WO2018088519A1 - 遺伝子導入細胞の製造方法 - Google Patents

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智之 中石
達也 馬渡
寛士 北
北野　光昭
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株式会社カネカ
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    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a gene-transferred cell, which comprises introducing a foreign gene into a target cell using a virus containing a chimeric envelope protein. More specifically, the present invention relates to a method for producing a gene-transferred cell, which comprises performing gene transfer using a virus containing a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • virus-derived vectors are used for the purpose of introducing and expressing a target gene in eukaryotic cells.
  • a viral vector can be prepared by inserting a target gene operably linked to a promoter having a function in a target cell into a viral gene.
  • Viral vectors infect target cells and can express the target gene instead of the viral gene. Since not all viral genes are present in the viral vector, no viral particles are produced when the viral vector infects target cells.
  • Viruses used for infection of target cells of mammals such as humans include herpes viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and retroviruses.
  • Patent Document 1 discloses a viral vector for transducing target cells, which contains a gene encoding a chimeric envelope protein containing a portion of the IgG binding domain of protein A, wherein the envelope protein is murine leukemia virus or avian.
  • the above viral vectors are described which contain a portion of the leukemia virus gp70 protein and which function to direct assembly of the fragment into viral particles.
  • Non-Patent Document 1 a plasmid that expresses a protein A Z domain and VSV-G fusion protein is prepared by inserting the protein A Z domain expressed gene sequence into the VSV-G expression plasmid in the outer coat. The plasmid is then introduced into 293FT cells, which are virus vector producing cells, to produce a lentiviral vector expressing the target coat protein. Thereafter, it is described that the above-mentioned lentiviral vector is added to a plate coated with a human IgG antibody, washed, and then infected with the viral vector by seeding the plate with adherent cells.
  • an antibody is immobilized on the surface of the plate
  • the lentiviral vector is concentrated on the surface of the plate using the interaction between the antibody and Z domain
  • the virus vector is infected through adhesion of adherent cells to the surface of the plate. It is described.
  • Patent Document 1 a retrovirus containing a chimeric protein including the gp70 protein of mouse leukemia virus or avian leukemia virus is used, but there is a problem that the types of target cells are limited.
  • target cells which are adherent cells, are seeded on a virus-fixed plate, and gene transfer is performed, and virus infection of target cells is not mediated by antibodies. Therefore, the method of Non-Patent Document 1 is difficult to apply to cells other than adherent cells (for example, floating cells), and gene transfer is difficult because the directivity of antibodies is not used in virus infection. It is also difficult to introduce a gene into human primary cells that are said to be.
  • the present invention is to solve the problem to be solved by providing a method for producing a gene-introduced cell, which can efficiently introduce a gene even in any number of cells, particularly human primary cells, regardless of the type of cell.
  • the present invention provides a virus comprising a chimeric protein of antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein, and gene therapy comprising the virus, which can be used in the above-described method for producing a transgenic cell.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • Providing an agent is a problem to be solved.
  • this invention makes it the problem which should be solved to provide the gene transfer cell obtained by the manufacturing method of said gene transfer cell.
  • the inventors of the present invention are specific to a virus containing a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus GV (VSV-G) protein, a target cell and the target cell. It has been found that a target cell can be infected with a virus with high efficiency by bringing it into contact with a target cell containing a specific antibody and / or a membrane-type antibody, whereby a gene can be introduced into the target cell.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus GV
  • a virus comprising a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein and a foreign gene;
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • a target cell and a target cell comprising an antibody specific for the target cell and / or a membrane-type antibody;
  • a method for producing a gene-transfected cell comprising a step of infecting a target cell with a virus in vitro by contacting with a target cell in vitro.
  • a method for producing cells (6) The method for producing a gene-transferred cell according to any one of (1) to (5), wherein the virus is a retrovirus. (7) The method for producing a transgenic cell according to (6), wherein the retrovirus is a lentivirus.
  • the target cell is any one of human primary cells, human induced pluripotent stem cells (iPS cells), human embryonic stem cells (ES cells), human mesenchymal stem cells, and cells derived from the cells.
  • the target cell is a human T cell, and the antibody specific for the target cell is at least one selected from an anti-human CD3 antibody, an anti-human CD8a antibody and an anti-human CD11a antibody, from (1) (10) The method for producing a transgenic cell according to any one of (10).
  • the target cell is a human B cell, and in the presence of at least one selected from IL-4, ODN 2006, stimulation via CD40 receptor, and stimulation via BAFF receptor, The method for producing a gene-transferred cell according to any one of (1) to (10), wherein the target cell is contacted in vitro.
  • the virus containing a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein contains vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein in addition to the chimeric protein, (1) To (11).
  • a method for producing cells is within a range of 1: 1 to 1: 512.
  • a base encoding a chimeric protein comprising an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein, wherein the virus comprises a chimeric protein comprising the antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • a virus comprising a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein and a foreign gene, wherein the antibody-binding protein comprises an IgG-binding domain of protein L; and A virus comprising 3 or more IgG binding domains of protein A.
  • the virus according to (18), wherein the virus is a retrovirus.
  • the virus according to (19), wherein the retrovirus is a lentivirus.
  • a gene therapy agent comprising the virus according to any one of (18) to (20).
  • a transgenic cell obtained by the method for producing a transgenic cell according to any one of (1) to (17).
  • a plasmid vector comprising a base sequence encoding a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • a target cell selected from human primary cells, human induced pluripotent stem cells (iPS cells), human embryonic stem cells (ES cells) or human mesenchymal stem cells, and an antibody specific for the target cells
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • ES cells human embryonic stem cells
  • mesenchymal stem cells and an antibody specific for the target cells
  • a gene can be efficiently introduced into a target cell.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a chimeric envelope protein expression vector in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a chimeric envelope protein expression vector in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the VSV-G vector concentration and titer in Example 6 of the present invention. In each column, pVSV-G shows the left graph, pCI-VSV-G shows the middle graph, and pCI-SP-VSV-G shows the right graph.
  • FIG. 4 is a diagram showing the evaluation results of the chimeric envelope protein expression vector in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the evaluation results of the number of domains of the antibody binding protein and the infection efficiency in Example 8 of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a chimeric envelope protein expression vector in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a chimeric envelope protein expression vector in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the evaluation results of the ratio between pVSV-G and pCI-SP-PL6d-VSV-G in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of evaluating the ratio between pVSV-G and the chimeric envelope protein expression vector in Example 9 of the present invention.
  • pVSV-G pCI-SP-PA6d-VSV-G shows the left graph
  • pVSV-G pCI-SP-PL6d-VSV-G shows the right graph.
  • FIG. 8 is a graph showing the evaluation results of the ratio between pCI-SP-VSV-G and the chimeric envelope protein expression vector in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of evaluating the infection of T cells via antibodies in Example 10 of the present invention.
  • FIG. 10 shows the results of evaluating the infection of B cells with retroviruses having chimeric envelope proteins in Example 11 of the present invention.
  • FBS indicates the left graph
  • Ultra-Low IgG FBS indicates the right graph.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of evaluating the infection of B cells with concentrated lentiviruses in Example 12 of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of evaluating the infection of MSCs with concentrated lentiviruses in Example 13 of the present invention.
  • the method for producing a transgenic cell comprises: (I) a virus comprising a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein and a foreign gene; (Ii) a target cell and a target cell comprising an antibody specific for the target cell and / or a membrane-type antibody; Is a method for producing a gene-transfected cell, which comprises the step of infecting a target cell with a virus in vitro by contacting them with in vitro.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • VSV-G Virus containing chimeric protein of antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein and foreign gene
  • the virus used in the present invention is antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G).
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • Retrovirus As the virus used in the present invention, retrovirus, baculovirus, Japanese encephalitis virus, hepatitis C virus and the like can be used, but are not particularly limited. Retroviruses include, for example, HIV (Human immunodefectivity virus), SIV (Similar Immuno-defectivity virus) or BIV (Bovine immunodefectivity virus) -derived lentivirus vector, or mouse leukemia virus (retroviral virus vector) ) Origin retrovirus vector and the like can be used. In particular, retroviral vectors lacking replication ability are preferred.
  • the virus used in the present invention includes a chimeric protein of an antibody binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • VSV-G Vesicular stomatitis virus G
  • VSV-G receptors are phospholipids, which are membrane components, and are widely present in animal cell membranes. Therefore, according to the method of the present invention, a desired foreign gene can be introduced into various animal cells.
  • the antibody binding protein includes either or both of an IgG binding domain of protein A and an IgG binding domain of protein L.
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus, signal sequence S, five immunoglobulin binding domains (IgG binding domains) (E domain, D domain, A domain, B domain, C domain) and XM region which is a cell wall binding domain (Japanese Patent No. 5952185).
  • the IgG binding domain of protein A in the present invention may be a mutant as long as it can bind to IgG.
  • Protein L is derived from two strains of Finegoldia magna. One is protein L from 3316 strain and the other is protein L from 312 strain. Protein L from 3316 strain has 4 immunoglobulin binding domains (IgG binding domains), and protein L from 312 strain has 5 immunoglobulin binding domains (IgG binding domains) 79149 of FIG. 1).
  • the IgG binding domain of protein L in the present invention may be a mutant as long as it can bind to IgG.
  • the antibody binding protein can comprise 3 or more IgG binding domains of protein A, for example, 3-15, 3-12, 3-9, or 3-6 Good.
  • the antibody binding protein can comprise 3 or more IgG binding domains of protein L, for example, 3 to 15, 3 to 12, 3 to 9, or 3 to 6 Good.
  • the total number of the domains is preferably 3 or more, for example, 3 to 15, 3 It may be ⁇ 12, 3 ⁇ 9, or 3 ⁇ 6.
  • virus used in the present invention is a virus comprising a chimeric protein of an antibody binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein and a foreign gene, wherein the antibody binding protein is IgG of protein L. Mention may be made of viruses that contain a binding domain and / or contain three or more IgG binding domains of protein A.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • the antibody-binding protein may be present on the N-terminal side of the vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein or on the C-terminal side of the vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein. May be present inside the vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein, but preferably present on the N-terminal side of the vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein. Yes.
  • the virus containing a chimeric protein of antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein may contain vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein in addition to the chimeric protein.
  • the molar ratio of the chimeric protein to the vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein in the virus is preferably Is within the range of 1: 1 to 1: 512, more preferably within the range of 1: 1 to 1: 256, even more preferably within the range of 1: 1 to 1: 128, and even more preferably 1
  • the range is from 1 to 1:64, and more preferably from 1: 2 to 1:64.
  • the virus when the virus contains vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein in addition to the chimeric protein, the virus encodes a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • a plasmid vector that does not include a base sequence encoding an antibody-binding protein but includes a base sequence encoding a vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein, and an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) )
  • the mass ratio of the protein to the plasmid vector containing the base sequence encoding the chimeric protein is preferably in the range of 64: 1 to 64: 256, for example, 64: 2 to 64: 256, 64: 4 to 64 : 256, 64: 8 to 64: 256, 64:16 to 64: 256, 64:32 to 64: 256, 64: 1 to 64: 128, 64: 1 to 64:64, 64: 1 to It may be 64:32, or 64: 2 to 64: 128, 64: 4 to 64: 128, 64: 8 to 64: 128, 64:16 to 64:64.
  • the chimeric protein can contain a secretory signal peptide.
  • a secretory signal peptide for example, the signal peptide of VSV-G or the signal peptide described in Biochemical and Biophysical Research Communication 294 (2002) 835-842 (human secretion signal peptide by hidden Markov model) can be used. .
  • the chimeric protein may contain a linker for linking the antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein.
  • the linker preferably has a flexible structure, which can impart mobility.
  • a flexible glycine serine linker consisting of 15 amino acid residues having a total of 5 amino acids of 4 glycines and 1 serine as the linker is used, but the type of linker is not particularly limited. Absent.
  • a virus containing a chimeric protein of antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein can be prepared by the following method.
  • an expression vector (packaging plasmid) having a gag-pol gene, an antibody-binding protein and a vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein are prepared in a cell having no retrovirus structural protein.
  • a method for producing a retrovirus by introducing an expression vector having a base sequence encoding a chimeric protein and an expression vector carrying a foreign gene.
  • a base sequence encoding a chimeric protein of an antibody binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein is added to a retrovirus packaging cell in which a gene encoding the gag-pol gene has been integrated on the chromosome.
  • a method of producing a retrovirus by introducing an expression vector having a foreign gene and an expression vector carrying a foreign gene may be used.
  • Lentivirus lent (lentivirus) ⁇ is a virus belonging to the family of retrovirus tro (retrovirus) ⁇ , and has many genes in the genome in addition to the three essential genes gag, pol and env.
  • a lentiviral vector is a vector that utilizes the genomic sequence of a lentivirus and can infect growing and arrested cells. Since the foreign gene is inserted into the chromosome of the cell, the expression of the transgene is stable even when the cell is passaged.
  • Lentiviral vectors derived from lentivirus include HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1), HIV-2, simian immunodeficiency virus, feline immunodeficiency virus, bovine immunodeficiency virus, equine infectious anemia virus, caprine arthritisencephalitis virus, jembrana disease virus visna virus etc. are known. Furthermore, in order to produce a virus from three structural proteins, gag, pol and env, the rev gene is required. Rev acts on post-transcription RNAs and selectively transports unspliced gag and gag-pol mRNAs out of the nucleus. This function translates structural proteins.
  • a plasmid vector can be preferably used.
  • a plasmid vector having a foreign gene (CSIV-CMV-Venus in the examples described later);
  • a packaging plasmid vector having a gag gene and a pol gene (pLenti-P3A in the examples described later);
  • a packaging plasmid vector having a rev gene (pLenti-P3B in the examples described later);
  • a plasmid vector having a base sequence encoding a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein Can be used.
  • the foreign gene in the present invention may be linked under the control of an appropriate promoter, for example, an LTR promoter or a foreign promoter present in a viral vector.
  • an appropriate promoter for example, an LTR promoter or a foreign promoter present in a viral vector.
  • CMV Cytomegalovirus
  • RSV Respiratory synchronous virus
  • SV40 Synimian Virus 40
  • HSV TK promoter EF-1 ⁇ promoter (19-2 C19 et al. promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), SR ⁇ promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), ⁇ -actin promoter (eg, patent) No.
  • 5198747 may be used as long as it is a generally usable promoter.
  • other regulatory elements cooperating with a promoter and transcription initiation site for example, an enhancer sequence, a terminator sequence, and an intron sequence may be present in the vector.
  • any gene can be selected as a foreign gene.
  • foreign genes include genes encoding enzymes and proteins related to the disease to be treated, T cell receptor genes, genes encoding growth factors, genes encoding antisense RNA, RNA interference (RNAi) And the like.
  • RNAi RNA interference
  • the foreign gene may be a gene encoding an industrially useful antibody such as a human monoclonal antibody, an enzyme, or other physiologically active substance.
  • cDNA can be used, and cDNA with optimized codons can also be used.
  • the virus used in the present invention may contain an appropriate marker gene that allows selection of the transfected cell.
  • marker genes include drug resistance genes (neomycin resistance genes, etc.) that confer resistance to antibiotics on cells, and reporter genes (LacZ ( ⁇ -galactosidase) that can distinguish cells introduced by enzymatic activity or fluorescence. Gene), a gene encoding a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein) or its analog), a cell surface marker gene localized on the cell surface, and the like.
  • the cell surface marker gene may be a mutant in which a part and / or whole of the intracellular region is deleted or a signal transduction ability is lost.
  • a plasmid vector containing a base sequence encoding a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein constitutes one aspect of the present invention.
  • the plasmid vector may contain an appropriate promoter capable of expressing the chimeric protein.
  • promoters CMV (Cytomegalovirus), RSV (Respiratory synchronous virus), SV40 (Simian Virus 40), HSV TK promoter, EF-1 ⁇ promoter (Kim et al. (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), SR ⁇ promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol.
  • ⁇ -actin promoter for example, Patent No. Any promoter that can be generally used such as 5198747) may be used.
  • other regulatory elements cooperating with promoters and transcription initiation sites such as enhancer sequences, terminator sequences, poly A sequences, and intron sequences, may be present in the vector. Good.
  • viruses can be produced in animal cells by introducing the various expression vectors described above into animal cells (packaging cells). By recovering the culture supernatant of animal cells, the produced virus can be recovered.
  • animal cells packaging cells
  • 293T cells, COS-1 cells, and the like can be used.
  • serum added to the medium used for virus preparation and target cell infection serum generally used for animal cell culture can be used, but it is preferable to use serum that does not contain immunoglobulin or reduced serum. Moreover, you may use the complete synthetic medium which does not contain immunoglobulin.
  • Target cell and antibody In the method for producing a gene-transferred cell according to the present invention, a target cell comprising (i) a virus, (ii) a target cell, an antibody specific for the target cell, and / or a membrane type antibody To infect the target cells with the virus.
  • the type of target cell that is a target for gene transfer is not particularly limited.
  • stem cells stem cells: hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, embryonic stem cells (human embryonic stem cells (ES cells), etc.)) , Human induced pluripotent stem cells (iPS cells, etc.), hematopoietic cells, mononuclear cells (peripheral blood mononuclear cells, umbilical cord blood mononuclear cells, etc.), embryonic cells, primordial germ cells cell), oocyte, oocyte, ovum, spermatocyte, sperm, erythroid progenitor cell, lymphocyte mother cell, mature blood cell, lymphocyte, B cell, T cell, NK cell, NKT cell, macrophage, single Sphere, dendritic cell, fibroblast, neuroblast, neuron, endothelial cell, vascular endothelial cell, hepatocyte, myoblast, skeletal muscle cell,
  • the target cell may be any one or more of human primary cells, human induced pluripotent stem cells (iPS cells), human embryonic stem cells (ES cells), or cells induced to differentiate from the cells.
  • Preferable target cells include peripheral blood mononuclear cells, human B cells, or human T cells, but are not particularly limited.
  • Hematopoietic cells obtained from blood and bone marrow are relatively easy to obtain, and their culture and maintenance techniques have been established, so they are suitable for use in the method of the present invention.
  • pluripotent stem cells hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, etc.
  • progenitor cells are suitable as target cells.
  • immune system cells such as CD4-positive T cells and their progenitor cells are suitable as target cells.
  • a kit comprising a target cell selected from human primary cells, human induced pluripotent stem cells (iPS cells), human embryonic stem cells (ES cells) or human mesenchymal stem cells, and an antibody specific for the target cells, It is useful as a kit for performing the above-described method for producing a gene-transferred cell according to the present invention.
  • a target cell selected from human primary cells, human induced pluripotent stem cells (iPS cells), human embryonic stem cells (ES cells) or human mesenchymal stem cells, and an antibody specific for the target cells.
  • a virus is contacted in vitro with (ii) a target cell and a target cell containing an antibody specific for the target cell and / or a membrane-type antibody.
  • an antibody specific for a target cell an antibody specific for an antigen present on the cell surface can be used. Examples of antigens present on the cell surface include, but are not limited to, the following.
  • Cell surface differentiation antigen (antigen classified as CD (Cluster of Designation)); Class I and class II major histocompatibility antigens; Cytokines and growth hormones (eg, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CTNF), colony stimulating factor, endothelial growth factor, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, glial cell-derived neurotrophic factor , Glial growth factor, gro-beta / mip2, hepatocyte growth factor, insulin-like growth factor, interferons ( ⁇ -IFN, ⁇ -IFN, ⁇ -IFN, consensus IFN), interleukins (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14), keratinocyte growth factor, leukemia inhibitory factor, macrophage / monocyte chemotaxis activator, nerve
  • the combinations of specific target cells and cell surface markers specific to them are shown below.
  • the combination of a specific target cell and a cell surface marker specific thereto is BioGPS (http://biogps.org/) or UniProt (http://www.uniprot.org/) You can search from.
  • Pluripotent stem cells SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-81, TRA-1-60 Hematopoietic stem cells (HSCs): CD34, CD49, CD90 / Thy1 Pluripotent progenitor cells (MPP): CD34 Common lymphoid progenitor cells (CLP): CD34, CD38, CD10, CD45RA Common myeloid progenitor (CMP): CD34, CD38, CD135 Megakaryocyte / erythroid progenitor cells (MEP): CD34, CD38 Granulocyte / macrophage progenitor (GMP): CD34, CD38, CD45RA, CD123, CD135 NK cells: CD56, CD94, NKp46 T cell: CD3 B cell: CD19 Monocyte: CD14 Macrophages: CD11b, CD68, CD163 Dendritic cells: CD11c, HLA-DR Neutrophils: CD11b, CD16,
  • cell type-specific infection is possible by using a differentiation antigen as an antigen present on the cell surface.
  • the target cell is a human T cell
  • the antibody specific for the target cell is at least one selected from an anti-human CD3 antibody, an anti-human CD8a antibody and an anti-human CD11a antibody.
  • the target cell is a human B cell, and is selected from at least one or more selected from stimulation through IL-4, ODN 2006, CD40 receptor, and stimulation through BAFF receptor.
  • the virus and the target cell can be contacted in vitro. Thereby, proliferation of a cell can be induced or a cell can be activated.
  • the target cell is a human mesenchymal stem cell
  • the antibody specific for the target cell is an anti-human CD90 antibody.
  • a target gene can be introduced into a target cell. That is, the method for producing a gene-transferred cell according to the present invention can be used as a gene transfer method.
  • a target cell infected with a virus in vitro.
  • Target cells infected with the virus can be cultured under normal conditions to express the introduced gene. That is, by culturing target cells in a culture solution, a protein encoded by the introduced foreign gene can be obtained.
  • target cells transduced in vitro can be transplanted into a subject.
  • a transgenic cell obtained by the method for producing a transgenic cell according to the present invention that is, a transgenic cell infected with the above-described virus of the present invention is also within the scope of the present invention.
  • viruses described herein are useful as an active ingredient of a gene therapeutic agent. That is, according to the present invention, a gene therapy agent containing the virus described herein is provided. More specifically, a virus comprising a chimeric protein of an antibody-binding protein and vesicular stomatitis virus G (VSV-G) protein and a foreign gene, wherein the antibody-binding protein comprises an IgG-binding domain of protein L And / or a viral gene therapy agent comprising three or more IgG binding domains of protein A.
  • the gene therapy agent of the present invention may contain other components such as a pharmaceutically acceptable carrier or diluent in combination with the active ingredient virus.
  • a gene therapy method comprising administering to a subject (such as a patient) a gene therapy agent containing the virus described herein is also within the scope of the present invention.
  • the gene therapy agent of the present invention and, if desired, an antibody may be directly administered to a subject.
  • the administration route for the subject is not particularly limited as long as the virus can contact the target cell, and any administration route can be adopted.
  • intravenous administration is appropriate for liver, spleen, kidney, heart, circulatory or hematopoietic target cells.
  • the virus can also be administered by catheter injection into an artery or vein leading to the target organ, whereby local administration is possible. If the target cell is the respiratory system, the virus can also be administered by inspiration.
  • the dosage of the gene therapy agent of the present invention depends on the type of foreign gene contained in the virus, the type and site of administration of the disease to be treated, the severity, and the patient's age, weight, sex, health status, etc. Those skilled in the art can select as appropriate.
  • the titer of the virus is preferably greater than 10 5 cfu / ml, more preferably greater than 10 6 cfu / ml, and more preferably 10 7 It is preferred to have a titer greater than a power of cfu / ml, more preferably a titer greater than 10 8 cfu / ml, more preferably a titer greater than 10 9 cfu / ml.
  • the virus of the present invention has a titer greater than 10 10 cfu / ml, more preferably greater than 10 11 cfu / ml.
  • the virus of the present invention is physically strong and can be easily concentrated by ultracentrifugation.
  • the gene introduced into a predetermined cell in the target region is incorporated into the chromosome of the cell, and the foreign gene can be stably expressed.
  • this gene transfer method it is possible to carry out gene therapy for various diseases of mammals including primates such as humans.
  • gene therapy using CD4 positive T cells as target cells can be performed by the following procedure.
  • a material containing CD4-positive T cells from a donor for example, bone marrow tissue, peripheral blood, umbilical cord blood or the like is collected.
  • the collected material may be used for gene introduction as it is, but the mononuclear cell fraction can be prepared by a method such as density gradient centrifugation.
  • purification of cells using CD4 molecule as an index, removal of CD8-positive T cells and / or monocytes, and a culture operation for expanding the number of CD4-positive T cells can be performed.
  • These cell populations are pre-stimulated (eg, stimulated with CD3 ligand, CD28 ligand, or IL-2) as necessary, and then infected with a virus carrying a foreign gene by the method of the present invention.
  • the gene-transferred cells obtained as described above can be transplanted into a recipient by intravenous administration, for example.
  • the recipient is preferably the donor itself, but allogeneic transplants can also be performed.
  • Examples of gene therapy methods targeting hematopoietic hematopoietic stem cells include those that complement a gene that is defective or abnormal in a patient, and examples include gene therapy for ADA deficiency and Gaucher disease.
  • introduction of a drug resistance gene into hematopoietic stem cells may be mentioned in order to alleviate the damage of hematopoietic cells caused by chemotherapeutic agents used for the treatment of cancer and leukemia.
  • a method of imparting specific cytotoxic activity to cancer cells expressing the antigen to lymphocytes by introducing a gene encoding a T cell receptor that recognizes a tumor antigen has been studied. ing. Furthermore, attempts have been made to treat AIDS by gene therapy. In this case, a nucleic acid molecule (single-strand specific endoribonuclease, antisense nucleic acid, ribozyme that interferes with HIV replication or gene expression on T cells such as CD4 positive T cells infected with HIV that causes AIDS. Etc.) is being considered.
  • Example 1 Preparation of chimeric envelope protein expression vector of antibody-binding protein and VSV-G (vesicular stomatitis virus G) protein Partial digestion of pVSV-G (Clontech) with XhoI After that, it was smoothed and electrophoresed to collect a band of about 6500 bp, purified using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN), and DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (Takara Bio). The plasmid (pVSV-G (back XhoI to PvuI)) in which the Xho I site downstream of the ORF of VSV-G was converted to PvuI was prepared.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were fully synthesized, digested with XhoI and SwaI, and electrophoresed to collect and purify about 550 bp band and about 560 bp band, respectively.
  • pVSV-G back XhoI to PvuI
  • Each of the fragments derived from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and the fragment derived from pVSV-G were ligated to prepare plasmids pPA2d-VSV-G and pPG2d-VSV-G (FIG. 1).
  • Escherichia coli JM109 TOYOBO was transformed with the ligated plasmid and cultured in 2 ⁇ YT agar medium and 2 ⁇ YT medium containing carbenicillin at a final concentration of 100 ⁇ g / ml, and sequence analysis and plasmid preparation were performed.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN
  • NucleoBond Xtra Midi Takara Bio
  • PCI-neo (Promega) was digested with ClaI and then electrophoresed to collect, purify and ligate a band of about 3500 bp to prepare pCI.
  • pCI was sufficiently digested with EcoRI (a plurality of digestion sites were processed so as to be completely digested), and after dephosphorylation, electrophoresis was performed to collect and purify a band of about 3500 bp.
  • pVSV-G was sufficiently digested with EcoRI and electrophoresed to collect and purify a band of about 2800 bp.
  • pCI-VSV-G The pCI-derived fragment and the pVSV-G-derived fragment were ligated, and a plasmid in which an initiation codon was inserted on the CMV promoter side was selected to prepare pCI-VSV-G (FIG. 1).
  • pCI-VSV-G was digested with XhoI and SwaI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 5000 bp.
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were completely synthesized, digested with XhoI and SwaI, and electrophoresed to collect and purify bands of about 180 bp and about 220 bp, respectively.
  • HMM-38 signal peptide refers to Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jun 21; 294 (4): 835-42.
  • PCI-SP-GS2-VSV-G was digested with NaeI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 5700 bp.
  • SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 were totally synthesized and digested with EheI, NaeI and ScaI, SacI and MlyI and NaeI, respectively, and electrophoresed to collect and purify bands of about 500 bp, about 580 bp and about 620 bp, respectively. .
  • fragments derived from pCI-SP-GS2 VSV-G and the fragments derived from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 were ligated, respectively, and pCI-SP-PA3d-GS2-VSV-G and pCI-SP-PG3d-GS2 -VSV-G and pCI-SP-PL3d-GS2-VSV-G were prepared (FIG. 1).
  • the fragment derived from SEQ ID NO: 5 and / or SEQ ID NO: 7 is ligated to produce linear DNA, and the target band is recovered, purified, ligated with the fragment derived from pCI-SP-GS2-VSV-G, and PCI-SP-PA6d-VSV-G, pCI-SP-PA9d-VSV-G, pCI-SP-PA12d-VSV-G, pCI-SP-PL6d- VSV-G, pCI-SP-PL9d-VSV-G, pCI-SP-PL12d-VSV-G, pCI-SP-PA3d-PL3d-VSV-G, pCI-SP-PL3d-PA3d-VSV-G were obtained. (FIG. 2).
  • CSIV-CMV-Venus Preparation of vector plasmid CSIV-CMV-Venus was used as a lentiviral vector plasmid for measuring the efficiency of infecting cells.
  • CSIV-CMV-MCS-IRES2-Venus (Cancer Sci. 2014 Apr; 1054: 402-8.) was partially digested with BalI, digested with Aor51HI, and electrophoresed to recover, purify, and ligate a band of about 9030 bp.
  • CSIV-CMV-Venus was prepared.
  • packaging plasmids used for lentivirus production pLenti-P3A (gag, pol packaging plasmid) and pLenti-P3B (rev packaging plasmid) of 3rd Generation pLenti-Combo Mix (Applied Biologicals) are used. It was. The packaging plasmid described in Example 1 was used as the packaging plasmid for env.
  • PMSCV-bact-Venus-wpre was used as a retroviral vector plasmid for measuring the infection efficiency to cells.
  • pMSCV-neo-bact-fEPO-wpre Japanese Patent No. 5198747
  • NotI NotI
  • pMSCV-bact-fEPO-wpre was digested with SalI and HindIII, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 5050 bp.
  • the fragment derived from pMSCV-bact-fEPO-wpre and the fragment derived from CSIV-CMV-MCS-IRES2-Venus were ligated to prepare pMSCV-bact-Venus-wpre.
  • feeder cells expressing human CD40 ligand and human BAFF were prepared.
  • Human CD40 ligand see, eg, Eur J Immunol. 1992 Dec; 22 (12): 3191-4. And EMBO J. 11 (12), 4313-4321 (1992), NCBI Reference Sequence: NM_000074)
  • human BAFF for example, J Exp Med. 1999 Jun 7; 189 (11): 1747-56., Science. 1999 Jul 9; 285 (5425): 260-3., NCBI Reference Sequence: NM_006573
  • J Exp Med. 1999 Jun 7; 189 (11): 1747-56., Science. 1999 Jul 9; 285 (5425): 260-3., NCBI Reference Sequence: NM_006573 is based on literature information etc. Totally synthesized.
  • pMSCV-bact-fEPO-wpre was digested with NotI and ClaI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 5000 bp.
  • pMSCV-MCS-wpre was digested with NotI and XhoI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 5100 bp.
  • CSIV-CMV-MCS-IRES2-Venus was digested with NotI and XhoI and then electrophoresed to collect and purify a band of about 1300 bp.
  • the fragment derived from pMSCV-MCS-wpre and the fragment derived from CSIV-CMV-MCS-IRES2-Venus were ligated to prepare pMSCV-IRES2-Venus-wpre.
  • pMSCV-IRES2-Venus-wpre was digested with NotI and EcoRI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 5000 bp.
  • a band of about 1300 bp was collected and purified.
  • PCR amplification was performed using SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 as primers, followed by electrophoresis, and a band of about 830 bp was collected and purified.
  • Amplification was carried out by PCR using a band of about 1300 bp and a band of about 830 bp as templates and SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 15 as primers, followed by purification.
  • BAFF Basal growth factor
  • H40LB H40LB was cloned using the expression of BAFF and CD40L as indicators.
  • Example 4 Preparation of sCD40L and sBAFF E. coli HST04 Competent Cells (Takara Bio Inc.) were transformed with pIRES (Takara Bio Inc.) and cultured in a 2 ⁇ YT medium containing carbenicillin at a final concentration of 100 ⁇ g / ml, Plasmid preparation was performed. After digesting pIRES with ClaI, electrophoresis was performed, and a band of about 4100 bp was collected, purified and ligated to prepare dpIRES. dpIRES was completely digested with SmaI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 4100 bp.
  • pLVSIN-EF1 ⁇ Pur (Takara Bio Inc.) as a template, the fragments amplified by PCR using SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 as primers were purified, recovered, phosphorylated, and electrophoresed to recover and purify a band of about 600 bp. .
  • the fragment derived from dpIRES and the fragment derived from pLVSIN-EF1 ⁇ Pur were ligated, and a plasmid in which an initiation codon was inserted on the IRES side was selected to prepare dpIRES-Pur.
  • dpIRES-Pur was digested with XhoI and MluI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 4700 bp.
  • Single-stranded DNA phosphorylated at the 5 ′ end of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 was synthesized, mixed, heat-treated, gently cooled to double-stranded DNA, ligated with a fragment derived from dpIRES-Pur, and dpCMV- MCS-IRES-Pur was prepared.
  • SEQ ID NO: 22 was fully synthesized, digested with NheI and EcoI, and electrophoresed to collect and purify about 900 bp bands, respectively.
  • dpCMV-MCS-IRES-Pur was digested with NheI and EcoI, dephosphorylated, and electrophoresed to collect and purify a band of about 4700 bp.
  • the fragment derived from SEQ ID NO: 22 and the fragment derived from dpCMV-MCS-IRES-Pur were ligated to prepare dpCMV-sCD40L-IRES-Pur.
  • 293T cells were transformed with dpCMV-sCD40L IRES-Pur, stably expressing cells were selected in the presence of puromycin, and 293T (sCD40L) was cloned.
  • 293T (sCD40L) was cultured with 293 SFM II (Thermo Fisher Scientific) (containing 2 ⁇ GlutaMAX (including Thermo Fisher Scientific)), and the supernatant was purified with Strep-Tactin Sepharose Co.
  • the purified solution thus eluted was substituted with PBS using Vivaspin Turbo 15 (MWCO: 10,000) (Sartorius) (purified sCD40L).
  • Purified sBAFF can be obtained by fully synthesizing SEQ ID NO: 23 and conducting the same experiment.
  • CD40L and BAFF are homotrimeric type II membrane proteins belonging to the TNF superfamily.
  • Example 5 Separation of cells from blood The use of blood was approved by an in-house ethics committee and was subject to informed consent. Blood was collected in a Terumo blood bag CPDA (Terumo) by a doctor / nurse, and mononuclear cells were separated using Lymphoprep Tube (tube size: 50 mL) (Aleure Technologies AS) to obtain PBMC. By a conventional method, biotin-anti-human CD2 antibody (Biolegend) and biotin-anti-human CD235a antibody (eBioscience) are reacted, and CD2, CD235-negative cells are treated with Streptavidin-Particle Plus-DM, BD Imagnet (BD Bioscience). (Pharmingen).
  • Example 6 Evaluation of pVSV-G, pCI-VSV-G, and pCI-SP-VSV-G 293T cells were seeded in a collagen-coated 24-well plate at 6 ⁇ 10 5, and Advanced RPMI 1640 medium ( 2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS) (Thermo Fisher Scientific) was cultured overnight. The next day, 0.5 mL of Advanced RPMI 1640 medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS) was replaced, and 0.5 ⁇ g and Lp of CSIV-CMV-Venus were added using Lipofectamine 3000 Reagent (Thermo Fisher Scientific).
  • Advanced RPMI 1640 medium 2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS
  • envelope protein expression vectors pVSV-G, pCI-VSV-G, pCI-SP-VSV-G. Envelope protein expression vectors were examined from 2 ⁇ g to 1/64 ⁇ g. Four hours after transfection, the medium was replaced with 2 mL of Advanced RPMI 1640 medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS) and cultured for 2 days to prepare a lentiviral vector.
  • the prepared lentiviral vector was filtered through a 0.8 ⁇ m filter to obtain a virus supernatant stock, and 1 mL each was infected overnight with 293T cells seeded at 2 ⁇ 10 5 in a 24-well plate.
  • the medium was changed the next day, and the cells detached with Accumax (Innovative Cell Technologies) two days after infection were stained with propidium iodide solution (SIGMA), analyzed with a flow cytometer, and the number of cells at the time of infection (2 ⁇ 10 5 )
  • the titer (titer (TU / ml)) was calculated from x viable cells Venus positive / total viable cells.
  • the results of the relationship between VSV-G vector concentration and titer are shown in FIG.
  • VSV-G Although any VSV-G vector produced a virus, the optimal vector concentration was different. This is because the expression level of VSV-G varies from vector to vector, and the expression level of each vector is assumed to be pCI-VSV-G ⁇ pCI-SP-VSV-G ⁇ pVSV-G. Viral titers were pVSV-G (1/16 ⁇ g / 24 well plate), pCI-SP-VSV-G (1/2 ⁇ g / 24 well plate), pCI-VSV-G (1 ⁇ g / 24 well plate). It is estimated that pCI-VSV-G is about 1/16 of pVSV-G, and pCI-SP-VSV-G is about 1/8 of pVSV-G.
  • Example 7 Evaluation of chimeric envelope protein expression vector of antibody binding protein (protein A: PA, protein G: PG, protein L: PL) and VSV-G (vesicular stomatitis virus G) protein Preparation of lentiviral vector The titer measurement was performed in the same manner as in Example 6 (FIG. 4). However, the envelope protein expression vector was used in a quantitative ratio as shown in Table 1.
  • virus supernatants IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L (Including 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL)
  • virus supernatants IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L (Including 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL)
  • 1 mL seeded in a 24-well plate and infected overnight.
  • the cells were centrifuged and suspended in Advanced RPMI 1640 (2% FBS, IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL, A286682 2 ⁇ M).
  • the infection efficiency to B cells was lower than that of pVSV-G. Moreover, the infection efficiency per titer increased about 1.8 times by increasing the number of domains from 2 to 3 with PA.
  • Example 8 Evaluation of domain number of antibody-binding protein and evaluation of infection efficiency 293T cells were seeded in a collagen-coated 12-well plate at 1.1 ⁇ 10 6, and Advanced RPMI 1640 medium (2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS) was used. Incubated overnight. The next day, the medium was replaced with 1 mL of Advanced RPMI 1640 medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS (ultra-low IgG) (Thermo Fisher Scientific)) and CSIV-CMV-gp-genus using Lipofectamine 3000 Reagent.
  • Advanced RPMI 1640 medium 2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS
  • ⁇ g of P3A, 1 ⁇ g of pLenti-P3B, 0.125 ⁇ g of pVSV-G and 0.25 ⁇ g of chimeric envelope protein expression vector were transfected.
  • the medium was replaced with 5 mL of Advanced RPMI 1640 medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS (ultra-low IgG)) and cultured for 2 days to prepare a lentiviral vector.
  • the prepared lentiviral vector was filtered through a 0.8 ⁇ m filter to obtain a virus supernatant stock.
  • 293T cells were seeded at 1.3 ⁇ 10 5 in a 24-well plate and cultured in 1 mL of Advanced DMEM medium (Thermo Fisher Scientific) (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS). To this, 0.2 mL of virus supernatant stock was added and infected overnight. The medium was changed the next day, and the cells detached with Accumax 5 days after infection were stained with propidium iodide solution and analyzed with a flow cytometer, and the number of cells at the time of infection (1.3 ⁇ 10 5 ) ⁇ viable cell Venus positive / The titer (titer (TU / ml)) was calculated from the total viable cells.
  • Advanced DMEM medium Thermo Fisher Scientific
  • Frozen B cells were cultured in Advanced RPMI 1640 (containing 2% FBS (ultra-low IgG), IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL, A286682 2 ⁇ M) for 2 days did. This was centrifuged and 5000 B cells were infected with 1 mL of virus supernatant stock.
  • Advanced RPMI 1640 containing 2% FBS (ultra-low IgG), IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL, A286682 2 ⁇ M
  • the number of antibody binding protein domains and the results of B cell infection efficiency are shown in FIG.
  • the infection efficiency was less than 1%, but the chimeric envelope protein showed an infection efficiency of 6% or more for any number of domains.
  • the infection efficiency to B cells was 7% or more.
  • 6-12 domains showed higher infection efficiency to B cells than 3 domains.
  • Example 9 Evaluation of ratio between VSV-G vector and chimeric envelope protein expression vector 293T cells were seeded at 6 ⁇ 10 5 in a collagen-coated 24-well plate, and Advanced DMEM medium (2 ⁇ GlutaMAX and 10 (With% FBS). The next day, the medium was replaced with 0.5 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX, 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific)), and CSIV-CM was used with Lipofectamine 3000 Reagent.
  • Advanced DMEM medium containing 2 ⁇ GlutaMAX, 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific)
  • Venus was transfected at 0.5 ⁇ g, pLenti-P3A at 0.5 ⁇ g and pLenti-P3B at 0.5 ⁇ g, and the envelope plasmid was transfected at the quantitative ratios shown in Tables 2, 3 and 4.
  • the medium was replaced with 2 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX, 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES) and cultured for 2 days to prepare a lentiviral vector.
  • the prepared lentiviral vector was filtered through a 0.8 ⁇ m filter to obtain a virus supernatant stock.
  • B cell infection was greatest at 64:32 for pVSV-G: pCI-SP-PL6d-VSV-G.
  • VSV-G protein chimeric envelope protein was around 16: 1 on the viral vector. It is presumed that the infection efficiency to cells is high.
  • FIG. 7 the ratio of pVSV-G to the chimeric envelope vector was examined in more detail.
  • the efficiency of B cell infection was maximized at 5: 5 for pVSV-G: pCI-SP-PA6d-VSV-G and 5: 4 for pVSV-G: pCI-SP-PL6d-VSV-G.
  • pVSV-G pCI-SP-PA6d-VSV-G
  • the ratio of pCI-SP-PA6d-VSV-G may be higher.
  • FIG. 8 the ratio of pCI-SP-VSV-G to the chimeric envelope vector was examined.
  • pCI-SP-VSV-G 16: 8 for pCI-SP-PA6d-VSV-G, 16: 2 for pCI-SP-VSV-G: 16: 2 for pCI-SP-PL6d-VSV-G Became the maximum.
  • pCI-SP-PA6d-VSV-G requires a larger amount of vector than pCI-SP-PL6d-VSV-G.
  • Example 10 Evaluation of infection of T cells via antibody 293T cells were seeded in a collagen-coated 6-well plate at 3 ⁇ 10 6, and Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS) Incubated overnight. The next day, 2 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES) was replaced with 2.5 ⁇ g of CSIV-CMV-Venus using Lipofectamine 3000 Reagent.
  • Advanced DMEM medium containing 2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS
  • pLenti-P3A 2.5 ⁇ g and pLenti-P3B 2.5 ⁇ g
  • pVSV-G 0.625 ⁇ g or pVSV-G 0.625 ⁇ g and pCI-SP-PA6d-GS2-VSV-G
  • pVSV-G 0.625 ⁇ g and pCI-SP-PL6d-GS2-VSV-G 0.625 ⁇ g were transfected.
  • the medium was replaced with 12 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX, 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES) and cultured for 2 days to prepare a lentiviral vector.
  • Advanced DMEM medium containing 2 ⁇ GlutaMAX, 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES
  • the prepared lentiviral vector was filtered through a 0.8 ⁇ m filter to obtain a virus supernatant stock.
  • the infection efficiency is higher than in pVSV-G, but the infection efficiency is not improved as much as pCI-SP-PA6d-GS2-VSV-G. Since PA and PL have different binding regions to antibodies, there is a possibility that the efficiency of infection via antibodies is affected.
  • Example 11 Evaluation of infection of B cells with retrovirus having a chimeric envelope protein (retrovirus other than lentivirus) GP293 cells were seeded in a collagen-coated 12-well plate at 1.5 ⁇ 10 6 , The cells were cultured overnight in Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX, 10 mM HEPES, and 10% FBS). The next day, 1 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX, 10 mM HEPES, and 10% FBS (ultra-low IgG)) was exchanged, and 2 ⁇ g of pMSCV-bact-Venus-wpre was added using Lipofectamine 3000 Reagent.
  • Advanced DMEM medium containing 2 ⁇ GlutaMAX, 10 mM HEPES, and 10% FBS (ultra-low IgG)
  • 0.5 ⁇ g of G or 0.5 ⁇ g of pVSV-G and 0.5 ⁇ g of pCI-SP-PA6d-GS2-VSV-G or 0.5 ⁇ g of pVSV-G and pCI-SP-PL6d-GS2-VSV-G 0.5 ⁇ g was transfected. Four hours after transfection, the medium was replaced with 5 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 10% FBS or 10% FBS (ultra-low IgG)) and cultured for 2 days to prepare a retroviral vector. The prepared retrovirus vector was filtered through a 0.8 ⁇ m filter to obtain a virus supernatant stock.
  • Frozen B cells were thawed and centrifuged, and 8000 B cells were infected with 1 mL of virus supernatant stock. Centrifugation was performed after 2 hours, and B cells were seeded on feeder cells (h40LB seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 in a 24-well plate the previous day), and Advanced RPMI 1640 (2% FBS (ultra-low IgG), IL -21 10ng / mL, IL-2 containing 25U / mL). After 5 days, the cells were detached with Accutase and centrifuged.
  • Example 12 Evaluation of infection of B cells with concentrated lentivirus A lentivirus supernatant stock was prepared in the same manner as in Example 6. 20 mL was centrifuged at 42,200 ⁇ g, 4 ° C. for 2 hours. Each precipitate was added to 1 mL of Advanced RPMI 1640 (containing IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL, ODN 2006 (Miltenyi Biotech) 2.5 ⁇ g / mL). Suspended to prepare a concentrated lentivirus solution.
  • Advanced RPMI 1640 containing IL-4 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL, sCD40L 400 ng / mL, sBAFF 100 ng / mL, ODN 2006 (Miltenyi Biotech) 2.5 ⁇ g / mL.
  • Advanced RPMI 1640 2% FBS (ultra-low IgG), IL-4 (containing 50 ng / mL, IL-2 25 U / mL).
  • the medium was changed to Advanced RPMI 1640 (containing 2% FBS (ultra-low IgG), IL-21 10 ng / mL, IL-2 25 U / mL), and the culture was continued.
  • Example 13 Evaluation of Infection of Mesenchymal Stem Cells (MSC) via Antibody 293T cells were seeded in a collagen-coated 6-well plate at 3 ⁇ 10 6, and Advanced DMEM medium (2 X GlutaMAX and 10% FBS). The next day, 2 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX and 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES) was replaced with 2.5 ⁇ g of CSIV-CMV-Venus using Lipofectamine 3000 Reagent.
  • MSC Mesenchymal Stem Cells
  • pLenti-P3A 2.5 ⁇ g of pLenti-P3A, 2.5 ⁇ g of pLenti-P3B, 0.625 ⁇ g of pVSV-G, and 0.625 ⁇ g of pCI-SP-PA6d-GS2-VSV-G were transfected.
  • the medium was replaced with 12 mL of Advanced DMEM medium (containing 2 ⁇ GlutaMAX, 2% FBS (ultra-low IgG) and 10 mM HEPES) and cultured for 2 days to prepare a lentiviral vector.
  • the prepared lentiviral vector was filtered through a 0.8 ⁇ m filter to obtain a virus supernatant stock.
  • the medium was changed the next day, and cells detached with Accumax 3 days after infection were stained with DRAQ7 and analyzed with a flow cytometer to calculate the percentage (%) of Venus positive cells in viable MSCs.
  • the results are shown in FIG.
  • the anti-CD90 antibody against CD90 expressed on the MSC was added for infection, the infection efficiency was improved as compared with the case where the antibody was not added.

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Abstract

本発明の課題は、細胞の種類に関わらず多くに任意の細胞、特にヒト初代細胞であっても遺伝子を効率よく導入することができる、遺伝子導入細胞の製造方法を提供することである。本発明によれば、（ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと、（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法が提供される。

Description

遺伝子導入細胞の製造方法
　本発明は、キメラエンベロープタンパク質を含むウイルスを用いて外来遺伝子を標的細胞に導入することを含む、遺伝子導入細胞の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスを用いて遺伝子導入を行うことを含む、遺伝子導入細胞の製造方法に関する。
　真核細胞に目的遺伝子を導入して発現させることを目的として、様々なウイルス由来ベクターが使用されている。標的細胞において機能を有するプロモーターに機能し得る形で連結された目的遺伝子を、ウイルス遺伝子に挿入することによって、ウイルスベクターを作製することができる。ウイルスベクターは標的細胞に感染し、ウイルス遺伝子の代わりに目的遺伝子を発現することができる。ウイルス遺伝子の全てがそのウイルスベクターに存在するわけではないので、ウイルスベクターが標的細胞に感染しても、ウイルス粒子は産生しない。ヒト等の哺乳動物の標的細胞の感染のために使用されているウイルスとしては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスなどがある。
　特許文献１には、プロテインＡのIgG結合ドメインの部分を含むキメラ・エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む、標的細胞に形質導入を起こさせるウイルスベクターであって、該エンベロープタンパク質がマウス白血病ウイルスまたはトリ白血病ウイルスのgp70タンパク質の部分を含み、かつ該エンベロープタンパク質がウイルス粒子への断片の組立てを指令するように機能する、上記ウイルスベクターが記載されている。
　非特許文献１においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　のＺ　ｄｏｍａｉｎ発現する遺伝子配列を外皮にＶＳＶ－Ｇを発現するプラスミドに挿入することで、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡのＺ　ｄｏｍａｉｎ　とＶＳＶ－Ｇの融合タンパク質を発現するプラスミドを作製し、このプラスミドをウイルスベクター生産細胞である２９３ＦＴ細胞に遺伝子導入することで目的の外皮タンパク質を発現しているレンチウイルスベクターを生産させている。その後、ヒトＩｇＧ　抗体でコートしたプレートに、上記のレンチウイルスベクターを添加し、洗浄した後、そのプレートに接着細胞を播種することでウイルスベクターを感染させることが記載されている。すなわち、プレート表面に抗体を固定し、その抗体とＺ　ｄｏｍａｉｎとの相互作用を利用してプレート表面にレンチウイルスベクターを濃縮し、接着細胞がプレート表面に接着することを介してウイルスベクターを感染させることが記載されている。
特表２００２－５１６５７０号公報
Y.Kameyama et al., Journal of Virological Methods 153 (2008) 49-54
　特許文献１においては、マウス白血病ウイルスまたはトリ白血病ウイルスのgp70タンパク質を含むキメラタンパク質を含むレトロウイルスを使用しているが、標的細胞の種類が制限されるという問題があった。非特許文献１においては、ウイルスを固定したプレート上に接着細胞である標的細胞を播種して、遺伝子導入を行っており、標的細胞へのウイルス感染は抗体を介したものではない。従って、非特許文献１の方法は、接着細胞以外の細胞（例えば、浮遊細胞等）には応用が困難であり、またウイルス感染において抗体の指向性を利用していないことから、遺伝子導入が困難であるとされているヒト初代細胞に対して遺伝子を導入することも困難である。
　本発明は、細胞の種類に関わらず多くに任意の細胞、特にヒト初代細胞であっても遺伝子を効率よく導入することができる、遺伝子導入細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記の遺伝子導入細胞の製造方法に使用することができる、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルス、並びに前記ウイルスを含む遺伝子治療剤を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記の遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスと、標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とを接触させることにより、標的細胞にウイルスを高効率で感染させることができ、これにより標的細胞に遺伝子を導入できることを見出した。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　（ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと；
（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞；
とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
（２）　抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインのうちの何れか又は両方を含む、（１）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（３）　抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、（２）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（４）　抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを３個以上含む、（２）又は（３）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（５）　前記キメラタンパク質において、抗体結合タンパク質が、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在している、（１）から（４）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（６）　ウイルスが、レトロウイルスである、（１）から（５）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（７）　レトロウイルスが、レンチウイルスである、（６）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（８）　標的細胞が、ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト間葉系幹細胞、及び前記細胞から分化誘導された細胞の何れか一種以上である、（１）から（７）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（９）　標的細胞が末梢血単核球細胞である、（１）から（８）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１０）　標的細胞が、ヒトＢ細胞、ヒトＴ細胞又はヒト間葉系幹細胞である、（１）から（８）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１１）　標的細胞が、ヒトＴ細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８ａ抗体及び抗ヒトＣＤ１１ａ抗体から選択される少なくとも一以上である、（１）から（１０）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１２）　標的細胞が、ヒトＢ細胞であり、ＩＬ－４、ＯＤＮ ２００６、ＣＤ４０受容体を介した刺激、及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激から選択される少なくとも一以上の存在下において前記ウイルスと前記標的細胞とをインビトロで接触させる、（１）から（１０）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１３）　標的細胞が、ヒト間葉系幹細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ９０抗体である、（１）から（１０）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１４）　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む、（１）から（１１）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１５）　前記ウイルスにおける、前記キメラタンパク質と、前記水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のモル比が、１：１～１：５１２の範囲内である、（１４）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１６）　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとを組み合わせて使用することによって製造されたものである、（１）から（１５）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１７）　抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとの質量比が６４：１～６４：２５６の範囲内である、（１６）に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
（１８）　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルス。
（１９）　ウイルスが、レトロウイルスである、（１８）に記載のウイルス。
（２０）　レトロウイルスが、レンチウイルスである、（１９）に記載のウイルス。
（２１）　（１８）から（２０）の何れか一に記載のウイルスを含む遺伝子治療剤。
（２２）　（１）から（１７）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞。
（２３）　（１８）から（２０）の何れか一に記載のウイルスが感染している遺伝子導入細胞。
（２４）　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクター。
（２５）　ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒト間葉系幹細胞から選択される標的細胞と、前記標的細胞に特異的な抗体とを含む、（１）から（１７）の何れか一に記載の遺伝子導入細胞の製造方法を行うためのキット。
　本発明による遺伝子導入細胞の製造方法によれば、標的細胞に遺伝子を効率よく導入することができる。
図１は、本発明の実施例１におけるキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの模式図である。 図２は、本発明の実施例１におけるキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの模式図である。 図３は、本発明の実施例６におけるＶＳＶ－Ｇベクター濃度と力価の関係を示す図である。各欄において、ｐＶＳＶ－Ｇは左のグラフ、ｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇは真ん中のグラフ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇは右のグラフを示す。 図４は、本発明の実施例７におけるキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの評価結果を示す図である。 図５は、本発明の実施例８における抗体結合タンパク質のドメイン数と感染効率の評価結果を示す図である。 図６は、本発明の実施例９におけるｐＶＳＶ－ＧとｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇとの比率の評価結果を示す図である。 図７は、本発明の実施例９におけるｐＶＳＶ－Ｇとキメラエンベロープタンパク質発現ベクターとの比率の評価結果を示す図である。各欄において、ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇは左のグラフ、ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇは右のグラフを示す。 図８は、本発明の実施例９におけるｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇとキメラエンベロープタンパク質発現ベクターとの比率の評価結果を示す図である。各欄において、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇは左のグラフ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇは右のグラフを示す。 図９は、本発明の実施例１０における抗体を介したＴ細胞への感染評価結果を示す図である。 図１０は、本発明の実施例１１におけるキメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイルスのＢ細胞への感染評価結果を示す図である。各欄において、ＦＢＳは左のグラフ、Ultra-Low IgGＦＢＳは右のグラフを示す。 図１１は、本発明の実施例１２における濃縮レンチウイルスのＢ細胞への感染評価結果を示す図である。 図１２は、本発明の実施例１３における濃縮レンチウイルスのＭＳＣへの感染評価結果を示す図である。
　本発明の実施の形態について以下に説明する。
　本発明による遺伝子導入細胞の製造方法は、
（ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと；
（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞；
とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法である。
（１）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルス
　本発明で用いるウイルスは、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含む。
　本発明で用いるウイルスとしては、レトロウイルス、バキュロウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを使用することができるが、特に限定されない。
　レトロウイルスとしては、例えばＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）又はＳＩＶ（Ｓｉｍｉａｎ　Ｉｍｍｕｎｏ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）又はＢＩＶ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）由来レンチウイルスベクター、あるいはマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来レトロウイルスベクター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来レトロウイスルベクター等を使用することができる。特に、複製能を欠損したレトロウイルスベクターが好適である。
　本発明において用いるウイルスは、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含む。
　水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質は、エンベロープタンパク質である。VSV-Gの受容体は膜成分であるリン脂質であり、動物細胞の膜に広く存在することから、本発明の方法によれば種々の動物細胞に所望の外来遺伝子を導入することができる。
　本発明において好ましくは、抗体結合タンパク質は、プロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインのうちの何れか又は両方を含む。
　プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合ドメイン（IgG結合ドメイン）（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（特許第５９５２１８５号公報）。本発明におけるプロテインAのIgG結合ドメインは、IgGに結合できる限り、変異体でもよい。
　プロテインLとしては、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）の２つの株由来のものが知られている。１つは3316株由来のプロテインLであり、もう１つの312株由来のプロテインLである。3316株由来のプロテインLは４つの免疫グロブリン結合ドメイン（IgG結合ドメイン）を有し、312株由来のプロテインLは５つの免疫グロブリン結合ドメイン（IgG結合ドメイン）を有している（特開２０１６－７９１４９号公報の図１）。本発明におけるプロテインＬのIgG結合ドメインは、IgGに結合できる限り、変異体でもよい。
　好ましくは、抗体結合タンパク質は、プロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含むことができ、例えば、３個～１５個、３個～１２個、３個～９個、又は３個～６個でもよい。
　好ましくは、抗体結合タンパク質は、プロテインLのIgG結合ドメインを３個以上含むことができ、例えば、３個～１５個、３個～１２個、３個～９個、又は３個～６個でもよい。
　抗体結合タンパク質がプロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインの両方を含む場合には、上記ドメインの合計数は、好ましくは３個以上であり、例えば、３個～１５個、３個～１２個、３個～９個、又は３個～６個でもよい。
　本発明で用いるウイルスの一例としては、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルスを挙げることができる。
　キメラタンパク質において、抗体結合タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在していてもよいし、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＣ末端側に存在していてもよいし、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質の内部に存在してもよいが、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在している。
　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスは、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含むものでもよい。ウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む場合、ウイルスにおける、前記キメラタンパク質と、前記水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のモル比は、好ましくは１：１～１：５１２の範囲内であり、より好ましくは１：１～１：２５６の範囲内であり、さらに好ましくは１：１～１：１２８の範囲内であり、さらに好ましくは１：１～１：６４の範囲内であり、さらに好ましくは１：２～１：６４の範囲内である。
　また、ウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む場合、ウイルスは、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとを組み合わせて使用することによって製造することができる。この場合、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとの質量比は好ましくは６４：１～６４：２５６の範囲内であり、例えば、６４：２～６４：２５６、６４：４～６４：２５６、６４：８～６４：２５６、６４：１６～６４：２５６、６４：３２～６４：２５６でもよいし、６４：１～６４：１２８、６４：１～６４：６４、６４：１～６４：３２でもよいし、又は、６４：２～６４：１２８、６４：４～６４：１２８、６４：８～６４：１２８、６４：１６～６４：６４でもよい。
　キメラタンパク質は、分泌シグナルペプチドを含むことができる。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、ＶＳＶ－Ｇのシグナルペプチド、又はBiochemicaland BiophysicalResearch Communications 294 (2002) 835-842に記載されているシグナルペプチド（hidden Markov Modelによるヒト分泌シグナルペプチド）等を使用することができる。
　キメラタンパク質は、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とを連結するためのリンカーを含んでいてもよい。リンカーは、好ましくは柔軟な構造を有し、これにより可動性を付与することができる。後記する実施例においては、リンカーとしてグリシン4つとセリン1つの合計５アミノ酸を基本単位とした15アミノ酸残基からなるフレキシブルなグリシンセリンリンカーを用いているが、リンカーの種類は特に限定されるものではない。
　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスは、以下の方法で作製することができる。
　レトロウイルスの作製方法としては、レトロウイルスの構造タンパク質を有さない細胞に、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子を有する発現ベクター（パッケージングプラスミド）と、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと、外来遺伝子を搭載した発現ベクターとを導入することによって、レトロウイルスを産生させる方法を挙げることができる。あるいは、予めｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子をコードする遺伝子が染色体上に組み込まれたレトロウイルスパッケージング細胞に、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと、外来遺伝子を搭載した発現ベクターを導入することによってレトロウイルスを産生させる方法でもよい。
　レンチウイルス (lentivirus) はレトロウイルス (retrovirus) 科に属するウイルスであり、gag、pol及びenv の 3つの必須遺伝子以外にも、多くの遺伝子をゲノム内に持っている。レンチウイルスベクターはレンチウイルスのゲノム配列を利用したベクターで、増殖中および増殖停止中の細胞に感染させることができる。外来遺伝子は細胞の染色体に挿入されるため、細胞を継体しても導入遺伝子の発現は安定している。
　レンチウイルス由来のレンチウイルスベクターとしては、HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1)、HIV-2、simian immunodeficiency virus、feline immunodeficiency virus、bovine immunodeficiency virus、equine infectious anemia virus、caprine arthritisencephalitis virus、jembrana disease virus、visna virusなどが知られている。さらにgag、pol及びenvの 3つの構造タンパク質からウイルスを産生するためには、rev 遺伝子が必要である。Rev は転写後の RNA に作用し、スプライシングを受けていない gag、gag-pol mRNA を選択的に核外に運び出す。この働きによって構造タンパク質が翻訳される。
　発現ベクターとしては、好ましくはプラスミドベクターを使用することができる。プラスミドベクターを用いてレンチウイルスを作製する場合には、
・外来遺伝子を有するプラスミドベクター（後記する実施例では、CSIV-CMV-Venus）；
・gag遺伝子及びpol遺伝子を有するパッケージングプラスミドベクター（後記する実施例では、pLenti-P3A）；
・rev遺伝子を有するパッケージングプラスミドベクター（後記する実施例ではpLenti-P3B）；及び
・抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を有するプラスミドベクター：
を使用することができる。
　本発明における外来遺伝子は、適当なプロモーター、例えば、ウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に連結されていてもよい。外来プロモーターとしては、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０）、ＨＳＶ　ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＥＦ－１　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら　Ｇｅｎｅ　９１，　ｐ．２１７－２２３　（１９９０））、ＣＡＧ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　１０８，　ｐ．１９３－２００　（１９９１））、ＳＲ　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　８，　ｐ．４６６　（１９８８））、βアクチンプロモーター(例えば、特許第5198747号)等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。効率のよい外来遺伝子の転写を達成するためには、プロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列、イントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
  外来遺伝子としては、任意の遺伝子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は、治療の対象となる疾患に関連している酵素やタンパク質をコードする遺伝子、Ｔ細胞レセプター遺伝子、増殖因子をコードする遺伝子、アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を起こすＲＮＡをコードする遺伝子、リボザイムをコードする遺伝子等を挙げることができる。あるいは、外来遺伝子としては、ヒトモノクローナル抗体などの産業上有用な抗体、酵素、又はその他の生理活性物質をコードする遺伝子でもよい。遺伝子としてはｃＤＮＡを使用することができ、コドンを最適化したｃＤＮＡを使用することもできる。
  本発明で用いるウイルスは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にするような適当なマーカー遺伝子を含有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）や、酵素活性や蛍光によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子（ＬａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ遺伝子）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はその類縁体等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、細胞表面に局在する細胞表面マーカー遺伝子等が利用できる。細胞表面マーカー遺伝子は、細胞内領域の一部及び／又は全部を欠損させたものやシグナル伝達能を無くした変異体でも良い。
　抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターは、本発明の一側面を構成する。上記プラスミドベクターには、上記キメラタンパク質を発現できるような適当なプロモーター含んでいてもよい。プロモーターとしては、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０）、ＨＳＶ　ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＥＦ－１　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら　Ｇｅｎｅ　９１，　ｐ．２１７－２２３　（１９９０））、ＣＡＧ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　１０８，　ｐ．１９３－２００　（１９９１））、ＳＲ　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　８，　ｐ．４６６　（１９８８））、βアクチンプロモーター(例えば、特許第5198747号)等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。効率のよい外来遺伝子の転写を達成するためには、プロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリＡ配列、イントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
　本発明においては、上記した各種発現ベクターを、動物細胞（パッケージング細胞）に導入することによって、動物細胞内においてウイルスを産生させることができる。動物細胞の培養上清を回収することによって、産生したウイルスを回収することができる。動物細胞（パッケージング細胞）としては、２９３Ｔ細胞、及びＣＯＳ－１細胞などを使用することができる。
　ウイルスの調製や標的細胞への感染に用いる培地に添加する血清として、一般に動物細胞培養に用いられる血清を用いることができるが、免疫グロブリンを含まないものや低減した血清を用いることが好ましい。また、免疫グロブリンを含まない完全合成培地を使用してもよい。
（２）標的細胞及び抗体
　本発明による遺伝子導入細胞の製造方法においては、（ｉ）ウイルスと、（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とを接触させることにより標的細胞にウイルスを感染させる。
  本発明の方法において遺伝子導入の標的となる標的細胞の種類は特に限定されないが、例えば、幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）など）、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等）、造血細胞、単核細胞（末梢血単核球細胞、臍帯血単核球細胞等）、胚細胞、プライモディアル・ジャーム・セル（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞及び白血病細胞等を使用することができる。また、標的細胞は、ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、又は前記細胞から分化誘導された細胞の何れか一種以上でもよい。好ましい標的細胞としては、末梢血単核球細胞、ヒトＢ細胞、又はヒトＴ細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。
　血液や骨髄より得られる造血系の細胞は入手が比較的容易であり、またその培養や維持の手法が確立されていることから、本発明の方法において使用するのに好適である。特に導入された遺伝子の生体内での長期にわたる発現が目的の場合には、多能性を有する幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞等）や種々の前駆細胞が標的細胞として適している。また、遺伝子治療法をＡＩＤＳの治療に適用する場合には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞等の免疫系細胞やその前駆細胞が標的細胞として好適である。
　ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒト間葉系幹細胞から選択される標的細胞と、前記標的細胞に特異的な抗体とを含むキットは、上記した本発明による遺伝子導入細胞の製造方法を行うためのキットとして有用である。
　本発明においては、（ｉ）ウイルスと、（ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞とをインビトロで接触させる。
　標的細胞に特異的な抗体としては、細胞表面に存在する抗原に特異的な抗体を使用することができる。細胞表面に存在する抗原としては、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
細胞表面分化抗原（ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）分類されている抗原）；
クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合性抗原；
サイトカイン及び成長ホルモン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＴＮＦ）、コロニー刺激因子、内皮増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子、グリア細胞増殖因子、ｇｒｏ－ｂｅｔａ／ｍｉｐ　２、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、インターフェロン類（α－ＩＦＮ、β－ＩＦＮ、γ－ＩＦＮ、コンセンサスＩＦＮ）、インターロイキン類（ＩＬ－１，ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＬ－７，ＩＬ－８，ＩＬ－９，ＩＬ－１０，ＩＬ－１１，ＩＬ－１２，ＩＬ－１３，ＩＬ－１４）、角質細胞増殖因子、白血病阻害因子、マクロファージ／単球走化性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化プロテイン２、血小板由来成長因子、幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子および血管内皮増殖因子）の受容体；
細胞接着分子；
アミノ酸などの代謝物の輸送分子；
Ｂ－およびＴ－リンパ球の抗原受容体；及び
リポタンパク質の受容体がある。
　特定の標的細胞と、それに特異的な細胞表面マーカーの組み合わせを以下に示す。
　なお、特定の標的細胞と、それに特異的な細胞表面マーカーの組み合わせは、下記以外についても、BioGPS(http://biogps.org/)、又はUniProt (http://www.uniprot.org/)から探索することができる。
多能性幹細胞（ＥＳＣｓ　及び　ｉＰＳＣｓ）：ＳＳＥＡ－４，ＳＳＥＡ－３，ＴＲＡ－１－８１，ＴＲＡ－１－６０
造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：ＨＳＣｓ）：ＣＤ３４，ＣＤ４９，ＣＤ９０／Ｔｈｙ１
多能性前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＭＰＰ）：ＣＤ３４
リンパ系共通前駆細胞（Ｃｏｍｍｏｎ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＣＬＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ１０，ＣＤ４５ＲＡ
骨髄球性共通前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＣＭＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ１３５
巨核球・赤芽球共通前駆細胞（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ／ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＭＥＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８
顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＧＭＰ）：ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ１２３，ＣＤ１３５
ＮＫ細胞：ＣＤ５６，ＣＤ９４，ＮＫｐ４６
Ｔ細胞：ＣＤ３
Ｂ細胞：ＣＤ１９
単球：ＣＤ１４
マクロファージ：ＣＤ１１ｂ，ＣＤ６８，ＣＤ１６３
樹状細胞：ＣＤ１１ｃ，ＨＬＡ－ＤＲ
好中球：ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１６，ＣＤ１８，ＣＤ３２，ＣＤ４４，ＣＤ５５
好酸球：ＣＤ４５，ＣＤ１２５，ＣＤ１９３，Ｆ４／８０，Ｓｉｇｌｅｃ－８
好塩基球：ＣＤ２２，ＣＤ４５ｌｏｗ，ＣＤ１２３
マスト細胞：ＣＤ３２，ＣＤ３３，ＣＤ１１７，ＣＤ２０３ｃ，ＦｃεＲＩ
巨核球：ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ａ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ６１
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）：ＣＤ４４，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＣＤ１４６，ＣＤ２７１
神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：ＮＳＣ）：ＣＤ１５ｍｉｄ，ＣＤ２４，ＣＤ１８４
ニューロン：ＣＤ１５ｌｏｗ，ＣＤ２４
腫瘍：ＣＤ１５，ＣＤ２４，ＣＤ３４，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ１６６，ＣＤ３２６，ＣＤ３３８，Ｈｅｒ－２／Ｎｅｕ，Ｌｇｒ５
　本発明においては、細胞表面に存在する抗原として、分化抗原を使用することにより、細胞型の特異的感染が可能になる。
　本発明の一例においては、標的細胞が、ヒトＴ細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８ａ抗体及び抗ヒトＣＤ１１ａ抗体から選択される少なくとも一以上である。
　本発明の別の例においては、標的細胞が、ヒトＢ細胞であり、ＩＬ－４、ＯＤＮ ２００６、ＣＤ４０受容体を介した刺激、及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激から選択される少なくとも一以上の存在下において前記ウイルスと前記標的細胞とをインビトロで接触させることができる。これにより、細胞の増殖を誘導したり、細胞を活性化することができる。
　本発明のさらに別の例においては、標的細胞が、ヒト間葉系幹細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ９０抗体である。
（３）標的細胞へのウイルスの感染
  本発明によれば、目的遺伝子を標的細胞へ導入することができる。 即ち、本発明による遺伝子導入細胞の製造方法は、遺伝子導入方法として利用することができる。
  本発明においては、標的細胞にウイルスをインビトロで接触させて感染させることができる。ウイルスに感染した標的細胞は通常の条件下で培養することによって、導入した遺伝子を発現させることができる。即ち、標的細胞を培養液中において培養することにより、導入された外来遺伝子によってコードされるタンパク質を得ることができる。あるいは、インビトロで形質導入された標的細胞を被験者に移植することもできる。
　本発明による遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞、即ち、上記した本発明のウイルスが感染している遺伝子導入細胞も本発明の範囲内のものである。
（４）遺伝子治療剤
　本明細書に記載したウイルスは遺伝子治療剤の有効成分として有用である。即ち、本発明によれば、本明細書に記載したウイルスを含む遺伝子治療剤が提供される。より具体的には、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルスを含む遺伝子治療剤が提供される。本発明の遺伝子治療剤は、有効成分であるウイルスと組み合せて、薬学上許容できる担体又は希釈剤等のその他の成分を含んでいてもよい。本明細書に記載したウイルスを含む遺伝子治療剤を被験者（患者など）に投与することを含む遺伝子治療方法も本発明の範囲内である。
  本発明においては、本発明の遺伝子治療剤と、所望により抗体とを、被験者に直接投与してもよい。被験者に対する投与経路は、ウイルスと標的細胞とが接触できる限り、特に限定されず、任意の投与経路を採用できる。例えば、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、循環系または造血系の標的細胞については、静脈投与が適切である。ウイルスは、標的器官につながる動脈または静脈へのカテーテル注入によって投与することもでき、それによれば局所投与が可能である。標的細胞が呼吸器系である場合には、ウイルスは吸気によって投与することもできる。
　本発明の遺伝子治療剤の投与量は、ウイルスに含まれる外来遺伝子の種類、治療対象である疾患の種類及び投与部位、重篤度、並びに患者の年齢、体重、性別及び健康状態などに応じて、当業者が適宜選択することができる。ウイルスの力価としては、１０の５乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の６乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の７乗cfu/mlよ り大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の８乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の９乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の１０乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましく、さらに好ましくは１０の１１乗cfu/mlより大きい力価を有することが好ましい。本発明のウイルスは、物理的に強く超遠心により容易に濃縮が可能である。
　本発明の遺伝子治療剤を患者に投与することによって、標的領域における所定の細胞に導入された遺伝子は上記細胞の染色体に組み込まれ、外来遺伝子を安定的に発現させることができる。この遺伝子導入方法を利用して、ヒト等の霊長類を含む哺乳動物の各種疾患について遺伝子治療を実施することが可能である。
  例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的細胞とした遺伝子治療法は、以下の手順で行うことができる。ドナーよりＣＤ４陽性Ｔ細胞を含有する材料として、例えば、骨髄組織、末梢血液、又は臍帯血液等を採取する。採取した材料はそのまま遺伝子導入に用いてもよいが、密度勾配遠心分離等の方法により単核細胞画分を調製することができる。さらにＣＤ４分子を指標とした細胞の精製、ＣＤ８陽性Ｔ細胞および／または単球の除去、ならびにＣＤ４陽性Ｔ細胞数を拡大する培養操作を行うこともできる。これらの細胞集団について、必要に応じて予備刺激（例えばＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、またはＩＬ－２による刺激）を行った後、本発明の方法により、外来遺伝子を搭載したウイルスを感染させる。上記により得られた遺伝子導入細胞は、例えば、静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能である。
  造血幹細胞を標的とした遺伝子治療法としては、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴーシェ病の遺伝子治療法などを挙げることができる。この他、例えば、ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入を行うことも挙げられる。
　癌の遺伝子治療法としては、腫瘍抗原を認識するＴ細胞レセプターをコードする遺伝子を導入することにより、リンパ球に当該抗原を発現する癌細胞に対する特異的な細胞傷害活性を付与する方法が研究されている。さらに、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われている。この場合には、ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶが感染するＣＤ４陽性Ｔ細胞等のＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げるような核酸分子（一本鎖特異的エンドリボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、リボザイム等）をコードする遺伝子を導入することが考えられている。
　以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。遺伝子操作について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　，　Ｅ．Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ　，　ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。細胞培養について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（小山 秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京　第１判）。商品名を記載している場合は特に記載のない限り添付の説明書の指示に従った。
（実施例１）抗体結合タンパク質とＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧ）タンパク質とのキメラエンベロープタンパク質発現ベクター作製
　ｐＶＳＶ－Ｇ（クロンテック社）をＸｈｏＩで部分消化（消化箇所が２箇所以上あるが全部が消化されないように処理している）後、平滑化、電気泳動し約６５００ｂｐのバンドを回収し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ.２．１（タカラバイオ社）を用いてライゲーションし、ＶＳＶ－ＧのＯＲＦ下流のＸｈｏ Ｉ部位がＰｖｕＩに変換されたプラスミド（ｐＶＳＶ-Ｇ（ｂａｃｋ ＸｈｏＩ ｔｏ ＰｖｕＩ））を作製した。配列番号１及び配列番号２を全合成し、ＸｈｏＩとＳｗａＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約５５０ｂｐのバンド及び約５６０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＶＳＶ-Ｇ（ｂａｃｋ ＸｈｏＩ ｔｏ ＰｖｕＩ）をＸｈｏＩとＳｗａＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約６４００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号１及び配列番号２由来の断片それぞれとｐＶＳＶ－Ｇ（ｂａｃｋ ＸｈｏＩ ｔｏ ＰｖｕＩ）由来の断片をライゲーションしプラスミドｐＰＡ２ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＰＧ２ｄ－ＶＳＶ－Ｇを作製した（図１）。ライゲーションしたプラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換し最終濃度１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２×ＹＴ寒天培地及び２×ＹＴ培地で培養し、配列解析やプラスミド調製を行なった。プラスミドの精製は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）やＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ（タカラバイオ社）を用いた。
　ｐＣＩ－ｎｅｏ（プロメガ社）をＣｌａＩで消化後、電気泳動し約３５００ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ｐＣＩを作製した。ｐＣＩをＥｃｏＲＩで十分に消化（消化箇所が複数ありが全部が完全に消化されるように処理している）し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約３５００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＶＳＶ－ＧをＥｃｏＲＩで十分に消化後、電気泳動し約２８００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＣＩ由来の断片とｐＶＳＶ－Ｇ由来の断片をライゲーションし、ＣＭＶプロモーター側に開始コドンが挿入されたプラスミドを選択し、ｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇを作製した（図１）。ｐＣＩ－ＶＳＶ－ＧをＸｈｏＩとＳｗａＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号３及び配列番号４を全合成し、ＸｈｏＩとＳｗａＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約１８０ｂｐ及び約２２０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇ由来の断片と配列番号３及び配列番号４由来の断片をそれぞれライゲーションし、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ及びｐＣＩ－ＳＰ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを作製した（図１）。ＨＭＭ－３８　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅはBiochem Biophys Res Commun. 2002 Jun 21;294(4):835-42.を参照した。
　ｐＣＩ－ＳＰ－ＧＳ２－ＶＳＶ－ＧをＮａｅＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５７００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号５及び配列番号６及び配列番号７を全合成しそれぞれＥｈｅＩ、ＮａｅＩ及びＳｃａＩ、ＳａｃＩ及びＭｌｙＩ、ＮａｅＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約５００ｂｐ及び約５８０ｂｐ及び約６２０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＣＩ－ＳＰ－ＧＳ２　ＶＳＶ－Ｇ由来の断片と配列番号５及び配列番号６及び配列番号７由来の断片をそれぞれライゲーションし、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ３ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＧ３ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ３ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを作製した（図１）。配列番号５及び／又は配列番号７由来の断片を直鎖状 ＤＮＡを生成するライゲーションし、目的のバンドを回収、精製しｐＣＩ－ＳＰ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇ由来の断片とライゲーションし、プロモーターに対して正しい方向に挿入された断片を選抜することにより、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ９ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ１２ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ９ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ１２ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ３ｄ-ＰＬ３ｄ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ３ｄ-ＰＡ３ｄ－ＶＳＶ－Ｇを得た（図２）。
（実施例２）ベクタープラスミドの作製
　細胞への感染効率を測定するレンチウイルスベクタープラスミドとして、ＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを用いた。ＣＳＩＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ（Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ. ２０１４ Ａｐｒ；１０５４：４０２－８．）をＢａｌＩで部分消化し、Ａｏｒ５１ＨＩで消化後、電気泳動し約９０３０ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを作製した。レンチウイルス作製時に用いる、パッケージングプラスミドとしては、３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐＬｅｎｔｉ－Ｃｏｍｂｏ Ｍｉｘ（アプライドバイオロジカル社）のｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ａ（ｇａｇ、ｐｏｌのパッケージングプラスミド）及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ｂ（ｒｅｖのパッケージングプラスミド）を用いた。ｅｎｖのパッケージングプラスミドとしては実施例１に記載のパッケージングプラスミドを用いた。
　細胞への感染効率を測定するレトロウイルスベクタープラスミドとして、ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－Ｖｅｎｕｓ－ｗｐｒｅを用いた。ｐＭＳＣＶ－ｎｅｏ－ｂａｃｔ－ｆＥＰＯ－ｗｐｒｅ（特許第５１９８７４７号）をＮｏｔＩで消化後、電気泳動し約６２００ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－ｆＥＰＯ－ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－ｆＥＰＯ－ｗｐｒｅをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０５０ｂｐのバンドを回収、精製した。ＣＳＩＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓを鋳型とし、配列番号８、配列番号９プライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製、回収しＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、電気泳動し約７９０ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－ｆＥＰＯ－ｗｐｒｅ由来の断片とＣＳＩＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ由来の断片をライゲーションし、ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－Ｖｅｎｕｓ－ｗｐｒｅを作製した。
（実施例３）フィーダー細胞の作製
　ヒトＢ細胞培養のためヒトＣＤ４０リガンドとヒトＢＡＦＦを発現するフィーダー細胞を作製した。ヒトＣＤ４０リガンド（例えば、Eur J Immunol. 1992 Dec;22(12):3191-4.及び、EMBO J. 11 (12), 4313-4321 (1992)、NCBI Reference Sequence: NM_000074）参照）を及びヒトＢＡＦＦ（例えば、J Exp Med. 1999 Jun 7;189(11):1747-56. 、Science. 1999 Jul 9;285(5425):260-3. 、NCBI Reference Sequence: NM_006573）は文献情報等を元に全合成した。ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－ｆＥＰＯ－ｗｐｒｅをＮｏｔＩとＣｌａＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号１０、配列番号１１の５’末端をリン酸化した１本鎖ＤＮＡを合成し、混合し熱処理後、穏やかに冷却し２本鎖ＤＮＡとし、ｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－ｆＥＰＯ－ｗｐｒｅ由来の断片とライゲーションし、ｐＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ｗｐｒｅをＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５１００ｂｐのバンドを回収、精製した。ＣＳＩＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－ＶｅｎｕｓをＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化後、電気泳動し約１３００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ｗｐｒｅ由来の断片とＣＳＩＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ由来の断片をライゲーションし、ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ－ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ－ｗｐｒｅをＮｏｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約５０００ｂｐのバンドを回収、精製した。ＣＳＩＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓを鋳型とし、配列番号１２、配列番号１３をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、電気泳動し約１３００ｂｐのバンドを回収、精製した。合成したヒトＣＤ４０リガンドｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、配列番号１５をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、電気泳動し約８３０ｂｐのバンドを回収、精製した。約１３００ｂｐのバンドと約８３０ｂｐのバンドを鋳型として、配列番号１２、配列番号１５をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、精製した。これをＮｏｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動し約１４００ｂｐのバンドを回収、精製し、ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓ－ｗｐｒｅ由来の断片とライゲーションし、ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ２－ＣＤ４０Ｌ－ｗｐｒｅを作製した。ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ２－ＣＤ４０Ｌ－ｗｐｒｅをＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約６４００ｂｐのバンドを回収、精製した。合成したヒトＢＡＦＦｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１６、配列番号１７をプライマーとしてＰＣＲにより増幅後、精製し、ＮｏｔＩで消化し、電気泳動し約９００ｂｐのバンドを回収、精製しｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ２－ＣＤ４０Ｌ－ｗｐｒｅ由来の断片とライゲーションし、５`ＬＴＲプロモーター側にヒトＢＡＦＦの開始コドンが挿入されたプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶ－ＢＡＦＦ－ＩＲＥＳ２－ＣＤ４０Ｌ－ｗｐｒｅを作製した。特許第５１９８７４７号に従って、レトロウイルスベクターを作製し、Ｂａｌｂ/c ３Ｔ３細胞に感染させた。ＢＡＦＦの発現はＨｕｍａｎ ＢＡＦＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＣＤ４０Ｌの発現はＦＩＴＣ ａｎｔｉ-ｈｕｍａｎ ＣＤ１５４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（バイオレジェンド社）を用いてフローサイトメーターで評価した。ＢＡＦＦとＣＤ４０Ｌの発現を指標にクローン化してｈ４０ＬＢとした。
（実施例４）ｓＣＤ４０Ｌ、ｓＢＡＦＦの調製
　Ｅ. ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）をｐＩＲＥＳ（タカラバイオ社）で形質転換し、最終濃度１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、プラスミド調製を行なった。ｐＩＲＥＳをＣｌａＩで消化後、電気泳動し約４１００ｂｐのバンドを回収、精製、ライゲーションし、ｄｐＩＲＥＳを作製した。ｄｐＩＲＥＳをＳｍａＩで完全に消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約４１００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α Ｐｕｒ（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１８、配列番号１９をプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収し、リン酸化後、電気泳動し約６００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｄｐＩＲＥＳ由来の断片とｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α Ｐｕｒ由来の断片をライゲーションし、ＩＲＥＳ側に開始コドンが挿入されたプラスミドを選択しｄｐＩＲＥＳ－Ｐｕｒを作製した。ｄｐＩＲＥＳ－ＰｕｒをＸｈｏＩとＭｌｕＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約４７００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号２０、配列番号２１の５’末端をリン酸化した１本鎖ＤＮＡを合成し、混合し熱処理後、穏やかに冷却し２本鎖ＤＮＡとし、ｄｐＩＲＥＳ－Ｐｕｒ由来の断片とライゲーションし、ｄｐＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒを作製した。配列番号２２を全合成し、ＮｈｅＩとＥｃｏＩで消化後、電気泳動しそれぞれ約９００ｂｐのバンドを回収、精製した。ｄｐＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰｕｒをＮｈｅＩとＥｃｏＩで消化し、脱リン酸化処理後、電気泳動し約４７００ｂｐのバンドを回収、精製した。配列番号２２由来の断片とｄｐＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒ由来の断片をライゲーションし、ｄｐＣＭＶ－ｓＣＤ４０Ｌ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒを作製した。ｄｐＣＭＶ－ｓＣＤ４０Ｌ　ＩＲＥＳ－Ｐｕｒを用いて２９３Ｔ細胞を形質転換し、ピューロマイシン存在下で安定発現細胞を選択し２９３Ｔ（ｓＣＤ４０Ｌ）をクローン化した。２９３Ｔ（ｓＣＤ４０Ｌ）を２９３　ＳＦＭ　ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（２×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）で培養し、上清をＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｏｌｕｍｎ（ＩＢＡ社）で精製した。溶出した精製溶液はＶｉｖａｓｐｉｎ　Ｔｕｒｂｏ　１５　（ＭＷＣＯ：１０，０００）（ザルトリウス社）を用いてＰＢＳに置換した（精製ｓＣＤ４０Ｌ）。配列番号２３を全合成し、同様の実験を行うことによって、精製ｓＢＡＦＦを得ることができる。ＣＤ４０ＬやＢＡＦＦはＴＮＦスーパーファミリーに属するホモ三量体のII型膜タンパク質である。ＣＤ４０ＬやＢＡＦＦの細胞外領域と配列番号２４のコイルドコイル配列(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1995 Apr 29;348(1323):81-8.)を融合させることにより、活性型の三量体タンパク質として生産することができる。
（実施例５）血液からの細胞分離
　血液の使用は社内の倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントを条件として行なった。医師・看護師によりテルモ血液バッグＣＰＤＡ（テルモ社）に採血し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ （ｔｕｂｅ ｓｉｚｅ： ５０ｍＬ）（Ａｌｅｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ＡＳ社）を用いて単核球分離を行ないＰＢＭＣとした。常法により、ビオチン－抗ヒトＣＤ２抗体(バイオレジェンド社）、ビオチン－抗ヒトＣＤ２３５ａ抗体(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社)を反応させ、ＣＤ２、ＣＤ２３５陰性の細胞を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｌｕｓ－ＤＭ、ＢＤ　ＩＭａｇｎｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて回収した。これに、常法によりＰＥ/Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ＡＲＩＡIII（ＢＤ　バイオサイエンス社）でＣＤ１９陽性の細胞ソーティングし、ヒトＢ細胞を得た。これを、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２（タカラバイオ社）で凍結保存し、凍結Ｂ細胞とした。また、採血した血液をＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＢ細胞を分離し新鮮Ｂ細胞とした。
（実施例６）ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇの評価
　２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした２４ウェルプレートに６×１０5となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で一晩培養した。翌日、０．５　ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを０．５　μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ａを０．５　μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ｂを０．５　μｇと、エンベロープタンパク質発現ベクター（ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ）をトランスフェクションした。エンベロープタンパク質発現ベクターは、２μｇから１／６４μｇで検討した。トランスフェクションから４時間後に２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとし、１ｍＬずつを２４ウェルプレートに２×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた。翌日培地交換し、感染から２日後にＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液（ＳＩＧＭＡ社）で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（２×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。ＶＳＶ-Ｇベクター濃度と力価の関係の結果を図３に示す。どのＶＳＶ－Ｇベクターでもウイルスが産生するが、至適ベクター濃度が異なった。これは、ベクター毎にＶＳＶ－Ｇの発現量が異なるためで、各ベクターの発現量はｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇ＜ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ＜ｐＶＳＶ－Ｇと推察される。ウイルス力価はｐＶＳＶ－Ｇ（１／１６　μｇ／２４　ウェルプレート)、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ（１／２　μｇ／２４　ウェルプレート)、ｐＣＩ－ＶＳＶ－Ｇ（１　μｇ／２４　ウェルプレート)で高くなっため、ｐＣＩ－ＶＳＶ－ＧはｐＶＳＶ－Ｇの１／１６前後、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－ＧはｐＶＳＶ－Ｇの１／８前後の発現量であると推察される。
（実施例７）抗体結合タンパク質（プロテインＡ：ＰＡ、プロテインＧ：ＰＧ、プロテインＬ：ＰＬ）とＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧ）タンパク質のキメラエンベロープタンパク質発現ベクターの評価
　レンチウイルスベクターの作製と力価測定は、実施例６と同様に行なった（図４）。但し、エンベロープタンパク質発現ベクターは、表１のような量比で用いた。Ｂ細胞への感染検討は、凍結Ｂ細胞を１．２５×１０の５乗となるように遠心分離し、ウイルス上清液（ＩＬ－４　　５０　ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５　Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ　４００　ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ　１００　ｎｇ／ｍＬを含む）１　ｍＬで懸濁し２４ウェルプレートに播種し一晩感染させた。翌日、細胞を遠心分離し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ　１６４０（２％　ＦＢＳ、ＩＬ－４　　５０　ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５　Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ　４００　ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ　１００　ｎｇ／ｍＬ、Ａ２８６９８２　２　μＭ)  に懸濁し培養を続けた。３日後、細胞を遠心分離し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ　１６４０（２％　ＦＢＳ、ＩＬ－２１　１０　ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５　Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ　４００　ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ　１００　ｎｇ／ｍＬ、Ａ２８６９８２　２　μＭ)に懸濁し培養を続けた。３日後、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の割合い（％）を算出した。結果を図４に示す。ＰＡ又はＰＬとＶＳＶ－Ｇタンパク質のキメラエンベロープタンパク質発現ベクターを用いることにより、Ｂ細胞への感染効率が顕著に増加している。ＰＧとＶＳＶ－Ｇタンパク質のキメラエンベロープタンパク質発現ベクターでは、ｐＶＳＶ－ＧよりもＢ細胞への感染効率は低下した。また、ＰＡでドメイン数を、２ドメインから３ドメインに増やすことにより力価あたりの感染効率が約１．８倍に増加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例８）抗体結合タンパク質のドメイン数と感染効率の評価
　２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした１２ウェルプレートに１．１×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを１　μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ａを１μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ｂを１μｇとｐＶＳＶ－Ｇを０．１２５μｇとキメラエンベロープタンパク質発現ベクター０．２５μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に５ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）を含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。２４ウェルプレートに２９３Ｔ細胞を１．３×１０5で播種し、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養した。これに、０．２ｍＬずつのウイルス上清液ストックを添加し一晩感染させた。翌日培地交換し、感染から５日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（１．３×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。抗体結合タンパク質のドメイン数と力価の関係の結果を図５に示す。凍結Ｂ細胞をＡｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０（２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）、ＩＬ－４　５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ　４００ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ　１００ｎｇ／ｍＬ、Ａ２８６９８２　２μＭを含む)で２日間培養した。これを遠心分離し、５０００個のＢ細胞にウイルス上清液ストック１ｍＬを感染させた。２時間後遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に２４ウェルプレートに１×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０（２％　ＦＢＳ、ＩＬ－２１　１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。５日後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ＣＤ１９陽性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（％）を算出した。抗体結合タンパク質のドメイン数とＢ細胞への感染効率の結果を図５に示す。ｐＶＳＶ－Ｇでは、感染効率は１％未満であったが、キメラエンベロープタンパク質ではどのドメイン数でも６％以上の感染効率を示した。ＰＬとＰＡを組み合わせたものでも、Ｂ細胞への感染効率は７％以上であった。ＰＡ、ＰＬどちらにおいても、６～１２ドメインで３ドメインより高いＢ細胞への感染効率を示した。
（実施例９）ＶＳＶ－Ｇベクターとキメラエンベロープタンパク質発現ベクターとの比率の評価
　２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした２４ウェルプレートに６×１０5となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、０．５ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）と１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを０．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ａを０．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ｂを０．５μｇと、エンベローププラスミドを表２、３、４の量比でトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）と１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。１０μＬずつを２４ウェルプレートに５×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた（２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養）。翌日培地交換し、感染から２日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（５×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。表２、３、４の結果を図６、７、８に示す。凍結Ｂ細胞を５×１０4となるように遠心分離し、ウイルス上清液（ＩＬ－４　５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ　４００ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ　１００ｎｇ／ｍＬを含む）１ｍＬで懸濁し２４ウェルプレートに播種し一晩感染させた。これを遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に２４ウェルプレートに１×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０（２％　ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）、ＩＬ－２１　１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。５日後、Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７抗ヒトＣＤ１９抗体とＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１抗マウスＨ－２Ｋｄ抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ヒトＣＤ１９陽性、マウスＨ－２Ｋｄ陰性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（％）を算出した。表２、３、４の結果を図６、７、８に示す。図６からキメラエンベロープベクターの比率が増えるに連れてウイルス力価が低下する傾向が見られる。一方で、Ｂ細胞への感染は、ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇが６４：３２で最大となった。実施例６（図３）の結果から、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－ＧはｐＶＳＶ－Ｇの１／８前後であったため、ウイルスベクター上でＶＳＶ－Ｇタンパク質：キメラエンベロープタンパク質が１６：１前後でＢ細胞への感染効率が高いと推定される。図７でｐＶＳＶ－Ｇとキメラエンベロープベクターの比率をより細かく調べた。ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇでは５：５、ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇでは５：４でＢ細胞への感染効率が最大となった。ｐＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇでは、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇの比率がもっと多くてもよい可能性がある。図８でｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇとキメラエンベロープベクターの比率を調べた。ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇでは１６：８、ｐＣＩ－ＳＰ－ＶＳＶ－Ｇ：ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇでは１６：２でＢ細胞への感染効率が最大となった。ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇでは、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＶＳＶ－Ｇに比べてより多くのベクター量が必要となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例１０）抗体を介したＴ細胞への感染評価
　２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした６ウェルプレートに３×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）とを含むと１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ａを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ｂを２．５μｇと、ｐＶＳＶ－Ｇを０．６２５μｇ、又はｐＶＳＶ－Ｇを０．６２５μｇとｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇ、又はｐＶＳＶ－Ｇを０．６２５μｇとｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを０．６２５μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に１２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）と１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。１０μＬずつを２４ウェルプレートに５×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた（２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養）。翌日培地交換し、感染から５日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をＤＲＡＱ７（ＢｉｏＳｔａｔｕｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（５×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。結果を図９に示す。１×１０6のＰＢＭＣを常法により、抗ヒトＣＤ３抗体、又は、抗ヒトＣＤ８ａ抗体、又は、抗ヒトＣＤ１１ａ抗体、又は、抗ヒトＣＤ１９抗体（バイオレジェンド社）と１．０ μｇ/ｍｌの濃度で反応させ、ＰＢＳによる洗浄で余剰の抗体をよく取り除いた後、１　ｍＬのウイルス上清液ストックを用い、３７℃で３０分間感染させた。遠心分離でウイルス液を除いた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０（２％　ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）、ＩＬ－２　６００Ｕ／ｍＬ、抗ヒトＣＤ３抗体　３０ｎｇ／ｍＬを含む)で４日間培養した。これに常法により、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体とＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ＣＤ３陽性、ＣＤ１９陰性細胞をＴ細胞として、生存Ｔ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｔ細胞の割合い（％）を算出した。結果を図９に示す。ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを用いた際、Ｔ細胞表面に発現していると考えられるＣＤ３、又はＣＤ８ａ、又はＣＤ１１ａと、抗ヒトＣＤ３抗体、又は、抗ヒトＣＤ８ａ抗体、又は、抗ヒトＣＤ１１ａ抗体とを介してＴ細胞への感染効率が向上した。ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇでは、ｐＶＳＶ－Ｇよりは感染効率が高いが、ｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇほどの感染効率の向上は見られない。ＰＡとＰＬでは、抗体への結合領域が違うため抗体を介した感染効率に影響している可能性がある。
（実施例１１）キメラエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス（レンチウイルス以外のレトロウイルス）のＢ細胞への感染評価
　ＧＰ２９３細胞をコラーゲンコートした１２ウェルプレートに１．５×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳと１０％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）を含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてｐＭＳＣＶ－ｂａｃｔ－Ｖｅｎｕｓ－ｗｐｒｅを２μｇと、ｐＶＳＶ－Ｇを０．５μｇ又はｐＶＳＶ－Ｇを０．５μｇとｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを０．５μｇ又はｐＶＳＶ－Ｇを０．５μｇとｐＣＩ－ＳＰ－ＰＬ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを０．５　μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に５ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳ又は１０％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）を含む）に交換し２日間培養しレトロウイルスベクターを作製した。作製したレトロウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。２０μＬずつを２４ウェルプレートに５.０×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた（２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養）。翌日培地交換し、感染から５日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（５．０×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。結果を図１０に示す。凍結Ｂ細胞を解凍、遠心分離し、８０００個のＢ細胞にウイルス上清液ストック１ｍＬを感染させた。２時間後遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に２４ウェルプレートに１×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０（２％　ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）、ＩＬ－２１　１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。５日後、Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７抗ヒトＣＤ１９抗体とＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１抗マウスＨ－２Ｋｄ抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ヒトＣＤ１９陽性、マウスＨ－２Ｋｄ陰性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（％）を算出した。結果を図１０に示す。レンチウイルス以外のレトロウイルスでは、レンチウイルスの場合よりＢ細胞への感染効率は低いが、ｐＶＳＶ－Ｇに比べてキメラエンベロープタンパク質発現ベクター用いた際に感染効率が向上している。また、キメラエンベロープタンパク質発現ベクター用いた際にＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）の利用で力価、Ｂ細胞への感染効率ともに向上している。
（実施例１２）濃縮レンチウイルスのＢ細胞への感染評価
　レンチウイルス上清液ストックを実施例６と同様に調製した。２０ｍＬを、４２,２００ ×ｇ、４℃で２時間遠心分離した。それぞれの沈殿を１ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ１６４０（ＩＬ－４　　５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬ、ｓＣＤ４０Ｌ　４００ｎｇ／ｍＬ、ｓＢＡＦＦ　１００ｎｇ／ｍＬ、ＯＤＮ ２００６（ミルテニーバイオテク社）　２．５μｇ/ｍＬを含む）に懸濁し、濃縮レンチウイルス液を作製した。濃縮レンチウイルス液１μＬずつを２４ウェルプレートに２×１０5で播種した２９３Ｔ細胞に一晩感染させた。翌日培地交換し、感染から２日後にＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で剥離させた細胞をヨウ化プロピジウム溶液（ＳＩＧＭＡ社）で染色後、フローサイトメーターで解析し、感染時細胞数（２×１０5）×生細胞Ｖｅｎｕｓ陽性／総生細胞から力価（ｔｉｔｅｒ (ＴＵ／ｍｌ））を算出した。ＶＳＶ-Ｇベクター濃度と力価の関係の結果を図１１に示す。新鮮Ｂ細胞を遠心分離し、１×１０5個とし、これに濃縮レンチウイルス液１ｍＬを感染させた。６時間後遠心分離し、Ｂ細胞をフィーダー細胞（前日に６ウェルプレートに５×１０5となるように播種したｈ４０ＬＢ）上に播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ　１６４０（２％　ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）、ＩＬ－４　　５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬを含む)で培養した。２日後、培地をＡｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ　１６４０（２％　ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）、ＩＬ－２１　１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２　２５Ｕ／ｍＬを含む)に交換し培養を続けた。２日後、Ａｃｃｕｔａｓｅで細胞を剥離、遠心分離した。これに常法により、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７抗ヒトＣＤ１９抗体を反応させ、ヨウ化プロピジウム溶液染色後、フローサイトメーターで解析し、ヒトＣＤ１９陽性細胞をＢ細胞として、生存Ｂ細胞中のＶｅｎｕｓ陽性Ｂ細胞の割合い（図１１）を算出した。結果を図１１に示す。新鮮Ｂ細胞や濃縮レンチウイルスやＴＯＬＬ様受容体からの刺激を組み合わせることによってＢ細胞への感染効率を向上させることができる。また、新鮮Ｂ細胞はＢ細胞に対する抗体は添加せずに調製している。抗体を別途添加しなくてもＢ細胞上のＢＣＲを介してキメラエンベロープタンパク質発現ベクターを利用することにより、効率よくＢ細胞にウイルスベクターを感染させることが出来た。
（実施例１３）抗体を介した間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）への感染評価
　２９３Ｔ細胞をコラーゲンコートした６ウェルプレートに３×１０6となるように播種し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと１０％ＦＢＳを含む）で一晩培養した。翌日、２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）とを含むと１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含む）に交換し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＳＩＶ－ＣＭＶ－Ｖｅｎｕｓを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ａを２．５μｇ及びｐＬｅｎｔｉ－Ｐ３Ｂを２．５μｇとｐＶＳＶ－Ｇを０．６２５μｇとｐＣＩ－ＳＰ－ＰＡ６ｄ－ＧＳ２－ＶＳＶ－Ｇを０．６２５μｇをトランスフェクションした。トランスフェクションから４時間後に１２ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）と１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含む）に交換し２日間培養しレンチウイルスベクターを作製した。作製したレンチウイルスベクターは０．８μｍのフィルターでろ過してウイルス上清液ストックとした。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％ＦＢＳを含む）で培養した５×１０5のヒト骨髄ＭＳＣ（プロモセル社）を常法により、抗ヒトＣＤ９０抗体（バイオレジェンド社）と１．０ μｇ/ｍｌの濃度で反応させ、ＰＢＳによる洗浄で余剰の抗体をよく取り除いた後、２　ｍＬのウイルス上清液ストックを用い、３７℃で１時間感染させた。遠心分離でウイルス液を除いた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ（２×ＧｌｕｔａＭＡＸと２％　ＦＢＳ（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ　ＩｇＧ）を含む)で２４ウェルプレートに播種した。翌日培地交換し、感染から３日後にＡｃｃｕｍａｘで剥離させた細胞をＤＲＡＱ７で染色後、フローサイトメーターで解析し、生存ＭＳＣ中のＶｅｎｕｓ陽性細胞の割合い（％）を算出した。結果を図１２に示す。ＭＳＣ上に発現しているＣＤ９０に対する抗ＣＤ９０抗体を添加して感染させたときは、抗体を添加せずに感染させたときに比べて感染効率の向上が見られた。

Claims (25)

  1. （ｉ）抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスと；
    （ｉｉ）標的細胞と前記標的細胞に特異的な抗体、及び／又は膜型抗体を含む標的細胞；
    とをインビトロで接触させることにより標的細胞にウイルスをインビトロで感染させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
  2. 抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメイン及びプロテインLのIgG結合ドメインのうちの何れか又は両方を含む、請求項１に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  3. 抗体結合タンパク質が、プロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、請求項２に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  4. 抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを３個以上含む、請求項２又は３に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  5. 前記キメラタンパク質において、抗体結合タンパク質が、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のＮ末端側に存在している、請求項１から４の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  6. ウイルスが、レトロウイルスである、請求項１から５の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  7. レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項６に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  8. 標的細胞が、ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト間葉系幹細胞、及び前記細胞から分化誘導された細胞の何れか一種以上である、請求項１から７の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  9. 標的細胞が末梢血単核球細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  10. 標的細胞が、ヒトＢ細胞、ヒトＴ細胞又はヒト間葉系幹細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  11. 標的細胞が、ヒトＴ細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８ａ抗体及び抗ヒトＣＤ１１ａ抗体から選択される少なくとも一以上である、請求項１から１０の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  12. 標的細胞が、ヒトＢ細胞であり、ＩＬ－４、ＯＤＮ ２００６、ＣＤ４０受容体を介した刺激、及びＢＡＦＦ受容体を介した刺激から選択される少なくとも一以上の存在下において前記ウイルスと前記標的細胞とをインビトロで接触させる、請求項１から１０の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  13. 標的細胞が、ヒト間葉系幹細胞であり、標的細胞に特異的な抗体が、抗ヒトＣＤ９０抗体である、請求項１から１０の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  14. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、前記キメラタンパク質以外に、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  15. 前記ウイルスにおける、前記キメラタンパク質と、前記水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質のモル比が、１：１～１：５１２の範囲内である、請求項１４に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  16. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質を含むウイルスが、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとを組み合わせて使用することによって製造されたものである、請求項１から１５の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  17. 抗体結合タンパク質をコードする塩基配列を含まず、水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターと、抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクターとの質量比が６４：１～６４：２５６の範囲内である、請求項１６に記載の遺伝子導入細胞の製造方法。
  18. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質と、外来遺伝子とを含むウイルスであって、抗体結合タンパク質が、プロテインLのIgG結合ドメインを含むか、及び／又はプロテインAのIgG結合ドメインを３個以上含む、ウイルス。
  19. ウイルスが、レトロウイルスである、請求項１８に記載のウイルス。
  20. レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項１９に記載のウイルス。
  21. 請求項１８から２０の何れか一項に記載のウイルスを含む遺伝子治療剤。
  22. 請求項１から１７の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法により得られる遺伝子導入細胞。
  23. 請求項１８から２０の何れか一項に記載のウイルスが感染している遺伝子導入細胞。
  24. 抗体結合タンパク質と水疱性口内炎ウイルスG （VSV-G）タンパク質とのキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドベクター。
  25. ヒト初代細胞、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又はヒト間葉系幹細胞から選択される標的細胞と、前記標的細胞に特異的な抗体とを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の遺伝子導入細胞の製造方法を行うためのキット。
PCT/JP2017/040578 2016-11-10 2017-11-10 遺伝子導入細胞の製造方法 WO2018088519A1 (ja)

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