CN112888777A - 用于造血细胞的基因修饰的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及用于造血细胞的基因修饰的方法。具体地，本发明涉及使用前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白来增强通过重组逆转录病毒载体进行的转导。本公开的组合物和方法特别适用于基因疗法应用，包含单基因遗传疾病和病症的治疗。

Description

用于造血细胞的基因修饰的方法
相关申请
本申请要求于2018年7月30日提交的美国临时专利申请第62/712,146号的优先权，所述美国临时专利申请的内容以其全文并入本文中。
序列表
本申请是经由EFS-Web以电子方式进行提交，并且包含处于.txt格式以电子方式提交的序列表。.txt文件含有2019年7月30日创建的名为“ROPA_01001WO_SeqList_ST25.txt”的序列表，并且大小为57千字节。此.txt文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且通过全文引用的方式并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于造血细胞的基因修饰的方法。具体地，本发明涉及使用选自前列腺素E2(PGE2)、重组纤连蛋白片段、泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白的两种或更多种转导增强子的组合来增强重组逆转录病毒载体的转导。
背景技术
离体介导的基因向靶细胞中的转移是用于细胞和基因疗法的临床应用方法。重组逆转录病毒载体(例如，重组慢病毒载体)可以用于向细胞(例如，造血细胞)递送多核苷酸。使靶造血细胞与重组逆转录病毒(例如，慢病毒)载体接触使得将一个或多个基因递送到造血细胞，这一过程称为转导。随后，可以向受试者施用造血细胞，旨在使造血细胞将其自身植入受试者的骨髓中。
逆转录病毒(例如，慢病毒)载体转导的效率通常是有限的，并且转导效率通常是基因疗法成功的主要障碍。因此，对适用于在临床环境下应用于造血细胞的组合物和方法的需求仍未得到满足。本公开提供了此类组合物和方法以及更多。
发明内容
本发明总体上涉及用于造血细胞的基因修饰的方法。具体地，本发明涉及使用两种或更多种转导增强子的组合来增强重组逆转录病毒载体的转导，其中所述组合的转导增强子中的至少两种转导增强子选自前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆、重组纤连蛋白片段和/或硫酸鱼精蛋白。在某些实施例中，所述组合包括三种或更多种转导，包含前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白。在某些实施例中，所述组合包括四种或更多种转导，包含前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆、重组纤连蛋白片段和硫酸鱼精蛋白。本公开的组合物和方法特别适用于基因疗法应用，包含单基因遗传疾病和病症的治疗。有利的是，与在没有转导增强子的情况下的转导相比，本公开的方法使经过转导的细胞群体的毒性降低(存活率更高)。
在一方面，本公开提供了一种造血细胞的基因修饰的方法，所述方法包括：使造血细胞与泊洛沙姆接触；使所述造血细胞与前列腺素E2(PGE2)或其衍生物接触；以及使所述造血细胞与重组逆转录病毒载体接触。
在一方面，本公开提供了一种造血细胞的基因修饰的方法，所述方法包括：提供造血细胞；使所述造血细胞与泊洛沙姆接触；使所述造血细胞与前列腺素E2(PGE2)或其衍生物接触；以及使所述造血细胞与重组逆转录病毒载体接触。
在一个实施例中，所述重组逆转录病毒载体是重组慢病毒载体。
在一个实施例中，所述造血细胞已经被操纵。
在一个实施例中，所述提供步骤包括CD34+细胞的富集。
在一个实施例中，所述造血细胞已经在重组纤连蛋白片段涂覆的容器上培养。
在一个实施例中，所述泊洛沙姆选自由以下组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。
在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOST)。
在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物是经修饰的。
在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物是16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)。
在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物是未经修饰的。
在一个实施例中，所述方法进一步包括使所述造血细胞与硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白片段接触。在某些实施例中，所述重组纤连蛋白片段可以存在于液体培养物中或涂覆在培养皿上。在某些实施例中，所述细胞可以通过在包括所述重组纤连蛋白的培养皿上培养来进行预处理，和/或所述重组纤连蛋白片段可以在转导期间存在于液体培养基中。
在一个实施例中，接触步骤同时执行或在重叠的时间段期间执行。
在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL。
在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物的浓度为约10μg/mL。
在一个实施例中，所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL。
在一个实施例中，所述泊洛沙姆的浓度为约1000μg/mL。
在一个实施例中，所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL。
在一个实施例中，所述硫酸鱼精蛋白的浓度为约4μg/mL。
在一个实施例中，当在液体培养物中使用时，所述重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectin)的浓度为约5到约50ug/mL。
在一个实施例中，当在液体培养物中使用时，所述重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectin)的浓度为约20μg/mL。
在第二方面，本公开提供了一种增强造血细胞的重组逆转录病毒载体介导的基因修饰的方法，所述方法包括：用有效量的PGE2或其衍生物并且用有效量的泊洛沙姆来离体处理所述造血细胞或者使所述造血细胞与有效量的PGE2或其衍生物并且与有效量的泊洛沙姆离体接触；以及使所述造血细胞暴露于或接触包括多核苷酸的重组逆转录病毒载体，所述多核苷酸包括所关注的基因，其中与在不存在PGE2和泊洛沙姆的情况下用所述重组逆转录病毒载体转导造血细胞相比，所述重组逆转录病毒载体的病毒转导功效得到增强。
在一个实施例中，所述方法进一步包括用有效量的硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白片段离体处理所述造血细胞或者使所述造血细胞与有效量的硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白片段离体接触。
在一个实施例中，所述所关注的基因补足在与单基因遗传疾病或病症相关的基因中的缺陷。
在一个实施例中，所述所关注的基因选自由以下组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。在特定实施例中，所述所关注的基因编码由这些基因中的任何基因编码的蛋白质，或者编码这些基因中的任何基因的功能片段或变体。在特定实施例中，所述基因或蛋白质是人类基因或蛋白质。
在一个实施例中，所述方法抵消临床后遗症或改善单基因遗传疾病或病症。
在一个实施例中，所述单基因疾病或病症选自由以下组成的组：范可尼贫血(Fanconi Anemia)(包含互补群中的任何互补群)、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨质疏松症。
在一个实施例中，所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地造血细胞、骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。在某些实施例中，所述造血细胞是从要用重组修饰的造血细胞治疗的受试者获得的。
在第三方面，本公开提供了一种用于造血细胞的重组逆转录病毒载体介导的基因修饰的方法，所述方法包括：由从用G-CSF或其类似物(任选地，非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)或培非格司亭(pegfilgrastim))和/或普乐沙福(plerixafor)治疗的受试者获得的生物样品(任选地，外周血)制备CD34富集细胞；以及用重组逆转录病毒载体对所述CD34富集细胞进行基因修饰，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：范可尼贫血互补群(FANC)基因、ITGB2、R型丙酮酸激酶、OSTM1、TCIRG1、CLCN7、OSTM1或编码其功能变体或片段的基因，以及与其操作性地连接的真核活性启动子序列；其中所述基因修饰步骤包括使所述CD34富集细胞与所述重组逆转录病毒载体、PGE2和泊洛沙姆以及任选地硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白片段接触。
本公开提供了一种用于造血细胞的重组逆转录病毒载体介导的基因修饰的体外方法，所述方法包括：由从用G-CSF或其类似物(任选地，非格司亭、沙格司亭或培非格司亭)和/或普乐沙福治疗的受试者获得的生物样品(任选地，外周血)制备CD34富集细胞；以及用重组逆转录病毒载体对所述CD34富集细胞进行基因修饰，以用于选自范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨质疏松症的疾病或病症；其中所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：范可尼贫血互补群(FANC)基因、ITGB2、R型丙酮酸激酶、CLCN7、OSTM1、TCIRG1、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A或编码其功能变体或片段的基因，以及与其操作性地连接的真核活性启动子序列；其中所述基因修饰步骤包括使所述CD34富集细胞与PGE2和泊洛沙姆以及任选地硫酸鱼精蛋白接触。
本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的单基因遗传疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供表达由于所述单基因遗传疾病或病症而缺失或突变的多肽的经过基因修饰的造血细胞。在特定实施例中，从在用G-CSF或其类似物(任选地，非格司亭、沙格司亭或培非格司亭)和/或普乐沙福治疗受试者之后获自所述受试者的生物样品(任选地，外周血)获得的CD34富集细胞通过以下来进行基因修饰：在存在至少两种转导增强子的情况下使其与重组逆转录病毒载体接触，所述重组逆转录病毒载体包括表达盒，所述表达盒包括编码多肽的多核苷酸序列，所述至少两种转导增强子选自前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆、重组纤连蛋白片段和/或硫酸鱼精蛋白，并且将所得的经过基因修饰的细胞提供给所述受试者。在某些实施例中，疾病或病症选自范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症或婴儿恶性骨质疏松症；并且所述重组逆转录病毒载体包括多核苷酸，所述多核苷酸包括范可尼贫血互补群(FANC)基因、ITGB2、R型丙酮酸激酶、CLCN7、OSTM1、TCIRG1、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A或编码其功能变体或片段的基因，以及与其操作性地连接的真核活性启动子序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的范可尼贫血的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用通过用重组逆转录病毒载体对造血细胞进行基因修饰而产生的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：范可尼贫血互补群(FANC)基因或编码其功能变体或片段的基因。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的I型白细胞粘附缺乏症的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用通过用重组逆转录病毒载体对造血细胞进行基因修饰而产生的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：ITGB2基因或编码其功能变体或片段的基因。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的丙酮酸激酶缺乏症的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用通过用重组逆转录病毒载体对造血细胞进行基因修饰而产生的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：R型丙酮酸激酶基因或编码其功能变体或片段的基因。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的婴儿恶性骨质疏松症的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用通过用重组逆转录病毒载体对造血细胞进行基因修饰而产生的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：CLCN7、OSTM1、TCIRG1、TNFSF11、PLEKHM1或TNFRSF11A基因或编码其功能变体或片段的基因。
在另外的相关方面，本公开提供了一种产生包括至少80％或至少90％基因修饰的造血细胞的造血细胞群体的方法，所述方法包括：使造血细胞与包括多核苷酸的重组逆转录病毒载体(任选地，慢病毒载体)离体接触，所述多核苷酸包括所关注的基因或编码所关注的多肽，其中所述接触在存在PGE2或其衍生物，任选地人PGE2或16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)和泊洛沙姆，任选地泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)的情况下发生。所述细胞可以在足以允许通过逆转录病毒载体来转导所述细胞的条件和时间下与所述逆转录病毒载体接触，例如在合适的培养基中持续至少一小时、至少两小时、至少四小时、至少八小时、至少十二小时、至少16小时或至少24小时。在一些实施例中，例如在预刺激之后，细胞被转导一次或连续两次，其中每个转导周期介于12小时与24小时之间，或者介于16小时与18小时之间。在一些实施例中，细胞在相同或重叠的时间段期间与逆转录病毒载体和转导增强子接触。转导之后，可以将细胞调配在冷冻混合物(例如，美国华盛顿州博瑟尔生物生命解决方案公司(BioLife Solutions,Bothell,WA,USA)的CryoStor CS5)中，并低温保存以备后用。在此方面和其它方面的某些实施例中，所述泊洛沙姆选自由以下组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。在特定实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，所述PGE2或其衍生物是未经修饰或经过修饰的，例如16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)。在特定实施例中，所述方法进一步包括使所述造血细胞与硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白片段接触。在一些实施例中，所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL或约10μg/mL。在一些实施例中，所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL或约1000μg/mL。在一些实施例中，所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL或约4μg/mL。在某些实施例中，所述多核苷酸补足在与单基因遗传疾病或病症相关的基因中的缺陷。在某些实施例中，所述所关注的多肽选自由以下组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。在一些实施例中，所述疾病或病症是例如选自由以下组成的组的单基因遗传疾病或病症：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。在特定实施例中，所述造血细胞是CD34富集细胞或CD34+造血细胞，任选地骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。在一些实施例中，所述造血细胞群体具有至少1.0、至少1.5、至少2.0或至少2.5的VCN/细胞。
在相关方面，本公开提供了一种包括至少80％或至少90％基因修饰的造血细胞的造血细胞群体，其中所述细胞群体通过所公开的方法产生。
在另一个相关方面，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的遗传疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供包括至少80％或至少90％基因修饰的造血细胞的造血细胞群体，其中所述细胞群体通过公开的方法产生，其中所述造血细胞在与逆转录病毒载体离体接触之前从所述受试者获得，并且其中所关注的基因编码由于所述遗传疾病或病症而在所述受试者中突变或缺失的功能性多肽。在一些实施例中，所述多肽选自由以下组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。在一些实施例中，所述疾病或病症是例如选自由以下组成的组的单基因遗传疾病或病症：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。在特定实施例中，所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
在本文公开的任何方面和实施例的各个实施例中，细胞在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上转导。在本文公开的任何方面和实施例的各个实施例中，在转导之前和/或转导期间，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上培养来预处理细胞。在一些实施例中，在Retro-Nectin的液体培养基中转导细胞。在一些实施例中，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段的培养皿上培养来对细胞进行预处理，并且还在存在重组纤连蛋白片段和其它TE的情况下在液体培养物中对细胞进行转导。因此，在一些实施例中，细胞在转导期间在暴露于其它TE之前暴露于重组纤连蛋白，而在一些实施例中，细胞在与其它TE相同或重叠的时间段期间暴露于重组纤连蛋白。
在本文公开的任何方面和实施例的各个实施例中，细胞在存在前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆(例如，LentiBoostTM)、重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)和硫酸鱼精蛋白的情况下被转导。
根据以下详细描述和权利要求，本发明的其它特征和优点将变得显而易见并被其涵盖在内。
附图说明
图1示出了说明性转导方案。TE的量或组合可以变化。低温保存是任选的。细胞可以新鲜使用或冷冻储存后使用。
图2A和2B示出了液体培养物中的在存在PGE2的情况下转导的细胞的VCN确定的结果。对于图2A，在所示的每个浓度下，左柱示出了用2.5×107TU/mL的慢病毒载体转导的细胞的结果，右柱示出了用5×107TU/mL的慢病毒载体转导的细胞的结果。
图3A-3C示出了在存在PGE2的情况下转导的细胞的CFC测定(图3A)、VCN确定(图3B)和CFC测定中的转导百分比(％)(图3C)的结果。
图4示出了液体培养物中的在存在LentiBOOST的情况下转导的细胞的VCN确定的结果。
图5A-5C示出了使用LentiBOOST转导的细胞的VCN确定和CFC测定中的转导百分比(％)的结果。
图6示出了液体培养物中的使用LentiBOOST(LB)、PGE2和硫酸鱼精蛋白(PS)中的一种或多种转导的细胞的VCN确定的结果。
图7A-7E示出了使用LentiBOOST(LB)、PGE2和硫酸鱼精蛋白(PS)中的一种或多种转导的细胞的CFC测定的结果(图7A)、VCN确定(图7B)以及在单独存在PS或存在LB、PGE2和PS的情况下转导的细胞的CFC测定中的转导百分比(％)(图7C)。图7D和7E示出了LB、PGE2和PS对衍生自不同来源的CD34+的CFC的转导百分比(图7D)和VCN(图7E)的影响，所述来源包含脐带血(CB-CD34+)和动员的外周血(mPB-CD34+)。
图8示出了单独用PS(“不使用TE”)或用PS和转导增强子LB和PGE2(“使用TE”)转导的放大结果。示出了在液体培养物中14天之后针对细胞的VCN测定。
图9A-9C示出了单独用PS或用PS与转导增强子LB和PGE2转导的放大结果。图9A示出了CFC测定的结果。图9B示出了CFU中的VCN的结果。示出了爆发形成单位-红系(BFU-E)细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)和髓样祖细胞(CFU-GM)的结果。图9C示出了CFC的转导效率。
图10A和10B示出了移植到免疫缺陷型NSG小鼠中的用单独的PS或用PS和转导增强子LB和PGE2转导的CD34+细胞的体内结果。示出了人CD45阳性(hCD45+)细胞百分比(％)(图10A)和VCN/细胞(图10B)。移植后一(1)、二(2)或三(3)个月(mpt)示出结果。
图11示出了在20或50MOI下，在具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子LB和PGE2的GMP LV批次的液体培养物中的VCN。
图12A-12D示出了具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子LB和PGE2的GMP LV批次的总细胞(图12A)、BFU(图12B)、GM(图12C)和混合髓样祖细胞(图12D)的集落形成单位(CFU)。
图13A和13B示出了在MOI 20(图13A)和MOI 50(图13B)下，爆发形成单位-红系(BFU-E)细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)和髓样祖细胞(CFU-GM)的具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子LB和PGE2的GMP LV批次的CFU中的VCN。
图14A和14B示出了在MOI 20(图14A)和MOI 50(图14B)下具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子LB和PGE2的CFU中的VCN和转导效率。
图15是pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO转移载体的示意图。
图16是pCCL-ChimhCD18W-82-RO转移载体的示意图。
图17是pCCL-PGK-coRPKW-82-RO转移载体的示意图。
图18是pRRL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre转移载体的示意图。
具体实施方式
本公开提供了用于造血细胞的基因修饰的组合物和方法。具体地，本发明涉及使用前列腺素E2(PGE2)、泊洛沙姆、重组纤连蛋白片段和/或硫酸鱼精蛋白中的两种或更多种的组合来增强重组逆转录病毒载体的转导。本公开的组合物和方法特别适用于基因疗法应用，包含单基因疾病和病症的治疗。本文提供的组合物和方法解决了限制基因疗法成功的因素，包含低转导效率。
A.定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本发明的实践中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全部内容明确地并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。另外，本文所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，而非限制性的。
除非特别相反地指示，否则本文设想的各个实施例将会采用本领域技术范围内常规的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学方法，所述方法中的许多出于说明的目的在下文进行描述。此些技术在文献中有充分解释。参见例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第3版,2001)；Sambrook等人,《分子克隆：实验手册》(第2版,1989)；Maniatis等人,《分子克隆：实验手册》(1982)；Ausubel等人,《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子公司(Wiley and Sons),2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology)》,格林出版协会和威利跨学科出版社(Greene Pub.Associatesand Wiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》,第I卷和第II卷(IRL出版社(IRL Press),牛津,1985)；Anand,《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》,(学术出版社(AcademicPress),纽约,1992)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编,1984)；Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to MolecularCloning)》(1984)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约，1998)；《当代免疫学指南(CurrentProtocols in Immunology)》,Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编,1991)；《免疫学年度评论(Annual Review of Immunology)》；以及《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著，所述文献中的每一个都通过引用明确并入本文。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指某一数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在特定实施例中，术语“约”或“大约”在数字值之前时指示所述值加上或减去15％、10％、5％或1％的范围。
“转染”是指通过非病毒方法将裸DNA引入细胞的过程。
“感染”是指使用病毒载体将外源DNA引入细胞的过程。
“转导”是指使用病毒载体将外源DNA引入细胞基因组中。
“载体拷贝数”或“VCN”是指样品中载体的拷贝数除以细胞数。通常，使用针对整合的前病毒的Psi序列的探针通过定量聚合酶链反应(qPCR)确定载体的拷贝数，并且使用针对人类管家基因的探针通过qPCR确定细胞数，对于所述人类管家基因，每个细胞将存在两个拷贝(每个染色体一个)。
“转导效率”是指用至少一个前病毒拷贝转导的细胞的百分比。例如，如果1×106个细胞暴露于病毒，并且0.5×106个细胞被确定在其基因组中具有病毒的至少一个拷贝，则转导效率为50％。用于确定转导效率的一种说明性方法是流式细胞术。
如本文所使用的，术语“逆转录病毒(retrovirus或retroviral)”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。逆转录病毒载体是用于基因递送的常见工具(Miller,2000,《自然(Nature)》.357:455-460)。一旦病毒整合到宿主基因组中，其就被成为“前病毒”。前病毒用作RNA聚合酶II的模板，并且指导由病毒编码的RNA分子的表达。
说明性逆转录病毒(逆转录病毒科属)包含但不限于：(1)γ逆转录病毒属，如莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)和猫白血病病毒(FLV)，(2)泡沫病毒属，如猿猴泡沫病毒，(3)慢病毒属，如人类免疫缺陷病毒-1和猿猴免疫缺陷病毒。
如本文所使用的，术语“慢病毒(lentiviral或lentivirus)”是指代复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒；山羊关节炎—脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，优选基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。
逆转录病毒载体，并且更具体地，慢病毒载体，可以用于实践本发明。因此，如本文使用的术语“逆转录病毒载体”意指包含“慢病毒载体”；并且如本文使用的术语“逆转录病毒”意指包含“慢病毒”。
术语“载体”在本文中用于是指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。被转移的核酸通常连接到，例如插入到，载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制或逆转录的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包含病毒载体。有用的病毒载体包含例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
术语“病毒载体”可以指代能够将核酸转移到细胞中的载体或载体颗粒或指代被转移的核酸本身。病毒载体含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体。术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的包含LTR的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体。术语“杂交”是指含有逆转录病毒例如慢病毒序列和非慢病毒病毒序列两者的载体、LTR或其它核酸。在一个实施例中，杂交载体是指包括用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒例如慢病毒序列的载体或转移质粒。
在特定实施例中，可以使用术语“慢病毒载体”和“慢病毒表达载体”来指代慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。当本文中引用如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等元件时，应理解，这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中并且以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。
根据某些具体实施例，大多数或全部病毒载体主链序列衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，可以使用许多不同来源的慢病毒序列，或者可以容置慢病毒序列中的某些慢病毒序列的多种取代和改变而不损害转移载体执行本文所描述的功能的能力。此外，各种慢病毒载体在本领域中是已知的，参见Naldini等人,(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号；和第5,994,136号，其中许多可以适于产生本发明的病毒载体或转移质粒。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”通常是指包括共价结合在链中的核苷酸单体的生物聚合物，如DNA和RNA。在一些实施例中，多核苷酸是指基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或DNA。多核苷酸包含重组、合成或分离的单链和双链多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))。如本文所用，术语“多核糖核苷酸”或“核糖核酸”也指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))。优选地，本发明的多核苷酸包含与本文所描述的参考序列(参见例如序列表)中的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中所述变体保持参考序列的至少一种生物活性。在各个说明性实施例中，设想了病毒载体和转移质粒多核苷酸序列以及包括所述病毒载体和转移质粒多核苷酸序列的组合物。在特定实施例中，设想了编码一种或多种治疗性多肽和/或其它所关注基因的多核苷酸。在特定实施例中，编码治疗性多肽的多核苷酸包含但不限于RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1基因。在一些实施例中，多核苷酸是这些基因中的任何基因的密码子优化的变体。在一些实施例中，多核苷酸编码人多肽或其功能片段或变体，例如由所公开的基因中的任何基因编码的多肽。
如本文所用，“假型”载体是指具有不同于天然载体的衣壳或包膜蛋白的重组衣壳或包膜蛋白的载体。例如，VSVG假型慢病毒载体是通过在包装细胞系中以允许将VSVG包膜蛋白掺入含有RNA基因组的病毒颗粒的方式共表达VSVG病毒的包膜蛋白与病毒的RNA基因组而产生的载体。假型载体可以具有改变的向性和/或降低的免疫原性，从而使得其在基因疗法应用中的使用是可取的。通过在不同的包装细胞系中产生病毒颗粒或通过从质粒或编码不同包膜蛋白(或衣壳蛋白)的其它DNA共表达包膜蛋白(或衣壳蛋白)来产生假型载体以及改变载体的假型在本领域技术人员的技术范围内。在Cronin等人《当前基因疗法(Curr.Gene Ther.)》5:387-398(2005)中提供了示例性方法。在一些实施例中，本公开的方法涉及使用假型重组逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)。在一些实施例中，假型重组逆转录病毒载体是VSVG假型的。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩展”通常是指与通过媒剂或对照分子/组合物转导的细胞数目相比，本文所设想的组合物和/或方法能够引发、引起或产生更高数目的转导细胞的能力，或在转导细胞群体中引发、引起或产生更高VCN的能力。在一个实施例中，用本文所设想的组合物和方法转导的造血干或祖细胞包括与现有转导组合物和方法相比增加数目的转导细胞，或者包括转导细胞群体的VCN增加。可以使用本领域已知的方法如报告基因测定、RT-PCR和细胞表面蛋白表达等来确定细胞转导的增加。“增加的”或“增强的”转导量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含是通过媒剂、对照组合物或其它转导方法转导的细胞数目的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8，等)的增加。
“减少”或“下降”或“减轻”或“降低”或“减缓”总体上指代与用根据本发明的组合物和/或方法转导的细胞相比导致相当少的转导细胞的组合物或方法。“减少的”或“降低的”转导细胞量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含是通过根据本发明的组合物和/或方法产生的转导细胞数目(参考应答)的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8，等)的减少。
“保持”或“保存”或“维护”或“无改变”或“无实质改变”或“无实质减少”总体上指代与由媒剂、对照分子/组合物或特定细胞的应答引起的应答相当的生理应答。相当的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。
以下说明中阐述了某些具体细节以便提供对本文所设想的本发明的各个说明性实施例的全面理解。然而，本领域技术人员应理解，可以在没有这些细节的情况下实践特定说明性实施例。另外，应理解，衍生自本文所描述的结构和取代基的各个组合的单独载体或载体组由本申请公开到与单独阐述每个载体或每组载体相同的程度。因此，特定载体结构或特定取代基的选择在本公开的范围内。
如本文所用，“X-VIVO 20”或“X-VIVO”是指可从
Figure BDA0002911016300000131
获得的X-VIVOTM20化学限定的无血清造血细胞培养基。可以使用除X-VIVO 20之外的其它培养基，并且本领域技术人员能够为细胞生长和转导选择合适的培养基。
如本文所用，“rhSCF”是指重组人干细胞因子。
如本文所用，“rhTPO”是指重组人血小板生成素。
如本文所用，“rh-FLT3-L”是指重组人fms相关酪氨酸激酶3-配体。
如本文所用，“IL-3”或“rhIL-3”是指重组人白介素-3。
如本文所用，“PGE2”是指前列腺素E2(PGE2)，也称为地诺前列酮(dinoprostone)。
如本文所用，“泊洛沙姆”是指由中部疏水的聚氧丙烯(多(氧化丙烯))链侧面连接两个亲水的聚氧乙烯(多(氧化乙烯))链构成的非离子型三嵌段共聚物。
如本文所用，“重组纤连蛋白片段”是指促进增强转导效率的纤连蛋白的任何片段。不受理论限制，据信重组纤连蛋白片段促进慢病毒或逆转录病毒与靶细胞的共定位。重组纤连蛋白片段的实例是人纤连蛋白的CH296片段，商品名为RetroNectinTM。
本公开和权利要求中提供的PGE2或其衍生物、泊洛沙姆或硫酸鱼精蛋白的浓度是指其中培养细胞的培养基中每种药剂的浓度。
如本文所用，“LB”或“LentiBoost”是指可从Sirion
Figure BDA0002911016300000132
获得的LentiBOOSTTM转导增强子。同义词包含泊洛沙姆338、F108和
Figure BDA0002911016300000133
P338。
如本文所用，“HSA”是指人血清白蛋白。
如本文所用，“DMSO”是指二甲基亚砜。
如本文所用，“CFC”是指集落形成细胞。集落形成细胞(CFC)测定用于通过造血祖细胞在半固体培养基中形成集落的能力来研究其增殖和分化模式。由固定数量的输入细胞形成的集落的数量和形态提供了关于祖细胞分化和增殖能力的初步信息。在Sarma等人“人类造血细胞的集落形成细胞(CFC)测定(Colony forming cell(CFC)assay for humanhematopoietic cells)”.《可视实验杂志(J Vis Exp.)》2010年12月18日；(46)中提供了示例性分析。
如本文所用，“LC”是指“液体培养物”。
如本文所用，“CFU”是指集落形成单位。CFU被理解为CFC的同义词，但有时用于指在半固体培养基中生长的CFU的类型。
如本文所用，“TU”是指转导单位。TU/mL是逆转录病毒(慢病毒)制剂的功能滴度的常用量度。
如本文所用，“PS”是指硫酸鱼精蛋白。
如本文所用，“TE”是指一种或多种转导增强子。
如本文所用，“CB新鲜细胞”是指新鲜的脐带血细胞。
如本文所用，“MOI”是指感染复数。
如本文所用，“BFU-E”指爆发形成单位-红系(BFU-E)细胞(最早的红系祖细胞)。
如本文所用，“CFU-GM”是指粒细胞-巨噬细胞祖细胞的集落形成单位。
如本文所用，“CFU-GEMM”是指髓样干细胞(粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞)的集落形成单位。
如本文所用，“mPB”是指动员的外周血细胞。
如本文所用，“SCGM”是指
Figure BDA0002911016300000141
SCGM无血清培养基。
如本文所用，术语“施用”或“引入”或“向...提供”是指向受试者递送造血细胞群体，例如通过动脉内或静脉内将细胞群体输注到受试者中。可以在如盐水等各种溶液中施用造血细胞群体。在一些实施例中，所使用的溶液将与受试者的血液等渗，并进行pH缓冲。
通常，当病毒载体或载体颗粒已经将异源DNA(例如，载体或其表达盒)引入细胞基因组时，所述细胞被称为“经过转导的”。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指已经用病毒载体或载体颗粒转导的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”是指原始转导的细胞和其子代。
术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，例如降低受试者体内发生疾病或其症状的可能性，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应方面可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”覆盖对哺乳动物的疾病的任何治疗并且包含：(a)防止疾病在可能倾向于患有疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者身上发生；(b)抑制疾病，即，中止疾病发展；或者(c)缓解疾病，即，使疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别关注了对发展中的疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减少了患者的不期望的临床症状。理想的是，在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。理想的是，将在疾病的症状期期间并且在一些情况下在疾病的症状期之后施用主题疗法。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物，包含但不限于：人和非人灵长类动物，包含猿类和人类；哺乳类运动动物(例如，马)；哺乳类农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
B.实施例和变体
以下描述了各种组合物和方法。尽管本文例示了特定组合物和方法，但是应当理解，多个替代性组合物和方法中的任何替代性组合物和方法均是适用的并且适用于实践本文所公开的组合物和方法。还应当理解，可以使用本领域中标准的程序对本文所公开的表达构建体和方法进行评估。
1.使用转导增强子的组合的转导
本公开提供了用于用慢病毒载体转导造血细胞以产生具有高百分比的用慢病毒载体转导的细胞的造血细胞群体的有利方法。这些方法对于用慢病毒基因疗法载体转导造血细胞以修正基因缺陷特别有利，因为其获得了大量表达由慢病毒基因疗法载体引入的经修正的基因的功能产物的细胞。
各种转导增强子在本领域中是已知的，包含聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、纤维连接蛋白(retronectin)(重组纤连蛋白片段)和DEAE右旋糖酐。在一些情况下，如聚凝胺等聚阳离子药剂已被用作转导增强子。Denning等人《分子生物技术(Mol Biotechnol.)》2013年3月；53(3):308–314。另外，雷帕霉素和环孢菌素A被用作转导增强子。然而，与单独使用所述转导增强子中的每一种相比，本公开鉴别了实现造血细胞的显著更高水平的慢病毒转导的转导增强子的特定组合。
在一方面，本公开提供了一种造血细胞的基因修饰的方法，所述方法包括：使所述造血细胞与至少两种选自以下的转导增强子接触：前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段；以及使所述造血细胞与重组逆转录病毒载体接触。细胞可以在足以允许通过逆转录病毒载体来转导细胞的条件和时间下与所述逆转录病毒载体接触，例如在合适的培养基中持续至少一小时、至少两小时、至少四小时、至少八小时、至少十二小时或至少16小时。在一些实施例中，例如在预刺激之后，细胞被转导一次或连续两次，其中每个转导周期介于12小时与24小时之间，或者介于16小时与18小时之间。在一些实施例中，细胞在相同或重叠的时间段期间与逆转录病毒载体和转导增强子接触。在特定实施例中，细胞与转导增强子和重组逆转录病毒载体同时或在重叠的时间段期间接触。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆和PGE2或其衍生物或由其组成。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白或由其组成。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆、PGE2和硫酸鱼精蛋白或由其组成。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段或由其组成。在本文公开的任何方面和实施例的各个实施例中，细胞在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上转导。在各个实施例中，在转导之前和/或转导期间，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上培养来预处理细胞。在某些实施例中，所述方法包括通过在涂覆有约2ug/cm2 RetroNectinTM(RN)的板上培养细胞来进行预刺激。在一些实施例中，在包括Retro-NectinTM的液体培养基中转导细胞。在一些实施例中，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段的培养皿上培养来对细胞进行预处理，并且还在存在重组纤连蛋白片段和其它TE的情况下在液体培养物中对细胞进行转导。
在一方面，本公开提供了一种造血细胞的基因修饰的方法，所述方法包括：提供造血细胞；使所述造血细胞与至少两种转导增强子接触，所述至少两种转导增强子选自前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM))、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段；以及使所述造血细胞与重组逆转录病毒载体接触。在特定实施例中，细胞与转导增强子和重组逆转录病毒载体同时或在重叠的时间段期间接触。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆和PGE2或其衍生物。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白或由其组成。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆、PGE2和硫酸鱼精蛋白或由其组成。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段或由其组成。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段或由其组成。在本文公开的任何方面和实施例的各个实施例中，细胞在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上转导。在各个实施例中，在转导之前和/或转导期间，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上培养来预处理细胞。在某些实施例中，所述方法包括通过在涂覆有约2ug/cm2 RetroNectinTM(RN)的板上培养细胞来进行预刺激。在一些实施例中，在包括Retro-NectinTM的液体培养基中转导细胞。在一些实施例中，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段的培养皿上培养来对细胞进行预处理，并且还在存在重组纤连蛋白片段和其它TE的情况下在液体培养物中对细胞进行转导。
在本文公开的方法的各个实施例中，在存在逆转录病毒载体、一种或多种刺激前列腺素EP受体信号传导路径的药剂和平均分子量为约10,000道尔顿的泊洛沙姆的情况下培养细胞群体。在特定实施例中，细胞与转导增强子和重组逆转录病毒载体同时或在重叠的时间段期间接触。
在本文公开的方法的各个实施例中，在存在逆转录病毒载体、一种或多种刺激前列腺素EP受体信号传导路径的药剂和泊洛沙姆的情况下培养细胞群体，所述泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量大于约2250道尔顿并且包括大于约40％的聚环氧乙烷。在特定实施例中，细胞与转导增强子和重组逆转录病毒载体同时或在重叠的时间段期间接触。
在本文公开的方法的特定实施例中，细胞在包括以下三种转导增强子的组合的培养基中被转导：例如在液体培养基中的泊洛沙姆338(LentiBOOST)、PGE2和硫酸鱼精蛋白。细胞可以粘附到培养皿上，或者细胞可以不粘附到培养皿上。在特定实施例中，细胞与转导增强子和重组逆转录病毒载体同时或在重叠的时间段期间接触。在某些实施例中，所述方法包括通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM(RN))的板上培养细胞来进行预刺激。在某些实施例中，细胞在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上转导。在各个实施例中，在转导之前和/或转导期间，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上培养来预处理细胞。在某些实施例中，所述方法包括通过在涂覆有约2ug/cm2 RetroNectinTM(RN)的板上培养细胞来进行预刺激。在一些实施例中，在包括Retro-NectinTM的液体培养基中转导细胞。在一些实施例中，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段的培养皿上培养来对细胞进行预处理，并且还在存在重组纤连蛋白片段和其它TE的情况下在液体培养物中对细胞进行转导。
在相关方面，本公开提供了一种增强造血细胞的重组逆转录病毒载体介导的基因修饰的方法，所述方法包括用有效量的两种或更多种转导增强子的组合离体处理所述造血细胞或者使所述造血细胞与有效量的两种或更多种转导增强子的组合离体接触，其中所述转导增强子中的至少两种转导增强子选自PGE2或其衍生物、泊洛沙姆、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在一些实施例中，细胞与PGE2或其衍生物和有效量的泊洛沙姆接触；并且与包括多核苷酸的重组逆转录病毒载体接触，所述多核苷酸包括所关注的基因，其中与在不存在转导增强子(例如，PGE2和泊洛沙姆)的组合的情况下用重组逆转录病毒载体转导造血细胞相比，逆转录病毒载体的病毒转导功效得到增强。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆和PGE2或其衍生物。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白或由其组成。在一个实施例中，所述方法进一步包括用有效量的硫酸鱼精蛋白离体处理所述造血细胞或者使所述造血细胞与有效量的硫酸鱼精蛋白离体接触。在某些实施例中，两种或更多种转导增强子包括前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆、硫酸鱼精蛋白和重组纤连蛋白片段或由其组成。在本文公开的任何方面和实施例的各个实施例中，细胞在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上转导。在各个实施例中，在转导之前和/或转导期间，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的培养皿上培养来预处理细胞。在某些实施例中，所述方法包括通过在涂覆有约2ug/cm2 RetroNectinTM(RN)的板上培养细胞来进行预刺激。在一些实施例中，在包括Retro-NectinTM的液体培养基中转导细胞。在一些实施例中，通过在涂覆有重组纤连蛋白片段的培养皿上培养来对细胞进行预处理，并且还在存在重组纤连蛋白片段和其它TE的情况下在液体培养物中对细胞进行转导。
在本文公开的任何方法的某些实施例中，细胞与包括两种或更多种转导增强子的溶液或培养基接触。溶液或培养基可以进一步包括重组逆转录病毒载体，或者可以在细胞与包括转导增强子的溶液或培养基接触之后添加重组逆转录病毒载体。在特定实施例中，细胞存在于包括溶液或培养基的培养皿中。在特定实施例中，培养皿涂覆有重组纤连蛋白片段。细胞可以在足以允许通过逆转录病毒载体来转导细胞的条件和时间下与所述逆转录病毒载体接触，例如在合适的培养基中持续至少一小时、至少两小时、至少四小时、至少八小时、至少十二小时或至少16小时。在一些实施例中，例如在预刺激之后，细胞被转导一次或连续两次，其中每个转导周期介于12小时与24小时之间，或者介于16小时与18小时之间。在一些实施例中，细胞在相同或重叠的时间段期间与逆转录病毒载体和转导增强子接触。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆接触。在一个实施例中，所述泊洛沙姆选自由以下组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。可以以约50μg/mL到约1,500μg/mL、约500μg/mL到约1,500μg/mL、约750μg/mL到约1,250μg/mL、约900μg/mL、约900μg/mL、约950μg/mL、约1000μg/mL、约1050μg/mL、约1100μg/mL或约1150μg/mL的最终浓度使用LentiBOOSTTM。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物是经修饰的。在一个实施例中，所述PGE2或其衍生物是二甲基化的PGE2。在一个实施例中，二甲基化的PGE2是16,16-二甲基前列腺素E2。16,16-二甲基前列腺素E2具有以下结构(表示为“骨架结构”，也称为“线-角式”或“简写式”)：
Figure BDA0002911016300000191
分子式：C22H36O5
在一些实施例中，所述PGE2或其衍生物未经修饰的。
在一些实施例中，PGE2或其衍生物可以以约1μM到约200μM、约10μM到约20μM、约20μM到约40μM、约40μM到约60μM、约60μM到约80μM、约5μM、约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM或约40μM的最终浓度使用。PGE2或其衍生物可以以约0.3μM到约70μg/ml、约3μg/ml到约7μg/ml、约7μg/ml到约13μg/ml、约13μg/ml到约20μg/ml、约20μg/ml到约26μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml或约15μg/ml的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，所述方法包括使造血细胞与硫酸鱼精蛋白接触。硫酸鱼精蛋白可以以约4μg/mL到约15μg/mL、约5μg/mL到约10μg/mL、或约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL或约15μg/mL或更多的最终浓度使用。在某些实施例中，硫酸鱼精蛋白可以以约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL或约5μg/mL的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约900μg/mL和约3μg/mL到约7μg/mL，或分别为约900μg/mL和约2μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约4μg/ml，或分别为约900μg/mL和约5μg/ml、或分别为约900μg/mL和约6μg/ml，或分别为约900μg/mL和约7μg/ml，或分别为约900μg/mL和约8μg/ml，或分别为约900μg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在一些实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约950μg/mL和约3μg/ml到约7μg/ml，或分别为约900μg/mL和约2μg/ml，或分别为约950μg/mL和约3μg/ml，或分别为约950μg/mL和约3μg/ml，或分别为约950μg/mL和约4μg/ml，或分别为约950μg/mL和约5μg/ml，或分别为约950μg/mL和约6μg/ml，或分别为约950μg/mL和约7μg/ml，或分别为约950μg/mL和约8μg/ml，或分别为约950μg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在一些实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约1000μg/mL和约3μg/ml到约7μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约2μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约3μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约3μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约4μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约5μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约6μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约7μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约8μg/ml，或分别为约1000μg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在一些实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约1050μg/mL和约3μg/ml到约7μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约2μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约3μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约3μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约4μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约5μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约6μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约7μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约8μg/ml，或分别为约1050μg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约0.5mg/mL和约3μg/mL到约7μg/mL，或分别为约0.5mg/mL和约2μg/ml，或分别为约0.5mg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约0.5mg/mL和约4μg/ml，或分别为约0.5mg/mL和约5μg/ml、或分别为约0.5mg/mL和约6μg/ml，或分别为约0.5mg/mL和约7μg/ml，或分别为约0.5mg/mL和约8μg/ml，或分别为约0.5mg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约1mg/mL和约3μg/mL到约7μg/mL，或分别为约1mg/mL和约2μg/ml，或分别为约1mg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约1mg/mL和约4μg/ml，或分别为约1mg/mL和约5μg/ml、或分别为约1mg/mL和约6μg/ml，或分别为约1mg/mL和约7μg/ml，或分别为约1mg/mL和约8μg/ml，或分别为约1mg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约2mg/mL和约3μg/mL到约7μg/mL，或分别为约2mg/mL和约2μg/ml，或分别为约2mg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约2mg/mL和约4μg/ml，或分别为约2mg/mL和约5μg/ml、或分别为约2mg/mL和约6μg/ml，或分别为约2mg/mL和约7μg/ml，或分别为约2mg/mL和约8μg/ml，或分别为约2mg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约4mg/mL和约3μg/mL到约7μg/mL，或分别为约4mg/mL和约2μg/ml，或分别为约4mg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约4mg/mL和约4μg/ml，或分别为约4mg/mL和约5μg/ml、或分别为约4mg/mL和约6μg/ml，或分别为约4mg/mL和约7μg/ml，或分别为约4mg/mL和约8μg/ml，或分别为约4mg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在本文公开的任何方法的一些实施例中，细胞与泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物接触。在一个实施例中，泊洛沙姆338和PGE2或其衍生物以分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约3μg/mL到约7μg/mL，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约2μg/ml，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约3μg/ml，或分别为约900μg/mL和约3μg/ml，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约4μg/ml，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约5μg/ml、或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约6μg/ml，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约7μg/ml，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约8μg/ml，或分别为约0.5mg/mL到约4mg/mL和约9μg/ml的最终浓度使用。在前述实施例中的任何实施例中，硫酸鱼精蛋白可以任选地以约3μg/ml到约7μg/ml、约1μg/mL到约5μg/mL、约3μg/mL到约5μg/mL、或约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL或约6μg/mL的最终浓度使用。
在优选实施例中，用慢病毒载体在含有约0.5mg/mL到约4mg/mL的泊洛沙姆338；约10μg/mL到50μg/mL的PGE2；和约1μg/mL到约10μg/mL的硫酸鱼精蛋白的培养基中转导细胞。在粘附模式下，在一些情况下，使用浓度为约20μg/mL到约100μg/mL的RetroNectinTM溶液，用人纤连蛋白的CH296片段(商品名为RetroNectinTM)来涂覆基质。
在优选实施例中，细胞与约0.5mg/mL到约4mg/mL的泊洛沙姆338；约10μg/mL到50μg/mL的PGE2；和约1μg/mL到约10μg/mL的硫酸鱼精蛋白接触。
在优选实施例中，用慢病毒载体在含有约1mg/mL的泊洛沙姆338；约10μM的PGE2；和约4μg/mL的硫酸鱼精蛋白的培养基中转导细胞。在粘附模式下，在一些情况下，使用浓度为约20μg/mL的RetroNectinTM溶液，用人纤连蛋白的CH296片段(商品名为RetroNectinTM)来涂覆基质。在某些实施例中，培养皿涂覆有2ug/cm2的RetroNectinTM。在某些实施例中，所述方法包括通过在涂覆有重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM(RN))的板上培养细胞来进行预刺激。
在优选实施例中，细胞与约1mg/mL的泊洛沙姆338；约10μM的PGE2；和约4的硫酸鱼精蛋白接触。
表1和表2提供了进一步的说明性实施例。根据所公开的方法，可以使用所指示的转导增强子的组合和浓度中的任一种，并且可以与其它类型的细胞一起使用。另外，所指示的组合中的任一种组合可以进一步与重组纤连蛋白(如RetroNectinTM)组合使用，如在用于转导的培养皿涂覆有RetroNectinTM的情况下。
表1.CB细胞和转导增强子的组合
Figure BDA0002911016300000231
Figure BDA0002911016300000241
表2.mPB细胞和转导增强子的组合
Figure BDA0002911016300000242
Figure BDA0002911016300000251
在一些实施例中，接触步骤同时执行或在重叠的时间段期间执行。
在一些实施例中，所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL。
在一些实施例中，所述PGE2或其衍生物的浓度为约10μg/mL。
在一些实施例中，所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL。
在一些实施例中，所述泊洛沙姆的浓度为约1000μg/mL。
在一些实施例中，所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL。
在一些实施例中，所述硫酸鱼精蛋白的浓度为约4μg/mL。
在一些实施例中，造血细胞已经或在涂覆有重组纤连蛋白或其片段的容器上培养，所述重组纤连蛋白或其片段增强了转导效率。重组纤连蛋白片段(例如，人纤连蛋白的CH296片段，商品名为RetroNectinTM)促进慢病毒或逆转录病毒与靶细胞的共定位，并提高转导效率。
在一些实施例中，所述方法包括使造血细胞与重组纤连蛋白片段、泊洛沙姆和PGE2接触。
在一些实施例中，所述方法包括使造血细胞与重组纤连蛋白片段、泊洛沙姆和硫酸鱼精蛋白接触。在一些实施例中，所述方法包括使造血细胞与重组纤连蛋白片段、泊洛沙姆、PGE2和硫酸鱼精蛋白接触。
在一些实施例中，所述方法包括使造血细胞与重组纤连蛋白片段、PGE2和硫酸鱼精蛋白接触。
在本文公开的任何方法的某些实施例中，细胞在相同或重叠的时间段期间与转导增强子接触。在某些实施例中，细胞还与重组逆转录病毒载体接触，例如，在与细胞与转导增强子接触时相同或重叠的时间段期间。在某些实施例中，细胞存在于包括溶液或培养基的容器中，其中转导增强子存在于容器和/或培养基中。
前列腺素
前列腺素通常涉及激素样分子，所述激素样分子衍生自含有20个碳原子的脂肪酸，包含5碳环，如本文所述和本领域已知的。前列腺素E2(PGE2)，也称为地诺前列酮，是天然存在的前列腺素，其被用作药物。PGE2具有以下结构(表示为“骨架结构”，也称为“线-角式”或“简写式”)：
Figure BDA0002911016300000261
PGE2分子式：C22H36O5
已经显示出前列腺素E2(PGE2)可以增加CD34+细胞离体培养物中慢病毒转基因递送的水平。Heffner等人《分子疗法(Mol Ther.)》2018年1月3日；26(1):320-328。
PGE2“类似物”或“衍生物”的说明性实例包含但不限于16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)、16-16二甲基PGE2对-(对乙酰氨基苯甲酰胺基)苯基酯、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮基氟前列醇、5-反式PGE2、17-苯基-ω-三正PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四正PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异15-酮基PGE2、8-异PGE2异丙酯、20-羟基PGE2、诺氯前列素(nocloprost)、硫前列酮(sulprostone)、布他前列素(butaprost)、15-酮基PGE2和19(R)羟基PGE2。
本文还设想了在9-位置处被卤素取代的具有与PGE2类似的结构的前列腺素类似物或衍生物(参见例如WO 2001/12596，其通过引用以其整体并入本文)，以及2-脱羧基-2-磷酸亚基前列腺素衍生物，如在美国公布第2006/0247214号中描述的那些，所述美国公布通过引用以其整体并入本文。
泊咯沙姆
泊洛沙姆是由中部疏水的聚氧丙烯(多(氧化丙烯))链侧面连接两个亲水的聚氧乙烯(多(氧化乙烯))链构成的非离子型三嵌段共聚物。泊洛沙姆也以商品名
Figure BDA0002911016300000273
、
Figure BDA0002911016300000271
和
Figure BDA0002911016300000272
为人所知。由于聚合物嵌段的长度可以定制，所以存在许多不同的泊洛沙姆。泊洛沙姆通常以字母P(对于泊洛沙姆)后跟三个数字命名：前两位数字乘以100得到聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字乘以10得到聚氧乙烯含量百分比(例如P407＝聚氧丙烯分子量为4000g/mol并且聚氧乙烯含量为70％的泊洛沙姆)。
在特定实施例中，泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量为至少约2750道尔顿。在特定实施例中，泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量为至少约3250道尔顿。在特定实施例中，泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量为至少约4000道尔顿或至少约10,000道尔顿。
在特定实施例中，泊洛沙姆包括至少约50％的聚环氧乙烷。在特定实施例中，泊洛沙姆包括至少约60％的聚环氧乙烷。在特定实施例中，泊洛沙姆包括至少约70％的聚环氧乙烷。在特定实施例中，泊洛沙姆包括至少约80％的聚环氧乙烷。
在特定实施例中，泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量为至少约2750道尔顿，并且泊洛沙姆包括至少约40％的聚环氧乙烷。在特定实施例中，泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量为至少约2750道尔顿，并且泊洛沙姆包括至少约50％的聚环氧乙烷。在特定实施例中，泊洛沙姆的聚丙烯亚基的平均分子量为至少约3250道尔顿，并且泊洛沙姆包括至少约50％的聚环氧乙烷。
在某些实施例中，泊洛沙姆选自由以下组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。在一个实施例中，泊洛沙姆是泊洛沙姆288。在一个实施例中，泊洛沙姆是泊洛沙姆335。在一个实施例中，泊洛沙姆是泊洛沙姆338。在一个实施例中，泊洛沙姆是泊洛沙姆407。在一个实施例中，所述重组逆转录病毒载体是重组慢病毒载体。
最近，已经显示泊洛沙姆F108可以改进造血细胞的转导。Hoefig等人《基因医学杂志(J Gene Med.)》2012年8月；14(8):549-60；美国专利9,771,599。将泊洛沙姆纳入标准造血干细胞(HSC)转导方案产生高转导效率，同时保持转导的HSC分化为各种造血谱系的能力。Hauber等人《人类基因治疗方法(Hum Gene Ther Methods)》.2018年4月；29(2):104-113。
重组纤连蛋白片段
重组纤连蛋白片段可以是促进增强转导效率的蛋白纤连蛋白(例如人纤连蛋白)的任何片段。不受理论限制，据信重组纤连蛋白片段促进慢病毒或逆转录病毒与靶细胞的共定位。重组纤连蛋白片段的实例是人纤连蛋白的CH296片段，商品名为RetroNectinTM。
造血细胞
可以根据本文公开的方法转导的造血细胞包含任何造血细胞或其群体。在某些实施例中，造血细胞是从哺乳动物获得的哺乳动物(例如，人)造血细胞。在某些实施例中，细胞是从要在根据本文公开的方法对造血细胞进行转导后用所述造血细胞进行治疗的人获得的。在一个实施例中，造血细胞已经富集CD34+细胞。在某些实施例中，造血细胞是从生物样品获得的CD34富集细胞群体，所述生物样品从受试者获得。在一个实施例中，生物样品是骨髓样品。在另一个实施例中，生物样品是外周血。在另一个实施例中，生物样品是脐带血。
在特定实施例中，生物样品(例如，外周血)是在造血干细胞(HSC)的动员之后从受试者中获得的。在一个实施例中，通过用G-CSF或其类似物治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。可以在收集生物样品之前动员外周血中的HSC和祖细胞(HSPC)。可以通过本领域中已知的任何方法来动员外周血HSC和HSPC。可以通过用本文中描述的或本领域中已知的增加HSPC在受试者的外周血中循环的数量的任何一种或多种药剂治疗受试者来动员外周血HSC和HSPC。例如，在特定实施例中，通过用一种或多种细胞因子或生长因子(例如，G-CSF、试剂盒配体(KL)、IL-I、IL-7、IL-8、IL-11、Flt3配体、SCF、血小板生成素或GM-CSF(如沙格司亭))治疗受试者来动员外周血。可以在用于动员外周血的方法中使用的不同类型的G-CSF包含非格司亭和更长效G-CSF：培非格司亭。在特定实施例中，通过用一种或多种趋化因子(例如，巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP1a/CCL3))、趋化因子受体配体(例如，趋化因子受体2配体GROl3和GR013M)、趋化因子受体类似物(例如，基质细胞源性因子-1a(SDF-1a)蛋白类似物，如CTCE-0021、CTCE-0214或SDF-1a，如Met-SDF-113)或趋化因子受体拮抗剂(例如，趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)拮抗剂，如AMD3100)治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过用一种或多种抗整合素信号传导药剂(例如，功能阻断抗极迟抗原4(VLA-4)抗体或抗血管细胞粘附分子1(VCAM-1))治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过用如环磷酰胺、依托泊苷或紫杉醇等一种或多种细胞毒性药物治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过向受试者施用以上所列药剂中的一种或多种药剂持续一定时间段来动员外周血。例如，在收集HSPC之前，可以通过注射(例如，皮下、静脉内或腹膜内)用一种或多种药剂(例如，G-CSF)治疗受试者每天一次或每天两次持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在具体实施例中，在最后剂量的用于将HSPC动员到外周血中的药剂之后的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或24小时内收集HSPC。在特定实施例中，通过用上文描述的或本领域已知的两种或更多种不同类型的药剂(如生长因子(例如，G-CSF)和趋化因子受体拮抗剂(例如，CXCR4受体拮抗剂，如AMD3100)或生长因子(例如，G-CSF或KL)和抗整合素药剂(例如，功能阻断VLA-4抗体))治疗受试者来动员HSC和HSPC。在一个实施例中，通过用G-CSF或其类似物治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。在一个实施例中，G-CSF是非格司亭。在一个实施例中，通过用普乐沙福治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。在某些实施例中，使用非格司亭和普乐沙福的组合、通过单独地非格司亭或通过单独地普乐沙福来动员HSC和/或祖细胞。在特定实施例中，同时地或顺序地施用不同类型的动员剂。对于关于动员外周血的方法的另外的信息，参见例如Craddock等人,1997,《血液(Blood)》90(12):4779-4788；Jin等人,2008,《转化医学杂志(Journal of Translational Medicine)》6:39；Pelus,2008，《血液学时论(Curr.Opin.Hematol.)》15(4):285-292；Papayannopoulou等人,1998,《血液》91(7):2231-2239；Tricot等人,2008,《血液学(Haematologica)》93(11):1739-1742；以及Weaver等人,2001,《骨髓移植(Bone Marrow Transplantation)》27(2):S23-S29)。
在某些实施例中，通过注射器或插入到受试者的血管中的导管来获得外周血。例如，可以使用单采血液成分术机器来收集外周血。血液从血管中流动穿过导管到分离白细胞(包含来自血液的剩余部分的HSPC)的单采血液成分术机器中，并且然后将血液的剩余部分返回到受试者的身体。可以在连续的天数内(例如，1到5天)执行单采血液成分术持续若干个小时，直到已收集到足够的HSPC。
在某些实施例中，通过细针抽吸从受试者的后髂嵴中获得骨髓(参加例如，Koda等人,1984,《临床研究杂志(J.Clin Invest.)》73:1377-1384)。
在某些实施例中，可以确定生物样品的血细胞比容水平。可以通过在处理室内将样品离心使样品的RBC分离成层来确定血细胞比容水平，使得可以确定血细胞压积。应当理解，样品可以与抗凝血剂组合以便帮助确定血细胞比容水平，并且此种抗凝血剂可以在离心之前或期间添加到处理室。可替代地，可以通过测量样品的光学性质来确定血细胞比容水平。例如，可以使用光谱仪来分析样品。应当理解，可以使用任何类型的确定血细胞比容水平的已知光谱法，如例如拉曼光谱法和/或光散射技术。
在某些实施例中，生物样品消耗红细胞，例如在制备针对来自生物样品的CD34+细胞而富集的一种或多种细胞群体之前。在一些实施例中，对在消耗技术之后剩余的细胞进行洗涤。在另一个实施例中，将非特异性IgG添加到经过洗涤的细胞。在一些实施例中，非特异性IgG是flebogamma。
在一些情况下，在CD34+选择之前，将两个或更多个生物样品混合在一起，包含例如在不同时间获取的骨髓样品，如间隔1、2、3、4或更多天，或间隔1、2或3周，或间隔1、2或3个月，或间隔数年，包含其它时间增量。
造血细胞的针对CD34+细胞的富集
在一些实施例中，造血细胞是CD34阳性造血细胞。通常，CD34+细胞通过CD34的高严格性富集来制备。可替代地或除了高严格性富集之外，可以执行CD34的低严格性富集。
如本文中使用的，“高严格性”或“高严格性条件”是指富集细胞群体的方法，所述方法旨在引起对表达特定生物标志物(例如，CD34)的细胞进行大量细胞富集。例如，临床上使用的“高严格性”CD34富集导致平均值：61.6％和中值：CD34+细胞的65.7％产率和平均值：88.5％和中值：95.9％相对纯度(N＝166)(《临床实验室(Clin Lab.)》2016年7月1日；62(7):1243-1248(PMID：28164638))。“高严格性”是指以大量富集相对少见的细胞类型CD34+为目标的过程，所述相对少见的细胞类型CD34+通常包括介于0.2-2％之间的动员的白细胞清除术或骨髓收集中的细胞产物。高严格性富集来自动员的白细胞清除术或骨髓收集中的CD34+细胞以百分比从0.2-2％增加到>80％的最终CD34+为靶标。为此，在初步将生物样品应用到捕获基质之后，以移除弱结合或非特异性结合到捕获基质的细胞为目标来执行在本文中称为“洗涤”的重复的缓冲液交换。通常，在每个洗涤周期中将细胞从捕获基质中移除并重新应用。移除和重新应用可以通过从试管中移液而手动地完成或使用泵和试管系统而自动化。例如，使用与
Figure BDA0002911016300000301
磁性细胞分离系统耦接的Quad Technologies
Figure BDA0002911016300000302
细胞磁性颗粒复合物在磁性支架上的试管中被分离并且手动完成洗涤。使用美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)
Figure BDA0002911016300000303
系统，预设置的自动化程序将细胞磁性颗粒复合物应用到管组中的磁柱并且使用阀泵系统完成洗涤/重新应用。在某些实施例中，可以在各种器械上执行在高严格性条件下的选择，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
Figure BDA0002911016300000311
Quad Technologies
Figure BDA0002911016300000312
细胞分离系统、Terumo
Figure BDA0002911016300000313
细胞分离系统、COBE
Figure BDA0002911016300000314
细胞分离器、SynGen
Figure BDA0002911016300000315
或
Figure BDA0002911016300000316
系统、Fresenius-Kabi
Figure BDA0002911016300000317
美天旎生物技术公司
Figure BDA0002911016300000318
系统或CliniMACS
Figure BDA0002911016300000319
系统。可以在实验室中或定点照护时执行选择。例如在国际专利公开第WO/2016/118780号中描述了用于制备和富集细胞和细胞群体的详细方法，包含用于在高严格性条件下选择CD34+细胞的示例性方法。美国专利第8,727,132号提供了对高严格性选择有用的说明性选择方法。在国际专利申请第PCT/US2019/027083号，特别是实例1中提供了另外的说明性选择方法。
在高严格性富集方案中，包括CD34+细胞的生物样品标记有CD34标记试剂，例如直接缀合的免疫磁珠。生物样品可以悬浮在任何合适的流体中，如但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其具有任选地在与细胞活力相容的缓冲液pH和等渗性下的乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些情况下，所使用的流体还含有适当浓度(如约2.5％)的人血清白蛋白。使用磁性活化细胞分选(MACS)技术，生物样品在被标记后应用于柱，所述柱包含磁敏感材料或铁磁材料。使用MACS系统，柱的磁敏感材料或铁磁材料保留靶细胞，而不影响非靶细胞流过并离开所述柱的能力。这种磁敏感材料或铁磁材料包含铁、钢、钴镍和其合金的其它铁磁稀土金属。本领域的技术人员将理解的是，这种材料可以容易地被磁化和消磁。在一些实施例中，生物样品在磁敏感材料或铁磁材料上再循环一次或多次。在柱装载后，将结合的细胞以低速洗涤、洗脱和/或重新装载到柱上，以增加富集级分的纯度。合适的洗涤缓冲液包含具有(任选地)EDTA和(任选地)人血清白蛋白的PBS。在洗涤步骤期间移除的标记的生物样品的任何组分都收集在废物或“非靶标”袋中。在合适的洗涤步骤后，高严格性富集的细胞被洗脱到靶细胞袋中。
在低严格性富集方案中，包括CD34+细胞的生物样品标记有CD34标记试剂，例如直接缀合的免疫磁珠。使用磁性活化细胞分选(MACS)技术，生物样品在被标记后以与在高严格性富集下相比更低的流速应用于含有磁敏感材料或铁磁材料的柱上。与高严格性富集一样，磁敏感材料或铁磁材料保留靶细胞，而不影响非靶细胞流过并离开所述柱的能力。在一些实施例中，生物样品在磁敏感材料或铁磁材料上再循环一次或多次。在柱装载后，对于低严格性富集，在低严格性下洗涤结合的细胞。然后将结合的细胞洗脱到收集袋中。
在一个示例性实施例中，通过修改MACS系统的标准操作程序来执行低严格性富集，使得旨在实现高严格性消耗(即，移除靶细胞)的“消耗模式”软件程序反而导致低严格性富集。MACS系统在消耗模式下的操作使生物样品中的靶细胞使用与在富集模式下的操作相比更慢的柱加载和更低严格性洗涤步骤与柱中的磁敏感材料或铁磁材料结合。非靶细胞被MACS系统冲洗到洗涤或所谓的“靶标”袋中。消耗模式程序随后切换输出阀，以将流体引导到所谓的“非靶标”袋中，并且然后对柱进行消磁。在消磁柱上持续应用流体引起CD34+富集细胞群体洗脱到所谓的“非靶标”袋中，所述CD34+富集细胞群体已经在低严格性条件下被富集，所述“非靶标”袋使用此方法收集靶细胞。
本领域的技术人员将认识到，可以在各种器械上执行这种低严格性富集方法，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
Figure BDA00029110163000003223
Quad Technologies
Figure BDA00029110163000003221
GE
Figure BDA00029110163000003213
细胞分离系统、Terumo
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细胞分离系统、COBE
Figure BDA00029110163000003215
细胞分离器、SynGen
Figure BDA00029110163000003216
或
Figure BDA00029110163000003217
系统、Fresenius-Kabi
Figure BDA00029110163000003222
美天旎生物技术公司
Figure BDA00029110163000003219
系统或CliniMACS
Figure BDA00029110163000003220
系统。本领域的技术人员无需过多的实验就能够对这种MAC系统的软件进行重新编程，使得输出阀将初始结合步骤的流通引导到废物或“非靶标”袋(而不是靶标袋)，并将洗脱的低严格性CD34富集群引导到“靶标”袋。实际上，低严格性富集是在分离模式下进行的，而不需要常规MAC程序的常规洗涤步骤。
如本文所使用的，“低严格性”或“低严格性条件”是指一种富集细胞群体的方法，所述方法旨在以与通过高严格性选择实现的产率相比保持更高的富集细胞群体产率的方式以富集与生物样品中的其它细胞相比表达生物标记物的细胞(即，减少的富集)为代价引起表达特定生物标记物(例如，CD34)的细胞富集。根据定义，高严格性条件下的富集倍数大于低严格性条件下的富集倍数。在一些情况下，高严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群体中的细胞(例如，CD34+细胞)的富集倍数是低严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群体中的CD34+细胞的富集倍数的2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75或4倍。在一个实施例中，高严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群体中的细胞(例如，CD34+细胞)的富集倍数是低严格性(CD34或其它标志物)富集细胞群体中的CD34+细胞的富集倍数的2到4倍。在某些实施例中，可以在各种器械上执行在低严格性条件下的选择，包含但不限于美天旎生物技术公司MACSQuant
Figure BDA0002911016300000321
Quad Technologies
Figure BDA0002911016300000322
GE
Figure BDA0002911016300000323
细胞分离系统、Terumo
Figure BDA0002911016300000324
细胞分离系统、COBE
Figure BDA0002911016300000325
细胞分离器、SynGen
Figure BDA0002911016300000326
或
Figure BDA0002911016300000327
系统、Fresenius-Kabi
Figure BDA0002911016300000328
美天旎生物技术公司
Figure BDA0002911016300000329
系统或CliniMACS
Figure BDA00029110163000003210
系统。可以在实验室中或定点照护时执行选择。在国际专利申请第PCT/US2019/027083号中提供了在低严格性条件下富集细胞的示例性方法，所述申请通过引用以其整体并入本文。
可以通过在高严格性条件下和/或在低严格性条件下选择CD34+细胞来产生富集CD34+细胞的细胞群体，从而产生高严格性CD34富集细胞群体和/或低严格性CD34富集细胞群体。用于CD34+细胞的选择方法可以是阳性选择、阴性选择或其组合。在某些实施例中，从受试者获得的生物样品被分成两个样品，其中一个样品用于制备高严格性CD34富集细胞群体，而另一个样品用于制备低严格性CD34富集细胞群体。在其它实施例中，首先对从受试者获得的生物样品进行低严格性CD34+选择，以制备低严格性CD34富集细胞群体，并且然后对低严格性CD34富集细胞群体的一部分进行高严格性CD34+选择，以制备高严格性CD34富集细胞群体。可以顺序地应用选择，例如，可以首先应用在低严格性条件下对CD34富集细胞的选择，随后在高严格性条件下从另外的CD34富集细胞的所得群体中进行选择。在其它情况下，可以首先应用在高严格性条件下对CD34富集细胞的选择，随后在低严格性条件下从CD34富集细胞的剩余群体中进行选择。在一些情况下，细胞群体可以被分裂，使得低严格性或高严格性选择被应用于先前进行高严格性或低严格性选择的细胞级分。在一些情况下，在低或高严格性条件下选择CD34富集细胞之前，将一个生物样品分成两个或更多个样品。
在每种情况下，在混合或分离生物样品或富集的细胞群体之前或之后的高严格性或低严格性选择都被考虑在所有可能的排列中。在某些实施例中，所述方法包括通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群体；以及通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群体。
经过转导的造血细胞
如在实例中进一步详细描述的，在存在本文公开的转导增强子(例如，硫酸鱼精蛋白、PGE2或其衍生物)和泊洛沙姆(例如，LentiBOOST))的组合的情况下转导的造血细胞群体，与在没有转导增强子的组合的情况下转导的造血细胞相比，表现出优异的性质。在某些实施例中，细胞也在存在重组纤连蛋白片段(例如，RetroNectinTM)的情况下被转导。在特定实施例中，经过转导的造血细胞或其群体具有以下中的一个或多个：VCN增加、VCN/细胞增加、基因修饰的CFU百分比增加，以及基因修饰的CFC百分比增加。在一些实施例中，增强了对所关注的基因的拯救。在患有LAD-1的患者的特定实施例中，与没有PGE2或泊洛沙姆的转导相比，或者与没有或仅有一种转导增强子的转导相比，在用包括CD18基因的慢病毒载体转导之后，CD18+细胞的百分比(％)增加。
在公开的方法的一些实施例中，与细胞未经PGE2或泊洛沙姆处理的情况下的由相同病毒载体基因修饰的造血细胞的百分比相比，或与仅用一种转导增强子对细胞进行处理的情况下的由相同病毒载体基因修饰的造血细胞的百分比相比，通过所述方法基因修饰的造血细胞的百分比增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或至少8倍。
在一些实施例中，用逆转录病毒(例如，慢病毒)载体转导造血细胞的方法使造血细胞群体具有至少1.0、至少1.5、至少2.0或至少2.5的VCN/细胞。在一些实施例中，治疗受试者的方法包括向受试者提供VCN/细胞为至少1.0、至少1.5、至少2.0或至少2.5的经过转导的造血细胞群体。
在一些实施例中，用逆转录病毒载体转导造血细胞的方法使造血细胞群体具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的转导效率。在一些实施例中，治疗受试者的方法包括向受试者提供转导效率为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的经过转导的造血细胞群体。
在一些实施例中，用逆转录病毒载体转导造血细胞的方法使造血细胞群体的经过转导的集落形成细胞的百分比为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在一些实施例中，治疗受试者的方法包括向受试者提供经过转导的集落形成细胞的百分比为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的经过转导的造血细胞群体。
在一些实施例中，本公开提供了由VCN/细胞为至少1.0、至少1.5、至少2.0或至少2.5的重组逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)转导的造血细胞群体。在一些实施例中，本公开提供了一种由转导效率为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的重组逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)转导的造血细胞群体。
在一些实施例中，本公开提供了一种产生造血细胞群体的方法，所述造血细胞群体包括至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％基因修饰的造血细胞，所述方法包括：使造血细胞与包括多核苷酸的重组逆转录病毒载体(任选地，慢病毒载体)离体接触，所述多核苷酸包括所关注的基因或编码所关注的多肽，其中所述接触在存在PGE2或其衍生物，任选地人PGE2或16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)和泊洛沙姆，任选地泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)的情况下发生。细胞可以在足以允许通过逆转录病毒载体来转导细胞的条件和时间下与所述逆转录病毒载体接触，例如在合适的培养基中持续至少一小时、至少两小时、至少四小时、至少八小时或至少十二小时。在一些实施例中，细胞在相同或重叠的时间段期间与逆转录病毒载体和转导增强子接触。
有利的是，与在没有转导增强子的情况下的转导相比，本公开的方法使经过转导的细胞群体的毒性降低(存活率更高)。在一些实施例中，本公开提供了一种产生造血细胞群体的方法，其中与没有转导增强子的转导相比，毒性降低了至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％或至少35％。
载体和表达盒
本公开的重组逆转录病毒载体涵盖了发现用于将多核苷酸序列递送到哺乳动物细胞的任何方便的重组逆转录病毒载体。例如，载体可以包括单链核酸或双链核酸，例如单链DNA或双链DNA。例如，重组逆转录病毒载体可以是DNA。载体可以包括单链或双链RNA，包含修饰形式的RNA。在另一个实例中，重组逆转录病毒载体可以是RNA，例如mRNA或经修饰的mRNA。
在特定实施例中，重组逆转录病毒载体可以是源自于病毒的病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(LV)、疱疹病毒、α病毒或逆转录病毒，例如莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、哈维(Harvey)鼠类肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德(Friend)鼠类白血病病毒、鼠类干细胞病毒(MSCV)或劳斯氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)。虽然以下更详细地描述了涵盖LV的用途的实施例，但是期望本领域普通技术人员应了解，本领域中的类似知识和技术也可以用于非LV重组逆转录病毒载体。在一些实施例中，重组逆转录病毒载体为自限制LV。
在具体实施例中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是假型慢病毒载体，例如VSVG-假型慢病毒载体。
具体地，本文所公开的某些方法涉及用编码和/或表达治疗性多肽的重组逆转录病毒载体(例如，FANCA)转导干细胞或祖细胞(例如，造血干细胞(HSC)或造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells)(在本文中也称为“造血祖细胞(hematopoieticprogenitors)”)中的两个群体，其中一个群体通过在高严格性条件下选择来制备，而另一个群体通过在低严格性条件下选择来制备。在一个实施例中，细胞群体富集CD34+细胞。在一个实施例中，HSC或造血祖细胞来自受试者，所述受试者具有来自一种或多种FANCA编码蛋白的降低的蛋白活性或无蛋白活性。在一个实施例中，受试者具有FA-A。在一个实施例中，HSC的内源性FANCA基因缺失和/或突变。
在一个实施例中，用重组逆转录病毒载体转导细胞引起整合到表达盒的细胞基因组中，所述表达盒包括与重组逆转录病毒载体内编码治疗剂的多核苷酸序列可操作连接的启动子。在一些实施例中，用重组逆转录病毒载体转导细胞引起治疗剂的表达，例如生物活性FANCA蛋白。
例如，具有生物活性的FANCA蛋白形成FA核心复合物的部分。在某些实施例中，通过病毒载体递送FANCA基因。在一个实施例中，通过慢病毒载体递送FANCA基因。在某些实施例中，慢病毒载体是PGK-FANCA.WPRE*LV。可以设想的是，在用FANCA慢病毒载体(LV)转导来自FA-A患者的骨髓(BM)细胞或干细胞或祖细胞之后，治疗性载体被整合到细胞的基因组中。一旦经过整合，治疗性蛋白(例如，人FANCA蛋白)由细胞表达。对经过转导的FA细胞进行基因修正，并且因此能够通过FANCD2和FANCI的单泛素化来激活FA通路。然后，这些蛋白质将能够迁移到DNA损伤的区域，并与其它DNA修复蛋白合作，将促进这些细胞中的DNA修复，如在健康细胞中发生的那样。
如本文所讨论的，本发明的方法和组合物可以用于在动物细胞中表达转基因，例如FANCA。例如，主题组合物可以用于研究中，以例如确定基因对细胞活力和/或功能的影响。作为另一个实例，可以在医药中使用主题组合物以例如治疗如FA等病症。
在一些实施例中，主题方法产生了治疗益处，例如预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。例如，在一个实施例中，所述病症为范可尼贫血贫血(FA)。在另一个实施例中，所述疾病或病症为骨髓衰竭(BMF)。在一个实施例中，所述病症为血小板减少症。在另一个实施例中，所述病症为白细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为全血细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，所述病症为贫血。在一些实施例中，主题方法包括检测到治疗益处已经实现的步骤。普通技术人员应了解，治疗功效的这种量度将适用于正被修饰的特定疾病，并且应认识到用来测量治疗功效的适当检测方法。
因此，本发明提供了用于治疗FA或FA的一种或多种血液学表现的方法。在一个实施例中，FA的血液学表现选自以下中的一种或多种：骨髓衰竭(BMF)、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血。在一个特定实施例中，血液学表现为BMF，其出现在大多数FA患者的小儿年龄中。在一个实施例中，血液学表现为血小板减少症。在另一个实施例中，血液学表现为白细胞减少症。在一个实施例中，血液学表现为全血细胞减少症。在一个实施例中，血液学表现为中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，血液学表现为贫血。在一个实施例中，血液学表现为BMF、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血中的两种或更多种的组合。
可以根据本文公开的方法使用的另外的LV载体包含但不限于使用下文所公开的转移载体来制备的那些载体。
2.经过转导的造血细胞的用途
在一些实施例中，根据本文公开的方法转导的造血细胞被用于基因疗法。在特定实施例中，造血细胞用包括所关注的基因的载体进行转导。可以将经过转导的细胞提供给有此需要的受试者，例如，以便治疗受试者的遗传疾病或病症。在特定实施例中，所述所关注的基因补足在与单基因遗传疾病或病症相关的基因中的缺陷。在一些实施例中，受试者包括所关注的内源基因中的突变。在一些实施例中，提供给受试者的所关注的基因是密码子优化的，例如以增强哺乳动物细胞中的表达。
在一个实施例中，所关注的基因选自由以下组成的组：范可尼贫血互补群-A(FANCA)、互补群-C(FANCC)和互补群-G(FANCG)。在一个实施例中，所关注的基因是红细胞型丙酮酸激酶(RPK)。在一个实施例中，所关注的基因是整合素β2(ITGB2)，和/或所关注的基因编码由本文公开的基因中的任何基因编码的蛋白质或其功能片段或变体。
在一个实施例中，所述方法预防或改善单基因遗传疾病或病症。
在一个实施例中，所述单基因疾病或病症选自由以下组成的组：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨质疏松症。
因此，本公开提供了用于治疗单基因遗传疾病或病症的方法，所述单基因遗传疾病或病症包含但不限于范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。在特定实施例中，所述方法包括向有此需要的受试者提供用逆转录病毒载体转导的造血细胞，所述逆转录病毒载体包括多核苷酸，所述多核苷酸包括可操作地连接到启动子序列的编码治疗性蛋白质的序列，其中根据本文公开的方法例如在存在本文公开的两种或更多种转导增强子的情况下来转导所述细胞。
在某些实施例中，本发明包含一种细胞，所述细胞包括(例如，本文公开的任何)基因表达盒、基因转移盒或重组逆转录病毒载体。在相关实施例中，细胞用包括表达盒的重组逆转录病毒载体来转导或具有整合到细胞基因组中的表达盒，其中根据本文公开的方法执行转导。在某些实施例中，细胞是用于产生重组逆转录病毒载体的细胞，例如包装细胞。
在某些实施例中，细胞是待递送给受试者以向受试者提供由表达盒编码的基因产物的细胞。因此，在某些实施例中，细胞对待治疗的受试者是自体的，或者从待治疗的受试者获得。在其它实施例中，细胞对待治疗的受试者是同种异体的，或者从不同于待治疗的受试者的供体获得。在特定实施例中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在某些实施例中，细胞是血细胞、红细胞、造血祖细胞、骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞、造血干细胞(例如，CD34+)或定向造血红系祖细胞。在特定实施例中，所述细胞是从受试者获得的CD34+细胞，所述受试者待用通过本文公开的重组逆转录病毒载体转导后的细胞治疗。在特定实施例中，所述细胞是从被诊断患有FA的受试者获得的CD34+FA细胞。本公开进一步包含根据本文公开的方法转导的造血细胞群体(任选地，CD34富集细胞)。
在一些实施例中，本文公开的方法产生了治疗益处，例如预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。例如，在一个实施例中，所述病症为BMF。在一个实施例中，所述病症为血小板减少症。在另一个实施例中，所述病症为白细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为全血细胞减少症。在一个实施例中，所述病症为中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，所述病症为贫血。在一些实施例中，主题方法包括检测到治疗益处已经实现的步骤。普通技术人员应了解，治疗功效的这种量度将适用于正被修饰的特定疾病，并且应认识到用来测量治疗功效的适当检测方法。
期望使用主题转基因获得的转基因的表达是稳健的。因此，在一些情况下，例如如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等检测到的转基因的表达可以在施用后两个月或更短时间观察到，例如在施用后4周、3周或2周或更短时间，例如在施用主题组合物后1周。也期望转基因的表达随着时间的推移而持续。因此，在一些情况下，例如如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等检测到的转基因的表达可以在施用主题组合物后2个月或更长观察到，例如4个月、6个月、8个月或10个月或更长，在一些情况下1年或更长，例如2年、3年、4年或5年，在某些情况下超过5年。
在某些实施例中，所述方法包括检测细胞中或受试者中转基因的表达的步骤，其中表达相对于来自不包括本公开的一个或多个经过改进的元件的多核苷酸盒的表达有所增强。通常，如通过例如早期检测、更高水平的基因产物、对细胞更强的功能性影响等证实的，相对于来自例如本领域已知的参照(即，对照多核苷酸盒)的表达，表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下，10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍。
在一些实施例中，患者通过输注接收的细胞剂量将是从转导过程中获得的剂量。在各个优选实施例中，将至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或更多的高严格性CD34富集细胞/KG患者体重输注到患者体内。在各个优选实施例中，将至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或更多的高严格性CD34富集细胞/KG患者体重输注到患者体内。在一些实施例中，将介于1×106与4×106之间的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在其它实施例中，将3×105和4×106的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在一些实施例中，将介于1×106与4×106之间的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在其它实施例中，将3×105和4×106的高严格性CD34富集细胞/Kg患者体重输注到患者体内。在一些实施例中，细胞将以单剂量输注到患者体内。在其它实施例中，细胞将以多剂量输注到患者体内(例如，顺序施用高严格性和低严格性CD34富集细胞群体一次或多次)。可以在转导过程完成后立即输注经过转导的细胞。在特定实施例中，经过转导的细胞在使用前被储存或冷冻，而在某些实施例中，其在被转导后立即或不久被提供给受试者，例如在一小时、两小时、四小时或八小时内。
一旦经过整合，治疗性蛋白(例如，人FANCA蛋白)由细胞表达。对经过转导的FA细胞进行基因修正，并且因此能够通过FANCD2和FANCI的单泛素化来激活FA通路。这些蛋白质迁移到DNA损伤的区域，并与其它DNA修复蛋白合作，促进这些细胞中的DNA修复，如在健康细胞中发生的那样。
如在实例中进一步详细描述的，来自人FA患者的BM样品的临床前体外数据已经显示FANCA LV修正这些细胞的表型的功效。
在一个实施例中，施用至少1×105到4×105CD34+经过修正细胞每千克患者体重(例如，FANCA转导的HSC)，例如以恢复非条件性FA患者的造血功能。在一些实施例中，经过转导的细胞在转导后立即输注或施用到患者中。在其它实施例中，在有或没有调理的情况下，经过转导的细胞在输注或施用到患者中之前被冷冻。
对来自FA患者的HSC进行基因修正，然后进行这些细胞的自体移植(造血基因疗法)，对于FA患者(尤其是那些缺乏同种异体移植的HLA相同的兄弟姐妹的患者)来说是很好的替代性方案。在一个实施例中，造血基因疗法对于缺乏HLA相同的兄弟姐妹的患者来说是优选治疗方案。在另一个实施例中，造血基因疗法是针对具有HLA相同的兄弟姐妹的患者的优选治疗方案。
范可尼贫血(FA)是常染色体隐性疾病(除了互补群FA-B，其为X连锁)，并且患者的中位生存期为约24年(Butturini A等人,(1994)《血液》84:1650-1655；Kutler DI等人(2003)《血液》101:1249-1256)。出生时，这些病人的血细胞计数一般是正常的。巨红细胞症通常是在这些患者中检测到的第一个血液异常。这通常与血小板减少症、贫血和全血细胞减少症一起演进。通常在5-10年后在这些患者中观察到骨髓衰竭(BMF)，其中血液学疾病发作的平均年龄为7岁。约80％的FA患者会在生命的第一个十年发展出BMF的证据。基于迄今为止的流行病学研究，如果在发育不全之前未出现恶性发作，则几乎所有FA患者将在40岁时发展为BMF，这是这些患者死亡的主要原因。由于FA的临床表现复杂，对这些患者的管理主要集中于改善以下临床表现：骨髓衰竭(BMF)、髓性白血病和实体瘤。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的范可尼贫血(FA)的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用用重组逆转录病毒载体转导的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：范可尼贫血互补群(FANC)基因或编码其功能变体或片段的基因。在一些实施例中，基因编码FANCA。
在一些实施例中，本文公开的方法用于用慢病毒载体转导造血细胞以例如产生用于治疗FA的细胞群体，所述慢病毒载体是使用pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO转移载体产生的。pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO是基于第三代慢病毒载体系统中使用的pCCL转移质粒的慢病毒载体。pCCL转移质粒是含有嵌合CMV-HIV 5′LTR和载体主链的慢病毒载体，其中猿猴病毒40多腺苷酸化和(无增强子)复制起点序列包含在HIV 3′LTR的下游，从而替代了大部分从HIV整合位点剩余的人序列。在pCCL中，CMV的增强子和启动子(相对于转录起始位点的核苷酸-673到-1；GenBank登录号K03104)接合到HIV-1的R区。载体使用连接到密码子优化的FANCA基因的PGK启动子，所述基因具有上游的RRE和cPPT/CTS元件以及下游的wPRE元件(图15)。
所得的慢病毒载体用于转导自体CD34+造血干细胞(“HSC”)，从而补足基因缺陷。简而言之，通过用G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合治疗患者来动员HSC。然后通过单采血液成分术从患者的外周血中收集HSC。CD34+细胞使用磁捕获富集(例如，在美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)CliniMACs系统上)，并且根据本文公开的方法用先前通过瞬时转染第三代慢病毒载体系统产生的慢病毒颗粒离体转导CD34+富集细胞，所述第三代慢病毒载体系统包含pCCL-PGK-FANCAW-82-RO转移质粒。在某些实施例中，细胞在存在PGE2和泊洛沙姆的情况下被转导。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。然后通过输注将经过转导的HSC移植到患者体内，并且用FANCA表达性细胞重新填充HSC龛。
在pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO(5'-3')中的FANCA表达盒的序列如下。FANCA的编码序列用粗体大写字母表示。带下划线的是WPRE序列。
Figure BDA0002911016300000401
Figure BDA0002911016300000411
Figure BDA0002911016300000421
由此多肽编码的FANCA蛋白序列被提供为SEQ ID NO:2。可用于本发明的表达FANCA的载体包含但不限于国际专利申请公布第WO 2018/049273号中公开的那些，所述专利申请的公开内容以其整体并入本文。
白细胞粘附缺乏症-1(LAD-1)是罕见的由ITGB2基因中的突变引起的常染色体隐性疾病，所述基因编码CD18(一种存在于白细胞上的几种细胞表面受体复合物中的蛋白质，包含淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、补体受体3(CR-3)和补体受体4(CR-4))。LFA-1的缺乏导致中性粒细胞无法粘附到血管和迁移出血管，因此其计数可能很高。其还损害免疫细胞相互作用、免疫识别和细胞杀伤淋巴细胞功能。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的I型白细胞粘附缺乏症(LAD-1)的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用用重组逆转录病毒载体转导的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：ITGB2基因或编码其功能变体或片段的基因。
在一些实施例中，本文公开的方法用于用慢病毒载体转导造血细胞以例如产生用于治疗LAD-1的细胞群体，所述慢病毒载体是使用pCCL-ChimhCD18W-82-RO转移载体产生的。pCCL-ChimhCD18W-82-RO是基于第三代慢病毒载体系统中使用的pCCL转移质粒的慢病毒转移载体。pCCL转移质粒是含有嵌合CMV-HIV 5′LTR和载体主链的慢病毒载体，其中猿猴病毒40多腺苷酸化和(无增强子)复制起点序列包含在HIV 3′LTR的下游，从而替代了大部分从HIV整合位点剩余的人序列。在pCCL中，CMV的增强子和启动子(相对于转录起始位点的核苷酸-673到-1；GenBank登录号K03104)接合到HIV-1的R区。载体使用连接到密码子优化的ITGB2基因的Chim启动子，所述基因具有上游的RRE和cPPT/CTS元件以及下游的wPRE元件(图16)。Chim启动子是c-Fes启动子和CTSG最小5′-侧翼区的融合体(其中CTSG启动子的TATA框突变，以便仅将转录起始限制于c-Fes最小启动子)。
慢病毒颗粒是通过瞬时转染包含LAD-1转移质粒的第三代慢病毒载体系统产生的。慢病毒颗粒用于转导自体CD34+造血干细胞(HSC)，从而补足基因缺陷。简而言之，通过用G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合治疗患者来动员HSC。然后通过单采血液成分术从患者的外周血中收集HSC。CD34+细胞使用磁捕获进行富集(例如，在美天旎生物技术公司CliniMACs系统上)，并且用慢病毒颗粒对CD34+富集细胞进行离体转导。转导过程结合转导增强子的使用，特别是polyaxamers(火箭公司(Rocket)已经许可来自西里安生物技术股份有限公司(Sirion Biotech GmbH)的LentiBOOST用于临床和商业用途)和PGE2(可从LGM制药公司(LGM Pharma)商购获得)。然后通过输注将经过转导的HSC移植到患者体内，其中其用LAD-1表达性细胞重新填充HSC龛。
所得的慢病毒载体用于转导自体CD34+造血干细胞(“HSC”)，从而补足基因缺陷。简而言之，通过用G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合治疗患者来动员HSC。然后通过单采血液成分术从患者的外周血中收集HSC。CD34+细胞可以使用磁捕获富集(例如，在美天旎生物技术公司CliniMACs系统上)，并且根据本文公开的方法用先前通过瞬时转染第三代慢病毒载体系统产生的慢病毒颗粒离体转导CD34+富集细胞，所述第三代慢病毒载体系统包含pCCL-ChimhCD18W-82-RO转移质粒。在某些实施例中，细胞在存在PGE2和泊洛沙姆的情况下被转导。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。然后通过输注将经过转导的HSC移植到患者体内，并且用ITGB2表达性细胞重新填充HSC龛。
在pCCL-ChimhCD18W-82-RO(5'-3')中的ITGB2表达盒的序列如下。ITGB的编码序列，也称为CD18，用粗体大写字母表示。带下划线的是WPRE序列。
Figure BDA0002911016300000441
Figure BDA0002911016300000451
人ITGB2蛋白序列被提供为SEQ ID NO:4。
丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是一种由损害红细胞能量平衡的PKLR基因突变引起的单基因代谢疾病，因此会引起范围非常可变的溶血性贫血，并且在新生儿期可能致命。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的丙酮酸激酶缺乏症的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用用重组逆转录病毒载体转导的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：R型丙酮酸激酶基因或编码其功能变体或片段的基因。
在一些实施例中，本文公开的方法用于用慢病毒载体转导造血细胞以例如产生用于治疗IMO的细胞群体，所述慢病毒载体是使用pCCL-PGK-coRPKW-82-RO转移载体产生的。pCCL-PGK-coRPKW-82-RO(PKD质粒)基于第三代慢病毒载体系统中使用的pCCL转移质粒。pCCL转移质粒是含有嵌合CMV-HIV 5′LTR和载体主链的慢病毒载体，其中猿猴病毒40多腺苷酸化和(无增强子)复制起点序列包含在HIV 3′LTR的下游，从而替代了大部分从HIV整合位点剩余的人序列。在pCCL中，CMV的增强子和启动子(相对于转录起始位点的核苷酸-673到-1；GenBank登录号K03104)接合到HIV-1的R区。PKD质粒包含连接到密码子优化的PKLR基因的PGK启动子，所述基因具有上游的RRE和cPPT/CTS元件以及下游的wPRE元件(图1)。慢病毒载体颗粒是通过瞬时转染包含PKD质粒的第三代慢病毒载体系统产生的(图17)。
慢病毒颗粒载体然后可以用于转导自体CD34+造血干细胞(HSC)，从而补足基因缺陷。简而言之，通过用G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合治疗患者来动员HSC。然后通过单采血液成分术从患者的外周血中收集HSC。CD34+细胞可以使用磁捕获进行富集(例如，在美天旎生物技术公司CliniMACs系统上)，并且根据本文公开的方法用慢病毒载体颗粒对CD34+富集细胞进行离体转导。在某些实施例中，细胞在存在PGE2和泊洛沙姆的情况下被转导。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。然后通过输注将经过转导的HSC移植到患者体内，并且用PKLR表达性细胞重新填充HSC龛。
在pCCL-PGK-coRPKW-82-RO(5'-3')中的PKLR表达盒的序列如下。PKLR的编码序列用粗体大写字母表示。PGK启动子用斜体表示，并且WPRE序列用下划线表示。
Figure BDA0002911016300000461
Figure BDA0002911016300000471
由此多肽编码的PKLR蛋白序列被提供为SEQ ID NO:6。可用于本发明的另外的PKLR多核苷酸序列包含SEQ ID NO:7-9。可用于本发明的表达PKLR的载体包含但不限于国际专利申请第PCT/US2019/041465号中公开的那些，所述专利申请的公开内容以其整体并入本文。
婴儿恶性骨硬化病(IMO)是一种罕见的隐性病症，其特征是由功能障碍的破骨细胞引起的骨量增加。所述疾病最常见是由TCIRG1基因的突变引起的，所述基因编码与破骨细胞吸收骨的能力有关的V-ATP酶的亚基。Richter等人已经表明破骨细胞功能可以通过慢病毒载体介导的TCIRG1表达来恢复，但是恢复吸收的确切阈值以及细胞对载体介导的TCIRG1表达的应答是未知的。
在某些实施例中，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的婴儿恶性骨质疏松症的方法，所述方法包括根据本文公开的方法施用用重组逆转录病毒载体转导的造血细胞，所述重组逆转录病毒载体包括编码以下的多核苷酸：CLCN7、OSTM1、T细胞免疫调节因子1、ATP酶H+转运V0亚基a3(TCIRG1)、TNFSF11、PLEKHM1或TNFRSF11A基因或编码其功能变体或片段的基因。
在一些实施例中，本文公开的方法用于用使用pCCL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre转移载体产生的慢病毒载体转导造血细胞以例如产生用于治疗IMO的细胞群体。pCCL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre是一种基于第三代慢病毒载体系统中使用的pCCL转移质粒的慢病毒转移载体。pCCL转移质粒是含有嵌合CMV-HIV 5′LTR和载体主链的慢病毒载体，其中猿猴病毒40多腺苷酸化和(无增强子)复制起点序列包含在HIV 3′LTR的下游，从而替代了大部分从HIV整合位点剩余的人序列。在pCCL中，CMV的增强子和启动子(相对于转录起始位点的核苷酸-673到-1；GenBank登录号K03104)接合到HIV-1的R区。载体使用连接到密码子优化的TCIRG1基因的EFS启动子(EF1α启动子的短的、无内含子的形式)，所述基因具有上游的RRE和cPPT/CTS元件以及下游的wPRE元件(图18)。
所得的慢病毒载体用于转导自体CD34+造血干细胞(“HSC”)，从而补足基因缺陷。在一些实施例中，通过用G-CSF、普乐沙福或G-CSF与普乐沙福的组合治疗患者来动员HSC。然后通过单采血液成分术从患者的外周血中收集HSC。CD34+细胞可以使用磁捕获富集(例如，在美天旎生物技术公司CliniMACs系统上)，并且可以根据本文公开的方法用先前通过瞬时转染慢病毒载体系统产生的慢病毒颗粒离体转导CD34+富集细胞，所述慢病毒载体系统包含pCCLL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre转移质粒。在某些实施例中，细胞在存在PGE2和泊洛沙姆的情况下被转导。在一个实施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。然后通过输注将经过转导的HSC移植到患者体内，并且产生TCIRG1表达性破骨细胞。
在pCCL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre(5'-3')中的TCIRG1表达盒的序列如下。TCIRG1的编码序列，也称为CD18，用粗体大写字母表示。带下划线的是WPRE序列。
Figure BDA0002911016300000481
Figure BDA0002911016300000491
由此多肽编码的TCIRG1蛋白序列被提供为SEQ ID NO:11。
在一些情况下，重组逆转录病毒载体提供转基因给或修复与疾病或病症相关的基因以外的基因。例如但不限于，重组逆转录病毒载体可以上调或下调免疫效应基因，可以改变细胞表面标志物，可以提供替代性MHC分子或可以编码免疫球蛋白基因。特别设想的是，在一些情况下，一种或多种重组逆转录病毒载体提供了同种异体或不匹配供体移植的使用，如通过改变免疫标志物(例如，HLA或MHC基因)或引起免疫效应基因的表达。
待在细胞中表达的编码序列可以是任何多核苷酸序列，例如，编码基因产物的基因或cDNA，所述基因产物例如基于多肽或RNA的治疗剂(siRNA、反义、核酶、shRNA等)。编码序列可以与启动子序列异源，所述启动子序列与所述编码序列可操作地连接，即不与其天然可操作地缔合。可替代地，编码序列可以与启动子序列内源，所述启动子序列与所述编码序列可操作地连接，即本质上与所述启动子缔合。基因产物可以内在地作用于哺乳动物细胞，或者可以外在地起作用，例如，其可能被分泌。例如，当转基因是治疗性基因时，编码序列可以是编码所期望的基因产物或其功能片段或变体的任何基因，所期望的基因产物或其功能片段或变体可以用作治疗疾病或病症的治疗剂。在各个实施例中，转基因编码人FANCA。
在一些实施例中，对转基因编码序列进行修饰或“密码子优化”，以通过用更频繁表示的密码子替换不频繁表示的密码子来增强表达。编码序列是编码用于转译的氨基酸的mRNA序列的一部分。在转译过程中，61个三核苷酸密码子中的每个三核苷酸密码子被转译成20个氨基酸中的一个氨基酸，从而导致遗传密码中的简并或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种会利用在不同频率下编码相同氨基酸的tRNA(各自携带反密码子)。当基因序列含有由对应tRNA不频繁表示的密码子时，核糖体转译机制可能会减慢，从而阻碍有效转译。可以通过特定物种的“密码子优化”来改进表达，其中改变编码序列以编码相同的蛋白质序列，而利用高度表示和/或由高度表示的人蛋白质利用的密码子(Cid-Arregui等人,2003；《病毒学杂志(J.Virol.)》77:4928)。在本发明的一个方面，对转基因的编码序列进行修饰以用灵长类动物中频繁表达的密码子替换哺乳动物或灵长类动物中不频繁表达的密码子。例如，在一些实施例中，由转基因编码的编码序列编码多肽，所述多肽与由上文或在此所公开的序列编码的多肽具有至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性，其中编码序列的至少一个密码子在人中具有比上文或在此所公开的序列中的对应密码子更高的tRNA频率。
在另外的实施例中，转基因编码序列被修饰以通过终止或移除不编码所期望的转基因的开放阅读框(ORF)来增强表达。开放阅读框(ORF)是跟随起始密码子且不含有终止密码子的核酸序列。与所关注的基因相比，ORF可以处于正向或反向朝向，并且可以在“框内”或“框外”。这种开放阅读框有可能在所关注的基因旁边的表达盒中表达，并且可能引起不期望的副作用。在本发明的一方面，已经对转基因的编码序列进行修饰，以通过进一步改变密码子使用来移除开放阅读框。这可以通过以下来实现的：消除起始密码子(ATG)和引入反向朝向或ORF框外的终止密码子(TAG、TAA或TGA)，同时保留氨基酸序列并维持所关注的基因中高度利用的密码子(即，避免频率<20％的密码子)。在本公开中，转基因编码序列可以通过密码子优化和移除非转基因ORF或同时使用两种技术来优化。对于本领域普通技术人员而言将显而易见的是，优选在密码子优化后移除或最小化非转基因ORF，以便移除在密码子优化期间引入的ORF。
另外，如本领域普通技术人员将认识到的，表达盒和重组逆转录病毒载体可以任选地含有其它元件，包含但不限于促进克隆的限制性位点和用于特定重组逆转录病毒载体的调节元件。
在本发明的一些方面，主题多核苷酸盒用于将基因递送到细胞，例如以确定基因对细胞活力和/或功能的影响，以便治疗细胞病症等。在各个实施例中，通过转导将病毒载体递送到细胞可以在体内、离体或体外进行。因此，在本发明的一些方面，提供转基因在哺乳动物细胞中的表达的组合物是重组逆转录病毒载体，其中所述重组逆转录病毒载体包括本公开的多核苷酸盒，例如基因转移盒。
可以使用标准方法来产生使本公开的多核苷酸盒衣壳化的重组逆转录病毒载体。
例如，在LV病毒粒子的情况下，根据本发明的LV表达载体可以引入到生产细胞中，然后引入LV辅助构建体，其中辅助构建体包含能够在生产细胞中进行表达的LV编码区并且所述LV编码区可对LV载体中不存在的LV辅助功能进行补足。随后将辅助病毒和/或另外的载体引入到生产细胞中，其中辅助病毒和/或另外的载体提供了能够支持高效LV生产的辅助功能。然后培养生产细胞以产生LV。这些步骤是使用标准方法进行的。在特定实施例中，图38-41中描绘的质粒用于产生重组逆转录病毒载体。
用于产生病毒载体的方法
可以使用标准方法来产生使本公开的多核苷酸盒衣壳化的重组逆转录病毒载体。
例如，在LV病毒粒子的情况下，根据本发明的LV表达载体可以引入到生产细胞中，然后引入LV辅助构建体，其中辅助构建体包含能够在生产细胞中进行表达的LV编码区并且所述LV编码区可对LV载体中不存在的LV辅助功能进行补足。随后将辅助病毒和/或另外的载体引入到生产细胞中，其中辅助病毒和/或另外的载体提供了能够支持高效LV生产的辅助功能。然后培养生产细胞以产生LV。这些步骤是使用标准方法进行的。在特定实施例中，图38-41中描绘的质粒用于产生重组逆转录病毒载体。
可以使用任何合适的用于产生用于递送主题多核苷酸盒的病毒载体的方法，包含但不限于以下实例中描述的那些。可以制备适合于对哺乳动物细胞进行有效转导的任何浓度的感染病毒载体，以在体外或体内接触哺乳动物细胞。例如，病毒颗粒的浓度可以调配成每毫升108个感染单位或更多个，例如每毫升1×108个感染单位；每毫升5×108个感染单位；每毫升109个感染单位；每毫升5×109个感染单位、每毫升1010个感染单位、每毫升5×1010个感染单位；每毫升1011个感染单位；每毫升5×1011个感染单位；每毫升1012个感染单位；每毫升5×1012个感染单位；每毫升1013个感染单位；每毫升1.5×1013个感染单位；每毫升3×1013个感染单位；每毫升5×1013个感染单位；每毫升7.5×1013个感染单位；每毫升9×1013个感染单位；每毫升1×1014个感染单位、每毫升5×1014个或更多个感染单位，但是通常每毫升不超过1×1015个感染单位。
在制备主题LV重组逆转录病毒载体时，可以采用用于产生LV病毒粒子的任何宿主细胞，包含例如哺乳动物细胞(例如，HEK 293T细胞)。宿主细胞也可以是包装细胞或生产细胞，在所述包装细胞中，LV gag/pol和Rev基因稳定地维持在宿主细胞中，在所述生产细胞中，LV载体基因组稳定地维持和包装。LV载体使用本领域已知的标准技术进行纯化和调配。
药物组合物和调配物
本发明包含包括如本文所述的细胞群体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物和调配物。主题细胞群体可以与可用于制备通常是安全、无毒且期望的并且包含可接受以供灵长类动物使用的赋形剂的调配物的药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂组合。此类赋形剂、载体或稀释剂的实例包含但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。补充性活性化合物也可以并入调配物中。用于调配物的溶液或悬浮液可以包含：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、二甲基亚砜(DMSO)、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如用于防止聚合的吐温(Tween)20；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调整pH。在特定实施例中，调配物是无菌的。
在一些实施例中，根据当前良好生产规范制造细胞群体。根据当前良好生产规范制造意味着，为施用而制备的调配物足够安全以允许在控制法规和政府授权下将其施用于人类受试者。一般地，控制法规和授权将指示调配物符合预先批准的关于同一性、强度、质量和纯度的验收标准。验收标准包含用于确定调配物是否符合当前良好生产规范的数值限值、范围或其它合适的测试结果的量度。说明书示出了用于测试是否符合验收标准的分析程序。可以分批评估调配物。批是经过测试以确保符合验收标准的调配物的特定数量。
调配物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如，注射器，例如载药注射器)中。
在必要或有益的情况下，调配物可以包含如利多卡因等局部麻醉剂，以减轻注射部位处的疼痛。
调配物中细胞的治疗有效量可以大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。调配物内的细胞的治疗有效量可以少于103个细胞、少于104个细胞、少于105个细胞、少于106个细胞、少于107个细胞、少于108个细胞、少于109个细胞、少于1010个细胞、少于1011个细胞或少于1012个细胞。调配物内的细胞的治疗有效量可以介于103个细胞与1012个细胞之间、介于104个细胞与1011个细胞之间、介于105个细胞与1010个细胞之间、介于108个细胞与1012个细胞之间、介于109个细胞与1012个细胞之间、介于108个细胞与1010个细胞之间或介于109个细胞与1011个细胞之间。
在本文公开的调配物中，细胞的体积通常为一升或更少、500mL或更少、250mL或更少或100mL或更少。因此，施用细胞的密度通常大于104个细胞/mL、107个细胞/mL或108个细胞/mL。
本文公开的调配物可以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来制备以便施用。施用的治疗有效量可以包含大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞。在特定实施例中，最小剂量为2×106个细胞/kg受试者体重。施用的治疗有效量可以包含少于103个细胞、少于104个细胞、少于105个细胞、少于106个细胞、少于107个细胞、少于108个细胞、少于109个细胞、少于1010个细胞、少于1011个细胞或少于1012个细胞。在特定实施例中，最大剂量为2×1012个细胞/kg受试者体重。施用的治疗有效量可以介于103个细胞与1012个细胞之间、介于104个细胞与1011个细胞之间、介于105个细胞与1010个细胞之间、介于108个细胞与1012个细胞之间、介于109个细胞与1012个细胞之间、介于108个细胞与1010个细胞之间或介于109个细胞与1011个细胞之间。
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合的如本文所公开的治疗有效量的细胞群体，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其它蛋白质。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏溶液和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，这一调配物在4℃下在至少六个月内是稳定的。在一个实施例中，细胞群体是从体内来源新鲜制备的。在一个实施例中，细胞群体在调配成药物组合物之前或在调配成药物组合物之后被冷冻储存。
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水以及本领域普通技术人员已知的其它缓冲液，如Good等人(1966)《生物化学(Biochemistry)》5:467中描述的那些缓冲液。包括腺病毒载体递送系统中含有的肿瘤抑制基因的药物组合物的缓冲液的pH可以在6.5到7.75的范围内，优选地7到7.5，并且最优选地7.2到7.4。
本文所提及的所有出版物均通过引用的方式并入本文中，以公开和描述引用出版物时结合的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开代替所并入出版物的任何公开内容。
进一步地，应注意，权利要求书的撰写可以不包含任何任选的要素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
本文所讨论的出版物仅被提供用于在本申请的提交日之前对其进行公开。进一步地，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，实际的出版日期可能需要独立地确认。
本公开在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求中所描述的本公开的范围。
实例
实例1
利用硫酸鱼精蛋白和PGE2的造血细胞的转导
用逆转录病毒载体转导造血细胞用于临床应用仍然具有挑战性。具体地，从文献中不清楚哪些转导增强子或其组合可能是最有效的或者可以达到的效果的量值。此实例证实硫酸鱼精蛋白与PGE2的组合增加了转导效率。
尽管在以下实例中描述的各个实验中，转导培养基不包含TE、包含单一TE或TE的各种组合，但是图1中提供了如在所述实例中执行的用慢病毒载体转导造血细胞的说明性方案。预刺激包含在涂覆有2ug/cm2 RetroNectinTM(RN)的板上培养细胞。转导培养基包含预刺激介质(X-VIVOTM20介质加100ng/mL rhSCF、100ng/mL rhTPO、100ng/mL rh-FLT3-L和20ng/mL IL-3)和4μg/mL硫酸鱼精蛋白。
在一个实验中，用表达GFP(绿色荧光蛋白)转基因报告基因的VSVG假型LV来转导造血细胞。在存在不同浓度的PGE2的情况下，用在液体培养物中的2.5×107TU/mL或5×107TU/mL的慢病毒载体转导细胞，并且在液体培养物中14天之后测定，以进行VCN确定(图2A)。结果表明，PGE2的浓度增加(10μg/mL、30μg/mL或50μg/mL)会增加转导效率，如通过载体拷贝数/细胞测量的。
在另一个实验中，在存在PGE2的情况下，用在液体培养物中的1×107TU/mL或1×108TU/mL的慢病毒载体转导细胞，并且在液体培养物中14天之后测定，以进行VCN确定(图2B)。在两种载体浓度下，PGE2增加了如通过VCN/细胞确定的转导效率。用经过转导的细胞执行集落形成单位(CFU)测定(图3A，CFC＝集落形成细胞)，并且在单个集落中分析VCN和转导百分比(％)(图3B和3C)。使用最高测试浓度的PGE2，高达约75％的细胞被转导(图3C)。
实例2
利用硫酸鱼精蛋白和泊洛沙姆F108的造血细胞的转导
此实例证实硫酸鱼精蛋白和泊洛沙姆F108(也称为泊洛沙姆338)增加了转导效率。使用泊洛沙姆F108(LentiBOOSTTM)在液体培养物中执行根据图1所展示的一般方案的测试。图4示出了液体培养物中的VCN的结果，并且图5A-5C示出了CFU测定的分析结果(图5A)以及分离的单个CFU中的VCN的分析结果(图5B和5C)。在0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL的浓度下，LentiBOOSTTM增加了表达GFP转基因报告基因的VSVG假型LV的转导效率。如同PGE2，使用最高测试浓度的PGE2，可以转导高达约75％的细胞(图5C)。
实例3
利用硫酸鱼精蛋白、PGE2和泊洛沙姆F108的造血细胞的转导
此实例证明，硫酸鱼精蛋白、PGE2和LentiBOOSTTM的组合令人惊讶地增加了转导效率，超过了单独使用PGE2或LentiBOOSTTM观察到的转导效率。执行根据图1所展示的方案的测试，并且所述测试用于比较硫酸鱼精蛋白(PS)、LentiBOOSTTM(LB)、LB加PGE2、PS加LB或PS加LB加PGE2。LB以1mg/mL的浓度使用，PGE2以10ug/mL的浓度使用，并且PS以4ug/mL的浓度使用。图6示出了液体培养14天之后经过转导的细胞中的VCN的获得结果。图7A示出了用衍生自CB和mPB的经过转导的细胞进行的CFU测定。此外，示出了在存在LB加PGE2加PS的情况下的分离集落中的VCN(图7B、图7E)，并且示出了转导效率(图7C、图7D)。如图7C所示，在这些条件下，大于80％的细胞被载体转导。
实例4
转导增强子方法的放大和体内测试
此实例证明，使用脐带血作为输入，可以将实例1-3中建立的方案转移到治疗载体并且进行缩放以产生用于临床研究的足够载体。在没有转导增强子(PS除外，其用于所有实验)或有转导增强子(+TE)(特别是LB、PGE2和PS)的情况下使用CD34富集脐带血(CB)细胞和从pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO产生的LV来执行转导程序的放大。LB以1mg/mL的浓度使用，PGE2以10ug/mL的浓度使用，并且PS以4ug/mL的浓度使用。图8中示出了液体培养14天之后的VCN。在图9A-9C中示出了在移植之前，在体外转导的细胞中的CFU测定(图9A)、分离的单个CFU中的VCN(图9B)以及CFU中的转导效率(图9C)的结果。图9B示出了爆发形成单位-红系(BFU-E)细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)和髓样祖细胞(CFU-GM)的结果。图10A和10B示出了体内结果。在存在或不存在转导增强子(TE：LB加PGE2加PS)的情况下在感染复数(MOI)为50下用治疗性LV对脐带血CD34+细胞进行转导过夜。LB以1mg/mL的浓度使用，PGE2以10ug/mL的浓度使用，并且PS以4ug/mL的浓度使用。然后将所收集的经过转导的细胞洗涤并以1–2.5×106个细胞/mL的密度悬浮。将1.3–1.6×105个经过转导的细胞静脉内移植到免疫缺陷型NSG小鼠中，所述免疫缺陷型NSG小鼠用1.5Gy照射作为人类造血功能的异种模型。在来自移植动物的骨髓细胞中，在移植后一(1)、二(2)或三(3)个月(mpt)评估人CD45阳性(hCD45+)细胞百分比(％)(图10A)和VCN/细胞(图10B)。
实例5
良好生产规范(GMP)条件下的LV生产和MPB的转导
此实例证明，使用动员的外周血作为输入，可以将实例1-4中建立的方案转移到治疗载体并且进行缩放以产生用于临床研究的足够载体。执行了GMP LV生产，并且将其用于使用从来自健康供体的动员的外周血(mPB)纯化的CD34+造血干细胞执行的下一组实验中。LV载体是表达FANCA转基因的VSVG假型LV，其是使用pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO转移载体产生的。图11示出了在具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子PS、LB和PGE2的液体培养物中14天后并且在两种不同的MOI下的经过转导的细胞中的VCN/细胞。LB以1mg/mL的浓度使用，PGE2以10ug/mL的浓度使用，并且PS以4ug/mL的浓度使用。图12A-12D示出了在两种不同的MOI下，针对具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子PS、LB和PGE2的GMP003的总细胞、BFU、GM和混合髓样祖细胞的集落形成单位(CFU)测定的结果。图13A和13B示出了在20或50MOI下，具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子PS、LB和PGE2的GMP003的分离的单个CFU中的VCN。示出了爆发形成单位-红系(BFU-E)细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)和髓样祖细胞(CFU-GM)的结果。图14A和14B示出了对于爆发形成单位-红系(BFU-E)细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GM)和髓样祖细胞(混合的)，在具有(+TE)或不具有(-TE)转导增强子PS、LB和PGE2的情况下CFU中的转导效率和VCN。
序列表
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TECNOLOGICAS, O.A., M.P.
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JIMENEZ DIAZ
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<400> 1
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
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ccctctgcgt tcctgtcata tgcagactgg ttcaaggcct cctttgggag cacacgaggc 1920
taccatggct gcagcaagaa ggccctggtc ttcctgttta cgttcttgtc agaactcgtg 1980
ccttttgagt ctccccggta cctgcaggtg cacattctcc acccacccct ggttcccagc 2040
aagtaccgct ccctcctcac agactacatc tcattggcca agacacggct ggccgacctc 2100
aaggtttcta tagaaaacat gggactctac gaggatttgt catcagctgg ggacattact 2160
gagccccaca gccaagctct tcaggatgtt gaaaaggcca tcatggtgtt tgagcatacg 2220
gggaacatcc cagtcaccgt catggaggcc agcatattca ggaggcctta ctacgtgtcc 2280
cacttcctcc ccgccctgct cacacctcga gtgctcccca aagtccctga ctcccgtgtg 2340
gcgtttatag agtctctgaa gagagcagat aaaatccccc catctctgta ctccacctac 2400
tgccaggcct gctctgctgc tgaagagaag ccagaagatg cagccctggg agtgagggca 2460
gaacccaact ctgctgagga gcccctggga cagctcacag ctgcactggg agagctgaga 2520
gcctccatga cagaccccag ccagcgtgat gttatatcgg cacaggtggc agtgatttct 2580
gaaagactga gggctgtcct gggccacaat gaggatgaca gcagcgttga gatatcaaag 2640
attcagctca gcatcaacac gccgagactg gagccacggg aacacattgc tgtggacctc 2700
ctgctgacgt ctttctgtca gaacctgatg gctgcctcca gtgtcgctcc cccggagagg 2760
cagggtccct gggctgccct cttcgtgagg accatgtgtg gacgtgtgct ccctgcagtg 2820
ctcacccggc tctgccagct gctccgtcac cagggcccga gcctgagtgc cccacatgtg 2880
ctggggttgg ctgccctggc cgtgcacctg ggtgagtcca ggtctgcgct cccagaggtg 2940
gatgtgggtc ctcctgcacc tggtgctggc cttcctgtcc ctgcgctctt tgacagcctc 3000
ctgacctgta ggacgaggga ttccttgttc ttctgcctga aattttgtac agcagcaatt 3060
tcttactctc tctgcaagtt ttcttcccag tcacgagata ctttgtgcag ctgcttatct 3120
ccaggcctta ttaaaaagtt tcagttcctc atgttcagat tgttctcaga ggcccgacag 3180
cctctttctg aggaggacgt agccagcctt tcctggagac ccttgcacct tccttctgca 3240
gactggcaga gagctgccct ctctctctgg acacacagaa ccttccgaga ggtgttgaaa 3300
gaggaagatg ttcacttaac ttaccaagac tggttacacc tggagctgga aattcaacct 3360
gaagctgatg ctctttcaga tactgaacgg caggacttcc accagtgggc gatccatgag 3420
cactttctcc ctgagtcctc ggcttcaggg ggctgtgacg gagacctgca ggctgcgtgt 3480
accattcttg tcaacgcact gatggatttc caccaaagct caaggagtta tgaccactca 3540
gaaaattctg atttggtctt tggtggccgc acaggaaatg aggatattat ttccagattg 3600
caggagatgg tagctgacct ggagctgcag caagacctca tagtgcctct cggccacacc 3660
ccttcccagg agcacttcct ctttgagatt ttccgcagac ggctccaggc tctgacaagc 3720
gggtggagcg tggctgccag ccttcagaga cagagggagc tgctaatgta caaacggatc 3780
ctcctccgcc tgccttcgtc tgtcctctgc ggcagcagct tccaggcaga acagcccatc 3840
actgccagat gcgagcagtt cttccacttg gtcaactctg agatgagaaa cttctgctcc 3900
cacggaggtg ccctgacaca ggacatcact gcccacttct tcaggggcct cctgaacgcc 3960
tgtctgcgga gcagagaccc ctccctgatg gtcgacttca tactggccaa gtgccagacg 4020
aaatgcccct taattttgac ctctgctctg gtgtggtggc cgagcctgga gcctgtgctg 4080
ctctgccggt ggaggagaca ctgccagagc ccgctgcccc gggaactgca gaagctacaa 4140
gaaggccggc agtttgccag cgatttcctc tcccctgagg ctgcctcccc agcacccaac 4200
ccggactggc tctcagctgc tgcactgcac tttgcgattc aacaagtcag ggaagaaaac 4260
atcaggaagc agctaaagaa gctggactgc gagagagagg agctattggt tttccttttc 4320
ttcttctcct tgatgggcct gctgtcgtca catctgacct caaatagcac cacagacctg 4380
ccaaaggctt tccacgtttg tgcagcaatc ctcgagtgtt tagagaagag gaagatatcc 4440
tggctggcac tctttcagtt gacagagagt gacctcaggc tggggcggct cctcctccgt 4500
gtggccccgg atcagcacac caggctgctg cctttcgctt tttacagtct tctctcctac 4560
ttccatgaag acgcggccat cagggaagag gccttcctgc atgttgctgt ggacatgtac 4620
ttgaagctgg tccagctctt cgtggctggg gatacaagca cagtttcacc tccagctggc 4680
aggagcctgg agctcaaggg tcagggcaac cccgtggaac tgataacaaa agctcgtctt 4740
tttctgctgc agttaatacc tcggtgcccg aaaaagagct tctcacacgt ggcagagctg 4800
ctggctgatc gtggggactg cgacccagag gtgagcgccg ccctccagag cagacagcag 4860
gctgcccctg acgctgacct gtcccaggag cctcatctct tctgatgaga attcgatatc 4920
aagcttatcg ataccgtcga atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt 4980
tattcccata tttgttctgt ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca 5040
aaatggtggg gcaatcattt acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg 5100
ccacaagaca aacatgttaa gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa 5160
cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt 5220
acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct 5280
ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 5340
gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg 5400
ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc 5460
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actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ggcc 5554
<210> 2
<211> 1455
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Ser Asp Ser Trp Val Pro Asn Ser Ala Ser Gly Gln Asp Pro Gly
1 5 10 15
Gly Arg Arg Arg Ala Trp Ala Glu Leu Leu Ala Gly Arg Val Lys Arg
20 25 30
Glu Lys Tyr Asn Pro Glu Arg Ala Gln Lys Leu Lys Glu Ser Ala Val
35 40 45
Arg Leu Leu Arg Ser His Gln Asp Leu Asn Ala Leu Leu Leu Glu Val
50 55 60
Glu Gly Pro Leu Cys Lys Lys Leu Ser Leu Ser Lys Val Ile Asp Cys
65 70 75 80
Asp Ser Ser Glu Ala Tyr Ala Asn His Ser Ser Ser Phe Ile Gly Ser
85 90 95
Ala Leu Gln Asp Gln Ala Ser Arg Leu Gly Val Pro Val Gly Ile Leu
100 105 110
Ser Ala Gly Met Val Ala Ser Ser Val Gly Gln Ile Cys Thr Ala Pro
115 120 125
Ala Glu Thr Ser His Pro Val Leu Leu Thr Val Glu Gln Arg Lys Lys
130 135 140
Leu Ser Ser Leu Leu Glu Phe Ala Gln Tyr Leu Leu Ala His Ser Met
145 150 155 160
Phe Ser Arg Leu Ser Phe Cys Gln Glu Leu Trp Lys Ile Gln Ser Ser
165 170 175
Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu His Val Gln Gly Ile Val Ser
180 185 190
Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ser His Pro Asp Met His Ala Val Gly Ser
195 200 205
Trp Leu Phe Arg Asn Leu Cys Cys Leu Cys Glu Gln Met Glu Ala Ser
210 215 220
Cys Gln His Ala Asp Val Ala Arg Ala Met Leu Ser Asp Phe Val Gln
225 230 235 240
Met Phe Val Leu Arg Gly Phe Gln Lys Asn Ser Asp Leu Arg Arg Thr
245 250 255
Val Glu Pro Glu Lys Met Pro Gln Val Thr Val Asp Val Leu Gln Arg
260 265 270
Met Leu Ile Phe Ala Leu Asp Ala Leu Ala Ala Gly Val Gln Glu Glu
275 280 285
Ser Ser Thr His Lys Ile Val Arg Cys Trp Phe Gly Val Phe Ser Gly
290 295 300
His Thr Leu Gly Ser Val Ile Ser Thr Asp Pro Leu Lys Arg Phe Phe
305 310 315 320
Ser His Thr Leu Thr Gln Ile Leu Thr His Ser Pro Val Leu Lys Ala
325 330 335
Ser Asp Ala Val Gln Met Gln Arg Glu Trp Ser Phe Ala Arg Thr His
340 345 350
Pro Leu Leu Thr Ser Leu Tyr Arg Arg Leu Phe Val Met Leu Ser Ala
355 360 365
Glu Glu Leu Val Gly His Leu Gln Glu Val Leu Glu Thr Gln Glu Val
370 375 380
His Trp Gln Arg Val Leu Ser Phe Val Ser Ala Leu Val Val Cys Phe
385 390 395 400
Pro Glu Ala Gln Gln Leu Leu Glu Asp Trp Val Ala Arg Leu Met Ala
405 410 415
Gln Ala Phe Glu Ser Cys Gln Leu Asp Ser Met Val Thr Ala Phe Leu
420 425 430
Val Val Arg Gln Ala Ala Leu Glu Gly Pro Ser Ala Phe Leu Ser Tyr
435 440 445
Ala Asp Trp Phe Lys Ala Ser Phe Gly Ser Thr Arg Gly Tyr His Gly
450 455 460
Cys Ser Lys Lys Ala Leu Val Phe Leu Phe Thr Phe Leu Ser Glu Leu
465 470 475 480
Val Pro Phe Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Gln Val His Ile Leu His Pro
485 490 495
Pro Leu Val Pro Ser Lys Tyr Arg Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ile Ser
500 505 510
Leu Ala Lys Thr Arg Leu Ala Asp Leu Lys Val Ser Ile Glu Asn Met
515 520 525
Gly Leu Tyr Glu Asp Leu Ser Ser Ala Gly Asp Ile Thr Glu Pro His
530 535 540
Ser Gln Ala Leu Gln Asp Val Glu Lys Ala Ile Met Val Phe Glu His
545 550 555 560
Thr Gly Asn Ile Pro Val Thr Val Met Glu Ala Ser Ile Phe Arg Arg
565 570 575
Pro Tyr Tyr Val Ser His Phe Leu Pro Ala Leu Leu Thr Pro Arg Val
580 585 590
Leu Pro Lys Val Pro Asp Ser Arg Val Ala Phe Ile Glu Ser Leu Lys
595 600 605
Arg Ala Asp Lys Ile Pro Pro Ser Leu Tyr Ser Thr Tyr Cys Gln Ala
610 615 620
Cys Ser Ala Ala Glu Glu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Leu Gly Val Arg
625 630 635 640
Ala Glu Pro Asn Ser Ala Glu Glu Pro Leu Gly Gln Leu Thr Ala Ala
645 650 655
Leu Gly Glu Leu Arg Ala Ser Met Thr Asp Pro Ser Gln Arg Asp Val
660 665 670
Ile Ser Ala Gln Val Ala Val Ile Ser Glu Arg Leu Arg Ala Val Leu
675 680 685
Gly His Asn Glu Asp Asp Ser Ser Val Glu Ile Ser Lys Ile Gln Leu
690 695 700
Ser Ile Asn Thr Pro Arg Leu Glu Pro Arg Glu His Ile Ala Val Asp
705 710 715 720
Leu Leu Leu Thr Ser Phe Cys Gln Asn Leu Met Ala Ala Ser Ser Val
725 730 735
Ala Pro Pro Glu Arg Gln Gly Pro Trp Ala Ala Leu Phe Val Arg Thr
740 745 750
Met Cys Gly Arg Val Leu Pro Ala Val Leu Thr Arg Leu Cys Gln Leu
755 760 765
Leu Arg His Gln Gly Pro Ser Leu Ser Ala Pro His Val Leu Gly Leu
770 775 780
Ala Ala Leu Ala Val His Leu Gly Glu Ser Arg Ser Ala Leu Pro Glu
785 790 795 800
Val Asp Val Gly Pro Pro Ala Pro Gly Ala Gly Leu Pro Val Pro Ala
805 810 815
Leu Phe Asp Ser Leu Leu Thr Cys Arg Thr Arg Asp Ser Leu Phe Phe
820 825 830
Cys Leu Lys Phe Cys Thr Ala Ala Ile Ser Tyr Ser Leu Cys Lys Phe
835 840 845
Ser Ser Gln Ser Arg Asp Thr Leu Cys Ser Cys Leu Ser Pro Gly Leu
850 855 860
Ile Lys Lys Phe Gln Phe Leu Met Phe Arg Leu Phe Ser Glu Ala Arg
865 870 875 880
Gln Pro Leu Ser Glu Glu Asp Val Ala Ser Leu Ser Trp Arg Pro Leu
885 890 895
His Leu Pro Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ala Ala Leu Ser Leu Trp Thr
900 905 910
His Arg Thr Phe Arg Glu Val Leu Lys Glu Glu Asp Val His Leu Thr
915 920 925
Tyr Gln Asp Trp Leu His Leu Glu Leu Glu Ile Gln Pro Glu Ala Asp
930 935 940
Ala Leu Ser Asp Thr Glu Arg Gln Asp Phe His Gln Trp Ala Ile His
945 950 955 960
Glu His Phe Leu Pro Glu Ser Ser Ala Ser Gly Gly Cys Asp Gly Asp
965 970 975
Leu Gln Ala Ala Cys Thr Ile Leu Val Asn Ala Leu Met Asp Phe His
980 985 990
Gln Ser Ser Arg Ser Tyr Asp His Ser Glu Asn Ser Asp Leu Val Phe
995 1000 1005
Gly Gly Arg Thr Gly Asn Glu Asp Ile Ile Ser Arg Leu Gln Glu
1010 1015 1020
Met Val Ala Asp Leu Glu Leu Gln Gln Asp Leu Ile Val Pro Leu
1025 1030 1035
Gly His Thr Pro Ser Gln Glu His Phe Leu Phe Glu Ile Phe Arg
1040 1045 1050
Arg Arg Leu Gln Ala Leu Thr Ser Gly Trp Ser Val Ala Ala Ser
1055 1060 1065
Leu Gln Arg Gln Arg Glu Leu Leu Met Tyr Lys Arg Ile Leu Leu
1070 1075 1080
Arg Leu Pro Ser Ser Val Leu Cys Gly Ser Ser Phe Gln Ala Glu
1085 1090 1095
Gln Pro Ile Thr Ala Arg Cys Glu Gln Phe Phe His Leu Val Asn
1100 1105 1110
Ser Glu Met Arg Asn Phe Cys Ser His Gly Gly Ala Leu Thr Gln
1115 1120 1125
Asp Ile Thr Ala His Phe Phe Arg Gly Leu Leu Asn Ala Cys Leu
1130 1135 1140
Arg Ser Arg Asp Pro Ser Leu Met Val Asp Phe Ile Leu Ala Lys
1145 1150 1155
Cys Gln Thr Lys Cys Pro Leu Ile Leu Thr Ser Ala Leu Val Trp
1160 1165 1170
Trp Pro Ser Leu Glu Pro Val Leu Leu Cys Arg Trp Arg Arg His
1175 1180 1185
Cys Gln Ser Pro Leu Pro Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gln Glu Gly
1190 1195 1200
Arg Gln Phe Ala Ser Asp Phe Leu Ser Pro Glu Ala Ala Ser Pro
1205 1210 1215
Ala Pro Asn Pro Asp Trp Leu Ser Ala Ala Ala Leu His Phe Ala
1220 1225 1230
Ile Gln Gln Val Arg Glu Glu Asn Ile Arg Lys Gln Leu Lys Lys
1235 1240 1245
Leu Asp Cys Glu Arg Glu Glu Leu Leu Val Phe Leu Phe Phe Phe
1250 1255 1260
Ser Leu Met Gly Leu Leu Ser Ser His Leu Thr Ser Asn Ser Thr
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Thr Asp Leu Pro Lys Ala Phe His Val Cys Ala Ala Ile Leu Glu
1280 1285 1290
Cys Leu Glu Lys Arg Lys Ile Ser Trp Leu Ala Leu Phe Gln Leu
1295 1300 1305
Thr Glu Ser Asp Leu Arg Leu Gly Arg Leu Leu Leu Arg Val Ala
1310 1315 1320
Pro Asp Gln His Thr Arg Leu Leu Pro Phe Ala Phe Tyr Ser Leu
1325 1330 1335
Leu Ser Tyr Phe His Glu Asp Ala Ala Ile Arg Glu Glu Ala Phe
1340 1345 1350
Leu His Val Ala Val Asp Met Tyr Leu Lys Leu Val Gln Leu Phe
1355 1360 1365
Val Ala Gly Asp Thr Ser Thr Val Ser Pro Pro Ala Gly Arg Ser
1370 1375 1380
Leu Glu Leu Lys Gly Gln Gly Asn Pro Val Glu Leu Ile Thr Lys
1385 1390 1395
Ala Arg Leu Phe Leu Leu Gln Leu Ile Pro Arg Cys Pro Lys Lys
1400 1405 1410
Ser Phe Ser His Val Ala Glu Leu Leu Ala Asp Arg Gly Asp Cys
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Asp Pro Glu Val Ser Ala Ala Leu Gln Ser Arg Gln Gln Ala Ala
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Pro Asp Ala Asp Leu Ser Gln Glu Pro His Leu Phe
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<210> 3
<211> 3903
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pCCL-ChimhCD18W-82-RO载体序列
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cgcgtctgcc agctttcttg ctttgctgga gtattctgga atttgatggg ttgagggttc 60
tggacacaat gccccaagcc ccttccttgt tgtgctgggt tcctatttct gctctcggca 120
ctgacttagc agctgctcaa gagctcacca tgttggcttg gattacacgg tctcacccac 180
atctccggca gtttgtgggc aaacttcctg agcagccttg ggtgatgaaa cctttcatgg 240
tagcaggaga atgggactgt gaattctcaa tcccctgtcc ccaccccttc cttcctctct 300
cagggccttg ctgtctagga ggagggagca cagcagcaac tgactgggca gcctttcagg 360
aaaggctagc ccgggctcga tcgagaagct tgataattcc gtgaggtggg gagggctggg 420
accagggttc cctctttctc ttctgcggtg gccctggcct ggtgctagga ctgcgcgcct 480
cccctcagta cccgcggaca ccctgggctt ccctgggccc agcatctgcc tggggcctcg 540
ccctgggctc cccctcctga cccccacctt gcgccccttc ccggtgttcc cggggcgctg 600
ccgggccctg gggcctgcgg ggcgcgggcg gctcttggct gggccattct ttcccggccc 660
cctcctccct tccgtttccg tggccgtgcg gccggctaga ggctgcggcc cagcgcggag 720
caggggggct ggcaggcgtc ggggcggtcg ggccggtccc gcccgcccct tcccctccac 780
aggcccgccc cggggcctgg gccaactgaa accgcgggag gaggaagcgc ggaatcagga 840
actggccggg gtccgcaccg ggcctgagtc ggtccgaggc cgtcccagga gcagctgccc 900
gaagggcgaa ttgggggatc ccccgggcta atgccaactt tgtacaaaaa agcaggctcc 960
accatgctgg gcctgcgccc cccacttctc gccctggtgg ggctgctctc cctcgggtgc 1020
gtcctctctc aggagtgcac gaagttcaag gtcagcagct gccgggaatg catcgagtcg 1080
gggcccggct gcacctggtg ccagaagctg aacttcacag ggccggggga tcctgactcc 1140
attcgctgcg acacccggcc acagctgctc atgaggggct gtgcggctga cgacatcatg 1200
gaccccacaa gcctcgctga aacccaggaa gaccacaatg ggggccagaa gcagctgtcc 1260
ccacaaaaag tgacgcttta cctgcgacca ggccaggcag cagcgttcaa cgtgaccttc 1320
cggcgggcca agggctaccc catcgacctg tactatctga tggacctctc ctactccatg 1380
cttgatgacc tcaggaatgt caagaagcta ggtggcgacc tgctccgggc cctcaacgag 1440
atcaccgagt ccggccgcat tggcttcggg tccttcgtgg acaagaccgt gctgccgttc 1500
gtgaacacgc accctgataa gctgcgaaac ccatgcccca acaaggagaa agagtgccag 1560
cccccgtttg ccttcaggca cgtgctgaag ctgaccaaca actccaacca gtttcagacc 1620
gaggtcggga agcagctgat ttccggaaac ctggatgcac ccgagggtgg gctggacgcc 1680
atgatgcagg tcgccgcctg cccggaggaa atcggctggc gcaacgtcac gcggctgctg 1740
gtgtttgcca ctgatgacgg cttccatttc gcgggcgacg ggaagctggg cgccatcctg 1800
acccccaacg acggccgctg tcacctggag gacaacttgt acaagaggag caacgaattc 1860
gactacccat cggtgggcca gctggcgcac aagctggctg aaaacaacat ccagcccatc 1920
ttcgcggtga ccagtaggat ggtgaagacc tacgagaaac tcaccgagat catccccaag 1980
tcagccgtgg gggagctgtc tgaggactcc agcaatgtgg tccatctcat taagaatgct 2040
tacaataaac tctcctccag ggtattcctg gatcacaacg ccctccccga caccctgaaa 2100
gtcacctacg actccttctg cagcaatgga gtgacgcaca ggaaccagcc cagaggtgac 2160
tgtgatggcg tgcagatcaa tgtcccgatc accttccagg tgaaggtcac ggccacagag 2220
tgcatccagg agcagtcgtt tgtcatccgg gcgctgggct tcacggacat agtgaccgtg 2280
caggtccttc cccagtgtga gtgccggtgc cgggaccaga gcagagaccg cagcctctgc 2340
catggcaagg gcttcttgga gtgcggcatc tgcaggtgtg acactggcta cattgggaaa 2400
aactgtgagt gccagacaca gggccggagc agccaggagc tggaaggaag ctgccggaag 2460
gacaacaact ccatcatctg ctcagggctg ggggactgtg tctgcgggca gtgcctgtgc 2520
cacaccagcg acgtccccgg caagctgata tacgggcagt actgcgagtg tgacaccatc 2580
aactgtgagc gctacaacgg ccaggtctgc ggcggcccgg ggagggggct ctgcttctgc 2640
gggaagtgcc gctgccaccc gggctttgag ggctcagcgt gccagtgcga gaggaccact 2700
gagggctgcc tgaacccgcg gcgtgttgag tgtagtggtc gtggccggtg ccgctgcaac 2760
gtatgcgagt gccattcagg ctaccagctg cctctgtgcc aggagtgccc cggctgcccc 2820
tcaccctgtg gcaagtacat ctcctgcgcc gagtgcctga agttcgaaaa gggccccttt 2880
gggaagaact gcagcgcggc gtgtccgggc ctgcagctgt cgaacaaccc cgtgaagggc 2940
aggacctgca aggagaggga ctcagagggc tgctgggtgg cctacacgct ggagcagcag 3000
gacgggatgg accgctacct catctatgtg gatgagagcc gagagtgtgt ggcaggcccc 3060
aacatcgccg ccatcgtcgg gggcaccgtg gcaggcatcg tgctgatcgg cattctcctg 3120
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attaggaatt cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt 3360
tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg 3420
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gcc 3903
<210> 4
<211> 769
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Met Leu Gly Leu Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu Val Gly Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Cys Val Leu Ser Gln Glu Cys Thr Lys Phe Lys Val Ser Ser
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Cys Arg Glu Cys Ile Glu Ser Gly Pro Gly Cys Thr Trp Cys Gln Lys
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Leu Asn Phe Thr Gly Pro Gly Asp Pro Asp Ser Ile Arg Cys Asp Thr
50 55 60
Arg Pro Gln Leu Leu Met Arg Gly Cys Ala Ala Asp Asp Ile Met Asp
65 70 75 80
Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Gln Glu Asp His Asn Gly Gly Gln Lys
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Gln Leu Ser Pro Gln Lys Val Thr Leu Tyr Leu Arg Pro Gly Gln Ala
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Ala Ala Phe Asn Val Thr Phe Arg Arg Ala Lys Gly Tyr Pro Ile Asp
115 120 125
Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Leu Asp Asp Leu Arg
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Asn Val Lys Lys Leu Gly Gly Asp Leu Leu Arg Ala Leu Asn Glu Ile
145 150 155 160
Thr Glu Ser Gly Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Thr Val
165 170 175
Leu Pro Phe Val Asn Thr His Pro Asp Lys Leu Arg Asn Pro Cys Pro
180 185 190
Asn Lys Glu Lys Glu Cys Gln Pro Pro Phe Ala Phe Arg His Val Leu
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Lys Leu Thr Asn Asn Ser Asn Gln Phe Gln Thr Glu Val Gly Lys Gln
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Leu Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ala Pro Glu Gly Gly Leu Asp Ala Met
225 230 235 240
Met Gln Val Ala Ala Cys Pro Glu Glu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr
245 250 255
Arg Leu Leu Val Phe Ala Thr Asp Asp Gly Phe His Phe Ala Gly Asp
260 265 270
Gly Lys Leu Gly Ala Ile Leu Thr Pro Asn Asp Gly Arg Cys His Leu
275 280 285
Glu Asp Asn Leu Tyr Lys Arg Ser Asn Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val
290 295 300
Gly Gln Leu Ala His Lys Leu Ala Glu Asn Asn Ile Gln Pro Ile Phe
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Ala Val Thr Ser Arg Met Val Lys Thr Tyr Glu Lys Leu Thr Glu Ile
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Lys Asn Cys Ser Ala Ala Cys Pro Gly Leu Gln Leu Ser Asn Asn Pro
645 650 655
Val Lys Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Asp Ser Glu Gly Cys Trp Val
660 665 670
Ala Tyr Thr Leu Glu Gln Gln Asp Gly Met Asp Arg Tyr Leu Ile Tyr
675 680 685
Val Asp Glu Ser Arg Glu Cys Val Ala Gly Pro Asn Ile Ala Ala Ile
690 695 700
Val Gly Gly Thr Val Ala Gly Ile Val Leu Ile Gly Ile Leu Leu Leu
705 710 715 720
Val Ile Trp Lys Ala Leu Ile His Leu Ser Asp Leu Arg Glu Tyr Arg
725 730 735
Arg Phe Glu Lys Glu Lys Leu Lys Ser Gln Trp Asn Asn Asp Asn Pro
740 745 750
Leu Phe Lys Ser Ala Thr Thr Thr Val Met Asn Pro Lys Phe Ala Glu
755 760 765
Ser
<210> 5
<211> 2890
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pCCL-PGK-coRPKW-82-RO载体序列
<400> 5
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccg tcgacaccgg tgccaccatg 540
agcatccagg aaaatatcag ctctctgcag ctgcggtcct gggtgtccaa gagccagaga 600
gacctggcca agagcatcct gatcggagcc cctggcggac cagccggata cctgagaagg 660
gctagcgtgg cccagctgac ccaggaactg ggcaccgcct ttttccagca gcagcagctg 720
ccagccgcca tggccgacac ctttctggaa cacctgtgcc tgctggacat cgactctgag 780
cccgtggccg ccagaagcac cagcatcatt gccaccatcg gccctgccag cagaagcgtg 840
gagcggctga aagagatgat caaggccggc atgaatatcg cccggctgaa cttctcccac 900
ggcagccacg agtaccacgc agagagcatt gccaacgtcc gggaggccgt ggagagcttt 960
gccggcagcc ccctgagcta cagacccgtg gccattgccc tggacaccaa gggccccgag 1020
atcagaacag gaattctgca gggagggcct gagagcgagg tggagctggt gaagggcagc 1080
caagtgctgg tgaccgtgga ccccgccttc agaaccagag gcaacgccaa cacagtgtgg 1140
gtggactacc ccaacatcgt gcgggtggtg cctgtgggcg gcagaatcta catcgacgac 1200
ggcctgatca gcctggtggt gcagaagatc ggacctgagg gcctggtgac ccaggtcgag 1260
aatggcggcg tgctgggcag cagaaagggc gtgaatctgc caggcgccca ggtggacctg 1320
cctggcctgt ctgagcagga cgtgagagac ctgagatttg gcgtggagca cggcgtggac 1380
atcgtgttcg ccagcttcgt gcggaaggcc tctgatgtgg ccgccgtgag agccgctctg 1440
ggccctgaag gccacggcat caagatcatc agcaagatcg agaaccacga gggcgtgaag 1500
cggttcgacg agatcctgga agtgtccgac ggcatcatgg tggccagagg cgacctgggc 1560
atcgagatcc ccgccgagaa ggtgttcctg gcccagaaaa tgatgatcgg acggtgcaac 1620
ctggccggca aacctgtggt gtgcgccacc cagatgctgg aaagcatgat caccaagccc 1680
agacccacca gagccgagac aagcgacgtg gccaacgccg tgctggatgg cgctgactgc 1740
atcatgctgt ccggcgagac agccaagggc aacttccccg tggaggccgt gaagatgcag 1800
cacgccattg ccagagaagc cgaggccgcc gtgtaccacc ggcagctgtt cgaggaactg 1860
cggagagccg cccctctgag cagagatccc accgaagtga ccgccatcgg agccgtggaa 1920
gccgccttca agtgctgcgc cgctgcaatc atcgtgctga ccaccacagg cagaagcgcc 1980
cagctgctgt ccagatacag acccagagcc gccgtgatcg ccgtgacaag atccgcccag 2040
gccgctagac aggtccacct gtgcagaggc gtgttccccc tgctgtaccg ggagcctccc 2100
gaggccatct gggccgacga cgtggacaga cgggtgcagt tcggcatcga gagcggcaag 2160
ctgcggggct tcctgagagt gggcgacctg gtgatcgtgg tgacaggctg gcggcctggc 2220
agcggctaca ccaacatcat gagggtgctg tccatcagct gaccgcggtc tagaggatcc 2280
cccgggctgc aggaattcga gcatcttacc gccatttatt cccatatttg ttctgttttt 2340
cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat ggtggggcaa tcatttacat 2400
ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac aagacaaaca tgttaagaaa 2460
ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 2520
agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta 2580
atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa 2640
tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg 2700
tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc 2760
ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc 2820
cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg 2880
gggaagggcc 2890
<210> 6
<211> 574
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Met Ser Ile Gln Glu Asn Ile Ser Ser Leu Gln Leu Arg Ser Trp Val
1 5 10 15
Ser Lys Ser Gln Arg Asp Leu Ala Lys Ser Ile Leu Ile Gly Ala Pro
20 25 30
Gly Gly Pro Ala Gly Tyr Leu Arg Arg Ala Ser Val Ala Gln Leu Thr
35 40 45
Gln Glu Leu Gly Thr Ala Phe Phe Gln Gln Gln Gln Leu Pro Ala Ala
50 55 60
Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Leu Cys Leu Leu Asp Ile Asp Ser
65 70 75 80
Glu Pro Val Ala Ala Arg Ser Thr Ser Ile Ile Ala Thr Ile Gly Pro
85 90 95
Ala Ser Arg Ser Val Glu Arg Leu Lys Glu Met Ile Lys Ala Gly Met
100 105 110
Asn Ile Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Ser His Glu Tyr His Ala
115 120 125
Glu Ser Ile Ala Asn Val Arg Glu Ala Val Glu Ser Phe Ala Gly Ser
130 135 140
Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Val Ala Ile Ala Leu Asp Thr Lys Gly Pro
145 150 155 160
Glu Ile Arg Thr Gly Ile Leu Gln Gly Gly Pro Glu Ser Glu Val Glu
165 170 175
Leu Val Lys Gly Ser Gln Val Leu Val Thr Val Asp Pro Ala Phe Arg
180 185 190
Thr Arg Gly Asn Ala Asn Thr Val Trp Val Asp Tyr Pro Asn Ile Val
195 200 205
Arg Val Val Pro Val Gly Gly Arg Ile Tyr Ile Asp Asp Gly Leu Ile
210 215 220
Ser Leu Val Val Gln Lys Ile Gly Pro Glu Gly Leu Val Thr Gln Val
225 230 235 240
Glu Asn Gly Gly Val Leu Gly Ser Arg Lys Gly Val Asn Leu Pro Gly
245 250 255
Ala Gln Val Asp Leu Pro Gly Leu Ser Glu Gln Asp Val Arg Asp Leu
260 265 270
Arg Phe Gly Val Glu His Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Ser Phe Val
275 280 285
Arg Lys Ala Ser Asp Val Ala Ala Val Arg Ala Ala Leu Gly Pro Glu
290 295 300
Gly His Gly Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu Asn His Glu Gly Val
305 310 315 320
Lys Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Val Ser Asp Gly Ile Met Val Ala
325 330 335
Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu Lys Val Phe Leu Ala
340 345 350
Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Leu Ala Gly Lys Pro Val Val
355 360 365
Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Thr Lys Pro Arg Pro Thr
370 375 380
Arg Ala Glu Thr Ser Asp Val Ala Asn Ala Val Leu Asp Gly Ala Asp
385 390 395 400
Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Pro Val Glu
405 410 415
Ala Val Lys Met Gln His Ala Ile Ala Arg Glu Ala Glu Ala Ala Val
420 425 430
Tyr His Arg Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg Arg Ala Ala Pro Leu Ser
435 440 445
Arg Asp Pro Thr Glu Val Thr Ala Ile Gly Ala Val Glu Ala Ala Phe
450 455 460
Lys Cys Cys Ala Ala Ala Ile Ile Val Leu Thr Thr Thr Gly Arg Ser
465 470 475 480
Ala Gln Leu Leu Ser Arg Tyr Arg Pro Arg Ala Ala Val Ile Ala Val
485 490 495
Thr Arg Ser Ala Gln Ala Ala Arg Gln Val His Leu Cys Arg Gly Val
500 505 510
Phe Pro Leu Leu Tyr Arg Glu Pro Pro Glu Ala Ile Trp Ala Asp Asp
515 520 525
Val Asp Arg Arg Val Gln Phe Gly Ile Glu Ser Gly Lys Leu Arg Gly
530 535 540
Phe Leu Arg Val Gly Asp Leu Val Ile Val Val Thr Gly Trp Arg Pro
545 550 555 560
Gly Ser Gly Tyr Thr Asn Ile Met Arg Val Leu Ser Ile Ser
565 570
<210> 7
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PKLR多核苷酸序列
<400> 7
atggtctgct tcagactgtt ccctgtccct ggatctggtc tggtgcttgt gtgcttggtg 60
ctgggtgctg tgagatccta tgcccttgag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120
tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgagactac caacaagacc 180
tacaagactg tgaccatctc agaccatggc actgtcacct acaatggatc aatctgtggt 240
gatgatcaga atggcccaaa gatagcagtg cagtttgggc ccggtttttc ctggattgct 300
aacttcacca aggcagcctc cacctacagc attgactcag tcagcttcag ctacaacact 360
ggggataaca ccaccttccc tgacgcagag gacaagggaa tccttactgt ggacgaactc 420
ctggcaatca gaatccccct taacgacctg ttcagatgca actccctttc aacccttgaa 480
aagaatgatg tggtgcaaca ctattgggac gtcctggtgc aagcctttgt gcagaatggg 540
acagtgagta ccaacgagtt cctctgtgac aaggacaaga ccagcactgt ggcccccact 600
atccacacca ctgtgcccag ccctaccact acccccaccc ctaaagagaa gccagaagct 660
ggaacctact cagtcaacaa tggaaatgac acatgcctcc ttgccaccat gggactgcag 720
ctgaacatca ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca tcaaccctaa caccactcat 780
agcactggga gctgcagatc acatacagct ctgctgaggc tcaactcctc caccatcaag 840
tacctggact ttgtgtttgc tgtgaagaat gagaacaggt tctacctcaa ggaagtgaac 900
atttccatgt acctggtcaa tggttcagtg ttctctattg ccaacaacaa tctgagctac 960
tgggatgcac ccctgggatc ctcctacatg tgcaacaagg agcagactgt gagtgtgtca 1020
ggtgcttttc agatcaacac ttttgacctg agggtgcagc ccttcaatgt gactcaggga 1080
aagtactcca ctgcacaaga gtgttccttg gatgatgaca ctatcctcat ccccattatt 1140
gtgggagctg gactgtcagg attgattata gtgattgtga ttgcttatgt gattggaagg 1200
agaaagagct atgctggcta ccagaccctg taa 1233
<210> 8
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PKLR多核苷酸序列
<400> 8
atggtgtgct ttagactgtt tcctgtgcct ggttcagggc tggtcctggt ctgtctggtg 60
ctgggggctg tcagaagcta tgccttggag ctgaacctca ctgatagtga aaatgccact 120
tgtctgtatg ctaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgaaaccac caacaagact 180
tacaaaacag tgaccatctc agatcatgga actgtgacct acaacggcag catttgtgga 240
gacgaccaga acggaccaaa aatcgctgtc caatttgggc ctggattctc ctggattgcc 300
aatttcacta aagctgcctc cacatattca attgactcag tgtccttctc ctacaacact 360
ggggacaaca ctactttccc tgatgctgaa gataagggaa tcttgacagt ggatgagctg 420
ctggctatca ggatcccttt gaatgacctg tttaggtgta attcactgag cactctggag 480
aagaacgacg tggtgcagca ctactgggac gtgctggtgc aggcctttgt gcagaacggc 540
actgtgtcca ccaacgaatt cctgtgtgat aaggacaaaa cttccactgt ggcacctaca 600
attcacacta ctgtgccttc acctaccacc actccaactc caaaggaaaa gcctgaagca 660
ggaacctact ctgtgaacaa tggcaatgat acctgtctgt tggccaccat gggcctccaa 720
ctgaacatta ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca ttaaccccaa cactacccac 780
tccactggca gctgtagatc acacacagcc ttgctcagac tgaatagcag caccatcaag 840
tatttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gaaaacaggt tctacctgaa ggaagtcaac 900
atctcaatgt acctggtgaa cggctcagtg ttcagcattg ccaacaacaa cctctcctat 960
tgggacgctc cactggggag cagctacatg tgtaacaagg aacagactgt gtcagtgtca 1020
ggagccttcc agattaacac ctttgatctg agggtccaac cctttaatgt cactcaagga 1080
aagtatagca ctgcccagga gtgctccctg gatgatgaca ccattctgat tccaatcatt 1140
gtgggtgcag gactttctgg gcttattatt gtgattgtga ttgcctatgt gattggcaga 1200
aggaaatcct atgcagggta ccaaactctg taa 1233
<210> 9
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PKLR多核苷酸序列
<400> 9
atggtctgtt ttaggctgtt ccctgtccct ggttcaggac tggtcttagt gtgtctggtg 60
cttggagctg tcagaagcta tgccctggag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120
tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtcagat atgaaaccac caacaagacc 180
tataagactg tgaccatctc agaccatggc actgtgactt acaatgggtc aatttgtgga 240
gatgaccaga atggccctaa gatagctgtc cagtttggtc caggattcag ctggattgcc 300
aacttcacca aggcagccag cacctacagc attgactctg tgtccttctc ctacaacaca 360
ggagacaaca ccactttccc tgatgcagag gacaaaggta tcctgactgt ggatgagttg 420
ctggcaatca ggatcccact gaacgatctg ttcaggtgca actcactgtc cactctggaa 480
aagaatgatg tggtgcagca ctattgggat gtgctagtcc aggcctttgt ccagaatggg 540
actgtgtcaa ctaatgagtt cctgtgtgac aaggacaaga caagcactgt agcccccact 600
atccatacca cagtacctag ccccaccact actccaaccc ccaaggagaa gcctgaggct 660
ggcacctact cagtgaacaa tgggaatgac acctgtttgc tggccactat gggactccaa 720
ctgaacatca cccaggacaa agtggcctct gtgatcaata tcaatcccaa caccacccac 780
agcactgggt cctgcagaag ccacactgcc ctcctgaggc tcaactcatc aactatcaag 840
tacttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gagaacagat tctacctcaa agaggtcaac 900
atttcaatgt acctggtgaa tgggagtgtg ttctccattg ctaacaacaa cctgagctac 960
tgggatgccc ctctgggctc ctcatacatg tgcaacaagg aacagactgt gagtgtgtca 1020
ggggccttcc agatcaacac ttttgacctg agagtgcagc cctttaatgt gacacaggga 1080
aagtacagca ctgctcagga gtgcagcctg gatgatgaca ctatcctgat ccctatcatt 1140
gtgggggcag gcctgtctgg actcattatt gtgattgtga ttgcctatgt gatagggaga 1200
aggaagtctt atgctggata ccagaccctg taa 1233
<210> 10
<211> 3384
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pRRL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre载体序列
<400> 10
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtgtcgtga 240
cgcgggatcc gccaccatgg gctccatgtt tcggagcgag gaggtggccc tggtccagct 300
ctttctgccc acagcggctg cctacacctg cgtgagtcgg ctgggcgagc tgggcctcgt 360
ggagttcaga gacctcaacg cctcggtgag cgccttccag agacgctttg tggttgatgt 420
tcggcgctgt gaggagctgg agaagacctt caccttcctg caggaggagg tgcggcgggc 480
tgggctggtc ctgcccccgc caaaggggag gctgccggca cccccacccc gggacctgct 540
gcgcatccag gaggagacgg agcgcctggc ccaggagctg cgggatgtgc ggggcaacca 600
gcaggccctg cgggcccagc tgcaccagct gcagctccac gccgccgtgc tacgccaggg 660
ccatgaacct cagctggcag ccgcccacac agatggggcc tcagagagga cgcccctgct 720
ccaggccccc ggggggccgc accaggacct gagggtcaac tttgtggcag gtgccgtgga 780
gccccacaag gcccctgccc tagagcgcct gctctggagg gcctgcagag gcttcctcat 840
tgccagcttc agggagctgg agcagccgct ggagcacccc gtgacgggcg agccagccac 900
gtggatgacc ttcctcatct cctactgggg tgagcagatc ggacagaaga tccgcaagat 960
cacggactgc ttccactgcc acgtcttccc gtttctgcag caggaggagg cccgcctcgg 1020
ggccctgcag cagctgcaac agcagagcca ggagctgcag gaggtcctcg gggagacaga 1080
gcggttcctg agccaggtgc taggccgggt gctgcagctg ctgccgccag ggcaggtgca 1140
ggtccacaag atgaaggccg tgtacctggc cctgaaccag tgcagcgtga gcaccacgca 1200
caagtgcctc attgccgagg cctggtgctc tgtgcgagac ctgcccgccc tgcaggaggc 1260
cctgcgggac agctcgatgg aggagggagt gagtgccgtg gctcaccgca tcccctgccg 1320
ggacatgccc cccacactca tccgcaccaa ccgcttcacg gccagcttcc agggcatcgt 1380
ggatgcctac ggcgtgggcc gctaccagga ggtcaacccc gctccctaca ccatcatcac 1440
cttccccttc ctgtttgctg tgatgttcgg ggatgtgggc cacgggctgc tcatgttcct 1500
cttcgccctg gccatggtcc ttgcggagaa ccgaccggct gtgaaggccg cgcagaacga 1560
gatctggcag actttcttca ggggccgcta cctgctcctg cttatgggcc tgttctccat 1620
ctacaccggc ttcatctaca acgagtgctt cagtcgcgcc accagcatct tcccctcggg 1680
ctggagtgtg gccgccatgg ccaaccagtc tggctggagt gatgcattcc tggcccagca 1740
cacgatgctt accctggacc ccaacgtcac cggtgtcttc ctgggaccct acccctttgg 1800
catcgatcct atttggagcc tggctgccaa ccacttgagc ttcctcaact ccttcaagat 1860
gaagatgtcc gtcatcctgg gcgtcgtgca catggccttt ggggtggtcc tcggagtctt 1920
caaccacgtg cactttggcc agaggcaccg gctgctgctg gagacgctgc cggagctcac 1980
cttcctgctg ggactcttcg gttacctcgt gttcctagtc atctacaagt ggctgtgtgt 2040
ctgggctgcc agggccgcct cggcccccag catcctcatc cacttcatca acatgttcct 2100
cttctcccac agccccagca acaggctgct ctacccccgg caggaggtgg tccaggccac 2160
gctggtggtc ctggccttgg ccatggtgcc catcctgctg cttggcacac ccctgcacct 2220
gctgcaccgc caccgccgcc gcctgcggag gaggcccgct gaccgacagg aggaaaacaa 2280
ggccgggttg ctggacctgc ctgacgcatc tgtgaatggc tggagctccg atgaggaaaa 2340
ggcagggggc ctggatgatg aagaggaggc cgagctcgtc ccctccgagg tgctcatgca 2400
ccaggccatc cacaccatcg agttctgcct gggctgcgtc tccaacaccg cctcctacct 2460
gcgcctgtgg gccctgagcc tggcccacgc ccagctgtcc gaggttctgt gggccatggt 2520
gatgcgcata ggcctgggcc tgggccggga ggtgggcgtg gcggctgtgg tgctggtccc 2580
catctttgcc gcctttgccg tgatgaccgt ggctatcctg ctggtgatgg agggactctc 2640
agccttcctg cacgccctgc ggctgcactg ggtggaattc cagaacaagt tctactcagg 2700
cacgggctac aagctgagtc ccttcacctt cgctgccaca gatgactagt aagtcgacgg 2760
atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt tatacccata tttgttctgt 2820
ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca aaatggtggg gcaatcattt 2880
acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg ccacaagaca aacatgttaa 2940
gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa cctctggatt acaaaatttg 3000
tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt acgctgtgtg gatatgctgc 3060
tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct ttcgttttct cctccttgta 3120
taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtccgtc aacgtggcgt 3180
ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg ggcattgcca ccacctgtca 3240
actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc acggcagaac tcatcgccgc 3300
ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc actgataatt ccgtggtgtt 3360
gtcggggaag ctgacgtcct ttcg 3384
<210> 11
<211> 830
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Gly Ser Met Phe Arg Ser Glu Glu Val Ala Leu Val Gln Leu Phe
1 5 10 15
Leu Pro Thr Ala Ala Ala Tyr Thr Cys Val Ser Arg Leu Gly Glu Leu
20 25 30
Gly Leu Val Glu Phe Arg Asp Leu Asn Ala Ser Val Ser Ala Phe Gln
35 40 45
Arg Arg Phe Val Val Asp Val Arg Arg Cys Glu Glu Leu Glu Lys Thr
50 55 60
Phe Thr Phe Leu Gln Glu Glu Val Arg Arg Ala Gly Leu Val Leu Pro
65 70 75 80
Pro Pro Lys Gly Arg Leu Pro Ala Pro Pro Pro Arg Asp Leu Leu Arg
85 90 95
Ile Gln Glu Glu Thr Glu Arg Leu Ala Gln Glu Leu Arg Asp Val Arg
100 105 110
Gly Asn Gln Gln Ala Leu Arg Ala Gln Leu His Gln Leu Gln Leu His
115 120 125
Ala Ala Val Leu Arg Gln Gly His Glu Pro Gln Leu Ala Ala Ala His
130 135 140
Thr Asp Gly Ala Ser Glu Arg Thr Pro Leu Leu Gln Ala Pro Gly Gly
145 150 155 160
Pro His Gln Asp Leu Arg Val Asn Phe Val Ala Gly Ala Val Glu Pro
165 170 175
His Lys Ala Pro Ala Leu Glu Arg Leu Leu Trp Arg Ala Cys Arg Gly
180 185 190
Phe Leu Ile Ala Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gln Pro Leu Glu His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Glu Pro Ala Thr Trp Met Thr Phe Leu Ile Ser Tyr Trp
210 215 220
Gly Glu Gln Ile Gly Gln Lys Ile Arg Lys Ile Thr Asp Cys Phe His
225 230 235 240
Cys His Val Phe Pro Phe Leu Gln Gln Glu Glu Ala Arg Leu Gly Ala
245 250 255
Leu Gln Gln Leu Gln Gln Gln Ser Gln Glu Leu Gln Glu Val Leu Gly
260 265 270
Glu Thr Glu Arg Phe Leu Ser Gln Val Leu Gly Arg Val Leu Gln Leu
275 280 285
Leu Pro Pro Gly Gln Val Gln Val His Lys Met Lys Ala Val Tyr Leu
290 295 300
Ala Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Thr Thr His Lys Cys Leu Ile Ala
305 310 315 320
Glu Ala Trp Cys Ser Val Arg Asp Leu Pro Ala Leu Gln Glu Ala Leu
325 330 335
Arg Asp Ser Ser Met Glu Glu Gly Val Ser Ala Val Ala His Arg Ile
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Met Pro Pro Thr Leu Ile Arg Thr Asn Arg Phe Thr
355 360 365
Ala Ser Phe Gln Gly Ile Val Asp Ala Tyr Gly Val Gly Arg Tyr Gln
370 375 380
Glu Val Asn Pro Ala Pro Tyr Thr Ile Ile Thr Phe Pro Phe Leu Phe
385 390 395 400
Ala Val Met Phe Gly Asp Val Gly His Gly Leu Leu Met Phe Leu Phe
405 410 415
Ala Leu Ala Met Val Leu Ala Glu Asn Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala
420 425 430
Gln Asn Glu Ile Trp Gln Thr Phe Phe Arg Gly Arg Tyr Leu Leu Leu
435 440 445
Leu Met Gly Leu Phe Ser Ile Tyr Thr Gly Phe Ile Tyr Asn Glu Cys
450 455 460
Phe Ser Arg Ala Thr Ser Ile Phe Pro Ser Gly Trp Ser Val Ala Ala
465 470 475 480
Met Ala Asn Gln Ser Gly Trp Ser Asp Ala Phe Leu Ala Gln His Thr
485 490 495
Met Leu Thr Leu Asp Pro Asn Val Thr Gly Val Phe Leu Gly Pro Tyr
500 505 510
Pro Phe Gly Ile Asp Pro Ile Trp Ser Leu Ala Ala Asn His Leu Ser
515 520 525
Phe Leu Asn Ser Phe Lys Met Lys Met Ser Val Ile Leu Gly Val Val
530 535 540
His Met Ala Phe Gly Val Val Leu Gly Val Phe Asn His Val His Phe
545 550 555 560
Gly Gln Arg His Arg Leu Leu Leu Glu Thr Leu Pro Glu Leu Thr Phe
565 570 575
Leu Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Val Phe Leu Val Ile Tyr Lys Trp
580 585 590
Leu Cys Val Trp Ala Ala Arg Ala Ala Ser Ala Pro Ser Ile Leu Ile
595 600 605
His Phe Ile Asn Met Phe Leu Phe Ser His Ser Pro Ser Asn Arg Leu
610 615 620
Leu Tyr Pro Arg Gln Glu Val Val Gln Ala Thr Leu Val Val Leu Ala
625 630 635 640
Leu Ala Met Val Pro Ile Leu Leu Leu Gly Thr Pro Leu His Leu Leu
645 650 655
His Arg His Arg Arg Arg Leu Arg Arg Arg Pro Ala Asp Arg Gln Glu
660 665 670
Glu Asn Lys Ala Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Ala Ser Val Asn Gly
675 680 685
Trp Ser Ser Asp Glu Glu Lys Ala Gly Gly Leu Asp Asp Glu Glu Glu
690 695 700
Ala Glu Leu Val Pro Ser Glu Val Leu Met His Gln Ala Ile His Thr
705 710 715 720
Ile Glu Phe Cys Leu Gly Cys Val Ser Asn Thr Ala Ser Tyr Leu Arg
725 730 735
Leu Trp Ala Leu Ser Leu Ala His Ala Gln Leu Ser Glu Val Leu Trp
740 745 750
Ala Met Val Met Arg Ile Gly Leu Gly Leu Gly Arg Glu Val Gly Val
755 760 765
Ala Ala Val Val Leu Val Pro Ile Phe Ala Ala Phe Ala Val Met Thr
770 775 780
Val Ala Ile Leu Leu Val Met Glu Gly Leu Ser Ala Phe Leu His Ala
785 790 795 800
Leu Arg Leu His Trp Val Glu Phe Gln Asn Lys Phe Tyr Ser Gly Thr
805 810 815
Gly Tyr Lys Leu Ser Pro Phe Thr Phe Ala Ala Thr Asp Asp
820 825 830

Claims (96)

1.一种造血细胞的基因修饰的方法，所述方法包括：
(a)提供造血细胞；
(b)使所述造血细胞与泊洛沙姆接触；
(c)使所述造血细胞与前列腺素E2(PGE2)或其衍生物接触；以及
(d)使所述造血细胞与重组逆转录病毒载体接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组逆转录病毒载体是重组慢病毒载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述造血细胞已经被操纵。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述泊洛沙姆选自由下列各项组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是经修饰的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是未经修饰的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括使所述造血细胞与硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白片段，任选地RetroNectinTM接触。
11.根据权利要求1或10所述的方法，其中所述接触步骤是在相同或重叠的时间段期间执行的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为约10μg/mL。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约1000μg/mL。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为约4μg/mL。
18.一种增强造血细胞的重组逆转录病毒载体介导的基因修饰的方法，所述方法包括：
(a)使造血细胞与有效量的PGE2或其衍生物，任选地人PGE2或16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)和有效量的泊洛沙姆，任选地泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)离体接触；以及
(b)使所述造血细胞与重组逆转录病毒载体接触，所述重组逆转录病毒载体包含含有所关注的基因或编码所关注的多肽的多核苷酸，
其中与在不存在所述PGE2或其衍生物和所述泊洛沙姆的情况下用所述重组逆转录病毒载体转导造血细胞相比，所述重组逆转录病毒载体的病毒转导功效得到增强。
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括使所述造血细胞与有效量的硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白多肽或其变体离体接触。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述所关注的基因补足在与单基因遗传疾病或病症相关的基因中的缺陷。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述所关注的基因或所关注的多肽选自由下列各项组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法预防或改善单基因遗传疾病或病症。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述单基因疾病或病症选自由下列各项组成的组：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地造血细胞、骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
25.一种用于造血细胞的重组逆转录病毒载体介导的基因修饰的方法，所述方法包括：
(a)由从用G-CSF或其类似物(任选地，非格司亭、沙格司亭或培非格司亭)和/或普乐沙福治疗的受试者获得的生物样品(任选地，外周血)制备CD34富集细胞；以及
(b)用重组逆转录病毒载体对所述CD34富集细胞进行基因修饰，所述重组逆转录病毒载体包含多核苷酸和与其操作性地连接的真核活性启动子序列，所述多核苷酸编码范可尼贫血互补群(FANC)基因、ITGB2、R型丙酮酸激酶、OSTM1、TCIRG1或者编码其功能变体或片段的基因；
其中所述基因修饰步骤包括使所述CD34富集细胞与所述重组逆转录病毒载体、PGE2和泊洛沙姆以及任选地硫酸鱼精蛋白和/或重组纤连蛋白多肽或其变体接触。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述CD34富集细胞选自由下列各项组成的组：造血细胞、骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
27.一种用慢病毒载体转导造血细胞的方法，所述方法包括在包含慢病毒载体的液体培养基中培养所述细胞，其中所述液体培养基包含泊洛沙姆和前列腺素E2(PGE2)或其衍生物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述液体培养基包含硫酸鱼精蛋白。
29.一种用慢病毒载体转导造血细胞的方法，所述方法包括：
(a)在包含泊洛沙姆和前列腺素E2(PGE2)或其衍生物的溶液中提供慢病毒载体；
(b)在液体培养基中提供造血细胞；以及
(c)将所述溶液添加到液体培养基中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述液体培养基包含硫酸鱼精蛋白。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体是重组慢病毒载体。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述造血细胞已经被操纵。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆选自由下列各项组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。
35.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是经修饰的。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)。
38.根据权利要求25至37中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是未经修饰的。
39.根据权利要求25至38中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL。
40.根据权利要求25至39中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为约10μg/mL。
41.根据权利要求25至40中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL。
42.根据权利要求25至41中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约1000μg/mL。
43.根据权利要求25至42中任一项所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL。
44.根据权利要求25至43中任一项所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为约4μg/mL。
45.根据权利要求25至44中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码从由下列各项组成的组中选择的所关注的多肽的序列：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。
46.根据权利要求25至45中任一项所述的方法，其中所述方法预防或改善单基因遗传疾病或病症。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述单基因疾病或病症选自由下列各项组成的组：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。
48.根据权利要求25至47中任一项所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地造血细胞、骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
49.一种治疗、改善和/或预防有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供用逆转录病毒载体转导的造血细胞，所述逆转录病毒载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与启动子序列可操作地连接的编码治疗性蛋白质的序列，其中所述细胞是通过使所述细胞与重组逆转录病毒载体以及两种或更多种、三种或更多种或者四种或更多种从由下列各项组成的组中选择的转导增强子接触来转导的：前列腺素E2(PGE2)或其衍生物、泊洛沙姆、重组纤连蛋白片段和硫酸鱼精蛋白。
50.根据权利要求49所述的方法，其中使所述细胞与PGE2和所述泊洛沙姆接触。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述重组逆转录病毒载体是重组慢病毒载体。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞。
53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆选自由下列各项组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是经修饰的。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)。
57.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是未经修饰的。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的方法，其包括使所述造血细胞与硫酸鱼精蛋白接触。
59.根据权利要求49至58中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL。
60.根据权利要求49至59中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为约10μg/mL。
61.根据权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL。
62.根据权利要求49至61中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约1000μg/mL。
63.根据权利要求49至62中任一项所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL。
64.根据权利要求49至63中任一项所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为约4μg/mL。
65.根据权利要求49至64中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸补足在与单基因遗传疾病或病症相关的基因中的缺陷。
66.根据权利要求49至65中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质选自由下列各项组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。
67.根据权利要求49至66中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是单基因遗传疾病或病症。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述单基因疾病或病症选自由下列各项组成的组：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。
69.根据权利要求49至68中任一项所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地造血细胞、骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
70.根据权利要求49至69中任一项所述的方法，其中所述造血细胞具有至少1.0、至少1.5、至少2.0或至少2.5的VCN/细胞。
71.根据权利要求49至70中任一项所述的方法，其中所述造血细胞具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的转导效率。
72.一种产生造血细胞群体的方法，所述造血细胞群体包含至少80％或至少90％基因修饰的造血细胞，所述方法包括：使造血细胞与重组逆转录病毒载体(任选地，慢病毒载体)离体接触，所述重组逆转录病毒载体包含含有所关注的基因或编码所关注的多肽的多核苷酸，其中所述接触在存在PGE2或其衍生物，任选地人PGE2或16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)，和泊洛沙姆，任选地泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)的情况下发生。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述泊洛沙姆选自由下列各项组成的组：泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。
74.根据权利要求72至73中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆338(LentiBOOSTTM)。
75.根据权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是经修饰的。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是16,16-二甲基PGE2(dmPGE2)。
77.根据权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物是未经修饰的。
78.根据权利要求72至77中任一项所述的方法，其进一步包括使所述造血细胞与硫酸鱼精蛋白接触。
79.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为5-30μg/mL。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述PGE2或其衍生物的浓度为约10μg/mL。
81.根据权利要求72至80中任一项所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为200-1200μg/mL。
82.根据权利要求49至81所述的方法，其中所述泊洛沙姆的浓度为约1000μg/mL。
83.根据权利要求72至82中任一项所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为4-10μg/mL。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述硫酸鱼精蛋白的浓度为约4μg/mL。
85.根据权利要求72至84中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸补足在与单基因遗传疾病或病症相关的基因中的缺陷。
86.根据权利要求72至85中任一项所述的方法，其中所述所关注的多肽选自由下列各项组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述疾病或病症是单基因遗传疾病或病症。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述单基因疾病或病症选自由下列各项组成的组：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。
89.根据权利要求72至88中任一项所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
90.根据权利要求49至69中任一项所述的方法，其中所述造血细胞群体具有至少1.0、至少1.5、至少2.0或至少2.5的VCN/细胞。
91.一种造血细胞群体，其包括至少80％或至少90％基因修饰的造血细胞，其中所述细胞群体通过根据权利要求72至90中任一项所述的方法产生。
92.一种治疗有此需要的受试者中的遗传疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供根据权利要求91所述的造血细胞群体，其中在与所述逆转录病毒载体离体接触之前，从所述受试者获得所述造血细胞，并且其中所述所关注的基因编码由于所述遗传疾病或病症而在所述受试者中突变或缺乏的功能性多肽。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述多肽选自由下列各项组成的组：RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述疾病或病症是单基因遗传疾病或病症。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述单基因疾病或病症选自由下列各项组成的组：范可尼贫血、I型白细胞粘附缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症和婴儿恶性骨硬化病。
96.根据权利要求92至94中任一项所述的方法，其中所述造血细胞是CD34富集细胞，任选地骨髓(BM)源性细胞、脐带血(CB)源性细胞或动员的外周血(mPB)细胞。
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