げられる。ＭＤ関連遺伝子及び疾患における遺伝的変異の他の関連性は当該技術分野において公知である。
眼疾患遺伝子療法
その遺伝的基礎に関して広範にマッピングされていて、従ってゲノムエンジニアリング技術を利用してヒト患者におけるそのような病態の治療に対する有効な遺伝子療法を開発するための優れた手段を提供する多くの種類の遺伝性網膜疾患がある。以下の表には、実現可能性に基づき、その遺伝学及び遺伝様式に関するアノテーションと共に眼疾患のリストを示す。
眼疾患に対する有効な遺伝子療法の開発に関する主要課題は、以下である：（ａ）容易に設計可能なゲノムエンジニアリングの欠如；（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ送達の低い効率；及び（ｃ）複数のウイルスベクターの共送達に起因する低いＨＤＲ効率。出願者らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術がこれらの課題に有効に対処し、その解決法を提供することを示している。出願者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ送達の低い効率及びＨＤＲ及び共送達の低い効率の課題が、小型Ｃａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳａＣａｓ９によって解決されることを示しており、ＳａＣａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質及びその対応する１つ以上のｓｇＲＮＡの両方を発現するように単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに容易にパッケージングすることができる。さらに、出願者らは、小型ＳａＣａｓ９の導入により、相同依存性修復（ＨＤＲ）の実施に必要なウイルスベクターの数が３個のベクターから２個のベクターに減少したことを示している。
ＳａＣａｓ９ベースのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノムエンジニアリング系を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳類細胞における内因性ゲノム配列の改変：
出願者らは、ＳａＣａｓ９を用いるゲノムエンジニアリング系をＡＡＶに有効にパッケージングすることができ、詳細にはｉｎ ｖｉｖｏで哺乳類細胞における内因性ゲノム配列を改変するために使用し得ることを示している。
出願者らのＳａＣａｓ９系の基本的特徴を図１５に示す。この系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの送達方法と組み合わせてｉｎ ｖｉｖｏで分裂終了細胞を編集することができ、特定の送達ビヒクルと組み合わせるとき、ヒト網膜の複数の細胞型に有効である。網膜疾患治療の場合、２つの送達経路が用いられる：硝子体内ＡＡＶ注射、ここではＡＡＶが眼の硝子体液に注射され、これを用いて網膜神経節細胞及びミューラーグリア細胞を標的化し、又は眼細胞内のトランス遺伝子の長期発現を持続させる（ｓｙｓｔａｉｎ）ことができる。他方で、網膜下ＡＡＶ注射、ここでは少量の流体が網膜の下に注射され、視細胞及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を効率的に標的化する。
ＡＡＶ血清型２及び８（ＡＡＶ２及びＡＡＶ８）は、神経節細胞及びミューラー細胞に対する硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒａｌ）経路を用いた送達に使用することのできる最も有効な血清型である。網膜下注射手技による視細胞及びＲＰＥ細胞へのトランス遺伝子の送達には、ＡＡＶ血清型１、２、５、７、８、ＤＪを使用することができる。この系を使用した遺伝子療法の詳細なモデルを図１６に示す。
本明細書に記載され、図１６に示され、且つ実施例２〜５に例示されるｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング手法が、視覚系における疾患を引き起こす突然変異又は他のタイプのゲノム異常の修正に用いられ得ることは容易に理解されるであろう。このプロトコルは、以下のステップにまとめることができる：（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的及びＨＤＲ鋳型の検証；（ｉｉ）ウイルス作製；（ｉｉｉ）ウイルス精製；及び（ｉｖ）眼注射。
網膜色素変性症に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング
網膜色素変性症（ＲＰ）は、視覚障害及び場合によっては失明につながり得る遺伝性眼障害である。ＲＰは変性眼疾患の一種であり、多くの場合、ヒト眼における視細胞又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能又は調節に関与する遺伝子のミスセンス突然変異によって引き起こされる。ＲＰは、最も一般的な形態の遺伝性網膜変性症の一つである。
ＲＰの分子遺伝学において重要な遺伝子は、ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）である。ＲＨＯ遺伝子は視細胞外節の主要タンパク質をコードする。研究が明らかにしているところによれば、この遺伝子の突然変異は常染色体優性型のＲＰの約２５％を占める。
ＲＰを引き起こすＲＨＯ突然変異の一例は、コドン２３におけるＣＣＣからＣＡＣへのヌクレオチド置換であり、これは、ＲＨＯ遺伝子の２３位でフェニルアラニンに代えてヒスチジンのアミノ酸置換、即ちＲＨＯ（Ｐ２３Ｈ）をコードする。Ｐ２３Ｈ突然変異は、常染色体優性網膜色素変性症に最もよく見られる原因の一つである（図１８Ａ）。ヘテロ接合患者の表現型は、主に網膜症及び進行性網膜変性症である。この疾患に関してホモ接合の患者は、より重症の表現型を呈する。突然変異Ｐ２３Ｈタンパク質のグリコシル化が著しく減少することが観察されている。一般に、患者は周辺視野が悪化する結果として暗順応障害、明順応障害又は夜盲症を患い得る。ある場合には、中心視力喪失もまた認められる。ＲＰは非症候性のこともあり、又は難聴、失調等を伴う症候性のこともある。
上述のとおり、本明細書に記載され、且つ図５に示される出願者らの例示的ｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング手法が、視覚系における疾患を引き起こす突然変異又は他のタイプのゲノム異常の修正に用いられ得ることは容易に理解されるであろう。ＲＨＯ遺伝子を標的化する網膜色素変性症遺伝子療法のための出願者らのゲノムエンジニアリング手法については、本明細書の実施例２及び３で考察する。
色覚異常に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング
色覚異常（ＡＣＨＭ）は、患者が色を知覚できないこと、高光量レベル（即ち屋外の昼光）で正常な視力を維持できないことによって記述される医学的状態である。ＡＣＨＭは後天的病態を指すこともあるが、典型的には常染色体劣性先天性色覚病態を指す。この病態はまた、色弱として定義される不完全型としても現れる。推定される発生率は、一般集団においておよそ３３，０００人に１人である。
ＡＣＨＭに関連する主要症状は５つあり、即ち、全色盲、弱視、夜盲、眼振、及び虹彩の働きの異常である。
ＡＣＨＭの分子遺伝学において重要な遺伝子は、錐状体細胞周期ヌクレオチド開口型イオンチャネル遺伝子ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、及び形質導入遺伝子ＧＮＡＴ２である。これらの遺伝子の突然変異は網膜光伝達経路の機能不全につながり得る。具体的には、この種の先天性ＡＣＨＭは、錐状体細胞が過分極によって光の入力に対して正しく反応できないことにより生じると考えられる。ＣＮＧＡ３突然変異によって引き起こされる色覚異常はＡＣＨＭ２に分類され、ＣＮＧＢ３突然変異によるものはＡＣＨＭ３に分類され、及びＧＮＡＴ２によるものはＡＣＨＭ４に分類される。これらがＡＣＨＭの主要なタイプであるが、一方、いくつかの少数の例は遺伝子ＰＤＥ６Ｃ及び他の遺伝子の突然変異によって引き起こされ、ＡＣＨＭ５と呼ばれる。
ＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３突然変異を標的化するＡＣＨＭ遺伝子療法のための出願者らのゲノムエンジニアリング手法は、本明細書の実施例４に記載する。
ＣＮＧＡ３（ＡＣＨＭ２）については、４つの主要な突然変異、ａｒｇ２７７からｃｙｓ（Ｒ２７７Ｃ）、ａｒｇ２８３からｔｒｐ（Ｒ２８３Ｗ）、ａｒｇ４３６からｔｒｐ（Ｒ４３５Ｗ）、及びｐｈｅ５４７からｌｅｕ（Ｆ５４７Ｌ）がある。これらの疾患を引き起こす突然変異が、検出される全突然変異の４１．８％を占めた（Ｗｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１１５３６０７７の報告による）。ここで出願者らは、第１及び第２の突然変異（Ｒ２７７Ｃ及びＲ２８３Ｗ）を例にとる。これらの２つの突然変異は近接しているため、同じストラテジー、構築物、ウイルスベクターセット、及び手順で修正することができる。
ＣＮＧＢ３（ＡＣＨＭ３）については、１１４８ｄｅｌＣ突然変異が、疾患を引き起こす突然変異の高頻度に見られる型であり、患者の７５％を占めることが報告されている（Ｗｉｓｚｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００７，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１７２６５０４７）。そしてＨＲ鋳型ベクターを伴うＣａｓ９媒介性ゲノムエンジニアリング手法によるこの突然変異の修正は、疾患表現型をレスキューすることが可能であろう。
加齢性黄斑変性症に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）は、通常高齢者に発症し、網膜の損傷による視野中心の視力喪失をもたらす医学的状態である。ＡＲＭＤは「乾燥型」及び「湿潤型」で起こる。ＡＲＭＤは５０歳の成人における失明及び視力障害の主な原因である。
ＡＲＭＤには、湿潤型及び乾燥型の２つのタイプがある。湿潤型又は滲出型のＡＲＭＤは、網膜の後ろ側の脈絡膜からの血管新生を特徴とする。新規血管は脆弱で、斑の下側から血液及びタンパク質が漏れ出し得る。治療せずに放置すれば、これらの血管からの出血、漏出、及び瘢痕が最終的には視細胞に不可逆的な損傷を引き起こし、ひいては視力が急速に失われる。成長する血管によって網膜が剥離した状態となり得る。
乾燥型又は非滲出型では、網膜と脈絡膜との間にドルーゼンと呼ばれる細胞残屑が蓄積し、これが患者の視覚を冒し、最終的には同様に網膜剥離を引き起こし得る。
加齢性黄斑変性症の治療の分子標的
遺伝子療法で治療し得る可能性のある最も適切な型のＡＲＭＤは、「湿潤型」のＡＲＭＤである。この場合、網膜における異常な血管の増殖は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、又はヒトゲノムにおけるゲノム遺伝子座ＶＥＧＦＡによって刺激される。従って、ＶＥＧＦ発現を抑制し、又はその活性を阻害することのできる方法が、血管の成長を止め、又はある場合には逆転させ得る。これは、ヒト患者においてこのタイプのＡＲＭＤを有効に治療するための有望な分子的手法である。
加齢性（ａｇｅ−ｒｅａｌｔｅｄ）黄斑変性症の治療に向けた遺伝子療法の例示的な非限定的ゲノムエンジニアリング手法は、本明細書において実施例５及び図２３Ａ〜図２３Ｂに例示する。
心臓
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を心臓に送達することも企図する。心臓に関しては、心筋向性アデノ随伴（ａｄｅｎａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶＭ）、詳細には心臓で優先的遺伝子導入を示したＡＡＶＭ４１が好ましい（例えば、Ｌｉｎ−Ｙａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ １０，２００９，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．１０を参照のこと）。投与は全身投与又は局所投与であってよい。全身投与には約１〜１０×１０１４ベクターゲノムの投薬量が企図される。例えば、Ｅｕｌａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４９２：３７６及びＳｏｍａｓｕｎｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４：７７９０も参照のこと。
例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１３９号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した心血管疾患に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載している。心血管疾患には、概して、高血圧、心臓発作、心不全、並びに脳卒中及びＴＩＡが含まれる。この開示に記載される方法においては、心血管疾患に関わる任意の染色体配列又は心血管疾患に関わる任意の染色体配列によってコードされるタンパク質が利用され得る。心血管関連タンパク質は、典型的には心血管関連タンパク質と心血管疾患の発症との実験的関連性に基づき選択される。例えば、心血管障害を有する集団では、心血管障害を有しない集団と比べて心血管関連タンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、心血管関連タンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。
例として、染色体配列は、限定はされないが、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、β）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンギオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、ＣＴＳＫ（カテプシンＫ）、ＰＴＧＩＲ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）受容体（ＩＰ））、ＫＣＮＪ１１（カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１１）、ＩＮＳ（インスリン）、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質、ペントラキシン関連）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来成長因子受容体、βポリペプチド）、ＣＣＮＡ２（サイクリンＡ２）、ＰＤＧＦＢ（血小板由来成長因子βポリペプチド（サル肉腫ウイルス（ｖ−ｓｉｓ）癌遺伝子ホモログ））、ＫＣＮＪ５（カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー５）、ＫＣＮＮ３（カリウム中間体／小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー３）、ＣＡＰＮ１０（カルパイン１０）、ＰＴＧＥＳ（プロスタグランジンＥシンターゼ）、ＡＤＲＡ２Ｂ（アドレナリン作動性、α−２Ｂ−、受容体）、ＡＢＣＧ５（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー５）、ＰＲＤＸ２（ペルオキシレドキシン２）、ＣＡＰＮ５（カルパイン５）、ＰＡＲＰ１４（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼファミリー、メンバー１４）、ＭＥＸ３Ｃ（ｍｅｘ−３ホモログＣ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＡＣＥアンジオテンシンＩ変換酵素（ペプチジルジペプチダーゼＡ）１）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー２））、ＩＬ６（インターロイキン６（インターフェロン、β２））、ＳＴＮ（スタチン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＥ（ネキシン、プラスミノーゲンアクチベータ阻害因子１型）、メンバー１）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＡＤＩＰＯＱ（アディポネクチン、Ｃ１Ｑ及びコラーゲンドメイン含有）、ＡＰＯＢ（アポリポタンパク質Ｂ（Ａｇ（ｘ）抗原を含む））、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＬＥＰ（レプチン）、ＭＴＨＦＲ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＮＡＤＰＨ））、ＡＰＯＡ１（アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）、ＥＤＮ１（エンドセリン１）、ＮＰＰＢ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂ）、ＮＯＳ３（一酸化窒素合成酵素３（内皮細胞））、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）、ＰＬＡＴ（プラスミノーゲンアクチベータ、組織）、ＰＴＧＳ２（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＣＥＴＰ（コレステリルエステル転送タンパク質、血漿）、ＡＧＴＲ１（アンジオテンシンＩＩ受容体、１型）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ））、ＳＥＬＥ（セレクチンＥ）、ＲＥＮ（レニン）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）、ＰＯＮ１（パラオキソナーゼ１）、ＫＮＧ１（キニノーゲン１）、ＣＣＬ２（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２）、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＶＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）、Ｆ２（凝固第ＩＩ因子（トロンビン））、ＩＣＡＭ１（細胞間接着分子１）、ＴＧＦＢ１（形質転換成長因子、β１）、ＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ）、ＩＬ１０（インターロイキン１０）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性）、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）、ＩＦＮＧ（インターフェロン、γ）、ＬＰＡ（リポタンパク質、Ｌｐ（ａ））、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＨＰ（ハプトグロビン）、Ｆ３（凝固第ＩＩＩ因子（トロンボプラスチン、組織因子））、ＣＳＴ３（シスタチンＣ）、ＣＯＧ２（オリゴマーゴルジ複合体の構成成分２）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＳＥＲＰＩＮＣ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１）、Ｆ８（凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固促進構成成分）、ＨＭＯＸ１（ヘムオキシゲナーゼ（デサイクリング）１）、ＡＰＯＣ３（アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ）、ＩＬ８（インターロイキン８）、ＰＲＯＫ１（プロキネチシン１）、ＣＢＳ（シスタチオニンβ合成酵素）、ＮＯＳ２（一酸化窒素合成酵素２、誘導型）、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様受容体４）、ＳＥＬＰ（セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ、抗原ＣＤ６２））、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１）、ＡＧＴ（アンジオテンシノーゲン（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＡ、メンバー８））、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））、ＶＥＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＮＲ３Ｃ２（核内受容体サブファミリー３、Ｃ群、メンバー２）、ＩＬ１８（インターロイキン１８（インターフェロン−γ誘導因子））、ＮＯＳ１（一酸化窒素合成酵素１（神経型））、ＮＲ３Ｃ１（核内受容体サブファミリー３、Ｃ群、メンバー１（グルココルチコイド受容体））、ＦＧＢ（フィブリノゲンβ鎖）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子（ヘパポエチンＡ；散乱因子））、ＩＬ１Ａ（インターロイキン１、α）、ＲＥＴＮ（レジスチン）、ＡＫＴ１（ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＬＩＰＣ（リパーゼ、肝臓）、ＨＳＰＤ１（熱ショック６０ｋＤａタンパク質１（シャペロニン））、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４）、ＳＰＰ１（分泌リンタンパク質１）、ＩＴＧＢ３（インテグリン、β３（血小板糖タンパク質１１１ａ、抗原ＣＤ６１））、ＣＡＴ（カタラーゼ）、ＵＴＳ２（ウロテンシン２）、ＴＨＢＤ（トロンボモジュリン）、Ｆ１０（凝固第Ｘ因子）、ＣＰ（セルロプラスミン（フェロキシダーゼ））、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ｂ）、ＥＤＮＲＡ（エンドセリン受容体Ａ型）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体（赤芽球性白血病ウイルス性（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ））、ＭＭＰ２（マトリックスメタロペプチダーゼ２（ゼラチナーゼＡ、７２ｋＤａゼラチナーゼ、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＰＬＧ（プラスミノーゲン）、ＮＰＹ（神経ペプチドＹ）、ＲＨＯＤ（ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＤ）、ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）、ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＦＮ１（フィブロネクチン１）、ＣＭＡ１（キマーゼ１、マスト細胞）、ＰＬＡＵ（プラスミノーゲンアクチベータ、ウロキナーゼ）、ＧＮＢ３（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド３）、ＡＤＲＢ２（アドレナリン作動性、β−２−、受容体、表面）、ＡＰＯＡ５（アポリポタンパク質Ａ−Ｖ）、ＳＯＤ２（スーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア）、Ｆ５（凝固第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子））、ＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）、ＡＬＯＸ５（アラキドン酸塩５−リポキシゲナーゼ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩ、ＤＲ β１）、ＰＡＲＰ１（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１）、ＣＤ４０ＬＧ（ＣＤ４０リガンド）、ＰＯＮ２（パラオキソナーゼ２）、ＡＧＥＲ（終末糖化産物特異的受容体）、ＩＲＳ１（インスリン受容体基質１）、ＰＴＧＳ１（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＥＣＥ１（エンドセリン変換酵素１）、Ｆ７（凝固第ＶＩＩ因子（血清プロトロンビン転化促進因子））、ＵＲＮ（インターロイキン１受容体拮抗薬）、ＥＰＨＸ２（エポキシドヒドロラーゼ２、細胞質）、ＩＧＦＢＰ１（インスリン様成長因子結合タンパク質１）、ＭＡＰＫ１０（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１０）、ＦＡＳ（Ｆａｓ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、メンバー６））、ＡＢＣＢ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）、ＣＤ１４（ＣＤ１４分子）、ＰＤＥ５Ａ（ホスホジエステラーゼ５Ａ、ｃＧＭＰ特異的）、ＡＧＴＲ２（アンジオテンシンＩＩ受容体、２型）、ＣＤ４０（ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５）、ＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ＣＣＲ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５）、ＭＭＰ１（マトリックスメタロペプチダーゼ１（間質コラゲナーゼ））、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１）、ＡＤＭ（アドレノメデュリン）、ＤＹＴ１０（ジストニー１０）、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子３（急性期反応因子））、ＭＭＰ３（マトリックスメタロペプチダーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ））、ＥＬＮ（エラスチン）、ＵＳＦ１（上流転写因子１）、ＣＦＨ（補体因子Ｈ）、ＨＳＰＡ４（熱ショック７０ｋＤａタンパク質４）、ＭＭＰ１２（マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ））、ＭＭＥ（膜メタロエンドペプチダーゼ）、Ｆ２Ｒ（凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体）、ＳＥＬＬ（セレクチンＬ）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＡＮＸＡ５（アネキシンＡ５）、ＡＤＲＢ１（アドレナリン作動性、β−１−、受容体）、ＣＹＢＡ（シトクロムｂ−２４５、αポリペプチド）、ＦＧＡ（フィブリノゲンα鎖）、ＧＧＴ１（γ−グルタミルトランスフェラーゼ１）、ＬＩＰＧ（リパーゼ、内皮）、ＨＩＦ１Ａ（低酸素誘導因子１、αサブユニット（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子））、ＣＸＣＲ４（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）、ＰＲＯＣ（プロテインＣ（凝固第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子のインアクチベーター））、ＳＣＡＲＢ１（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１）、ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９ａ分子、免疫グロブリン関連α）、ＰＬＴＰ（リン脂質転移タンパク質）、ＡＤＤ１（アデュシン１（α））、ＦＧＧ（フィブリノゲンγ鎖）、ＳＡＡ１（血清アミロイドＡ１）、ＫＣＮＨ２（カリウム電位開口型チャネル、サブファミリーＨ（ｅａｇ関連）、メンバー２）、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）、Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＮＰＲ１（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ／グアニル酸シクラーゼＡ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ））、ＶＴＮ（ビトロネクチン）、ＫＩＡＡ０１０１（ＫＩＡＡ０１０１）、ＦＯＳ（ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＴＬＲ２（ｔｏｌｌ様受容体２）、ＰＰＩＧ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＧ（シクロフィリンＧ））、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体、Ｉ型）、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＣＹＰ１Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー１）、ＭＴＲ（５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ）、ＲＢＰ４（レチノール結合タンパク質４、血漿）、ＡＰＯＡ４（アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ）、ＣＤＫＮ２Ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（メラノーマ、ｐ１６、ＣＤＫ４を阻害））、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２（塩基性））、ＥＤＮＲＢ（エンドセリン受容体Ｂ型）、ＩＴＧＡ２（インテグリン、α２（Ｃ
Ｄ４９Ｂ、ＶＬＡ−２受容体のα２サブユニット））、ＣＡＢＩＮ１（カルシニューリン結合タンパク質１）、ＳＨＢＧ（性ホルモン結合グロブリン）、ＨＭＧＢ１（高移動度群ボックス１）、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ（熱ショックタンパク質９０ｋＤａ β（Ｇｒｐ９４）、メンバー２（偽遺伝子））、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＧＪＡ１（ギャップ結合タンパク質、α１、４３ｋＤａ）、ＣＡＶ１（カベオリン１、カベオラタンパク質、２２ｋＤａ）、ＥＳＲ２（エストロゲン受容体２（ＥＲ β））、ＬＴＡ（リンホトキシンα（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー１））、ＧＤＦ１５（成長分化因子１５）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＣＹＰ２Ｄ６（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＤ、ポリペプチド６）、ＮＧＦ（神経成長因子（βポリペプチド））、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＴＧＩＦ１（ＴＧＦＢ誘導性因子ホメオボックス１）、ＳＲＣ（ｖ−ｓｒｃ肉腫（シュミット−ルピンＡ−２（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ Ａ−２））ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＥＧＦ（上皮成長因子（β−ウロガストロン））、ＰＩＫ３ＣＧ（ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒、γポリペプチド）、ＨＬＡ−Ａ（主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩ、Ａ）、ＫＣＮＱ１（カリウム電位開口型チャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１）、ＣＮＲ１（カンナビノイド受容体１（脳））、ＦＢＮ１（フィブリリン１）、ＣＨＫＡ（コリンキナーゼα）、ＢＥＳＴ１（ベストロフィン１）、ＡＰＰ（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＣＴＮＮＢ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１、８８ｋＤａ）、ＩＬ２（インターロイキン２）、ＣＤ３６（ＣＤ３６分子（トロンボスポンジン受容体））、ＰＲＫＡＢ１（プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化、β１非触媒サブユニット）、ＴＰＯ（甲状腺ペルオキシダーゼ）、ＡＬＤＨ７Ａ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ７ファミリー、メンバーＡ１）、ＣＸ３ＣＲ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）受容体１）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、Ｆ９（凝固第ＩＸ因子）、ＧＨ１（成長ホルモン１）、ＴＦ（トランスフェリン）、ＨＦＥ（ヘモクロマトーシス）、ＩＬ１７Ａ（インターロイキン１７Ａ）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシンホモログ）、ＧＳＴＭ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼμ１）、ＤＭＤ（ジストロフィン）、ＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ結合タンパク質４）、Ｆ１３Ａ１（凝固第ＸＩＩＩ因子、Ａ１ポリペプチド）、ＴＴＲ（トランスサイレチン）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞）、ＰＯＮ３（パラオキソナーゼ３）、ＡＰＯＣ１（アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ）、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ）、ＨＴＲ２Ａ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ａ）、ＣＳＦ３（コロニー刺激因子３（顆粒球））、ＣＹＰ２Ｃ９（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９）、ＴＸＮ（チオレドキシン）、ＣＹＰ１１Ｂ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー１１、サブファミリーＢ、ポリペプチド２）、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）、ＣＳＦ２（コロニー刺激因子２（顆粒球マクロファージ））、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ））、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ（ホスホリパーゼＡ２、グループＩＩＡ（血小板、滑液））、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＧＣＧ（グルカゴン）、ＲＨＯＡ（ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＡ）、ＡＬＤＨ２（アルデヒドデヒドロゲナーゼ２ファミリー（ミトコンドリア））、ＴＣＦ７Ｌ２（転写因子７様２（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス））、ＢＤＫＲＢ２（ブラジキニン受容体Ｂ２）、ＮＦＥ２Ｌ２（核内因子（赤血球由来２）様２）、ＮＯＴＣＨ１（Ｎｏｔｃｈホモログ１、転座関連（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＵＧＴ１Ａ１（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１）、ＩＦＮＡ１（インターフェロン、α１）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ）、ＳＩＲＴ１（サーチュイン（サイレント交配型情報調節２ホモログ）１（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＧＮＲＨ１（ゴナドトロピン放出ホルモン１（黄体形成放出ホルモン））、ＰＡＰＰＡ（妊娠関連血漿タンパク質Ａ、パパリシン１）、ＡＲＲ３（アレスチン３、レチナール（Ｘ−アレスチン））、ＮＰＰＣ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ）、ＡＨＳＰ（αヘモグロビン安定化タンパク質）、ＰＴＫ２（ＰＴＫ２プロテインチロシンキナーゼ２）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）、ＭＴＯＲ（ラパマイシンの機構的標的（セリン／スレオニンキナーゼ））、ＩＴＧＢ２（インテグリン、β２（補体成分３受容体３及び４サブユニット））、ＧＳＴＴ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼθ１）、ＩＬ６ＳＴ（インターロイキン６シグナル伝達因子（ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体））、ＣＰＢ２（カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿））、ＣＹＰ１Ａ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＡ、ポリペプチド２）、ＨＮＦ４Ａ（肝細胞核内因子４、α）、ＳＬＣ６Ａ４（溶質輸送担体ファミリー６（神経伝達物質輸送体、セロトニン）、メンバー４）、ＰＬＡ２Ｇ６（ホスホリパーゼＡ２、ＶＩ群（細胞質型、カルシウム非依存性））、ＴＮＦＳＦ１１（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１１）、ＳＬＣ８Ａ１（溶質輸送担体ファミリー８（ナトリウム／カルシウム交換体）、メンバー１）、Ｆ２ＲＬ１（凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体様１）、ＡＫＲ１Ａ１（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＡ１（アルデヒドレダクターゼ））、ＡＬＤＨ９Ａ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ９ファミリー、メンバーＡ１）、ＢＧＬＡＰ（骨γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）含有タンパク質）、ＭＴＴＰ（ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質）、ＭＴＲＲ（５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼレダクターゼ）、ＳＵＬＴ１Ａ３（スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞質型、１Ａ、フェノール選択、メンバー３）、ＲＡＧＥ（腎腫瘍抗原）、Ｃ４Ｂ（補体成分４Ｂ（チド（Ｃｈｉｄｏ）血液型）、Ｐ２ＲＹ１２（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役、１２）、ＲＮＬＳ（リナラーゼ、ＦＡＤ依存性アミンオキシダーゼ）、ＣＲＥＢ１（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質１）、ＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）、ＲＡＣ１（ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー、低分子ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１））、ＬＭＮＡ（ラミンＮＣ）、ＣＤ５９（ＣＤ５９分子、補体調節タンパク質）、ＳＣＮ５Ａ（ナトリウムチャネル、電位開口型、Ｖ型、αサブユニット）、ＣＹＰ１Ｂ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＢ、ポリペプチド１）、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子（グリコシル化阻害因子））、ＭＭＰ１３（マトリックスメタロペプチダーゼ１３（コラゲナーゼ３））、ＴＩＭＰ２（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子２）、ＣＹＰ１９Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー１９、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＣＹＰ２１Ａ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー２１、サブファミリーＡ、ポリペプチド２）、ＰＴＰＮ２２（タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型２２（リンパ球））、ＭＹＨ１４（ミオシン、重鎖１４、非筋肉性）、ＭＢＬ２（マンノース結合レクチン（プロテインＣ）２、可溶性（オプソニン欠損））、ＳＥＬＰＬＧ（セレクチンＰリガンド）、ＡＯＣ３（アミンオキシダーゼ、銅含有３（血管接着タンパク質１））、ＣＴＳＬ１（カテプシンＬ１）、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）、ＩＧＦ２（インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ））、ＩＴＧＢ１（インテグリン、β１（フィブロネクチン受容体、βポリペプチド、抗原ＣＤ２９はＭＤＦ２、ＭＳＫ１２を含む））、ＣＡＳＴ（カルパスタチン）、ＣＸＣＬ１２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１））、ＩＧＨＥ（免疫グロブリン重鎖定常ε）、ＫＣＮＥ１（カリウム電位開口型チャネル、Ｉｓｋ関連ファミリー、メンバー１）、ＴＦＲＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１））、ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲン、Ｉ型、α１）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲン、Ｉ型、α２）、ＩＬ２ＲＢ（インターロイキン２受容体、β）、ＰＬＡ２Ｇ１０（ホスホリパーゼＡ２、Ｘ群）、ＡＮＧＰＴ２（アンギオポエチン２）、ＰＲＯＣＲ（プロテインＣ受容体、内皮（ＥＰＣＲ））、ＮＯＸ４（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４）、ＨＡＭＰ（ヘプシジン抗菌ペプチド）、ＰＴＰＮ１１（タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型１１）、ＳＬＣ２Ａ１（溶質輸送担体ファミリー２（促進性グルコーストランスポーター）、メンバー１）、ＩＬ２ＲＡ（インターロイキン２受容体、α）、ＣＣＬ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５）、ＩＲＦ１（インターフェロン調節因子１）、ＣＦＬＡＲ（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子）、ＣＡＬＣＡ（カルシトニン関連ポリペプチドα）、ＥＩＦ４Ｅ（真核生物翻訳開始因子４Ｅ）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ１）、ＪＡＫ２（ヤヌスキナーゼ２）、ＣＹＰ３Ａ５（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド５）、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＣＣＬ３（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３）、ＭＹＤ８８（ミエロイド分化一次応答遺伝子（８８））、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）、ＳＯＡＴ１（ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ１）、ＡＤＲＢＫ１（アドレナリン作動性、β、受容体キナーゼ１）、ＮＲ４Ａ２（核内受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２）、ＭＭＰ８（マトリックスメタロペプチダーゼ８（好中球コラゲナーゼ））、ＮＰＲ２（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ／グアニル酸シクラーゼＢ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ））、ＧＣＨ１（ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１）、ＥＰＲＳ（グルタミル−プロリル−ｔＲＮＡシンテターゼ）、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、コアクチベーター１α）、Ｆ１２（凝固第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子））、ＰＥＣＡＭ１（血小板／内皮細胞接着分子）、ＣＣＬ４（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー３）、ＣＡＳＲ（カルシウム感知受容体）、ＧＪＡ５（ギャップ結合タンパク質、α５、４０ｋＤａ）、ＦＡＢＰ２（脂肪酸結合タンパク質２、腸）、ＴＴＦ２（転写終結因子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、ＰＲＯＳ１（プロテインＳ（α））、ＣＴＦ１（カルジオトロフィン１）、ＳＧＣＢ（サルコグリカン、β（４３ｋＤａジストロフィン関連糖タンパク質））、ＹＭＥ１Ｌ１（ＹＭＥ１様１（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＣＡＭＰ（カテリシジン抗菌ペプチド）、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ）、ＡＫＲ１Ｂ１（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＢ１（アルドースレダクターゼ））、ＤＥＳ（デスミン）、ＭＭＰ７（マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮））、ＡＨＲ（アリール炭化水素受容体）、ＣＳＦ１（コロニー刺激因子１（マクロファージ））、ＨＤＡＣ９（ヒストン脱アセチル化酵素９）、ＣＴＧＦ（結合組織成長因子）、ＫＣＮＭＡ１（大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル、サブファミリーＭ、αメンバー１）、ＵＧＴ１Ａ（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ複合遺伝子座）、ＰＲＫＣＡ（プロテインキナーゼＣ、α）、ＣＯＭＴ（カテコール−β−メチルトランスフェラーゼ）、Ｓ１００Ｂ（Ｓ１００カルシウ
ム結合タンパク質Ｂ）、ＥＧＲ１（初期増殖応答１）、ＰＲＬ（プロラクチン）、ＩＬ１５（インターロイキン１５）、ＤＲＤ４（ドーパミン受容体Ｄ４）、ＣＡＭＫ２Ｇ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩγ）、ＳＬＣ２２Ａ２（溶質輸送担体ファミリー２２（有機カチオントランスポーター）、メンバー２）、ＣＣＬ１１（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１）、ＰＧＦ（Ｂ３２１胎盤成長因子）、ＴＨＰＯ（トロンボポエチン）、ＧＰ６（糖タンパク質ＶＩ（血小板））、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、ＮＴＳ（ニューロテンシン）、ＨＮＦ１Ａ（ＨＮＦ１ホメオボックスＡ）、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＫＣＮＤ１（カリウム電位開口型チャネル、Ｓｈａｌ関連サブファミリー、メンバー１）、ＬＯＣ６４６６２７（ホスホリパーゼ阻害因子）、ＴＢＸＡＳ１（トロンボキサンＡシンターゼ１（血小板））、ＣＹＰ２Ｊ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＪ、ポリペプチド２）、ＴＢＸＡ２Ｒ（トロンボキサンＡ２受容体）、ＡＤＨ１Ｃ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）、γポリペプチド）、ＡＬＯＸ１２（アラキドン酸１２−リポキシゲナーゼ）、ＡＨＳＧ（α−２−ＨＳ−糖タンパク質）、ＢＨＭＴ（ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ）、ＧＪＡ４（ギャップ結合タンパク質、α４、３７ｋＤａ）、ＳＬＣ２５Ａ４（溶質輸送担体ファミリー２５（ミトコンドリア輸送担体；アデニンヌクレオチドトランスロケーター）、メンバー４）、ＡＣＬＹ（ＡＴＰクエン酸リアーゼ）、ＡＬＯＸ５ＡＰ（アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質）、ＮＵＭＡ１（核有糸分裂装置タンパク質１）、ＣＹＰ２７Ｂ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー２７、サブファミリーＢ、ポリペプチド１）、ＣＹＳＬＴＲ２（システイニルロイコトリエン受容体２）、ＳＯＤ３（スーパーオキシドジスムターゼ３、細胞外）、ＬＴＣ４Ｓ（ロイコトリエンＣ４シンターゼ）、ＵＣＮ（ウロコルチン）、ＧＨＲＬ（グレリン／オベスタチンプレプロペプチド）、ＡＰＯＣ２（アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ）、ＣＬＥＣ４Ａ（Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーＡ）、ＫＢＴＢＤ１０（ケルヒリピート及びＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有１０）、ＴＮＣ（テネイシンＣ）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼ）、ＳＨＣｌ（ＳＨＣ（Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有）形質転換タンパク質１）、ＬＲＰ１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）、ＳＯＣＳ３（サイトカインシグナル伝達のサプレッサー３）、ＡＤＨ１Ｂ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｂ（クラスＩ）、βポリペプチド）、ＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ３）、ＨＳＤ１１Ｂ１（ヒドロキシステロイド（１１−β）デヒドロゲナーゼ１）、ＶＫＯＲＣ１（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット１）、ＳＥＲＰＩＮＢ２（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２）、ＴＮＳ１（テンシン１）、ＲＮＦ１９Ａ（リングフィンガータンパク質１９Ａ）、ＥＰＯＲ（エリスロポエチン受容体）、ＩＴＧＡＭ（インテグリン、αＭ（補体成分３受容体３サブユニット））、ＰＩＴＸ２（ペアード様ホメオドメイン２）、ＭＡＰＫ７（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ７）、ＦＣＧＲ３Ａ（ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性１１１ａ、受容体（ＣＤ１６ａ））、ＬＥＰＲ（レプチン受容体）、ＥＮＧ（エンドグリン）、ＧＰＸ１（グルタチオンペルオキシダーゼ１）、ＧＯＴ２（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２、ミトコンドリア（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ２））、ＨＲＨ１（ヒスタミン受容体Ｈ１）、ＮＲ１１２（核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）、ＣＲＨ（コルチコトロピン放出ホルモン）、ＨＴＲ１Ａ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ａ）、ＶＤＡＣ１（電位依存性アニオンチャネル１）、ＨＰＳＥ（ヘパラナーゼ）、ＳＦＴＰＤ（サーファクタントタンパク質Ｄ）、ＴＡＰ２（トランスポーター２、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ））、ＲＮＦ１２３（リングフィンガータンパク質１２３）、ＰＴＫ２Ｂ（ＰＴＫ２Ｂプロテインチロシンキナーゼ２β）、ＮＴＲＫ２（神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、２型）、ＩＬ６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ（Ｙｔ血液型））、ＧＬＰ１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）、ＧＨＲ（成長ホルモン受容体）、ＧＳＲ（グルタチオンレダクターゼ）、ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１）、ＮＲ５Ａ１（核内受容体サブファミリー５、グループＡ、メンバー１）、ＧＪＢ２（ギャップ結合タンパク質、β２、２６ｋＤａ）、ＳＬＣ９Ａ１（溶質輸送担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー１）、ＭＡＯＡ（モノアミンオキシダーゼＡ）、ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩａ、受容体（ＣＤ３２））、ＳＥＲＰＩＮＦ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＦ（α−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー１）、ＥＤＮ３（エンドセリン３）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＧＡＳ６（成長停止特異的６）、ＳＭＰＤ１（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１、酸性リソソーム）、ＵＣＰ２（脱共役タンパク質２（ミトコンドリア、プロトン担体））、ＴＦＡＰ２Ａ（転写因子ＡＰ−２α（活性化エンハンサー結合タンパク質２α））、Ｃ４ＢＰＡ（補体成分４結合タンパク質、α）、ＳＥＲＰＩＮＦ２（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＦ（α−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー２）、ＴＹＭＰ（チミジンホスホリラーゼ）、ＡＬＰＰ（アルカリホスファターゼ、胎盤（リーガン（Ｒｅｇａｎ）アイソザイム））、ＣＸＣＲ２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２）、ＳＬＣ３９Ａ３（溶質輸送担体ファミリー３９（亜鉛トランスポーター）、メンバー３）、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー２）、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ）、ＪＡＫ３（ヤヌスキナーゼ３）、ＨＳＰＡ１Ａ（熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ）、ＦＡＳＮ（脂肪酸シンターゼ）、ＦＧＦ１（線維芽細胞成長因子１（酸性））、Ｆ１１（凝固第ＸＩ因子）、ＡＴＰ７Ａ（ＡＴＰアーゼ、Ｃｕ＋＋輸送、αポリペプチド）、ＣＲ１（補体成分（３ｂ／４ｂ）受容体１（Ｋｎｏｐｓ血液型））、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＲＯＣＫ１（Ｒｈｏ関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ１）、ＭＥＣＰ２（メチルＣｐＧ結合タンパク質２（レット症候群））、ＭＹＬＫ（ミオシン軽鎖キナーゼ）、ＢＣＨＥ（ブチリルコリンエステラーゼ）、ＬＩＰＥ（リパーゼ、ホルモン感受性）、ＰＲＤＸ５（ペルオキシレドキシン５）、ＡＤＯＲＡ１（アデノシンＡ１受容体）、ＷＲＮ（ウェルナー症候群、ＲｅｃＱヘリカーゼ様）、ＣＸＣＲ３（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体３）、ＣＤ８１（ＣＤ８１分子）、ＳＭＡＤ７（ＳＭＡＤファミリーメンバー７）、ＬＡＭＣ２（ラミニン、γ２）、ＭＡＰ３Ｋ５（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ５）、ＣＨＧＡ（クロモグラニンＡ（副甲状腺分泌タンパク質１））、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドポリペプチド）、ＲＨＯ（ロドプシン）、ＥＮＰＰ１（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１）、ＰＴＨＬＨ（副甲状腺ホルモン様ホルモン）、ＮＲＧ１（ニューレグリン１）、ＶＥＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、ＥＮＰＥＰ（グルタミルアミノペプチダーゼ（アミノペプチダーゼＡ））、ＣＥＢＰＢ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、β）、ＮＡＧＬＵ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−）、Ｆ２ＲＬ３（凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体様３）、ＣＸ３ＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）リガンド１）、ＢＤＫＲＢ１（ブラジキニン受容体Ｂ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３（トロンボスポンジン１型モチーフを有するＡＤＡＭメタロペプチダーゼ、１３）、ＥＬＡＮＥ（エラスターゼ、好中球発現）、ＥＮＰＰ２（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ２）、ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）、ＧＡＳＴ（ガストリン）、ＭＹＯＣ（ミオシリン、小柱網誘導性グルココルチコイド応答）、ＡＴＰ１Ａ２（ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送、α２ポリペプチド）、ＮＦ１（ニューロフィブロミン１）、ＧＪＢ１（ギャップ結合タンパク質、β１、３２ｋＤａ）、ＭＥＦ２Ａ（筋細胞エンハンサー因子２Ａ）、ＶＣＬ（ビンキュリン）、ＢＭＰＲ２（骨形成タンパク質受容体、ＩＩ型（セリン／スレオニンキナーゼ））、ＴＵＢＢ（チューブリン、β）、ＣＤＣ４２（細胞分裂周期４２（ＧＴＰ結合タンパク質、２５ｋＤａ））、ＫＲＴ１８（ケラチン１８）、ＨＳＦ１（熱ショック転写因子１）、ＭＹＢ（ｖ−ｍｙｂ骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＰＲＫＡＡ２（プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化、α２触媒サブユニット）、ＲＯＣＫ２（Ｒｈｏ関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ２）、ＴＦＰＩ（組織因子経路阻害因子（リポタンパク質関連凝固阻害因子））、ＰＲＫＧ１（プロテインキナーゼ、ｃＧＭＰ依存性、Ｉ型）、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）、ＣＴＮＮＤ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、δ１）、ＣＴＨ（シスタチオナーゼ（シスタチオニンγ−リアーゼ））、ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）、ＶＡＶ２（ｖａｖ ２グアニンヌクレオチド交換因子）、ＮＰＹ２Ｒ（ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様成長因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ）、ＣＤ２８（ＣＤ２８分子）、ＧＳＴＡ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ＡＰＯＨ（アポリポタンパク質Ｈ（β−２−糖タンパク質Ｉ））、Ｓ１００Ａ８（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８）、ＩＬ１１（インターロイキン１１）、ＡＬＯＸ１５（アラキドン酸１５−リポキシゲナーゼ）、ＦＢＬＮ１（フィビュリン１）、ＮＲ１Ｈ３（核内受容体サブファミリー１、グループＨ、メンバー３）、ＳＣＤ（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（Δ−９−デサチュラーゼ））、ＧＩＰ（胃抑制ポリペプチド）、ＣＨＧＢ（クロモグラニンＢ（セクレトグラニン１））、ＰＲＫＣＢ（プロテインキナーゼＣ、β）、ＳＲＤ５Ａ１（ステロイド−５−アルファ−レダクターゼ、αポリペプチド１（３−オキソ−５α−ステロイドΔ４−デヒドロゲナーゼα１））、ＨＳＤ１１Ｂ２（ヒドロキシステロイド（１１−β）デヒドロゲナーゼ２）、ＣＡＬＣＲＬ（カルシトニン受容体様）、ＧＡＬＮＴ２（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２））、ＡＮＧＰＴＬ４（アンギオポエチン様４）、ＫＣＮＮ４（カリウム中間体／小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４）、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ（ホスホイノシチド−３−キナーゼ、クラス２、αポリペプチド）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、ＣＹＰ７Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー７、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＨＬＡ−ＤＲＢ５（主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩ、ＤＲ β ５）、ＢＮＩＰ３（ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３）、ＧＣＫＲ（グルコキナーゼ（ヘキソキナーゼ４）調節因子）、Ｓ１００Ａ１２（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２）、ＰＡＤＩ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、ＩＶ型）、ＨＳＰＡ１４（熱ショック７０ｋＤａタンパク質１４）、ＣＸＣＲ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１）、Ｈ１９（Ｈ１９、刷り込み母性発現転写物（非タンパク質コード））、ＫＲＴＡＰ１９−３（ケラチン関連タンパク質１９−３）、ＩＤＤＭ２（インスリン依存性真性糖尿病２）、
ＲＡＣ２（ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２（ｒｈｏファミリー、低分子ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ２））、ＲＹＲ１（リアノジン受容体１（骨格））、ＣＬＯＣＫ（時計ホモログ（マウス））、ＮＧＦＲ（神経成長因子受容体（ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１６））、ＤＢＨ（ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ドーパミンβ−モノオキシゲナーゼ））、ＣＨＲＮＡ４（コリン作動性受容体、ニコチン性、α４）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（カルシウムチャネル、電位依存性、Ｌ型、α１Ｃサブユニット）、ＰＲＫＡＧ２（プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化、γ２非触媒サブユニット）、ＣＨＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、ＰＴＧＤＳ（プロスタグランジンＤ２シンターゼ２１ｋＤａ（脳））、ＮＲ１Ｈ２（核内受容体サブファミリー１、グループＨ、メンバー２）、ＴＥＫ（ＴＥＫチロシンキナーゼ、内皮）、ＶＥＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、ＭＥＦ２Ｃ（筋細胞エンハンサー因子２Ｃ）、ＭＡＰＫＡＰＫ２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ａ、ＮＦＫＢアクチベータ）、ＨＳＰＡ９（熱ショック７０ｋＤａタンパク質９（モルタリン））、ＣＹＳＬＴＲ１（システイニルロイコトリエン受容体１）、ＭＡＴ１Ａ（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩ、α）、ＯＰＲＬ１（オピエート受容体様１）、ＩＭＰＡ１（イノシトール（ｍｙｏ）−１（又は４）−モノホスファターゼ１）、ＣＬＣＮ２（クロライドチャネル２）、ＤＬＤ（ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ）、ＰＳＭＡ６（プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン（ｍａｃｒｏｐａｉｎ））サブユニット、α型、６）、ＰＳＭＢ８（プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、β型、８（大型多機能ペプチダーゼ７））、ＣＨＩ３Ｌ１（キチナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９））、ＡＬＤＨ１Ｂ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＢ１）、ＰＡＲＰ２（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ２）、ＳＴＡＲ（ステロイド産生急性調節タンパク質）、ＬＢＰ（リポ多糖結合タンパク質）、ＡＢＣＣ６（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ）、メンバー６）、ＲＧＳ２（Ｇタンパク質シグナル伝達の調節因子２、２４ｋＤａ）、ＥＦＮＢ２（エフリン−Ｂ２）、ＧＪＢ６（ギャップ結合タンパク質、β６、３０ｋＤａ）、ＡＰＯＡ２（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ）、ＡＭＰＤ１（アデノシン一リン酸デアミナーゼ１）、ＤＹＳＦ（ジスフェリン、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（常染色体劣性遺伝））、ＦＤＦＴ１（ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ１）、ＥＤＮ２（エンドセリン２）、ＣＣＲ６（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６）、ＧＪＢ３（ギャップ結合タンパク質、β３、３１ｋＤａ）、ＩＬ１ＲＬ１（インターロイキン１受容体様１）、ＥＮＴＰＤ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１）、ＢＢＳ４（バルデー−ビードル症候群４）、ＣＥＬＳＲ２（カドヘリン、ＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通型Ｇ型受容体２（フラミンゴホモログ、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、Ｆ１１Ｒ（Ｆ１１受容体）、ＲＡＰＧＥＦ３（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）３）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）、ＺＮＦ２５９（ジンクフィンガータンパク質２５９）、ＡＴＯＸ１（ＡＴＸ１抗酸化タンパク質１ホモログ（酵母））、ＡＴＦ６（活性化転写因子６）、ＫＨＫ（ケトヘキソキナーゼ（フルクトキナーゼ））、ＳＡＴ１（スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ１）、ＧＧＨ（γ−グルタミルヒドロラーゼ（コンジュガーゼ、ホリルポリγグルタミルヒドロラーゼ））、ＴＩＭＰ４（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子４）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質輸送担体ファミリー４、ナトリウム・炭酸水素イオン共輸送体、メンバー４）、ＰＤＥ２Ａ（ホスホジエステラーゼ２Ａ、ｃＧＭＰ刺激性）、ＰＤＥ３Ｂ（ホスホジエステラーゼ３Ｂ、ｃＧＭＰ阻害性）、ＦＡＤＳ１（脂肪酸デサチュラーゼ１）、ＦＡＤＳ２（脂肪酸デサチュラーゼ２）、ＴＭＳＢ４Ｘ（チモシンβ４、Ｘ連鎖）、ＴＸＮＩＰ（チオレドキシン相互作用タンパク質）、ＬＩＭＳ１（ＬＩＭ及び老化細胞抗原様ドメイン１）、ＲＨＯＢ（ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＢ）、ＬＹ９６（リンパ球抗原９６）、ＦＯＸＯ１（フォークヘッドボックスＯ１）、ＰＮＰＬＡ２（パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有２）、ＴＲＨ（サイロトロピン放出ホルモン）、ＧＪＣ１（ギャップ結合タンパク質、γ１、４５ｋＤａ）、ＳＬＣ１７Ａ５（溶質輸送担体ファミリー１７（アニオン／糖輸送体）、メンバー５）、ＦＴＯ（体脂肪量及び肥満関連）、ＧＪＤ２（ギャップ結合タンパク質、δ２、３６ｋＤａ）、ＰＳＲＣ１（プロリン／セリンリッチコイルドコイル１）、ＣＡＳＰ１２（カスパーゼ１２（遺伝子／偽遺伝子））、ＧＰＢＡＲ１（Ｇタンパク質共役型胆汁酸受容体１）、ＰＸＫ（ＰＸドメイン含有セリン／スレオニンキナーゼ）、ＩＬ３３（インターロイキン３３）、ＴＲＩＢ１（トリブルズ（ｔｒｉｂｂｌｅｓ）ホモログ１（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＰＢＸ４（プレＢ細胞白血病ホメオボックス４）、ＮＵＰＲ１（核タンパク質、転写調節因子、１）、１５−Ｓｅｐ（１５ｋＤａ セレノプロテイン）、ＣＩＬＰ２（軟骨中間層タンパク質２）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ構成成分）、ＧＧＴ２（γ−グルタミルトランスフェラーゼ２）、ＭＴ−ＣＯ１（ミトコンドリアにコードされたシトクロムｃオキシダーゼＩ）、及びＵＯＸ（尿酸オキシダーゼ、偽遺伝子）を含み得る。
さらなる実施形態において、染色体配列は、Ｐｏｎ１（パラオキソナーゼ１）、ＬＤＬＲ（ＬＤＬ受容体）、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＡｐｏＢ−１００（アポリポタンパク質Ｂ−１００）、ＡｐｏＡ（アポリポタンパク質（ａ））、ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）、ＣＢＳ（シスタチオニン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）Ｂ−シンターゼ）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩｂ、ＭＴＨＲＦ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＮＡＤＰＨ）、及びそれらの組み合わせからさらに選択され得る。一つの反復では、心血管疾患に関与する染色体配列及び染色体配列によりコードされるタンパク質は、Ｃａｃｎａ１Ｃ、Ｓｏｄ１、Ｐｔｅｎ、Ｐｐａｒ（α）、ＡｐｏＥ、レプチン、及びそれらの組み合わせから選択され得る。
肺
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の肺に送達することも企図する。
当初はＡＡＶ−２ベースのベクターがＣＦ気道に対するＣＦＴＲ送達に提案されたが、他の血清型、例えばＡＡＶ−１、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、及びＡＡＶ−９が種々の肺上皮モデルにおいて遺伝子導入効率の向上を呈している（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７−２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照のこと）。ＡＡＶ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞の形質導入効率がＡＡＶ−２及びＡＡＶ−５と比べて約１００倍高く５、しかしながらマウス気管気道上皮についてはＡＡＶ−１はｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶ−５と同等の効率で形質導入したことが実証された。他の試験では、ＡＡＶ−５はＡＡＶ−２と比べてｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮（ＨＡＥ）に対する遺伝子送達の効率が５０倍高く、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス肺気道上皮における効率が有意に高いことが示されている。ＡＡＶ−６もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞及びｉｎ ｖｉｖｏでのマウス気道における効率がＡＡＶ−２と比べて高いことが示されている８。最近の分離株ＡＡＶ−９は、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス鼻上皮及び肺胞上皮においてＡＡＶ−５より高い遺伝子導入効率を呈することが示され、９ヶ月間にわたり遺伝子発現が検出されたことから、ＣＦＴＲ遺伝子送達ベクターにとって望ましい特性であるｉｎ ｖｉｖｏでの長期遺伝子発現がＡＡＶで実現し得ることが示唆される。さらに、ＡＡＶ−９は、ＣＦＴＲ発現の損失なしに且つ免疫学的帰結を最小限に抑えてマウス肺に再投与し得ることが実証された。ＣＦ及び非ＣＦ ＨＡＥ培養物の頂端表面に１００μｌのＡＡＶベクターを数時間接種し得る（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７−２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照のこと）。ＭＯＩは、ウイルス濃度及び実験の目的に応じて１×１０３から４×１０５ベクターゲノム／細胞まで異なり得る。上記に引用したベクターは、本発明の送達及び／又は投与に企図される。
Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ Ｖｏｌ １８３．ｐｐ ５３１−５３８，２０１１）は、ヒト感染症の治療に対するＲＮＡ干渉治療薬の適用例、及びまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した肺移植レシピエントにおける抗ウイルス薬の無作為化試験を報告した。Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．は、ＲＳＶ気道感染症のＬＴＸレシピエントにおける無作為化二重盲検プラセボ対照試験を実施した。患者はＲＳＶに対する標準治療を受けることが許された。エアロゾル化したＡＬＮ−ＲＳＶ０１（０．６ｍｇ／ｋｇ）又はプラセボが毎日、３日間にわたり投与された。この試験は、ＲＳＶを標的化するＲＮＡｉ治療薬をＲＳＶ感染症のＬＴＸレシピエントに安全に投与し得ることを実証している。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の３回の１日用量は、気道症状の増悪又は肺機能障害をもたらさず、且つサイトカイン又はＣＲＰの誘導などの全身性の炎症誘発効果を呈しなかった。薬物動態が吸入後に僅かな低い一過性の全身曝露を示したが、これは、静脈内投与されるか又は吸入により投与されたＡＬＮ−ＲＳＶ０１がエキソヌクレアーゼ媒介性の消化及び腎排泄によって循環から急速に消失することを示す前臨床動物データと一致している。Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．の方法は本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができ、本発明にはエアロゾル化したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを例えば０．６ｍｇ／ｋｇの投薬量で企図することができる。
ＣＦＴＲΔ５０８キメラガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用した、嚢胞性線維症又は嚢胞性線維症（ＣＦ）関連症状に罹患している、必要性のある対象又は患者の気道におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子導入又は遺伝子送達に用いられている。この修復戦略は、嚢胞性線維症ΔＦ５０８突然変異に対する使用を例示している。この種の戦略は全生物にわたり適用されるはずである。特にＣＦに関連して、好適な患者には以下が含まれ得る：ヒト、非霊長類ヒト（ｎｏｎ−ｐｒｉｍａｔｅ ｈｕｍａｎ）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及び他の家畜。出願者らはＣａｓ９酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してΔＦ５０８又は他のＣＦＴＲ誘発突然変異を標的化した。
この例における治療対象は、自発呼吸下で各肺につき薬学的有効量のエアロゾル化ＡＡＶベクター系の気管支内送達を受ける。このように、エアロゾル化送達は、一般にＡＡＶ送達に好ましい。送達にはアデノウイルス又はＡＡＶ粒子が用いられ得る。各々が１つ以上の調節配列に機能的に連結している好適な遺伝子構築物を送達ベクターにクローニングし得る。この例では、以下の構築物が例として提供される：Ｃａｓ９に対するＣｂｈ又はＥＦ１ａプロモーター、キメラガイドＲＮＡに対するＵ６又はＨ１プロモーター）：好ましい構成は、ＣＦＴＲΔ５０８を標的化するキメラガイド、ΔＦ５０８突然変異の修復鋳型及びコドン最適化されたＣａｓ９酵素（好ましいＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を有するものである）を、場合により１つ以上の核局在化シグナル又は配列（ＮＬＳ）、例えば２つのＮＬＳを伴い使用することである。ＮＬＳを含まない構築物もまた想定される。
Ｃａｓ９標的部位を同定するため、出願者らはヒトＣＦＴＲゲノム遺伝子座を解析し、Ｃａｓ９標的部位を同定した。好ましくは、一般に、及びこのＣＦの場合、ＰＡＭはＮＧＧ又はＮＮＡＧＡＡＷモチーフを含み得る。
従って、ＣＦの場合、本方法は、組成物を発現させるため組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作を含み、
ここでこの組成物は、
天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
（ａ）好適な哺乳類細胞におけるＣＦ標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、及び
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列が標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む。ＣＦに関して、好ましい標的ＤＮＡ配列はＣＦＴＲΔ５０８突然変異を含む。好ましいＰＡＭは上記に記載される。好ましいＣＲＩＳＰＲ酵素は任意のＣａｓである。ＣＦに代わるものとしては任意の遺伝的障害が挙げられ、その例は周知されている。本発明の別の好ましい方法又は使用は、ラフォラ病に関連することが特定されているＥＭＰ２Ａ及びＥＭＰ２Ｂ遺伝子の欠陥を修正するためのものである。
一部の実施形態では、「ガイド配列」は「ガイドＲＮＡ」と異なり得る。ガイド配列は、ガイドＲＮＡの範囲内にある、標的部位を特定する約２０ｂｐの配列を指し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳｐＣａｓ９である（又はそれから誘導される）。かかる実施形態において、好ましい突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位及び／又は９８６位又は他のＣａｓ９における対応する位置（これは例えば標準的な配列比較ツールによって確かめることができる）の一部又は全部にある。詳細には、ＳｐＣａｓ９において以下の突然変異の一部又は全部が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａ；並びに代替アミノ酸のいずれかの保存的置換も想定される。他のＣａｓ９の対応する位置におけるそれら（又はこれらの突然変異の保存的置換）もまた好ましい。特に、ＳｐＣａｓ９ではＤ１０及びＨ８４０が好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基もまた好ましい。これらはニッカーゼ活性を提供するため有利である。かかる突然変異は、ＣＦの治療のみならず、本発明の全ての態様に適用し得る。Ｓｃｈｗａｎｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１３：６５３−５８，２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してヒト幹細胞における嚢胞性線維症に関連する欠陥を修正した。このチームの標的は、イオンチャネル、嚢胞性線維症膜貫通コンダクター受容体（ＣＦＴＲ）の遺伝子であった。嚢胞性線維症患者においてはＣＦＴＲにおける欠失がタンパク質の誤った折り畳みを引き起こす。Ｓｃｈｗａｎｋ ｅｔ ａｌ．は、２人の嚢胞性線維症小児由来の細胞試料から生じさせた培養腸幹細胞を使用して、挿入しようとする修復配列を含有するドナープラスミドと共にＣＲＩＳＰＲを使用してこの欠陥を修正することができた。この研究者らは、次に細胞を腸の「オルガノイド」、即ち小型の腸に成長させ、それらが正常に機能することを示した。この例では、クローンオルガノイドの約半分に適切な遺伝的修正が起こった。
筋肉
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を筋肉に送達することも企図する。
Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１９ ｎｏ．１１，２０５５−２０６４ Ｎｏｖ．２０１１）は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）が発症した後のＦＲＧ１マウスにおけるＲＮＡ干渉発現カセットの全身送達が、毒性の徴候なしに用量依存的な長期ＦＲＧ１ノックダウンをもたらしたことを示している。Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．は、５×１０１２ｖｇのｒＡＡＶ６−ｓｈ１ＦＲＧ１の単回静脈注射がＦＲＧ１マウスの筋組織病理及び筋機能をレスキューすることを見出した。詳細には、生理溶液中に２×１０１２又は５×１０１２ｖｇのベクターを含有する２００μｌを、２５ゲージＴｅｒｕｍｏシリンジを使用して尾静脈に注入した。Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．の方法を、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するＡＡＶに適用し、約２×１０１５又は２×１０１６ｖｇのベクターの投薬量でヒトに注射し得る。
Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．５，８８１−８８７ Ｍａｙ ２０１０）は、ミオスタチン受容体ＡｃｖＲＩＩｂ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ｓｈ−ＡｃｖＲＩＩｂ）の技術を用いてミオスタチン経路を阻害する。ベクター化したＵ７エクソンスキッピング技法（Ｕ７−ＤＹＳ）により、擬似ジストロフィンの回復が媒介された。ｓｈ−ＡｃｖｒＩＩｂ構築物単独、Ｕ７−ＤＹＳ構築物単独、又は両方の構築物の組み合わせのいずれかを担持するアデノ随伴ベクターが、ジストロフィーｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に注射された。注射は１０１１個のＡＡＶウイルスゲノムで実施された。Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．の方法を、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するＡＡＶに適用し、例えば約１０１４〜約１０１５ｖｇのベクターの投薬量でヒトに注射し得る。
Ｋｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１１２６−１１３０）は、アテロコラーゲン（ＡＴＣＯＬ）を含む化学的に改変されていないｓｉＲＮＡのナノ粒子製剤を用いた正常又は罹患マウスの骨格筋へのｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ送達の有効性を報告する。骨格筋成長の負の調節因子であるミオスタチンを標的とするｓｉＲＮＡをマウス骨格筋又は静脈内にＡＴＣＯＬの媒介によって局所適用すると、投与後数週間以内に筋量の顕著な増加が生じた。これらの結果は、ＡＴＣＯＬの媒介によるｓｉＲＮＡの適用が、筋萎縮症を含む疾患に対するさらなる治療用途の強力なツールであることを含意する。Ｍｓｔ−ｓｉＲＮＡ（終濃度１０ｍＭ）がＡＴＣＯＬ（局所投与用の終濃度０．５％）（ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ、高研、東京、日本）と、製造者の指示に従い混合された。ネンブタール（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によるマウス（２０週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６）の麻酔後、Ｍｓｔ−ｓｉＲＮＡ／ＡＴＣＯＬ複合体が咀嚼筋及び大腿二頭筋に注射された。Ｋｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．の方法をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓに適用し、ヒトに対して例えば約５００〜１０００ｍｌの４０μＭ溶液の投薬量で筋肉に注射し得る。
Ｈａｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，Ａｕｇｕｓｔ ２００４）は、哺乳動物の四肢筋全体にわたる筋細胞（筋線維）に対する効率的且つ反復可能な核酸送達を可能にする血管内非ウイルス方法を記載している。この手順には、ターニケット又は血圧測定用カフで一過性に遮断した肢の遠位静脈へのネイキッドプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの注射が含まれる。筋線維に対する核酸送達は、筋組織中への核酸溶液の溢出を可能にするのに十分な容積で急速注入することにより促進される。小型動物及び大型動物の両方において、最小毒性で骨格筋における高度なトランス遺伝子発現が達成された。四肢筋に対するｓｉＲＮＡ送達のエビデンスもまた得られた。アカゲザルに対するプラスミドＤＮＡ静脈内注射では、各々単一のシリンジが装填された２つのシリンジポンプ（モデルＰＨＤ ２０００；Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に三方活栓が接続された。パパベリン注射後５分でｐＤＮＡ（４０〜１００ｍｌ生理食塩水中１５．５〜２５．７ｍｇ）が１．７又は２．０ｍｌ／秒の速度で注射された。これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するプラスミドＤＮＡ用にスケールアップして、ヒトについて８００〜２０００ｍｌ生理食塩水中約３００〜５００ｍｇの注射とし得る。ラットに対するアデノウイルスベクター注射では、３ｍｌの通常生理食塩水（ＮＳＳ）中２×１０９個の感染粒子が注射された。これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するアデノウイルスベクター用にスケールアップして、ヒトについて１０リットルのＮＳＳ中約１×１０１３個の感染粒子の注射とし得る。ｓｉＲＮＡに関しては、ラットは大伏在静脈に１２．５μｇのｓｉＲＮＡを注射され、霊長類は大伏在静脈に７５０μｇのｓｉＲＮＡを注射された。これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ用にスケールアップして、例えばヒトの大伏在静脈への約１５〜約５０ｍｇの注射とし得る。
皮膚
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を皮膚に送達することも企図する。Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１２９）は、ヒト及びマウス皮膚にセルフデリバリー（ｓｄ）ｓｉＲＮＡを送達するための電動マイクロニードルアレイ皮膚送達装置に関する。ｓｉＲＮＡベースの皮膚治療薬を臨床に移行させる際の主な課題は、有効な送達システムの開発である。種々の皮膚送達技術に多くの試みが投じられてきたが、成功は限られている。皮膚がｓｉＲＮＡで治療された臨床試験では、皮下針注射に伴う激痛のために試験におけるさらなる患者の登録が不可能となっており、改良された、より「患者に優しい」（即ち痛みがほとんど又は全くない）送達手法の必要性が浮き彫りとなっている。マイクロニードルは、ｓｉＲＮＡを含む大型の荷電カーゴを、最大の障壁である角質層を越えて送達する効率的な方法であり、概して従来の皮下針より痛みが少ないと考えられる。電動「スタンプ型」マイクロニードル装置は、Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によって使用された電動マイクロニードルアレイ（ＭＭＮＡ）装置を含め、無毛マウス試験で安全性が示されており、且つ（ｉ）化粧品業界での広範な使用、及び（ｉｉ）限られた試験でほぼ全てのボランティアがこの装置の使用はインフルエンザの予防接種と比べてはるかに痛みが少ないと認めたことからも明らかなとおり、痛みをほとんど又は全く引き起こさないため、この装置を使用したｓｉＲＮＡ送達により、皮下針注射を使用した先行臨床試験で経験されたものと比べて痛みがはるかに少なくなることが示唆される。ＭＭＮＡ装置（Ｂｏｍｔｅｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏ、ソウル、韓国からＴｒｉｐｌｅ−Ｍ又はＴｒｉ−Ｍとして市販されている）は、マウス及びヒト皮膚に対するｓｉＲＮＡの送達用に構成された。０．１ｍｍの深さに設定された、使い捨てＴｒｉ−Ｍ針カートリッジ（Ｂｏｍｔｅｃｈ）のチャンバに、ｓｄ−ｓｉＲＮＡ溶液（最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡ）が導入された。ヒト皮膚の治療に関しては、処置前に不特定の皮膚（外科手技後直ちに入手）が手で伸ばされ、コルク製プラットフォームにピンで留められた。皮内注射は全て、２８ゲージ０．５インチ針を備えるインスリンシリンジを使用して実施された。Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．のＭＭＮＡ装置及び方法は、例えば皮膚に対して最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量で、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に使用し及び／又は適合させることができる。
Ｌｅａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１８ ｎｏ．２，４４２−４４６ Ｆｅｂ．２０１０）は、第１の低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ベースの皮膚用治療薬を利用した、生活に支障をきたす程の足底角皮症を含む常染色体優性症候群であるまれな皮膚障害の先天性爪肥厚症（ＰＣ）の治療に関する第Ｉｂ相臨床試験に関する。ＴＤ１０１と呼ばれるこのｓｉＲＮＡは、野生型Ｋ６ａ ｍＲＮＡには影響を及ぼすことなくケラチン６ａ（Ｋ６ａ）Ｎ１７１Ｋ突然変異ｍＲＮＡを特異的且つ強力に標的化する。以下に用量漸増スケジュールを提供する：
最初に、ＴＤ１０１又はビヒクル単独（カルシウム又はマグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）の０．１ｍｌの１．０ｍｇ／ｍｌ溶液が対称性の胼胝に投与された。６つの漸増用量容積が完了し、増加に対する有害反応はなかった：注射１回当たり０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、及び２．０ｍｌのＴＤ１０１溶液の１．０ｍｇ／ｍｌ溶液。計画された最大容積（２．０ｍｌ）で十分な忍容性が示されたため、次にＴＤ１０１の濃度を１ｍｇ／ｍｌから８．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に至るまで毎週増加させた。同様の投薬量が、ケラチン６ａ（Ｋ６ａ）Ｎ１７１Ｋ突然変異ｍＲＮＡを特異的且つ強力に標的化するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投与に企図される。
Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｊｕｌｙ ２４，２０１２，ｖｏｌ．１０９，ｎｏ．３０，１１９７５−１１９８０）は、金コアが高配向の共有結合的に固定化されたｓｉＲＮＡの高密度シェルに取り囲まれている球状核酸ナノ粒子コンジュゲート（ＳＮＡ−ＮＣ）が、適用後数時間以内にｉｎ ｖｉｔｒｏのケラチノサイト、マウス皮膚、及びヒト表皮のほぼ１００％を自在に通り抜けることを示している。Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．が実証したところによれば、６０時間にわたる２５ｎＭ上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＳＮＡ−ＮＣの単回適用がヒト皮膚における有効な遺伝子ノックダウンを実証する。同様の投薬量が、皮膚に対する投与についてＳＮＡ−ＮＣに固定化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓに企図される。
核酸、アミノ酸、及びタンパク質、調節配列、ベクターなど
核酸、アミノ酸、及びタンパク質：本発明は、標的ＤＮＡ配列に結合する核酸を使用する。これは、核酸がタンパク質よりも作製するのが遥かに容易で安価であるため有利であり、特異性は、相同性が求められる伸長の長さによって異なり得る。例えば、複数のフィンガーの複雑な３Ｄ位置決めを行う必要がない。「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換的に使用される。これらの語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体のポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、かつ既知又は未知の任意の機能を果たし得る。次に示すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって決定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この語はまた、合成主鎖を有する核酸様構造も包含する。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；同第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの構築の前又は後で行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合の後に、例えば、標識構成成分との接合によりさらに修飾することができる。本明細書で使用される「野生型」という語は、当業者によって理解される語であり、突然変異型又は変異型とは区別される、天然に存在する典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用される「変異体」という語は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の提示を意味すると解釈するべきである。「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」という語は、互換的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この語は、核酸分子又はポリペプチドについてである場合、核酸分子又はポリペプチドが、自然では自然に結合し、かつ自然で見られる少なくとも１つの他の構成成分から少なくとも実質的に解放されていることを意味する。「相補性」とは、従来のワトソン−クリック塩基対形成又は他の非従来型によって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力のことである。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０がそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」という語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指す、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件のことである。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、因子の数によって異なる。一般に、配列が長ければ長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列について述べられる場合、相補的な配列又は部分的に相補的な配列も想定される。これらは、好ましくは、高ストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリダイズすることができる。一般に、ハイブリダイゼーション率を最大化するために、比較的低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される：熱融点（Ｔｍ）よりも低い約２０〜２５℃。このＴｍは、特定の標的配列の５０％が、規定イオン強度及びｐＨで、溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を必要とするため、高ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔｍよりも低い約５〜１５℃であるように選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を必要とするため、中ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔｍよりも低い約１５〜３０℃であるように選択される。高い許容の（非常に低いストリンジェントな）洗浄条件は、Ｔｍよりも低い５０℃であり得、ハイブリダイズした配列間の高レベルのミスマッチが許容される。当業者であれば、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的なパラメーターも、標的配列とプローブ配列との間の特定のレベルの相同性からの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるように変更できることが分かるであろう。好ましい高ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳ中、４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳでの６５℃の洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定した複合体を形成する反応のことである。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又はその他の配列特異的な方法によって起こり得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多数鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲のプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断における１つのステップを構成し得る。所与の配列にハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」（複数形も含む）という語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの伸長、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子単位の遺伝であるＲＮＡ鎖のことである。本発明の目的のために、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、このような調節配列を含むと見なすことができる。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域を含む。本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に使用されるプロセスである。遺伝子発現の産物は、多くの場合タンパク質であるが、非タンパク質コード遺伝子、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子の場合は、産物は機能的ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、全ての既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及び生存する機能的産物を産生するウイルスによって使用される。本明細書で使用される遺伝子又は核酸の「発現」は、細胞での遺伝子発現だけではなく、クローニング系及びその他の関連における核酸の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用される「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスである。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、線状又は分岐であり得、修飾アミノ酸を含み得、かつ非アミノ酸によって中断され得る。この語はまた、修飾；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の処置、例えば、標識成分との接合がなされたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は天然に存在しない若しくは合成アミノ酸を含む。本明細書で使用される「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」という語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立に存在して機能し得るタンパク質配列の部分を指す。本発明の態様で説明されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、肉眼で、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの支援で行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、かつ２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列によって共有される配列同一性を計算することもできる。一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるｄＴＡＬＥのキャッピング領域は、本明細書で提供されるキャッピング領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性又は共有同一性である配列を有する。配列相同性は、当該技術分野で公知の多数のコンピュータープログラムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって作成することができる。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３
−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は、連続する配列に対して計算することができる、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列における各アミノ酸又はヌクレオチドが、他方の配列における対応するアミノ酸又はヌクレオチドと、一度に１つの残基が直接比較される。これは、「無ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このような無ギャップアラインメントは、比較的少数の残基に対してのみ行われる。これは、非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、その他が同一の配列の対でも、１つの挿入又は欠失によって続くアミノ酸残基がアラインメントから外れ、従って全アラインメントが行われたときに相同性（％）が大幅に低下する可能性があることを考慮できない。結果として、殆どの配列比較法は、起こり得る挿入及び欠失を、全体の相同性又は同一性スコアに著しいペナルティーを課すことなく考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、局所相同性又は同一性を最大にするように配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てて、同数の同一アミノ酸の場合、ギャップが最少の配列アラインメントは、２つの比較される配列間の高い関連性を反映し、ギャップが多い配列よりも高いスコアを獲得することができる。典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを付与し、ギャップにおける各連続する残基に小さいペナルティーを付与する「親和性ギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップの少ない最適化アラインメントを作成することができる。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列の比較にこのようなソフトウェアを使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、１つのギャップが−１２、各伸長が−４である。従って、最大％相同性の計算はまず、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作成を必要とする。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７−８、及び米国の国立衛生研究所のウェブサイトに記載のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを参照されたい）。最終％相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体が、典型的には、オール・オア・ナッシングの対比較に基づくものではない。むしろ、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が使用される。一般的に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、又はカスタム記号比較表が提供される場合はこれを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージにはパブリックデフォルト値、又は他のソフトウェアでは、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。別法として、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数のアラインメントの特徴を用いて計算することができる。このソフトウェアが、最適なアラインメントを作成したら、％相同性、好ましくは、％配列同一性を計算することが可能である。このソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として、数値結果を出す。配列は、サイレント変化を生じさせて機能的に同等の物質にする、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換を、アミノ酸特性の類似性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性）に基づいて行うことができ、従って、この計画的なアミノ酸置換は、アミノ酸を官能基に分類するのに有用である。アミノ酸は、その側鎖のみの特性に基づいて分類することができる。しかしながら、突然変異のデータも含めるとより有用である。従って、このように得られたアミノ酸のセットは、構造的理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形式で示すことができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的な置換は、例えば、一般に許容されるアミノ酸分類のベン図を示す下表に従って行うことができる。
本発明の実施形態は、相同置換（本明細書では、置換及び交換は共に、既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドの別のアミノ酸残基又はヌクレオチドでの置き換えを指すために用いられる）を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含み、この相同置換は、即ち、アミノ酸の場合は同種置換、例えば、塩基性の塩基性での置換、酸性の酸性での置換、極性の極性での置換などが起こり得る。非相同置換、即ち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいは天然に存在しないアミノ酸、例えば、オルニチン（以降、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以降、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンの取り込みを伴う置換も起こり得る。変異アミノ酸配列は、配列のいずれか２つのアミノ酸残基間に適切なスペーサー基を含み得、このスペーサー基には、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ−アラニン残基に加えて、アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、又はプロピル基が含まれる。ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う変異のさらなる形態は、当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなくその残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指すために用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製プロセスは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１、及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４を参照されたい。
本発明の目的では、増幅は、十分な忠実性で標的配列を複製することができるプライマー及びポリメラーゼを利用する任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片、及び逆転写酵素によって行うことができる。好ましい増幅法はＰＣＲである。
ある態様では、本発明はベクターに関係する。本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移送を可能にする又は促進するツールである。レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて、この挿入されたセグメントを複製することができる。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントに結合されると複製を行うことができる。一般に、「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドを含む。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは、例えば、標準的な分子クローニング技術によって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループのことである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためにウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。あるベクターは、導入された宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができる、即ち、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択できる、１つ以上の調節エレメントを含む。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又はベクターが導入された宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されたことを意味するものとする。組換え法及びクローニング法については、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に記載されている。
本発明の態様は、キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性ベクターに関する。キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般に、そして特にこの実施形態では、Ｃａｓ９が、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによって駆動される。キメラＲＮＡは、好ましくは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターによって駆動され得る。理想的には、この２つのプロモーターが組み合わせられる。キメラガイドＲＮＡは、典型的には、２０ｂｐのガイド配列（Ｎｓ）からなり、これは、ｔｒａｃｒ配列（下鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端まで延びている）に接続することができる。ｔｒａｃｒ配列は、示されているように様々な位置で切断することができる。ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡであり得るｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列によって分離されている。このｔｒａｃｒ配列には、図示されているループ配列ＧＡＡＡが続き得る。これらは共に、好ましい例である。本出願人らは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介挿入欠失を実証している。ＣｈｉＲＮＡは、その「＋ｎ」指定によって示され、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。本出願全体において、キメラＲＮＡは、単一ガイド、又は合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれることがある。ループは、好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列、又は僅か４ｂｐの長さに限定されるものではない。実際、ヘアピン構造に使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、これよりも長い又は短いループ配列を使用することができ、これらは代替の配列とすることができる。この配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び追加のヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例として、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。本明細書に開示の任意の方法の実施において、適切なベクターを、当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に導入することができ、このような方法には、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光トランスフェクション、専売薬剤で促進される核酸の取り込み、及びリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンによる送達が含まれる。一部の方法では、ベクターは、マイクロインジェクションによって胚に導入され得る。１つ又は複数のベクターは、胚の核又は細胞質に導入され得る。一部の方法では、１つ又は複数のベクターは、ヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
「調節エレメント」という語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ−Ｕ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントは、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する調節エレメント、及び特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を誘導する調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を誘導し得る。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に、又は発生段階依存的に発現を誘導することができ、この誘導は、組織特異的又は細胞型特異的であっても良いし、又はこのように特異的でなくても良い。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節エレメント」という語には、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細の選択などの因子、望ましい発現レベルなどによって異なり得ることを理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、これらの突然変異型、これらの融合タンパク質など）を産生することができる。調節配列に関して、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書に記載されている。プロモーターに関しては、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書に記載されている。
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写して翻訳することができる。
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させることができる。一部の実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するため、又は真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）として使用される。一部の実施形態では、原核生物は、ベクターのコピーを増幅して１つ以上の核酸を発現させるため、例えば、宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するために使用される。原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質又は非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる場合が殆どである。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、その中でコードされたタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を高めること；及び（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けることに役立ち得る。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質と融合部分との分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素及びその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例として、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）での発現用のベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質の発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞での１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアン・ウイルス４０、及び本明細書に開示され当該技術分野で公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方の他の適切な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。
一部の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ｍｉｌｋ ｗｈｅｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターは、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含する。これらの原核生物ベクター及び真核生物ベクターに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，７５０，０５９号明細書に記載されている。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関連することがあり、このようなウイルスベクターについては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書に記載されている。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野で公知であり、これに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，７７６，３２１号明細書に記載されている。一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動するためにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに機能的に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、通常は特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に見られる短鎖散在配列反復（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）の異なるクラス（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）及び関連する遺伝子を含む。類似の散在ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌でも同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、反復の構造が他のＳＳＲとは異なり、短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、この反復は、実質的に一定の長さのユニークな介在配列によって規則的に間隔が空いたクラスターで生じる短鎖エレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、上記）。反復配列は、株間で高度に保存されているが、散在反復の数及びスペーサー領域の配列は、典型的には、株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されるものではないが、アエロピュルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルカエオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアオーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルキナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びテルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む４０を超える原核生物で同定された（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のヘテロタンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、若しくはそれ以上の、又は約１つを超える、２つを超える、３つを超える、４つを超える、５つを超える、６つを超える、７つを超える、８つを超える、９つを超える、１０を超える、ドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されるものではないが、エピトープタグ、受容体遺伝子配列、並びに次の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含む、ＤＮＡ分子又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態では、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導系の構成成分を形成し得る。この系の誘導性は、あるエネルギー形態を用いて遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御を可能にするであろう。このエネルギー形態には、限定されるものではないが、電磁放射線、音波エネルギー、化学エネルギー、及び熱エネルギーが含まれ得る。誘導系の例として、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、又は光誘導系（ファイトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が挙げられる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性に変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナからの）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法のさらなる例は、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び同第６１／７２１，２８３号明細書に記載されている。
本発明の実施では、特段の記載がない限り、当該技術分野の技術の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの従来の技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、及びＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
組換え鋳型（例えば、ＨＤＲ鋳型）
一部の実施形態において、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、本明細書に記載されるとおりの別のベクターの一構成成分であるか、別個のベクターに含まれるか、又は別個のポリヌクレオチドとして提供され得る。一部の実施形態において、組換え鋳型は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素によってニッキング又は切断される標的配列内又はその近傍での相同組換えにおける鋳型として機能するように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の好適な長さ、例えば、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００若しくはそれ以上の数のヌクレオチド長又はそれより大きいヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適にアラインメントされた場合、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０若しくはそれ以上の数のヌクレオチド又はそれより多いヌクレオチド）と重複し得る。一部の実施形態において、鋳型配列及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインメントされた場合、鋳型ポリヌクレオチドの最近接ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００ヌクレオチド又はそれ以上の数のヌクレオチドの範囲内にある。
標的の改変
一態様では、本発明は、真核細胞における標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物又は植物からの細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。ｅｘ ｖｉｖｏで任意の段階で培養を行うことができる。この１つ又は複数の細胞は、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入される細胞の場合、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドを切断し、これによりこの標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結される。
一態様では、本発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により、前記ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結される。同様の考慮及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法に上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の全ての態様に当てはまる。
実際、本発明の何れの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得るｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され得る。同様の考慮及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法に上記のように当てはまる。
キット
一態様では、本発明は、上記の方法で開示されるいずれか１つ以上の要素、及び組成物を含むキットを提供する。要素は、個別に又は組み合わせて提供することができ、かつ任意の適切な容器、例えば、バイアル、瓶、又は管に入れて提供することができる。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば、２つ以上の言語の取扱説明書を含む。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上の要素を利用するプロセスに使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供することができる。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能形態で、又は使用の前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含む任意の緩衝液とすることができる。一部の実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを機能的に連結するようにベクターに挿入されるガイド配列に一致する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上のベクター及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含む。キットは、本発明の系の全ての要素を提供できると有利であろう。
疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド
本発明の実施において標的化することのできる疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例を表Ａ及び表Ｂに列挙する。疾患の具体的情報は、ワールドワイドウェブで利用可能なジョンズ・ホプキンス大学マキュージック・ネイサンズ遺伝医学研究所（ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及び米国国立医学図書館国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手することができる。シグナリング生化学経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例を表Ｃに列挙する。これらの遺伝子及び経路中の突然変異は、不適切なタンパク質又は機能に影響する不適切な量のタンパク質の産生をもたらし得る。遺伝子、疾患及びタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書から本明細書によって参照により組み入れられる。このような遺伝子、タンパク質及び経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとなり得る。
本発明の実施形態はまた、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅並びにＤＮＡリピート不安定性及び神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関係する方法及び組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。タンデムリピート配列の特定の側面が２０を超えるヒト疾患に関与することが分かっている（「リピート不安定性に関する新しい洞察：ＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドの役割（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ）」．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの欠陥を修正することができる。
本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２Ａ及びＥＭＰ２Ｂ遺伝子の欠陥を修正するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期に癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、及び最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によって標的化することができ、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，編者Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓ，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を不活性化させることに関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０１５８９５７号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。別の例では、両方ともにグルタミンシンテターゼ遺伝子発現遺伝子を不活性化させることに関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１００３１１１２４号明細書及びＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２２５６６４号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。
本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトのトピック小節Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓにあるウェブサイト）にさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する欠陥の修正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病及び他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチー及びＮＩＮＤＳコルポセファリーを挙げることができる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトの小節Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓにさらに記載されている。
Ｃａｒｔｉｅｒ，「ミニシンポジウム：Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーにおける造血幹細胞移植及び造血幹細胞遺伝子療法（ＭＩＮＩ−ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ：Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙｐａ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）」，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０（２０１０）８５７−８６２（その引用文献と共に、全てが示されたものとして参照により本明細書に組み入れられる）に、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を利用してハーラー病患者の脳に正常なリソソーム酵素が送達されたという認識、及びＡＬＤ治療のためのＨＳＣ遺伝子療法の考察がある。２人の患者において、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の動員後に末梢ＣＤ３４＋細胞が収集され、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）−ＡＬＤレンチウイルスベクターで形質導入された。患者由来のＣＤ３４＋細胞は、低濃度でサイトカインの存在下１６時間にわたりこのＭＮＤ−ＡＬＤベクターで形質導入された。形質導入されたＣＤ３４＋細胞は形質導入後に凍結され、細胞の５％に対し、詳細には３つの複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）アッセイを含む様々な安全性試験が実施された。ＣＤ３４＋細胞の形質導入有効性は３５％〜５０％の範囲であり、レンチウイルス組込みコピー数の平均は０．６５〜０．７０であった。形質導入ＣＤ３４＋細胞の解凍後、ブスルファン及びシクロホスファミドによる完全な骨髄破壊に続き、患者に４．１０６個超の形質導入ＣＤ３４＋細胞／ｋｇが再注入された。遺伝子が修正されたＨＳＣの生着に有利となるように、患者のＨＳＣがアブレーションされた。２人の患者について１３日目〜１５日目に血液学的回復が起こった。第１の患者については１２ヵ月目、及び第２の患者については９ヵ月目に、ほぼ完全な免疫学的回復が起こった。レンチウイルスを使用するのとは対照的に、当業者は、当該技術分野における知識及びこの開示の教示に基づき、ＡＬＤに関して、突然変異を標的化して修正するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、好適なＨＤＲ鋳型を含む）を使用してＨＳＣを修正することができる；具体的には、ｓｇＲＮＡが、ペルオキシソーム膜輸送タンパク質ＡＬＤをコードするＸ染色体以上に位置する遺伝子のＡＢＣＤ１の突然変異を標的化することができ、及びＨＤＲが、適切なタンパク質発現のコーディングをもたらすことができる。この開示から、突然変異を標的化するｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）幹細胞と接触させてＨＤＲ鋳型を導入し、突然変異を修正することにより、ペルオキシソーム膜輸送タンパク質を発現させることができる。
一部の実施形態において、病態は新形成であり得る。病態が新形成である一部の実施形態において、標的化する遺伝子は、表Ａに掲載するもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態はトリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は脆弱Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態はセクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態はプリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態はＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は薬物嗜癖であり得る。一部の実施形態において、病態は自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態はアルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は炎症であり得る。一部の実施形態において、病態はパーキンソン病であり得る。
例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１４５号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載している。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的相互作用及びコミュニケーションの質的障害、並びに限定された反復的且つ常同的様式の行動、興味、及び活動によって特徴付けられる一群の障害である。３つの障害、自閉症、アスペルガー症候群（ＡＳ）及び特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）は、種々の重症度、関連する知的機能及び医学的状態を伴う一連の同じ障害である。ＡＳＤは主に遺伝的に決定される障害であり、遺伝率は約９０％である。
米国特許出願公開第２０１１００２３１４５号明細書は、ＡＳＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含み、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。ＡＳＤに関連するタンパク質は、典型的にはＡＳＤに関連するタンパク質とＡＳＤの発生率又は徴候との実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＡＳＤを有する集団では、ＡＳＤを有しない集団と比べてＡＳＤに関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＡＳＤに関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。
ＡＳＤに関連するタンパク質に関連し得る疾患状態又は障害の非限定的な例には、自閉症、アスペルガー症候群（ＡＳ）、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、レット症候群、結節性硬化症、フェニルケトン尿症、スミス・レムリ・オピッツ症候群及び脆弱Ｘ症候群が含まれる。非限定的な例として、ＡＳＤに関連するタンパク質には、限定はされないが以下のタンパク質が含まれる：ＡＴＰ１０Ｃ アミノリン脂質− ＭＥＴ ＭＥＴ受容体 輸送ＡＴＰアーゼ チロシンキナーゼ（ＡＴＰ１０Ｃ） ＢＺＲＡＰ１ ＭＧＬＵＲ５（ＧＲＭ５）代謝型グルタミン酸受容体５（ＭＧＬＵＲ５） ＣＤＨ１０ カドヘリン１０ ＭＧＬＵＲ６（ＧＲＭ６）代謝型グルタミン酸受容体６（ＭＧＬＵＲ６） ＣＤＨ９ カドヘリン９ ＮＬＧＮ１ ニューロリジン１ ＣＮＴＮ４ コンタクチン４ ＮＬＧＮ２ ニューロリジン２ ＣＮＴＮＡＰ２ コンタクチン関連 ＳＥＭＡ５Ａ ニューロリジン３ タンパク質様２（ＣＮＴＮＡＰ２） ＤＨＣＲ７ ７−デヒドロコレステロール ＮＬＧＮ４Ｘ ニューロリジン４ Ｘ− レダクターゼ（ＤＨＣＲ７） 連鎖性 ＤＯＣ２Ａ二重Ｃ２様ドメイン− ＮＬＧＮ４Ｙ ニューロリジン４ Ｙ− 含有タンパク質α 連鎖性 ＤＰＰ６ ジペプチジル ＮＬＧＮ５ ニューロリジン５ アミノペプチダーゼ様タンパク質６ ＥＮ２ エングレイルド２（ＥＮ２） ＮＲＣＡＭ 神経細胞接着分子（ＮＲＣＡＭ） ＭＤＧＡ２ 脆弱Ｘ精神遅滞 ＮＲＸＮ１ ニューレキシン１ １（ＭＤＧＡ２） ＦＭＲ２（ＡＦＦ２）ＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２ ＯＲ４Ｍ２ 嗅覚受容体 （ＡＦＦ２） ４Ｍ２ ＦＯＸＰ２ フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２ ＯＲ４Ｎ４ 嗅覚受容体 （ＦＯＸＰ２） ４Ｎ４ ＦＸＲ１ 脆弱Ｘ精神 ＯＸＴＲ オキシトシン受容体 遅滞、常染色体性 （ＯＸＴＲ） ホモログ１（ＦＸＲ１） ＦＸＲ２ 脆弱Ｘ精神 ＰＡＨ フェニルアラニン 遅滞、常染色体性 水酸化酵素（ＰＡＨ） ホモログ２（ＦＸＲ２） ＧＡＢＲＡ１ γ−アミノ酪酸 ＰＴＥＮ ホスファターゼ及び 受容体サブユニットα−１ テンシンホモログ （ＧＡＢＲＡ１） （ＰＴＥＮ） ＧＡＢＲＡ５ ＧＡＢＡＡ（γ−アミノ酪 ＰＴＰＲＺ１ 受容体型 酸）受容体α５ チロシンタンパク質 サブユニット（ＧＡＢＲＡ５） ホスファターゼζ（ＰＴＰＲＺ１） ＧＡＢＲＢ１ γ−アミノ酪酸 ＲＥＬＮ リーリン 受容体サブユニットβ−１（ＧＡＢＲＢ１） ＧＡＢＲＢ３ ＧＡＢＡＡ（γ−アミノ酪 ＲＰＬ１０ ６０Ｓリボソーム 酸）受容体β３サブユニット タンパク質Ｌ１０（ＧＡＢＲＢ３） ＧＡＢＲＧ１ γ−アミノ酪酸 ＳＥＭＡ５Ａ セマフォリン−５Ａ 受容体サブユニットγ−１ （ＳＥＭＡ５Ａ） （ＧＡＢＲＧ１） ＨＩＲＩＰ３ ＨＩＲＡ相互作用タンパク質３ ＳＥＺ６Ｌ２ 発作関連６ホモログ（マウス）様２ ＨＯＸＡ１ ホメオボックスタンパク質Ｈｏｘ−Ａ１ ＳＨＡＮＫ３ ＳＨ３及び複数の（ＨＯＸＡ１）アンキリンリピートドメイン３（ＳＨＡＮＫ３） ＩＬ６ インターロイキン６ ＳＨＢＺＲＡＰ１ ＳＨ３及び複数のアンキリンリピートドメイン３（ＳＨＢＺＲＡＰ１） ＬＡＭＢ１ ラミニンサブユニットβ−１ ＳＬＣ６Ａ４ セロトニン （ＬＡＭＢ１）トランスポーター（ＳＥＲＴ） ＭＡＰＫ３ マイトジェン活性化タンパク質 ＴＡＳ２Ｒ１ 味覚受容体キナーゼ３ タイプ２ メンバー１ ＴＡＳ２Ｒ１ ＭＡＺ Ｍｙｃ関連ジンクフィンガー ＴＳＣ１ 結節性硬化症 タンパク質 タンパク質１ ＭＤＧＡ２ ＭＡＭドメイン含有 ＴＳＣ２ 結節性硬化症 グリコシルホスファチジルイノシトール タンパク質２ アンカー２（ＭＤＧＡ２） ＭＥＣＰ２ メチルＣｐＧ結合 ＵＢＥ３Ａ ユビキチンタンパク質 タンパク質２（ＭＥＣＰ２） リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ） ＭＥＣＰ２ メチルＣｐＧ結合 ＷＮＴ２ ウィングレス型 タンパク質２（ＭＥＣＰ２） ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー２（ＷＮＴ２）。
その染色体配列が編集されるＡＳＤに関連するタンパク質のアイデンティティは様々であってよく、且つ様々となる。好ましい実施形態において、その染色体配列が編集されるＡＳＤに関連するタンパク質は、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚａｐｉｎｅ）受容体（末梢）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体性ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、ＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体性ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）、ＭＤＧＡ２遺伝子によりコードされるＭＡＭドメイン含有グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー２タンパク質（ＭＤＧＡ２）、ＭＥＣＰ２遺伝子によりコードされるメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ＭＧＬＵＲ５−１遺伝子（ＧＲＭ５とも称される）によりコードされる代謝型グルタミン酸受容体５（ＭＧＬＵＲ５）、ＮＲＸＮ１遺伝子によりコードされるニューレキシン１タンパク質、又はＳＥＭＡ５Ａ遺伝子によりコードされるセマフォリン５Ａタンパク質（ＳＥＭＡ５Ａ）であり得る。例示的実施形態において、遺伝子改変を受ける動物はラットであり、ＡＳＤに関連するタンパク質をコードする編集される染色体配列を以下に列挙する：ＢＺＲＡＰ１ ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚａｐｉｎｅ）受容体 ＸＭ＿００２７２７７８９、（末梢）関連 ＸＭ＿２１３４２７、タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１） ＸＭ＿００２７２４５３３、ＸＭ＿００１０８１１２５ ＡＦＦ２（ＦＭＲ２）ＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２ ＸＭ＿２１９８３２、（ＡＦＦ２） ＸＭ＿００１０５４６７３ ＦＸＲ１ 脆弱Ｘ精神 ＮＭ＿００１０１２１７９ 遅滞、常染色体性ホモログ１（ＦＸＲ１）ＦＸＲ２ 脆弱Ｘ精神 ＮＭ＿００１１００６４７ 遅滞、常染色体性ホモログ２（ＦＸＲ２） ＭＤＧＡ２ＭＡＭ ドメイン含有 ＮＭ＿１９９２６９ グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー２（ＭＤＧＡ２） ＭＥＣＰ２ メチルＣｐＧ結合 ＮＭ＿０２２６７３ タンパク質２（ＭＥＣＰ２） ＭＧＬＵＲ５ 代謝型グルタミン酸 ＮＭ＿０１７０１２ （ＧＲＭ５） 受容体５（ＭＧＬＵＲ５） ＮＲＸＮ１ ニューレキシン１ ＮＭ＿０２１７６７ ＳＥＭＡ５Ａ セマフォリン−５Ａ（ＳＥＭＡ５Ａ） ＮＭ＿００１１０７６５９。
例示的動物又は細胞は、ＡＳＤに関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個又はそれ以上の不活性化染色体配列、及びＡＳＤに関連するタンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。編集され又は組み込まれる染色体配列は、変化したＡＳＤ関連タンパク質をコードするように改変され得る。ＡＳＤに関連するタンパク質における突然変異の非限定的な例としては、１８位のロイシンがグルタミンに置換されているニューレキシン１におけるＬ１８Ｑ突然変異、４５１位のアルギニンがシステインに置換されているニューロリジン３におけるＲ４５１Ｃ突然変異、８７位のアルギニンがトリプトファンに置換されているニューロリジン４におけるＲ８７Ｗ突然変異、及び４２５位のイソロイシンがバリンに置換されているセロトニントランスポーターにおけるＩ４２５Ｖ突然変異が挙げられる。ＡＳＤ関連染色体配列における他の多くの突然変異及び染色体再配列がＡＳＤと関連付けられており、当該技術分野において公知である。例えば、Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｕｒ．Ｃｈｉｌｄ．Ａｄｏｌｅｓｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９：１６９−１７８、及びＢｕｃａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：ｅ１０００５３６（これらの開示は参照により全体として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、及びＮＵＲＲ１が挙げられる。嗜癖関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、又はＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、又はＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１５３号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したアルツハイマー病に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。一たび改変された細胞及び動物は、ＡＤの試験で一般的に用いられる尺度−例えば、限定なしに、学習及び記憶、不安、抑欝、嗜癖、及び感覚運動機能を使用して、標的突然変異がＡＤの発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究するための公知の方法、並びに行動的、機能的、病理学的、代謝的（ｍｅｔａｂｏｌｏｉｃ）及び生化学的機能を計測するアッセイを用いてさらに試験し得る。
本発明は、ＡＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含む。ＡＤ関連タンパク質は、典型的にはＡＤ関連タンパク質とＡＤ障害との実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＡＤ障害を有する集団では、ＡＤ障害を有しない集団と比べてＡＤ関連タンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＡＤ関連タンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、又はＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。非限定的な例として、ＡＤに関連するタンパク質には、限定はされないが、以下のとおり列挙されるタンパク質が含まれる：染色体配列によりコードされるタンパク質ＡＬＡＳ２ Δ−アミノレブリン酸シンターゼ２（ＡＬＡＳ２） ＡＢＣＡ１ ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣＡ１） ＡＣＥ アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ） ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＯＥ） ＡＰＰ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） ＡＱＰ１ アクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１） ＢＩＮ１ Ｍｙｃボックス依存性相互作用タンパク質１又は架橋インテグレータ（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）１タンパク質（ＢＩＮ１） ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） ＢＴＮＬ８ ブチロフィリン様タンパク質８（ＢＴＮＬ８） Ｃ１ＯＲＦ４９ 染色体１オープンリーディングフレーム４９ ＣＤＨ４ カドヘリン４ ＣＨＲＮＢ２ ニューロンアセチルコリン受容体サブユニットβ−２ ＣＫＬＦＳＦ２ ＣＫＬＦ様ＭＡＲＶＥＬ膜貫通ドメイン含有タンパク質２（ＣＫＬＦＳＦ２） ＣＬＥＣ４Ｅ Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーｅ（ＣＬＥＣ４Ｅ） ＣＬＵ クラスタリンタンパク質（アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊとしても知られる） ＣＲ１ 赤血球補体受容体１（ＣＲ１、またＣＤ３５、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体及び免疫粘着受容体としても知られる） ＣＲ１Ｌ 赤血球補体受容体１（ＣＲ１Ｌ） ＣＳＦ３Ｒ 顆粒球コロニー刺激因子３受容体（ＣＳＦ３Ｒ） ＣＳＴ３ シスタチンＣ又はシスタチン３ ＣＹＰ２Ｃ シトクロムＰ４５０ ２Ｃ ＤＡＰＫ１ 細胞死関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１） ＥＳＲ１ エストロゲン受容体１ ＦＣＡＲ ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ、またＣＤ８９としても知られる） ＦＣＧＲ３Ｂ ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩＩｂ、受容体（ＦＣＧＲ３Ｂ又はＣＤ１６ｂ） ＦＦＡ２ 遊離脂肪酸受容体２（ＦＦＡ２） ＦＧＡ フィブリノゲン（因子Ｉ） ＧＡＢ２ ＧＲＢ２関連結合タンパク質２（ＧＡＢ２） ＧＡＢ２ ＧＲＢ２関連結合タンパク質２（ＧＡＢ２） ＧＡＬＰ ガラニン様ペプチド ＧＡＰＤＨＳ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、精子形成（ＧＡＰＤＨＳ） ＧＭＰＢ ＧＭＢＰ ＨＰハプトグロビン（ＨＰ） ＨＴＲ７ ５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体７（アデニル酸シクラーゼ共役型） ＩＤＥ インスリン分解酵素 ＩＦ１２７ ＩＦ１２７ ＩＦＩ６インターフェロン、α−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６） ＩＦＩＴ２ テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質２（ＩＦＩＴ２） ＩＬ１ＲＮ インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ） ＩＬ８ＲＡ インターロイキン８受容体、α（ＩＬ８ＲＡ又はＣＤ１８１） ＩＬ８ＲＢ インターロイキン８受容体、β（ＩＬ８ＲＢ） ＪＡＧ１ジャグド１（ＪＡＧ１） ＫＣＮＪ１５ カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１５（ＫＣＮＪ１５） ＬＲＰ６ 低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６） ＭＡＰＴ 微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ） ＭＡＲＫ４ ＭＡＰ／微小管親和性調節キナーゼ４（ＭＡＲＫ４） ＭＰＨＯＳＰＨ１ Ｍ期リンタンパク質１ ＭＴＨＦＲ ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素 ＭＸ２ インターフェロン誘導ＧＴＰ結合タンパク質 Ｍｘ２ ＮＢＮ ニブリン、ＮＢＮとしても知られる ＮＣＳＴＮ ニカストリン ＮＩＡＣＲ２ ナイアシン受容体２（ＮＩＡＣＲ２、またＧＰＲ１０９Ｂとしても知られる） ＮＭＮＡＴ３ ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３ ＮＴＭ ニューロトリミン（又はＨＮＴ） ＯＲＭ１ オロソムコイド（Ｏｒｏｓｍｕｃｏｉｄ）１（ＯＲＭ１）又はα−１−酸糖タンパク質１ Ｐ２ＲＹ１３ Ｐ２Ｙ プリン受容体１３（Ｐ２ＲＹ１３） ＰＢＥＦ１ プレＢ細胞コロニー増強因子１（ＰＢＥＦ１）又はビスファチンとしても知られるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡｍＰＲＴアーゼ又はＮａｍｐｔ） ＰＣＫ１ ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ ＰＩＣＡＬＭ ホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ） ＰＬＡＵ ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（ＰＬＡＵ） ＰＬＸＮＣ１ プレキシンＣ１（ＰＬＸＮＣ１） ＰＲＮＰ プリオンタンパク質 ＰＳＥＮ１ プレセニリン１タンパク質（ＰＳＥＮ１） ＰＳＥＮ２ プレセニリン２タンパク質（ＰＳＥＮ２） ＰＴＰＲＡ タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ） ＲＡＬＧＰＳ２ ＰＨドメイン及びＳＨ３結合モチーフを有するＲａｌ ＧＥＦ２（ＲＡＬＧＰＳ２） ＲＧＳＬ２ Ｇタンパク質シグナル伝達様の調節因子２（ＲＧＳＬ２） ＳＥＬＥＮＢＰ１ セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＮＢＰ１） ＳＬＣ２５Ａ３７ ミトフェリン１ ＳＯＲＬ１ ソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲクラス）Ａリピート含有タンパク質（ＳＯＲＬ１） ＴＦ トランスフェリン ＴＦＡＭ ミトコンドリア転写因子Ａ ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ） ＴＮＦＳＦ１０ 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、（ＴＲＡＩＬ）メンバー１０ａ（ＴＮＦＳＦ１０） ＵＢＡ１ ユビキチン様モディファイヤー活性化酵素１（ＵＢＡ１） ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ） ＵＢＢ ユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ） ＵＢＱＬＮ１ ユビキリン１ ＵＣＨＬ１ ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１） ＵＣＨＬ３ ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３） ＶＬＤＬＲ 超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）。例示的実施形態において、その染色体配列が編集されるＡＤに関連するタンパク質は、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様モディファイヤー活性化酵素１（ＵＢＡ１）、ＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）、ＡＱＰ１遺伝子によりコードされるアクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１）、ＵＣＨＬ１遺伝子によりコードされるユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１）、ＵＣＨＬ３遺伝子によりコードされるユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３）、ＵＢＢ遺伝子によりコードされるユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ）、ＭＡＰＴ遺伝子によりコードされる微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ）、ＰＴＰＲＡ遺伝子によりコードされるタンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ）、ＰＩＣＡＬＭ遺伝子によりコードされるホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ）、ＣＬＵ遺伝子によりコードされるクラスタリンタンパク質（アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊとしても知られる）、ＰＳＥＮ１遺伝子によりコードされるプレセニリン１タンパク質、ＰＳＥＮ２遺伝子によりコードされるプレセニリン２タンパク質、ＳＯＲＬ１遺伝子によりコードされるソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲクラス）Ａリピート含有タンパク質（ＳＯＲＬ１）タンパク質、ＡＰＰ遺伝子によりコードされるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＯＥ）、又はＢＤＮＦ遺伝子によりコードされる脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）であり得る。例示的実施形態において、遺伝子改変を受ける動物はラットであり、及びＡＤに関連するタンパク質をコードする編集される染色体配列は以下のとおりである：ＡＰＰ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） ＮＭ＿０１９２８８ ＡＱＰ１ アクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１） ＮＭ＿０１２７７８ ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子 ＮＭ＿０１２５１３ ＣＬＵ クラスタリンタンパク質（ＮＭ＿０５３０２１ アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊとしても知られる） ＭＡＰＴ 微小管結合タンパク質 ＮＭ＿０１７２１２ τ（ＭＡＰＴ） ＰＩＣＡＬＭ ホスファチジルイノシトール結合 ＮＭ＿０５３５５４ クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ） ＰＳＥＮ１ プレセニリン１タンパク質（ＰＳＥＮ１） ＮＭ＿０１９１６３ ＰＳＥＮ２ プレセニリン２タンパク質（ＰＳＥＮ２） ＮＭ＿０３１０８７ ＰＴＰＲＡ タンパク質チロシンホスファターゼ ＮＭ＿０１２７６３ 受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ） ＳＯＲＬ１ ソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲ ＮＭ＿０５３５１９、クラス）Ａリピート含有 ＸＭ＿００１０６５５０６、タンパク質 （ＳＯＲＬ１） ＸＭ＿２１７１１５ ＵＢＡ１ ユビキチン様モディファイヤー活性化 ＮＭ＿００１０１４０８０ 酵素１（ＵＢＡ１） ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１ ＮＭ＿０５７２０５ 触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ） ＵＢＢ ユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ） ＮＭ＿１３８８９５ ＵＣＨＬ１ ユビキチンカルボキシル末端 ＮＭ＿０１７２３７ エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１） ＵＣＨＬ３ ユビキチンカルボキシル末端 ＮＭ＿００１１１０１６５ ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３） ＶＬＤＬＲ 超低密度リポタンパク質 ＮＭ＿０１３１５５ 受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）。動物又は細胞は、ＡＤに関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれ以上の破壊された染色体配列、及びＡＤに関連するタンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。編集される又は組み込まれる染色体配列は、変化したＡＤ関連タンパク質をコードするように改変され得る。ＡＤ関連染色体配列における数多くの突然変異がＡＤと関連付けられている。例えば、ＡＰＰにおけるＶ７１７１（即ち７１７位のバリンがイソロイシンに変わる）ミスセンス突然変異は家族性ＡＤを引き起こす。プレセニリン１タンパク質における複数の突然変異、例えばＨ１６３Ｒ（即ち１６３位のヒスチジンがアルギニンに変わる）、Ａ２４６Ｅ（即ち２４６位のアラニンがグルタミン酸に変わる）、Ｌ２８６Ｖ（即ち２８６位のロイシンがバリンに変わる）及びＣ４１０Ｙ（即ち４１０位のシステインがチロシンに変わる）は家族
性アルツハイマー３型を引き起こす。プレセニリン２タンパク質における突然変異、例えばＮ１４１Ｉ（即ち１４１位のアスパラギンがイソロイシンに変わる）、Ｍ２３９Ｖ（即ち２３９位のメチオニンがバリンに変わる）、及びＤ４３９Ａ（即ち４３９位のアスパラギン酸がアラニンに変わる）は家族性アルツハイマー４型を引き起こす。ＡＤ関連遺伝子の遺伝的変異と疾患との他の関連性は当該技術分野において公知である。例えば、Ｗａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５：３２９−３３４（この開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、又はＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。
黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、又はＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。
統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、及びそれらの組合せを挙げることができる。
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症及びＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。
セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、又はＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ切断酵素１）を挙げることができる。例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１４６号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したセクレターゼ関連障害に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。セクレターゼは、プレタンパク質をその生物学的に活性な形態にプロセシングするために必須である。セクレターゼ経路の種々の構成成分の欠陥は、多くの障害、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）など、顕著な特徴であるアミロイド形成又はアミロイド斑を伴う障害に寄与する。
セクレターゼ障害及びそれらの障害に関連するタンパク質は、数多くの障害に対する感受性、障害の存在、障害の重症度、又はそれらの任意の組み合わせをもたらすタンパク質の多様な集合である。本開示は、セクレターゼ障害に関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含む。セクレターゼ障害に関連するタンパク質は、典型的にはセクレターゼ関連タンパク質とセクレターゼ障害の発症との実験的関連性に基づき選択される。例えば、セクレターゼ障害を有する集団では、セクレターゼ障害を有しない集団と比べてセクレターゼ障害に関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、セクレターゼ障害に関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。非限定的な例として、セクレターゼ障害に関連するタンパク質には、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（前咽頭不全１ホモログＢ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、ＢＡＣＥ１（β部位ＡＰＰ切断酵素１）、ＩＴＭ２Ｂ（内在性膜タンパク質２Ｂ）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ）、ＮＯＴＣＨ１（Ｎｏｔｃｈホモログ１、転座関連（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー２））、ＩＮＳ（インスリン）、ＤＹＴ１０（ジストニー１０）、ＡＤＡＭ１７（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＡＣＥ（アンジオテンシンＩ変換酵素（ペプチジルジペプチダーゼＡ）１）、ＳＴＮ（スタチン）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＩＬ６（インターロイキン６（インターフェロン、β２））、ＮＧＦＲ（神経成長因子受容体（ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１６））、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、β）、ＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ（Ｙｔ血液型））、ＣＴＮＮＢ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１、８８ｋＤａ）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ））、ＩＦＮＧ（インターフェロン、γ）、ＮＲＧ１（ニューレグリン１）、ＣＡＳＰ３（カスパーゼ３、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＣＤＨ１（カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（上皮））、ＡＰＢＢ１（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質結合、ファミリーＢ、メンバー１（Ｆｅ６５））、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素）、ＣＲＥＢ１（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質１）、ＰＴＧＳ２（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＨＥＳ１（ヘアリー及びエンハンサー・オブ・スプリット１、（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＣＡＴ（カタラーゼ）、ＴＧＦＢ１（形質転換成長因子、β１）、ＥＮＯ２（エノラーゼ２（γ、ニューロン））、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ４（トリ））、ＴＲＡＰＰＣ１０（輸送タンパク質粒子複合体１０）、ＭＡＯＢ（モノアミンオキシダーゼＢ）、ＮＧＦ（神経成長因子（βポリペプチド））、ＭＭＰ１２（マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ））、ＪＡＧ１（ジャグド１（アラジール症候群））、ＣＤ４０ＬＧ（ＣＤ４０リガンド）、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２（塩基性））、ＩＬ３（インターロイキン３（コロニー刺激因子、多重））、ＬＲＰ１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）、ＮＯＴＣＨ４（Ｎｏｔｃｈホモログ４（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）、ＰＲＥＰ（プロリルエンドペプチダーゼ）、ＮＯＴＣＨ３（Ｎｏｔｃｈホモログ３（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＣＴＳＧ（カテプシンＧ）、ＥＧＦ（上皮成長因子（β−ウロガストロン））、ＲＥＮ（レニン）、ＣＤ４４（ＣＤ４４分子（インド人血液型））、ＳＥＬＰ（セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ、抗原ＣＤ６２））、ＧＨＲ（成長ホルモン受容体）、ＡＤＣＹＡＰ１（アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体））、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＭＭＰ３（マトリックスメタロペプチダーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ））、ＭＡＰＫ１０（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１０）、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＣＴＳＥ（カテプシンＥ）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１）、ＩＬ５（インターロイキン５（コロニー刺激因子、好酸球））、ＩＬ１Ａ（インターロイキン１、α）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＨＴＲ４（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体４）、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＫＲＡＳ（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＣＹＣＳ（シトクロムｃ、体細胞性）、ＳＭＧ１（ＳＭＧ１ホモログ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体、Ｉ型）、ＰＲＯＫ１（プロキネチシン１）、ＭＡＰＫ３（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３）、ＮＴＲＫ１（神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、１型）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）、ＭＭＥ（膜メタロエンドペプチダーゼ）、ＴＫＴ（トランスケトラーゼ）、ＣＸＣＲ２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２）、ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様成長因子１受容体）、ＲＡＲＡ（レチノイン酸受容体、α）、ＣＲＥＢＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＰＴＧＳ１（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＧＡＬＴ（ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、ＣＨＲＭ１（コリン作動性受容体、ムスカリン作動性１）、ＡＴＸＮ１（アタキシン１）、ＰＡＷＲ（ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、調節因子）、ＮＯＴＣＨ２（Ｎｏｔｃｈホモログ２（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、Ｍ６ＰＲ（マンノース−６−リン酸受容体（カチオン依存性））、ＣＹＰ４６Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー４６、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＣＳＮＫ１ Ｄ（カゼインキナーゼ１、δ）、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４）、ＰＲＧ２（プロテオグリカン２、骨髄（ナチュラルキラー細胞アクチベータ、好酸球顆粒主要塩基性タンパク質））、ＰＲＫＣＡ（プロテインキナーゼＣ、α）、Ｌ１ ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）、ＣＤ４０（ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５）、ＮＲ１Ｉ２（核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）、ＪＡＧ２（ジャグド２）、ＣＴＮＮＤ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、δ１）、ＣＤＨ２（カドヘリン２、１型、Ｎ−カドヘリン（神経型））、ＣＭＡ１（キマーゼ１、マスト細胞）、ＳＯＲＴ１（ソルチリン１）、ＤＬＫ１（δ様１ホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＴＨＥＭ４（チオエステラーゼスーパーファミリーメンバー４）、ＪＵＰ（結合プラコグロビン）、ＣＤ４６（ＣＤ４６分子、補体調節タンパク質）、ＣＣＬ１１（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１）、ＣＡＶ３（カベオリン３）、ＲＮＡＳＥ３（リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファミリー、３（好酸球カチオン性タンパク質））、ＨＳＰＡ８（熱ショック７０ｋＤａタンパク質８）、ＣＡＳＰ９（カスパーゼ９、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＣＣＲ３（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体３）、ＴＦＡＰ２Ａ（転写因子ＡＰ−２α（活性化エンハンサー結合タンパク質２α））、ＳＣＰ２（ステロールキャリアタンパク質２）、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）、ＨＩＦ１Ａ（低酸素誘導因子１、αサブユニット（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子））、ＴＣＦ７Ｌ２（転写因子７様２（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス））、ＩＬ１Ｒ２（インターロイキン１受容体、ＩＩ型）、Ｂ３ＧＡＬＴＬ（β １，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ様）、ＭＤＭ２（Ｍｄｍ２ ｐ５３結合タンパク質ホモログ（マウス））、ＲＥＬＡ（ｖ−ｒｅｌ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ（トリ））、ＣＡＳＰ７（カスパーゼ７、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＩＤＥ（インスリン分解酵素）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞）、ＣＡＳＫ（カルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＭＡＧＵＫファミリー））、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１（アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体）受容体Ｉ型）、ＡＴＦ４（活性化転写因子４（ｔａｘ応答性エンハンサーエレメントＢ６７））、ＰＤＧＦＡ（血小板由来成長因子αポリペプチド）、Ｃ２１又はｆ３３（染色体２１オープンリーディングフレーム３３）、ＳＣＧ５（セクレトグラニンＶ（７Ｂ２タンパク質））、ＲＮＦ１２３（リングフィンガータンパク質１２３）、ＮＦＫＢ１（Ｂ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子１）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、神経／膠芽腫由来癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＣＡＶ１（カベオリン１、カベオラタンパク質、２２ｋＤａ）、ＭＭＰ７（マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮））、ＴＧＦＡ（形質転換成長因子、α）、ＲＸＲＡ（レチノイドＸ受容体、α）、ＳＴＸ１Ａ（シンタキシン１Ａ（脳））、ＰＳＭＣ４（プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ、４）、Ｐ２ＲＹ２（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役、２）、ＴＮＦＲＳＦ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー２１）、ＤＬＧ１（ディスク、ラージホモログ１（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＮＵＭＢＬ（ｎｕｍｂホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））様）、ＳＰＮ（シアロホリン）、ＰＬＳＣＲ１（リン脂質スクランブラーゼ１）、ＵＢＱＬＮ２（ユビキリン２）、ＵＢＱＬＮ１（ユビキリン１）、ＰＣＳＫ７（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型）、ＳＰＯＮ１（スポンジン１、細胞外マトリックスタンパク質）、ＳＩＬＶ（シルバーホモログ（マウス））、ＱＰＣＴ（グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ）、ＨＥＳＳ（ヘアリー及びエンハンサー・オブ・スプリット５（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＧＣＣ１（ＧＲＩＰ及びコイルドコイルドメイン含有１）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。遺伝子改変を受ける動物又は細胞は、セクレターゼ障害に関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以
上の破壊された染色体配列、及び破壊されたセクレターゼ障害関連タンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。
筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例には、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫融合）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１４４号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＡＬＳ）疾患に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。ＡＬＳは、随意運動に関わる皮質、脳幹、及び脊髄における特定の神経細胞の漸進的で確実な変性によって特徴付けられる。
運動ニューロン障害及びそれらの障害に関連するタンパク質は、運動ニューロン障害の発症に対する感受性、運動ニューロン障害の存在、運動ニューロン障害の重症度又はそれらの任意の組み合わせをもたらすタンパク質の多様な集合である。本開示は、特定の運動ニューロン障害であるＡＬＳ疾患に関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含む。ＡＬＳに関連するタンパク質は、典型的にはＡＬＳ関連タンパク質とＡＬＳとの実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＡＬＳを有する集団では、ＡＬＳを有しない集団と比べてＡＬＳに関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＡＬＳに関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。非限定的な例として、ＡＬＳに関連するタンパク質としては、限定はされないが以下のタンパク質が挙げられる：ＳＯＤ１ スーパーオキシドジスムターゼ１、ＡＬＳ３ 筋萎縮性側索 可溶性 硬化症３ ＳＥＴＸ セナタキシン ＡＬＳ５ 筋萎縮性側索硬化症５ ＦＵＳ 肉腫融合 ＡＬＳ７ 筋萎縮性側索硬化症７ ＡＬＳ２ 筋萎縮性側索 ＤＰＰ６ ジペプチジルペプチダーゼ６ 硬化症２ ＮＥＦＨ ニューロフィラメント、ヘビー ＰＴＧＳ１ プロスタグランジン− ポリペプチド エンドペルオキシドシンターゼ１ ＳＬＣ１Ａ２ 溶質輸送担体ファミリー１ ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ 腫瘍壊死因子 （グリア高親和性 受容体スーパーファミリー、グルタミン酸トランスポーター）、 メンバー１０ｂ メンバー２ ＰＲＰＨ ペリフェリン ＨＳＰ９０ＡＡ１ 熱ショックタンパク質９０ｋＤａ α（細胞質型）、クラスＡ メンバー１ ＧＲＩＡ２ グルタミン酸受容体、ＩＦＮＧ インターフェロン、γ イオンチャネル型、ＡＭＰＡ ２ Ｓ１００Ｂ Ｓ１００カルシウム結合 ＦＧＦ２ 線維芽細胞成長因子２ タンパク質Ｂ ＡＯＸ１ アルデヒドオキシダーゼ１ ＣＳ クエン酸シンターゼ ＴＡＲＤＢＰ ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質 ＴＸＮ チオレドキシン ＲＡＰＨ１ Ｒａｓ関連 ＭＡＰ３Ｋ５ マイトジェン活性化プロテイン （ＲａＩＧＤＳ／ＡＦ−６）及び キナーゼ５ プレクストリン相同ドメイン１ ＮＢＥＡＬ１ ニューロビアクチン様１ ＧＰＸ１ グルタチオンペルオキシダーゼ１ ＩＣＡ１Ｌ 膵島細胞自己抗原 ＲＡＣ１ ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス １．６９ｋＤａ様 毒素基質１ ＭＡＰＴ 微小管関連 ＩＴＰＲ２ イノシトール１，４，５− タンパク質τ 三リン酸受容体、２型 ＡＬＳ２ＣＲ４ 筋萎縮性側索 ＧＬＳ グルタミナーゼ 硬化症２（若年性）染色体領域、候補４ ＡＬＳ２ＣＲ８ 筋萎縮性側索 ＣＮＴＦＲ 毛様体神経栄養因子 硬化症２（若年性） 受容体 染色体領域、候補８ ＡＬＳ２ＣＲ１１ 筋萎縮性側索 ＦＯＬＨ１ 葉酸ヒドロラーゼ１ 硬化症２（若年性）染色体領域、候補１１ ＦＡＭ１１７Ｂ 配列を有するファミリー Ｐ４ＨＢ プロリル４−ヒドロキシラーゼ、 類似性１１７、メンバーＢ βポリペプチド ＣＮＴＦ 毛様体神経栄養因子 ＳＱＳＴＭ１ セクエストソーム１ ＳＴＲＡＤＢ ＳＴＥ２０関連キナーゼ ＮＡＩＰ ＮＬＲファミリー、アポトーシス アダプターβ 阻害タンパク質 ＹＷＨＡＱ チロシン３− ＳＬＣ３３Ａ１ 溶質輸送担体ファミリー３３ モノオキシゲナーゼ／トリプトフ （アセチル−ＣｏＡトランスポーター）、 ァン５−モノオキシゲナーゼ メンバー１ 活性化タンパク質、θポリペプチド ＴＲＡＫ２ 輸送タンパク質、ＦＩＧ．４ ＦＩＧ．４ホモログ、ＳＡＣ１ キネシン結合２ 脂質ホスファターゼドメイン含有 ＮＩＦ３Ｌ１ ＮＩＦ３ ＮＧＧ１相互作用 ＩＮＡ インターネキシンニューロン 因子３様１ 中間径フィラメントタンパク質、α ＰＡＲＤ３Ｂ ｐａｒ−３分配 ＣＯＸ８Ａ シトクロムｃオキシダーゼ 欠損３ホモログＢ サブユニットＶＩＩＩＡ ＣＤＫ１５ サイクリン依存性キナーゼ ＨＥＣＷ１ ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷ １５ ドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１ ＮＯＳ１ 一酸化窒素合成酵素１ ＭＥＴ ｍｅｔ癌原遺伝子 ＳＯＤ２ スーパーオキシドジスムターゼ２、ＨＳＰＢ１ 熱ショック２７ｋＤａ ミトコンドリア タンパク質１ ＮＥＦＬ ニューロフィラメント、ライト ＣＴＳＢ カテプシンＢ ポリペプチド ＡＮＧ アンジオゲニン、ＨＳＰＡ８ 熱ショック７０ｋＤａ リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡ タンパク質８ ファミリー、５ ＶＡＰＢ ＶＡＭＰ（小胞− ＥＳＲ１ エストロゲン受容体１ 関連膜タンパク質）関連タンパク質Ｂ及びＣ ＳＮＣＡ シヌクレイン、α ＨＧＦ 肝細胞成長因子 ＣＡＴ カタラーゼ ＡＣＴＢ アクチン、β ＮＥＦＭ ニューロフィラメント、ミディアム ＴＨ チロシンヒドロキシラーゼ ポリペプチド ＢＣＬ２ Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２ ＦＡＳ Ｆａｓ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、メンバー６） ＣＡＳＰ３ カスパーゼ３、アポトーシス− ＣＬＵ クラスタリン 関連システインペプチダーゼ ＳＭＮ１ 運動ニューロン生存 Ｇ６ＰＤ グルコース−６−リン酸 １、テロメア デヒドロゲナーゼ ＢＡＸ ＢＣＬ２関連Ｘ ＨＳＦ１ 熱ショック転写 タンパク質 因子１ ＲＮＦ１９Ａ リングフィンガータンパク質１９Ａ ＪＵＮ ｊｕｎ癌遺伝子 ＡＬＳ２ＣＲ１２ 筋萎縮性側索 ＨＳＰＡ５ 熱ショック７０ｋＤａ 硬化症２（若年性） タンパク質５ 染色体領域、候補１２ ＭＡＰＫ１４ マイトジェン活性化タンパク質 ＩＬ１０ インターロイキン１０ キナーゼ１４ ＡＰＥＸ１ ＡＰＥＸヌクレアーゼ ＴＸＮＲＤ１ チオレドキシンレダクターゼ１ （多機能性ＤＮＡ修復酵素）１ ＮＯＳ２ 一酸化窒素合成酵素２、ＴＩＭＰ１ ＴＩＭＰ メタロペプチダーゼ 誘導性 阻害因子１ ＣＡＳＰ９ カスパーゼ９、アポトーシス− ＸＩＡＰ のＸ連鎖阻害因子 関連システイン アポトーシス ペプチダーゼ ＧＬＧ１ ゴルジ糖タンパク質１ ＥＰＯ エリスロポエチン ＶＥＧＦＡ 血管内皮 ＥＬＮ エラスチン 成長因子Ａ ＧＤＮＦ グリア細胞由来 ＮＦＥ２Ｌ２ 核内因子（赤血球− 神経栄養因子 由来２）様２ ＳＬＣ６Ａ３ 溶質輸送担体ファミリー６ ＨＳＰＡ４ 熱ショック７０ｋＤａ （神経伝達物質 タンパク質４ トランスポーター、ドーパミン）、メンバー３ ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ ＰＳＭＢ８ プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、β型、８ ＤＣＴＮ１ ダイナクチン１ ＴＩＭＰ３ ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子３ ＫＩＦＡＰ３ キネシン関連 ＳＬＣ１Ａ１ 溶質輸送担体ファミリー１ タンパク質３ （ニューロン／上皮高親和性グルタミン酸トランスポーター、系Ｘａｇ）、メンバー１ ＳＭＮ２ 運動ニューロン生存 ＣＣＮＣ サイクリンＣ ２、セントロメア ＭＰＰ４ 膜タンパク質、ＳＴＵＢ１ ＳＴＩＰ１ 相同性及びＵ− パルミトイル化４ ボックス含有タンパク質１ ＡＬＳ２ アミロイドβ（Ａ４） ＰＲＤＸ６ ペルオキシレドキシン６ 前駆体タンパク質 ＳＹＰ シナプトフィジン ＣＡＢＩＮ１ カルシニューリン結合タンパク質１ ＣＡＳＰ１ カスパーゼ１、アポトーシス− ＧＡＲＴ ホスホリボシルグリシンアミ 関連システイン ド ホルミルトランスフェラーゼ、 ペプチダーゼ ホスホリボシルグリシンアミ ド シンテターゼ、ホスホリボシルアミノイミ ダゾール シンテターゼ ＣＤＫ５ サイクリン依存性キナーゼ５ ＡＴＸＮ３ アタキシン３ ＲＴＮ４ レティキュロン４ Ｃ１ＱＢ 補体成分１、ｑサブ構成成分、Ｂ鎖 ＶＥＧＦＣ 神経成長因子 ＨＴＴ ハンチンチン受容体 ＰＡＲＫ７ パーキンソン病７ ＸＤＨ キサンチンデヒドロゲナーゼ ＧＦＡＰ グリア線維性酸性 ＭＡＰ２ 微小管結合 タンパク質 タンパク質２ ＣＹＣＳ シトクロムｃ、体細胞型、ＦＣＧＲ３Ｂ ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩＩｂ、ＣＣＳ の銅シャペロン ＵＢＬ５ ユビキチン様５ スーパーオキシドジスムターゼ ＭＭＰ９ マトリックスメタロペプチダーゼ ＳＬＣ１８Ａ３ 溶質輸送担体ファミリー１８ ９（（小胞アセチルコリン）、メンバー３ ＴＲＰＭ７ 一過性受容体 ＨＳＰＢ２ 熱ショック２７ｋＤａ 電位カチオンチャネル、 タンパク質２ サブファミリーＭ、メンバー７ ＡＫＴ１ ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫 ＤＥＲＬ１ Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、ウイルス癌遺伝子ホモログ１ メンバー１ ＣＣＬ２ ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ） ＮＧＲＮ ノイグリン、神経突起 リガンド２ 伸長関連 ＧＳＲ グルタチオンレダクターゼ ＴＰＰＰ３ チューブリン重合促進タンパク質ファミリーメンバー３ ＡＰＡＦ１ アポトーシスペプチダーゼ ＢＴＢＤ１０ ＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン 活性化因子１ 含有１０ ＧＬＵＤ１ グルタミン酸 ＣＸＣＲ４ ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ） デヒドロゲナーゼ１ 受容体４ ＳＬＣ１Ａ３ 溶質輸送担体ファミリー１ ＦＬＴ１ ｆｍｓ関連チロシン （グリア高親和性グルタミン酸トランスポーター）、メンバー３ キナーゼ１ ＰＯＮ１ パラオキソナーゼ１ ＡＲ アンドロゲン受容体 ＬＩＦ 白血病抑制因子 ＥＲＢＢ３ ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３ ＬＧＡＬＳ１ レクチン、ガラクトシド− ＣＤ４４ ＣＤ４４分子 結合、可溶性、１ ＴＰ５３ 腫瘍タンパク質ｐ５３ ＴＬＲ３ Ｔｏｌｌ様受容体３ ＧＲＩＡ１ グルタミン酸受容体、ＧＡＰＤＨ グリセルアルデヒド−３− イオンチャネル型、ＡＭＰＡ １ リン酸デヒドロゲナーゼ ＧＲＩＫ１ グルタミン酸受容体、ＤＥＳ デスミン イオンチャネル型、カイニン酸１ ＣＨＡＴ コリンアセチルトランスフェラーゼ ＦＬＴ４ ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４ ＣＨＭＰ２Ｂ クロマチン改変 ＢＡＧ１ ＢＣＬ２関連 タンパク質２Ｂ アタノ遺伝子 ＭＴ３ メタロチオネイン３ ＣＨＲＮＡ４ コリン作動性受容体、ニコチン性、α４ ＧＳＳ グルタチオンシンテターゼ ＢＡＫ１ ＢＣＬ２−アンタゴニスト／キラー１ ＫＤＲ キナーゼ挿入ドメイン ＧＳＴＰ１ グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ 受容体（ＩＩＩ型 π１ 受容体チロシンキナーゼ） ＯＧＧ１ ８−オキソグアニンＤＮＡ ＩＬ６ インターロイキン６（インターフェロン、グリコシラーゼ β２）。動物又は細胞は、ＡＬＳに関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の破壊された染色体配列、及び破壊されたＡＬＳ関連タンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。好ましいＡＬＳ関連タンパク質には、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫融合）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、及びそれらの任意の組合せを挙げることができる。
プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、又はＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。
免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；又はＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。
トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、又はＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、又はＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、又はＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例としては以下が挙げられ、以下から選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩ及びＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症及び（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群及びＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；及び色素性乾皮症。
明らかなとおり、本発明の系は任意の目的ポリヌクレオチド配列の標的化に使用し得ることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療し得るであろう病態又は疾患の一部の例は本明細書の表に掲載し、それらの病態に現在関連付けられている遺伝子の例もそれらの表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために記載するものであり、本発明を限定することを一切意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内に包含される本発明における変化及び他の使用に想到するであろう。
実施例１：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した哺乳類の脳における遺伝子機能のｉｎ ｖｉｖｏ研究
「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した哺乳類の脳における遺伝子機能のｉｎ ｖｉｖｏ研究（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）」と題されるＳｗｉｅｃｈ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．による発表、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ １９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］は、参照により本明細書に組み入れられる。この研究は以下の要点を提示する：
・ ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ媒介性Ｃａｓ９送達の成功並びに分裂終了ニューロンにおける効率的なゲノム改変の初めての実証；
・ Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ発現細胞からの神経核の容易な単離を可能にする核タグ標識技法の開発；
・ ニューロントランスクリプトームのＲＮＡｓｅｑ解析に向けた適用の実証；
・ 電気生理学的研究とＣａｓ９媒介性ゲノム摂動との統合；及び
・ そして多重標的化及びＣａｓ９媒介性ゲノム編集を用いてげっ歯類行動に関する遺伝子機能を調べる能力の実証。
疾患関連突然変異を有するトランスジェニック動物モデルは、神経障害の研究に極めて有用であり、疾患の遺伝的及び病態生理学的機構を解明する助けとなる。しかしながら、単一又は複数の遺伝子改変を有する動物モデルの作成は特に労力を要し、何世代にもわたる時間のかかる繁殖が必要である。従って、正常な及び疾患に関連する脳プロセスにおける遺伝子機能の迅速な分析を促進するため、出願者らはｉｎ ｖｉｖｏでニューロンのゲノムを正確且つ効率的に操作する能力を必要とする。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、複製真核細胞において単一及び複数の遺伝子の正確且つ効率的なゲノム切断を媒介し、フレームシフト挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらすことが示されている。ここで、出願者らは、Ｃａｓ９媒介性ゲノム摂動を生化学的、シーケンシングの、電気生理学的、及び行動学的リードアウトと統合して、神経プロセスにおける個々の及び一群の遺伝子の機能並びに脳障害でのその役割をｉｎ ｖｉｖｏで研究する。
考察
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、マウス脳への組換え遺伝子の送達に一般的に用いられている。ＡＡＶ系の主な限界は、上限がＩＴＲなしに約４．５ｋｂという、その小さいパッケージングサイズであり、これにより単一のベクター中にパッケージングし得る遺伝物質の量が制限される。ＳｐＣａｓ９のサイズが既に４．２ｋｂあり、単一のＡＡＶベクター内で他の遺伝エレメントに残されるのは０．３ｋｂ未満であるため、出願者らは、２つの別個のウイルスベクター上にＳｐＣａｓ９（ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９）及びｓｇＲＮＡ発現カセット（ＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅ）をパッケージングするデュアルベクター系を設計した（図１）。ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９ベクターを設計する一方で、出願者らは、ＳｐＣａｓ９発現を最適化するため様々な短いニューロン特異的プロモーター並びにポリアデニル化シグナルを比較した。出願者らは、その最終的な設計について、培養初代マウス皮質ニューロンで十分なレベルのＳｐＣａｓ９発現を達成する能力に基づきマウスＭｅｃｐ２プロモーター（２３５ｂｐ、ｐＭｅｃｐ２）及び最小ポリアデニル化シグナル（４８ｂｐ、ｓｐＡ）を選択した（図５ｃ）。ＳｐＣａｓ９発現ニューロンの免疫蛍光法による同定を促進するため、出願者らはＳｐＣａｓ９にＨＡ−エピトープタグを付加した。ＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅベクターについては、出願者らは、Ｕ６−ｓｇＲＮＡ発現カセット並びにヒトシナプシンＩプロモーターによって駆動されるＫＡＳＨ核膜貫通ドメイン９と融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をパッケージングした（図１ａ）。ＧＦＰ−ＫＡＳＨ融合タンパク質ではＧＦＰが核外膜に向かい（図５ｃ、図５ｄ）、ＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅによって形質導入されたインタクトな神経核の蛍光に基づく同定及び精製が可能である。
出願者らのデュアルベクター送達系の送達有効性を試験するため、出願者らは初めにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養初代マウス皮質ニューロンを形質導入し、ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９及びＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅによるロバストな発現を観察したところ（図５ｃ）、８０％を超える同時形質導入効率であった（図５ｅ）。重要なことには、非形質導入ニューロンと比較すると、ＳｐＣａｓ９の発現は形質導入ニューロンの形態及び生存率に悪影響を及ぼさなかった（図５ｃ、図５ｆ）。
効率的な送達系が確立されたことで、出願者らは次に、マウス初代ニューロンにおいてＳｐＣａｓ９媒介性ゲノム編集を試験しようとした。種々の分裂細胞型でＳｐＣａｓ９を使用して効率的なゲノム改変が達成されているが、ＳｐＣａｓ９を分裂終了ニューロンにおけるゲノム編集の効率的な達成に使用し得るかどうかは不明である。出願者らは、その初期試験について、自閉症スペクトラム障害の一種であるレット症候群で主要な役割を果たすＭｅｃｐ２遺伝子を標的化した。ＭｅＣＰ２タンパク質は脳の至る所のニューロンで遍在的に発現するが、グリア細胞にはほとんど存在せず、その欠損はニューロンの重大な形態学的及び電気生理的表現型に関連することが示されており、両方ともに、レット症候群の患者で観察される神経学的症状に寄与すると考えられている。Ｍｅｃｐ２を標的化するため、出願者らは初めに、マウスＭｅｃｐ２遺伝子のエクソン３を標的化するいくつかのｓｇＲＮＡを設計し（図６ａ）、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を使用してそれらの有効性を評価した。最も効率の高いｓｇＲＮＡを、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いて同定した（図６ｂ）。出願者らは、続くｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ Ｍｅｃｐ２標的化実験用に、最も有効なｓｇＲＮＡ（Ｍｅｃｐ２標的５）を選択した。
ニューロンにおける出願者らのデュアルベクター系の編集効率を評価するため、出願者らは初代マウス皮質ニューロンをｉｎ ｖｉｔｒｏ７日培養時点で形質導入し（７ＤＩＶ、図７ａ）、形質導入の７日後にＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いてインデル率を計測した（図７ｂ）。注目すべきことに、ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９とＭｅｃｐ２を標的化するＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅとで同時形質導入したニューロン培養物は、対照ニューロンと比較して最大８０％のＭｅＣＰ２タンパク質レベルの低下を示した（図７ｃ、図７ｄ）。比較的低いインデル頻度（約１４％）とロバストなタンパク質欠乏（約８０％）との間の観察された不整合に関する１つの可能な説明は、単に標的部位におけるＳｐＣａｓ９の結合が転写を妨げ得るというものであり、これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で示されている。出願者らは、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメインの両方を不活性化したＳｐＣａｓ９の突然変異体（Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、ｄＳｐＣａｓ９）を使用してこの可能性を調べた。ｄＳｐＣａｓ９及びＭｅｃｐ２標的化ｓｇＲＮＡの同時発現はＭｅＣＰ２タンパク質レベルを低下させなかった（図７ａ、図７ｄ）ことから、活性ＳｐＣａｓ９の存在下で観察されたＭｅＣＰ２レベルの低下は、Ｍｅｃｐ２遺伝子座に改変が起こったことに起因するものと示唆される。低レベルの検出インデルと高レベルのタンパク質欠乏との間の不整合に関する別の可能な説明は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイによる真のインデル率の過小評価に起因し得る−ＳＵＲＶＥＹＯＲの検出精度はインデル配列組成に感受性が高いことが以前示されている。
ＭｅＣＰ２機能喪失は、ニューロンにおける樹状突起樹の異常及び棘形態形成障害に関連することが以前示されている。ＭｅＣＰ２欠乏のこれらの表現型はまた、ＭｅＣＰ−ＫＯ ｉＰＳ細胞から分化したニューロンでも再現されている。従って、出願者らは、ニューロンにおけるＳｐＣａｓ９媒介性ＭｅＣＰ２欠乏が同様にレット症候群の形態学的表現型を再現するかどうかを調べた。実際、ＳｐＣａｓ９とＭｅｃｐ２を標的化するｓｇＲＮＡとを同時発現するニューロンは、対照ニューロンと比較したとき樹状突起樹形態及び棘密度の変化を呈した（図８）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９を使用することにより、分裂終了ニューロンにおける標的ノックアウトが可能となるため、細胞アッセイにおける遺伝子機能の研究を促進し得ることを実証している。
不均一な細胞型の入り組んだ回路網で構成される神経系の複雑さを考えれば、ニューロンのゲノムをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に編集可能であることにより、自然のコンテクストに組み込まれた関連細胞型における遺伝子機能の直接的な試験が可能となる。従って、出願者らは、高力価ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９とＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅとの混合物（１：１比）を成体マウスの海馬歯状回に定位注入した。出願者らは、ウイルス注入後４週間で海馬顆粒細胞において両方のベクターの同時形質導入効率が高く（８０％を超える）（図１ｂ、図１ｃ）、Ｍｅｃｐ２遺伝子座のゲノム修飾がもたらされた（図１ｄ）ことを観察した。ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いて、出願者らは、注入した脳領域から採取した脳パンチに約１３％のインデル頻度を検出した（図１ｅ）。出願者らの培養初代ニューロンにおける知見と同様に、ＳｐＣａｓ９の媒介によるＭｅｃｐ２遺伝子座の切断により、ＭｅＣＰ２タンパク質レベルが６０％超効率的に低下した（図１ｆ）。加えて、歯状回中のＭｅＣＰ２陽性核の数が、ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９及びＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅを注入したとき、ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９単独と比較して７５％超減少した（図１ｇ〜図１ｈ）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９を使用してインタクトな生物学的コンテクストの範囲内で特定の遺伝子に直接摂動を与え得ることを示唆している。
標的化したゲノム摂動を定量的リードアウトと組み合わせると、特定のゲノムエレメントの生物学的機能に関する洞察がもたらされ得る。ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９及びＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅを形質導入した細胞の分析を促進するため、出願者らは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いてＧＦＰ−ＫＡＳＨ標識核を精製する方法を開発した（図２ａ）。選別した核を直接使用して、下流の生化学的分析又は配列解析用に核ＤＮＡ及びＲＮＡを精製することができる。出願者らはサンガーシーケンシングを用いて、１４個中１３個の単一ＧＦＰ陽性核がｓｇＲＮＡ標的部位にインデル突然変異を含んだことを見出した。
ゲノムＤＮＡシーケンシングに加え、精製ＧＦＰ陽性核をまたＲＮＡｓｅｑ解析に使用して、ＭｅＣＰ２欠乏の転写結果を研究することもできる（図２ｂ及び図９）。歯状回のニューロンの転写に対するＭｅｃｐ２ノックアウトの効果を試験するため、出願者らは、ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９、並びに細菌ｌａｃＺ遺伝子を標的化し、且つマウスゲノムは標的化しないように設計されている対照ｓｇＲＮＡか、又はＭｅｃｐ２を標的化するｓｇＲＮＡかのいずれかの投与を受ける動物のＦＡＣＳ精製ＧＦＰ＋核を使用して、ＲＮＡｓｅｑライブラリを調製した。ｓｇＲＮＡは全て、そのオフターゲットスコアが最小となるように最適化されている（ＣＲＩＳＰＲ設計ツール：ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ）。出願者らは、対照とＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡ発現核との間に差次的発現遺伝子（図２ｂ）を見出すことができた（ｐ＜０．０１）。出願者らは、Ｍｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡ発現核で下方制御された遺伝子の中にいくつかの興味深い候補を同定した：Ｈｐｃａ、Ｏｌｆｍ１、及びＮｃｄｎ（これらは学習行動において重要な役割を果たすことが以前報告されている）；及びＣｐｌｘ２（これはシナプス小胞放出に関与し、且つニューロン発火率に関係することが示されている）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９媒介性ゲノム摂動と集団レベルのＲＮＡｓｅｑ解析との組み合わせが、ニューロンにおける転写調節を特徴付け、且つ特定のニューロン機能又は疾患過程に重要であり得る遺伝子を提案する方法をもたらすことを実証している。
脳におけるＳｐＣａｓ９媒介性ｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集はまた、電気生理学的記録法と組み合わせることにより、特定の細胞型又は回路成分に対するゲノム摂動の効果を研究することができる。神経生理学に対するＭｅＣＰ２欠乏の機能的効果を研究するため、出願者らは、ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９とＭｅｃｐ２を標的化するＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅとを雄マウスの一次視覚野（Ｖ１）の表層に定位的に共送達した。Ｖ１を選択したのは、二光子イメージング及び二光子誘導標的記録法にとって表層皮質興奮性ニューロンが到達し易いためである。ＳｐＣａｓ９送達の２週間後、マウスを二光子誘導傍細胞記録法に供し（図３）、マウスＶ１の第２／３層におけるＫＡＳＨ−ＧＦＰ＋ニューロンとＧＦＰ−隣接ニューロンとの電気生理学的反応を比較した（図３ａ〜図３ｃ）。出願者らは、２０度インクリメントの１８枚のドリフトグレーティングに対するニューロン応答を測定し、細胞の誘発された発火率（ＦＲ）及び方位選択性指数（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ：ＯＳＩ）を、応答のベクトル平均を取ることにより計算した。ＦＲ及びＯＳＩの両方とも、興奮性ＧＦＰ＋、ＭｅＣＰ２ノックアウトニューロンについて隣接ＧＦＰ−興奮性ニューロンと比較して有意に低下した（図３ｄ〜図３ｅ）。比較すると、ＳｐＣａｓ９と併せた対照ｓｇＲＮＡ発現は、隣接する非感染ニューロンと比較したときＦＲ及びＯＳＩに対して何ら効果を有しなかった（図３ｄ〜図３ｅ）。これらの結果は、成熟Ｖ１皮質ニューロンにおけるＳｐＣａｓ９媒介性のＭｅＣＰ２欠乏がｉｎ ｖｉｖｏで２週間以内に興奮性ニューロンの視覚反応特性を変化させることを示しており、さらに、遺伝子機能の研究及び神経回路の分析のための、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳類の脳における標的遺伝子ノックアウトを促進することにおけるＳｐＣａｓ９の多用途性を実証している。
ＳｐＣａｓ９系の一つの重要な利点は、多重ゲノム編集を促進するその能力である。生きている動物の脳に複数の遺伝子の安定したノックアウトを導入することには、生理学的及び神経病理学的病態における多遺伝子機構の因果関係研究など、潜在的に広範囲に及ぶ適用性があるものと思われる。脳における多重ゲノム編集の可能性を試験するため、出願者らは、核標識用のＧＦＰ−ＫＡＳＨを伴うタンデムの３つのｓｇＲＮＡからなる多重ｓｇＲＮＡ発現ベクターを設計した（図４ａ）。出願者らは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリー（ＤＮＭＴ）（Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂからなる）を標的化するｓｇＲＮＡを選択した。Ｄｎｍｔ１及び３ａは成熟脳で高度に発現し、以前、ＤＮＭＴ活性がＤＮＡメチル化を変化させ、且つシナプス可塑性並びに学習及び記憶形成にＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１の両方が必要であることが示された。出願者らは、高い改変効率でＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１に対する個々のｓｇＲＮＡを設計した。Ｄｎｍｔ３ｂによるいかなる潜在的な代償効果も回避するため、出願者らはまた、この遺伝子を、それが主として神経発生中に発現するにしても、さらに標的化することに決めた２７。最後に出願者らは、３つ全ての標的遺伝子について高度に同時的にＤＮＡを切断するための個々のｓｇＲＮＡを選択した（図４ｂ及び図１０）。
ｉｎ ｖｉｖｏでの多重ゲノム編集の有効性を試験するため、出願者らは、高力価ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９とＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅとの混合物を雄成体マウスの背側及び腹側歯状回に定位的に送達した。４週間後、海馬を解剖し、ＦＡＣＳで標的細胞核を選別した。出願者らは、選別した核集団においてＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ（図４ｃ）及びシーケンシング（図１１）を用いて約１９％（Ｄｎｍｔ３ａ）、１８％（Ｄｎｍｔ１）及び４％（Ｄｎｍｔ３ｂ）のインデル頻度を検出した。複数の遺伝子座の標的化は、個々の細胞における有効な多重ノックアウト率に関して疑問を起こさせる。単一の核選別を標的シーケンシングと組み合わせて使用することにより、出願者らは、個々の神経核における複数のＤＮＭＴ遺伝子座の同時標的化を定量化した（図４ｄ）。少なくとも１つのＤｎｍｔ遺伝子座に改変を有する神経核のうち、７０％を上回る核がＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１の両方にインデルを含んだ（約４０％が３つ全ての遺伝子座に、及び約３０％がＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１遺伝子座の両方にインデルを含んだ）。これらの結果は、歯状回におけるＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１タンパク質欠乏レベルと一致する（図４ｅ）。成熟脳におけるＤｎｍｔ３ｂの低い発現に起因して、出願者らはＤｎｍｔ３ｂタンパク質を検出することができなかった。
最近のＳｐＣａｓ９研究は、２０ｎｔ ｓｇＲＮＡ配列内の各塩基が全体的な特異性に寄与するが、ｓｇＲＮＡに部分的に一致するゲノム遺伝子座が、オフターゲット二本鎖切断及びインデル形成をもたらし得ることを示している。オフターゲット改変率を評価するため、出願者らは、高度に類似したゲノム標的部位のリストを計算的に同定し２、標的ディープシーケンシングを用いて改変率を定量化した。上位の予測オフターゲット遺伝子座のインデル解析から、０〜１．６％のインデル形成率が明らかとなり、ＳｐＣａｓ９改変が特異的であることが実証された（補表１）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＳｐＣａｓ９媒介性ゲノム編集の特異性を高めるため、さらなる研究では、二重ニッキング及びトランケートｓｇＲＮＡなどのオフターゲット最小化戦略を用い得る。
Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ１のノックダウンは、海馬依存性の記憶形成に影響を与えることが以前示されている２７。従って、出願者らは、文脈的恐怖条件付け行動試験を実施して、ＳｐＣａｓ９媒介性三重ノックアウト（Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１及びＤｎｍｔ３ｂ）が記憶の獲得及び固定に及ぼす効果を調べた。出願者らは、記憶獲得段階では対照マウスと三重ノックアウトマウスとの間にいかなる違いも認めなかったが、訓練文脈条件下で試験したとき、ノックアウトマウスは記憶固定の障害を示した（図４ｆ）。マウスを変化文脈で試験したときには、この効果は消失した。出願者らの結果は、歯状回ニューロンにおけるＤＮＭＴファミリーメンバーのＣＲＩＰＳＲ−Ｃａｓ９媒介性ノックアウトが、行動課題における遺伝子の機能を探索するのに十分であることを実証している。
出願者らの結果は、ＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡのＡＡＶ媒介性ｉｎ ｖｉｖｏ送達が、インタクトな神経回路内で正確なゲノム摂動を達成するための迅速且つ強力な技術を提供することを実証している。ＳｐＣａｓ９は分裂細胞のエンジニアリングに広く用いられているが、出願者らは、ＳｐＣａｓ９を使用して分裂終了ニューロンのゲノムもまたＮＨＥＪ媒介性インデル生成によって高効率でエンジニアリングし得ることを実証している。ＳｐＣａｓ９媒介性ゲノム摂動を、生化学的、シーケンシングの、電気生理学的、及び行動学的解析と組み合わせて、標的ゲノムエレメントの機能を研究することができる。出願者らは、ＳｐＣａｓ９の媒介によって単一又は複数の遺伝子を標的化することにより、古典的な、一層時間のかかるマウス遺伝モデルを使用して観察される形態学的、電気生理学的、及び行動学的表現型を再現し得ることを実証している。現在の研究では化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を用いたが、これは２つのＡＡＶベクターの使用を必要とするのみならず、細胞型特異的標的化を達成するために用い得るプロモーターエレメントのサイズもまた制限する。ＳｐＣａｓ９と比べて実質的に短いものもあるＣａｓ９オルソログの多様性を所与とすれば、本明細書に記載されるとおりの、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡとの両方を発現する単一のＡＡＶベクターをエンジニアリングすることが可能なはずである。
方法
ＤＮＡ構築物
ＳｐＣａｓ９標的選択及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の作成のため、５’−ＮＧＧ ＰＡＭ配列に先行するように２０ｎｔ標的配列を選択した。オフターゲット効果を最小限に抑えるため、ＣＲＩＰＳＲ設計ツールを使用した（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ）。Ｕ６プロモーターを鋳型として使用して、フォワードプライマー：５’−ｃｇｃａｃｇｃｇｔａａｔｔｃｇａａｃｇｃｔｇａｃｇｔｃａｔｃ−３’及び２０ｎｔ ＤＮＡ標的部位（太字）を有するｓｇＲＮＡを含むリバースプライマー：５’−ｃａｃａｃｇｃｇｔＡＡＡＡＡＡｇｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔｇｃｃａｃｔｔｔｔｔｃａａｇｔｔｇａｔａａｃｇ ｇａｃｔａｇｃｃｔｔａｔｔｔｔａａｃｔｔｇｃｔａＴＴＴＣｔａｇｃｔｃｔａａａａｃＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号 ）でｓｇＲＮＡをＰＣＲ増幅した。
対照ｓｇＲＮＡ配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｌａｃＺ遺伝子を標的化するように設計した：
標的配列：ＴＧＣＧＡＡＴＡＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＡＴＧＧＧ（配列番号 ）
ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ構築物はＷｏｒｍａｎ教授（コロンビア大学（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），ＮＹＣ）から供与されたもので、コードカセットをＡＡＶ骨格のヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ）下にクローニングするためのＰＣＲ鋳型として使用した。次に、ＭｌｕＩ部位を使用してＵ６−Ｍｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡコード配列を導入した。多重遺伝子標的化戦略向けに、個々のｓｇＲＮＡを上記に記載したとおりＰＣＲ増幅した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニング戦略を用いることにより、３つ全てのｓｇＲＮＡを、ＰＣＲ増幅したｈＳｙｎ−ＧＦＰ−ＫＡＳＨ−ｂＧＨｐＡカセットとライゲートした（図１Ａを参照）。ＰＣＲ増幅後、３つのｓｇＲＮＡ及びｈＳｙｎ−ＧＦＰ−ＫＡＳＨ−ｂＧＨ ｐＡを含むＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅライゲーション産物をＡＡＶ骨格にクローニングした。得られた全ての構築物をシーケンシングして確認した。ニューロンにおけるＳｐＣａｓ９発現の駆動に最適なプロモーター配列を見付けるため、出願者らは以下を試験した：ｈＳｙｎ１、マウストランケートＭｅｃｐ２（ｐＭｅｃｐ２）、及びトランケートラットＭａｐ１ｂ（ｐＭａｐ１ｂ）プロモーター配列２（図５ａを参照）。以下のプライマーを使用してプロモーター領域を増幅した：
ラットｍａｐ１ｂプロモーターの別のトランケーションは、以下のオリゴでアセンブルした：
短鎖合成ポリアデニル化シグナル（ｓｐＡ）３は、以下のオリゴを使用してアセンブルした：
ＳｐＣａｓ９及びそのＤ１０Ａ突然変異型（ｄＳｐＣａｓ９）は以前記載されている４、５。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるニューロントランスフェクションには、ＥＦ１αプロモーターの制御下にある赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするプラスミドを使用した。
細胞株培養及びトランスフェクション
Ｎｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２ａ）細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＢＳＡ）を含有するＤＭＥＭ中で成長させた。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞には、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭを使用した。細胞は５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で維持した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「ＭＡＸ」試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造者のプロトコルに従い細胞をトランスフェクトした。
濃縮ＡＡＶベクターの作製
等比のＡＡＶ１及びＡＡＶ２血清型プラスミド並びにｐＤＦ６ヘルパープラスミドを使用して高力価ＡＡＶ１／２粒子を作製し、ヘパリンアフィニティーカラムで精製した６。ｑＰＣＲによってウイルス粒子の力価測定を行った。高力価ＡＡＶ１粒子はＵＮＣ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ノースカロライナ大学チャペルヒル校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ））によって作製された。ＤＭＥＭ中の低力価ＡＡＶ１粒子は、以前記載があるとおり作製した７。簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、ＰＥＩ「ＭＡＸ」を使用してトランス遺伝子プラスミド、ｐＡＡＶ１血清型プラスミド及びｐＤＦ６ヘルパープラスミドをトランスフェクトした。４８時間後に培養培地を回収し、０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。
初代皮質ニューロン培養
組織培養用のニューロンを得るために使用した動物を、ＭＩＴ動物管理委員会（ＭＩＴ ＣＡＣ：Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）によって承認されたプロトコルに従い犠牲にした。胚性１６日目のマウス脳から初代培養物を調製した８。男女両性の胚を使用した。細胞を、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）でコートした２４ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はラミニン／ＰＤＬでコートしたカバーガラス（ＶＷＲ）にプレーティングした。培養物は、Ｂ２７、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びペニシリン／ストレプトマイシン混合物を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地において３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた。ＡＡＶ形質導入のため、５００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培養培地中の皮質ニューロンを、７ＤＩＶでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞からの３００μｌ（１：１比での二重感染）ＡＡＶ１含有馴化培地と共にインキュベートした７。形質導入後１週間でニューロンは下流処理用に回収しており、又は免疫蛍光染色若しくは形態分析用に４％パラホルムアルデヒド中に固定している。
ニューロン形態を可視化するため、以前記載のとおりＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１週間使用してＤＩＶ７の細胞にＥＦ１α−ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターをトランスフェクトした９。総樹状突起長さを計測するため、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して個々のニューロンの全ての樹状突起をトレースした。蛍光顕微鏡によって４０倍対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ Ａｘ１０顕微鏡、Ａｘｉｏｃａｍ ＭＲｍカメラ）で取得した画像に関し、一次樹状突起、樹状突起先端の数の定量化及びＳｈｏｌｌ解析１０を実施した。樹状突起の数は、１０μｍより長い全ての非軸索突起の端部をカウントした。Ｓｈｏｌｌ解析については、Ｓｈｏｌｌプラグインを備えたＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞体の周りに直径５μｍ刻みの同心円を自動で描き、各円を横切る樹状突起の数をカウントした。
マウス脳へのＡＡＶ１／２の定位注入
本明細書に記載する全ての動物手順がＭＩＴ ＣＡＣによって承認された。成体（１２〜１６週齢）雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを１００ｍｇ／ｋｇケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で麻酔した。先制鎮痛を投与した（ブプレネックス、１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。承認された手順に従い開頭術を実施し、１μｌの１：１ＡＡＶ混合物（１×１０１３Ｖｇ／ｍｌのｓＭｅｃｐ２−ＳｐＣａｓ９；６×１０１２Ｖｇ／ｍｌのＤＮＭＴ ３×ｓｇＲＮＡ；３〜５×１０１２Ｖｇ／ｍｌのｈＳｙｎ−ＧＦＰ−ＫＡＳＨ）を背側歯状回（前側／後側：−１．７；中外側：０．６；背側／腹側：−２．１５）及び／又は腹側歯状回（前側／後側：−３．５２；中外側：２．６５；背側／腹側：−３）に注入した。ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学記録実験については（図３）、ウイルス注入座標は３ｍｍ外側（ブレグマから）及び後側縫合線から１ｍｍ前側であった。時折生理食塩水で冷却しながらドレメルドリルを使用して頭蓋を薄くし、残りの硬膜を、鉱油中に懸濁したウイルスを充填したガラス製マイクロピペットを使用して穿刺した。隣接部位に２００〜２５０μｍの深さで数回の注入（３〜４回）を行った。１５０〜２００ｎｌの容積のウイルス混合物を各部位につき７５ｎｌ／分の速度で注入した。注入後は毎回、ピペットをその場に３〜５分間保持してから引き込み、漏れを防いだ。切開を縫合し、術後３日間にわたり適切な術後鎮痛薬（メロキシカム、１〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
ｉｎ ｖｉｖｏ二光子誘導標的ルースパッチ記録法
ウイルス注入の２週間後、マウスを電気生理学的実験に使用した。マウスを２％イソフルランで麻酔し、０．８％イソフルランを使用して維持した。皮膚を切除し、ｓｕｇｉで洗浄し、接着剤及び歯科用アクリルを使用して頭蓋に金属ヘッドプレートを取り付け、一次視覚野（Ｖ１）上で２ｍｍ×２ｍｍ開頭術を実施した。次に露出した領域を人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ グルコース；ｐＨ７．４）中の１．５％アガロースの薄層で覆った。実験中、動物の体温は加温ブランケットで３７．５℃に維持した。ホウケイ酸ガラスピペット（ＷＰＩ）を、Ｓｕｔｔｅｒ Ｐ−２０００レーザープラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して引いた。先端径は約１μｍであった一方、抵抗は３〜５ＭΩであった。記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ）を制御して、Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）で書かれたカスタムソフトウェア（Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｉｓｍ、Ｓｕｒ ｌａｂ）を使用して行った。ガラスピペット電極を２０〜３５°の角度で脳に挿入し、Ａｇ／ＡｇＣｌ接地電極ペレット（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を脳及び対物レンズと同じ溶液中に位置決めした。蛍光による可視化のため、ピペットにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を充填した。ピペットは、初めに１０倍レンズを使用して注入部位に標的化し、次に２５倍レンズを使用して、７７０ｎｍの同時二光子イメージングで個々のＧＦＰ＋細胞に標的化した。急激に時間変化する５ｍＶ指令電圧パルスの間に電圧固定で観察される抵抗の振れによって細胞近接性を検出した。抵抗が５〜１０ＭΩ上昇したところで、増幅器を電流固定に切り換え、ゼロ注入電流、４ＫＨｚのベッセルフィルタ下及び３００ＨｚのＡＣフィルタ下でスパイクを記録した。ウイルスを注入した脳は事後に灌流し、免疫組織化学を実施した。
視覚刺激及びｉｎ ｖｉｖｏ二光子誘導標的ルースパッチ記録法からのデータ解析
ゲノム編集されたニューロンの方位選択性及びチューニングを評価するため、出願者らは、Ｍａｔｌａｂ ＰｓｙｃｈＴｏｏｌｂｏｘ−３で書かれたカスタムソフトウェアを使用して定方位グレーティングを提示した。グレーティングは細胞応答性に対して最適化し、方位を０から３６０度まで２０度刻みで段階的に変えることにより提示し、各グレーティングの提示は４秒間「オフ」が先行し、その後４秒間「オン」が続き、合計提示時間を１４４秒であった。
データはＭａｔｌａｂに直接取得し、．ｍａｔファイルとして保存した。スパイク検出は、手動で定義した閾値と、続いてさらなる妥当性確認のためスパイク形状鋳型マッチングを使用した解析ルーチンによって実施した。全てのスパイクをタグ付けし、グラフィカルユーザインターフェースのスクリーンに表示して、偽陽性及び偽陰性を実験者が手動で精査した。次に各刺激に応答したスパイク回数をその視覚刺激に対するタイミングに基づき「オン」期間又は「オフ」期間に分類し、各刺激の「オン」スパイクを、同じ時間内に観察された「オフ」スパイクの数だけデクリメントした。方位実験について、「オン」期間及び「オフ」期間は同じ長さであったため、刺激当たりのスパイク数＝（「オン」スパイク数）−（「オフ」スパイク数）である。目的とするあらゆる細胞について、この方法を用いて各方位刺激（０〜３６０度、２０度刻み）に対する応答を収集した。次にこれらの応答を、試験毎に方位対応答の「チューニング曲線」に変えた。以下のとおりの式に従い好ましい方位のベクトル平均を取ることにより、方位選択性指数（ＯＳＩ）を計算した：
組織調製及び細胞核の精製
海馬又は歯状回の全体を氷冷ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で速やかに解剖し、ドライアイスで衝撃凍結した。細胞核精製のため、組織を２ｍｌの氷冷ホモジナイズ緩衝液（ＨＢ）（３２０ｍＭ スクロース、５ｍＭ ＣａＣｌ、３ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）２、１０ｍＭ トリス ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ４０、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に、２ｍｌダウンス型ホモジナイザー（Ｓｉｇｍａ）を使用して；ペッスルＡで２５回、続いてペッスルＢで２５回、穏やかにホモジナイズした。次に、合計５ｍｌになるまで３ｍｌのＨＢを添加し、氷上に５分間置いておいた。勾配遠心のため、５ｍＭ ＣａＣｌ、３ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）２、１０ｍＭ トリス ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有する５ｍｌの５０％ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）密度勾配媒体（Ｓｉｇｍａ）を添加して混合した。この溶解物を、コニカル３０ｍｌ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＳＷ２８ロータ）の中の１０ｍｌ ２９％等浸透圧ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）溶液の上に穏やかに入れた。試料を１０，１００×ｇ（７，５００ｒｐｍ）、４℃で３０分間遠心した。上清を取り除き、核ペレットを、６５ｍＭ β−グリセロリン酸（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、３４０ｍＭ スクロース及び５％グリセロール中に穏やかに再懸濁した。精製した核の数及び質を、明視野顕微鏡法を用いて検査した。
細胞核選別
精製したＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）及び陰性（ＧＦＰ−）のインタクトな核をＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｒｕｂｙ染色剤（１：５００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で同時標識し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ，ＭＩＴ）を使用して選別した。ＧＦＰ＋核及びＧＦＰ−核を、１％ＢＳＡでコーティングされた、且つ４００μｌの再懸濁緩衝液（６５ｍＭ β−グリセロリン酸 ｐＨ７．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、３４０ｍＭ スクロース及び５％グリセロール）が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に収集した。選別後、全ての試料を氷上に保ち、１０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。核ペレットを−８０℃で保存し、又は下流処理に直接使用した。
ゲノムＤＮＡ抽出及びＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイ
ｓｇＲＮＡの機能試験のため、５０〜７０％コンフルエントのＮ２ａ細胞に、単一のＰＣＲ増幅したｓｇＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９ベクターをコトランスフェクトした。ＳｐＣａｓ９のみをトランスフェクトした細胞を陰性対照として供した。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコルに従いＤＮＡを抽出した。ＡＡＶ１形質導入初代ニューロンからゲノムＤＮＡを単離するため、ＡＡＶ形質導入の７日後にＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキットを製造者の指示に従い使用した。選別した核又は解剖した組織を、溶解緩衝液（１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＳＤＳ、プロテイナーゼＫ（ＰＫ、１ｍｇ／ｍｌ）及びＲＮアーゼＡ）中において５５℃で３０分間溶解させた。次に、クロロホルム−フェノール抽出、続いてエタノールによるＤＮＡ沈殿を、標準的手順に従い実施した。最後にＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、下流分析に使用した。個々のｓｇＲＮＡの機能試験を、補表２に掲載するＰＣＲプライマーを使用したＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって実施した。本明細書に記載されるとおり、バンド強度の定量化を実施した。
ＲＮＡライブラリ調製及びシーケンシング
Ｍｅｃｐ２を標的化するガイドを有するＳｐＣａｓ９（４匹の動物）又はｌａｃＺを標的化するｇＲＮＡを有するＳｐＣａｓ９（４匹の動物）の両側性ウイルス送達の２週間後、歯状回を氷冷ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で速やかに解剖し、直ちにＲＮＡ−ｌａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）に移した。４℃で２４時間後、組織を−８０℃に移した。１００個の標的神経核の集団を、１％２−メルカプトエタノール（Ｑｉａｇｅｎ）を補足した１０μｌ ＴＣＬ緩衝液中にＦＡＣＳ選別した。遠心後、直ちに試料を−８０℃で凍結した。ＲＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ ＲＮＡｃｌｅａｎＸＰ ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で製造者の指示に従い精製し、８０％エタノールで３回洗浄し、最終的な溶出は省いた。ＲＮＡを捕捉したビーズを風乾させて、直ちにｃＤＮＡ合成用に処理した。核を含まない試料を陰性対照として使用した。ｃＤＮＡライブラリの調製においては、逆転写酵素を０．１ｕｌのＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ酵素（２００Ｕ／ｕｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に置き換え、且つＰＣＲ反応を２５ｕｌの容積にスケールダウンしたことを除きＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ２プロトコルに従い、各動物につき３個の集団試料、合計２４個の集団試料を使用した。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を以下の改変を伴い使用して、タグメンテーション反応及び最終的なＰＣＲ増幅を行った。反応容積は全て４分の１にスケールダウンし、且つＰＣＲ増幅ステップ後に、各試料につき２．５ｕｌを取ることによりライブラリをプールした。プールしたライブラリを、２ラウンドの０．７容積のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズクリーンアップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してクリーニングし、サイズ選択した。試料を高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）にロードしてライブラリのクオリティを確かめ、一方、Ｑｕｂｉｔ高感度ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量化を行った。プールしたライブラリを４ｎＭの終濃度及び１２ｐｍｏｌとなるように希釈し、７５ｂｐペアエンドリードでＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑを使用してシーケンシングした。
ＲＮＡライブラリデータ解析
マウスｍｍ９ ＵＣＳＣゲノム及び既知の遺伝子トランスクリプトーム１３に基づきＢｏｗｔｉｅ２インデックスを作成し、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してコマンドラインオプション−ｑ −−ｐｈｒｅｄ３３−ｑｕａｌｓ −ｎ ２ −ｅ ９９９９９９９９ −ｌ ２５ −Ｉ １ −Ｘ １０００ −ａ −ｍ ２００ −ｐ ４ −−ｃｈｕｎｋｍｂｓ ５１２でペアエンドリードをこのインデックスと直接アラインメントした。次に、Ｂｏｗｔｉｅ２によって作成されたアラインメントに対してＲＳＥＭ ｖ１．２７をデフォルトパラメータで実行し、発現レベルを推定した。各遺伝子についてＲＳＥＭ遺伝子レベル発現推定値（τ）に１，０００，０００を乗じて転写物百万分率（ＴＰＭ）推定値を求め、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）を取ることによりＴＰＭ推定値を対数空間に変換した。遺伝子は、その変換後発現レベルが（ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）目盛で）２以上である場合に検出されたと見なした。検出された遺伝子が８０００個未満の場合には、ライブラリは除外した。この基準に基づき４個のライブラリが選別され、下流分析から外された。対照動物とＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡを発現する動物との間の差次的発現遺伝子を見付けるため、２０回のランダムな順列ランでスチューデントｔ検定（Ｍａｔｌａｂ Ｖ２０１３ｂ）及びクロス確認を使用し、ここでは各ランにおいて各動物から１つのライブラリがランダムに選択され、除外された（これにより毎回のｔ検定で合計１２個のライブラリが使用されることになる）。各試料について平均発現レベルが０．９分位点より高い（通常約５ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１））全ての遺伝子に関して、ｔ検定を実行した。次に、３分の１より多い順列ランで有意であった（ｐ＜０．０１）遺伝子を選択した。全試料にわたるこれらの遺伝子のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）発現レベルを、階層クラスタリング（Ｍａｔｌａｂ Ｖ２０１３ｂ）を使用してクラスタリングした。
免疫蛍光染色
細胞培養：初代ニューロンの免疫蛍光染色のため、細胞をウイルス送達７日後に４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ）（ＰＦＡ）によって室温で２０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＰＢＳ中５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％ロバ血清（ＤＳ）（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）によって室温で３０分間ブロックした。細胞を一次抗体と共に２．５％ＮＧＳ、２．５％ＤＳ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、細胞を二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、ＤＡＰＩ含有ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ＨａｒｄＳｅｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してカバーガラスをマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ Ａｘ１０顕微鏡及びＡｘｉｏｃａｍ ＭＲｍカメラを使用してイメージングした。画像をＺｅｎ ２０１２ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して処理した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア１．４８ｈ及びニューロン検出器プラグインを使用することにより定量化を実施した。ウイルス送達の４週間後に、致死量のケタミン／キシラジンによってマウスを犠牲にし、ＰＢＳ、続いてＰＦＡで経心的に灌流した。固定した組織を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ、ＶＴ１０００Ｓ）を使用して切片化した。次に、３０μｍ切片をクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸三ナトリウム脱水物、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中で２分間煮沸し、室温で２０分間冷却した。切片をＴＢＳＴ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス ｐＨ７．６、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の４％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で１時間ブロックした。パラフィン切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２１２５ ＲＴＳ）を使用して８μｍに切り、先述のとおり染色した。切片を、４％ＮＧＳを含むＴＢＳＴ中に希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ中で３回洗浄した後、試料を二次抗体と共にインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ＨａｒｄＳｅｔ封入剤を使用して切片をマウントし、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０、Ａｘ１０ ＩｍａｇｅｒＺ２、Ｚｅｎ ２０１２ソフトウェア）で可視化した。以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗Ｄｎｍｔ３ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１００）；ウサギ抗ＭｅＣＰ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２００）；マウス抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：５０〜１：４００）；ニワトリ抗ＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ、１：４００）；マウス抗Ｍａｐ２（Ｓｉｇｍａ、１：５００）；ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ ｌａｂｓ、１：２００〜１：４００）；マウス抗ＨＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００）。二次抗体：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、５６８又は６３３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：５００〜１：１，０００）。
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）アッセイの定量化
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）アッセイ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従い使用して、対照及び形質導入初代ニューロンを染色した。ＧＦＰ−ＫＡＳＨ発現からのＧＦＰシグナルへの干渉を回避するため、ＤＥＡＤ（エチジウムホモ二量体）及びＤＡＰＩ（全ての細胞）のみについて細胞を染色した。染色した細胞を蛍光顕微鏡法を用いてイメージングし、ＩｍａｇｅＪ １．４８ｈソフトウェア及びニューロン検出器プラグインを使用してＤＥＡＤ、ＧＦＰ及びＤＡＰＩ陽性細胞をカウントした。
ウエスタンブロット分析
形質導入初代皮質ニューロン（２４ウェル、ウイルス送達７日後）及び形質導入組織試料（ウイルス送達４週間後）を、０．１％ＳＤＳ及びプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ）を含有する５０μＬの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中で溶解させた。細胞溶解物をＢｉｏｒｕｐｔｏｒソニケーター（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）で５分間超音波処理し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使用してタンパク質濃度を決定した。タンパク質溶解物（ｌｙｓａｔｓ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に溶解し、還元条件下４〜１５％トリス−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、一次抗体：ウサギ抗Ｄｎｍｔ３ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：５００）、マウス抗Ｄｎｍｔ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：８００）、ウサギ抗Ｍｅｃｐ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：４００）、ウサギ抗チューブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０，０００）、続いて二次抗マウス及び抗ウサギ（ｒａｂｂｂｉｔ）ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１：１０，０００）を使用したウエスタンブロッティングによって分析した。ＧＡＰＤＨはウサギＨＲＰ共役抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０，０００）で直接可視化した。チューブリン又はＧＡＰＤＨをローディング対照として供した。ＩｍａｇｅＬａｂ ４．１ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を備えるＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰシステムでブロットをイメージングし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア１．４８ｈを使用して定量化した。
遅延文脈的恐怖条件付け（ＤＣＦＣ）
１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウスの背側及び腹側歯状回への両側性ＳｐＣａｓ９／ＤＮＭＴ ３ｘｓｇＲＮＡ送達の８週間後、動物を実験者及び行動実験室に７日間馴化させた。ＳｐＣａｓ９／ＧＦＰ−ＫＡＳＨを注入した同腹仔を対照として供した。ＤＣＦＣの１日目、マウスケージを隔離された控え室に置き、試験前及び試験後にマウスに聴覚キューが入ることを防いだ。個々のマウスをＦＣチャンバ（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．）に置き、１２分間の馴化期間を実施した。馴化後、マウスをそのホームケージに戻した。翌日（訓練日）、個々のマウスをチャンバに入れ、４分間馴化させた。さらに２０秒間の（トーン前）間隔後、トーン（聴覚キュー）を８５ｄＢ、２．８ｋＨｚのレベルで２０秒間提示し、続いて１８秒間の遅延間隔を置いた後、フットショックを提示した（０．５ｍＡ、２秒間）。フットショック後、４０秒間の間隔（トーン／ショック後）を置いた後、次の同じ試行を２０秒間のトーン前期間から開始した。この訓練試行を６回繰り返してからマウスをそのホームケージに戻した。３日目（試験日）、マウスを初めに条件付け文脈チャンバに３分間置いた。次に、マウスは、２０秒間の間隔から始まり、２０秒間のトーン及び６０秒間のトーン後間隔が続く４×１００秒間の試験試行を受けた。最後に、マウスを文脈を変えた条件付けチャンバ（フラットフロア対グリッド、四分割対七分割チャンバ、バニリン芳香）に入れ、試験試行を繰り返した。フリージング行動を記録し、分析を盲検的にオフラインで手動で実施し、Ｎｏｌｄｕｓ ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で確認した。
ディープシーケンシング及びインデル検出
ＣＲＩＳＰＲ設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を使用して、脳においてＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９により標的化されるＤＮＭＴファミリー遺伝子の潜在的なオフターゲットを見付けた。ウイルス送達の１２週間後に歯状回の標的細胞核をＦＡＣＳ選別し、ゲノムＤＮＡを上記に記載したとおり精製した。目的の遺伝子毎に、ＣＲＩＳＰＲ標的部位に隣接するゲノム領域をフュージョンＰＣＲ法によって増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５アダプター並びにユニークな試料特異的バーコードを標的アンプリコンに取り付けた（オンターゲット及びオフターゲットプライマーについては、補表３を参照のこと）。バーコードを付加して精製したＤＮＡ試料をＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって定量化し、等モル比でプールした。次にシーケンシングライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌシーケンサー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってリード長さ３００ｂｐでシーケンシングした。ＭｉＳｅｑリードを以前記載のとおり解析した１５。簡潔に言えば、リードをＰｈｒｅｄクオリティ（Ｑスコア）によってフィルタリングし、スミス−ウォーターマンアルゴリズムを用いて標的部位の５０ヌクレオチド上流及び下流のゲノム領域とアラインメントした。標的部位の５ヌクレオチド上流から５ヌクレオチド下流まで（合計３０ｂｐ）のアラインメント領域におけるインデルを推定した。各試料の陰性対照を使用して、インデルが含まれるか又は含まれないかを推定切断イベントとして推定した。出願者らは、真のインデルを含む標的領域を有するリードの割合について、陰性対照試料のデータからの標的領域毎リード毎のエラー率を使用して最尤推定量（ＭＬＥ）を計算した。各標的のＭＬＥスコア及び切断率を補表１に掲載する。
統計的分析
全ての実験は、最小２つの独立した生物学的レプリケートで行った。統計は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）でスチューデント両側ｔ検定を用いて実施した。
実施例２：ｉｎ ｖｉｖｏ網膜疾患モデル（網膜色素変性症マウスモデル）
出願者らは、ＡＡＶにパッケージングしたときのＣａｓ９を使用したゲノムエンジニアリング手法のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証し、それを使用した哺乳類細胞における内因性ゲノム配列の改変に成功している。出願者らはこの系を使用して、人体における重要な分裂終了細胞集団の一つであるニューロンにおける遺伝子エンジニアリングの可能性を実証する。出願者らの研究は、ヒト患者に見られるものと同様の遺伝的欠陥に対応する突然変異を有するマウスモデルでヒト疾患網膜色素変性症に関連する突然変異を修正することを通じて、体細胞組織のこのｉｎ ｖｉｖｏゲノムエンジニアリングの治療可能性を強調する。出願者らの研究に使用されるマウス系統は、Ｃ５７ＢＬ／６系統Ｂ６．１２９Ｓ６（Ｃｇ）−Ｒｈｏｔｍ１．１Ｋｐａｌ／Ｊである。このマウス系統を選択した理由は、これらのマウスがマウスロドプシン（Ｒｈｏ）遺伝子のコドン２３にＣＣＣからＣＡＣへのヌクレオチド置換を有するためである。このコドンは、２３位でフェニルアラニンに代えてヒスチジンのアミノ酸置換、Ｐ２３Ｈをコードする。Ｐ２３Ｈ突然変異は、常染色体優性網膜色素変性症に最もよく見られる原因の一つである。Ｒｈｏ遺伝子のゲノム位置は、マウス６番染色体上：１１５、９３１、９２７〜１１５、９３８、８２９である。本出願者らは、標的突然変異に関してホモ接合のマウスが生存可能且つ繁殖可能であることを観察した。突然変異体及び野生型遺伝子産物（ｍＲＮＡ）の両方ともに、ｃＤＮＡシーケンシングクロマトグラムによって検出される。ヘテロ接合マウスにおける表現型は、Ｐ２３Ｈ突然変異によって引き起こされる常染色体優性網膜色素変性症の患者で観察される網膜症及び進行性網膜変性症を模倣する。３５日齢までに、ヘテロ接合体は対照と比べて桿体外節が短くなっている。生後６３日目、ヘテロ接合体は桿体核数が減少しており（野生型マウスに観察される数の半分）、桿体外節の長さが短くなっている。ホモ接合マウスは一層重篤な表現型を呈して外核層が薄くなり、生後２３日目までに視細胞が重度に変性し、生後６３日目までにほぼ全ての視細胞が失われる。突然変異Ｐ２３Ｈタンパク質のグリコシル化が重度に減少する。
マウス系統Ｂ６．１２９Ｓ６（Ｃｇ）−Ｒｈｏｔｍ１．１Ｋｐａｌ／Ｊにおける網膜ニューロンへのＣａｓ９系のＡＡＶ送達：
出願者らは、網膜ニューロンの正常機能に決定的に重要な遺伝子Ｒｈｏを標的化し、且つｃａｓ９ゲノムエンジニアリングツール及び組換え鋳型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を使用して標的に相同組換えを誘導し、関係する疾患関連突然変異Ｐ２３Ｈを修正することにした。出願者らは、３つの標的、赤色で表示される単一ヌクレオチド突然変異Ｃ−Ａを伴うオレンジ色で表示されるＰ２３Ｈ突然変異部位を設計した（図１８Ａを参照）。この手法は、このマウスモデルにおける遺伝子突然変異の修正が疾患関連表現型をレスキューし得ることを実証し、さらに、成体動物のニューロンにおいてゲノム改変を実施することの実現可能性を実証する。さらに、この研究は、モデル系としてこの系統の網膜ニューロンを使用して、遺伝子エンジニアリング目的で神経細胞型において誘導することのできた相同組換えレベルを評価するための情報を提供する。実験セットアップは、下表に示すとおりである：
合計２５匹のマウスを使用して繁殖ペアをセットアップし、従って本研究には、各系統につき合計＝１００匹のマウスを使用する。
ＡＡＶの網膜注射：
網膜下注射を送達経路として使用する。マウスは、体温に加温し、且つ最大１Ｅ１２個のウイルス粒子を含有する０．５〜１マイクロリットルの生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）の網膜下注射を受ける。これらのマウスは６週齢超である。動物は加温パッド及び／又はランプで保温し、モニタする。手技に関連する合併症の臨床徴候に関して動物を毎日モニタする。マウス当たり最大２回の注射を投与する。
組織採取：
材料を注射して１〜４週間後にＣＯ２吸入法によってマウスを犠牲にした後、マウスから組織を採取する。遺伝子トランスフェクションの成功、ゲノム変化、又は毒性のエビデンスに関して組織を分析する。
実施例３：網膜色素変性症に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング手法
ガイド選択及びｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
初めに、ヒトゲノムにおける遺伝子ＲＨＯを標的化するＳａＣａｓ９用ガイドを、以下に示すとおり設計する。これは、疾患を引き起こす突然変異Ｐ２３Ｈの遺伝子座に基づき選択されている。設計は、最も高い効率及び特異性の治療的遺伝子修正を促進するため疾患突然変異部位に最も近いオンターゲット切断が導入される可能性が最大となるように計算アルゴリズムによって作成した。ガイドはまた、そのＤＮアーゼＩ過感受性（ＨＳ）アッセイ結果に関してスクリーニングし、標的ガイド配列に対応するゲノム領域の接触し易さを最大化して、それによりｉｎ ｖｉｖｏでの送達後のガイドの予想効率を増加させた。２つ以上のガイドを選択し、次にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養ヒト細胞（ＨＥＫ ２９３ＦＴ）においてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いてスクリーニングすることにより、標的ゲノム遺伝子座におけるインデル形成の誘導効率を計測する。次にｉｎ ｖｉｔｒｏで最も高い効率を有するガイドを、ウイルス作製及びｉｎ ｖｉｖｏでの下流実験用に選択する。図１８Ａ〜図１８Ｂは、ＲＨＯ遺伝子座に対するガイド設計、及びＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏガイドスクリーニング結果を示す。
相同組換え鋳型設計及び検証
次に、標的に相同組換えを誘導することにより相同依存性修復を用いて関係のある疾患関連突然変異Ｐ２３Ｈを修正するため、罹患していないヒト個体の野生型（正常）ゲノム配列に基づきＨＲベクターを合成する。このベクターは、ＡＡＶパッケージングシグナル、及び合計で最大５ｋｂのホモロジーアームを有する正常バージョンのゲノム配列を有する：以下に示すとおり、標的突然変異部位Ｐ２３Ｈを中央に挟んで２つのホモロジーアーム、左及び右が、配列の両側にある。このベクターを、前節で計測したとき最良のガイドを有するＳａＣａｓ９系をコードする対応するベクターと１：１比、１：３比、１：５比でコトランスフェクトすることによりｉｎ ｖｉｔｒｏで検証し、次に制限断片長多型アッセイ（ＲＦＬＰ）アッセイを用いて標的Ｐ２３Ｈ遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）効率を計測し、そのようにしてＨＤＲ手順に最適な条件を検証する。
図１９は、ＲＨＯ ＨＲ ＡＡＶベクターを示す。相同組換え鋳型としての働きに関与する部分の具体的な配列を、以下に掲載する。
＞Ｒｈｏ ＨＲ ＡＡＶベクター鋳型領域
Ｃａｓ９ゲノムエンジニアリングツール及び組換え鋳型のＡＡＶ送達
最後に、ｉｎ ｖｉｖｏでのｃａｓ９ゲノムエンジニアリングツール及び組換え鋳型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を用いるため、両方のウイルスを血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８（全て有効である）で作製し、勾配超遠心法又はクロマトグラフィー法によって精製する。次に前節で決定されるとおりの最適条件を用いてウイルス粒子を網膜下送達経路で視細胞及びＲＰＥ細胞に注射する。
注射プロトコル詳細
ＡＡＶの網膜注射：体温に加温した種々の用量のＡＡＶウイルス粒子を含有する最大１ミリリットルの生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）の注射によって網膜下注射を実施する。１つはＳａＣａｓ９用及び１つはＨＲ鋳型の２つの異なるＡＡＶベクターを種々の比で混合し（例えばＳａＣａｓ９対ＨＲ鋳型＝１：１、１：３、又は１：５）、最適条件を決定する。注射に使用する用量は、合計１．５×１０Ｅ１０個のベクターゲノム程の低さであっても、又は最大合計１．５×１０Ｅ１１個のベクターゲノムであってもよい。用量が高い程、遺伝子療法の有効性は良好になるが、ウイルスベクター注射に対する免疫応答に起因して合併症の可能性の増加につながり得る。手技に関連する合併症の臨床徴候に関して患者を毎日モニタする。この手順は、本質的に以下の文献に提供されるガイドラインに従う：Ｍａｇｕｉｒｅ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００８ Ｍａｙ ２２；３５８（２１）：２２４０−８．ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０８０２３１５．Ｅｐｕｂ ２００８ Ａｐｒ ２７．「レーベル先天性黒内障のための遺伝子導入の安全性及び有効性（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ Ｌｅｂｅｒ’ｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ）」、Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｍａｒ；１８（３）：６４３−５０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００９．２７７．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｄｅｃ １．「レーベル先天性黒内障に対する遺伝子療法はベクター投与後１．５年まで安全且つ有効である（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｅｂｅｒ’ｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ ｉｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｒｏｕｇｈ １．５ ｙｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、Ｍａｇｕｉｒｅ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２００９ Ｎｏｖ ７；３７４（９７０１）：１５９７−６０５．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（０９）６１８３６−５．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｏｃｔ ２３．「レーベル先天性黒内障に対するＲＰＥ６５遺伝子療法の年齢依存的効果：第１相用量漸増試験（Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＲＰＥ６５ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｅｂｅｒ’ｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ：ａ ｐｈａｓｅ １ ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ）」。
注射後手順
注射後、免疫応答又は有害作用がないか患者をモニタする。少なくとも４週間後、制限断片長多型アッセイ（ＲＦＬＰ）を用いて、眼細胞型で誘導することのできた相同組換えレベルを評価する。そして次に、ＲＰ表現型の軽減又は回復もまた評価する。
実施例４：色覚異常に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング
ガイド選択及びｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
初めに、ヒトゲノムにおける遺伝子ＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３を標的化するＳａＣａｓ９用ガイドを、以下に示すとおり設計する。これは、疾患を引き起こす突然変異、即ちＣＮＧＡ３についてＲ２７７Ｃ及びＲ２８３Ｗ並びにＣＮＧＢ３について１１４８ｄｅｌＣの遺伝子座に基づき選択されている。設計は、最も高い効率及び特異性の治療的遺伝子修正を促進するため疾患突然変異部位に最も近いオンターゲット切断が導入される可能性が最大となるように計算アルゴリズムによって作成した。ガイドはまた、そのＤＮアーゼＩ過感受性（ＨＳ）アッセイ結果に関してスクリーニングし、標的ガイド配列に対応するゲノム領域の接触し易さを最大化して、それによりｉｎ ｖｉｖｏでの送達後のガイドの予想効率を増加させた。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって最も効率的なガイドをｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができるように２つ以上のガイドを選択する。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最も高い効率を有するガイドをウイルス作製及びｉｎ ｖｉｖｏでの下流実験用に選択する。図２０Ａ〜図２０Ｂは、ＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３に対するガイド選択（ｓｅｌｃｔｉｏｎ）を示す。
相同組換え鋳型設計及び検証
次に、標的に相同組換えを誘導することにより相同依存性修復を用いて関係のある疾患関連突然変異を修正するため、罹患していないヒト個体のそれぞれＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３遺伝子の野生型（正常）ゲノム配列に基づきＨＲベクターを合成する必要がある。
図２１及び図２２は、それぞれＣＮＧＡ３ ＨＲ ＡＡＶベクター及びＣＮＧＢ３ ＨＲ ＡＡＶベクターのマップを示す。これらのベクターは、ＡＡＶパッケージングシグナル、及び合計で最大５ｋｂのホモロジーアームを有する正常バージョンのゲノム配列を有する：以下に示すとおり、標的突然変異部位を中央に挟んで２つのホモロジーアーム、左及び右が、配列の両側にある。このベクターを、前節で計測したとき最良のガイドを有するＳａＣａｓ９系をコードする対応するベクターと１：１比、１：３比、１：５比でコトランスフェクトすることによりｉｎ ｖｉｔｒｏで検証し、次に制限断片長多型アッセイ（ＲＦＬＰ）アッセイを用いて標的遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）効率を計測し、そのようにしてＨＤＲ手順に最適な条件を検証する。
相同組換え鋳型としての働きに関与する部分の具体的な配列を、以下に掲載する。
＞ＣＮＧＡ３ ＨＲ ＡＡＶベクター鋳型領域
＞ＣＮＧＢ３ ＨＲ ＡＡＶベクター鋳型領域
Ｃａｓ９ゲノムエンジニアリングツール及び組換え鋳型のＡＡＶ送達
最後に、ｉｎ ｖｉｖｏでのｃａｓ９ゲノムエンジニアリングツール及び組換え鋳型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を用いるため、両方のウイルスを血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８（全て有効である）で作製し、勾配超遠心法又はクロマトグラフィー法によって精製する。次に前節で決定されるとおりの最適条件を用いてウイルス粒子を網膜下送達経路で視細胞及びＲＰＥ細胞に注射する。
注射プロトコル詳細
ＡＡＶの網膜注射：体温に加温した種々の用量のＡＡＶウイルス粒子を含有する最大１ミリリットルの生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）の注射によって網膜下注射を実施する。１つはＳａＣａｓ９用及び１つはＨＲ鋳型の２つの異なるＡＡＶベクターを種々の比で混合し（例えばＳａＣａｓ９対ＨＲ鋳型＝１：１、１：３、又は１：５）、最適条件を決定する。注射に使用する用量は、合計１．５×１０Ｅ１０個のベクターゲノム程の低さであっても、又は最大合計１．５×１０Ｅ１１個のベクターゲノムであってもよい。用量が高い程、遺伝子療法の有効性は良好になるが、ウイルスベクター注射に対する免疫応答に起因して合併症の可能性の増加につながり得る。手技に関連する合併症の臨床徴候に関して患者を毎日モニタする。
注射後手順
注射後、免疫応答又は有害作用がないか患者をモニタする。少なくとも４週間後、制限断片長多型アッセイ（ＲＦＬＰ）を用いて、眼細胞型で誘導することのできた相同組換えレベルを評価する。そして次に、色覚異常表現型の軽減又は回復もまた評価する。
実施例５：加齢性黄斑変性症に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療的ゲノムエンジニアリング手法
ガイド選択及びｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
初めに、ヒトゲノムにおけるゲノム遺伝子座ＶＥＧＦＡを標的化するＳａＣａｓ９用ガイドを、以下に示すとおり設計する。これは遺伝子の第１のエクソンの範囲内で選択されたが、遺伝子の他の部分も同様に標的化することができ、従って広範囲の標的領域をスクリーニングして最も有効なガイド設計を決定することができる。全ての設計は、転写開始部位に最も近い、且つ網膜における種々の発現転写物の共通領域の範囲内に位置するオンターゲット切断が導入される可能性が最大となるように計算アルゴリズムによって作成した。これにより、最も高い効率及び特異性の治療的遺伝子修正が促進されることになる。ガイドはまた、そのＤＮアーゼＩ過感受性（ＨＳ）アッセイ結果に関してスクリーニングし、標的ガイド配列に対応するゲノム領域の接触し易さを最大化して、それによりｉｎ ｖｉｖｏでの送達後のガイドの予想効率を増加させた。最も効率的なガイドをｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができるように２つ以上のガイドを選択した。図２３Ａ〜図２３Ｂは、ＶＥＧＦＡに対するガイド選択（ｓｅｌｃｔｉｏｎ）を示す。
設計したガイドがヒト細胞におけるＶＥＧＦＡ遺伝子の発現を有効に抑制し得ることを確かめ、最適なガイド及び条件を見付ける。設計したガイドを有する閉じたＡＡＶベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３）に送達する。細胞は送達後７２〜９６時間で回収した。細胞からＲＮＡ及びタンパク質を抽出する。ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲ法又は他のＲＮＡ計測方法によって計測する一方、ＶＥＧＦのタンパク質レベルもまたＥＬＩＳＡ又は他のタンパク質計測方法によって計測する。最も重要な基準はＶＥＧＦタンパク質レベルであり、なぜならこれが系の臨床効果に直接関係するためである。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦの発現レベルを低下させる効率が最も高いガイドを、ウイルス作製及びｉｎ ｖｉｖｏでの下流実験用に選択する。
最後に、ｃａｓ９ゲノムエンジニアリングツールのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を用いてｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦ発現を破壊するため、血清型ＡＡＶ２及びＡＡＶ８（両方ともに有効である、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ−ＤＪなどの他のＡＡＶ血清型が使用されてもよいが、但し効力は劣る）でウイルスを作製する。ウイルス粒子は全て、勾配超遠心法又はクロマトグラフィー法によって精製する。
次に前節で決定されたとおりの最適条件を用いてＡＡＶウイルス粒子を硝子体内経路で注射し、ここではＡＡＶは、眼の硝子体液に注射される。この手順は低侵襲性であり、構築物の持続的な発現を維持して、治療的修正効果を誘導するためのＶＥＧＦ発現の十分な破壊を得ることができる。
注射プロトコル詳細
ＡＡＶの網膜注射：硝子体内注射は、体温に加温した種々の用量のＡＡＶウイルス粒子を含有する典型的には１００マイクロリットル（又は推奨されないが最大１ミリリットル）の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）の注射によって実施する。注射に使用する用量は、合計１×１０Ｅ８個のベクターゲノム程の低さであっても、又は最大合計１×１０Ｅ１１個のベクターゲノムであってもよい。種々の投薬量を使用することにより、最適用量の決定が可能となる。
用量が高い程、遺伝子療法の有効性は良好になるが、ウイルスベクター注射に対する免疫応答に起因して合併症の可能性の増加につながり得る。手技に関連する合併症の臨床徴候について患者を毎日モニタし得る。
ヒト注射パラメータに関する参考文献は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ（ｄｏｔ）Ｇｏｖ−臨床試験情報に関する米国政府のウェブサイト、ウェブアドレス：ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１０２４９９８で利用可能である。
注射後手順
注射後、免疫応答又は有害作用がないか、患者をモニタする。少なくとも４週間後、ＥＬＩＳＡ又は他のタンパク質計測方法を用いて網膜におけるＶＥＧＦレベルを評価することができる。そして次に、ＡＲＭＤ表現型の軽減又は回復を評価する。
患者においてフォローすべき重要な安全尺度には、単回一眼硝子体内注射の最大耐容量、有害事象が現れる治療回数、及び注射後の網膜厚さが含まれる。
実施例６：ＡＴＯＨ１発現を刺激して難聴又は聴覚障害を治療するｄＳａＣａｓ９
ガイド選択及びｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
初めに、ヒトゲノムにおける遺伝子ＡＴＯＨ１を標的化するＳａＣａｓ９用ガイドを、以下に示すとおり設計する。これは、標的遺伝子発現に関する後成的モジュレーションの効率を最大化するのに最適なパラメータに基づき選択されている。具体的には、設計は、最も高い効率及び特異性の治療遺伝子療法を促進するためオンターゲット結合が導入される可能性が最大となるように計算アルゴリズムによって作成した。ガイドはまた、そのＤＮアーゼＩ過感受性（ＨＳ）アッセイ結果に関してスクリーニングし、標的ガイド配列に対応するゲノム領域の接触し易さを最大化して、それによりｉｎ ｖｉｖｏでの送達後のガイドの予想効率を増加させた。さらに、ガイドの選択においては、潜在的に結合を妨げ得る転写因子部位もまた考慮した。２つ以上のガイドを選択し、次にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養ヒト細胞（ＨＥＫ ２９３ＦＴ）においてスクリーニングして、それがＡＴＯＨ１遺伝子発現を誘導する効率を計測する。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率が最も高いガイドをｉｎ ｖｉｖｏでの下流実験及び治療介入用に選択する。ＡＴＯＨ１のガイドの具体的な設計を図２５Ａ〜図２５Ｃに示す。
ガイドスクリーニング及び検証
設計したガイドがヒト細胞におけるＡＴＯＨ１遺伝子の発現を有効に誘導し得ることを確かめ、且つ最適なガイド及び条件を見付けるため、ヒト細胞株でｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング及び検証を実施する。ｄＳａＣａｓ９、融合エフェクター、及び最適ガイドＲＮＡを含有するこの系を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３）に送達する（図２４）。細胞は送達後７２〜９６時間で回収した。細胞からＲＮＡ及びタンパク質を抽出する。ＡＴＯＨ１のｍＲＮＡレベルはｑＲＴ−ＰＣＲ法又は他のＲＮＡ計測方法によって計測する一方、ＡＴＯＨ１のタンパク質レベルはＥＬＩＳＡ又は他のタンパク質計測方法によって計測する。最も重要な基準はＡＴＯＨ１タンパク質レベルであり、なぜならこれが系の臨床効果に直接関係するためである。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＴＯＨ１の発現を刺激する効率が最も高いガイドをｉｎ ｖｉｖｏ送達及び治療実証用に選択する。
次に、系全体をパッケージングするＡＡＶ又はＡｄウイルス粒子又は他の送達ビヒクルを作製し、実験的に決定されるとおりの最適条件を用いて注射する。最適化するために最も重要なパラメータは、個々の注射毎に使用する送達ビヒクルの量（即ち投薬量）である。
用量が高い程、遺伝子療法の有効性は良好になるが、ビヒクル注射に対する免疫応答又は系のオフターゲット効果に起因して合併症の可能性の増加につながり得る。手技に関連する合併症の臨床徴候に関して患者を毎日モニタする。
注射後手順
注射後、免疫応答又は有害作用がないか、患者をモニタする。注射後毎週、ＥＬＩＳＡ又は他のタンパク質計測方法を用いてＡＴＯＨ１刺激レベルを評価することができる。蝸牛における新規有毛細胞成長は、生検及びイメージング方法で可視化することができる。そして次に、ヒト患者に対する聴覚検査で難聴及び聴覚障害の軽減又は回復を評価する。
患者においてフォローすべき重要な安全尺度には、ヒト蝸牛における単回注射の最大耐容量、注射後に有害事象が現れる治療回数が含まれる。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、当業者には、このような実施形態が単なる例として示されることは明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく様々なバリエーション、変形形態、及び置換形態にすぐに想到するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な変更形態を本発明の実施に利用できることを理解されたい。

Claims (46)

  1. 真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法であって、
    （Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
    （ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含むポリヌクレオチド配列、及び
    ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列
    ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードする前記ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］、
    又は
    （Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）前記標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    を含むポリヌクレオチド、
    ＩＩ．Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列、及び
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列、
    ［転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記Ｃａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードする前記ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
    を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法。
  2. 前記Ｃａｓ９がＳａＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｃａｓ９をコードする配列、前記ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又はｔｒａｃｒ配列をコードする前記ポリヌクレオチドがＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、細胞透過性ペプチド、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ポリヌクレオチドが１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法であって、組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法において、前記組成物が、
    （Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が
    （ａ）前記標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含む、第１の調節エレメント、及び
    ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
    ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
    構成成分Ｉ及びＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記Ｃａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
    又は
    （Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．第１の調節エレメントであって、
    （ａ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    に機能的に連結している第１の調節エレメント、
    ＩＩ．Ｃａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、
    ［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列；（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記Ｃａｓ９を含み；及び前記Ｃａｓ９が好ましくはＳａＣａｓ９である］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む、方法。
  6. 前記ウイルスベクターの１つ以上が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される、請求項５に記載の方法。
  7. 真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態又は疾患を治療又は阻害する方法であって、標的配列の操作によって対象又は非ヒト対象を改変するステップを含む、それを必要としている前記対象又は非ヒト対象における前記標的配列中の前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含み、及び前記病態又は疾患が、
    組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含む、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
    を含む治療を提供するステップを含む前記標的配列の操作による治療又は阻害の影響を受け易く、前記標的配列は発現時に前記組成物によって操作され、前記組成物は、
    （Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が
    （ａ）真核細胞における標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含む、第１の調節エレメント、及び
    ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
    ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
    構成成分Ｉ及びＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列（ａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記Ｃａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
    又は
    （Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．第１の調節エレメントであって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、
    に機能的に連結している第１の調節エレメント、
    ＩＩ．Ｃａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント
    ［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
    転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み；及びＣａｓ９は好ましくはＳａＣａｓ９である］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む、方法。
  8. ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 発現を誘導するステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記病態又は疾患が眼疾患である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記眼疾患が網膜色素変性症又は色覚異常である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ウイルスベクターがＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記Ｃａｓ９を送達する方法であって、前記Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを細胞に送達するステップを含む方法。
  14. 前記Ｃａｓ９をコードする前記ポリヌクレオチド又は配列が、前記Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを前記細胞に送達することによって前記細胞に送達される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＡＡＶ又はレンチウイルスをコードする１つ以上の核酸分子を含有するか、又はそれから本質的になる１つ以上のプラスミドをＡＡＶ感染又はレンチウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップ、及び前記ＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ及び／又はヘルパー核酸分子を供給するステップを含む、請求項７に記載のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを調製する方法。
  16. 前記ＡＡＶ又はレンチウイルスをコードする１つ以上の核酸分子を含有するか、又はそれから本質的になる１つ以上のプラスミドをＡＡＶ感染又はレンチウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップ、及び前記ＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ及び／又はヘルパー核酸分子を供給するステップを含む、請求項７に記載の方法で使用されるＡＡＶ又はレンチウイルスベクターの調製方法。
  17. 前記ＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに必須の前記ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐが、前記細胞に１つ以上のヘルパープラスミド又は１つ以上のヘルパーウイルスをトランスフェクトすることにより供給される、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記ヘルパーウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス又はバキュロウイルスである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記細胞が昆虫細胞であり、及び前記ヘルパーウイルス（存在する場合）がバキュロウイルスである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. Ｃａｓ９が野生型、トランケート型又はキメラＣａｓ９である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 医薬又は治療に使用される、請求項１〜２２のいずれか一項に定義されるとおりの組成物。
  24. 遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む真核生物又は非ヒト生物における前記遺伝子座に関連する疾患をモデル化する方法において使用される請求項１〜２２のいずれか一項に定義されるとおりの組成物。
  25. ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集における、請求項１〜２４のいずれか一項に定義されるとおりの組成物の使用。
  26. ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集用の薬剤、又は疾患に関連するゲノム遺伝子座の標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法において使用されるか、又は真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態又は疾患（ｄｉｅｓｅａｓｅ）を治療又は阻害する方法において使用される薬剤の製造における、請求項１〜２４のいずれか一項に定義されるとおりの組成物の使用。
  27. （Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含むポリヌクレオチド配列、及び
    ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列
    ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記Ｃａｓ９を含み、且つＳａＣａｓ９をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである］
    又は
    （Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    を含むポリヌクレオチド、
    ＩＩ．Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列、及び
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
    ［転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み、且つＣａｓ９をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり；及び前記Ｃａｓ９が好ましくはＳａＣａｓ９である］を含む組成物であって、
    医薬又は治療において使用されるか；又は疾患又は障害に関連するゲノム遺伝子座の標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法において使用されるか；又は真核生物又は非ヒト生物における疾患に関連する遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態を治療又は阻害する方法において使用されるか；又はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集において使用される組成物。
  28. 前記ポリヌクレオチドが、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡがキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
  30. 前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、複数のキメラ及び／又は複数のマルチガイド配列及び単一のｔｒａｃｒ配列をさらに含む多重ＳａＣａｓ９酵素系である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
  31. 前記Ｃａｓ９が、前記標的配列の前記位置にある両鎖の切断を誘導するヌクレアーゼである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
  32. 前記Ｃａｓ９が１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
  33. 前記Ｃａｓ９が、１つ以上の突然変異Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＤ９８６Ａを含む、請求項３２に記載の方法、使用又は組成物。
  34. 前記１つ以上の突然変異が前記Ｃａｓ９のＲｕｖＣ１ドメインにある、請求項３２に記載の方法、使用又は組成物。
  35. 前記Ｃａｓ９が、前記標的配列の前記位置における切断を誘導するニッカーゼである、請求項３０に記載の方法、使用又は組成物。
  36. 前記ニッカーゼが二重ニッカーゼである、請求項３５に記載の方法、使用又は組成物。
  37. 少なくとも２つ以上のＮＬＳをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
  38. 前記ＳａＣａｓ９が触媒ドメインに１つ以上の突然変異を有し、転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び前記酵素が機能ドメインをさらに含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
  39. 前記機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項３８に記載の方法、使用又は組成物。
  40. 前記転写活性化ドメインがＶＰ６４である、請求項３９に記載の方法、使用又は組成物。
  41. 真核生物又は非ヒト生物におけるゲノム遺伝子座の１つ以上の突然変異によって引き起こされる病態又は疾患を治療又は阻害するための治療的ゲノム編集方法であって、標的配列の操作によって対象又は非ヒト対象を改変するステップを含む、それを必要としている前記対象又は非ヒト対象における前記標的配列中の前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含み、前記病態又は疾患が、
    組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含む、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
    を含む治療を提供するステップを含む前記標的配列の操作による治療又は阻害の影響を受け易く、前記標的配列は発現時に前記組成物によって操作され、前記組成物が、
    （Ａ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が
    （ａ）真核細胞における前記標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含む、第１の調節エレメント、及び
    ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
    ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が５’から３’への方向に並び、
    構成成分Ｉ及びＩＩが前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列（ａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記Ｃａｓ９を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
    又は
    （Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
    Ｉ．第１の調節エレメントであって、
    （ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    に機能的に連結している第１の調節エレメント、
    ＩＩ．Ｃａｓ９をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、及び
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第３の調節エレメント
    ［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩが前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、且つ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、（２）前記ｔｒａｃｒにハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣａｓ９を含み；及び前記Ｃａｓ９が好ましくはＳａＣａｓ９である］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む、方法。
  42. 前記病態又は疾患が網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｅｎｔｏｓａ）又は色覚異常である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ＤＪ又はそれらの任意の組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
  44. かかる治療を必要としている対象における遺伝性疾患の個別化又は個人化された治療方法であって
    （ａ）ｅｘ ｖｉｖｏで１つ以上のＳａＣａｓ９発現真核細胞を含む組織、臓器又は細胞株において、又はｉｎ ｖｉｖｏで、ＳａＣａｓ９を発現する細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、複数の突然変異を導入するステップであって、前記組織、臓器、細胞又は哺乳動物の１つ以上の細胞に本明細書で考察するとおりの前記ベクターを送達するステップを含み、前記特定の突然変異又は正確な配列置換が前記遺伝性疾患と関係付けられるか、又は関係付けられている、ステップ；
    （ｂ）前記ベクターが送達された、前記遺伝性疾患に関係付けられる前記特定の突然変異又は正確な配列置換を有する前記細胞に対して、前記遺伝性疾患の１つ以上の治療を試験するステップ；及び
    （ｃ）ステップ（ｂ）の１つ以上の治療の試験結果に基づき対象を治療するステップ
    を含む方法。
  45. 前記遺伝性疾患が眼疾患である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記眼疾患が網膜色素変性症又は色覚異常である、請求項４５に記載の方法。
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