JP3454818B1 - 肝臓細胞の増殖方法、該方法により得られる肝臓細胞、およびその用途 - Google Patents
肝臓細胞の増殖方法、該方法により得られる肝臓細胞、およびその用途Info
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Abstract
【要約】
本発明は、哺乳類の肝臓細胞に細胞増殖因子遺伝子を導
入して不死化肝臓細胞を得る工程、該不死化肝臓細胞を
増殖する工程、および該不死化肝臓細胞から該細胞増殖
因子遺伝子を除去する工程からなる方法、該方法により
得られる大量の肝臓細胞、ならびに得られた肝臓細胞か
らなる治療剤および人工肝臓を提供する。
入して不死化肝臓細胞を得る工程、該不死化肝臓細胞を
増殖する工程、および該不死化肝臓細胞から該細胞増殖
因子遺伝子を除去する工程からなる方法、該方法により
得られる大量の肝臓細胞、ならびに得られた肝臓細胞か
らなる治療剤および人工肝臓を提供する。
Description
【０００１】［技術分野］
本発明は、哺乳類の肝臓細胞の増殖方法、該方法により
得られる肝臓細胞、およびその用途に関する。さらに詳
細には、本発明は、遺伝子工学的手法を用いた哺乳類の
肝臓細胞の増殖方法、該方法により得られるインビトロ
肝臓細胞、および該肝臓細胞の治療剤や人工肝臓などの
用途に関する。
得られる肝臓細胞、およびその用途に関する。さらに詳
細には、本発明は、遺伝子工学的手法を用いた哺乳類の
肝臓細胞の増殖方法、該方法により得られるインビトロ
肝臓細胞、および該肝臓細胞の治療剤や人工肝臓などの
用途に関する。
【０００２】［背景技術］
肝移植は、代謝性肝疾患や肝不全の患者に利用できる唯
一の治療法である。しかしながら、その治療は、ドナー
肝の不足、手術リスクにともなう無視できぬ術後死亡
率、高費用、および長期におよぶ免疫抑制剤の使用など
の問題を抱えている。近年、分離肝臓細胞の移植や生き
た肝臓細胞を使用したバイオ人工肝臓が、肝移植または
肝臓再生までのつなぎとして期待されている。分離肝臓
細胞移植やバイオ人工肝臓の利点としては、肝移植手術
に比べ経済的であること、リスクが少ない点などが含ま
れる。分離肝臓細胞の移植やバイオ人工肝臓において
も、ドナー肝の不足のため、その臨床使用が制限されて
いる。
一の治療法である。しかしながら、その治療は、ドナー
肝の不足、手術リスクにともなう無視できぬ術後死亡
率、高費用、および長期におよぶ免疫抑制剤の使用など
の問題を抱えている。近年、分離肝臓細胞の移植や生き
た肝臓細胞を使用したバイオ人工肝臓が、肝移植または
肝臓再生までのつなぎとして期待されている。分離肝臓
細胞移植やバイオ人工肝臓の利点としては、肝移植手術
に比べ経済的であること、リスクが少ない点などが含ま
れる。分離肝臓細胞の移植やバイオ人工肝臓において
も、ドナー肝の不足のため、その臨床使用が制限されて
いる。
【０００３】分離肝臓細胞の代用として、インビトロで
大量に増殖でき、分離肝臓細胞の性質を保持し、さらに
移植後に代謝補助を提供できる肝臓細胞株がある。大量
増殖可能でかつ高度な肝機能を有する肝臓細胞株の樹立
および細胞バンクの発達は、必要時に必要数の肝臓細胞
の移植を可能としドナー肝の不足を解消し得るものと期
待されている。
大量に増殖でき、分離肝臓細胞の性質を保持し、さらに
移植後に代謝補助を提供できる肝臓細胞株がある。大量
増殖可能でかつ高度な肝機能を有する肝臓細胞株の樹立
および細胞バンクの発達は、必要時に必要数の肝臓細胞
の移植を可能としドナー肝の不足を解消し得るものと期
待されている。
【０００４】従来、癌遺伝子を導入して細胞を不死化す
ることにより、適度な分化機能を保持した細胞株を産出
できることが知られている（ケイ エイ ウェスタマン
（K.A. Westerman）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．第９３巻、８９７１頁、１９９
６年）。しかしながら、不死化細胞株を、生体内に注入
することにより、またはバイオ人工肝臓などの体外循環
補助装置に使用することにより、予期せぬ癌化の危険性
に患者を曝す可能性がある。異種動物の細胞や非適合の
同種のヒトの細胞を用いたとしても、移植細胞が最終的
に拒絶される保証は無い。異種動物との安定なキメラ状
態やＨＬＡ非適合の同種腫瘍の偶発的な生着がヒトにお
いて報告されている（ガートナー（Gartner）ら、Ｎ．
Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３３５巻、１４９４頁、１９
９６年；ケイ パラディス（K. Paradis）ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、第２８５巻、１２３６頁、１９９９年）。した
がって、安全性の高い肝臓細胞を容易に大量に入手でき
ることが望ましい。
ることにより、適度な分化機能を保持した細胞株を産出
できることが知られている（ケイ エイ ウェスタマン
（K.A. Westerman）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．第９３巻、８９７１頁、１９９
６年）。しかしながら、不死化細胞株を、生体内に注入
することにより、またはバイオ人工肝臓などの体外循環
補助装置に使用することにより、予期せぬ癌化の危険性
に患者を曝す可能性がある。異種動物の細胞や非適合の
同種のヒトの細胞を用いたとしても、移植細胞が最終的
に拒絶される保証は無い。異種動物との安定なキメラ状
態やＨＬＡ非適合の同種腫瘍の偶発的な生着がヒトにお
いて報告されている（ガートナー（Gartner）ら、Ｎ．
Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３３５巻、１４９４頁、１９
９６年；ケイ パラディス（K. Paradis）ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、第２８５巻、１２３６頁、１９９９年）。した
がって、安全性の高い肝臓細胞を容易に大量に入手でき
ることが望ましい。
【０００５】さらに肝疾患の治療目的以外の面におい
て、大量増殖可能な正常肝臓細胞株および細胞バンクの
樹立に対するニーズが高まっている。主に１）ヒトの薬
物代謝検定モデル、２）新薬の開発、および３）ヒト肝
炎の感染モデルとしての利用が含まれる。
て、大量増殖可能な正常肝臓細胞株および細胞バンクの
樹立に対するニーズが高まっている。主に１）ヒトの薬
物代謝検定モデル、２）新薬の開発、および３）ヒト肝
炎の感染モデルとしての利用が含まれる。
【０００６】しかしながら、従来の培養技術では、安全
性の高い肝臓細胞を大量に増殖させることは困難であっ
た。
性の高い肝臓細胞を大量に増殖させることは困難であっ
た。
【０００７】本発明は、前記のような点に鑑みて、哺乳
類肝臓細胞の無限に増殖可能な増殖方法を提供すること
を目的とする。さらに本発明は、該方法により得られる
肝臓細胞、ならびに治療剤や人工肝臓などの該肝臓細胞
の用途を提供することを目的とする。
類肝臓細胞の無限に増殖可能な増殖方法を提供すること
を目的とする。さらに本発明は、該方法により得られる
肝臓細胞、ならびに治療剤や人工肝臓などの該肝臓細胞
の用途を提供することを目的とする。
【０００８】［発明の開示］
本発明者らは、前記問題点を考慮して鋭意検討した結
果、以下の点を見出し、本発明を完成させた。本発明者
らは、特異的な細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞
に導入することにより不死化させた細胞を大量に増殖さ
せた後、該細胞増殖因子遺伝子を除去することにより、
大量の単一な哺乳類の肝臓細胞株をインビトロにて得る
ことができることを見出し、本発明を完成するにいたっ
た。
果、以下の点を見出し、本発明を完成させた。本発明者
らは、特異的な細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞
に導入することにより不死化させた細胞を大量に増殖さ
せた後、該細胞増殖因子遺伝子を除去することにより、
大量の単一な哺乳類の肝臓細胞株をインビトロにて得る
ことができることを見出し、本発明を完成するにいたっ
た。
【０００９】すなわち、本発明は、哺乳類の肝臓細胞に
細胞増殖因子遺伝子を導入して不死化肝臓細胞を得る工
程、該不死化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死
化肝臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程か
らなる、インビトロでの肝臓細胞の増殖方法に関する。
細胞増殖因子遺伝子を導入して不死化肝臓細胞を得る工
程、該不死化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死
化肝臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程か
らなる、インビトロでの肝臓細胞の増殖方法に関する。
【００１０】前記方法において、哺乳類の肝臓細胞がヒ
トの肝臓細胞であることが好ましく、ヒトの成人肝臓細
胞であることがさらに好ましい。
トの肝臓細胞であることが好ましく、ヒトの成人肝臓細
胞であることがさらに好ましい。
【００１１】前記方法において、細胞増殖因子遺伝子が
ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）遺伝子であ
ることが好ましく、さらに細胞増殖因子遺伝子がレトロ
ウイルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）遺伝子であ
ることが好ましく、さらに細胞増殖因子遺伝子がレトロ
ウイルスベクターを用いて導入されることが好ましい。
【００１２】また、前記方法において、細胞増殖因子遺
伝子が一対の部位特異的組換え配列に挟まれていること
が好ましく、一対の部位特異的組換え配列がＬｏｘＰ配
列であることが好ましく、さらに一対の部位特異的組換
え配列間にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が存在するこ
とが好ましい。
伝子が一対の部位特異的組換え配列に挟まれていること
が好ましく、一対の部位特異的組換え配列がＬｏｘＰ配
列であることが好ましく、さらに一対の部位特異的組換
え配列間にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が存在するこ
とが好ましい。
【００１３】前記方法において、不死化肝臓細胞を無血
清培地で増殖させることが好ましい。
清培地で増殖させることが好ましい。
【００１４】前記方法において、部位特異的組換え酵素
を用いて前記不死化肝臓細胞から前記細胞増殖因子遺伝
子を除去することが好ましく、該部位特異的組換え酵素
がＣｒｅ組換え酵素であることが好ましく、さらに該Ｃ
ｒｅ組換え酵素がアデノウイルスベクターによってコー
ドされることが好ましい。
を用いて前記不死化肝臓細胞から前記細胞増殖因子遺伝
子を除去することが好ましく、該部位特異的組換え酵素
がＣｒｅ組換え酵素であることが好ましく、さらに該Ｃ
ｒｅ組換え酵素がアデノウイルスベクターによってコー
ドされることが好ましい。
【００１５】本発明は、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の
肝臓細胞に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、該不死
化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死化肝臓細胞
から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からなる肝臓
細胞の増殖方法により得られるインビトロ肝臓細胞に関
する。
肝臓細胞に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、該不死
化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死化肝臓細胞
から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からなる肝臓
細胞の増殖方法により得られるインビトロ肝臓細胞に関
する。
【００１６】前記方法により得られるインビトロ肝臓細
胞は、ヒトの肝臓の薬物代謝検定モデルとして使用され
ることが好ましい。
胞は、ヒトの肝臓の薬物代謝検定モデルとして使用され
ることが好ましい。
【００１７】本発明は、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の
肝臓細胞に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、該不死
化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死化肝臓細胞
から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からなる肝臓
細胞の増殖方法により得られるインビトロ肝臓細胞から
なる肝疾患用治療剤に関する。
肝臓細胞に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、該不死
化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死化肝臓細胞
から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からなる肝臓
細胞の増殖方法により得られるインビトロ肝臓細胞から
なる肝疾患用治療剤に関する。
【００１８】さらに本発明は、細胞増殖因子遺伝子を哺
乳類の肝臓細胞に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、
該不死化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死化肝
臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からな
るインビトロでの肝臓細胞の増殖方法を用いて得られる
インビトロ肝臓細胞からなる人工肝臓に関する。
乳類の肝臓細胞に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、
該不死化肝臓細胞を増殖させる工程、および該不死化肝
臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からな
るインビトロでの肝臓細胞の増殖方法を用いて得られる
インビトロ肝臓細胞からなる人工肝臓に関する。
【００１９】前記人工肝臓がマイクロキャリアーを含む
ことが好ましい。該マイクロキャリアーがセルロースビ
ーズであることが好ましく、さらに、該セルロースビー
ズが細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロース
ビーズであることが好ましい。さらに、マイクロキャリ
アーがコラーゲンミクロスフィアであることが最も好ま
しい。また該マイクロキャリアー上の細胞の付着占拠率
が８０〜１００％の範囲であることが好ましい。
ことが好ましい。該マイクロキャリアーがセルロースビ
ーズであることが好ましく、さらに、該セルロースビー
ズが細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロース
ビーズであることが好ましい。さらに、マイクロキャリ
アーがコラーゲンミクロスフィアであることが最も好ま
しい。また該マイクロキャリアー上の細胞の付着占拠率
が８０〜１００％の範囲であることが好ましい。
【００２０】さらに、本発明は、細胞増殖因子遺伝子を
哺乳類の肝臓細胞に導入する工程、不死化肝臓細胞を増
殖させる工程、および該不死化肝臓細胞から該細胞増殖
因子遺伝子を除去する工程からなる方法により得られる
インビトロ肝臓細胞を、無血清培地にて培養することか
らなるアルブミンの製造方法を提供する。
哺乳類の肝臓細胞に導入する工程、不死化肝臓細胞を増
殖させる工程、および該不死化肝臓細胞から該細胞増殖
因子遺伝子を除去する工程からなる方法により得られる
インビトロ肝臓細胞を、無血清培地にて培養することか
らなるアルブミンの製造方法を提供する。
【００２１】そのうえ、本発明は、前記不死化肝臓細胞
を得る工程が、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞
に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、薬剤誘導性プロ
モーターの下流で部位特異的組換え酵素がコードされる
ＤＮＡ配列を該不死化肝臓細胞に導入する工程、および
薬剤依存的に部位特異的組換え酵素を発現する不死化肝
臓細胞を得る工程からなるインビトロでの肝臓細胞の増
殖方法を提供する。
を得る工程が、細胞増殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞
に導入して不死化肝臓細胞を得る工程、薬剤誘導性プロ
モーターの下流で部位特異的組換え酵素がコードされる
ＤＮＡ配列を該不死化肝臓細胞に導入する工程、および
薬剤依存的に部位特異的組換え酵素を発現する不死化肝
臓細胞を得る工程からなるインビトロでの肝臓細胞の増
殖方法を提供する。
【００２２】［発明を実施するための最良の形態］
本発明で用いられる哺乳類の肝臓細胞としては、豚、
猿、類人猿、ヒトなどの肝臓細胞などである。その中で
もヒトの肝臓細胞が好ましく、ヒトの成人肝臓細胞が最
も好ましい。ヒトの胎児肝臓細胞を応用してもよい。本
明細書に記載される用語「肝臓細胞」とは、たとえば肝
機能の指標であるアルブミンや各種血液凝固因子などの
タンパク質の産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解
毒および浄化能、ならびに、アミノ酸、糖質および脂質
代謝能を有する細胞を意味する。具体的には、肝細胞、
肝類洞内皮細胞、肝星状細胞、ピット細胞およびクッパ
ー細胞などがあげられる。
猿、類人猿、ヒトなどの肝臓細胞などである。その中で
もヒトの肝臓細胞が好ましく、ヒトの成人肝臓細胞が最
も好ましい。ヒトの胎児肝臓細胞を応用してもよい。本
明細書に記載される用語「肝臓細胞」とは、たとえば肝
機能の指標であるアルブミンや各種血液凝固因子などの
タンパク質の産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解
毒および浄化能、ならびに、アミノ酸、糖質および脂質
代謝能を有する細胞を意味する。具体的には、肝細胞、
肝類洞内皮細胞、肝星状細胞、ピット細胞およびクッパ
ー細胞などがあげられる。
【００２３】本発明に使用される細胞増殖因子遺伝子は
正常細胞由来の遺伝子であり、導入することにより哺乳
類の肝臓細胞を不死化できるものである。該細胞増殖因
子遺伝子の産物は、正常細胞の細胞増殖および情報伝達
に基本的に関与するものである。その例としては、増殖
因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキナ
ーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと結
合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナー
ゼ活性を有するもの、ならびに核内に存在しＤＮＡに結
合能を有するものが含まれる。そのような細胞増殖因子
遺伝子としては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子などが含まれる。ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現は、
血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり
再生を繰り返している臓器の幹細胞および前駆細胞、な
らびに特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖してい
るリンパ球では自然と発現増強している遺伝子であるた
めに、ｈＴＥＲＴ遺伝子が好ましい。
正常細胞由来の遺伝子であり、導入することにより哺乳
類の肝臓細胞を不死化できるものである。該細胞増殖因
子遺伝子の産物は、正常細胞の細胞増殖および情報伝達
に基本的に関与するものである。その例としては、増殖
因子として機能するもの、細胞膜に存在しチロシンキナ
ーゼ活性を有するもの、細胞膜内側に存在しＧＴＰと結
合するもの、細胞質に存在しセリン／トレオニンキナー
ゼ活性を有するもの、ならびに核内に存在しＤＮＡに結
合能を有するものが含まれる。そのような細胞増殖因子
遺伝子としては、ラス遺伝子、ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子などが含まれる。ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現は、
血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜などの、生涯にわたり
再生を繰り返している臓器の幹細胞および前駆細胞、な
らびに特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖してい
るリンパ球では自然と発現増強している遺伝子であるた
めに、ｈＴＥＲＴ遺伝子が好ましい。
【００２４】本発明において、細胞増殖因子遺伝子を哺
乳類の肝臓細胞に導入するためにレトロウイルスベクタ
ーが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞
への外来遺伝子導入手段として利用される。導入された
遺伝子は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるため
に遺伝子は確実に嬢細胞に受け継がれ、したがって組み
込まれた遺伝子は長期にわたり安定に発現されることが
可能である。
乳類の肝臓細胞に導入するためにレトロウイルスベクタ
ーが用いられる。レトロウイルスベクターは、動物細胞
への外来遺伝子導入手段として利用される。導入された
遺伝子は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるため
に遺伝子は確実に嬢細胞に受け継がれ、したがって組み
込まれた遺伝子は長期にわたり安定に発現されることが
可能である。
【００２５】レトロウイルスベクターの導入方法として
は、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、門脈内投与
および直接穿刺による投与、インビトロでは、レトロウ
イルスベクターの培養細胞への直接播種による方法など
が知られている。門脈内投与および直接穿刺による投
与、ならびに培養細胞への直接播種による方法が好まし
い。
は、インビボでは静脈内投与、腹腔内投与、門脈内投与
および直接穿刺による投与、インビトロでは、レトロウ
イルスベクターの培養細胞への直接播種による方法など
が知られている。門脈内投与および直接穿刺による投
与、ならびに培養細胞への直接播種による方法が好まし
い。
【００２６】レトロウイルスベクターを培養細胞に直接
播種することによりレトロウイルスベクターを培養細胞
に導入する方法としては、本発明の目的を達成するもの
であればあらゆる方法を使用してよい。たとえば、レト
ロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清
を、別途培養中の肝臓細胞に播種することにより導入を
達成することができる。各種細胞の培養条件および播種
濃度など種々の条件は、当該技術分野で周知の方法で決
定することができる。
播種することによりレトロウイルスベクターを培養細胞
に導入する方法としては、本発明の目的を達成するもの
であればあらゆる方法を使用してよい。たとえば、レト
ロウイルスベクター産生細胞を培養し、その培養上清
を、別途培養中の肝臓細胞に播種することにより導入を
達成することができる。各種細胞の培養条件および播種
濃度など種々の条件は、当該技術分野で周知の方法で決
定することができる。
【００２７】また、培養細胞への播種は、細胞への影
響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが好
ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮す
ると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これらの
ことに基づき、本発明では、４時間感染を日に２回、計
３日間実施することが最も好ましい。
響、たとえば染色体の安定性を考えると、１回のみが好
ましい。しかしながら、該ベクターの導入効率を考慮す
ると、細胞への播種回数は多い方が好ましい。これらの
ことに基づき、本発明では、４時間感染を日に２回、計
３日間実施することが最も好ましい。
【００２８】さらに、本発明で用いられる細胞増殖因子
遺伝子は、肝臓細胞に導入されたプロウイルスから後に
切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配列に挟
まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部位特異
的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であ
り、この配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結
合が行なわれる。
遺伝子は、肝臓細胞に導入されたプロウイルスから後に
切り出し可能なように一対の部位特異的組換え配列に挟
まれている。「部位特異的組換え配列」とは、部位特異
的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であ
り、この配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結
合が行なわれる。
【００２９】部位特異的組換え配列としては、ＬｏｘＰ
配列やＦＲＴ配列などがある。その中でＬｏｘＰ配列が
好ましい。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素単独で相
同組換えを行なうための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４
塩基からなる配列である。同一のＤＮＡ分子上に同方向
の一対のＬｏｘＰ配列が存在する場合は、そのあいだに
挟まれたＤＮＡ配列が切り出されて環状分子となる（切
り出し反応）。異なるＤＮＡ分子上に一対のＬｏｘＰ配
列が存在し、そのＤＮＡ分子の一方が環状ＤＮＡである
場合はＬｏｘＰ配列を用いて環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ
分子上に挿入される（挿入反応）。
配列やＦＲＴ配列などがある。その中でＬｏｘＰ配列が
好ましい。ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素単独で相
同組換えを行なうための「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ」の３４
塩基からなる配列である。同一のＤＮＡ分子上に同方向
の一対のＬｏｘＰ配列が存在する場合は、そのあいだに
挟まれたＤＮＡ配列が切り出されて環状分子となる（切
り出し反応）。異なるＤＮＡ分子上に一対のＬｏｘＰ配
列が存在し、そのＤＮＡ分子の一方が環状ＤＮＡである
場合はＬｏｘＰ配列を用いて環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ
分子上に挿入される（挿入反応）。
【００３０】さらに本発明において、細胞増殖因子遺伝
子を哺乳類の肝臓細胞に導入する際には、常に同時にＧ
ＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位特異的組
換え配列間に存在することが好ましい。「部位特異的組
換え配列間」とは、一対の部位特異的組換え配列に挟ま
れた位置関係を意味する。該ＧＦＰ遺伝子は、レトロウ
イルスベクターが感染し、プロウイルスがゲノムに組み
込まれた肝臓細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ
ー）にて選択的に同定するために用いられる。したがっ
て、プロウイルスがゲノムに組み込まれた肝臓細胞を選
択的に同定できれば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性
遺伝子を用いてもよい。
子を哺乳類の肝臓細胞に導入する際には、常に同時にＧ
ＦＰ遺伝子などの選択マーカーが、一対の部位特異的組
換え配列間に存在することが好ましい。「部位特異的組
換え配列間」とは、一対の部位特異的組換え配列に挟ま
れた位置関係を意味する。該ＧＦＰ遺伝子は、レトロウ
イルスベクターが感染し、プロウイルスがゲノムに組み
込まれた肝臓細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ
ー）にて選択的に同定するために用いられる。したがっ
て、プロウイルスがゲノムに組み込まれた肝臓細胞を選
択的に同定できれば、ＧＦＰ遺伝子の代わりに薬剤耐性
遺伝子を用いてもよい。
【００３１】該薬剤耐性遺伝子の例としては、ハイグロ
マイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピ
シリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、と
くに限定されない。
マイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピ
シリン耐性遺伝子、大腸菌ｇｐｔ遺伝子などがあり、と
くに限定されない。
【００３２】本明細書に記載される「不死化肝臓細胞」
とは、腫瘍原性が無く、正常肝臓細胞様の形態を有し、
肝特異的機能を比較的保持し、特別な培養条件を必要と
せず短期間に増殖する特徴を有する細胞を意味する。
とは、腫瘍原性が無く、正常肝臓細胞様の形態を有し、
肝特異的機能を比較的保持し、特別な培養条件を必要と
せず短期間に増殖する特徴を有する細胞を意味する。
【００３３】該不死化肝臓細胞の培養に関しては、増殖
速度が速いことが好ましい。しかし容器の取り扱いが容
易であるため、コラーゲンなどによる培養容器表面の特
別なコーティングを必要としないことがさらに好まし
い。該不死化細胞の倍化時間は２４〜７２時間であり、
好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４〜３
６時間である。該不死化肝臓細胞の培地としては、人畜
共通感染症を回避するために、ウシなどの動物の血清が
添加されていない無血清培地が好ましい。不死化細胞は
機能的にもアルブミンの産生量が増加することから無血
清培地が好ましい。ＣＳ−Ｃ培地がより好ましい。ダル
ベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２〜３倍に希釈
されたＣＳ−Ｃ培地を用いてもよい。
速度が速いことが好ましい。しかし容器の取り扱いが容
易であるため、コラーゲンなどによる培養容器表面の特
別なコーティングを必要としないことがさらに好まし
い。該不死化細胞の倍化時間は２４〜７２時間であり、
好ましくは２４〜４８時間、さらに好ましくは２４〜３
６時間である。該不死化肝臓細胞の培地としては、人畜
共通感染症を回避するために、ウシなどの動物の血清が
添加されていない無血清培地が好ましい。不死化細胞は
機能的にもアルブミンの産生量が増加することから無血
清培地が好ましい。ＣＳ−Ｃ培地がより好ましい。ダル
ベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２〜３倍に希釈
されたＣＳ−Ｃ培地を用いてもよい。
【００３４】本明細書における不死化肝臓細胞は、導入
された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え酵素によ
り除去できる可逆的な不死化細胞である。部位特異的組
換え酵素は、部位特異的組換え配列を特異的に認識し、
切断および結合を含む相同組換えを単独で行なう酵素で
ある。部位特異的組換え酵素としては、Ｃｒｅ組換え酵
素、ＦＬＰ組換え酵素などが含まれる。その中でもＣｒ
ｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換え酵素はＬｏｘＰ
配列を特異的に認識する組換え酵素である。
された細胞増殖因子遺伝子を部位特異的組換え酵素によ
り除去できる可逆的な不死化細胞である。部位特異的組
換え酵素は、部位特異的組換え配列を特異的に認識し、
切断および結合を含む相同組換えを単独で行なう酵素で
ある。部位特異的組換え酵素としては、Ｃｒｅ組換え酵
素、ＦＬＰ組換え酵素などが含まれる。その中でもＣｒ
ｅ組換え酵素が好ましい。Ｃｒｅ組換え酵素はＬｏｘＰ
配列を特異的に認識する組換え酵素である。
【００３５】部位特異的組換え酵素は、アデノウイルス
またはプラスミドベクターなどの発現ベクターによって
コードされることができる。あるいは、部位特異的組換
え酵素は、ヒト免疫不全ウイルスＩ型由来のＴＡＴタン
パク質（Green, M. and Loewenstein, P. M., Cell 55,
p179-1188, 1988: Frankel, A. D. and Pabo, C. O.,
Cell 55, p1189-1193, 1988: Nagahara, H. et al., Na
t. Med. 1988, 4, 1449-1452）に融合されてもよい。Ｔ
ＡＴタンパク質はタンパク質導入ドメインを有している
ため、融合タンパク質を培地に添加することにより、前
記不死化肝臓細胞内で部位特異的組換え反応が起こる。
アデノウイルスベクターは細胞傷害性である。そのよう
なリスクを予防するために、アデノウイルスベクター以
外の発現ベクターによってコードされること、またはＴ
ＡＴタンパク質を融合することが好ましい。
またはプラスミドベクターなどの発現ベクターによって
コードされることができる。あるいは、部位特異的組換
え酵素は、ヒト免疫不全ウイルスＩ型由来のＴＡＴタン
パク質（Green, M. and Loewenstein, P. M., Cell 55,
p179-1188, 1988: Frankel, A. D. and Pabo, C. O.,
Cell 55, p1189-1193, 1988: Nagahara, H. et al., Na
t. Med. 1988, 4, 1449-1452）に融合されてもよい。Ｔ
ＡＴタンパク質はタンパク質導入ドメインを有している
ため、融合タンパク質を培地に添加することにより、前
記不死化肝臓細胞内で部位特異的組換え反応が起こる。
アデノウイルスベクターは細胞傷害性である。そのよう
なリスクを予防するために、アデノウイルスベクター以
外の発現ベクターによってコードされること、またはＴ
ＡＴタンパク質を融合することが好ましい。
【００３６】部位特異的組換え酵素とＴＡＴタンパク質
との融合タンパク質は、部位特異的組換え酵素およびＴ
ＡＴタンパク質のタンパク質導入ドメイン（すなわち、
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg）が含
まれる限り、限定されない。前記融合タンパク質は、不
死化細胞の培地に添加することにより、部位特異的組換
え反応を誘導することができる。
との融合タンパク質は、部位特異的組換え酵素およびＴ
ＡＴタンパク質のタンパク質導入ドメイン（すなわち、
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg）が含
まれる限り、限定されない。前記融合タンパク質は、不
死化細胞の培地に添加することにより、部位特異的組換
え反応を誘導することができる。
【００３７】本発明において用いられる発現ベクター
は、部位特異的組換え酵素をコードする配列を含有する
ものである限り、とくに限定されない。部位特異的組換
え酵素のプロモーターとしては薬剤誘導性プロモーター
が好ましい。本明細書において、「薬剤誘導性プロモー
ター」は、薬剤を添加することにより遺伝子発現を誘導
するプロモーターを意味する。薬剤誘導性プロモーター
および部位特異的組換え酵素を含有する発現ベクターが
染色体に組み込まれた不死化肝臓細胞を樹立すれば、ウ
イルスの感染効率などを考慮する必要がない。そのよう
な細胞株を用いれば、部位特異的組換え酵素の発現の時
期を任意に設定することができる。
は、部位特異的組換え酵素をコードする配列を含有する
ものである限り、とくに限定されない。部位特異的組換
え酵素のプロモーターとしては薬剤誘導性プロモーター
が好ましい。本明細書において、「薬剤誘導性プロモー
ター」は、薬剤を添加することにより遺伝子発現を誘導
するプロモーターを意味する。薬剤誘導性プロモーター
および部位特異的組換え酵素を含有する発現ベクターが
染色体に組み込まれた不死化肝臓細胞を樹立すれば、ウ
イルスの感染効率などを考慮する必要がない。そのよう
な細胞株を用いれば、部位特異的組換え酵素の発現の時
期を任意に設定することができる。
【００３８】前記薬剤誘導性プロモーターはとくに限定
されるものではなく、たとえばテトラサイクリン誘導性
プロモーターおよびタモキシフェン誘導性プロモーター
など、公知のプロモーターを使用することができる。こ
れらの薬剤誘導性プロモーターは、当業者により適宜選
択され得る。
されるものではなく、たとえばテトラサイクリン誘導性
プロモーターおよびタモキシフェン誘導性プロモーター
など、公知のプロモーターを使用することができる。こ
れらの薬剤誘導性プロモーターは、当業者により適宜選
択され得る。
【００３９】したがって、インビトロでの肝臓細胞の増
殖方法において、不死化肝臓細胞を得る工程は、細胞増
殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入して不死化肝臓
細胞を得る工程、薬剤誘導性プロモーターの下流に部位
特異的組換え酵素がコードされるＤＮＡ配列を不死化肝
臓細胞に導入する工程、および薬剤依存的に部位特異的
組換え酵素を発現する不死化肝臓細胞を得る工程からな
ることが好ましい。
殖方法において、不死化肝臓細胞を得る工程は、細胞増
殖因子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入して不死化肝臓
細胞を得る工程、薬剤誘導性プロモーターの下流に部位
特異的組換え酵素がコードされるＤＮＡ配列を不死化肝
臓細胞に導入する工程、および薬剤依存的に部位特異的
組換え酵素を発現する不死化肝臓細胞を得る工程からな
ることが好ましい。
【００４０】本発明の肝臓細胞は、ヒト肝臓の薬物代謝
検定モデルとして利用可能である。環境汚染や薬剤使用
時に生体への影響が問題となる毒性物質や発癌性物質の
代謝経路は、ヒトと動物では異なる。これまで、薬剤を
含む化学物質の毒性や発癌性、また体内での代謝経路の
検定はラット、イヌまたはブタといった実験動物を用い
て検討されてきた。しかしながら、ヒトと実験動物との
化学物質の代謝経路の違いは明らかであり、動物実験で
のデータをヒトに当てはめるには慎重でなけらばならな
い。また、近年の動物愛護の立場より、できるだけ動物
を用いた研究は控え、ヒトの病態変化はヒトで行なうと
いう研究手段の開発が重要な課題である。本発明の肝臓
細胞は、高度肝機能を発現しており、実験動物の代わり
でなくよりヒト肝の機能に近づいた新しい薬物代謝検定
モデルとして大きな意義を有する。具体的には、１）薬
物の肝での代謝系の解析、２）薬物の相互作用の検討、
３）肝における薬物からの変異原性物質産生の検定など
に利用される。
検定モデルとして利用可能である。環境汚染や薬剤使用
時に生体への影響が問題となる毒性物質や発癌性物質の
代謝経路は、ヒトと動物では異なる。これまで、薬剤を
含む化学物質の毒性や発癌性、また体内での代謝経路の
検定はラット、イヌまたはブタといった実験動物を用い
て検討されてきた。しかしながら、ヒトと実験動物との
化学物質の代謝経路の違いは明らかであり、動物実験で
のデータをヒトに当てはめるには慎重でなけらばならな
い。また、近年の動物愛護の立場より、できるだけ動物
を用いた研究は控え、ヒトの病態変化はヒトで行なうと
いう研究手段の開発が重要な課題である。本発明の肝臓
細胞は、高度肝機能を発現しており、実験動物の代わり
でなくよりヒト肝の機能に近づいた新しい薬物代謝検定
モデルとして大きな意義を有する。具体的には、１）薬
物の肝での代謝系の解析、２）薬物の相互作用の検討、
３）肝における薬物からの変異原性物質産生の検定など
に利用される。
【００４１】また、本発明の肝臓細胞は創薬の開発に利
用できる。すなわち、ヒト由来肝臓細胞株の大量培養に
より、生理活性物質の大量産生が可能となる。これらの
産生物は、遺伝子操作による酵母類、大腸菌、またはク
ローン動物などにより産生される生理活性物質より除去
しにくい夾雑物の混入が少なく、容易に単離される。創
薬開発の応用例としては、各種の血液凝固因子製剤およ
び／またはアルブミンの産生などがあげられる。
用できる。すなわち、ヒト由来肝臓細胞株の大量培養に
より、生理活性物質の大量産生が可能となる。これらの
産生物は、遺伝子操作による酵母類、大腸菌、またはク
ローン動物などにより産生される生理活性物質より除去
しにくい夾雑物の混入が少なく、容易に単離される。創
薬開発の応用例としては、各種の血液凝固因子製剤およ
び／またはアルブミンの産生などがあげられる。
【００４２】さらに、本発明の肝臓細胞はヒト肝炎ウイ
ルスの感染モデルとしても利用できる。ヒトＢ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＶ）およびヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）の全容は明らかになりつつあるが、未だにウイルス
本体は確認されていない。これは、インビトロの培養系
が未だに確立されていないためであり、ウイルスの複
製、粒子形成、変異などの生物学および発癌機構の解明
などの基礎的研究の大きな障害となっている。本発明の
肝臓細胞を用いてＨＢＶおよびＨＣＶの感染実験系を確
立し、感染の機構と予防や治療の方策をたてる基礎実験
の系を確立することも可能である。
ルスの感染モデルとしても利用できる。ヒトＢ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＶ）およびヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）の全容は明らかになりつつあるが、未だにウイルス
本体は確認されていない。これは、インビトロの培養系
が未だに確立されていないためであり、ウイルスの複
製、粒子形成、変異などの生物学および発癌機構の解明
などの基礎的研究の大きな障害となっている。本発明の
肝臓細胞を用いてＨＢＶおよびＨＣＶの感染実験系を確
立し、感染の機構と予防や治療の方策をたてる基礎実験
の系を確立することも可能である。
【００４３】本発明の肝疾患用の治療剤は、細胞増殖因
子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入してインビトロ不死
化肝臓細胞を得る工程、該インビトロ不死化肝臓細胞を
増殖させる工程、および該インビトロ不死化肝臓細胞か
ら該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からなる肝臓細
胞の増殖方法により得られる肝臓細胞からなる。該治療
剤は、他に肝臓細胞を保護するために、電解質、アミノ
酸、糖質を含んでもよい。
子遺伝子を哺乳類の肝臓細胞に導入してインビトロ不死
化肝臓細胞を得る工程、該インビトロ不死化肝臓細胞を
増殖させる工程、および該インビトロ不死化肝臓細胞か
ら該細胞増殖因子遺伝子を除去する工程からなる肝臓細
胞の増殖方法により得られる肝臓細胞からなる。該治療
剤は、他に肝臓細胞を保護するために、電解質、アミノ
酸、糖質を含んでもよい。
【００４４】本発明における「肝疾患」としては、たと
えばウイルス、薬剤、そして中毒（キノコ等）による急
性肝不全などの肝不全、血友病、α１−抗トリプシン欠
損症、ガラクトース血症、肝腎性チロシン血症、カエデ
シロップ尿症、糖原病１ａ型、肝性ポルフィリン症、低
ベータリポ蛋白血症、高コレステロール血症、原発性高
シュウ酸尿症１型、クリグラー−ナジャー症候群１型、
高フェニルアラニン血症などの代謝性肝疾患、慢性肝疾
患の急性増悪などが含まれる。本発明の治療剤は、肝不
全および代謝性肝疾患の治療に用いられることが好まし
い。
えばウイルス、薬剤、そして中毒（キノコ等）による急
性肝不全などの肝不全、血友病、α１−抗トリプシン欠
損症、ガラクトース血症、肝腎性チロシン血症、カエデ
シロップ尿症、糖原病１ａ型、肝性ポルフィリン症、低
ベータリポ蛋白血症、高コレステロール血症、原発性高
シュウ酸尿症１型、クリグラー−ナジャー症候群１型、
高フェニルアラニン血症などの代謝性肝疾患、慢性肝疾
患の急性増悪などが含まれる。本発明の治療剤は、肝不
全および代謝性肝疾患の治療に用いられることが好まし
い。
【００４５】本発明における該治療剤の投与形態として
は、門脈内持続点滴投与、脾動脈内持続点滴投与、腹腔
内投与が好ましい。門脈内持続点滴投与、脾動脈内持続
点滴投与がさらに好ましく、門脈内持続点滴投与がもっ
とも好ましい。該治療剤の投与量は１×１０10細胞であ
り、１．５×１０10細胞が好ましく、２．０×１０10細
胞がさらに好ましい。
は、門脈内持続点滴投与、脾動脈内持続点滴投与、腹腔
内投与が好ましい。門脈内持続点滴投与、脾動脈内持続
点滴投与がさらに好ましく、門脈内持続点滴投与がもっ
とも好ましい。該治療剤の投与量は１×１０10細胞であ
り、１．５×１０10細胞が好ましく、２．０×１０10細
胞がさらに好ましい。
【００４６】本発明の人工肝臓は、細胞増殖因子遺伝子
を哺乳類の肝臓細胞に導入してインビトロ不死化肝臓細
胞を得る工程、該不死化肝臓細胞を増殖させる工程、お
よび該不死化肝臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去
する工程からなる、肝臓細胞の増殖方法を用いて得られ
る肝臓細胞からなる。本明細書における「人工肝臓」と
は、マイクロ孔質糖マイクロキャリヤーまたは毛管やセ
ラミックのような他の生体適合性支持マトリックス系を
基盤とした機能的肝臓細胞の集合体がグルコースや尿素
を新生し、肝性脳症の原因物質であるアンモニア等を速
やかに解毒すると共に肝不全患者のアミノ酸異常を是正
するといった適確な肝機能の再現が行なえる体外循環肝
補助装置として定義される。
を哺乳類の肝臓細胞に導入してインビトロ不死化肝臓細
胞を得る工程、該不死化肝臓細胞を増殖させる工程、お
よび該不死化肝臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去
する工程からなる、肝臓細胞の増殖方法を用いて得られ
る肝臓細胞からなる。本明細書における「人工肝臓」と
は、マイクロ孔質糖マイクロキャリヤーまたは毛管やセ
ラミックのような他の生体適合性支持マトリックス系を
基盤とした機能的肝臓細胞の集合体がグルコースや尿素
を新生し、肝性脳症の原因物質であるアンモニア等を速
やかに解毒すると共に肝不全患者のアミノ酸異常を是正
するといった適確な肝機能の再現が行なえる体外循環肝
補助装置として定義される。
【００４７】本発明の人工肝臓は、マイクロキャリアー
を含んでもよい。マイクロキャリアーは肝臓細胞の細胞
基質として単位面積当たりの培養肝臓細胞総数を増加さ
せるのに有用である。該マイクロキャリアーは、球型の
デキストラン、多孔質樹脂およびコラーゲンミクロスフ
ィアが好ましい。
を含んでもよい。マイクロキャリアーは肝臓細胞の細胞
基質として単位面積当たりの培養肝臓細胞総数を増加さ
せるのに有用である。該マイクロキャリアーは、球型の
デキストラン、多孔質樹脂およびコラーゲンミクロスフ
ィアが好ましい。
【００４８】また、生体適合性に優れたセルロースビー
ズが好ましく、細胞接着性ペプチドを表面に付着させた
セルロースビーズがより好ましい。細胞接着性ペプチド
としては、ＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳ（Ｇ：グリシン、Ｒ：
アルギニン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｓ：セリン）などの
アミノ酸配列が含まれるが、ＲＧＤのアミノ酸配列が含
まれればとくに限定されない。
ズが好ましく、細胞接着性ペプチドを表面に付着させた
セルロースビーズがより好ましい。細胞接着性ペプチド
としては、ＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳ（Ｇ：グリシン、Ｒ：
アルギニン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｓ：セリン）などの
アミノ酸配列が含まれるが、ＲＧＤのアミノ酸配列が含
まれればとくに限定されない。
【００４９】コラーゲンミクロスフィアのなかでもコラ
ーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフ
ィアが、インビボに類似した培養環境を作ることができ
るため、最も好ましい。
ーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフ
ィアが、インビボに類似した培養環境を作ることができ
るため、最も好ましい。
【００５０】本発明においては、肝臓細胞の付着占拠率
を考えると、細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセ
ルロースビーズ、およびコラーゲンのフィブリンのみか
らなるコラーゲンミクロスフィアが好ましい。コラーゲ
ンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィア
は、ウシ真皮をペプシンで処理し、可溶化し、精製し、
ついでビーズ状に成形することにより製造することがで
きる。細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロー
スビーズの場合は、肝臓細胞の付着占拠率は８０〜９０
％であり、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラー
ゲンミクロスフィアでは、ほぼ１００％である。したが
って、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲン
ミクロスフィアが最も好ましい（図４（ａ）および図４
（ｂ）参照）。
を考えると、細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセ
ルロースビーズ、およびコラーゲンのフィブリンのみか
らなるコラーゲンミクロスフィアが好ましい。コラーゲ
ンのフィブリンのみからなるコラーゲンミクロスフィア
は、ウシ真皮をペプシンで処理し、可溶化し、精製し、
ついでビーズ状に成形することにより製造することがで
きる。細胞接着性ペプチドを表面に付着させたセルロー
スビーズの場合は、肝臓細胞の付着占拠率は８０〜９０
％であり、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラー
ゲンミクロスフィアでは、ほぼ１００％である。したが
って、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラーゲン
ミクロスフィアが最も好ましい（図４（ａ）および図４
（ｂ）参照）。
【００５１】これらの担体に対する肝臓細胞の付着率を
図４（ａ）および図４（ｂ）により説明する。図４
（ａ）は、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラー
ゲンミクロスフィア（商品番号ＫＯ−００００−０１、
フナコシ社製）に付着した肝臓細胞の顕微鏡写真であ
る。図４（ａ）中、コラーゲンのフィブリンのみからな
るコラーゲンミクロスフィア１は肝臓細胞２に完全に覆
われているのが認められる。図４（ｂ）は、細胞接着性
ペプチドを表面に付着させたセルロースビーズ（株式会
社クラレ製）に付着した肝臓細胞の顕微鏡写真である。
図４（ｂ）中、細胞接着性ペプチドを表面に付着させた
セルロースビーズ３は、（ａ）より低い占拠率で肝臓細
胞２により覆われ、細胞の付着していないビーズ表面４
が観察される。
図４（ａ）および図４（ｂ）により説明する。図４
（ａ）は、コラーゲンのフィブリンのみからなるコラー
ゲンミクロスフィア（商品番号ＫＯ−００００−０１、
フナコシ社製）に付着した肝臓細胞の顕微鏡写真であ
る。図４（ａ）中、コラーゲンのフィブリンのみからな
るコラーゲンミクロスフィア１は肝臓細胞２に完全に覆
われているのが認められる。図４（ｂ）は、細胞接着性
ペプチドを表面に付着させたセルロースビーズ（株式会
社クラレ製）に付着した肝臓細胞の顕微鏡写真である。
図４（ｂ）中、細胞接着性ペプチドを表面に付着させた
セルロースビーズ３は、（ａ）より低い占拠率で肝臓細
胞２により覆われ、細胞の付着していないビーズ表面４
が観察される。
【００５２】本発明の人工肝臓は、前記肝臓細胞を内蔵
するための容器を含んでもよい。容器としては、ホロー
ファイバー型、平板状に培養肝臓細胞をモジュール内に
積み上げた積層型、不織布充填型などがあげられ、細胞
密度が高く、機能的に長期間の培養維持が可能であれ
ば、とくに限定されない。
するための容器を含んでもよい。容器としては、ホロー
ファイバー型、平板状に培養肝臓細胞をモジュール内に
積み上げた積層型、不織布充填型などがあげられ、細胞
密度が高く、機能的に長期間の培養維持が可能であれ
ば、とくに限定されない。
【００５３】本発明の人工肝臓は、さらに導管を有して
もよい。患者の血液から有害物質を含む血漿の一部が導
管を介して血漿分離装置によって分離される。分離され
た血漿は、導管をとおってバイオ人工肝臓モジュール側
回路へ移動し、バイオ人工肝臓モジュールで有害物質が
解毒され、グルコースやその他の物質の新生が行なわれ
る。処理された血漿を再び患者体内へと導くために、導
管を用いることもできる。導管はバイオ人工肝臓モジュ
ール内の培養肝臓細胞への酸素供給のためにガス交換装
置や活性炭カラム等を直列に連結するために使用しても
よい。バイオ人工肝臓モジュールとは、患者側からの血
漿流入部路と処理された血漿が患者側に導かれる流出路
を有するものであれば、とくに限定されない。
もよい。患者の血液から有害物質を含む血漿の一部が導
管を介して血漿分離装置によって分離される。分離され
た血漿は、導管をとおってバイオ人工肝臓モジュール側
回路へ移動し、バイオ人工肝臓モジュールで有害物質が
解毒され、グルコースやその他の物質の新生が行なわれ
る。処理された血漿を再び患者体内へと導くために、導
管を用いることもできる。導管はバイオ人工肝臓モジュ
ール内の培養肝臓細胞への酸素供給のためにガス交換装
置や活性炭カラム等を直列に連結するために使用しても
よい。バイオ人工肝臓モジュールとは、患者側からの血
漿流入部路と処理された血漿が患者側に導かれる流出路
を有するものであれば、とくに限定されない。
【００５４】本発明の方法は、ドナー肝の不足を解消す
べく価値ある治療戦略である。また将来的にも、本発明
による可逆的な不死化機構は、さまざまな治療状況下で
他の体細胞にも広く応用可能である。
べく価値ある治療戦略である。また将来的にも、本発明
による可逆的な不死化機構は、さまざまな治療状況下で
他の体細胞にも広く応用可能である。
【００５５】実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】製造例１
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７の製造
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７（図１参照）
は、従来の方法（ケイエイ ウェスタマンら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、
８９７１頁、１９９６年）にしたがい製造した。具体的
に、その方法は以下のとおりである。
は、従来の方法（ケイエイ ウェスタマンら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３巻、
８９７１頁、１９９６年）にしたがい製造した。具体的
に、その方法は以下のとおりである。
【００５７】１． ＬＸＳＮレトロウイルスベクターを
ＥｃｏＲＩとＲｓｒ２で消化した。バックボーンベクタ
ー由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏ
ｔ１、ＢａｍＨ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ
１、Ｓａｌ１、Ｓｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を
含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１Ｌｏ
ｘＰ配列は、該ベクターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に
挿入した。ｈＴＥＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部
位に挿入した。
ＥｃｏＲＩとＲｓｒ２で消化した。バックボーンベクタ
ー由来のＥｃｏＲ１を変異させたのち、制限部位（Ｎｏ
ｔ１、ＢａｍＨ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｈｐａ
１、Ｓａｌ１、Ｓｆｉ１、Ｃｌａ１およびＲｓｒ２）を
含有するポリリンカーを挿入した。合成した５１１Ｌｏ
ｘＰ配列は、該ベクターのＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位に
挿入した。ｈＴＥＲＴ遺伝子はＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部
位に挿入した。
【００５８】２． ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、５１１ＬｏｘＰ
およびＢ型肝炎転写後調節因子（ティー エス エン
（T. S. Yen）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９
９５年）を含有するカセットベクターを、以下のように
して製造した。
およびＢ型肝炎転写後調節因子（ティー エス エン
（T. S. Yen）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９
９５年）を含有するカセットベクターを、以下のように
して製造した。
【００５９】ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ３で消
化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異さ
せたのち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲ
Ｖ、Ｎｏｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃ
ｌａ１、Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリ
ンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該
ベクターのＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。
ついで、ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（No
vagen）製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロン
テク社（Clontech Inc）製）とがＮｃｏ１部位で連結さ
れ、一方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑Ｃｌ
ａ１部位である断片を製造した。この断片をバックボー
ンベクターのＳａｌ１および平滑Ｂｇｌ２部位に挿入し
た。
化し、バックボーンベクター由来のＥｃｏＲ１を変異さ
せたのち、制限部位（Ｘｈｏ１、Ｓａｌ１、ＥｃｏＲ
Ｖ、Ｎｏｔ１、Ｈｐａ１、Ｈｉｎｄ３、ＥｃｏＲ１、Ｃ
ｌａ１、Ｓｆｉ１およびＨｉｎｄ３）を含有するポリリ
ンカーを挿入した。合成した５１１ＬｏｘＰ配列は、該
ベクターのＮｏｔ１およびＨｉｎｄ３部位に挿入した。
ついで、ｐＣＩＴＥ−Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバゲン社（No
vagen）製）由来のＩＲＥＳとＥＧＦＰ遺伝子（クロン
テク社（Clontech Inc）製）とがＮｃｏ１部位で連結さ
れ、一方の末端がＳａｌ１部位、他方の末端が平滑Ｃｌ
ａ１部位である断片を製造した。この断片をバックボー
ンベクターのＳａｌ１および平滑Ｂｇｌ２部位に挿入し
た。
【００６０】３． 前記工程１で製造したベクターのＳ
ａｌ１およびＣｌａ１部位に、前記工程２で製造したカ
セットベクター由来のＸｈｏ１およびＣｌａ１断片を挿
入し、ＳＳＲ＃１９７ベクターを完成させた。
ａｌ１およびＣｌａ１部位に、前記工程２で製造したカ
セットベクター由来のＸｈｏ１およびＣｌａ１断片を挿
入し、ＳＳＲ＃１９７ベクターを完成させた。
【００６１】実施例１
不死化ヒト成人肝細胞株ＴＴＮＴ−１の樹立
レトロウイルスベクターＳＳＲ＃１９７産生細胞である
Ｃｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクター
ＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち、力価は１×１０5
ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５フラスコに１×１０5細胞
／ｃｍ2で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ
（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密度が約９
０％となった時点で、ＤＥＭＥ＋１０％ＮＣＳ培養液１
０ｍｌで培養液の交換を行なった。
Ｃｒｉｐ細胞（Ｃｒｉｐ細胞のレトロウイルスベクター
ＳＳＲ＃１９７産生能力、すなわち、力価は１×１０5
ｃｆｕ／ｍｌ）を、Ｔ−７５フラスコに１×１０5細胞
／ｃｍ2で播種し、１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ
（新生仔ウシ血清）培養液で培養した。細胞密度が約９
０％となった時点で、ＤＥＭＥ＋１０％ＮＣＳ培養液１
０ｍｌで培養液の交換を行なった。
【００６２】培養液交換２４時間後に、レトロウイルス
ベクターＳＳＲ＃１９７を含有するＣｒｉｐ細胞の培養
上清２ｍｌを０．４５μｍのフィルターで濾過した液に
１２μｇ／ｍｌのポリブレン（polybrene、シグマ（Sig
ma）社製）を加えた。これを、１×１０6個の初代成人
ヒト肝細胞（カタログ番号ＣＳ−ＡＢＩ−３７１６、大
日本製薬株式会社製）を培養した培養液と交換し、肝細
胞を４時間感染させた。同様な感染処置を日に２回、計
３日間実行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮な
ＣＳ−Ｃ培養液に置き換えて肝細胞を培養した。
ベクターＳＳＲ＃１９７を含有するＣｒｉｐ細胞の培養
上清２ｍｌを０．４５μｍのフィルターで濾過した液に
１２μｇ／ｍｌのポリブレン（polybrene、シグマ（Sig
ma）社製）を加えた。これを、１×１０6個の初代成人
ヒト肝細胞（カタログ番号ＣＳ−ＡＢＩ−３７１６、大
日本製薬株式会社製）を培養した培養液と交換し、肝細
胞を４時間感染させた。同様な感染処置を日に２回、計
３日間実行した。各日の最終感染後は、培養液を新鮮な
ＣＳ−Ｃ培養液に置き換えて肝細胞を培養した。
【００６３】最終感染から２日後に細胞をトリプシンに
て処理し、回収した。ついでＦＡＣＳカリバー（FACS C
alibur）（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickins
on）製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を回収した（図２
（ａ）および（ｂ）参照）。ＣＳ−Ｃ無血清培地キット
（カタログ番号ＣＳ−ＳＦ−４ＺＯ−５００、大日本製
薬株式会社製）において、限界希釈法（１／２細胞／穴
で播種）にてＴＴＮＴ−１を樹立した。このＴＴＮＴ−
１細胞を産業技術総合研究所特許寄託センターに寄託し
た（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８）。ＴＴＮＴ−１細胞
は、増殖が停止する危機もなく不死化しＣＳ−Ｃ培地下
に単層に増殖し、約２４時間後にその数が倍加した。Ｔ
ＴＮＴ−１細胞は、数個の核小体を有する大きな核をも
ち細胞内顆粒に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態
学的な特徴を示した。
て処理し、回収した。ついでＦＡＣＳカリバー（FACS C
alibur）（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickins
on）製）を用いてＧＦＰ陽性細胞を回収した（図２
（ａ）および（ｂ）参照）。ＣＳ−Ｃ無血清培地キット
（カタログ番号ＣＳ−ＳＦ−４ＺＯ−５００、大日本製
薬株式会社製）において、限界希釈法（１／２細胞／穴
で播種）にてＴＴＮＴ−１を樹立した。このＴＴＮＴ−
１細胞を産業技術総合研究所特許寄託センターに寄託し
た（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８）。ＴＴＮＴ−１細胞
は、増殖が停止する危機もなく不死化しＣＳ−Ｃ培地下
に単層に増殖し、約２４時間後にその数が倍加した。Ｔ
ＴＮＴ−１細胞は、数個の核小体を有する大きな核をも
ち細胞内顆粒に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態
学的な特徴を示した。
【００６４】実施例２
Ｃｒｅ組換え酵素によるｈＴＥＲＴ遺伝子の切り出し
（図１参照） 核内限局信号（ＮＬＳ）標識されたＣｒｅ組換え酵素を
産生する複製不可能な組換えアデノベクターＡｘＣＡＮ
Ｃｒｅ（３．３×１０8ｐｆｕ／ｍｌ）（理研ジーンバ
ンク、日本、ＲＤＢ Ｎｏ．１７４８）をＭＯＩ（感染
多重度）＝５０でＴＴＮＴ−１細胞に感染させた。Ａｘ
ＣＡＮＣｒｅで４８時間感染したのち、細胞をトリプシ
ンで処理して回収し、ついでＦＡＣＳカリバーにてｈＴ
ＥＲＴを発現していない陰性細胞のみを入手した。これ
は蛍光顕微鏡で確認された（図２（ｃ）および図２
（ｄ）参照）。さらにＲＴ−ＰＣＲ法により、ｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子切り出し前後のＴＴＮＴ−１細胞において、肝
臓代謝に関わる重要な遺伝子、すなわち、アルブミン遺
伝子、ＡＳＧＰＲ遺伝子、ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子、
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子、ＧＫ遺伝子、ＧＳ遺伝子、ＧＳＴ
−π遺伝子、ヒト血液凝固第Ｘ因子遺伝子およびヒトβ
−アクチン遺伝子ならびにｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を調
べた。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＲＮＡｚｏｌ（シンナ／バ
イオテックス社、フレンズウッド、テキサス州、アメリ
カ合衆国）を用いてＴＴＮＴ−１細胞からＲＮＡを抽出
し、２μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２
℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応さ
せた。
（図１参照） 核内限局信号（ＮＬＳ）標識されたＣｒｅ組換え酵素を
産生する複製不可能な組換えアデノベクターＡｘＣＡＮ
Ｃｒｅ（３．３×１０8ｐｆｕ／ｍｌ）（理研ジーンバ
ンク、日本、ＲＤＢ Ｎｏ．１７４８）をＭＯＩ（感染
多重度）＝５０でＴＴＮＴ−１細胞に感染させた。Ａｘ
ＣＡＮＣｒｅで４８時間感染したのち、細胞をトリプシ
ンで処理して回収し、ついでＦＡＣＳカリバーにてｈＴ
ＥＲＴを発現していない陰性細胞のみを入手した。これ
は蛍光顕微鏡で確認された（図２（ｃ）および図２
（ｄ）参照）。さらにＲＴ−ＰＣＲ法により、ｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子切り出し前後のＴＴＮＴ−１細胞において、肝
臓代謝に関わる重要な遺伝子、すなわち、アルブミン遺
伝子、ＡＳＧＰＲ遺伝子、ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子、
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子、ＧＫ遺伝子、ＧＳ遺伝子、ＧＳＴ
−π遺伝子、ヒト血液凝固第Ｘ因子遺伝子およびヒトβ
−アクチン遺伝子ならびにｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を調
べた。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＲＮＡｚｏｌ（シンナ／バ
イオテックス社、フレンズウッド、テキサス州、アメリ
カ合衆国）を用いてＴＴＮＴ−１細胞からＲＮＡを抽出
し、２μｇの総ＲＮＡを２２℃で１０分間、さらに４２
℃で２０分間、ＲＮＡ逆転写酵素を用いて逆転写反応さ
せた。
【００６５】得られた２μｇの逆転写産物を、各プライ
マー２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌ
ｄキット（パーキン−エルマー／シータス社、ノーウォ
ーク、コネチカット州、アメリカ合衆国）を用い、その
プロトコールにしたがってＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ
は、９５℃で１０分間インキュベーションし、９５℃で
３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒からなる
インキュベーションを３５サイクル行ない、最後に７２
℃で７分間インキュベーションして実施した。各遺伝子
に対するプライマーには下記のものを使用した。
マー２０ｐｍｏｌ／ｍｌで、ＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌ
ｄキット（パーキン−エルマー／シータス社、ノーウォ
ーク、コネチカット州、アメリカ合衆国）を用い、その
プロトコールにしたがってＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ
は、９５℃で１０分間インキュベーションし、９５℃で
３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒からなる
インキュベーションを３５サイクル行ない、最後に７２
℃で７分間インキュベーションして実施した。各遺伝子
に対するプライマーには下記のものを使用した。
【００６６】
アルブミン遺伝子
５′プライマー：ＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣ
３′プライマー：ＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＧ
ＡＳＧＰＲ遺伝子
５′プライマー：ＴＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡ
３′プライマー：ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＣ
ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子
５′プライマー：ＡＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＴＡＴＣＡＣ
３′プライマー：ＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＣ
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子
５′プライマー：ＣＣＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＣＧ
３′プライマー：ＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＡＣＧＧＴＧＣ
ＧＫ遺伝子
５′プライマー：ＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴ
３′プライマー：ＡＧＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡ
ＧＳ遺伝子
５′プライマー：ＡＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＧ
３′プライマー：ＴＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＴＧＣＧ
ＧＳＴ−π遺伝子
５′プライマー：ＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＴＡＴＴ
３′プライマー：ＧＧＣＴＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡ
ヒト血液凝固因子Ｘ遺伝子
５′プライマー：ＧＴＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴ
３′プライマー：ＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧ
ｈＴＥＲＴ遺伝子
５′プライマー：ＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡ
３′プライマー：ＴＧＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧ
ヒトβ−アクチン遺伝子
５′プライマー：ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴ
ＣＴＡ
３′プライマー：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡ
ＧＧＧ
上記遺伝子はいずれも、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ組換えによる
ｈＴＥＲＴ遺伝子の除去前に比べ、除去後の方が高い発
現性を示した（図３（ａ）および図３（ｂ）参照）。
ｈＴＥＲＴ遺伝子の除去前に比べ、除去後の方が高い発
現性を示した（図３（ａ）および図３（ｂ）参照）。
【００６７】実施例３アルブミンの製造２ｍｌの無血清
培地ＣＳ−Ｃを用い、実施例２においてｈＴＥＲＴ遺伝
子の切り出すことにより得られた肝臓細胞１×１０5細
胞個を２４時間３７℃で培養した。ついで、培養上清１
００μｌを採取し、それを、Ａｌｂｕｗｅｌｌ（エキソ
セル社（EXOCELL INC.）製、ＰＡ、アメリカ合衆国）を
用いて、そのプロトコルどおりにアルブミン濃度を測定
するために用いた。コントロールとしては、２ｍｌの４
％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭを用いるほかは同じ方法で
培養した肝臓細胞の培養上清を、培地として用いた。
培地ＣＳ−Ｃを用い、実施例２においてｈＴＥＲＴ遺伝
子の切り出すことにより得られた肝臓細胞１×１０5細
胞個を２４時間３７℃で培養した。ついで、培養上清１
００μｌを採取し、それを、Ａｌｂｕｗｅｌｌ（エキソ
セル社（EXOCELL INC.）製、ＰＡ、アメリカ合衆国）を
用いて、そのプロトコルどおりにアルブミン濃度を測定
するために用いた。コントロールとしては、２ｍｌの４
％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭを用いるほかは同じ方法で
培養した肝臓細胞の培養上清を、培地として用いた。
【００６８】測定の結果、培養上清に含まれるアルブミ
ン濃度は、無血清培地の場合３７．３６μｇ／ｄｌ、血
清を含む培地の場合には１４．６μｇ／ｄｌであった。
したがって無血清培地を用いることにより、より多くの
アルブミンが産生され得ることが示された。
ン濃度は、無血清培地の場合３７．３６μｇ／ｄｌ、血
清を含む培地の場合には１４．６μｇ／ｄｌであった。
したがって無血清培地を用いることにより、より多くの
アルブミンが産生され得ることが示された。
【００６９】［産業上の利用可能性］
本発明によると、哺乳類の肝臓細胞に細胞増殖遺伝子を
導入してインビトロ不死化肝臓細胞を得る工程、該イン
ビトロ不死化肝臓細胞を培養する工程、および該インビ
トロ不死化肝臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去す
る工程からなる肝臓細胞の増殖方法を用いることによ
り、大量増殖可能な哺乳類の肝臓細胞株を樹立すること
ができる。本発明のＴＴＮＴ−１細胞には、Ｃｒｅ／Ｌ
ｏｘＰ部位特異的組換えによる細胞増殖因子遺伝子の除
去という、安全手段が備わっているので、ＴＴＮＴ−１
細胞の移植により患者を腫瘍発現の危険性から回避でき
る。 配列表フリーテキスト 配列番号１：ＬｏｘＰ配列 配列番号２：アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プ ライマー 配列番号３：アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プ ライマー 配列番号４：ＡＳＧＰＲ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プ ライマー 配列番号５：ＡＳＧＰＲ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プ ライマー 配列番号６：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用５′プライマー 配列番号７：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用３′プライマー 配列番号８：ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ プライマー 配列番号９：ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ プライマー 配列番号１０：ＧＫ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライ マー 配列番号１１：ＧＫ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライ マー 配列番号１２：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライ マー 配列番号１３：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライ マー 配列番号１４：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ プライマー 配列番号１５：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ プライマー 配列番号１６：ヒト血液凝固因子Ｘ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反 応用５′プライマー 配列番号１７：ヒト血液凝固因子Ｘ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反 応用３′プライマー 配列番号１８：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ プライマー 配列番号１９：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ プライマー 配列番号２０：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用５′プライマー 配列番号２１：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用３′プライマー 配列番号２２：細胞接着性ペプチド 配列番号２３：細胞接着性ペプチド ［図面の簡単な説明］
導入してインビトロ不死化肝臓細胞を得る工程、該イン
ビトロ不死化肝臓細胞を培養する工程、および該インビ
トロ不死化肝臓細胞から該細胞増殖因子遺伝子を除去す
る工程からなる肝臓細胞の増殖方法を用いることによ
り、大量増殖可能な哺乳類の肝臓細胞株を樹立すること
ができる。本発明のＴＴＮＴ−１細胞には、Ｃｒｅ／Ｌ
ｏｘＰ部位特異的組換えによる細胞増殖因子遺伝子の除
去という、安全手段が備わっているので、ＴＴＮＴ−１
細胞の移植により患者を腫瘍発現の危険性から回避でき
る。 配列表フリーテキスト 配列番号１：ＬｏｘＰ配列 配列番号２：アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プ ライマー 配列番号３：アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プ ライマー 配列番号４：ＡＳＧＰＲ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プ ライマー 配列番号５：ＡＳＧＰＲ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プ ライマー 配列番号６：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用５′プライマー 配列番号７：ビリルビン−ＵＧＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用３′プライマー 配列番号８：ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ プライマー 配列番号９：ＣＹＰ３Ａ４遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ プライマー 配列番号１０：ＧＫ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライ マー 配列番号１１：ＧＫ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライ マー 配列番号１２：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′プライ マー 配列番号１３：ＧＳ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′プライ マー 配列番号１４：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ プライマー 配列番号１５：ＧＳＴ−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ プライマー 配列番号１６：ヒト血液凝固因子Ｘ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反 応用５′プライマー 配列番号１７：ヒト血液凝固因子Ｘ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反 応用３′プライマー 配列番号１８：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用５′ プライマー 配列番号１９：ｈＴＥＲＴ遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用３′ プライマー 配列番号２０：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用５′プライマー 配列番号２１：ヒトβ−アクチン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応 用３′プライマー 配列番号２２：細胞接着性ペプチド 配列番号２３：細胞接着性ペプチド ［図面の簡単な説明］
【図１】図１は、アデノベクターＡｘＣＡＮＣｒｅの感
染によるＬｏｘＰ配列特異的な切り出し機構を示す図で
ある。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケージン
グシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴはｈ
ＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、ＭｏＭ
ＬＶ ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長末端反
復、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリ
ー部位をそれぞれ示す。
染によるＬｏｘＰ配列特異的な切り出し機構を示す図で
ある。ここで、ＡＴＧは開始コドン、Ψはパッケージン
グシグナル、ＬｏｘＰはＬｏｘＰ配列、ｈＴＥＲＴはｈ
ＴＥＲＴ遺伝子、ＥＧＦＰは増強ＧＦＰ遺伝子、ＭｏＭ
ＬＶ ＬＴＲはモロニーマウス白血病ウイルス長末端反
復、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリ
ー部位をそれぞれ示す。
【図２ａ】図２（ａ）は、レトロウイルスベクターＳＳ
Ｒ＃１９７に感染した肝細胞の位相差顕微鏡像である。
Ｒ＃１９７に感染した肝細胞の位相差顕微鏡像である。
【図２ｂ】図２（ｂ）は、図２（ａ）に示した細胞の蛍
光顕微鏡像である。
光顕微鏡像である。
【図２ｃ】図２（ｃ）は、ｈＴＥＲＴとＧＳＴタンパク
質とをコードするＤＮＡ断片を除去するために、アデノ
ウイルスベクターＡｘＣＡＮＣｒｅ処理された肝細胞の
位相差顕微鏡像である。
質とをコードするＤＮＡ断片を除去するために、アデノ
ウイルスベクターＡｘＣＡＮＣｒｅ処理された肝細胞の
位相差顕微鏡像である。
【図２ｄ】図２（ｄ）は、図２（ｃ）に示した細胞の蛍
光顕微鏡像である。
光顕微鏡像である。
【図３ａ】図３（ａ）は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の切り出し
前におけるＴＴＮＴ−１細胞での肝特異的遺伝子および
ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を示す図である。レーン１から
９は、それぞれアルブミン遺伝子、アシアロ糖タンパク
質受容体（以下、ＡＳＧＰＲという）遺伝子、肝臓性ビ
リルビン−ウリジンジフォスフェートグルクロノシルト
ランスフェラーゼ（以下、ビリルビン−ＵＧＴという）
遺伝子、チトクローム Ｐ ４５０ ３Ａ４（以下、Ｃ
ＹＰ３Ａ４という）遺伝子、グルコキナーゼ（以下、Ｇ
Ｋという）遺伝子、グルタミンシンセターゼ（以下、Ｇ
Ｓという）遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼπ（以下、ＧＳＴ−πという）遺伝子、ヒト血液凝
固第Ｘ因子（ＨＢＣＦ−Ｘ）遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子
およびヒトβ−アクチン遺伝子の発現を示す。Ｍはマー
カーを示す。
前におけるＴＴＮＴ−１細胞での肝特異的遺伝子および
ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を示す図である。レーン１から
９は、それぞれアルブミン遺伝子、アシアロ糖タンパク
質受容体（以下、ＡＳＧＰＲという）遺伝子、肝臓性ビ
リルビン−ウリジンジフォスフェートグルクロノシルト
ランスフェラーゼ（以下、ビリルビン−ＵＧＴという）
遺伝子、チトクローム Ｐ ４５０ ３Ａ４（以下、Ｃ
ＹＰ３Ａ４という）遺伝子、グルコキナーゼ（以下、Ｇ
Ｋという）遺伝子、グルタミンシンセターゼ（以下、Ｇ
Ｓという）遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼπ（以下、ＧＳＴ−πという）遺伝子、ヒト血液凝
固第Ｘ因子（ＨＢＣＦ−Ｘ）遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子
およびヒトβ−アクチン遺伝子の発現を示す。Ｍはマー
カーを示す。
【図３ｂ】図３（ｂ）は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の切り出し
後におけるＴＴＮＴ−１細胞での肝特異的遺伝子および
ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を示す図である。レーン１から
９は、それぞれ図３（ａ）と同じ遺伝子の発現を示す。
Ｍはマーカーを示す。
後におけるＴＴＮＴ−１細胞での肝特異的遺伝子および
ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を示す図である。レーン１から
９は、それぞれ図３（ａ）と同じ遺伝子の発現を示す。
Ｍはマーカーを示す。
【図４ａ】図４（ａ）は、コラーゲンのフィブリンのみ
からなるコラーゲンミクロスフィアに付着した肝臓細胞
の顕微鏡像である。
からなるコラーゲンミクロスフィアに付着した肝臓細胞
の顕微鏡像である。
【図４ｂ】図４（ｂ）は、細胞接着性ペプチドを表面に
付着させたセルロースビーズに付着した肝臓細胞の顕微
鏡像である。
付着させたセルロースビーズに付着した肝臓細胞の顕微
鏡像である。
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ
(73)特許権者 599173527
藤原 俊義
岡山県岡山市東山３−５−30
(73)特許権者 502381793
都津川 敏範
広島県福山市瀬戸町長和2374番地
(72)発明者 小林 直哉
日本国岡山県岡山市海吉2033−15
(72)発明者 レブルシュ、フィリップ
アメリカ合衆国、02129 マサチューセ
ッツ州、チャールズタウン、エイス ス
トリート 197、ナンバー 729（番地な
し)
(72)発明者 田中 紀章
日本国岡山県浅口郡鴨方町六条院中2325
−１
(72)発明者 藤原 俊義
日本国岡山県岡山市東山３−５−30
(72)発明者 都津川 敏範
日本国広島県福山市瀬戸町長和2374番地
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏ
ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．33，ｐｐ．701−708
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Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ
ｉｏｎ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．737−742
（2000)
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖ
ｏｌ．18，ｐｐ．65−68（1998)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．34，ｐ
ｐ．83−87（1999)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子を導入して得られたインビトロ不死化肝細胞Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７４９８を増殖する工程、およびＣｒｅ
組換え酵素を用いて該インビトロ不死化肝細胞から該ｈ
ＴＥＲＴ遺伝子を除去する工程からなる肝細胞の増殖方
法。 - 【請求項２】 前記不死化肝細胞を無血清培地で増殖さ
せる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 Ｃｒｅ組換え酵素がアデノウイルスによ
ってコードされる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子を導入して得られたインビトロ不死化肝細胞Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７４９８を増殖させる工程、およびＣｒ
ｅ組換え酵素を用いて該インビトロ不死化肝細胞から該
ｈＴＥＲＴ遺伝子を除去する工程からなる肝細胞の増殖
方法により得られるインビトロ肝細胞。 - 【請求項５】 ヒトの肝臓の薬物代謝検定モデルとして
使用される請求項４記載のインビトロ肝細胞。 - 【請求項６】 一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子を導入して得られたインビトロ不死化肝細胞Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７４９８を増殖させる工程、およびＣｒ
ｅ組換え酵素を用いて該インビトロ不死化肝細胞から該
ｈＴＥＲＴ遺伝子を除去する工程からなる肝細胞の増殖
方法により得られるインビトロ肝細胞からなる肝疾患治
療剤。 - 【請求項７】 一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲ
Ｔ遺伝子を導入して得られた不死化肝細胞ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７４９８を増殖させる工程、およびＣｒｅ組換え酵
素を用いて該不死化肝細胞から該ｈＴＥＲＴ遺伝子を除
去する工程からなる方法により得られるインビトロ肝細
胞を、無血清培地にて培養することからなるアルブミン
の製造方法。
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-
2002
- 2002-03-15 US US10/169,085 patent/US7033744B2/en not_active Expired - Fee Related
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